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JP7536188B2 - エキサテカン誘導体及びそのリンカー－ペイロードとコンジュゲート - Google Patents

エキサテカン誘導体及びそのリンカー－ペイロードとコンジュゲート Download PDF

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Description

本発明は、生物医薬品の分野に関し、特に、エキサテカン誘導体、そのリンカー－ペイロードとコンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、及びその対応する製造方法並びに使用に関する。
従来の腫瘍治療において、化学療法は、主な治療戦略の１つとなっている。しかし、正常組織における非特異的蓄積によるオフターゲット毒性、短い治療空白期間及び低い耐性は、化学療法薬物の開発を制限する。数十年以来、モノクローナル抗体及び腫瘍細胞表面特異的マーカーに結合するポリペプチドを用いた標的治療は、化学療法よりも小さい毒性を示す。しかし、それらは、いずれも腫瘍細胞を死滅させる効力が高くない。
１９７０年に、毒素を担持する抗体が標的細胞を選択的に殺傷する治療戦略は初めて見出された。腫瘍標的薬物コンジュゲートは、主に、一般的に腫瘍細胞表面抗原を特異的に識別する抗体をリンカーにより化学毒素とカップリングするＡＤＣを含み、化学毒素は、腫瘍組織を効果的に殺傷する。２０２１年まで、１２０種のＡＤＣが臨床開発中である。
大部分の細胞毒性ペイロードは、チューブリン阻害剤（メイタンシン類化合物（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）又はアウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ））、及びＤＮＡ損傷剤（主に、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ））という２つのファミリーに属する。それらは、いずれも非常に効果的な細胞毒性薬物であり、ＩＣ50（５０％細胞を抑制する抑制濃度）がナノモル及びピコモル範囲内にあるが、全身投与すれば、不利な毒性スペクトルを有する特徴がある。細胞毒性薬物をＡＤＣにコンジュゲートすることにより、それを血液に隠して腫瘍細胞に直接送達し、これにより、これらの効力のある薬物の毒性を顕著に低下させる。一般的には、治療指数が優れた薬物は、弾頭として開発することに適せず、そのＩＣ50が低すぎ、一定の量で腫瘍細胞に送達するときに機能を果たすことができないと考えられる。
いくつかのＡＤＣ研究は、ＤＡＲを増加させるか又はバイスタンダー効果を利用することに取り組むことにより、有望な新しい方法を提供し、細胞毒性が小さい薬物を弾頭として用いることができる。
これまで、ほとんどの開発された弾頭は、アウリスタチン（例えば、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ））のようなチューブリン阻害剤である。Ｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ、ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ及びｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎは、いずれも承認されたＭＭＡＥペイロードを担持するＡＤＣである。
トポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ １）阻害剤は、様々なＡＤＣの弾頭として用いられている。Ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ ｇｏｖｉｔｅｃａｎは、イリノテカンの活性代謝物ＳＮ－３８を弾頭として担持する。Ｅｎｈｅｒｔｕ（ｆａｍ－ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ（ＤＳ８２０１ａ）、Ｔ－Ｄｘｄとも呼ばれる）は、エキサテカン誘導体ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ（Ｄｘｄ）を弾頭として担持し（特許文献１）、また、最近、乳癌の治療に用いられることが承認された。これを基礎として、単独で使用してもＡＤＣの成分として使用しても、より高い活性、安定性及び物理化学的性質を有する新規な小分子トポイソメラーゼＩ阻害剤が本分野では強く要望されている。
しかし、一方では、Ｅｎｈｅｒｔｕ及び他の市販のＡＤＣと臨床試験における大部分のＡＤＣは、化学カップリングにより製造され、スルホスクシンイミド構造（スルホスクシンイミドによる連結）を使用して小分子薬物を標的抗体又はタンパク質にカップリングする。スルホスクシンイミド構造は、メルカプト基とマレイミドとが反応して形成される。スルホスクシンイミドによる連結は、不安定である。インビボで、逆Ｍｉｃｈａｅｌ付加又は他のメルカプト基との交換は、細胞毒素がＡＤＣから脱落しかつオフターゲット毒性を誘発し、それにより安全性を低下させ、臨床応用を制限する。例えば、Ｅｎｈｅｒｔｕは、効力が高いが、１０％を超える間質性肺疾患を引き起こし、これは、その一部の患者での使用を制限する。他方では、化学カップリング反応は、部位特異性ではなく、生成されたＡＤＣは、高度な異質性を示す。
より高い効力及びより低い毒性を有する新規なＡＤＣが依然として強く要望されている。
国際公開第２０１４０５７６８７号
一態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物を提供する。
Figure 0007536188000001
 ここで、
ｏｐＳｕは、
Figure 0007536188000002
 又は
Figure 0007536188000003
 であり、
Ｒ0はＣ1～10アルキル基であり、
ｎは２～２０の任意の整数であり、
ｋ１とｋ２は、独立して１～７の整数であり、
ｉは１～１００の整数であり、
ｊは１～１００の整数であり、
Ｐ１とＰ２は、独立して、式（ｉ’）に示す構造を有するペイロードであり、
Figure 0007536188000004
 ここで、
ａは０又は１であり、
ｐ１*を付けた炭素原子とｐ２*を付けた炭素原子は、それぞれ不斉中心であり、かつ前記不斉中心がＳ配置、Ｒ配置又はラセミ化されたものであり、
Ｌ1は、Ｃ1～6アルキレン基から選択され、未置換であるか、又はハロゲン、－ＯＨ及び－ＮＨ2から選択される１つの置換基によって置換されており、
Ｍは－ＣＨ2－、－ＮＨ－又は－Ｏ－であり、
Ｌ2はＣ1～3アルキレン基であり、
Ｒ1とＲ2は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1～6アルキル基、ハロゲン及びＣ1～6アルコキシ基から選択される。
第２の態様では、本発明は、式（ＩＩ）に示す構造を有するコンジュゲートを提供する。
Figure 0007536188000005
 ここで、
（Ａ）は、抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは修飾されることで式（Ｉ）の化合物における（Ｇｌｙ）n部分に結合し、
ｚは１～２０の整数であり、好ましくは１～４であり、特に２であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｒ0、ｏｐＳｕ、ｎ、ｋ１、ｋ２、ｉ及びｊは、式（Ｉ）で定義されているとおりである。
第３の態様では、本発明は、本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容される少なくとも１種の担体と、を含む医薬組成物を提供する。
第４の態様では、本発明は、本発明のコンジュゲート又は医薬組成物の、疾患を治療するための薬物の製造における使用を提供し、前記疾患は、腫瘍又は自己免疫疾患であり、好ましくは、ＨＥＲ２－陽性腫瘍細胞を含む腫瘍である。
第５の態様では、本発明は、式（ｉ）に示す構造を有する化合物を提供する。
Figure 0007536188000006
 ここで、
ａ、ｐ１*を付けた炭素原子、ｐ２*を付けた炭素原子、Ｌ1、Ｍ、Ｌ2、Ｒ1及びＲ2は、式（Ｉ）で定義されているとおりである。
第６の態様では、本発明は、式（１）の化合物を提供する。
Figure 0007536188000007
 ここで、ｋは１～７の整数であり、好ましくは１又は３又は５であり、特に５であり、
Ｐは、式（ｉ′）に示す構造を有するペイロードであり、式（ｉ′）に示す構造は、式（Ｉ）で定義されているとおりである。
コンジュゲートのＨＥＲ２高発現細胞株ＳＫ－ＢＲ－３における効力を示す図である。 コンジュゲートのＨＥＲ２高発現細胞株ＮＣＩ－Ｎ８７における効力を示す図である。 コンジュゲートのＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８における効力を示す図である。 コンジュゲートのＳＫ－ＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８共培養システムにおける効力を示す図である。図４ａは、ＧＦＰ蛍光検出の結果を示す図である。図４ｂは、ルシフェラーゼ基質化学発光検出の結果を示す図である。図４ａ及び図４ｂにおいて、左から右へとそれぞれＣＨ－２－５８９、ＣＨ－２－５９３、ＣＨ－２－５１８、ＬＣ１１８４（８）及びＬＣ３０２－２－４（４）である。 ＧＦＰ蛍光検出に合格するＳＫ－ＢＲ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８共培養システムにおけるコンジュゲートの効力を示す図である。 コンジュゲートを５ｍｇ／ｋｇ投与したＳＣＩＤ ＢｅｉｇｅマウスＪＩＳ １ ＣＤＸモデルの平均腫瘍体積の経時変化を示す図である。 コンジュゲートを５ｍｇ／ｋｇ投与したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＣａｐａｎ－１ ＣＤＸモデルの平均腫瘍体積の経時変化を示す図である。 コンジュゲートを５ｍｇ／ｋｇ投与したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＣａｐａｎ－１ ＣＤＸモデルの平均腫瘍体積及び体重の経時変化を示す図である。 コンジュゲートを５ｍｇ／ｋｇ投与したＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＮＣＩ－Ｎ ８７ ＣＤＸモデルの平均腫瘍体積及び体重の経時変化を示す図である。 ヒト血清に混合して０、２４、４８及び９６時間インキュベートした後のコンジュゲートのインビトロ血清安定性を示す図である。
以下、具体的な実施形態を参照して本発明の技術的内容を説明する。当業者であれば、本発明の他の利点及び効果を明細書に開示された内容から容易に理解することができる。本発明は、さらに他の異なる具体的な実施形態により実施又は適用することができる。当業者であれば、本発明の精神から逸脱することなく、様々な修正及び変更を行うことができる。
定義
特に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される技術は、本分野で一般的に理解される技術を指し、当業者にとって明らかな変形及び等価置換を含む。以下の用語は当業者が容易に理解できるものであると考えられるが、本発明をよりよく説明するために、以下の定義を説明する。本明細書に商品名が記載されている場合、対応する商品又はその活性成分を指す。本明細書に引用される全ての特許、開示されている特許出願及び出版物は、いずれも参照により本明細書に組み込まれる。
量、濃度、若しくは他の値、又はパラメータが範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値及び好ましい下限値として示されている場合、これは、具体的には、範囲が個別に開示されているか否かに関係なく、一対の上限範囲又は好ましい値及び下限範囲又は好ましい値から形成される全ての範囲を開示していると理解すべきである。数値の範囲が本明細書で開示されている場合、特に明記しない限り、範囲はそれの端点のほか、範囲内の全ての整数、及び分数（小数）を含むことが意図されている。例えば、「ｉが１～２０の整数である」という表現は、ｉが１～２０の任意の整数であることを表し、例えば、ｉが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であってもよい。他の類似の表現、例えばｊ、ｋ及びｇも同様に理解されるべきである。
文脈が明らかに別の意味を示さない限り、「１種（個）」及び「該種（個）」などの単数形は、複数形を含む。「１種（個）又は複数種（個）」又は「少なくとも１種（個）」という表現は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上を表すことができる。
可変数値と共に使用される場合、「およそ」又は「約」という用語は、通常、変数の値、及び変数の全ての値が実験誤差内（例えば、平均の９５％信頼区間内）若しくは具体的な値の±１０％内の、又はそれより広い範囲にあることを意味する。
「好ましくは」又は「任意選択」という用語は、後で説明する事象が発生する可能性があるが、必ずしも発生しないことを意味し、そのような説明には、事象又は状況が発生するか又は発生しない状況が含まれる。
「備える」、「含む」、「含有する」、「有する」という表現は、非限定的であり、他の列挙されていない要素、ステップ又は成分を排除しない。「．．．からなる」という表現は、列挙されていない要素、ステップ又は成分を排除する。「．．．から実質的になる」という表現は、範囲が、特許請求される主題の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を与えない任意の要素、ステップ又は成分と共に、特定の要素、ステップ又は成分に限定されることを意味する。「備える」という表現は、「…から実質的になる」及び「…からなる」という表現を含むことを理解されたい。
本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、最も広い意味で使用されており、それらが所望の生物活性を示す限り、特に完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異的抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）及び抗体断片を含む。抗体は、任意のサブタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）又はサブクラスであってもよく、かつ任意の適切な種に由来することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト又はマウス由来のものである。抗体は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体又は組換え方法により製造されたキメラ抗体であってもよい。
本明細書で使用されるモノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能な天然で生じる突然変異の場合を除き同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して高特異的である。「モノクローナル」という用語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示すものであり、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要すると解釈されるべきではない。
完全抗体又は全長抗体は、基本的に抗原結合可変領域及び軽鎖定常領域（ＣＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、抗体のサブタイプに応じて、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４を含んでもよい。抗原結合可変領域（断片可変領域とも呼ばれ、Ｆｖ断片）は、一般的に軽鎖可変領域（ＶL）及び重鎖可変領域（ＶH）を含む。定常領域は、天然配列を有する定常領域（例えば、ヒト天然配列を有する定常領域）又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。可変領域は、標的抗原を認識してそれと相互作用する。定常領域は、免疫システムに認識されてそれと相互作用することができる。
抗体断片は、完全な抗体の一部、好ましくは、その抗原結合領域又は可変領域を含んでもよい。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、ＶH及びＣＨ１ドメインで構成されたＦｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片及び分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。Ｆａｂ断片は、パパインにより全長免疫グロブリンを消化して得られた抗体断片、又は例えば、組換え発現により生成された同じ構造を有する断片である。Ｆａｂ断片は、軽鎖（ＶL及びＣＬを含む）及び他の鎖を含み、上記他の鎖は、重鎖の可変領域（ＶH）及び重鎖の１つの定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ′）２断片は、ｐＨ ４．０～４．５でペプシンにより免疫グロブリンを消化して得られた抗体断片、又は例えば、組換え発現により生成された同じ構造を有する断片である。Ｆ（ａｂ′）２断片は、基本的に２つのＦａｂ断片を含み、各重鎖部分は、いくつかの追加のアミノ酸を含み、２つの断片を連結するジスルフィド結合を形成するシステインを含む。Ｆａｂ′断片は、Ｆ（ａｂ′）２断片の片方（重鎖１つ及び軽鎖１つ）を含む断片である。上記抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合及び／又はペプチドリンカーにより連結している複数の鎖を含んでもよい。抗体断片の例は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、Ｆｄ及びＦｄ′断片、並びに修飾断片を含む他の断片をさらに含む。抗体断片は、一般的に少なくとも又は約５０個のアミノ酸を含み、一般的に少なくとも又は約２００個のアミノ酸を含む。抗原結合断片は、抗体フレームワークに挿入される場合（例えば、対応する領域を置換することにより）に、抗原に免疫特異的に結合する抗体を取得することができる任意の抗体断片を含んでもよい。
本発明の抗体は、本分野で周知の技術、例えば、以下の技術又はそれらの組み合わせを用いて製造することができる。組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術又は本分野の既知の他の技術である。例えば、遺伝子組換え抗体（又は抗体アナログ）は、適切な培養システム（例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）又は哺乳動物細胞）により発現することができる。前記操作は、例えば、その末端にリガーゼ特異的認識配列を導入することを指すことができる。
ＨＥＲ２は、ヒト上皮成長因子アクセプター－２を指し、上皮成長因子（ＥＧＦＲ）アクセプターチロシンキナーゼファミリーに属する。本願において、用語ＥｒｂＢ２とＨＥＲ２は、同じ意味を有し、かつ交換して使用することができる。
本明細書で使用されるように、用語「抗体－薬物コンジュゲート」は、「コンジュゲート」と呼ばれる。
小分子化合物とは、一般的に薬物に用いられる有機分子に相当する大きさを有する分子を指す。該用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を含まないが、低分子量ペプチド又はその誘導体、例えば、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチドなどを含む。一般的に、小分子化合物の分子量は、例えば、約１００～約２０００Ｄａ、約２００～約１０００Ｄａ、約２００～約９００Ｄａ、約２００～約８００Ｄａ、約２００～約７００Ｄａ、約２００～約６００Ｄａ、約２００～約５００Ｄａであってよい。
「スペーサー（ｓｐａｃｅｒ）」とは、異なる構造モジュールの間に位置し、空間から構造モジュールを隔てることができる構造を指す。スペーサーの定義は、一定の機能を有するか否かを限定するものではなく、インビボで切断されるか又は分解されるか否かを限定するものではない。スペーサーの例は、アミノ酸及び非アミノ酸構造を含むがこれらに限定されず、非アミノ酸構造は、アミノ酸誘導体又は類似体であってもよいがこれらに限定されない。「スペーサー配列（Ｓｐａｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、スペーサーとするアミノ酸配列を指し、その例は、単一のアミノ酸、複数のアミノ酸を含有する配列を含むがそれらに限定されず、例えば、ＧＡなどのような２つのアミノ酸を含有する配列、又は例えば、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳなどを含む。自壊性スペーサーは、共有結合アセンブリであるため、前駆体中の保護性部分が活性化された後に２つの化学結合が連続的に分解し、保護性部分（例えば、切断可能な配列）が活性化された後に除去され、カスケード型分解反応が発生することにより、優先順位に応じてより小さい分子が放出される。自壊性スペーサーの例は、例えば、ＰＡＢＣ（ｐ－ベンジルオキシカルボニル）、アセタール、ヘテロアセタール、及びこれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
用語「アルキル基」は、炭素原子及び水素原子で構成された飽和脂肪族炭化水素基を指し、単結合により分子の残りの部分に結合する。アルキル基は、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基又は環状アルキル基（シクロアルキル基）若しくは部分的環状アルキル基（例えば、シクロアルキル基－直鎖アルキル基とシクロアルキル基－分岐鎖アルキル基）を含む。アルキル基は、１～１０個の炭素原子を有してもよく、Ｃ1-10アルキル基と呼ばれ、例えば、Ｃ1～6アルキル基、Ｃ1～4アルキル基、Ｃ1～3アルキル基、Ｃ1～2アルキル基、Ｃ3アルキル基、Ｃ4アルキル基、Ｃ3～6アルキル基である。直鎖アルキル基の非限定的な例は、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを含むが、これらに限定されない。分岐鎖アルキル基の非限定的な例は、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、イソペンチル基、２－メチルブチル基、１－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、ネオペンチル基、１，１－ジメチルプロピル基、４－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２－メチルペンチル基、１－メチルペンチル基、２－エチルブチル基、１－エチルブチル基、３，３－ジメチルブチル基、２，２－ジメチルブチル基、１，１－ジメチルブチル基、２，３－ジメチルブチル基、１，３－ジメチルブチル基又は１，２－ジメチルブチル基などを含むが、これらに限定されない。
用語「環状アルキル基」と「シクロアルキル基」は、本明細書において同じ意味を有し、かつ互換して使用することができる。シクロアルキル基は、単環又は多環（例えば、２つ又はそれ以上の縮合環を有する）式基を含んでもよい。多環式シクロアルキル基において、２つ以上の環は、縮合又は架橋又はスピロ縮合されてもよい。シクロアルキル基の環を形成する炭素原子は、任意にオキソ（即ち、Ｃ（Ｏ））で置換されてもよい。シクロアルキル基は、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の環形成炭素原子（Ｃ3～10）を有してもよい。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ビシクロ［１．１．１］ペンチル基、ビシクロ［２．１．１］ヘキシル基などを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、シクロアルキル基は、Ｃ3～6単環又は二環式シクロアルキル基であり、好ましくは、Ｃ3～6単環式シクロアルキル基、特にシクロプロピル基である。
用語「部分的環状」は、該基が１つ以上の環状部分と１つ以上の非環状（即ち、直鎖又は分岐鎖）部分を含有することを指す。部分的環状アルキル基は、シクロアルキル基－直鎖アルキル基とシクロアルキル基－分岐鎖アルキル基を含んでもよい。部分的環状アルキル基は、環形成炭素原子及び非環形成炭素原子を含む４、５、６、７、８、９又は１０個の炭素原子（Ｃ3～10）を有してもよい。部分的環状アルキル基の例は、Ｃ3～9シクロアルキル基－Ｃ1アルキル基、Ｃ3～8シクロアルキル基－Ｃ2アルキル基、Ｃ3～7シクロアルキル基－Ｃ3直鎖アルキル基、Ｃ3～6シクロアルキル基－Ｃ4直鎖アルキル基、Ｃ3～5シクロアルキル基－Ｃ5直鎖アルキル基、Ｃ3～4シクロアルキル基－Ｃ6直鎖アルキル基、Ｃ3シクロアルキル基－Ｃ7直鎖アルキル基、Ｃ3～7 シクロアルキル基－Ｃ3分岐鎖アルキル基、Ｃ3～6シクロアルキル基－Ｃ4分岐鎖アルキル基、Ｃ3～5シクロアルキル基－Ｃ5分岐鎖アルキル基、Ｃ3～4シクロアルキル基－Ｃ6分岐鎖アルキル基及びＣ3シクロアルキル基－Ｃ7分岐鎖アルキル基を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、部分的環状アルキル基は、Ｃ3～9シクロアルキル基－Ｃ1アルキル基であり、好ましくは、Ｃ3～6シクロアルキル基－Ｃ1～2アルキル基、Ｃ3～6シクロアルキル基－Ｃ1アルキル基であり、より好ましくは、Ｃ3～4シクロアルキル基－Ｃ1～2アルキル基、特にＣ3～4シクロアルキル基－Ｃ1アルキル基、特にシクロプロピル基－メチル基である。
二価基とは、対応する一価基の自由価電子を有する炭素原子から１つの水素原子を除去して得られた基を指す。二価基は、分子の残りの部分に結合する２つの結合部位を有し、２つの結合部位は、上記二価基の同じ原子又は２つの異なる原子にあってもよい。
「アルキレン基（ａｌｋｙｌｅｎｅ）」又は「アルキリデン基（ａｌｋｙｌｉｄｅｎｅ）」とは、飽和二価炭化水素基を指す。アルキレン基は、直鎖、分岐鎖、環状又は部分的環状基を含む。直鎖アルキレン基の例は、メチレン基（－ＣＨ2－）、－（ＣＨ2）2－、－（ＣＨ2）3－、－（ＣＨ2）4－、－（ＣＨ2）5－、－（ＣＨ2）6－などを含むが、これらに限定されない。分岐鎖アルキレン基の例は、－ＣＨ（ＣＨ3）－、－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－、－ＣＨ（ＣＨ3）－ＣＨ2－、－ＣＨ（Ｃ3Ｈ7）－、－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－ＣＨ2－、－Ｃ（ＣＨ3）2－ＣＨ2－、－（ＣＨ（ＣＨ3））2－、－ＣＨ（ＣＨ3）－（ＣＨ2）2－、－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ3）－ＣＨ2－、－ＣＨ（Ｃ4Ｈ9）－、－Ｃ（ＣＨ3）（Ｃ3Ｈ7）－、－Ｃ（Ｃ2Ｈ5）2－、－ＣＨ（Ｃ3Ｈ7）－ＣＨ2－、－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－ＣＨ（ＣＨ3）－、－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－（ＣＨ2）2－、－ＣＨ2－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－ＣＨ2－、－Ｃ（ＣＨ3）2－（ＣＨ2）2－、－ＣＨ2－Ｃ（ＣＨ3）2－ＣＨ2－、－ＣＨ（ＣＨ3）－（ＣＨ2）3－、－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ3）－（ＣＨ2）2－、－ＣＨ（Ｃ5Ｈ11）－、－Ｃ（Ｃ2Ｈ5）（Ｃ3Ｈ7）－、－Ｃ（ＣＨ3）（Ｃ4Ｈ9）－、－ＣＨ（Ｃ4Ｈ9）－ＣＨ2－、－Ｃ（Ｃ2Ｈ5）2－ＣＨ2－、－Ｃ（ＣＨ3）（Ｃ3Ｈ7）－ＣＨ2－、－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－、－ＣＨ（ＣＨ3）－ＣＨ（Ｃ3Ｈ7）－、－Ｃ（ＣＨ3）2－Ｃ（ＣＨ3）2－、－ＣＨ（Ｃ3Ｈ7）－（ＣＨ2）2－、－ＣＨ2－ＣＨ（Ｃ3Ｈ7）－ＣＨ2－、－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－Ｃ（ＣＨ3）2－、－Ｃ（ＣＨ3）2－ＣＨ（ＣＨ3）－ＣＨ2－、－ＣＨ（ＣＨ3）－Ｃ（ＣＨ3）2－ＣＨ2－、－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－ＣＨ（ＣＨ3）－ＣＨ2－、－ＣＨ（ＣＨ3）－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－ＣＨ2－、－ＣＨ（ＣＨ3）－ＣＨ2－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－、－ＣＨ（ＣＨ3）－Ｃ（ＣＨ3）2－ＣＨ2－、－（ＣＨ（ＣＨ3））3－、－Ｃ（ＣＨ3）2－（ＣＨ2）3－、－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－（ＣＨ2）3－、－ＣＨ2－ＣＨ（Ｃ2Ｈ5）－（ＣＨ2）2－、－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ3）－ＣＨ（ＣＨ3）－ＣＨ2－、－（ＣＨ（ＣＨ3））2－（ＣＨ2）2－、－ＣＨ（ＣＨ3）－（ＣＨ2）2－ＣＨ（ＣＨ3）－、－（ＣＨ2）2－ＣＨ（ＣＨ3）－（ＣＨ2）2－、－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ3）－（ＣＨ2）3－、－ＣＨ（ＣＨ3）－（ＣＨ2）4－などを含むが、これらに限定されない。
用語「シクロアルキレン基」と「環状アルキレン基」は、本明細書において同じ意味を有し、かつ互換して使用することができる。シクロアルキレン基の例は、シクロプロピレン基、シクロブチレン基、シクロペンチレン基、シクロヘキシレン基、シクロヘプチレン基及びシクロオクチレン基と、縮合環、スピロ環又は架橋環を含む二価多環式アルキル基などを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、シクロアルキレン基は、Ｃ3～6シクロアルキレン基であり、特にＣ3～4シクロアルキレン基、特にシクロプロピル基である。
部分的環状アルキレン基は、二価基を含んでもよく、その分子の残りの部分に結合する２つの結合部位が、いずれも上記１つ以上の直鎖又は分岐鎖アルキル基部分にあってもよく、いずれも上記１つ以上のシクロアルキル基部分にあってもよく、それぞれシクロアルキル基部分と直鎖又は分岐鎖アルキル基部分にあってもよい。部分的環状アルキレン基の例は、（１）それぞれ１つ以上の直鎖又は分岐鎖アルキル基で独立して置換されたシクロプロピレン基、シクロブチレン基、シクロペンチレン基、シクロヘキシレン基、シクロヘプチレン基及びシクロオクチレン基と、縮合環、スピロ環又は架橋環を含む二価多環式アルキル基と、（２）それぞれ１つ以上のシクロアルキル基で独立して置換された直鎖又は分岐鎖アルキレン基と、（３）化学的に安定な構造を形成するという条件で、１つ以上のシクロアルキレン基及び１つ以上の直鎖又は分岐鎖アルキレン基を組み合わせて得られた基と、を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、部分的環状アルキレン基は、Ｃ3～9シクロアルキル基－Ｃ1アルキレン基であり、好ましくは、Ｃ3～6シクロアルキル基－Ｃ1～2アルキレン基、Ｃ3～6シクロアルキル基－Ｃ1アルキレン基であり、より好ましくは、Ｃ3～4シクロアルキル基－Ｃ1～2アルキレン基、特にＣ3～4シクロアルキル基－Ｃ1アルキレン基、特にシクロプロピル基－メチレン基である。
本発明の化合物は、自然界で最も一般的な原子質量及び質量数と異なる原子質量及び質量数を有する１つ以上の原子を含有する同位体標識又は同位体濃縮形態で存在することができる。同位体は、放射性又は非放射性の同位体であってもよい。水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素及びヨウ素などの原子の同位体は、2Ｈ、3Ｈ、13Ｃ、14Ｃ、15Ｎ、18Ｏ、32Ｐ、35Ｓ、18Ｆ、36Ｃｌ及び125Ｉを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、ペイロード（例えば、式（ｉ）の化合物）は、同位体標識又は同位体濃縮形態、特に重水素化形態で存在することができる。
本明細書で使用されるように、用語「抗体にコンジュゲートされ得る薬物」と「抗体薬物コンジュゲート」は、同じ意味を有する。
式（ｉ）の化合物
一態様では、本発明は、化合物又はその薬学的に許容される塩、立体異性体、溶媒和物、多形体、互変異性体、同位体化合物、代謝物又はプロドラッグを提供し、上記化合物は、式（ｉ）に示す構造を有する。
Figure 0007536188000008
 ここで、
ａは０又は１であり、
ｐ１*を付けた炭素原子とｐ２*を付けた炭素原子は、それぞれ不斉中心であり、かつ上記不斉中心がＳ配置、Ｒ配置又はラセミ化されたものであり、
Ｌ1は、Ｃ1～6アルキレン基から選択され、未置換であるか、又はハロゲン、－ＯＨ及び－ＮＨ2から選択される１つの置換基によって置換されており、
Ｍは－ＣＨ2－、－ＮＨ－又は－Ｏ－であり、
Ｌ2はＣ1～3アルキレン基であり、
Ｒ1とＲ2は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1～6アルキル基、ハロゲン及びＣ1～6アルコキシ基から選択される。
一実施形態では、Ｌ1は、Ｃ1～6直鎖アルキレン基、Ｃ1～6分岐鎖アルキレン基、Ｃ3～6シクロアルキレン基及びＣ3～4シクロアルキル基－Ｃ1～2直鎖アルキレン基から選択され、上記基は独立して未置換であるか、又はハロゲン、－ＯＨ及び－ＮＨ2から選択される１つの置換基によって置換されている。一実施形態では、Ｌ1は、Ｃ1～4アルキレン基から選択され、未置換であるか、又はハロゲン、－ＯＨ及び－ＮＨ2から選択される１つの置換基によって置換されている。好ましい一実施形態では、Ｌ1は、－ＣＨ2－、－Ｃ2Ｈ4－、
Figure 0007536188000009
 から選択され、前記基はそれぞれ独立して未置換であるか、又はハロゲン、－ＯＨ及び－ＮＨ2から選択される少なくとも１つの置換基によって置換されている。好ましい一実施形態では、Ｌ1は、－ＣＨ2－、
Figure 0007536188000010
 から選択され、ここで、「＃」は、カルボニル基と結合する位置を示す。より好ましい実施形態では、Ｌ1は、－ＣＨ2－、
Figure 0007536188000011
 から選択され、ここで、「＃」は、カルボニル基と結合する位置を示す。特別な実施形態では、Ｌ1は、－ＣＨ2－、
Figure 0007536188000012
 及び
Figure 0007536188000013
 から選択され、ここで、「＃」は、カルボニル基と結合する位置を示す。好ましい一実施形態では、ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ及びＢｒから選択され、特にＦである。
一実施形態では、ａは１であり、Ｍは－ＣＨ2－、－ＮＨ－又は－Ｏ－であり、かつＬ2は－Ｃ2Ｈ4－である。別の実施形態では、ａは１であり、Ｍは－ＣＨ2－であり、Ｌ2は－ＣＨ2－である。
一実施形態では、ｐ１*を付けた炭素原子はＳ配置又はラセミ化されたものであり、好ましくはＳ配置である。別の実施形態では、ｐ２*を付けた炭素原子はＳ配置又はラセミ化されたものであり、好ましくはＳ配置である。
一実施形態では、Ｒ1とＲ2は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1～3アルキル基、ハロゲン及びＣ1～3アルコキシ基から選択される。好ましい一実施形態では、Ｒ1とＲ2は、それぞれ独立して、ＣＨ3－、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3Ｏ－から選択される。一実施形態では、Ｒ1は、ＣＨ3－とＣｌから選択される。別の実施形態では、Ｒ2は、Ｆである。
一実施形態では、Ｌ1は、－ＣＨ2－、
Figure 0007536188000014
 から選択され、ここで、「＃」は、カルボニル基と結合する位置を示す。一実施形態では、ａは１であり、Ｌ1は
Figure 0007536188000015
 であり、ＭはＯであり、Ｌ2は－Ｃ2Ｈ4－である。
一実施形態では、ａは０であり、Ｒ1はＣｌであり、Ｒ2はＦであり、Ｌ1は－ＣＨ2－、
Figure 0007536188000016
 から選択される。一実施形態では、ａは０であり、Ｒ1はＣＨ3－であり、Ｒ2はＦであり、Ｌ1は、
Figure 0007536188000017
 から選択され、ここで、「＃」はカルボニル基と結合する位置を示す。
一実施形態では、ａは１であり、Ｒ1はＣＨ3－であり、Ｒ2はＦであり、Ｌ1は
Figure 0007536188000018
 であり、ＭはＯであり、Ｌ2は－Ｃ2Ｈ4－である。
一実施形態では、上記化合物は、
Figure 0007536188000019
Figure 0007536188000020
Figure 0007536188000021
 から選択される。
一実施形態では、上記化合物は、
Figure 0007536188000022
Figure 0007536188000023
 から選択される。
好ましい一実施形態では、上記化合物は、
Figure 0007536188000024
Figure 0007536188000025
 から選択される。
好ましい一実施形態では、上記化合物は、
Figure 0007536188000026
 から選択される。
より好ましい実施形態では、上記化合物は、
Figure 0007536188000027
 から選択される。
特別な実施形態では、上記化合物は、
Figure 0007536188000028
 から選択される。
一態様では、本発明は、
Figure 0007536188000029
 Ｃ７３０
及び、
Figure 0007536188000030
 Ｃ７３１
から選択される化合物を提供する。
式（Ｉ）の化合物
一態様では、本発明は、式（Ｉ）に示す構造を有する化合物を提供する。
Figure 0007536188000031
 ここで、
ｏｐＳｕは
Figure 0007536188000032
 又は
Figure 0007536188000033
 であり、
Ｒ0はＣ1～10アルキル基であり、
ｎは２～２０の任意の整数であり、
ｋ１とｋ２は、独立して１～７の整数であり、
ｉは１～１００の整数であり、
ｊは１～１００の整数であり、
Ｐ１とＰ２は、独立して、式（ｉ’）に示す構造を有するペイロードであり、
Figure 0007536188000034
 ここで、
ａ、ｐ１*を付けた炭素原子、ｐ２*を付けた炭素原子、Ｌ1、Ｍ、Ｌ2、Ｒ1及びＲ2は、式（ｉ）で定義されているとおりである。
一実施形態では、ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）は、
Figure 0007536188000035
Figure 0007536188000036
Figure 0007536188000037
 から選択される。
一実施形態では、ペイロードは、
Figure 0007536188000038
Figure 0007536188000039
 から選択される。
好ましい一実施形態では、ペイロードは、
Figure 0007536188000040
Figure 0007536188000041
 から選択される。
好ましい一実施形態では、ペイロードは、
Figure 0007536188000042
 から選択される。
より好ましい実施形態では、ペイロードは、
Figure 0007536188000043
 から選択される。
特別な実施形態では、ペイロードは、
Figure 0007536188000044
 から選択される。
一実施形態では、Ｒ0はＣ1～6アルキル基である。好ましい一実施形態では、Ｒ0はＣ1～3アルキル基である。特別な実施形態では、Ｒ0は、メチル基である。
一実施形態では、ｎは２～５の整数である。特別な実施形態では、ｎは３である。
一実施形態では、ｋ１とｋ２は、独立して１又は３又は５である。特別な実施形態では、ｋ１とｋ２は、独立して５である。
一実施形態では、ｉは、独立して１～２０の整数であり、好ましくは１～１２であり、より好ましくは２～８である。特別な実施形態では、ｉは、４である。
一実施形態では、ｊは、独立して１～２０の整数であり、好ましくは１～１２であり、より好ましくは８～１２であり、特に８又は１２である。特別な実施形態では、ｊは、１２である。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｉ－１）に示す構造を有する。
Figure 0007536188000045
 ここで、
Ｐ１、Ｐ２、Ｒ0、ｏｐＳｕ、ｎ、ｉ及びｊは、式（Ｉ）で定義されているとおりである。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、
Figure 0007536188000046
 ＢＨ－１
及び
Figure 0007536188000047
 ＢＨ－２
から選択される。
式（Ｉ）の化合物の具体的な実施形態
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物の構造は、以下の表に示すとおりである。
Figure 0007536188000048
Figure 0007536188000049
式（Ｉ）の化合物の製造
一実施形態では，式（Ｉ）の化合物は、リンカーとペイロードを結合させること、又は一連の適切なビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）を結合させることによって製造することができる。このようなビルディングブロックは、逆合成解析により容易に設計され、当該技術分野で既知の任意の方法を使用することができる。
一態様では、本発明は、式（１）に示す構造を有する化合物を提供する。
Figure 0007536188000050
 ここで、
ｋは１～７の整数であり、
Ｐは、式（ｉ′）に示す構造を有するペイロードであり、式（ｉ′）に示す構造は以上で定義されているとおりである。
好ましい一実施形態では、ｋは１、３又は５である。特別な実施形態では、ｋは５である。
式（１）の化合物は、式（ｉ）化合物及び他の必要なビルディングブロックを使用して、欧州特許出願公開第２９０７８２４号に開示された合成方法と類似する方法（例えば欧州特許出願公開第２９０７８２４号の式（２））又は（２ｂ）の合成方法）で、合成することができる。適切なビルディングブロックは、結合ユニットＨＸ２０１１３及び結合ユニットＨＸ２０１１１を含むが、これらに限定されない。
Figure 0007536188000051
次に、そのうちのマレイミド基は、式（Ｉ）の化合物の別のビルディングブロックにおけるメルカプト基と反応することができる。取得されるスルホスクシンイミドは、生理学的条件では不安定であり、かつ容易にＭｉｃｈａｅｌ付加反応の逆反応が発生して、結合部位の分解をおこす。また、系に別のスルフヒドリル化合物が存在している場合、チオスクシンイミドが別のスルフヒドリル化合物とチオール交換をしてもよい。この二つの反応はいずれもペイロードの脱落及び毒性副作用をもたらす。次に、スルホスクシンイミドを開環反応させる。次に、式（Ｉ）の化合物を得ることができる。
開環反応の方法は、国際公開第２０１５１６５４１３号を参照することができる。スクシンイミドを開環する部分を含有する化合物は、高純度かつ的確な構成を実現するように、スクシンイミドの開環反応の効率を問わず、半分取／分取ＨＰＬＣ又は他の適切な分離方法で精製することができる。
本発明において、リンカー－ペイロード（リンカー－小分子中間体）に応用される場合、開環スクシンイミド構造は逆Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応又はチオール交換が発生しないため、製品がより安定的である。
リガーゼアクセプター又はドナー基質認識配列を含む部分
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物の（Ｇｌｙ）n部分は、リガーゼアクセプター又はドナー基質認識配列であり、式（Ｉ）の化合物と抗体又は抗原結合断片との、リガーゼにより触媒された酵素的カップリングを促進する。抗体又はその抗原結合断片は、修飾されていてもよく、かつリガーゼアクセプター又はドナー基質の対応する認識配列を含む。
一実施形態では、リガーゼはトランスペプチダーゼである。一実施形態では、リガーゼは天然トランスペプチダーゼ、非天然トランスペプチダーゼ、それらの変異体及びそれらの組み合わせから選択される。非天然トランスペプチダーゼは、天然トランスペプチダーゼを操作することによって取得したものであってもよいが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、リガーゼは、天然Ｓｏｒｔａｓｅ酵素、非天然Ｓｏｒｔａｓｅ酵素及びそれらの組み合わせから選択される。天然Ｓｏｒｔａｓｅ酵素の種類としては、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｂ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｃ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｄ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍなどが挙げられる（米国特許出願公開第２０１１０３２１１８３号）。リガーゼの種類はリガーゼ認識配列に対応し、それにより、異なる分子又は構成断片間の特異的コンジュゲートを実現するために用いられる。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物の（Ｇｌｙ）n部分は、リガーゼアクセプター基質の認識配列であり、また、抗体又はその抗原結合断片は、修飾されていてもよく、かつリガーゼドナー基質の対応する認識配列を含む。
いくつかの実施形態では、リガーゼは、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｂ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｃ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｄ及びＳｏｒｔａｓｅ Ｌ． ｐｌａｎｔａｒｕｍから選択されるＳｏｒｔａｓｅ酵素である。
特別な実施形態では、リガーゼは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＳｏｒｔａｓｅ Ａである。したがって、リガーゼ認識配列は該酵素の代表的な認識配列ＬＰＸＴＧであってもよい。別の特別な実施形態では、リガーゼドナー基質認識配列はＬＰＸＴＧＪであり、リガーゼアクセプター基質認識配列はＧmであり、ここで、Ｘは任意の天然又は非天然の単一のアミノ酸であり、Ｊは存在しないか、又は１～１０個のアミノ酸を含むアミノ酸断片であり、タグを有してもよい。一実施形態では、Ｊは存在しない。別の実施形態では、Ｊは、１～１０個アミノ酸を含むアミノ酸断片であり、そのうちの各アミノ酸が独立して任意天然又は非天然のアミノ酸である。また別の実施形態では、Ｊは（Ｇｌｙ）mであり、ここで、ｍは１～１０の整数である。別の特別な実施形態では、リガーゼドナー基質認識配列はＬＰＥＴＧである。また別の特別な実施形態では、リガーゼドナー基質認識配列はＬＰＥＴＧＧである。
一実施形態では、リガーゼは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＳｏｒｔａｓｅ Ｂであり、対応するドナー基質認識配列はＮＰＱＴＮであってもよい。別の実施形態では、リガーゼは炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）由来のＳｏｒｔａｓｅ Ｂであり、対応するドナー基質認識配列はＮＰＫＴＧであってもよい。
また別の実施形態では、リガーゼは化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＳｏｒｔａｓｅ Ａであり、対応するドナー基質認識配列はＬＰＸＴＧＪであってもよく、ここでＪは以上で定義されているとおりである。別の実施形態では、リガーゼはストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＳｏｒｔａｓｅ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ５であり、対応するドナー基質認識配列はＬＡＸＴＧであってもよい。
また別の実施形態では、リガーゼはラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のＳｏｒｔａｓｅ Ａであり、対応するドナー基質認識配列はＬＰＱＴＳＥＱであってもよい。
リガーゼ認識配列は、人力で選別して最適化した他の真新しいトランスペプチダーゼ認識配列であってもよい。
コンジュゲート及びその調製
また、リガーゼ認識配列を含む部分を持つペイロードを有する化合物（式（Ｉ）の化合物）は、リガーゼ認識配列を含む他の分子とコンジュゲートすることができるため、例えば抗体－薬物コンジュゲートなどの抗体－小分子コンジュゲートの調製に用いることができる。したがって、別の態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物及び抗体又は抗原結合断片を含むコンジュゲートを提供する。
別の態様では、本発明は、式（ＩＩ）に示す構造を有するコンジュゲートを提供する。
Figure 0007536188000052
 ここで、
Ａは、抗体又はその抗原結合断片であり、
ｚは、１～２０の整数であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｒ0、ｏｐＳｕ、ｎ、ｋ１、ｋ２、ｉ及びｊは、式（Ｉ）で定義されているとおりである。
好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は修飾されることで式（Ｉ）の化合物における（Ｇｌｙ）n部分に結合する。
好ましい一実施形態では、ｚは１～４である。特別な実施形態では、ｚは２である。
抗体又はその抗原結合断片
一実施形態では、抗体は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４４ｖ６抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＣＤ７４抗体、抗ＣＤ７９ｂ抗体、抗ＣＤ１１７／ＫＩＴｋ抗体、抗ＣＤ１２３抗体、抗ＣＤ１３８抗体、抗ＣＤ１４２抗体、抗ＣＤ１７４抗体、抗ＣＤ２２７／ＭＵＣ１抗体、抗ＣＤ３５２抗体、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体、抗ＤＬＬ３抗体、抗ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２抗体、抗ＣＮ３３抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗ＥＮＰＰ３抗体、抗Ｎｅｃｔｉｎ－４抗体、抗ＥＧＦＲｖIII抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４／ＡＧＳ－５抗体、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＴＩＭ１抗体、抗ＬＹ６Ｅ抗体、抗ＬＩＶ１抗体、抗Ｎｅｃｔｉｎ４抗体、抗ＳＬＩＴＲＫ６抗体、抗ＨＧＦＲ／ｃＭｅｔ抗体、抗ＳＬＡＭＦ７／ＣＳ１抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＢＣＭＡ抗体、抗ＡＸＬ抗体、抗ＮａＰｉ２Ｂ抗体、抗ＧＣＣ抗体、抗ＳＴＥＡＰ１抗体、抗ＭＵＣ１６抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、抗ＥＴＢＲ抗体、抗ＥｐｈＡ２抗体、抗５Ｔ４抗体、抗ＦＯＬＲ１抗体、抗ＬＡＭＰ１抗体、抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ６抗体、抗ＦＧＦＲ２抗体、抗ＦＧＦＲ３抗体、抗ＣＡ６抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗ｉｎｔｅｇｒｉｎαＶ抗体、抗ＴＤＧＦ１抗体、抗ＥｐｈｒｉｎＡ４抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗ＰＴＫ７抗体、抗ＮＯＴＣＨ３抗体、抗Ｃ４．４Ａ抗体、抗ＦＬＴ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３／４抗体、抗ＴｉｓｓｕｅＦａｃｔｏｒ抗体又は抗ＲＯＲ１／２抗体であり、好ましくは、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＦＧＦＲ３抗体、抗Ｔｒｏｐ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体又は抗ＦＲα抗体である。
好ましい一実施形態では、抗体は抗ＨＥＲ２抗体である。一実施形態では、抗体は抗ヒトＨＥＲ２抗体である。抗ヒトＨＥＲ２抗体の例として、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）及びトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）が挙げられるが、それらに限定されない。ペルツズマブは、ＨＥＲ２の２番目の細胞外ドメイン（ＥＣＤ２）と結合し、ＨＥＲ２陽性乳癌の治療に使用することが承認されている。トラスツズマブは、ＨＥＲ２の４番目の細胞外ドメイン（ＥＣＤ４）と結合し、ＨＥＲ２陽性乳癌及び胃癌の治療に使用することが承認されている。
一実施形態では、抗体は抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片であり、軽鎖可変ドメイン（ＶL）及び重鎖可変ドメイン（ＶH）を含み、そのうち、ＶLは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含み、また、そのうち、ＶHは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ＨＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＤＲはＫＡＢＡＴにより定義される。一実施形態では、抗体は抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片であり、軽鎖可変ドメイン（ＶL）及び重鎖可変ドメイン（ＶH）を含み、そのうち、ＶLは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、また、ＶHは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。好ましい一実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖可変ドメイン（ＶL）及び重鎖可変ドメイン（ＶH）を含み、そのうち、ＶLは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７のアミノ酸配列を有し、また、ＶHは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８のアミノ酸配列を有する。特別な実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は軽鎖及び重鎖を含み、そのうち、軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９のアミノ酸の１～２１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有し、また、重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。好ましい一実施形態では、抗ヒトＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブに基づく操作された抗ＨＥＲ２抗体から選択される１つ又は複数である。一実施形態では、抗体は修飾されたトラスツズマブであり、好ましくはＡｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣ（軽鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、重鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を有する）である。抗体Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣの配列は、トラスツズマブのアミノ酸配列に基づいて、軽鎖のＣ末端にＧＡＬＰＥＴＧＧが導入され、そのうちＬＰＥＴＧＧはリガーゼドナー基質の認識配列であり、ＧＡはスペーサー配列である。
好ましい一実施形態では、抗ヒトＨＥＲ２抗体は組換え抗体であり、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体断片及び抗体模倣物から選択される。一実施形態では、抗体模倣物はｓｃＦｖ、ミニ抗体、二重抗体、及びナノ抗体から選択される。式（Ｉ）の化合物とのコンジュゲートについて、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、式（Ｉ）の化合物における（Ｇｌｙ）n部分にコンジュゲートするために、修飾部分を含んでもよい。このような修飾部分の導入される位置は制限されず、例えば、抗体又はその抗原結合断片の導入位置は抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端にあってもよいが、それらに限定されない。
好ましい一実施形態では、式（Ｉ）の化合物における（Ｇｌｙ）n部分とコンジュゲートするための修飾部分は、例えば化学修飾方法で抗体の重鎖又は軽鎖の末端以外の位置に導入することができる。
一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、末端修飾を含んでもよい。末端修飾とは、抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端又はＮ末端における修飾を指し、例えばリガーゼ認識配列を含む。別の実施形態では、末端修飾２～１００個のアミノ酸を含むスペーサーＳｐをさらに含んでもよく、抗体、Ｓｐ及びリガーゼ認識配列が順に結合している。好ましい一実施形態では、Ｓｐは２～２０個のアミノ酸を含むスペーサー配列である。特別な実施形態では、ＳｐはＧＡ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳから選択されるスペーサー配列であり、特にＧＡである。
好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片の軽鎖は、野生型（ＬＣ）、リガーゼ認識配列ＬＰＥＴＧＧを直接導入することで修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴ）、及び、短いペプチドスペーサーとリガーゼドナー基質認識配列ＬＰＸＴＧを導入することで修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＬＣＣＴL）の３種類を含む。抗体又はその抗原結合断片の重鎖は、野生型（ＨＣ）、リガーゼ認識配列ＬＰＸＴＧを直接導入することで修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＨＣＣＴ）、及び、短いペプチドスペーサーとリガーゼドナー基質認識配列ＬＰＸＴＧを導入することで修飾されたＣ－末端修飾軽鎖（ＨＣＣＴL）の３種類を含む。Ｘは、任意の天然又は非天然の単一アミノ酸であってもよい。式（ＩＩ）の化合物におけるｚが１又は２である場合、上記重鎖及び軽鎖が組み合わせて、８つの好ましい抗体分子を形成することができる。
一実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、
Figure 0007536188000053
 及び
Figure 0007536188000054
 から選択される。
コンジュゲートの具体的な実施形態
一実施形態では、ペイロードは、細胞毒素又はその断片である。一実施形態では、抗体－薬物コンジュゲートは、以下の表で示すとおりである。
ＡＤＣの命名法：括弧内の数字は、抗体に結合させることを意図したペイロード（薬物）分子の数である。
Figure 0007536188000055
コンジュゲートの調製
本発明のコンジュゲート（即ち、式（ＩＩ）の化合物）は、本分野の既知の任意の方法で調製され得る。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、抗体又は抗原結合断片と式（Ｉ）の化合物をリガーゼの触媒で部位特異的にコンジュゲートして調製されたものであり、抗体又は抗原結合断片がリガーゼ認識配列によって修飾される。
抗体又はその抗原結合断片と式（Ｉ）の化合物とは、基質のリガーゼ特異的認識配列により相互に結合している。認識配列は、使用される特定のリガーゼに依存する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端に認識配列に基づく末端修飾が導入された抗体であり、抗体又はその抗原結合断片は、野生型若しくは最適化した工学的リガーゼ又はそれらの任意の組み合わせの触媒で、適切な触媒反応条件で、式（Ｉ）の化合物とコンジュゲートする。
具体的な実施形態では、リガーゼは、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａであり、コンジュゲーション反応は、以下の解決手段で表されてもよい。
Figure 0007536188000056
 三角形は、抗体の一部を表し、五角形は、式（Ｉ）の化合物の一部を表し、Ｇnは（Ｇｌｙ）n部分を表す。ｎ、Ｘ及びＪは、それぞれ上記で定義されているとおりである。アクセプター基質の対応する認識配列Ｇnとコンジュゲートする場合、ＬＰＸＴＧＪ配列中のグリシンの上流ペプチド結合は、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａによって分解され、生成された中間体は、Ｇnの遊離Ｎ末端に結合して新たなペプチド結合を生成させる。得られたアミノ酸配列は、ＬＰＸＴＧnである。配列Ｇn及びＬＰＸＴＧＪは、上記で定義されているとおりである。
したがって、一実施形態では、式（Ｉ）の化合物のＧn部分は、リガーゼアクセプター基質認識配列であり、上記抗体は、リガーゼドナー基質認識配列を含むように修飾されることにより、式（Ｉ）の化合物のＧn部分に結合し、
好ましくは、
（ａ）リガーゼは、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｂ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｃ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ｄ及びＳｏｒｔａｓｅ Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍから選択されるＳｏｒｔａｓｅ酵素であり、好ましくは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＳｏｒｔａｓｅ Ａが好ましく、及び／又は、
（ｂ）リガーゼドナー基質認識配列は、ＬＰＸＴＧＪであり、Ｊは存在しないか又はＧmであり、Ｇは、グリシンであり、ｍは１～１０の整数であり、Ｘは任意の天然又は非天然の単一のアミノ酸であり、好ましくは、リガーゼドナー基質認識配列は、ＬＰＸＴＧ又はＬＰＥＴＧＧであり、及び／又は、
ＬＰＸＴＧは、Ｇnに結合してＬＰＸＴＧnを生成する。
本発明の式（Ｉ）の化合物は、的確な構造、的確な構成及び高純度を有するため、抗体とのコンジュゲーション反応を行う場合、極めて少ない不純物が導入され、又は他の不純物が導入されない。このような中間体が、リガーゼによって触媒されるリガーゼ認識配列を含有する修飾抗体との部位特異的コンジュゲートに用いられる場合、品質が高度に制御可能な均質ＡＤＣを得る。
生理的環境におけるコンジュゲートの代謝
リンカーの一部又は全体が腫瘍細胞において分解される場合、ペイロードは、放出される。リンカーが抗腫瘍化合物に結合している位置で分解されるため、抗腫瘍化合物は、その固有構造で放出されてその固有の抗腫瘍作用を示す。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物に含まれるＧＧＦＧ（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ）部分は、リソソーム酵素（例えば、カテプシンＢ及び／又はカテプシンＬ）によって分解されてもよい。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、自壊性スペーサーを含む。一実施形態では、自壊性スペーサーは、アセタール又はヘテロアセタールである。一実施形態では、式（Ｉ）の化合物に含まれる－ＧＧＦＧ－ＮＨ－ＣＨ2－Ｏ－部分は、制限酵素部位と自壊性スペーサーの組み合わせを表し、細胞で分解し、かつ標的分子（例えば、抗腫瘍化合物）を放出する。
医薬組成物及び医薬製剤
本発明の別の目的は、本発明のコンジュゲートと、薬学的に許容される少なくとも１種の担体と、を含む医薬組成物を提供することである。
本発明の医薬組成物は、人又は動物の症状を予防、緩和、予防又は治療する効果を達成できれば、任意の方式で投与することができる。例えば、投与経路に応じて様々な適切な剤形、特に、注射用凍結乾燥粉末、注射用無菌粉末などの注射剤に調製することができる。
用語「薬学的に許容される」は、正しい医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応などを引き起こすことなく、患者の組織と接触し、妥当なベネフィット／リスク比を有するとともに、意図される用途に効果的である。
用語「薬学的に許容される担体」とは、薬学的に許容され、かつコンジュゲートの生物活性及び特性を損なわないそのような担体材料を指す。水性担体としては、緩衝生理食塩水などが挙げられるが、これに限定されない。薬学的に許容される担体は、組成物を生理的条件に近づける担体材料、例えばｐＨ調整剤、緩衝剤、毒性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどをさらに含む。
一実施形態では、本発明の医薬組成物の薬物／抗体比（ＤＡＲ）は、約１～約２０の整数又は非整数であり、例えば、約１～約１０、約１～約８、約１～約６、約１～約４、約２～約５、約２～約４若しくは約３～約４の整数、又は非整数である。特別な実施形態では、本発明のコンジュゲートは、約４のＤＡＲを有する。特別な実施形態では、本発明のコンジュゲートは、約３．３～約３．７５、特に約３．４～約３．６５のＤＡＲを有する。
治療方法及び使用
本発明のコンジュゲートは、腫瘍及び／又は自己免疫疾患の治療に用いることができる。コンジュゲートを用いた治療に敏感な腫瘍は、特定の腫瘍関連抗原又は細胞表面アクセプターを特徴とする腫瘍を含み、これらの腫瘍細胞は、コンジュゲートの標的分子（抗体）によって認識され、さらにコンジュゲートのペイロード／細胞毒素によって殺傷される。
したがって、別の態様では、本発明は、本発明のコンジュゲート又は本発明の医薬組成物の、腫瘍又は自己免疫疾患から選択される疾患、病症又は病状を治療するための薬物の製造における使用をさらに提供する。
別の態様では、本発明は、腫瘍又は自己免疫疾患を治療するための本発明のコンジュゲート又は本発明の医薬組成物を提供する。
更なる態様では、本発明は、必要とする個体に有効量の本発明のコンジュゲート又は本発明の医薬組成物を投与することを含む、腫瘍又は自己免疫疾患を治療する方法を提供する。
好ましい一実施形態では、本発明に係る、抗ＨＥＲ２抗体と小分子細胞毒素が結合して形成されたコンジュゲートは、腫瘍細胞表面のＨＥＲ２と特異的に結合し、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞を選択的に殺傷することができる。別の好ましい実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体は、抗ヒトＨＥＲ２抗体である。別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のコンジュゲート又は本発明の医薬組成物の、ＨＥＲ２陽性腫瘍から選択される疾患、病症又は病状を治療するための薬物の製造における使用を提供する。より好ましい実施形態では、上記疾患、病症又は病状は、乳癌、胃癌、肺癌、卵巣癌及び尿路上皮癌などから選択される。
被験者に投与されるコンジュゲートの用量は、かなりの程度で調整することができる。用量は、具体的な投与経路及び被験者の必要に応じて変化し、かつ医療専門家により判断することができる。
上記で定義されているとおり、本発明の実施形態は、以下の［１］～［２０］のとおり説明されてもよい：
［１］
式（Ｉ）の化合物であって、
Figure 0007536188000057
 ここで、
ｏｐＳｕは
Figure 0007536188000058
 又は
Figure 0007536188000059
 であり、
Ｒ0はＣ1～10アルキル基であり、
ｎは２～２０の任意の整数であり、
ｋ１とｋ２は、独立して１～７の整数であり、
ｉは１～１００の整数であり、
ｊは１～１００の整数であり、
Ｐ１とＰ２は、独立して、式（ｉ’）に示す構造を有するペイロードであり、
Figure 0007536188000060
 ここで、
ａは０又は１であり、
ｐ１*を付けた炭素原子とｐ２*を付けた炭素原子は、それぞれ不斉中心であり、かつ前記不斉中心がＳ配置、Ｒ配置又はラセミ化されたものであり、
Ｌ1は、Ｃ1～6アルキレン基から選択され、未置換であるか、又はハロゲン、－ＯＨ及び－ＮＨ2から選択される１つの置換基によって置換されており、
Ｍは－ＣＨ2－、－ＮＨ－又は－Ｏ－であり、
Ｌ2はＣ1～3アルキレン基であり、
Ｒ1とＲ2は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1～6アルキル基、ハロゲン及びＣ1～6アルコキシ基から選択される、化合物。
［２］
式（Ｉ－１）に示す構造を有し、
Figure 0007536188000061
 ここで、
Ｐ１、Ｐ２、Ｒ0、ｏｐＳｕ、ｎ、ｉ及びｊは、請求項１で定義されているとおりである、請求項［１］に記載の化合物。
［３］
式（ｉ’）において、
Ｌ1は、Ｃ1～6直鎖アルキレン基、Ｃ1～6分岐鎖アルキレン基、Ｃ3～6シクロアルキレン基及びＣ3～4シクロアルキル基－Ｃ1～2直鎖アルキレン基から選択され、前記基はそれぞれ独立して未置換であるか、又はハロゲン、－ＯＨ及び－ＮＨ2から選択される１つの置換基によって置換されており、
好ましくは、
Ｌ1は、Ｃ1～4直鎖アルキレン基、Ｃ1～4分岐鎖アルキレン基、Ｃ3～4シクロアルキレン基及びシクロプロピル基－メチレン基から選択され、前記基はそれぞれ独立して未置換であるか、又はハロゲン、－ＯＨ及び－ＮＨ2から選択される１つの置換基によって置換されており、
好ましくは、Ｌ1は、－ＣＨ2－、－Ｃ2Ｈ4－、
Figure 0007536188000062
 から選択され、前記基はそれぞれ独立して未置換であるか、又はハロゲン、－ＯＨ及び－ＮＨ2から選択される少なくとも１つの置換基によって置換されており、
より好ましくは、Ｌ1は、－ＣＨ2－、
Figure 0007536188000063
 から選択され、ここで、「＃」は、カルボニル基と結合する位置を示し、
さらに好ましくは、Ｌ1は、－ＣＨ2－、
Figure 0007536188000064
 から選択され、ここで、「＃」は、カルボニル基と結合する位置を示し、
特に、Ｌ1は、－ＣＨ2－、
Figure 0007536188000065
 及び
Figure 0007536188000066
 から選択され、ここで、「＃」は、カルボニル基と結合する位置を示し、
及び／又は、
ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ及びＢｒから選択される、請求項［１］又は［２］に記載の化合物。
［４］
式（ｉ’）において、
Ｍは－ＣＨ2－、－ＮＨ－又は－Ｏ－であり、Ｌ2は－Ｃ2Ｈ4－であり、或いは、
Ｍは－ＣＨ2－であり、Ｌ2は－ＣＨ2－である、請求項［１］～［３］のいずれか一項に記載の化合物。
［５］
式（ｉ’）において、
ｐ１*を付けた炭素原子はＳ配置又はラセミ化されたものであり、好ましくはＳ配置であり、及び／又は、
ｐ２*を付けた炭素原子はＳ配置又はラセミ化されたものであり、好ましくはＳ配置である、請求項［１］～［４］のいずれか一項に記載の化合物。
［６］
式（ｉ’）において、
Ｒ1とＲ2は、それぞれ独立して、水素、Ｃ1～3アルキル基、ハロゲン及びＣ1～3アルコキシ基から選択され、
好ましくは、Ｒ1とＲ2は、それぞれ独立して、ＣＨ3－、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＣＨ3Ｏ－から選択され、
より好ましくは、
Ｒ1は、ＣＨ3－とＣｌから選択され、及び／又は、
Ｒ2は、Ｆであり、
さらに好ましくは、
ａは０であり、Ｒ1はＣｌであり、Ｒ2はＦであり、Ｌ1は、－ＣＨ2－、
Figure 0007536188000067
 から選択され、或いは、
ａは０であり、Ｒ1はＣＨ3－であり、Ｒ2はＦであり、Ｌ1は、
Figure 0007536188000068
 から選択され、ここで、「＃」はカルボニル基と結合する位置を示し、或いは、
ａは１であり、Ｒ1はＣＨ3－であり、Ｒ2はＦであり、Ｌ1は
Figure 0007536188000069
 であり、ＭはＯであり、Ｌ2は－Ｃ2Ｈ4－である、請求項［１］～［５］のいずれか一項に記載の化合物。
［７］
前記ペイロードは、
Figure 0007536188000070
Figure 0007536188000071
 から選択され、
好ましくは、
Figure 0007536188000072
 から選択され、
より好ましくは、
Figure 0007536188000073
 から選択され、
特に、
Figure 0007536188000074
 から選択される、請求項［１］～［６］のいずれか一項に記載の化合物。
［８］
Ｒ0はＣ1～6アルキル基であり、好ましくはＣ1～3アルキル基、特にメチル基であり、及び／又は、
ｎは２～５の整数であり、特に３であり、及び／又は
ｋ１とｋ２は、独立して１又は３又は５であり、特に５であり、
ｉは、独立して１～２０の整数であり、好ましくは１～１２であり、より好ましくは２～８であり、特に４であり、及び／又は
ｊは、独立して１～２０の整数であり、好ましくは１～１２であり、より好ましくは８～１２であり、特に８又は１２であり、特に１２である、請求項［１］～［７］のいずれか一項に記載の化合物。
［９］
Figure 0007536188000075
Figure 0007536188000076
 から選択されるものである、請求項［１］～［８］のいずれか一項に記載の化合物。
［１０］
式（ＩＩ）に示す構造を有し、
Figure 0007536188000077
 ここで、
Ａは、抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは修飾されることで式（Ｉ）の化合物における（Ｇｌｙ）n部分に結合し、
ｚは１～２０の整数であり、好ましくは１～４であり、特に２であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｒ0、ｏｐＳｕ、ｎ、ｋ１、ｋ２、ｉ及びｊは、請求項［１］～［８］のいずれか一項で定義されているとおりである、コンジュゲート。
［１１］
Figure 0007536188000078
 から選択されるものである、請求項［１０］に記載のコンジュゲート。
［１２］
前記抗体は、抗ヒトＨＥＲ２抗体、好ましくはトラスツズマブである、請求項［１０］又は［１１］に記載のコンジュゲート。
［１３］
予防又は治療上の有効量の請求項［１０］～［１２］のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される少なくとも１種の担体と、を含む医薬組成物。
［１４］
前記コンジュゲートの薬物／抗体比（ＤＡＲ）は、１～８の整数又は非整数であり、特に３～４の整数又は非整数である、請求項［１３］に記載の医薬組成物。
［１５］
請求項［１０］～［１２］のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項［１３］若しくは［１４］に記載の医薬組成物の、疾患を治療するための薬物の製造における使用であって、前記疾患は、腫瘍又は自己免疫疾患であり、好ましくは、ＨＥＲ２－陽性腫瘍細胞を含む腫瘍である、使用。
［１６］
前記ＨＥＲ２－陽性腫瘍細胞を含む腫瘍は、更にＨＥＲ２低発現腫瘍細胞を含み、
前記ＨＥＲ２低発現腫瘍細胞のＨＥＲ２発現レベルは、前記ＨＥＲ２－陽性腫瘍細胞より低い、請求項［１５］に記載の使用。
［１７］
式（ｉ）に示す構造を有し、
Figure 0007536188000079
 ここで、
ａ、ｐ１*を付けた炭素原子、ｐ２*を付けた炭素原子、Ｌ1、Ｍ、Ｌ2、Ｒ1及びＲ2は、請求項［１］～［７］のいずれか一項で定義されているとおりである、化合物又はその薬学的に許容される塩、立体異性体、溶媒和物、多形体、互変異性体、同位体化合物、代謝物又はプロドラッグ。
［１８］
Figure 0007536188000080
Figure 0007536188000081
 から選択され、
好ましくは、
Figure 0007536188000082
 から選択され、
より好ましくは、
Figure 0007536188000083
 から選択され、
特に、
Figure 0007536188000084
 から選択されるものである、請求項［１７］に記載の化合物。
［１９］
式（１）の化合物であって、
Figure 0007536188000085
 ここで、
ｋは１～７の整数であり、好ましくは１又は３又は５であり、特に５であり、
Ｐは、式（ｉ′）に示す構造を有するペイロードであり、式（ｉ′）に示す構造は、請求項［１］～［７］のいずれか一項で定義されているとおりである、化合物。
［２０］
Figure 0007536188000086
 から選択されるものである、請求項［１９］に記載のコンジュゲート。
本発明に係る新規な小分子トポイソメラーゼＩ阻害剤は、単独で使用されるか又はＡＤＣの成分として使用されると、従来技術より高い活性、安定性及び物理化学的性質を示すことができる。
本発明の抗体薬物コンジュゲートは、特別に設計されたリンカー－ペイロード（Ｌｉｎｋｅｒ－ｐａｙｌｏａｄ）を用いて、高い効力及びバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）殺傷効果を達成することができる。そして、低いＤＡＲを有するため、副作用を低減するとともに治療指数を向上させることができ、これは、バイスタンダー殺傷に対して非常に重要である。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、開環スクシンイミド構造などの構造がより安定的である。
本発明は、特有の構造を持つリンカーを利用し、かつリガーゼを用いて標的分子（抗体）とペイロードとのコンジュゲートを触媒する。本発明のコンジュゲートは、均質性が高く、活性が高い。また、リンカー単位－ペイロード中間体は、毒性が遊離ペイロードよりはるかに低いため、薬物の製造過程における危害性が低く、工業化生産に役立つ。
本発明のコンジュゲートは、少なくとも一つの以下の技術的効果を達成する。
（１）標的細胞に対して高い抑制活性を持つとともに、高いバイスタンダー殺傷効果を持つ。
（２）物理化学的性質（例えば溶解度、物理的及び／又は化学的安定性）に優れている。
（３）薬物動態学的特性（例えば、血漿における高い安定性、適切な半減期及び作用持続時間）に優れている。
（４）安全性（非標的正常細胞又は組織に対する低い毒性及び／又は少ない副作用、広い治療域）などに優れている。
（５）高度にモジュール化された設計により、様々な薬物を簡単に組み合わせることができる。
調製実施例
本発明の目的及び技術手段をより明確に説明するために、以下、具体的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例で言及されていない具体的な実験方法は、いずれも従来の実験方法に従って行われる。
機器、材料及び試薬
特に説明しない限り、実施例で使用される機器及び試薬は、いずれも市販されているものである。試薬は、精製することなくそのまま使用することができる。
ＭＳ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ、Ｗａｔｅｒ２７９５－Ｑｕａｔｔｒｏマイクロ三連四重極型質量分析計
ＨＰＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５、 Ａｇｉｌｅｎｔ １１００、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００
半分取ＨＰＬＣ：Ｌｉｓｕｒｅ ＨＰ ｐｌｕｓ ５０Ｄ
フローサイトメーター：ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓ
ＨＩＣ－ＨＰＬＣ：Ｂｕｔｙｌ－ＨＩＣ、移動相Ａ：２５ｍＭ ＰＢ、２Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ ７．０、移動相Ｂ：２５ｍＭ ＰＢ、ｐＨ ７．０、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；収集時間：２５ｍｉｎ、試料注入量：２０ μｇ；カラム温度：２５°Ｃ； 検出波長：２１０ｎｍ；試料チャンバー温度：８ °Ｃ。
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ：クロマトグラフィーカラム：ＴＳＫ－ｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ、ＴＯＳＯＨ ７．８ｍｍ ＩＤ×３００ｍｍ、５μｍ、移動相：０．２Ｍ ＫＨ2ＰＯ4、０．２５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ ６．２、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；収集時間：３０ｍｉｎ、 試料注入体積：５０μｌ、カラム温度：２５°Ｃ；検出波長：２１０ｎｍ；試料皿温度：８°Ｃ。
ＣＨＯ細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得られたものであり、ｐｃＤＮＡ３．３は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から得られたものであり、ＨＥＫ２９３Ｆは、普瑞金社（Ｐｒｅｊｉｎ）から得られたものであり、ＰＥＩＭＡＸトランスフェクション試薬は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社から得られたものであり、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＰｒｏＡは、ＧＥ社から得られたものであり、Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔは、ＧＥ社から得られたものであり、Ｒｉｎｋ－ａｍｉｄｅ－ＭＢＨＡ－樹脂とジクロロ樹脂は、南開合成社（Ｎａｎｋａｉ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）から得られたものであり、ＨＣＣ１９５４は、ＡＴＣＣ ＣＡＴ＃ ＣＲＬ－２３３８から得られたものであり、ＳＫ－ＢＲ－３は、ＡＴＣＣ ＣＡＴ＃ ＨＴＢ－３０から得られたものであり、ＢＴ－４７４は、ＡＴＣＣ ＣＡＴ＃ ＨＴＢ－２０、ＮＣＩ－Ｎ８７（ＡＴＣＣ Ｃａｔ ＃ ＣＲＬ－５８２２）から得られたものであり、ＭＣＦ７は、ＡＴＣＣ ＣＡＴ＃ ＨＴＢ－２２から得られたものであり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、ＡＴＣＣ ＣＡＴ＃ ＨＴＢ－２６から得られたものであり、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８は、ＡＴＣＣ ＣＡＴ＃ ＨＴＢ－１３２から得られたものであり、ＣＦＰＡＣ－１は、ＡＴＣＣ ＣＡＴ＃ ＣＲＬ－１９１８から得られたものであり、ＮＣＩ－Ｈ２１１０は、ＡＴＣＣ ＣＡＴ＃ ＣＲＬ－５９２４から得られたものであり、ＪＩＭＴ－１は、薬明康徳社（Ｗｕｘｉ Ａｐｐｔｅｃｈ）から得られたものであり、Ｃａｐａｎ－１は、ＡＴＣＣ ＣＡＴ＃ ＣＲＬ－１５７３から得られたものであり、抗体トラスツズマブは、既知の配列に基づいて製造されたものであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来する最適化したリコンビナーゼＳｏｒｔａｓｅ Ａを製造する。
場合によっては、上記反応スキームを実行する順序を変更して反応を促進するか又は不要な反応生成物を回避することができる。本発明をより十分に理解するように、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、説明的なものに過ぎず、いかなる方式で本発明を限定するものであると解釈されるべきではない。
ペイロード小分子の調製
中間体１１
Figure 0007536188000087
 ステップＡ： Ｎ－（２－ブロモ－５－フルオロフェニル）アセトアミド：撹拌しながら、無水酢酸（２１４ｇ、２．１０ｍｏｌ）と酢酸（５００ｍＬ）の溶液に濃Ｈ2ＳＯ4（３ｍＬ）を添加してから、室温で、２－ブロモ－５－フルオロアニリン（１００ｇ、５２６．２７ｍｍｏｌ）を小分けにて添加した。混合物を３ｈ撹拌した後、２０００ｍＬの氷水に入れた。沈殿物を形成し、濾過して収集し、かつ室温で真空乾燥させて黄色の固体状のＮ－（２－ブロモ－５－フルオロフェニル）アセトアミド（１０５ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ７．６８（ｄｄ，Ｊ＝８．９，６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．７，５．３，３．１Ｈｚ，１Ｈ），７．０２（ｄｄｄ，Ｊ＝８．９，８．０，３．１Ｈｚ，１Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ）．ＬＣＭＳｍ／ｚ２３２．０［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップＢ： Ｎ－（５－フルオロ－２－（１－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）アセトアミド：－７８oＣで撹拌しながら、１ｈ内にＮ－（２－ブロモ－５－フルオロフェニル）アセトアミド（１０５ｇ、４５２．４８ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（１０００ｍＬ）の溶液にｎ－ＢｕＬｉ（５９４ｍＬ、１．６Ｍ、ｎ－ヘキサン中、９５０．２２ｍｍｏｌ）を滴加した。完了した後、混合物をＮ2で０．５ｈ撹拌した。そして、－７８oＣで、０．５ｈ内にシクロブタノン（３８．０６ｇ、５４２．９８ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（５０ｍＬ）の溶液を滴加し、かつ混合物を－７８oＣから室温に６ｈ撹拌した。０oＣで、混合物を５００ｍＬの飽和ＮＨ4Ｃｌ水溶液に入れ、酢酸エチル（５００ｍＬｘ３）で抽出し，塩水（２５０ｍＬｘ２）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ濃縮した。混合物を（ＰＥ／ＥＡ＝１：１、１００ｍＬ）で１０ｍｉｎ研磨し、濾過して濾過ケーキを収集し、真空乾燥させて黄色の固体状のＮ－（５－フルオロ－２－（１－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）アセトアミド（２４ｇ）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ ２０６．１（Ｍ－１８＋Ｈ）、２４６．１（Ｍ＋Ｎａ）。
ステップＣ： Ｎ－（３－フルオロ－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１－イル）アセトアミド：撹拌しながら、Ｎ－（５－フルオロ－２－（１－ヒドロキシシクロブチル）フェニル）アセトアミド（２４ｇ、１０７．５０ｍｍｏｌ）と、ＣＨ2Ｃｌ2 （１７０ｍＬ）及び水（１７０ｍＬ）との混合物に、硝酸銀（ＡｇＮＯ3）（５．４８ ｇ、３２．２５ｍｍｏｌ）及び過硫酸カリウム（Ｋ2Ｓ2Ｏ8）（５８．１２ｇ、２１５．０１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を３０oＣで６ｈ撹拌した。混合物を珪藻土で濾過してＣＨ2Ｃｌ2 （１００ｍＬ）で洗浄し、濾液を濃縮してＦＣＣ（ＥＡ／ＰＥ＝０－４０％）にかけて精製することで、淡黄色の固体状のＮ－（３－フルオロ－８－（オキソ）－５，６，７，８－テトラリン－１－イル））アセトアミド（１４ ｇ）Ｗを得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ ２２２．１ ［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップＤ： Ｎ－（３－フルオロ－７－（ヒドロキシイミノ）－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１－イル）アセトアミド：０oＣで、撹拌しながら、Ｎ－（３－フルオロ－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１－イル）アセトアミド（１４ｇ、６３．２８ｍｍｏｌ）とＴＨＦ（５００ｍＬ）との混合物に１－亜硝酸ブチル（８．４８ｇ、６３．２８ｍｍｏｌ）を添加した後、ｔ－ＢｕＯＫ（８．５２ｇ、７５．９４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０oＣで２ｈ撹拌した。完了した後、混合物をＨＣｌ（２Ｎ）で酸性化してｐＨ＝３に調節した。混合物を酢酸エチル（２００ｍＬｘ３）で抽出し、塩水（１００ｍＬｘ２）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧濃縮した。混合物の粗生成物をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２００ｍＬ）で１０ｍｉｎ研磨し、濾過して濾過ケーキを収集し、真空乾燥させて黄色の固体状のＮ－（３－フルオロ－７－（ヒドロキシイミノ）－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１－イル）アセトアミド（１２ｇ）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ ２５１．１ ［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップＥ： Ｎ，Ｎ′－（３－フルオロ－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１，７－ジイル）ジアセトアミド：Ｎ－（３－フルオロ－７－（ヒドロキシイミノ）－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１－イル）アセトアミド（１２ｇ、４７．９６ｍｍｏｌ）と無水酢酸（９０ｍＬ）及びＴＨＦ（９０ｍＬ）との溶液に１０％ Ｐｄ／Ｃ（１ｇ）を添加し、混合物を２５oＣで、Ｈ2雰囲気下で１６ｈ撹拌した。０oＣに冷却した後、Ｅｔ3Ｎ（２０ｍＬ）を滴加し、混合物を０oＣで１ｈ撹拌した。珪藻土で濾過して、濾液を氷水（５００ｍＬ）に入れた。酢酸エチル（５００ｍＬｘ３）で抽出し，塩水（２５０ｍＬｘ２）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ濃縮した。残留物をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１２０ｍＬ）で１０ｍｉｎ研磨し、濾過して濾過ケーキを収集し、真空乾燥させて黄色の固体状のＮ，Ｎ′－（３－フルオロ－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１，７－ジイル）ジアセトアミド（７．９ｇ）を得た。ＬＣＭＳ ｍ／ｚ ２７９．１ ［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップＦ： Ｎ，Ｎ′－（３－フルオロ－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１，７－ジイル）ジアセトアミド：Ｎ，Ｎ′－（３－フルオロ－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１，７－ジイル）ジアセトアミド（７．９ｇ、２８．３９ｍｍｏｌ）とＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）との溶液にＨＣｌ水溶液（２Ｎ、１５０ｍＬ）を添加し、混合物を５０oＣで７ｈ撹拌した。０oＣに冷却した後、飽和ＮａＨＣＯ3水溶液を滴加してｐＨ＝８に調節した。酢酸エチル（２００ｍＬｘ３）で抽出し，塩水（２００ｍＬｘ２）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ減圧濃縮して黄色の固体状のＮ，Ｎ′－（３－フルオロ－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１，７－ジイル）ジアセトアミド（６．０ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ６．５７（ｓ，３Ｈ），６．１８（ｔｄ，Ｊ＝１１．１，２．４Ｈｚ，２Ｈ），４．５２（ｄｔ，Ｊ＝１３．３，５．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１３（ｄｄｄ，Ｊ＝１７．５，１３．０，４．６Ｈｚ，１Ｈ），３．００－２．８１（ｍ，１Ｈ），２．６９（ｄｔｄ，Ｊ＝９．４，４．６，２．５Ｈｚ，１Ｈ），２．０９（ｓ，３Ｈ），１．７９（ｑｄ，Ｊ＝１３．０，４．３Ｈｚ，１Ｈ）．ＬＣＭＳｍ／ｚ２３７．１［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップＧ： Ｎ－（８－アミノ－５－クロロ－６－フルオロ－１－オキソ－１，２，３，４－テトラリン－２－イル）アセトアミド：０oＣで、Ｎ，Ｎ′－（３－フルオロ－８－オキソ－５，６，７，８－テトラリン－１，７－ジイル）ジアセトアミド（４．０ｇ、１６．９３ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（８０ｍＬ）との溶液にＮＣＳ（２．２６ ｇ、１６．９３ｍｍｏｌ）を小分けにして添加し、混合物を室温で１６ｈ撹拌した。混合物を２００ｍＬの氷水に入れた。沈殿物を形成し、濾過して収集し、かつ室温で真空乾燥させて黄色の固体状のＮ－（８－アミノ－５－クロロ－６－フルオロ－１－オキソ－１，２，３，４－テトラリン－２－イル）アセトアミド（４．０ｇ）を得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）δ８．１１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｓ，２Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．０，８．０，４．７Ｈｚ，１Ｈ），３．１８－３．０４（ｍ，１Ｈ），２．９１（ｄｄｄ，Ｊ＝１７．５，１２．４，４．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２１－２．０８（ｍ，１Ｈ），１．９９－１．８３（ｍ，４Ｈ）．ＬＣＭＳｍ／ｚ２７１．０［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップＨ： Ｎ－（（９Ｓ）－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１０，１３－ジ（オキソ）－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アセトアミド：Ｎ－（８－アミノ－５－クロロ－６－フルオロ－１－オキソ－１，２，３，４－テトラリン－２－イル）アセトアミド（４．０ｇ、１４．７８ｍｍｏｌ）とトルエン（４００ｍＬ）との混合物に（Ｓ）－４－エチル－４－ヒドロキシル－７，８－ジヒドロ－１Ｈ－ピラノ［３，４－ｆ］インドリジン－３，６，１０（４Ｈ）－トリオン（４．２８ｇ、１６．２５ｍｍｏｌ）、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム（１．１１ｇ、４．４３ｍｍｏｌ）及びオルソクレゾール（１０ｍＬ）を添加し、混合物をＮ2で還流まで加熱し、２４ｈ保持した。減圧して溶媒を除去し、混合物をＦＣＣ（ＴＨＦ／ＣＨ2Ｃｌ2＝０－６０％）にかけて精製することで、褐色の固体状のＮ－（（９Ｓ）－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１０，１３－ジ（オキソ）－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アセトアミド（４．１ｇ）を得た。ＬＣＭＳｍ／ｚ４９８．１［Ｍ＋Ｈ］+。
ステップＩ： （９Ｓ）－１－アミノ－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオン：７０oＣで、Ｎ－（（９Ｓ）－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１０，１３－ジ（オキソ）－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）アセトアミド（２．０ｇ、４．０２ｍｍｏｌ）の、２０ｍＬ濃ＨＣｌ水溶液中の混合物をＮ2下で３６ｈ撹拌した。混合物を減圧濃縮して褐色の固体状の粗生成物（９Ｓ）－１－アミノ－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオン塩酸塩（２ｇ）を得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ４５６．１［Ｍ＋Ｈ］+。
中間体１２
Figure 0007536188000088
 中間体１２：（９Ｓ）－１－アミノ－４－ブロモ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオン臭化水素酸塩を、中間体１１と類似する方法で２－ブロモ－５－フルオロアニリンから合成した。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ５００．０［Ｍ＋Ｈ］+。
中間体１３
Figure 0007536188000089
 中間体１３：（９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－４－メトキシ－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオン塩酸塩を、中間体１１と類似する方法で２－ブロモ－５－フルオロ－４－メトキシアニリンから合成した。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４５２．１［Ｍ＋Ｈ］+。
Ｃ７３０及びＣ７３１の方法
Figure 0007536188000090
 Ｃ７３０及びＣ７３１を、分取ＨＰＬＣにより、（９Ｓ）－１－アミノ－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオン塩酸塩（中間体１１）からＴＦＡ塩形態として調製した。
表Ｉ
Figure 0007536188000091
Ｃ５１８の方法
Figure 0007536188000092
 ステップＪ： Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１０，１３－ジ（オキソ）－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド：粗生成物（９Ｓ）－１－アミノ－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオン塩酸塩（５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）と２ｍＬのＤＭＦとの溶液に２－ヒドロキシ酢酸（１１．６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５７．９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した後、０oＣでＥｔ3Ｎ（２０．５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を滴加し、混合物を０oＣから室温まで２ｈ撹拌した。混合物を１０ｍＬの氷水に入れ、酢酸エチル（２０ｍＬｘ３）で抽出し，塩水（２０ｍＬｘ２）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製することで、黄色の固体状のＮ－（（１Ｓ，９Ｓ）－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１０，１３－ジ（オキソ）－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド（６ｍｇ）、及び黄色の固体状のＮ－（（１Ｓ，９Ｓ）－４－クロロ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－１０，１３－ジ（オキソ）－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－２－ヒドロキシアセトアミド（５ｍｇ）を得た。
下記表ＩＩ中の調製された化合物は、実施例Ｃ５１８と同じ方法で反応と後処理を行った。
表ＩＩ
Figure 0007536188000093
Figure 0007536188000094
Figure 0007536188000095
Figure 0007536188000096
Figure 0007536188000097
Figure 0007536188000098
Figure 0007536188000099
Figure 0007536188000100
下記表ＩＩＩ中の調製された化合物を、上述した、Ｃ５１８と類似した方法を利用して、中間体１２又は中間体１３から合成した。
表ＩＩＩ
Figure 0007536188000101
Figure 0007536188000102
Figure 0007536188000103
Figure 0007536188000104
Figure 0007536188000105
Figure 0007536188000106
Figure 0007536188000107
Ｃ５８９の方法
Figure 0007536188000108
 ステップＫ： （Ｓ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－４－メチル－１０，１３－ジ（オキソ）－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－３－ヒドロキシルブチロアミド：（１Ｓ，９Ｓ）－１－アミノ－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－４－メチル－１，２，３，９，１２，１５－ヘキサヒドロ－１０Ｈ，１３Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１０，１３－ジオンメタンスルホン酸塩（５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、ＣＡＳ：１６９８６９－９０－３）と２ｍＬのＤＭＦとの溶液に（Ｓ）－３－ヒドロキシ酪酸（１５．６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（５７．９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した後、０oＣでＥｔ3Ｎ（２０．５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を滴加し、混合物を０oＣから室温まで２ｈ撹拌した。混合物を１０ｍＬの氷水に入れ、酢酸エチル（２０ｍＬｘ３）で抽出し，塩水（２０ｍＬｘ２）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させ濃縮した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製することで、黄色の固体状の（Ｓ）－Ｎ－（（１Ｓ，９Ｓ）－９－エチル－５－フルオロ－９－ヒドロキシル－４－メチル－１０，１３－ジ（オキソ）－２，３，９，１０，１３，１５－ヘキサヒドロ－１Ｈ，１２Ｈ－ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３′，４′：６，７］インドリジノ［１，２－ｂ］キノリン－１－イル）－３－ヒドロキシルブチロアミド（９．４ｍｇ）を得た。
下記表ＩＶ中の調製された化合物は、実施例Ｃ５８９と同じ方法で反応と後処理を行った。
表ＩＶ
Figure 0007536188000109
Figure 0007536188000110
Figure 0007536188000111
Figure 0007536188000112
Figure 0007536188000113
リンカーの調製
２．１ リンカーＨＸ２０１１３の調製
Figure 0007536188000114
 ＨＸ２０１１３は、Ｒｉｎｋ－アミド－ＭＢＨＡ－樹脂の一般的な固相ポリペプチド合成方法で合成されたものである。Ｆｍｏｃは、結合ユニット中のアミノ酸を保護するものである。コンジュゲート試薬は、ＨＯＢＴ、ＨＯＡｔ／ＤＩＣ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ又はＨＡＴＵから選択される。合成した後、トリフルオロ酢酸で樹脂を分解した。生成物をＨＰＬＣにかけて精製し凍結乾燥させて使用に備えた。理論質量：１２０７．５９、測定値：［Ｍ－Ｈ］-＝１２０６．７。
リンカーＨＸ２０１１１の調製
Figure 0007536188000115
 ＨＸ２０１１１は、Ｒｉｎｋ－アミド－ＭＢＨＡ－樹脂の一般的な固相ポリペプチド合成方法で合成されたものである。Ｆｍｏｃは、結合ユニット中のアミノ酸を保護するものである。コンジュゲート試薬は、ＨＯＢＴ、ＨＯＡｔ／ＤＩＣ、ＤＣＣ、ＥＤＣＩ又はＨＡＴＵから選択される。合成した後、トリフルオロ酢酸で樹脂を分解した。生成物をＨＰＬＣにかけて精製し凍結乾燥させて使用に備えた。理論質量：１３８３．７０、測定値：［Ｍ－Ｈ］-＝１３８２．６。
リンカー－ペイロード中間体の調製
３．１ 中間体Ｍｃ－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄの調製
中間体Ｍｃ－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄは、市販から購入されるか、又は欧州特許出願公開第２９０７８２４号に記載の方法により調製することができる。該化合物は、リンカー－ペイロード中間体（式（Ｉ）の化合物）の調製に用いることができ、直接（修飾されていていよいた）抗体と結合することでコントロールＡＤＣ ＬＣ１１８４（８）及びコントロールＡＤＣ ＬＣ１１８４（４）を調製することに用いることもできる。
３．２ Ｈ００１９の調製
Figure 0007536188000116
 ＨＸ２１００８－ａの合成
４．３３ｇのＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨと６．８４ｇのＰｂ（ＯＡｃ）4を秤量して、５００ｍＬの一口丸底フラスコに入れた。窒素ガス雰囲気下で無水ＴＨＦ／トルエン（１２０／４０ｍｌ）を添加して、撹拌溶解した。次に反応系に１．１６ｍＬのピリジンを添加した。窒素ガス雰囲気下で、反応系を８０°Ｃまで加熱し、５ｈ還流させた。サンプリングしてＨＰＬＣにより測定することで反応をモニタリングした。
反応系を室温まで冷却し、濾過して濾過ケーキをＥＡで三回洗浄した。濾液を合せて濃縮乾固した。カラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝１００：０～５０：１００）精製により２０００ ｍｇの白色固体状の目的物を得て、収率は４４％であった。
Ｈ０００５－ａの合成
２００ｍｇのＨＸ２１００８－ａを秤量して、１００ｍｌの一口丸底フラスコに入れた。次に、１５ｍｌのＴＨＦを添加して撹拌溶解した。次に、Ｈ０００５（３１６ｍｇ，３．０ｅｑ）及びＴｓＯＨ・Ｈ2Ｏ（１５ｍｇ，０．１５ｅｑ）を添加した。反応系を室温で一晩反応させた。サンプリングしてＴＬＣ（ＰＥ／ＥＡ＝１：１）により測定することで反応をモニタリングした。原料は実質的に消失し、新しいスポットが現れた。
飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加して反応をクエンチした。ＥＡで３回抽出した。有機相を合わせて塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ濃縮した粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＰＥ：ＥＡ＝５：１～１：１）により精製して、約１６５ｍｇの無色油状物の目的物を得て、収率は６０％であった。ＭＳ：［Ｍ＋Ｈ］+＝５０３．４．
Ｈ０００５－ｂの合成
２００ｍｇのＨ０００５－ａを秤量して、１００ｍｌの一口丸底フラスコに入れた。次に、１０ｍｌのＥｔＯＨ及び５ｍｌのＥＡを添加して完全に溶解させた。次に窒素ガス雰囲気下で反応系に４０ｍｇのパラジウム炭素を添加し、反応系に窒素ガスを３回通した。反応系を水素ガス雰囲気に保ち、室温で０．５ｈ撹拌した。サンプリングしてＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０：１）により測定することで反応をモニタリングした。原料は実質的に消失し、新しいスポットが現れた。
反応系を濾過して、濾過ケーキをＥＡで３回洗浄した。濾液を合せて濃縮乾固して、２００ｍｇの白色固体状の生成物を得て、収率は１００％であった。生成物は、精製することなく、そのまま次の反応に用いられた。［Ｍ＋Ｈ］+＝４１３．３．
Ｈ０００５の合成
２．０ｇのジクロロ樹脂を秤量してペプチド合成チューブに入れた。ＤＣＭ（１０ｍｌ）を添加して室温で３０分間膨潤させた。真空吸引により溶媒を除去した。毎回では体積７ｍＬ、時間１分間という条件で、樹脂をＤＣＭで２回洗浄した。真空吸引により溶媒を除去した。次にＨ０００５－ｂ（２００ｍｇ）を秤量して５０ｍｌの遠心管に入れた。ＤＣＭ（約１０ｍｌ）を添加し、振とうにより固体を溶解させた。上記樹脂に添加した。全ての樹脂を溶液に浸漬させるように撹拌した（管壁に樹脂が付着していれば、少量のＤＣＭで管壁を洗浄する）。４～５時間撹拌した。反応が完了した後、適量のメタノールを添加した。３０分間撹拌した。真空吸引により溶媒を除去した。毎回では体積１０ｍＬ、時間１分間という条件で、樹脂を順にＤＭＦで１回、メタノールで１回、ＤＭＦで１回、タノールで１回、ＤＭＦで２回洗浄した。真空吸引により溶媒を除去した。少量の乾燥樹脂を対象としてニンヒドリン検出を行った。樹脂が無色透明であり、溶液が淡黄色を呈し、次のステップのカップリングには合格していることを示唆した。
１０ｍＬの既製の２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を添加することにより２回の脱保護を行い、毎回では１０分間反応させた。反応が完了した後、真空吸引により溶液を除去した。毎回では体積１０ｍＬ、時間１分間という条件で、樹脂を順にＤＭＦで２回、メタノールで１回、ＤＭＦで１回、タノールで１回、ＤＭＦで２回洗浄した。真空吸引により溶媒を除去した。少量の乾燥樹脂を対象としてニンヒドリン検出を行った。樹脂と溶液は、いずれも濃青色であった。
５０ｍＬの遠心管に５６３ ｍｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、１９７ｍｇのＨＯＢｔを添加した。次にＤＭＦを約７ｍＬ添加した。振とうにより固体を溶解させた。次にＤＩＣを０．２４ｍＬ添加した。１０～３０分間活性化して活性化反応溶液を得た。
３モル当量の活性化反応溶液を樹脂に添加した。樹脂を完全に溶液に浸漬させるように撹拌した（管壁に樹脂が付着していれば、少量のＤＣＭで管壁を洗浄する）。２～３時間撹拌した。反応が完了した後、真空吸引により溶媒を除去した。毎回では体積１０ｍＬ、時間１分間という条件で、樹脂を順にＤＭＦで２回、メタノールで１回、ＤＭＦで１回、タノールで１回、ＤＭＦで２回洗浄した。真空吸引により溶媒を除去した。少量の乾燥樹脂を対象としてニンヒドリン検出を行った。樹脂が無色透明であり、溶液が淡黄色を呈し、次のステップのカップリングには合格していることを示唆した。
１０ｍＬの既製の２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を添加することにより２回の脱保護を行い、毎回では１０分間反応させた。反応が完了した後、真空吸引により溶液を除去した。毎回では体積１０ｍＬ、時間１分間という条件で、樹脂を順にＤＭＦで２回、メタノールで１回、ＤＭＦで１回、タノールで１回、ＤＭＦで２回洗浄した。真空吸引により溶媒を除去した。少量の乾燥樹脂を対象としてニンヒドリン検出を行った。樹脂と溶液は、いずれも濃青色であった。
５０ｍＬの遠心管に５３１ｍｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、１９７ｍｇのＨＯＢｔを添加した。次にＤＭＦを約１０ｍＬ添加した。振とうにより固体を溶解させた。次にＤＩＣを０．２４ｍＬ添加した。１０～３０分間活性化して活性化反応溶液を得た。
３モル当量の活性化反応溶液を樹脂に添加した。樹脂を完全に溶液に浸漬させるように撹拌した（管壁に樹脂が付着していれば、少量のＤＣＭで管壁を洗浄する）。２～３時間撹拌した。反応が完了した後、真空吸引により反応溶液を除去した。毎回では体積１０ｍＬ、時間１分間という条件で、樹脂を順にＤＭＦで２回、メタノールで１回、ＤＭＦで１回、タノールで１回、ＤＭＦで２回洗浄した。真空吸引により溶媒を除去した。少量の乾燥樹脂を対象としてニンヒドリン検出を行った。樹脂が無色透明であり、溶液が淡黄色を呈し、次のステップのカップリングには合格していることを示唆した。
１０ｍＬの既製の２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を添加することにより２回の脱保護を行い、毎回では１０分間反応させた。反応が完了した後、真空吸引により溶液を除去した。毎回では体積１０ｍＬ、時間１分間という条件で、樹脂を順にＤＭＦで２回、メタノールで１回、ＤＭＦで１回、タノールで１回、ＤＭＦで２回洗浄した。真空吸引により溶媒を除去した。少量の乾燥樹脂を対象としてニンヒドリン検出を行った。樹脂と溶液は、いずれも濃青色であった。
５０ｍＬの遠心管に４６２ｍｇのＭＣ－ＯＳｕ、１０ｍＬのＤＭＦを添加した。振とうにより固体を溶解させた。次に、樹脂に０．２４ｍＬのＤＩＥＡを添加した。樹脂を完全に溶液に浸漬させるように撹拌した（管壁に樹脂が付着していれば、少量のＤＣＭで管壁を洗浄する）。２～３時間撹拌した。反応が完了した後、真空吸引により反応溶液を除去した。毎回では体積１０ｍＬ、時間１分間という条件で、樹脂を順にＤＭＦで２回、メタノールで１回、ＤＭＦで１回、タノールで１回、ＤＭＦで２回洗浄した。真空吸引により溶媒を除去した。少量の乾燥樹脂を対象としてニンヒドリン検出を行った。樹脂が無色透明であり、溶液が淡黄色を呈し、次のステップのカップリングには合格していることを示唆した。
樹脂を１０ｍＬのメタノールで２回洗浄した。次に、真空吸引により溶媒を完全に除去した。樹脂を取出して、秤量した。ＴＦＥ／ＤＣＭの割合が８０％／２０％、体積がペプチド樹脂の重量の７～８倍であるように、溶解緩衝液を２５０ｍＬの三角フラスコにおいて調製した。溶解緩衝液をペプチド樹脂に添加して、均一に振り混ぜた。樹脂を完全に溶解緩衝液に浸漬させて、室温で２～３時間溶解させた。次に溶解緩衝液を、注射器で製造されたシンプルな濾過器で濾過し、樹脂を１～２ｍｌのＤＣＭで洗浄しかつ廃棄した。その後に溶解緩衝液に１５０ｍＬの予め冷却させた無水エーテルを添加し、均一に振り混ぜ、その後に２０～３０分間静置した。５０ｍＬの遠心管を使用して、上記系を遠心分離機で３５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を取出して廃棄した。個体を予め冷却させた無水エーテルで振とうして、１回超音波洗浄し、３５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を取出して廃棄した。固体を遠心分離管に入れて一晩風乾し、次に分取精製して、１２５ｍｇの白色固体の生成物を得て、収率が４０％であった。［Ｍ＋Ｈ］+＝６４５．４．
Ｈ００１３の合成
１５０ｍｇの原料Ｈ０００５及び５５ｍｇのＴＳＴＵを秤量し、１０ｍＬの一口丸底フラスコに入れ、窒素ガス雰囲気で無水ＤＭＦ（３ｍＬ）を添加して２０ｍｉｎ撹拌した。次に反応系に１８ｍｇのＴＳＮ ００６４３及び２０μｌのＤＩＥＡを順に添加した。窒素ガス雰囲気下で、室温で２ｈ撹拌した。サンプリングしてＨＰＬＣにより測定することで反応をモニタリングした。原料ピークは実質的に消失し、新しいピークが現れた。
反応系を分取精製し、目的物を収集して凍結乾燥して、約２２ｍｇの淡黄色固体の生成物を得た。［Ｍ＋Ｈ］+＝１０６２．７．
Ｈ００１９の合成
Ｈ００１３（３０ｍｇ）を秤量し、１０ｍＬの一口丸底フラスコに入れて、精製水（２ｍｌ）を添加した。撹拌して溶解させた。反応系にＨＸ２０１１１（１９．５ｍｇ）を含むＤＭＦ溶液（２ｍＬ）を添加して撹拌した。一晩反応させた後、全ての原料が中間体に変換されるまで、ＨＰＬＣで反応をモニタリングした。次に、反応系を０－１０℃に冷却し、温度を制御しながら、反応系のｐＨ値が約１２になるまで反応系に０．５％のＬｉＯＨ溶液を添加した。反応液を２０ｍｉｎ撹拌し、全ての中間体が消費されるまでＨＰＬＣで反応をモニタリングし、その後、反応系に３０％の酢酸（１．５ｍＬ）を添加して反応をクエンチした。
反応系を分取精製し、目的物を収集して凍結乾燥して、約２５ｍｇの淡黄色固体の生成物を得た。［（Ｍ＋３Ｈ）／３］+＝１１８２．３．
３．３ Ｈ００２０、Ｈ００２１、Ｈ００３４及びＨ００３５
類似する合成経路及び試薬で、リンカー－ペイロード中間体Ｈ００２０、Ｈ００２１、Ｈ００３４及びＨ００３５を調製することができる。Ｈ００１３と類似する方法で、中間体Ｈ００１４、Ｈ００１５、Ｈ００２６及びＨ００３２を合成し、その後、それぞれＨ００２０、Ｈ００２１、Ｈ００３４及びＨ００３５の合成に用いた。
Figure 0007536188000117
Figure 0007536188000118
 ＬＣ－Ｍｓデータは以下の表に示すとおりである。
Figure 0007536188000119
 ３．４ ＬＢ３０２－２－４の調製
Figure 0007536188000120
 ＨＸ ２０１１１と中間体ＭＣ－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄ（モル比が約１：２である）を秤量し、それぞれ水とＤＭＦに溶解し、次に十分に混合して混合物を得て、０～４０°Ｃで０．５～３０ ｈ反応させた。反応が完了した後、反応混合物に適量のＴｒｉｓ－Ｂａｓｅ溶液又は開環反応を促進する他の溶液を直接添加し、次に０～４０°Ｃでさらに０．２～２０ｈ反応させた。反応が完了した後、生成物を半分取／分取ＨＰＬＣで精製し凍結乾燥してリンカー－ペイロード中間体ＬＢ ３０２－２－４を得た。理論質量：３４８６．５２、測定値：［（Ｍ＋３Ｈ）／３］+＝１１６３．３。
３．５ ＬＢ３０２－２－１の調製
ＬＢ３０２－２－１は、類似する合成経路及び試薬で調製することができる。
Figure 0007536188000121
抗体発現ベクターの構築、抗体発現、精製及び同定
４．１ 修飾された抗ヒトＨＥＲ２抗体Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣの調製
抗体Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣ（軽鎖ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、重鎖：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）の発現プラスミドは以下のように構築される。抗体Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣの配列：トラスツズマブのアミノ酸配列に基づいて、軽鎖のＣ末端にＧＡＬＰＥＴＧＧが導入され、そのうちＬＰＥＴＧＧはリガーゼドナー基質の認識配列であり、ＧＡはスペーサー配列である。プラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、細胞集団を確立しかつ高発現細胞集団をスクリーニングし、５－１０Ｌの反応器におけるトラスツズマブの培養過程を参照して培養し、上澄液を収集した。
４．２ 抗体Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣの精製
Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣの精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔアフィニティークロマトグラフィーとＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた標準的なプロセスで行われ、精製された生成物を元のトラスツズマブ薬物緩衝液（５ｍＭのヒスチジン－ＨＣｌ、２％のトレハロース、０．００９％のポリソルベート２０、ＰＨ ６．０）に溶解し、等量かつ少量ずつ冷凍した。
４．３ 抗体Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣの質量制御
上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより精製された抗体Ａｂ ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣの純度は９８．５％であり、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、試料中の高分子ポリマーの含有量が０．４％未満であって、エンドトキシンの含有量は０．０９８ ＥＵ／ｍｇ未満であると検出された。
４．４ 他の修飾された抗ヒト抗体の調製
類似する方法に基づいて、トラスツズマブの軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端にそれぞれリガーゼ認識配列に基づく末端修飾を導入し、修飾された抗体を得た。
Ａｂ０００１（トラスツズマブ）に基づく修飾された抗ヒトＨＥＲ２抗体は以下の表に示すとおりである。末端修飾配列におけるＬＰＥＴＧＧはリガーゼドナー基質の認識配列であり、ＧＡはスペーサー配列である。
修飾された抗ヒトＨＥＲ２抗体
Figure 0007536188000122
抗体－小分子コンジュゲートの調製
５．１ リンカー－ペイロード中間体は、それぞれリガーゼにより抗体と部位特異的にコンジュゲートしてＡＤＣを形成する。コンジュゲーション反応の方法は、国際公開第２０１５１６５４１３号からに見つけることができる。生成されたＡＤＣは以下の表に示すとおりである。
Figure 0007536188000123
５．２ コントロールＡＤＣ ＬＣ １１８４（８）及びＬＣ １１８４（４）は、中間体Ｍｃ－ＧＧＦＧ－ＤｘｄをＡｂ ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣに直接結合（Ｃｙｓコンジュゲート、即ちマレイミド構造とＣｙｓのメルカプト基とで形成される結合によりコンジュゲートする）することにより調製される。コンジュゲーション反応の方法は当分野で周知である。ＬＣ １１８４（８）には、還元された鎖間システインにより８つのＭｃ－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄを導入する。ＬＣ １１８４（４）には、還元された鎖間システインにより４つのＭｃ－ＧＧＦＧ－Ｄｘｄを導入する。
効果例１ 小分子が細胞増殖に与える影響
研究の目的：本実験は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いて細胞活性を測定することにより、小分子化合物が高ＨＥＲ２腫瘍細胞株ＳＫ－ＢＲ－３の増殖に与える影響を評価し、かつ小分子化合物が腫瘍細胞増殖に与える影響を分析する。
材料及び装置
ＰＢＳ：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１００１０－０２３）；トリプシン：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃２５２０００５６）；ＦＢＳ：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１０２７０－１０６）；ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃Ｇ７５７３）；ＭｃＣｏｙ’５Ａ：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１６６００－０８２）；Ｌ１５：Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ＃ＳＨ３０５２５．０１）；ＤＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１１９９５－０６５）。９６ウェルプレートＣｏｒｎｉｎｇ／３６０３；９６ウェルディープウェルプレート：Ｔｈｅｒｍｏ／２７８７４３；１５ｍＬ微量遠心チューブ：Ｔｈｅｒｍｏ／３３９６５０；１．５ｍＬ微量遠心チューブ：Ｂｅａｖｅｒ。
細胞接種－１日目
（１）細胞の顕微鏡検査
（２）消化：２ｍＬの０．２５％トリプシンで３分間消化した。
（３）遠心分離：１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ；
（４）細胞計数
Ａ．細胞希釈：
Ｂ．細胞接種：１００μｌ／ウェル
Ｃ．インキュベート：３７℃、５％のＣＯ2、一晩越し
細胞試験
（１）（顕微鏡検査）
（２）薬物の調製：
Ａ．試料調製用緩衝液の調製：試験細胞の培地（１０％のＦＢＳ）を用いて必要な量の試料調製用緩衝液を調製した。
Ｂ．試料調製：９６ディープウェルプレートでサンプルを第１の濃度から所望の濃度に希釈した。
試験化合物：細胞培地で、１０００、２００、４０、８、１．６、０．３２、０．０６４、０．０１２８、０．００２５６及び０．０００５１２ｎＭという１０つの最終濃度に希釈して調製した。
陽性対照ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）：２．５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を使用し、細胞培地で希釈した。２５０倍希釈を行い、次に化合物を投与する際に、ピューロマイシンの試験濃度５μｇ／ｍｌになるように、２倍希釈を行った。
（３）化合物の投与：化合物を希釈系列の各濃度がそれぞれ３つの重複があるように投与した。１００μｌ／ウェル。
（４）薬物を与えた後、細胞をインキュベータで１２０ｈインキュベートした。
細胞活性試験
（１）検出試薬の調製：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ試薬を遮光しながら室温まで昇温させた。
（２）細胞調製：インキュベータから試験対象細胞を取り出し、室温（２５℃）で３０ｍｉｎ平衡化した。
（３）ＡＴＰ測定：培地を捨て１００μｌ／ウェルのＤＭＥＭを添加し、５０μｌ／ウェルのＣＴＧを９６ウェルプレートに添加し、アルミニウム箔で遮光し、ボルテックスミキサーを用いて室温で２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ振とうさせた。
（４）測定プログラム：プログラムを設定した後、カバーを付けず黒壁透明底プレートを機器に配置した。
（５）データ収集
５．データ処理及び分析
ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いてデータ処理した。４ラメータ曲線モデルを用いて対照試料又は試験試料の濃度に対する細胞増殖阻害率の図を描画し、データフィッティングを行って、それぞれ対照試料と試験試料のＲ2（有効数字が４桁になるまで四捨五入する）及びＩＣ50（有効数字が４桁になるまで四捨五入する）又はＥＣ50を得た。必要があれば、試料Ａの相対生物活性即ち比活性を計算した。Ｄｘｄを、比活性を計算するための対照試料とした。
細胞増殖阻害率（％）＝（薬物処理群の発光値－ｐｕｒｏ群の発光値）／（ブランク対照群の発光値－ｐｕｒｏ群の発光値）×１００（ｐｕｒｏ群は即ちｐｕｒｏｍｙｃｉｎ処理群である）
試料の比活性（％）＝（対照試料のＩＣ50値／試験試料のＩＣ50値）×１００
対照試料の比活性（％）＝（対照試料のＩＣ50値／前の試験試料のＩＣ50値）×１００
６．結果検証
Ｒ2値≧０．９５０、重複ウェル間のＣＶ％≦３０％。
結果：
結果は、以下の表に示すとおりである。
Figure 0007536188000124
 効果例２ ＨＥＲ２を標的とするコンジュゲートが細胞増殖に与える影響
研究の目的：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いて検出細胞活性を測定することにより、ＡＤＣの二種類の高ＨＥＲ ２腫瘍細胞株ＳＫ－ＢＲ－３、ＮＣＩ－Ｎ ８７及びＨＥＲ ２陰性腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の増殖に対する影響を評価し、かつＡＤＣの腫瘍細胞増殖に対する影響を分析する。
材料及び装置
ＰＢＳ：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１００１０－０２３）；トリプシン：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃２５２０００５６）；ＦＢＳ：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１０２７０－１０６）；ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ：Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ＃Ｇ７５７３）；ＭｃＣｏｙ’５Ａ：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１６６００－０８２）；Ｌ１５：Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔ＃ＳＨ３０５２５．０１）；ＤＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃１１９９５－０６５）。９６ウェルプレートＣｏｒｎｉｎｇ／３６０３；９６ウェルディープウェルプレート：Ｔｈｅｒｍｏ／２７８７４３；１５ｍＬ微量遠心チューブ：Ｔｈｅｒｍｏ／３３９６５０；１．５ｍＬ微量遠心チューブ：Ｂｅａｖｅｒ。
細胞接種－１日目
（１）細胞の顕微鏡検査
（２）消化：２ｍＬの０．２５％トリプシンで３分間消化した。
（３）遠心分離：１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ；
（４）細胞計数
Ａ．細胞希釈：
Ｂ．細胞接種：１００μｌ／ウェル
Ｃ．インキュベート：３７℃、５％のＣＯ2、一晩越し
細胞試験
（１）顕微鏡検査
（２）薬物の調製：
Ａ．試料調製用緩衝液の調製：試験細胞の培地（１０％のＦＢＳ）を用いて必要な量の試料調製用緩衝液を調製した。
Ｂ．試料調製：９６ディープウェルプレートでサンプルを第１の濃度から所望の濃度に希釈した。
試験試料：細胞培地で、２００、４０、８、１．６、０．３２、０．０６４、０．０１２８、０．００２５６、０．０００５１２及び０．０００１０２４ｎＭという１０つの最終濃度に希釈して調製した。
陽性対照ピューロマイシン：１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液を使用し、細胞培地で希釈した。１００倍希釈を行い、次に化合物を投与する際に、ピューロマイシンの試験濃度５μｇ／ｍｌになるように、１０倍希釈を行った。
（３）化合物の投与：化合物を希釈系列の各濃度がそれぞれ３つの重複があるように投与した。１００μｌ／ウェル。
（４）薬物を与えた後、細胞をインキュベータで１２０ｈインキュベートした。
細胞活性試験
（１）検出試薬の調製：ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ試薬を遮光しながら室温まで昇温させた。
（２）細胞調製：インキュベータから試験対象細胞を取り出し、室温（２５℃）で３０ｍｉｎ平衡化した。
（３）ＡＴＰ測定：培地を捨て１００μｌ／ウェルのＤＭＥＭを添加し、５０μｌ／ウェルのＣＴＧを９６ウェルプレートに添加し、アルミニウム箔で遮光し、ボルテックスミキサーを用いて室温で２００ｒｐｍで１０ｍｉｎ振とうさせた。
（４）測定プログラム：プログラムを設定した後、カバーを付けず黒壁透明底プレートを機器に配置した。
（５）データ収集
５．データ処理及び分析
ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いてデータ処理した。４ラメータ曲線モデルを用いて対照試料又は試験試料の濃度に対する細胞増殖阻害率の図を描画し、データフィッティングを行って、それぞれ対照試料と試験試料のＲ2（有効数字が４桁になるまで四捨五入する）及びＩＣ50（有効数字が４桁になるまで四捨五入する）又はＥＣ50を得た。
細胞増殖阻害率（％）＝（薬物処理群の発光値－ｐｕｒｏ群の発光値）／（ブランク対照群の発光値－ｐｕｒｏ群の発光値）×１００（ｐｕｒｏ群は即ちｐｕｒｏｍｙｃｉｎ処理群である）
６．結果検証
Ｒ2値≧０．９５０、重複ウェル間のＣＶ％≦３０％。
結果：
結果は、以下の表、図１、図２及び図３に示すとおりである。
Figure 0007536188000125
ＨＥＲ２高発現ＳＫ－ＢＲ－３及びＮＣＩ－Ｎ ８７において、コンジュゲート（ＣＨ－２－５８９、ＣＨ－２－５９３、ＣＨ－２－５１８、ＬＣ３０２－２－１（４）及びＬＣ３０２－２－４（４））は、顕著な効果を示した。コンジュゲートのＩＣ50値は、小分子ペイロードＤｘｄよりも小さい。ＨＥＲ２陰性細胞において、コンジュゲートは最小の効果を示した。ＨＥＲ２陰性細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８において細胞毒性が観察されず、コンジュゲートの安定性が証明され、ペイロードの標的外放出が減少しているため、良好な安全性を有する。以上により、コンジュゲートが用量依存的にＨＥＲ２依存性細胞傷害活性を示し、良好なターゲティング能力、顕著な効力及び良好な安全性を示したことが明らかになる。
効果例３ バイスタンダー殺傷効果の評価
試験目的：ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞株ＳＫ－ＢＲ－３とＨＥＲ２陰性腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４６８の共培養システムにおいてＡＤＣ（ＣＨ－２－５８９、ＣＨ－２－５９３、ＣＨ－２－５１８及びＬＣ３０２－２－４（４））によるＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞へのバイスタンダー殺傷活性を測定し、構造がＤＳ８２０１ａと類似するコントロールＡＤＣ （ＬＣ１１８４ （８））とバイスタンダー殺傷効果を比較した。
材料及び装置
Ｌ１５： Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０５２５．０１；ＭｃＣｏｙ′ｓ ５Ａ： Ｇｉｂｃｏ、１６６００－０８２；ＦＢＳ： Ｇｉｂｃｏ、１００９９－１４１；ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット：Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、ＲＧ００６；５０ｍｌ遠沈管：ｃｏｒｎｉｎｇ、４３０８２９、 １５ｍｌ遠沈管：ｃｏｒｎｉｎｇ、４３０７９１；９６ウェルプレート：ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９９；ＣＯ2細胞インキュベータ：Ｔｈｅｒｍｏ； 遠心分離機：Ｔｈｅｒｍｏｓ、Ｌ５５０；顕微鏡：Ｎｉｋｏｎ、ＩＳＺ；細胞カウンター：Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ、ＩＣ１０００；Ｃｙｔａｔｉｏｎ３プレートリーダー：ＢｉｏＴｅｋ、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３；ＨＴＸマルチモードマイクロプレートリーダー：ＢｉｏＴｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸ；ＳＫ－ＢＲ－３：ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－３０；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－Ｌｕｃ－ＧＦＰ：レンチウイルス感染を用いて自製した。
実験方法
１）細胞収集及び計数。
２）細胞密度を１＊１０5細胞／ｍｌに調整した
３）ＳＫＢＲ３：ＭＤＡ－ＭＢ－４６８－Ｌｕｃ－ＧＦＰ＝４：１，５ｍｌとして細胞混合物を調製した。
細胞接種：１＊１０4細胞／ウェル、１００μｌ／ウェル
試験試料：細胞培地で、５０、１０及び１ｎＭという３つの最終濃度に希釈して調製した。
４）２日目に薬物を投与し、１００μｌ／ウェルにした。
５）３７℃の５％のＣＯ2インキュベータで１２０ｈ培養した。
（１）ＰＢＳで洗浄して死細胞を除去し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３プレートリーダーで検出し、
（２）碧雲天社製ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット：１００μｌの溶解緩衝液を用いて３７℃のインキュベータで１０ｍｉｎ溶解した。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｌの上澄液を取った。１００μｌの基質を添加した。化学発光をマイクロプレートリーダーにより検出した（ゲイン：２００）。
結果：
２種の方法（ＧＦＰ蛍光計数法及びルシフェラーゼ基質発光法）をバイスタンダー殺傷効果の検出に用いた（図４ａ、４ｂ及び図５）。
この２種の方法を用いた検出中にコンジュゲート（ＣＨ－２－５９３、ＣＨ－２－５８９、ＣＨ－２－５１８及びＬＣ３０２－２－４（４））は、いずれも顕著なバイスタンダー殺傷効果を示した。ＣＨ－２－５９３は、ＬＣ１１８４（８）に相当するか又はより高いバイスタンダー殺傷効果を示した。
効果例４ コンジュゲートのインビボ評価
４．１ ＪＩＭＴ－１ヒト乳癌異種移植モデル
５ｘ１０6のＪＩＭＴ－１ヒト乳癌細胞（ＨＥＲ２培地）をＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅモデルの右脇に皮下接種した。７日後、腫瘍の平均体積が１４２ｍｍ3に達する場合、担癌マウスを分配し、ＬＣ１１８４（８）及び他の５種の異なるコンジュゲートを静脈内投与し、用量を５ｍｇ／ｋｇとした。カリパスで腫瘍の体積を週に２回測定した。ＬＣ１１８４（８）は、ＬＣ１１８４（４）より高い効力を示し、これは、ペイロードが同じである場合、高いＤＡＲがより高い効力を生じることを示す。ＬＣ３０２－２－１（４）とＬＣ３０２－２－４（４）の効力は、ＬＣ１１８４（８）より高い（図６）。本発明のコンジュゲートは、低いＤＡＲにより高い効力を実現する。
４．２ Ｃａｐａｎ－１ヒト膵臓癌異種移植モデル（１）
５ｘ１０6のＣａｐａｎ－１ヒト膵臓癌細胞（ＨＥＲ２低）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇に皮下接種して、異種移植モデルを得た。８日後、腫瘍の平均体積が１７８ｍｍ3に達する場合、担癌マウスに対して、ＬＣ１１８４（８）及び他の５種の異なるコンジュゲートを静脈内投与し、用量を５ｍｇ／ｋｇとした。カリパスで腫瘍の体積を週に２回測定した。ＬＣ１１８４（８）は、ＬＣ１１８４（４）より高い効力を示した。ＬＣ３０２－２－１（４）とＬＣ３０２－２－４（４）は、ＬＣ１１８４（８）に相当する効力を示した（図７）。
４．３ Ｃａｐａｎ－１ヒト膵臓癌異種移植モデル（２）
研究の目的：本研究の目的は、ＣＨ－２－５８９、ＣＨ－２－５９３、ＣＨ－２－５１８及びＬＣ３０２－２－４（４）の、雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下Ｃａｐａｎ－１ヒト膵臓癌異種移植モデルの治療中のインビボ抗腫瘍効力を評価することである。
研究の設計：
細胞培養：Ｃａｐａｎ－１腫瘍細胞（ＡＴＣＣ－ＨＴＢ－７９）を、３７°Ｃ、空気中５％ ＣＯ2の雰囲気で、２０％ウシ胎児血清、１％抗生物質抗真菌剤が充填されたＩＭＤＭで単層培養物として生体外で維持した。腫瘍細胞に対して、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により一般的な継代培養を週に２回行った。対数増殖段階で増殖した細胞を収穫し、かつ計数して腫瘍接種に用いた。
動物：雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスであり、６～８週齢であり、体重が約１８～２２ｇである。研究は、合計で４８匹（３０プラス６０％）を必要とし、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，ＬＴＤ又は他の認証済みサプライヤーから購入する。
腫瘍接種：各マウスに対して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）を含む０．２ｍＬのＰＢＳ中のＣａｐａｎ－１腫瘍細胞（５×１０6）を右脇に皮下接種して、腫瘍発育を促進した。腫瘍の平均体積が約１５０～２００ｍｍ3に達する場合、動物をランダムに群分けし、処理を開始して、効力研究を行った。各群の被験品投与及び動物数量を以下の実験設計表に示す。
群及び処理
Figure 0007536188000126
腫瘍体積に基づいて実験時間を調整した。
動物飼育：動物を実験室環境に適応させるために、動物が実験室に到着してから、腫瘍接種する前に約１週間の適応期間がある。マウスを特別な病原体がない環境、単一の換気ケージにいるように維持した（各ケージに３匹のマウスとした）。全てのケージ、マット及び水を使用前に消毒した。マウス室で作業するとき、研究者は研究用白衣とラテックス又はエチレン手袋を着用する。各ケージには、動物数量、性別、品種、受領日付、処理、研究番号、群番号及び処理開始日付を示すカードが貼り付けられた。食物と水が入れたケージを週に２回交換する。動物室の環境と光周期の目的条件は、以下のとおりである：
温度：２０～２６°Ｃ
湿度：４０～７０％
明暗サイクル 明期１２時間、暗期１２時間
食餌物質：全ての動物が認証された試験動物市販標準食を自由に摂取できるようにした。食餌中の汚染物質の最大許容濃度は、製造業者によって制御され、定期的に分析された。ヒトの摂取に適したオートクレーブされた市営水道水を、動物は、自由に摂取することができた。食餌物質には腫瘍成長に影響を与える可能性のある既知の汚染物がないとみなされる。
群分け：処理を開始する前に、全ての動物を秤量し、かつ腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は任意の所定の処理の有効性に影響を与える可能性があるため、Ｅｘｃｅｌに基づくランダム化ソフトウェアを使用してマウスを群分けし、その腫瘍体積に基づいて層別ランダム化を行った。これにより、すべての群がベースラインで同等となるよう保証される。
観察：本研究における動物の管理使用に関連するプロトコール及び全ての訂正又は手順は、研究を開始する前に薬明康徳社（ＷｕＸｉ ＡｐｐＴｅｃ）の所内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって審査され承認された。研究期間において、動物のケアと使用は、実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）の規定に従って実施した。接種した後、毎日動物の発病率及び死亡率をチェックした。ルーチンモニタリングの時に、動物を、腫瘍増殖及び処置が正常な挙動に及ぼすあらゆる影響、例えば運動性、飼料及び水の消費、体重増加／減少、目／毛髪のつやびけ、並びに任意のその他の異常な影響についてチェックした。各サブセット内の動物の数に基づいて、死亡及び観察された臨床徴候を記録した。
エンドポイント：主なエンドポイントは、腫瘍の成長が遅延できるか否か、又はマウスが治癒できるか否かを観察することであった。カリパスで毎週二次元で腫瘍の大きさを２回測定し、体積は、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ2で計算し、ｍｍ3で表し、ここでａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径である。次に腫瘍の大きさをＴＧＩ（％）及び相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）値の計算に用いる。各群のＴＧＩは、ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００という式で計算され、Ｔｉは、処理群の所定日における平均腫瘍体積であり、Ｔ０は処理群の処理１日目の平均腫瘍体積であり、Ｖｉはビヒクル対照群のＴｉとは同日の腫瘍体積であり、Ｖ０はビヒクル群の処理１日目の腫瘍平均体積である。
各群のＴ／Ｃ（％）値は、Ｔ／Ｃ％＝ＴRTV／ＣRTV×１００％という式で計算され、（ＴRTV：処理群の相対平均腫瘍体積（ＲＴＶ）、ＣRTV：ＴRTVとは同じ日のビヒクル対照群の相対平均腫瘍体積（ＲＴＶ））各群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は、ＲＴＶ＝Ｖt／Ｖ0という式で計算され、Ｖ0は処理１日目の腫瘍体積であり、Ｖtは所定日の腫瘍体積である。
終了：
１）体重損失：任意の１日において２０％の体重減少を示す動物は、人道的に屠殺するか、又は獣医に連絡する。
２）腫瘍負荷：腫瘍負荷は３，０００ｍｍ3超えてはいけない。腫瘍体積が３，０００ｍｍ3に達したら、直ちに動物個体を屠殺する。
潰瘍化：腫瘍の潰瘍化が生じる場合、以下の手順を適用する。
潰瘍化腫瘍を有する動物を、１週間当たり少なくとも３回モニタリングし、臨床徴候に応じて１日１回まで頻度を増大する。
痂皮を有していない潰瘍化腫瘍は、適切な創傷クレンジング溶液（例えば、Ｎｏｖａｌｓａｎ）で清浄すべきである。獣医によって指示された場合のみ、潰瘍／病変に抗生物質クリームが塗布することができる。
安楽死についての基準には、病変が、（以下のうちの１つ又は複数）：
１週間以内に治癒せず、痂皮も形成しない場合、
直径が５ｍｍを超える場合、
空洞化した場合、
感染の徴候（例えば膿汁の存在）若しくは出血があるか、又は動物が、不快感の徴候（例えば、部位を過度になめる及び噛む）若しく疾病の全身徴候（嗜眠、活動低下、食餌消費量減少、身体状態低下又は体重減少）を示す場合、が含まれる。獣医に連絡して、任意の可能な例外について検討する。
３）臨床徴候：動物の瀕死が見出された場合、安楽死させなければならない（プロトコールに含まれていなければならないように、十分な正当化に基づいてＩＡＣＵＣによって認定され、かつ、加温した皮下輸液、動物が食餌に到達できるように動物の傍にＤｉｅｔ Ｇｅｌ食用カップを置くこと、補助的な熱のために加温パッドの上にケージを置くことなどの、追加的な支持ケアが提供される場合は除外する。注記：瀕死状態とは、動物が生存する可能性が低いことを示す）。これらのエンドポイントに関する質問については、獣医に連絡を取られたい。
発病の臨床例には、以下が含まれ得る。
身を縮める。
持続的臥床、及び取扱い又は他の刺激に対する応答の欠如。
重症臓器又は系不全の徴候。
るい痩。
低体温。
ＣＮＳ欠損痙れん。
呼吸：急速な呼吸、努力性呼吸、咳嗽、ラ音。
ＧＩ：下痢が２日以上持続、黄疸。
上記臨床的問題を示す任意の動物は、ＣＯ2で人道的に屠殺する。
予期せず死亡する場合、剖検は実施しない。
統計的解析２群間の比較には、独立したサンプルのｔ－検定を使用した。３群以上の間の比較は、１元配置分散分析ＡＮＯＶＡを実施した。有意なＦ統計量（誤差分散に対する処理分散の比）が得られた場合、ＡＮＯＶＡの後に多重比較を行った。すべてのデータを、ＳＰＳＳ １７．０を使用して解析した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
結果：
すべてのコンジュゲートは、いずれも顕著な腫瘍抑制効果を示した（図８ａ及び図８ｂ）。
ＮＣＩ－Ｎ８７ヒト胃癌異種移植モデル
研究の目的：本研究の目的は、ＣＨ－２－５８９、ＣＨ－２－５９３、ＣＨ－２－５１８及びＬＣ３０２－２－４（４）の、雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下ＮＣＩ－Ｎ８７ヒト胃癌異種移植モデルの治療中のインビボ抗腫瘍効力を評価することである。
研究の設計：
細胞培養：ＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ｃａｔ＃ＣＲＬ－５８２２）を、３７°Ｃ、空気中５％ＣＯ2の雰囲気で、１０％ウシ胎児血清、１％抗生物質抗真菌剤が充填されたＲＰＭＩ１６４０培地で単層培養物として生体外で維持した。腫瘍細胞に対して、トリプシン－ＥＤＴＡ処理により一般的な継代培養を週に２回行った。対数増殖段階で増殖した細胞を収穫し、かつ計数して腫瘍接種に用いた。
動物：雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスであり、６～８週齢であり、体重が約１８～２２ｇである。研究は、合計で３６匹（３０プラス２０％）を必要とし、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＡｎｉｍａｌＣｏ．，ＬＴＤ又は他の認証済みサプライヤーから購入する。
腫瘍接種：各マウスに対して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）を含む０．２ｍＬのＰＢＳ中のＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍細胞（１０×１０6）を右脇に皮下接種して、腫瘍発育を促進した。腫瘍の平均体積が約１５０～２００ｍｍ3に達する場合、動物をランダムに群分けし、処理を開始して、効力研究を行った。各群の被験品投与及び動物数量を以下の実験設計表に示す。
群及び処理
Figure 0007536188000127
腫瘍体積に基づいて実験時間を調整した。
結果：
すべてのコンジュゲートは、いずれも顕著な腫瘍抑制効果を示した（図９ａ及び図９ｂ）。
効果例５ コンジュゲートのインビトロ血清の安定性
インビトロ血清の安定性の研究について、コンジュゲートのＬＣ３０２－２－１（４）、ＬＣ３０２－２－４（４）及びＬＣ１１８４（８）をそれぞれ３７°Ｃの混合ヒト血清に接種した。０、２４、４８及び９６時間に、抗原でコンジュゲートを捕捉した後、グリコシダーゼで脱グリコシル化し、かつ酸で解離した。上澄液を収集し遠心分離した後、高分解能ＬＣ－ＭＳにより検出してＤＡＲを決定した。
ＬＣ３０２－２－１（４）とＬＣ３０２－２－４（４）は、血清に９６時間インキュベートした後、非常に安定する。９６時間インキュベートした後、ＬＣ３０２－２－１（４）とＬＣ３０２－２－４（４）のＤＡＲには、見られる低下はなかった。しかしながら、ＬＣ１１８４（８）のＤＡＲは、９６時間インキュベート後に７．８から２．６に低下した（図１０）。リンカーの安定性は、より多くのペイロードが標的腫瘍に送達され、オフターゲットの遊離ペイロードの放出が減少するため、治療指数が向上することを示す。
［配列表］
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴＬ－ＨＣ ＬＣＤＲ１
ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴＬ－ＨＣ ＬＣＤＲ２
ＳＡＳＦＬＹＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴＬ－ＨＣ ＬＣＤＲ３
ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴＬ－ＨＣ ＨＣＤＲ１
ＤＴＹＩＨ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴＬ－ＨＣ ＨＣＤＲ２
ＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴＬ－ＨＣ ＨＣＤＲ３
ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ７： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣ 軽鎖可変ドメイン：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣ 重鎖可変ドメイン：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． ９： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣ 軽鎖全長：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＡＬＰＥＴＧＧ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ． １０： Ａｂ０００１－ＬＣＣＴL－ＨＣ 重鎖全長：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

Claims (17)

  1. 式（Ｉ）の化合物であって、
    Figure 0007536188000128
     ここで、
    ｏｐＳｕは
    Figure 0007536188000129
     又は
    Figure 0007536188000130
     であり、
    Ｒ0はＣ1～ 3 アルキル基であり、
    ｎは２～５の任意の整数であり、
    ｋ１とｋ２は、独立して、１、３又は５の整数であり、
    ｉは１～２０の整数であり、
    ｊは１～２０の整数であり、
    Ｐ１とＰ２は、独立して、以下に示す構造のペイロードである、化合物。
    Figure 0007536188000131
  2. 式（Ｉ－１）に示す構造を有し、
    Figure 0007536188000132
     ここで、
    Ｐ１、Ｐ２、Ｒ0、ｏｐＳｕ、ｎ、ｉ及びｊは、請求項１で定義されているとおりである、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ 0 はメチルであり、及び／又は、
    ｎは３であり、及び／又は、
    ｉは４であり、及び／又は、
    ｊは８又は１２である、
    請求項１又は２に記載の化合物。
  4. Ｒ 0 はメチルであり、ｎは３であり、ｉは４であり、ｊは１２である、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. Figure 0007536188000133
    Figure 0007536188000134
    Figure 0007536188000135
    Figure 0007536188000136
     から選択されるものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
  6. 式（ＩＩ）に示す構造を有し、
    Figure 0007536188000137
     ここで、
    Ａは、抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗体又はその抗原結合断片は、修飾されることで式（Ｉ）
    Figure 0007536188000138
     の化合物における（Ｇｌｙ）n部分に結合し、
    ｚは１～４の整数であり、
    ｏｐＳｕは
    Figure 0007536188000139
     又は
    Figure 0007536188000140
     であり、
    Ｒ 0 はＣ 1 ～ 3 アルキル基であり、
    ｎは２～５の任意の整数であり、
    ｋ１とｋ２は、独立して、１、３又は５の整数であり、
    ｉは１～２０の整数であり、
    ｊは１～２０の整数であり、
    Ｐ１とＰ２は、独立して、以下に示す構造のペイロードである、コンジュゲート。
    Figure 0007536188000141
  7. Figure 0007536188000142
    Figure 0007536188000143
     から選択されるものである、請求項６に記載のコンジュゲート。
  8. 前記抗体は、トラスツズマブである、請求項６又は７に記載のコンジュゲート。
  9. 予防又は治療上の有効量の請求項６～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される少なくとも１種の担体と、を含む医薬組成物。
  10. 前記コンジュゲートの薬物／抗体比（ＤＡＲ）は、１～８の整数又は非整数である、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記コンジュゲートの薬物／抗体比（ＤＡＲ）は、３～４の整数又は非整数である、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 請求項６～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートの、疾患を治療するための薬物の製造における使用であって、前記疾患は腫瘍である、使用。
  13. 請求項９～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物の、疾患を治療するための薬物の製造における使用であって、前記疾患は腫瘍である、使用。
  14. 化合物又はその薬学的に許容される塩であって、該化合物は以下の式
    Figure 0007536188000144
     から選択される構造を有する、化合物又はその薬学的に許容される塩。
  15. 式（１）の化合物であって、
    Figure 0007536188000145
     ここで、
    ｋは１～７の整数であり、
    Ｐは、以下に示す構造を有する、化合物。
    Figure 0007536188000146
  16. ｋは、１、３又は５である、請求項１５に記載の化合物。
  17. Figure 0007536188000147
     から選択されるものである、請求項１５に記載の化合物。
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