JP7610262B2

JP7610262B2 - 皮膚外用剤

Info

Publication number: JP7610262B2
Application number: JP2021111135A
Authority: JP
Inventors: 茂豊澤木; 英生岩野; 哲史愛水
Original assignee: 共栄化学工業株式会社
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2025-01-08
Anticipated expiration: 2041-07-02
Also published as: JP2022031140A

Description

本発明は、皮膚（頭皮も含む）外用剤に配合可能な酵母培養抽出物及び植物発酵物を組み合わせた組成物に関するものである。

従来、皮膚外用剤に配合する有効成分として天然物由来の成分が研究開発されている。しかし、それらの天然物由来の成分は、皮膚外用剤の有効成分として利用する場合に、有効性や安定性等の点で課題があった。

上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、本発明者らは、酵母培養物抽出物、ハス属植物の発酵物及びワスレグサ属植物の組み合わせが、美白及び抗酸化等の相乗効果を有し、皮膚外用剤の有効成分として有用であることを新たに見出した。

従来、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）を皮膚外用剤の美白成分として使用することは、例えば、特許文献１，２により知られていた。また、ハス属植物の発酵物、又はワスレグサ属植物の発酵物を化粧料に配合することは、特許文献３，４により知られていた。しかし、ササユリ由来酵母の培養物抽出物、ハス属植物の乳酸菌発酵物及びワスレグサ属植物の酵母発酵物の組み合わせが、美白及び抗酸化等の相乗効果を有し、皮膚外用剤の有効成分として有用であることについては知られていなかった。
特開2001-354570号特開2002-234828号特開2005-298489号特開2008-050326号

本発明は、ササユリ由来酵母の培養物抽出物或いはその濃縮物又は乾燥粉末と、ハス科ハス属に属するハスの乳酸菌発酵物と、ユリ科ワスレグサ属のホンカンゾウ及び／又はヤブカンゾウの酵母発酵物とを有効成分とする皮膚外用剤である。

本発明は、ササユリ由来酵母の培養物抽出物或いはその濃縮物又は乾燥粉末と、ハス科ハス属に属するハスの乳酸菌発酵物と、ユリ科ワスレグサ属のホンカンゾウ及び／又はヤブカンゾウの酵母発酵物を有効成分として組み合わせて配合することで、格段にすぐれた美白効果及び抗酸化効果等を有する皮膚外用剤を提供することができる。

本発明に係る組成物のＳＣＦ（Steam Cell Factor）の合成抑制評価試験の結果を示す。本発明に係る組成物のプロスタグランジンＥ２（PGE2）の合成抑制評価試験の結果を示す。本発明に係る組成物のメラニン合成抑制評価試験の結果を示す。本発明に係る組成物のヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）遺伝子の発現亢進評価試験の結果を示す。本発明に係る組成物のHepatocyte Growth Factor（HGS）の発現抑制評価試験の結果を示す。本発明に係る組成物のＳＯＤ様活性評価試験の結果を示す。本発明に係る組成物の糖化抑制評価試験の結果を示す。本発明に係る組成物のメラノサイトのETBR合成抑制評価試験の結果を示す。本発明に係る組成物のメラノサイトのMC1R合成抑制評価試験の結果を示す。

以下、本発明について詳細に説明する。本発明で用いる酵母は、サッカロマイセス属の酵母であって、ユリ科(Liliaceae)ユリ属（Lilium）にササユリ（Lilium japonicum）の花由来の酵母である。ササユリの花由来の酵母としては、特許6175697に記載のササユリの花より採取された酵母「サッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）」（特許微生物寄託センター受託番号NITE P－01947）が挙げられる。

酵母培養物抽出物或いはその濃縮物又は乾燥物は、以下のようにして調製することができる。酵母培養物抽出物の製造方法は、酵母を培養液で培養する方法、培養した酵母を酸やアルカリで菌体成分を可溶化する加水分解法、酵母菌体内にあるタンパク質分解酵素などを利用する自己消化法、タンパク質分解酵素等の酵素剤を利用する酵素法、これらを組み合わせた方法により得ることができる。

酵母を培養する際の炭素源は、特に限定はなく、炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース又はガラクトース或いはそれらを構成糖とするオリゴ糖、多糖が挙げられる。また、炭素源に加えて、窒素源を添加することでも良く、例えば、窒素源としては、アミノ酸やペプトン等が挙げられる。

酵母の培養温度は、２５℃～４０℃の範囲で、好ましくは２８℃～３５℃の範囲である。また、ｐＨは、３．０～８．０の範囲で、好ましくは、３．５～７．０の範囲である。

酵母培養物抽出物の濃縮物は、酵母の培養液、或いは加水分解方法、酵母の自己消化法又は酵素法にて得られる液を、減圧濃縮器等で濃縮することで得ることが出来る。

また、酵母培養物抽出物の乾燥物は、酵母の培養液又はその濃縮液を、真空乾燥法、スプレードライ法などにより乾燥することで得ることができる。

また、酵母培養物抽出物乾燥物は、化学安定性、低吸湿性を目的として、賦形剤を加えた乾燥物としても良い。賦形剤は、澱粉、ブドウ糖、結晶セルロース、乳糖、デキストリン等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マンニトール、マルチトール、ラクチトール、等の糖アルコールなどを用いることができるが、酵母培養物抽出物と混合して乾燥粉末化できるものであればいずれの物質でもよい。

また、本発明に係るハス発酵物の素材として使用する植物は、ハス科（Nelumbonaceae）ハス属（Nelumbo）に属するハス（Nelumbo nucifera)であり、発酵に用いる部位はその種子である。

また、本発明に係るユリ科ワスレグサ属の植物の発酵物素材として使用するものは、ホンカンゾウ（Hemerocallis fulva var. fulva）又はヤブカンゾウ（Hemerocallis fulva var. kwanso）或いはそれら２種の混合物であり、発酵に用いる部位は、その蕾又は花弁及び蕾である。

発酵処理は、以下のようにして行うことができる。まず、発酵の資化源としては植物部位（種子、蕾又は花弁）自体（以下、植物体ということがある）を用いてもよく、又は植物体を適宜の媒体で抽出して得られる抽出物を用いてもよい。また、抽出物を用いる場合には、被抽出物の植物体を固液分離によって除去することなく、植物体を含んだままで発酵を行うことも可能である。ここで、植物は、生のままであっても、又予め乾燥若しくは半乾燥したものであってもよい。また、形状としては採取したものをそのまま用いることも可能である。

本発明において、ハス種子の発酵に用いる微生物は乳酸菌であり、例えば、ラクトバシルスプランタラム（Lactobacillus plantarum)、ラクトバシルスブレビス（Lactobacillus brevis)、ラクトバシルスカゼイ（Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・デルブルッキー（Lactobacillus delbrueckii）等のラクトバシルス（Lactobacillus）属の乳酸菌；カルノバクテリウムディバージェンス（Carnobacterium divergens)、カルノバクテリウムピシコーラ(Carnobacterium piscicola)等のカルノバクテリウム（Carnobacterium）属の乳酸菌；ロイコノストックメセンテロイズ（Leuconostoc mesenteroides)、ロイコノストックラクティス（Leuconostoc lactis)、ロイコノストックシトレウム（Leuconostoc citreum)等のロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌；ストレプトコッカスフェーカリス（Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカスピオジェネス（Streptococcus pyogenes)等のストレプトコッカス属の乳酸菌；エンテロコッカスカゼリフラバス（Enterococcus caseliflavus)、エンテロコッカスサルフレウス（Enterococcus sulfreus)等のエンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌；ラクトコッカスプランタラム（Lactococcus plantarum) ラクトコッカスラフィノラクティス（Lactococcus rafinolactis)等のラクトコッカス属の乳酸菌；ヴェイセラコンフューザ（Weissella confusa)、ヴェイセラカンドウレリ（Weissella kandleri)等のヴェイセラ属の乳酸菌；アトポビウムミニュタム（Atopobium minutum)、アトポビウムパービュラス（Atopobiumparvulus)等のアトポビウム（Atopobium）属の乳酸菌；バゴコッカスフルビアリス（Vagococcus fluvialis）、バゴコッカスサーモニナラム（Vagococcus salmoninarum)等のバゴコッカス（Vagococcus）属の乳酸菌；ペディオコッカスダムノサス（Pediococcus damnosus)、ペディオコッカスペントサセウス（Pediococcus pentosaceus)等のペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌等が挙げられる。

また、本発明において、ホンカンゾウ及び／又はヤブカンゾウの蕾又は蕾及び花弁の発酵に用いる酵母とは、例えば、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセスアワモリ(Saccharomyces awamori)、サッカロミセスチェバリエリ(Saccharomyces chevalieri)、サッカロミセスカールスバージェンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセスバヨナス（Saccharomyces bayonus)等のサッカロミセス属の酵母、ガラクトミセス（Galactomyces）属の酵母、ラカンセア属（Lachancea）の酵母（Lachancea kluyveri等）、トルラスポラデルブルエキ(Torulaspora delbruekii)、トルラスポラファーメンタチ(Torulaspora fermentati)、トルラスポラロゼイ(Torulaspora rosei)等のトルラスポラ属の酵母、ジゴサッカロミセスローキシ(Zygosaccharomyces rouxii)、ジゴサッカロミセスソーヤ(Zygosacchar omyces soya)、ジゴサッカロミセスサケ(Zygosaccharomyces sake)、ジゴサッカロミセスミソ(Zygosaccharomyces miso)、ジゴサッカロミセスラクティス(Zygosaccharomyces lactis)等のジゴサッカロミセス属の酵母、カンディダベルサチリス(Candida versatilis)、カンディダエチェリシイ(Candida etchellsii)、カンディダケフィール（Candida kefyr）、カンディダサケ（Candida sake）、カンディダスコッティ（Candida scottii）等のカンディダ属の酵母、オーレオバシディウムプルランス（Aureobasidium Pullulans）、オーレオバシディウムマンソニー（Aureobasidium mansonii）、オーレオバシディウムマイクロスティクタム（Aureobasideium microstictum）等のオーレオバシディウム属の酵母、等が挙げられる。また、本発明に係る酵母としては、清酒酵母、ワイン酵母、ビール酵母、植物の花（バラ、ユリ、サクラ等）由来の酵母、海由来の酵母の何れであっても良い。

上述の懸濁液又は抽出物を微生物により発酵させるときには、発酵工程前に、殺菌を行って発酵の障害となる雑菌を除去することが必要である。この雑菌の殺菌除去方法としては、発酵素材を予め殺菌用エタノール等で洗浄した後無菌水等の無菌溶媒に懸濁する方法を用いてもよく、又発酵素材を溶媒に懸濁した後、懸濁液を加熱殺菌等により殺菌するようにしてもよい。加熱殺菌処理としては、懸濁液を１２０～１３０℃で１０～２０分間加熱するオートクレーブ殺菌法や、８０～９０℃に６０～１２０分間保持することを１日１回２～３日間繰り返す間断殺菌法といった加熱殺菌法が一般に用いられる。

無菌化した懸濁液を発酵タンクに入れ、これに微生物を植菌して発酵させる。微生物の接種量は１０^７～１０^８個／ｍＬが適量である。接種量が上記の範囲より多くなっても発酵の進行時間は殆ど変わらず、一方上記の範囲より少なくなると発酵完了までに長時間を要することとなって好ましくない。

発酵温度は一般に５～５０℃の範囲、好ましくは各微生物の生育至適温度である２０℃～４０℃（例えば、乳酸菌であれば３０℃～４０℃、酵母であれば２５℃～３０℃）の範囲である。発酵日数は、至適温度に於いて一般に１～１０日、好ましくは２～５日の範囲である。発酵日数が上記の一般的範囲より短くなると発酵が十分に行われず発酵物の有効性が低下する傾向にあり、一方１０日を越えて長くしても有効性のそれ以上の上昇は認められないだけでなく、着色や発酵臭の増加が生ずることとなっていずれも好ましくない。

発酵物を調製する際には、対象使用部位の成分が乳酸菌又は酵母の資化源としてより有効に利用されるようにするため、それらの植菌前又は同時に前記の懸濁液又は抽出物溶液に対して、酸、アルカリ又は酵素（糖分解酵素、繊維分解酵素、タンパク質分解酵素又は脂肪分解酵素等）による加水分解処理を行ってもよい。

上述のように調製した抽出物、加水分解物又は発酵物は、一般にはｐＨを３～９に調製した上で、これをそのままの状態で使用しても良く、又減圧濃縮等により所望の濃度として使用しても良い。また、スプレードライ法等の常法により乾燥物としても良い。

また、上述のように調製した抽出物、加水分解物又は発酵物は、保存安定性等を高めるために、一定時間冷蔵保存した上で、上清を使用しても良い。

本発明に係る酵母培養物抽出物或いはその濃縮物又は乾燥物と上記植物発酵物を組み合わせた組成物は、皮膚外用剤（化粧料、医薬部外品、外用医薬品）に配合することができる。皮膚外用剤としては、例えば、乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉、洗顔料、ボディシャンプー、頭皮，頭髪用シャンプー、頭髪用コンディショナー、育毛，養毛用のシャンプー又はトニック、石けん等の清浄用化粧料、さらには浴剤等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

皮膚外用剤には、本発明に係る組成物の他に、皮膚外用剤に用いられる成分、例えば油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明に係る組成物の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分を組み合わせて配合することも何ら差し支えない。

ここで、油性成分としては、例えば、ハス油、オリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米糠油、米胚芽油、ヤシ油、カミツレ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、ベルガモット油、ローズヒップ油、アラビアコーヒーノキ種子油、ランベンダー油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、バニラ油、植物由来スクワラン等の植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油等の動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリン等のロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン等の炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、エイコセン酸等の脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、イソオクタン酸セチル、２－エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）等の合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。

また、界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α－スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩等のアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級～第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２－アルキル－１－アルキル－１－ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ，Ｎ－ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩等のカチオン界面活性剤；Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－アルキル－Ｎ－カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリアルキル－Ｎ－アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ－アシルアミドプロピル－Ｎ′，Ｎ′－ジメチル－Ｎ′－β－ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタイン等の両性界面活性剤等を使用することができる。

また、乳化剤又は乳化助剤としては、酵素処理ステビア等のステビア誘導体、サポニン又はその誘導体、カゼイン又はその塩（ナトリウム等）、糖と蛋白質の複合体、ショ糖又はそのエステル、ラクトース、大豆由来の水溶性多糖、大豆由来蛋白質と多糖の複合体、ラノリン又はその誘導体、コレステロール、ステビア誘導体（ステビア酵素発酵物等）、ケイ酸塩（アルミニウム、マグネシウム等）、炭酸塩（カルシウム、ナトリウム等）、サポニン及びその誘導体、レシチン及びその誘導体（水素添加レシチン等）、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀等）等を配合することもできる。

また、保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン・メタクリル酸ブチル共重合体液等があり、さらにトレハロース等の糖類、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体等）、チューベロース多糖体、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、ＮＭＦ関連物質、加水分解コンキオリン、加水分解シルク、スフィンゴモナス培養物、スフィンゴ糖脂質、セラミド、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、海藻抽出物、柑橘系由来のフラボノイド又はその配糖体、シラン根（白及）抽出物、各種アミノ酸及びそれらの誘導体が挙げられる。

また、増粘剤としては、例えば、アルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン等の褐藻、緑藻又は紅藻由来成分；シラン根（白及）抽出物；ペクチン、ローカストビーンガム、アロエ多糖体、アルカリゲネス産生多糖体等の多糖類；キサンタンガム、トラガントガム、ローストビーンガム、グアーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、マスチック樹脂、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体；ポリグルタミン酸及びその誘導体等が挙げられる。

また、防腐・殺菌剤としては、例えば、尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャマール（イミダゾデイニールウレア）、ポリリン酸、プロパンジオール、１，２－ペンタンジオール、各種精油類、樹皮乾留物、大根発酵液、サトウキビ等の植物由来のエタノール又は１，３－ブチレングリコール等がある。

また、粉体成分としては、例えば、セリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビ等）のパウダー、豆類（大豆、小豆等）のパウダー等がある。

また、紫外線吸収剤としては、例えば、パラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２－エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２，４－ジヒドロキシベンゾフェノン、２－ヒドロキシ－４－メトキシベンゾフェノン－５－スルホン酸塩、４－ターシャリーブチル－４－メトキシベンゾイルメタン、２－（２－ヒドロキシ－５－メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。

また、消泡剤とは、例えば、エタノール、イソプロパノール、ジシロキサン、ジメチルポリシクロサン、ジメチコンケイ酸シリカ、トリシロキサン、シリル化シリカ、ジメチコン、トリメチルシロキシケイ酸、ＤＰＧイソボルニルエーテル等がある。

また、抗酸化剤としては、例えば、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ムラサキシキブの抽出物、シラン根の抽出物、シャクヤク抽出物、ビタミンＥ及びその誘導体（例えば、ビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等）等がある。

また、キレート剤としては、例えば、エチレンジアミンヒドロキシエチル三酢酸三ナトリウム、エデト酸又はその塩類、グルコン酸、フィチン酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、ヒドロキシエタンジホスホン酸四ナトリウム等がある。

また、ｐＨ調整剤としては、例えば、クエン酸又はその塩類、乳酸又はその塩類、グリコール酸、コハク酸、塩酸、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等がある。

次に、製造例、試験例及び実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下において、部はすべて重量部を、また、％はすべて重量％を意味する。

製造例１．酵母培養物抽出物の調製（１）
滅菌したＧＰ液体培地2700gに、予め同培地で培養しておいたササユリ由来の酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）の前培養液300gを添加し、30℃で通気しながら24時間培養した培養した。加熱殺菌した後、水酸化ナトリウム水溶液でpH8.5に調整し、3時間、攪拌しながら90℃で加熱処理した。この液をpH調整した後、濾過し1610gの酵母培養液抽出物を得た（固形分濃度1.13％）。

製造例２．酵母培養物抽出物の調製（２）
滅菌したＧＰ液体培地2700gに、予め同培地で培養しておいたササユリ由来の酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）の前培養液300g添加し、30℃で通気しながら24時間培養した。加熱殺菌した後、塩酸水溶液でpH2.5に調整し、3時間、攪拌しながら90℃で加熱処理した。この液をpH調整した後、濾過し1215gの酵母培養液抽出物を得た（固形分濃度1.07％）。

製造例３．酵母培養物抽出物の調製（３）
滅菌したＧＰ液体培地2700gに、予め同培地で培養しておいたササユリ由来の酵母（サッカロマイセス・セレビシエ）の前培養液300g添加し、30℃で通気しながら24時間培養した。加熱殺菌した後、3時間、90℃で加熱処理した。この液をpH調整した後、濾過し1540gの酵母培養液抽出物を得た（固形分濃度0.62％）。

製造例４．酵母培養物抽出物の調製（４）
製造例１で示した方法で作製した酵母培養液抽出物を濃縮し、酵母培養液抽出物粉末を17g得た。これに水を少量加え溶解した後、少量のエタノール、及びD-マンニット833gを加え、撹拌しながら真空乾燥し、D-マンニット賦形化酵母培養液抽出物粉末850gを得た。

製造例５．ハス種子発酵物
ハスの種子（渋皮を除去したもの）100gを粉砕し、精製水1900gを加えて懸濁液を調製し、加熱殺菌した。この懸濁液に乳酸菌（ラクトバチルスプランタラム）を10⁸個／ｍＬ接種し、窒素気流下に37℃で3日間静置培養した。培養終了後加熱殺菌し、培養液をろ過して、ハス種子の乳酸菌発酵物溶液1415g（固形分濃度2.53％）を得た。

製造例６．ヤブカンゾウ花発酵物
ヤブカンゾウの花部（蕾及び花弁を含む）の細切物150gに精製水1500gを加えて混合し、40℃で3時間抽出処理を行った。次に、抽出懸濁液を加熱殺菌後、酵母（サッカロミセスセレビシエ）を10⁸個／ｍＬ接種し、窒素気流下に30℃で3日間静置培養した。培養終了後加熱殺菌し、培養液をろ過して、脱臭、脱色処理を行い、褐色透明の酵母発酵物溶液1110g（固形分濃度4.0％）を得た。これを精製水で3倍に希釈し、酵母発酵物溶液とした。

実施例１．組成物の調製
製造例１の抽出物溶液、製造例５の発酵物溶液及び製造例６の発酵物溶液を等量混合後、不溶物を濾過し、褐色透明の抽出物溶液混合溶液2920ｇを得た（固形分濃度2.53％）。

上述のように調整した実施例１に係る組成物を本発明試料１として以下の通り有効性を評価した。また、本発明試料１の比較試料として、製造例１の酵母培養抽出物を比較試料１として、製造例５のハス種子発酵物を比較試料２として、製造例６のヤブカンゾウ花部の発酵物を比較試料３として使用した。

試験例１．表皮細胞ＳＣＦ合成抑制効果
正常ヒト皮膚由来表皮細胞（NHEK）を、HuMedia KG2培地（クラボウ社製）を入れた９６穴マイクロプレートに8×10³個／穴播種し、37℃，5.0％CO₂の条件下に１日間プレ培養した後、試料溶液として本発明試料１、比較試料１～３を含むHuMedia KG2培地を添加した。ここで、各試料の濃度は培地中の溶液としての終濃度が1.2％となるように調整した。その後、培養器底面からＵＶ－Ｂランプ（Philips社製TL20W/12RS）を用いて約10mJ/cm²の紫外線照射を行い、同条件でさらに２日間培養した。
細胞膜上に発現したＳＣＦの判定は以下の様にして行った。すなわち、培養上清を除去・洗浄後、細胞を固定し、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）ラベルされた抗ＳＣＦ抗体を用いて細胞膜表面上のＳＣＦの検出を行った。検出結果は、基質とＨＲＰの反応によって得られた反応溶液の450nmにおける吸光度を測定し、ＳＣＦ量とした。また、比較のために、上記試料溶液を含まない培地で細胞を培養したコントロール区も設定し、紫外線照射したコントロール（ＵＶ照射control）と、ＵＶ未照射のコントロール（ＵＶ未照射control）についても、ＳＣＦ量を測定した。結果は、ＵＶ照射コントロールでのＳＣＦ値を100％として相対値で示した。

試験例1の結果を図１に示す。
図１に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、比較試料１～３と比較して、格段にすぐれたＳＣＦ合成抑制効果を有することが確認された。ＳＣＦは表皮細胞の表面で発現するタンパク質であり、これがメラノサイトの受容体と結合するとメラニンの合成が促進されることから、本発明に係る組成物はＳＣＦ合成を抑制することで、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。

試験例２．プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）抑制効果試験
正常ヒト表皮細胞（NHEK）を、専用培地Humedia-KG2（クラボウ社製）に懸濁して96ウェルプレートに4×10³個／穴播種し、37℃で１日間培養した後、培地に本発明に係る組成物（本発明試料１）を試料溶液として、当該培地の全量に対して溶液としての最終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるように添加し、さらに24時間培養した。次に培養器の底面から100ｍJ／cm²の紫外線Ｂ波を照射し、さらに２日間培養後、培養上清に分泌されたＰＧＥ２の量を、ＰＧＥ２測定キット（カイマンケイミカル社製）を用いて測定した。なお、比較のために、上記試料溶液に代えてＰＢＳ（－）を添加し、かつ、紫外線を照射したコントロール（ＵＶ照射control）と、上記試料溶液に代えてＰＢＳ（－）を添加し、かつ、紫外線を照射しない未照射コントロール（ＵＶ未照射control）も設定した。試験結果の値は、ＵＶ照射controlでのＰＥＧ２量を100としたときのＵＶ未照射control区と各試料添加区でのＰＥＧ２量の相対値を求め、各値をＰＧＥ２合成率（％）とした。

試験例２の結果を図２に示す。
図２に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたプロスタグランジンＥ２抑制効果を有することが確認された。プロスタグランジンは、色素細胞におけるメラニンの合成を刺激する炎症因子であることから、本発明に係る組成物は、プロスタグランジンＥ２を抑制することで、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。

試験例３．チロシナーゼ活性抑制試験
正常ケラチノサイトNHEKを、Humedia KG2培地（クラボウ社製）を入れた24ウェルプレートに6×10⁴個／穴播種し、翌日上清をＰＢＳ(－)に交換して紫外線照射（50mJ/cm²）を行った。紫外線照射後、上清をHumedia KB2培地（クラボウ社製）に交換し、培養を継続した。次に培養１日後の培養上清を分取した（紫外線照射上清）。また、比較として紫外線照射を行わない区を設定し、その他の操作は同様に行った区の培養上清も分取しておいた（紫外線未照射上清）。
一方、正常メラノサイトNHEMを、DermaLife培地（クラボウ社社製）を入れた96穴マイクロプレートに5×10³個／穴播種し、37℃，5.0％CO₂の条件下に１日間プレ培養した後、本発明に係る組成物（本発明試料１）を試料溶液として、当該培地の全量に対して溶液としての最終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるように添加し、さらに上記ケラチノサイトの紫外線照射上清も添加した。３日間培養後上清を捨て、ＰＢＳ(－)で1回洗浄後、界面活性剤（Triton X-100）と5mM Ｌ－ドーパ溶液を添加して37℃で反応を行った後、マイクロプレートリーダー（Model 450、バイオラッド社製）を用い、波長490nmでドーパ値を測定した。なお、比較のために、上記試料溶液に代えてＰＢＳ（－）を添加し、かつ、紫外線を照射した上清を用いるコントロール（ＵＶ照射control）と、上記試料溶液に代えてＰＢＳ（－）を添加し、かつ、紫外線未照射の上清を使用するコントロール（ＵＶ未照射control）も設定した。試験結果の値は、ＵＶ照射controlでドーパ値を１００としたときのＵＶ未照射control区と各試料添加区でのドーパ値の相対値を求め、各値をチロシナーゼ活性率（％）とした。

試験例３の結果を図３に示す。
図３に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたチロシナーゼ活性抑制効果を有することが確認されたことから、本発明に係る組成物組成物は、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。

試験例４．遺伝子解析
線維芽細胞NB1RGBを２４ウェルプレートに6×10⁴個／穴播種した。24時間培養後、本発明に係る組成物（本発明試料１）を試料溶液として添加し、底面より紫外線照射を行った。さらに２４時間培養を行った。ここで、本発明試料１は、溶液としての最終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるように添加した。その後、それぞれの試験区の細胞をＴｒｉｚｏｌ試薬（Invitrogen社製）500μLで回収した。回収した細胞に対してクロロホルム100μL添加して撹拌混合し12,500rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離した後、水層のみを200μL分取した。回収した水層にイソプロパノール250μLを添加して撹拌混合し、12,500rpm、4℃の条件下で10分間遠心分離してtotalＲＮＡの沈殿物を得た。totalＲＮＡに75％冷エタノールを1mL添加して撹拌して洗浄し、12,500rpm、4℃条件下で10分間遠心分離して沈殿を回収した。回収したtotal ＲＮＡを所定のキット（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Erase (Perfect Real Time)（タカラバイオ社製））を用いて逆転写反応し、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡをサンプルとして、Thermal Cycler Dice Real Time System Single（タカラバイオ社製）、及びＳＹＢＲ Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)［タカラバイオ社製］を用いて、ターゲット遺伝子の発現と、内部標準物質βアクチン遺伝子の発現の検出を行った。試験結果は、βアクチン遺伝子の発現量に対するターゲット遺伝子の相対発現量を算出した。本試験例４では、ヘパラン硫酸プロテオグリカン遺伝子（HSPG）の発現と、Hepatocyte Growth Factor (HGF)遺伝子の発現を評価した。

試験例４の結果を図４と図５に示す。
図４に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、紫外線によって発現低下するHSPG遺伝子に対して、濃度依存的に格段にすぐれたＨＳＰＧ遺伝子の発現亢進効果を有することが確認された。ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、真皮からのメラニン合成刺激物質をブロックする役割が知られていることから、本発明に係る組成物組成物は、ＨＳＰＧ遺伝子の発現を亢進することで、基底膜を健全に保ち、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。

また、図５に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたＨＧＦ遺伝子発現抑制効果を有することが確認された。ＨＧＦはメラニン合成刺激物質であることから、本発明に係る組成物組成物は、ＨＧＦ遺伝子の発現を抑制することで、格段にすぐれた美白効果を発揮することが示唆される。

試験例５．ＳＯＤ様作用の評価試験
1Mトリス－塩酸緩衝液0.15mL、1mM エチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩溶液0.30mL、1mM キサンチン溶液0.30mL、0.75mM ニトロブル-テトラゾリウム溶液0.20mL、本発明に係る組成物（本発明試料１）0.10mL及び精製水1.90mLを混合して試験溶液を調製した。本発明試料１の濃度は、試験溶液中の溶液としての終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるように調製した。また、試験溶液において、本発明試料１に代えて30％ 1,3－ブチレングリコール0.10mLを用いる他は上記試験溶液と同様の組成からなる混合液（コントロール）を調製した。又試験液において本発明試料１（0.10mL）に代えて、0.875Unit／mLのスーパーオキシドジスムターゼ溶液0.10mLを用いる他は上記試験溶液と同様の組成からなる混合液（陽性対照）を調製した。
上記試験溶液、又は試料無添加の混合液をそれぞれ37℃でインキュベートした後、これに1Unit／mL キサンチンオキシダーゼ溶液0.05mLを添加し、一定時間経過後（５分）、各被験液の570nmにおける吸光度（被験液中のスーパーオキシドアニオン量の指標）を測定した。結果は、コントロールの混合液の吸光度を100とした時の各試験溶液の吸光度の相対値（％）で示した。

試験例５の結果を図６に示す。
図６に示すように、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたＳＯＤ様活性を有することが確認された。

試験例６．糖化抑制効果の評価試験
本試験では、グルコースを介したＢＳＡ（アルブミン）の蛍光の発生により、ＡＧＥの発生抑制効果、すなわち、タンパク質糖化抑制効果を評価した。まず、本発明に係る組成物（本発明試料１）40μLと、50mg／mLのＢＳＡ水溶液40μLと、2.5Ｍのグルコース水溶液40μLと、ＰＢＳ（－）溶液80μLを混合、攪拌して試料溶液を調製した。試料溶液は本発明試料１の終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％となるようにとなるよう調製した。次に、試料溶液を50℃で7日間静置し、7日後、各試料溶液について、蛍光発生（励起：355nm、放射：460nm：蛍光マイクロプレートリーダー（フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製））を測定した。また、本発明試料１に代えて30％の1,3－ブチレングリコール溶液を用いた試料無添加（コントロール）の場合について同様の操作を行い、ここで得られた蛍光測定値に対する各試料溶液の蛍光測定値の相対値（％）を求め、タンパク質糖化率（％）とした。

試験例６の結果を図７に示す。
図７に示す通り、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれた糖化抑制効果を有することが確認された。

試験例７．メラノサイトのETBR合成抑制効果の評価試験
試験例７では、メラノサイトの刺激因子として知られるエンドセリン-1（ET-1）の受容体であるETBRの合成抑制効果を評価する。
正常ヒト表皮メラニン細胞を増殖添加剤含有DermaLife(登録商標)[クラボウ社製]にて96穴マイクロプレートに1×10⁴個/穴播種し、37℃，5.0％CO₂の条件下に１日間プレ培養した後、本発明に係る組成物（本発明試料１）を規定の濃度（溶液としての終濃度が0.3％，0.45％，0.6％，0.9％，1.2％）となるように調整した(登録商標)[クラボウ社製]を添加した。その後、培養器底面からUV-Bランプ（Philips社製TL20W/12RS）を用いて約15ｍJ/cm2の紫外線照射を行った。その後同条件でさらに2日間培養した。その後ETBR抗体を用いた免疫的検出を行った。すなわち、PBS(-)洗浄後、15％中性緩衝ホルマリン液を用いて細胞を30分処理して固定、0.2％Triton X-100溶液で1時間浸透処理、5倍希釈ブロッキングワンP（ナカライテスク社）溶液で2時間処理によるブロッキングを行った後、ETBR抗体を添加し、4℃で一昼夜静置した。その後PBS(-)洗浄し、蛍光ラベルした二次抗体を添加してさらに暗所で一定時間静置した。そのPBS(-)後洗浄し、蛍光強度の測定を行った。先ず二次抗体の蛍光ラベル（Alexa Fluor546）をEx=544nm、Em=590nmで測定し（蛍光マイクロプレートリーダー（フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製））、その後、Hoechst33342によるDNA染色を行い、Ex=355nm、Em=460nmの測定を行った。それぞれの試験区のAlexa Fluor546の蛍光強度をHoechst33342の蛍光強度で割ることで、ETBRの生成度合いを求めた。試料溶液に代えてPBS(-)を添加した試料無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作を行い、紫外線照射した区のETBR生成度合いに対する各試料添加時のETBR生成度合いの相対値を求め、ETBR生成量（％）とした。

試験例７の結果を図８に示す。図８に示す通り、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたメラノサイトのETBR合成抑制効果を有することが確認された。これにより、エンドセリンによる刺激が伝わりにくくなることで、エンドセリンによるメラニン合成を抑制し、色素沈着を防ぐ効果につながる。

試験例８．メラノサイトのMC1R合成抑制評価試験
試験例８では、メラノサイト刺激ホルモンであるαMSHの受容体MC1Rの合成抑制効果を評価した。
正常ヒト表皮メラニン細胞を増殖添加剤含有DermaLife(登録商標)[クラボウ社製]にて96穴マイクロプレートに1×10⁴個/穴播種し、37℃，5.0％CO₂の条件下に１日間プレ培養した後、試料溶液を規定の濃度（溶液として）となるように調整したDermaLife(登録商標)[クラボウ社製]を添加した。その後、培養器底面からUV-Bランプ（Philips社製TL20W/12RS）を用いて約15ｍJ/cm2の紫外線照射を行った。その後同条件でさらに2日間培養した。その後MC1R抗体を用いた免疫的検出を行った。すなわち、PBS(-)洗浄後、15％中性緩衝ホルマリン液を用いて細胞を30分処理して固定、0.2％Triton X-100溶液で１時間浸透処理、５倍希釈ブロッキングワンP（ナカライテスク社）溶液で2時間処理によるブロッキングを行った後、MC1R抗体を添加し、4℃で一昼夜静置した。その後PBS(-)洗浄し、蛍光ラベルした二次抗体を添加してさらに暗所で一定時間静置した。そのPBS(-)後洗浄し、蛍光強度の測定を行った。先ず二次抗体の蛍光ラベル（Alexa Fluor546）をEx=544nm、Em=590nmで測定し（蛍光マイクロプレートリーダー（フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製））、その後、Hoechst33342によるDNA染色を行い、Ex=355nm、Em=460nmの測定を行った。それぞれの試験区のAlexa Fluor546の蛍光強度をHoechst33342の蛍光強度で割ることで、MC1Rの生成度合いを求めた。試料溶液に代えてPBS(-)を添加した試料無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作を行い、紫外線照射した区のMC1R生成度合いに対する各試料添加時のMC1R生成度合いの相対値を求め、MC1R生成量（％）とした。

試験例８の結果を図９に示す。図９に示す通り、本発明に係る組成物（本発明試料１）は、濃度依存的に格段にすぐれたメラノサイトのMC1R合成抑制効果を有することが確認された。これにより、αＭＳＨによる刺激が伝わりにくくなることで、αＭＳＨによるメラニン合成を抑制し、色素沈着を防ぐ効果につながる。

処方例１．化粧水
［成分］部
ホホバ油１．０
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール５．０
メチルパラベン０．１
製造例１の酵母培養物抽出物１．０
製造例５の発酵物１・０
製造例６の発酵物１・０
グリセリン５．０
１，３－ブチレングリコール５．０
クエン酸ナトリウム０．２
精製水全量が１００部となる量

処方例２．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の酵母培養物抽出物に代えて、製造例２の酵母培養物抽出物１．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例３．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の酵母培養物抽出物に代えて、製造例３の酵母培養物抽出物２．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例４．乳液
［成分］部
スクワラン５．０
ヘキサラン３．０
ホホバ油１．０
ツバキ油１．５
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート１．０
親油型ステアリン酸グリセリル１．０
水添大豆レシチン１．５
製造例１の酵母培養物抽出物０．５
製造例５の発酵物０．５
製造例６の発酵物０．５
グリセリン３．０
１，３－ブチレングリコール２．０
カルボキシメチルセルロース０．３
キサンタンガム０．２
ヒアルロン酸ナトリウム０．０１
精製水全量が１００部となる量

処方例５．クリーム
［成分］部
オリーブ油５．０
ホホバ油５．０
スクワラン５．０
ベヘニルアルコール２．０
パルミチン酸２．５
製造例２の酵母培養物抽出物粉末０．５
製造例５の発酵物０．５
製造例６の発酵物０．５
乳酸菌発酵米２．０
水素添加レシチン０．５
カルボキシビニルポリマー０．３
アルギン酸ナトリウム０．２
海藻抽出物２．０
メチルパラベン０．１５
エチルパラベン０．０３
精製水全量が１００部となる量

処方例７．リキッドファンデーション
［成分］部
ステアリン酸２．４
モノステアリン酸プロピレングリコール２．０
セトステアリルアルコール０．２
液状ラノリン２．０
流動パラフィン３．０
ミリスチン酸イソプロピル８．５
プロピルパラベン０．０５
製造例３の酵母培養物抽出物粉末０．５
製造例５の発酵物０．５
製造例６の発酵物０．５
カルボキシメチルセルロースナトリウム０．２
ベントナイト０．５
プロピレングリコール４．０
トリエタノールアミン１．１
メチルパラベン０．１
酸化チタン８．０
タルク４．０
着色顔料適量
精製水全量が１００部となる量

処方例８．ボディシャンプー
［成分］部
Ｎ－ラウロイルメチルアラニンナトリウム２５．０
ヤシ油脂肪酸カリウム液（４０％）２６．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド３．０
メチルパラベン０．１
製造例１の酵母培養物抽出物粉末０．５
製造例５の発酵物０．５
製造例６の発酵物０．５
１，３－ブチレングリコール２．０
精製水全量が１００部となる量

処方例９．ヘアシャンプー
［成分］部
Ｎ－ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム１０．０
ポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸ナトリウム２０．０
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン１０．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド４．０
メチルパラベン０．１
クエン酸０．１
製造例１の酵母培養物抽出物粉末０．５
製造例５の発酵物０．５
製造例６の発酵物０．５
１，３－ブチレングリコール２．０
精製水全量が１００部となる量

処方例１０．ヘアコンディショナー
［成分］部
ポリオキシエチレン（１０）硬化ヒマシ油１．０
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム１．５
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム２．０
２－エチルヘキサン酸グリセリル１．０
セタノール３．０
ステアリルアルコール１．０
メチルパラベン０．１
製造例４の酵母培養物抽出物粉末０．５
製造例５の発酵物０．５
製造例６の発酵物０．５
１，３－ブチレングリコール５．０
精製水全量が１００部となる量

処方例１１．シートマスク
不織布に下記の成分を含浸させてシートマスクを得る。
［成分］部
グリセリン３．０
１、３－ブチレングリコール２．０
メチルパラベン０．２
クエン酸０．１
クエン酸ナトリウム０．３
キサンタンガム１．０
水溶性コラーゲン１．０
ヒアルロン酸ナトリウム１．０
製造例１の酵母培養物抽出物０．５
製造例５の発酵物０．５
製造例６の発酵物０．５
精製水全量が１００部となる量

Claims

ササユリ由来酵母の培養物抽出物或いはその濃縮物又は乾燥粉末と、ハス科ハス属に属するハスの種子の乳酸菌発酵物と、ユリ科ワスレグサ属のホンカンゾウ及び／又はヤブカンゾウの花部の酵母発酵物を有効成分とする皮膚外用剤。