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ES2988140T3 - Derivados de Exatecán, cargas útiles de ligador, y conjugados de los mismos - Google Patents

Derivados de Exatecán, cargas útiles de ligador, y conjugados de los mismos Download PDF

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ES2988140T3
ES2988140T3 ES22862412T ES22862412T ES2988140T3 ES 2988140 T3 ES2988140 T3 ES 2988140T3 ES 22862412 T ES22862412 T ES 22862412T ES 22862412 T ES22862412 T ES 22862412T ES 2988140 T3 ES2988140 T3 ES 2988140T3
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Spain
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antibody
compound
tumor
formula
her2
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Active
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English (en)
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Gang Qin
Tony Zhang
Guangming Cheng
Paul Song
Boyu Zhong
Mingyu Hu
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Original Assignee
Genequantum Healthcare Suzhou Co Ltd
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Abstract

La presente divulgación se refiere al campo biofarmacéutico, en particular, a derivados de Exatecan, cargas útiles de enlace y conjugados de los mismos y conjugados anticuerpo-fármaco, y al correspondiente proceso de preparación y uso de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de Exatecán, cargas útiles de ligador, y conjugados de los mismos
Campo técnico
La presente divulgación se refiere al campo biofarmacéutico, en particular, a los derivados de Exatecán, las cargas útiles de ligador, conjugados de los mismos, y conjugados de anticuerpo-fármaco, y el uso correspondiente de los mismos.
Antecedentes
En el tratamiento tradicional de tumores, la quimioterapia es una de las principales estrategias de tratamiento. Sin embargo, la toxicidad fuera del objetivo por acumulación inespecífica en tejidos normales, la ventana terapéutica estrecha y la baja tolerancia limitan el desarrollo del fármaco quimioterápico. En las últimas décadas, las terapias dirigidas que utilizan anticuerpos monoclonales y polipéptidos que se unen a marcadores específicos en la superficie de la célula tumoral han demostrado menos toxicidad que la quimioterapia. Sin embargo, ambos carecen de potencia para matar las células tumorales.
La estrategia de tratamiento de anticuerpos armados con toxinas para matar selectivamente las células objetivo se propuso por primera vez en 1970. El fármaco dirigido al tumor conjuga principalmente compuestos de ADC que generalmente acoplan anticuerpos que reconocen específicamente los antígenos de superficie de las células tumorales con toxinas químicas que matan eficazmente los tejidos tumorales a través de ligadores.
Hasta 2021, más de 120 ADC han estado en proceso de desarrollo clínico.
La mayoría de las cargas citotóxicas desarrolladas pertenecen a dos familias principales: inhibidores de tubulina (maitansinoides o auristatinas) y agentes que dañan el ADN (principalmente caliqueamicinas). Todos ellos son fármacos citotóxicos extremadamente potentes que se caracterizan por un IC50 (las concentraciones inhibidoras que inhibieron el 50 % de las células) en el rango nanomolar y picomolar, y un perfil de toxicidad desfavorable si se administran sistémicamente. La conjugación en ADC oculta el fármaco citotóxico en el torrente sanguíneo para transportarlo directamente a las células tumorales, lo que reduce significativamente la toxicidad de estos potentes agentes. En general, los fármacos con un índice terapéutico más favorable se consideran inadecuados para el desarrollo como agentes de ataque, con un IC50 demasiado bajo para ser eficaz cuando se libera en la cantidad que se administra en las células tumorales.
Las investigaciones sobre los ADC con un aumento de DAR o que exhiben el efecto espectador proponen un nuevo enfoque prometedor para explotar los fármacos menos citotóxicos como agentes de ataque.
Hasta ahora, los agentes antimicrotúbulos tales como las auristatinas (por ejemplo, la monometil auristatina E (MMAE) y F (MMAF)) representan la gran mayoría de los agentes de ataque desarrollados. El brentuximab vedotina, polatuzumab vedotina y enfortumab vedotina son todos ADC aprobados que transportan la carga útil MMAE.
Los inhibidores de la topoisomerasa I (TOP1) se utilizan como agentes de ataque en varios ADC. El sacituzumab govitecán lleva SN-38, el metabolito activo del irinotecán, como agente de ataque. Enhertu (famtrastuzumab deruxtecán (DS8201a), también conocido como T-Dxd) lleva un derivado de Exatecán deruxtecán (Dxd) como el agente de ataque (WO2014057687A), y recientemente fue aprobado para el tratamiento del cáncer de mama. Sobre esta base, se requieren en el campo nuevos inhibidores de la topoisomerasa I de moléculas pequeñas, ya sea utilizados solos o como componente de los ADC, con mayor actividad, estabilidad, y propiedades fisicoquímicas.
Sin embargo, por un lado, Enhertu, así como los otros ADC disponibles comercialmente y la mayoría de los ADC en ensayos clínicos, se preparan por conjugación química, utilizando una estructura de tiosuccinimida (ligamiento de tiosuccinimida) para conjugar el fármaco de molécula pequeña con el anticuerpo o proteína objetivo. La estructura de la tiosuccinimida se forma por la reacción de un grupo tiol y una maleimida. El ligamiento de tiosuccinimida no es estable. En los organismos, la adición o el intercambio de Michael inverso con otros grupos tioles conduce a la disminución de la citotoxina del ADC y a la toxicidad fuera del objetivo, lo que reduce la seguridad y limita la aplicación clínica. Por ejemplo, a pesar de la gran eficacia, Enhertu causó más del 10 % de las enfermedades pulmonares intersticiales, lo que limitó su uso en parte de los pacientes. Por otro lado, la reacción de acoplamiento químico no es específica del sitio, y los ADC resultantes muestran una alta heterogeneidad.
El documento WO 2022/218331, que es la técnica anterior de conformidad con el Art. 54(3) del EPC, divulga una molécula ligadora para dirigirse al conjugado de molécula-fármaco.
El documento EP 2907824 A1 divulga un conjugado de anticuerpo-fármaco.
El documento EP 4 130006 A1 divulga un conjugado análogo de anticuerpo anti-PSMA-exatecán.
El documento EP 3854816 A1 divulga un conjugado análogo de anticuerpo anti-B7H3-exatecán.
El documento US 2021/187114 A1 divulga un ligador adecuado para preparar un conjugado de fármaco dirigido. El documento WO 2018/112253 A1 divulga conjugados de multi-fármaco anticuerpo y fármaco.
El documento EP 3797796 A1 divulga un conjugado de anticuerpo y fármaco.
El documento WO 2021/136475 A1 divulga una molécula ligadora para un conjugado de molécula-fármaco objetivo.
El documento EP 3138568 A1 divulga un conjugado de anticuerpo y fármaco.
Fontaine Shaun D. etal., Bioconjugate Chemistry, vol. 26, no. 1, December26, 2014, páginas 145-152 divulgan la estabilización a largo plazo de los conjugados de maleimida-tiol.
Todavía se necesitan urgentemente nuevos ADC con mayor eficacia y menor toxicidad.
Resumen
La presente invención se refiere a la materia objeto de las reivindicaciones 1 a 14.
En un primer aspecto, se proporciona un compuesto de la fórmula (I):
R0 es alquilo C1-3;
n es un entero de 2 a 5;
k1 y k2 son independientemente 1, 3, o 5;
i es independientemente un entero de 1 a 20;
j es independientemente un entero de 1 a 20;
P1 y P2 son independientemente una carga útil que tiene la siguiente estructura:
En un segundo aspecto, se proporciona un conjugado que tiene la estructura de la fórmula (II):
en la que,
A es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo; el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se modifica para conectarse con la fracción de (Gly)n en el compuesto de la fórmula (I);
z es un entero de 1 a 4; particularmente 2;
P1, P2, R0, opSu, n, k1, k2, i y j son como se define en la fórmula (I).
En un tercer aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente divulgación, y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
En un cuarto aspecto, se proporciona el conjugado de la presente divulgación o la composición farmacéutica de la presente divulgación para uso en tratar una enfermedad; en la que la enfermedad es un tumor; preferiblemente un tumor que comprende células tumorales positivas para HER2.
En un quinto aspecto, se proporciona un compuesto, que tiene una estructura seleccionada de las siguientes fórmulas:
En un sexto aspecto, se proporciona un compuesto de la fórmula (1):
en la que,
k es un entero de 1, o 3 o 5, particularmente 5
P es una carga útil que tiene una estructura como se define en la fórmula (I).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la eficacia de los conjugados en la estirpe celular SK-BR-3 HER2-alta.
La Figura 2 muestra la eficacia de los conjugados en la estirpe celular NCI-N87 HER2-alta.
La Figura 3 muestra la eficacia de los conjugados en la estirpe celular MDA-MB-468 HER2 negativa.
La Figura 4a y la Figura 4b muestran la eficacia de los conjugados en el sistema de cocultivo de SK-BR-3 y MDA-MB-468. La Figura 4a muestra el resultado detectado por la fluorescencia GFP La Figura 4b se muestran los resultados detectados por quimioluminiscencia del sustrato de luciferasa. En la Figura 4a y la Figura 4b, de izquierda a derecha están CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518, LC1184(8) y LC302-2-4(4) respectivamente. La Figura 5 muestra la eficacia de los conjugados en el sistema de cocultivo de SK-BR-3 y MDA-MB-468 detectado por fluorescencia GFP
La Figura 6 muestra el cambio el volumen tumoral medio a lo largo del tiempo en ratones SCID Beige con modelo JIMT1 CDX dosificado con 5 mg/kg de conjugados.
La Figura 7 muestra el cambio del volumen tumoral medio a lo largo del tiempo en ratones BALB/c sin pelaje con modelo Capan-1 CDX dosificados con 5 mg/kg de conjugados.
La Figura 8a y la Figura 8b muestran el cambio del volumen tumoral medio y el cambio en el peso corporal a lo largo del tiempo en ratones BALB/c sin pelaje con modelo Capan-1 CDX dosificados con 5 mg/kg de conjugados.
La Figura 9a y la Figura y 9b muestran el cambio medio del volumen tumoral y el cambio en el peso corporal a lo largo del tiempo en ratones BALB/c sin pelaje con modelo NCI-N87 CDX dosificados con 5 mg/kg de conjugados.
La Figura 10 muestra la estabilidad sérica ex-vivo de los conjugados después de 0, 24, 48 y 96 h de incubación en suero humano combinado.
Descripción detallada
Las realizaciones específicas se proporcionan a continuación para ilustrar el contenido técnico de la presente divulgación. Los expertos en la técnica pueden comprender fácilmente otras ventajas y efectos de la presente divulgación a través de los contenidos divulgados en la especificación. La presente divulgación también se puede implementar o aplicar a través de otras diferentes realizaciones específicas. La invención se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario en lo sucesivo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica. Las técnicas utilizadas en el presente documento se refieren a las que generalmente se entienden en la técnica, que incluyen las variantes y sustituciones equivalentes que son obvias para los expertos en la técnica. Si bien se considera que los siguientes términos son fácilmente comprensibles para los expertos en la materia, las siguientes definiciones se establecen para ilustrar mejor la presente divulgación. Cuando un nombre comercial está presente en el presente documento, se refiere a la materia prima correspondiente o al ingrediente activo de la misma.
Cuando una cierta cantidad, concentración u otro valor o parámetro se establece en forma de un rango, un rango preferido, o un límite superior preferido o un límite inferior preferido, se debe entender que es equivalente para revelar específicamente cualquier rango formado por la combinación de cualquier límite superior o valor preferido con cualquier límite inferior o valor preferido, independientemente de si dicho rango se recita explícitamente. A menos que se indique lo contrario, los rangos numéricos enumerados en el presente documento están destinados a incluir los puntos finales del rango y todos los números enteros y fracciones (decimales) dentro del rango. Por ejemplo, la expresión “ i es un número entero de 1 a 20” significa que i es cualquier número entero de 1 a 20, por ejemplo, i puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. Otras expresiones similares como j, k y g también se deben entender de manera similar.
A menos que el contexto dicte claramente lo contrario, las formas singulares como “un” y “el” incluyen las formas plurales. La expresión “uno o más” o “al menos uno” puede significar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más.
Los términos “alrededor de” y “aproximadamente”, cuando se utilizan en relación con una variable numérica, generalmente significan que el valor de la variable y todos los valores de la variable están dentro de un error experimental (por ejemplo, dentro de un intervalo de confianza del 95 % para la media) o dentro de ± 10 % de un valor especificado, o un rango más amplio.
El término “opcional” u “opcionalmente” significa que el evento descrito posteriormente puede, pero no necesariamente, suceder, y la descripción incluye los casos en los que dicho evento o circunstancia sucede o no sucede.
Las expresiones “que comprende”, “que incluye”, “que contiene” y “que tiene” son ilimitadas, y no excluyen elementos, etapas o ingredientes adicionales no mencionados. La expresión “consistente en” excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no designado. La expresión “que consistente esencialmente en” significa que el ámbito de aplicación se limita a los elementos, etapas o ingredientes designados, además de los elementos, etapas o ingredientes que están presentes opcionalmente y que no afectan sustancialmente a las características esenciales y novedosas de la materia objeto reivindicada. Se debe entender que la expresión “que comprende” abarca las expresiones “que consisten esencialmente en” y “que consisten en”.
Como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo” se utiliza de manera amplia e incluye particularmente los anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoespecíficos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y los fragmentos de anticuerpos, siempre que tengan la actividad biológica deseada. El anticuerpo puede ser de cualquier subtipo (tales como IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase, y se puede derivar de cualquier especie adecuada. En algunas realizaciones, el anticuerpo es de origen humano o murino. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo totalmente humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico preparado por métodos recombinantes.
Los anticuerpos monoclonales se utilizan en el presente documento para referirse a los anticuerpos obtenidos de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos excepto por un pequeño número de posibles mutaciones naturales. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos para un solo sitio antigénico. La palabra “monoclonal” se refiere a que las características del anticuerpo se derivan de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se deben interpretar en el sentido de que requieren algunos métodos particulares para producir el anticuerpo.
Un anticuerpo intacto o un anticuerpo de longitud completa comprende esencialmente la(s) región(es) variable(s) de unión al antígeno, así como la(s) región(es) constante(s) de cadena ligera (CL) y la(s) región(es) constante(s) de cadena pesada (CH), que podrían incluir CH1, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del subtipo del anticuerpo. Una región variable de unión a antígeno (también conocida como una región variable de fragmento, fragmento Fv) normalmente comprende una región variable de cadena ligera (V<l>) y una región variable de cadena pesada (V<h>). Una región constante puede ser una región constante con una secuencia nativa (tal como una región constante con una secuencia nativa humana) o una variante de secuencia de aminoácidos de la misma. La región variable reconoce e interactúa con el antígeno objetivo. La región constante puede ser reconocida e interactúa con el sistema inmunitario.
Un fragmento de anticuerpo puede comprender una porción de un anticuerpo intacto, preferiblemente su región de unión al antígeno o su región variable. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, fragmento Fd que consiste en dominios V<h>y CH1 , fragmento Fv, fragmento de anticuerpo de dominio único (dAb) y región determinante de complementariedad aislada (CDR). El fragmento Fab es un fragmento de anticuerpo obtenido por digestión de papaína de una inmunoglobulina de longitud completa, o un fragmento que tiene la misma estructura producido, por ejemplo, por expresión recombinante. Un fragmento Fab comprende una cadena ligera (que comprende un V<l>y un CL) y otra cadena, en la que dicha otra cadena comprende un dominio variable de la cadena pesada (V<h>) y un dominio de región constante de la cadena pesada (CH1). El fragmento F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo obtenido por la digestión con pepsina de una inmunoglobulina a pH 4.0-4.5, o un fragmento que tiene la misma estructura producido, por ejemplo, por la expresión recombinante. El fragmento F(ab')2 comprende esencialmente dos fragmentos Fab, en los que cada porción de la cadena pesada comprende algunos aminoácidos adicionales, que incluyen las cisteínas que forman enlaces disulfuro que conectan los dos fragmentos. El fragmento AFab' es un fragmento que comprende la mitad de un fragmento F(ab')2 (una cadena pesada y una cadena ligera). El fragmento de anticuerpo puede comprender una pluralidad de cadenas unidas entre sí, por ejemplo, a través de un enlace disulfuro y/o mediante un ligador peptídico. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos también incluyen Fv de cadena simple (scFv), Fv, dsFv, diacuerpo, fragmentos Fd y Fd' y otros fragmentos, que incluyen los fragmentos modificados. Un fragmento de anticuerpo normalmente comprende al menos 50 aminoácidos y, normalmente al menos o aproximadamente 200 aminoácidos. Un fragmento de unión a antígeno puede incluir cualquier fragmento de anticuerpo que, cuando se inserta en un marco de anticuerpos (por ejemplo, mediante sustitución de la región correspondiente), puede dar lugar a un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al antígeno.
Los anticuerpos, de acuerdo con la presente divulgación, se pueden preparar utilizando técnicas bien conocidas en el arte, como las siguientes técnicas o una combinación de las mismas: técnicas recombinantes, técnicas de visualización de fagos, técnicas sintéticas u otras técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo recombinante modificado genéticamente (o un imitador de anticuerpos) se puede expresar mediante un sistema de cultivo adecuado (por ejemplo, células de E. coli o mamíferos). La ingeniería se puede referir a, por ejemplo, la introducción de una secuencia de reconocimiento específica de la ligasa en sus terminales.
HER2 se refiere al receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, que pertenece a la familia de la tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En la presente solicitud, los términos ErbB2 y HER2 tienen el mismo significado y se pueden utilizar indistintamente.
Como se utiliza en el presente documento, el término “conjugado de anticuerpo-fármaco” se refiere como un “conjugado”.
Un compuesto de molécula pequeña se refiere a una molécula con un tamaño comparable al de una molécula orgánica comúnmente utilizada en medicina. El término no abarca macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, etcétera), sino que abarca péptidos de bajo peso molecular o derivados de los mismos, tal como dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos, pentapéptidos y similares. Normalmente, el peso molecular del compuesto de molécula pequeña puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2000 Da, aproximadamente 200 a aproximadamente 1000 Da, aproximadamente 200 a aproximadamente 900 Da, aproximadamente 200 a aproximadamente 800 Da, aproximadamente 200 a aproximadamente 700 Da, aproximadamente 200 a aproximadamente 600 Da, aproximadamente 200 a aproximadamente 500 Da.
Un espaciador es una estructura que se encuentra entre diferentes módulos estructurales y puede separar espacialmente los módulos estructurales. La definición de espaciador no está limitada por si tiene una determinada función o si se puede escindir o degradar in vivo. Los ejemplos de espaciadores incluyen pero no se limitan a aminoácidos y estructuras de no aminoácidos, en las que las estructuras de no aminoácidos pueden ser, pero no se limitan a, derivados o análogos de aminoácidos. “Secuencia espadadora” se refiere a una secuencia de aminoácidos que sirve como un espaciador, y los ejemplos de los mismos incluyen pero no se limitan a un solo aminoácido, una secuencia que contiene una pluralidad de aminoácidos, por ejemplo, una secuencia que contiene dos aminoácidos como GA, etc., o, por ejemplo, GGGGS, GGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGS, etc. Los espaciadores autoinmolativos son conjuntos covalentes diseñados para correlacionar la escisión de dos enlaces químicos después de la activación de una parte protectora en un precursor: Tras la estimulación, se elimina la fracción protectora (tal como una secuencia escindible), lo que genera una cascada de reacciones de desmontaje que conducen a la liberación secuencial temporal de moléculas más pequeñas. Ejemplos de espaciadores autoinmolativos incluyen pero no se limitan a PABC (pbenciloxicarbonilo), acetal, heteroacetal y la combinación de los mismos.
El término “alquilo” se refiere a un grupo de hidrocarburos alifáticos saturados que consiste en átomos de carbono y átomos de hidrógeno, que se conecta al resto de la molécula a través de un solo enlace. Los grupos alquilo comprenden alquilo recto, alquilo ramificado o alquilo cíclico (cicloalquilo) o alquilo parcialmente cíclico (por ejemplo, cicloalquil-alquilo lineal y cicloalquil-alquilo ramificado). El grupo alquilo puede contener de 1 a 10 átomos de carbono, con referencia al grupo alquilo C1-10, por ejemplo, grupo alquilo C1-6, grupo alquilo C1-4, grupo alquilo C1-3, alquilo C1-2, alquilo C3, alquilo C4, alquilo C3-6. Ejemplos no limitantes de grupos alquilo lineales incluyen pero no se limitan a metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Ejemplos no limitantes de grupos alquilo ramificados incluyen pero no se limitan a isopropilo, isobutilo, sec-butilo, tert-butilo, isopentilo, 2-metilbutilo, 1 -metilbutilo, 1 -etilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, neopentilo, 1,1 -dimetilpropilo, 4-metilpentilo, 3-metilpentilo, 2-metilpentilo, 1 -metilpentilo, 2-etilbutilo, 1 -etilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetil butilo, 1,1 -dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo o 1,2-dimetilbutilo, etc.
Los términos “alquilo cíclico” y “cicloalquilo” tienen el mismo significado y se utilizan en el presente documento indistintamente. Los grupos alquilo cíclicos pueden incluir grupos monocíclicos o policíclicos (por ejemplo, que tienen 2 o más de 2 anillos fusionados). En un cicloalquilo multicíclico, dos o más anillos se pueden fusionar, puentear o ser espiro entre sí. Los átomos de carbono formadores de anillos de un grupo alquilo cíclico se pueden sustituir opcionalmente por oxo (es decir, C(O)). Los grupos alquilo cíclicos pueden tener 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 o 10 átomos de carbono formadores de anillos (C3-10). Ejemplos de grupos alquilo cíclicos incluyen pero no se limitan a ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, biciclo[1.1.1]pentilo y biciclo[2.1.1]hexilo. En algunas realizaciones, el alquilo cíclico es un alquilo cíclico monocíclico o bicíclico C3-6, preferiblemente alquilo cíclico monocíclico C3-6, especialmente ciclopropilo.
El término “parcialmente cíclico” se refiere a que el grupo contiene una o más fracciones cíclicas y una o más fracciones acíclicas (es decir, lineales o ramificadas). Los grupos alquilo parcialmente cíclicos pueden incluir grupos alquilo cíclico-alquilo lineal y grupos alquilo cíclico-alquilo ramificado. Los grupos alquilo parcialmente cíclicos pueden tener 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 átomos de carbono (C3-10), que incluyen los átomos de carbono formadores de anillos y los átomos de carbono no formadores de anillos. Ejemplos de grupos alquilo parcialmente cíclicos incluyen pero no se limitan a grupos alquilo cíclico C3-9-alquilo C1, grupos alquilo cíclico C3-8-alquilo C2, grupos alquilo cíclico C3-7-alquilo lineal C3, grupos alquilo cíclico C3-6-alquilo lineal C4, grupos alquilo cíclico C3-5-alquilo lineal C5, grupos alquilo cíclico C3-4-alquilo lineal C6, grupos alquilo cíclico C3-alquilo lineal C7, grupos alquilo cíclico C3-7-alquilo ramificado C3, grupos alquilo cíclico C3-6-alquilo ramificado C4, grupos alquilo cíclico C3-5-alquilo ramificado C5, grupos alquilo cíclico C3-4-alquilo ramificado C6, y grupos alquilo cíclico C3-alquilo ramificado C7. En algunas realizaciones, el alquilo parcialmente cíclico es un grupo alquilo cíclico C3-9-alquilo-C1, preferiblemente un grupo alquilo cíclico C3-6-alquilo C1-2, grupo alquilo cíclico C3-6-alquilo C1, más preferiblemente grupo alquilo cíclico C3-4-alquilo C1-2, particularmente grupo alquilo cíclico C3-4-alquilo C1, especialmente ciclopropil-metilo.
Un radical bivalente se refiere a un grupo obtenido a partir del radical monovalente correspondiente mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo de carbono con electrón(es) de valencia libre(s). Un radical bivalente tiene dos sitios de conexión que están conectados con el resto de la molécula, en el que los dos sitios de conexión pueden estar en el mismo átomo o en dos átomos diferentes del radical bivalente.
Un “alquileno” o un “alquilideno” se refiere a un grupo hidrocarburo divalente saturado. Los grupos alquileno comprenden grupos lineales, ramificados, cíclicos o parcialmente cíclicos. Ejemplos de grupos alquileno lineales incluyen pero no se limitan a metileno (-CH2-), -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, -(CH2)5-, -(CH2)6-, etc. Ejemplos de grupos alquileno ramificados incluyen, pero no se limitan a: -CH(CH3)-, -C<h>(C2H5)-, -CH(CH3)-CH2-, -CH(C3H7)-, -CH(C2H5)-CH2-, -C(CH3)2-CH2-, -(CH(CH3))2-, -CH(CH3)-(CH2)2-, -CH2-CH(CH3)-CH2-, -CH(C4H9)-, -C(CH3)(C3H7)-, -C(C2H5)2-, -CH(C3H7)-CH2-, -CH(C2H5)-CH(CH3)-, -CH(C2H5)-(CH2)2-, -CH2-CH(C2H5)-CH2-, -C(CH3)2-(CH2)2-, -CH2-C(CH3)2-CH2-, -CH(CH3)-(CH2)3-, -CH2-CH(CH3)-(CH2)2-, -CH(C5H11)-, -C(C2H5)(C3H7)-, -C(CH3)(C4H9)-, -CH(C4H9)-CH2-, -C(C2H5)2-CH2-, -C(CH3)(C3H7)-CH2-, -CH(C2H5)-CH(C2H5)-, -CH(CH3)-CH(C3H7)-, -C(CH3)2-C(CH3)2-, -CH(C3H7)-(CH2)2-, -CH2-CH(C3H7)-CH2-, -CH(C2H5)-C(CH3)2-, -C(CH3)2-CH(CH3)-CH2-, -CH(CH3)-C(CH3)2-CH2-, -CH(C2H5)-CH(CH3)-CH2-, -CH(CH3)-CH(C2H5)-CH2-, -CH(CH3)-CH2-CH(C2H5)-, -CH(CH3)-C(CH3)2-CH2-, -(CH(CH3))3-, -C(CH3)2-(CH2)3-, -CH(C2H5)-(CH2)3-, -CH2-CH(C2H5)-(CH2)2-, -CH2-CH(CH3)-CH(CH3)-CH2-, -(CH(CH3))2-(CH2)2-, -CH(CH3)-(CH2)2-CH(CH3)-, -(CH2)2-CH(CH3)-(CH2)2-, -CH2-CH(CH3)-(CH2)3-, -CH(CH3)-(CH2)4-, etc.
Los términos “alquileno cíclico” y “cicloalquileno” tienen el mismo significado y se utilizan indistintamente en el presente documento. Ejemplos de grupos alquileno cíclicos incluyen pero no se limitan a ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, cicloheptileno y ciclooctileno, y grupos alquilo multicíclicos divalentes que contienen anillos fusionados, espiro o puenteados. En algunas realizaciones, el alquileno cíclico es un grupo alquileno cíclico C3-6, particularmente el grupo alquileno cíclico C3-4, especialmente el ciclopropilo.
Los grupos alquileno parcialmente cíclico pueden incluir radicales bivalentes en los que los dos sitios de conexión que están conectados al resto de la molécula pueden estar ambos en una o más fracciones de alquilo lineal o ramificado, o ambas en una o más fracciones de alquilo cíclico, o respectivamente en una fracción de alquilo cíclica y una fracción de alquilo lineal o ramificada. Ejemplos de grupos alquileno parcialmente cíclicos incluyen pero no se limitan a: (1 ) ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclohexileno, cicloheptileno y ciclooctileno, y grupos alquilo multicíclicos divalentes que contienen anillos fusionados, espiro o puenteados, cada uno de los cuales se sustituye independientemente por uno o más grupos alquilo lineal o ramificado; (2) grupos alquileno lineal o ramificado, cada uno de los cuales se sustituye independientemente por uno o más grupos alquilo cíclico; y (3) un grupo formado al combinar uno o más grupos alquileno cíclico y uno o más grupos alquileno lineal o ramificado, siempre que se forme una estructura químicamente estable. En algunas realizaciones, el alquileno parcialmente cíclico es un grupo alquilo cíclico C3-9-alquileno C1, preferiblemente un grupo alquilo cíclico C3-6-alquileno C1-2, grupo alquilo cíclico C3-6-alquileno C1, más preferiblemente grupo alquilo cíclico C3-4-alquileno C1-2, particularmente grupo alquilo cíclico C3-4-alquileno C1, especialmente ciclopropil-metileno.
Los compuestos de la invención pueden existir en forma isotópica marcada o enriquecida que contiene uno o más átomos que tienen una masa atómica o un número de masa diferente de la masa atómica o el número de masa más abundante que se encuentra en la naturaleza. Los isótopos pueden ser radiactivos o no radiactivos. Los isótopos de los átomos, tales como hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor, cloro y yodo, incluyen pero no se limitan a 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, 32P, 35S, 18F, 36Cl y 125I. En una realización, la carga útil (por ejemplo, el compuesto de la fórmula (i)) puede existir en forma marcada con isótopos o enriquecida, especialmente en forma deuterada.
Como se utilizan en el presente documento, las expresiones “fármaco conjugado con anticuerpos” y “conjugado de anticuerpo-fármaco” tienen el mismo significado.
Compuesto de la fórmula (i)
En un aspecto, se proporciona un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el compuesto tiene una estructura seleccionada de las siguientes fórmulas:
En una realización particular el compuesto se selecciona de:
Compuesto de la Fórmula (I)
En un aspecto, se proporciona un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (I):
R0 es alquilo C1-3;
n es un entero de 2 a 5;
k1 y k2 son independientemente 1, 3, o 5;
i es independientemente un entero de 1 a 20;
j es independientemente un entero de 1 a 20;
P1 y P2 son independientemente una carga útil que tiene una estructura seleccionada de:
En una realización particular, la carga útil se selecciona de:
n es un entero de 2 a 5. En una realización, n es 3.
k1 y k2 son independientemente 1, o 3 o 5. En una realización, k1 y k2 son independientemente 5.
i es independientemente un entero de 1 a 20, preferiblemente 1 a 12, más preferiblemente 2 a 8. En una realización particular, i es 4.
j es independientemente un entero de 1 a 20, preferiblemente 1 a 12, más preferiblemente 8 a 12 , especialmente 8 o 12. En una realización particular, j es 12.
En una realización, el compuesto de la fórmula (I) has la estructura de la fórmula (I-1)
en la que,
P1, P2, R0, opSu, n, i y j son como se define en la fórmula (I).
En una realización, el compuesto de la fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en:
Realizaciones específicas del compuesto de la Fórmula (I)
Las estructuras ejemplificadas de los compuestos de la fórmula (I) son como se muestra en la siguiente tabla.
Nota: Para todos los compuestos enumerados, P1 y P2 son iguales y se describen como carga útil. BH-1-518, BH-1-593, BH-1-704, BH-1-627, BH-2-518, BH-2-593, BH-2-704 y BH-2-627 están de acuerdo con la invención, los compuestos restantes son Ejemplos comparativos.
Preparación del compuesto de la Fórmula (I)
En una realización, el compuesto de la fórmula (I) se puede sintetizar al conectar un ligador con una carga útil o al conectar una serie de bloques de construcción adecuados. Dichos bloques de construcción se pueden diseñar fácilmente mediante análisis retrosintético, y se puede utilizar cualquier reacción conocida en la técnica. En un aspecto, se proporciona un compuesto que tiene la estructura de la fórmula (1):
en la que
k es un número entero de 1, 3 o 5;
P es una carga útil que tiene una estructura como se definió anteriormente.
En una realización preferida, k es 5.
El compuesto de la fórmula (1) se puede sintetizar utilizando el compuesto de la fórmula (i) y otros bloques de construcción necesarios, utilizando un método similar al método sintético como se divulga en el documento EP2907824A (por ejemplo, el método sintéti
bloques de construcción adecuados incluyen pero no se limitan a la unidad de ligamiento HX20113 y la unidad de ligamiento HX20111.
Entonces el grupo maleimida en el mismo se puede hacer reaccionar con un grupo tiol en otro bloque de construcción para el compuesto de la fórmula (I). La tiosuccinimida resultante es inestable bajo condiciones fisiológicas y es susceptible a la adición de Michael inversa lo que conduce a la escisión en el sitio de conexión. Más aún, cuando otro compuesto tiol está presente en el sistema, la tiosuccinimida también puede experimentar un intercambio de tiol con el otro compuesto tiol. Ambas reacciones provocan la disminución de la carga útil y provocan efectos secundarios tóxicos. A continuación la tiosuccinimida se somete a una reacción de apertura del anillo. A continuación, se puede obtener el compuesto de la fórmula (I).
El método de reacción de apertura del anillo se puede encontrar en el documento WO2015165413A1. El compuesto que comprende la fracción de succinimida abierta en anillo se puede purificar mediante HPLC semipreparativo/preparativo u otros medios de separación adecuados para obtener una alta pureza y una composición definida, independientemente de la eficiencia de la reacción de apertura del anillo de succinimida.
En la presente divulgación, cuando se aplica en la carga útil del ligador (intermedio de molécula pequeña del ligador), la estructura de succinimida abierta en anillo ya no experimenta la adición de Michael inversa o el intercambio de tiol, y por lo tanto el producto es más estable.
Fracción que comprende la secuencia de reconocimiento del sustrato aceptor o donante de ligasa
En una realización, la fracción (Gly)n del compuesto de la fórmula (I) es una secuencia de reconocimiento de un sustrato aceptor o donante de ligasa, que facilita el acoplamiento catalizado por enzimas del compuesto de la fórmula (I) con un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo bajo la catálisis de la ligasa. El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se modifica opcionalmente y comprende la secuencia de reconocimiento correspondiente de un sustrato aceptor o donante de ligasa.
En una realización, la ligasa es una transpeptidasa. En una realización, la ligasa se selecciona del grupo que consiste en una transpeptidasa natural, una transpeptidasa no natural, variantes de las mismas y la combinación de las mismas. Las enzimas transpeptidasas no naturales pueden ser, pero no se limitan a, las obtenidas por ingeniería de transpeptidasa natural. En una realización preferida, la ligasa se selecciona del grupo que consiste en una Sortasa natural, una Sortasa no natural y la combinación de las mismas. Las especies de Sortasa natural incluyen Sortasa A, Sortasa B, Sortasa C, Sortasa D, SortasaL. plantarum,etc. (US20110321183A1). El tipo de ligasa corresponde a la secuencia de reconocimiento de ligasa y, por lo tanto, se utiliza para lograr una conjugación específica entre diferentes moléculas o fragmentos estructurales.
En una realización, la fracción (Gly)n del compuesto de la fórmula (I) es una secuencia de reconocimiento de un sustrato aceptor de ligasa; y el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se modifica opcionalmente y comprende la secuencia de reconocimiento correspondiente de un sustrato donante de ligasa.
En algunas realizaciones, la ligasa es una Sortasa seleccionada de Sortasa A, Sortasa B, Sortasa C, Sortasa D y SortasaL. plantarum.
En una realización particular, la ligasa es la Sortasa A deStaphylococcus aureus.De acuerdo con lo anterior, la secuencia de reconocimiento de ligasa del sustrato donante de ligasa puede ser la secuencia de reconocimiento típica LPXTG de la enzima. En aún otra realización particular, la secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa es LPXTGJ, en la que x puede ser cualquier aminoácido individual que sea natural o no natural; J está ausente, o es un fragmento de aminoácido que comprende de 1-10 aminoácidos, opcionalmente marcados. En una realización, J está ausente. En aún otra realización, J es un fragmento de aminoácido que comprende de 1-10 aminoácidos, en el que cada aminoácido es independientemente cualquier aminoácido natural o no natural. En otra realización, J es (Gly)m, en el que m es un número entero de 1 a 10. En aún otra realización particular, la secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa es LPETG. En otra realización particular, la secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa es LPETGG.
En una realización, la ligasa es la Sortasa B deStaphylococcus aureusy la secuencia de reconocimiento del sustrato donante correspondiente puede ser NPQTN. En otra realización, la ligasa es la Sortasa B deBacillus anthracisy la secuencia de reconocimiento del sustrato donante correspondiente puede ser NPKTG.
En aún otra realización, la ligasa es la Sortasa A deStreptococcus pyogenesy la secuencia de reconocimiento del sustrato donante correspondiente puede ser LPXTGj , en la que J es como se definió anteriormente. En otra realización, la ligasa es la subfamilia 5 de la Sortasa deStreptomyces coelicolor,y la secuencia de reconocimiento del sustrato donante correspondiente puede ser LAXTg .
En aún otra realización, la ligasa es la Sortasa A deLactobacillus plantarumy la secuencia de reconocimiento del sustrato donante correspondiente puede ser LPQTSEQ.
La secuencia de reconocimiento de ligasa también puede ser otra secuencia de reconocimiento totalmente nueva para la transpeptidasa optimizada por cribado manual.
Conjugados y su preparación
Además, el compuesto portador de carga útil (compuesto de la fórmula (I)) que tiene la fracción que comprende la secuencia de reconocimiento de ligasa se puede conjugar con otras moléculas que comprenden una secuencia de reconocimiento de ligasa, y por lo tanto se puede utilizar, por ejemplo, en la preparación de un conjugado de anticuerpo-molécula pequeña, tal como un conjugado de anticuerpo-fármaco. De acuerdo con lo anterior, en otro aspecto, se proporciona un conjugado que comprende un compuesto de la fórmula (I) y un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno.
En otro aspecto, se proporciona un conjugado que tiene la estructura de la fórmula (II):
en la que,
A es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo;
z es un entero de 1 a 4;
P1, P2, R0, opSu, n, k1, k2, i y j son como se define en la fórmula (I).
En una realización preferida, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se modifica para conectarse con la fracción (Gly)n en el compuesto de la fórmula (I).
En una realización, z es 2.
Anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD19, anticuerpo anti-CD20, anticuerpo anti-CD22, anticuerpo anti-CD25, anticuerpo anti-CD30/TNFRSF8, anticuerpo anti-CD33, anticuerpo anti-CD37, anticuerpo anti-CD44v6, anticuerpo anti-CD56, anticuerpo anti-CD70, anticuerpo anti-CD71, anticuerpo anti-CD74, anticuerpo anti-CD79b, anticuerpo anti-CD117/KITk, anticuerpo anti-CD123, anticuerpo anti-CD138, anticuerpo anti-CD142, anticuerpo anti-CD174, anticuerpo anti-CD227/MUC1, anticuerpo anti-CD352, anticuerpo anti-CLDN18.2, anticuerpo anti-DLL3, anticuerpo anti-ErbB2/HER2, anticuerpo anti-CN33, anticuerpo anti-GPNMB, anticuerpo anti-ENPP3, anticuerpo anti-Nectina-4, anticuerpo anti-EGFRvIII, anticuerpo anti-SLC44A4/AGS-5, anticuerpo anti-CEACAM5, anticuerpo anti-PSMA, anticuerpo anti-TIM1, anticuerpo anti-LY6E, anticuerpo anti-LIV1, anticuerpo anti-Nectin4, anticuerpo anti-SLITRK.6, anticuerpo anti-HGFR/cMet, anticuerpo anti-SLAMF7/CS1, anticuerpo anti-EGFR, anticuerpo anti-BCMA, anticuerpo anti-AXL, anticuerpo anti-NaPi2B, anticuerpo anti-GCC, anticuerpo anti-STEAP1, anticuerpo anti-MUC16, anticuerpo anti-mesotelina, anticuerpo anti-ETBR, anticuerpo anti-EphA2, anticuerpo anti-5T4, anticuerpo anti-FOLR1, anticuerpo anti-LAMP1, anticuerpo anti-Caderina 6, anticuerpo anti-FGFR2, anticuerpo anti-FGFR3, anticuerpo anti-CA6, anticuerpo anti-CanAg, anticuerpo anti-integrina aV, anticuerpo anti-TDGFI, anticuerpo anti-Ephrin A4, anticuerpo anti-TROP2, anticuerpo anti-PTK7, anticuerpo anti-NOTCH3, anticuerpo anti-C4.4A, anticuerpo anti-FLT3, anticuerpo anti-B7H3/4, anticuerpo anti-factor de tejido o anticuerpo anti-RORI/2; preferiblemente anticuerpo anti-HER2, anticuerpo anti-FGFR3, anticuerpo anti-Trop2, anticuerpo anti-HER3 o anticuerpo anti-FRa.
En una realización preferida, el anticuerpo es el anticuerpo anti-HER2. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo HER2 anti-humano. Ejemplos de anticuerpos HER2 anti-humano incluyen pero no se limitan a Pertuzumab y Trastuzumab. El pertuzumab se une al segundo dominio extracelular (ECD2) de HER2 y está aprobado para el tratamiento del cáncer de mama positivo para HER2. El trastuzumab se une al cuarto dominio extracelular (ECD4) de HER2 y está aprobado para el tratamiento del cáncer de mama y el cáncer gástrico positivos para Her2.
En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera (V<l>) y una región variable de cadena pesada (V<h>), en el que la V<l>comprende LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, y en el que la V<h>comprende HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6. En una realización, las regiones CDR se definen por KABAT En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera (V<l>) y una región variable de cadena pesada (V<h>), en el que la V<l>tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7, y la V<h>tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8. En una realización preferida, el anticuerpo anti-HER2 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena ligera (V<l>) y una región variable de cadena pesada (V<h>), en el que la V<l>tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, y la V<h>tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En una realización particular, el anticuerpo anti-HER2 comprende una cadena ligera y una cadena pesada, en el que la cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 214 de la SEQ ID NO: 9, y la cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 % o al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10. En una realización preferida, el anticuerpo HER2 anti- humano es uno o más seleccionados de anticuerpos anti-HER2 diseñados por ingeniería basados en Trastuzumab. En una realización, el anticuerpo es un Trastuzumab modificado, preferiblemente Ab0001-LCCTL-HC (con cadena ligera de la SEQ ID NO: 9, cadena pesada: SEQ ID NO: 10). La secuencia de Ab0001-LCCTL-HC se basa en la secuencia de aminoácidos de Trastuzumab, y GALPETGG se introdujo en el terminal C de la cadena ligera, en el que LPETGG es la secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa, y GAes una secuencia espaciadora.
En una realización preferida, el anticuerpo HER2 anti-humano es un anticuerpo recombinante seleccionado de un anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, fragmento de anticuerpo o imitador de anticuerpo. En una realización, el imitador de anticuerpos se selecciona de scFv, minicuerpo, diacuerpo, nanocuerpo. Para la conjugación con el compuesto de la fórmula (I), el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente divulgación puede comprender una fracción modificada para conjugar con la fracción (Gly)n en el compuesto de la fórmula (I). La posición de introducción de dicha fracción modificada no se limita, por ejemplo, la posición de introducción en el anticuerpo o en el fragmento de unión a antígeno del mismo se puede ubicar, pero no se limitan, en el terminal C o en el terminal N de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo.
En una realización alternativa, se puede introducir una fracción modificada para la conjugación con la fracción (Gly)n en el compuesto de la fórmula (I) en una posición no terminal de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo utilizando, por ejemplo, métodos de modificación química.
En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender una modificación terminal. Una modificación terminal se refiere a una modificación en el terminal C o terminal N de la cadena pesada o la cadena ligera del anticuerpo, que por ejemplo comprende una secuencia de reconocimiento de ligasa. En otra realización, la modificación terminal puede comprender además un espaciador Sp que comprende 2-100 aminoácidos, en el que el anticuerpo, Sp y la secuencia de reconocimiento de ligasa se ligan secuencialmente. En una realización preferida, Sp es una secuencia espaciadora que contiene 2-20 aminoácidos. En una realización particular, Sp es una secuencia espaciadora seleccionada de GA, GGGGS, GGGGSGGGGS y GGGGSGGGGSGGGGS, especialmente GA.
En una realización preferida, la cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye 3 tipos: de tipo silvestre (LC); la cadena ligera modificada de terminal C (LCCT), que se modifica mediante la introducción directa de una secuencia de reconocimiento de ligasa LPXTG y la cadena ligera modificada de terminal C (LCCT<l>), que se modifica mediante la introducción de espaciadores de péptidos cortos más la secuencia de reconocimiento de sustrato donante de ligasa LPXTG. La cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye 3 tipos: tipo silvestre (HC); la cadena pesada modificada de terminal C (HCCT), que se modifica mediante la introducción directa de una secuencia de reconocimiento de ligasa LPXTG; y la cadena pesada modificada de terminal C (HCCT<l>), que se modifica mediante la introducción de espaciadores peptídicos cortos más la secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa LPXTG. X puede ser cualquier aminoácido natural o no natural. Cuando z en el compuesto de la fórmula (II) es 1 o 2, la combinación de las cadenas pesadas y ligeras anteriores puede formar 8 moléculas de anticuerpos preferidas.
En una realización, el compuesto de la fórmula (II) se selecciona del grupo que consiste:
Realizaciones especificas de conjugados
En una realización, el conjugado de anticuerpo-fármaco es CH-1-518, CH-1-593, CH-1-704, CH-1-627, CH-2-518, CH-2-593, CH-2-704 o CH-2-627 como se muestra en la siguiente tabla, los compuestos restantes son Ejemplos comparativos.
Nomenclatura de los ADC: el número entre paréntesis indica el número de moléculas de carga útil (fármaco) que se pretende conectar al anticuerpo.
Nota: 1. Para todos los ADC enumerados, P1 y P2 son iguales y se describen como Carga útil; z es 2; el anticuerpo es Ab0001-LCCT|_-HC (cadena ligera SEQ ID No. 9, cadena pesada: SEQ ID No. 10).
2. Cuando el ADC enumerado anteriormente está formado por la carga útil del ligador correspondiente y el anticuerpo correspondiente (molécula objetivo) enumerado anteriormente, el enlace de péptido en dirección ascendente de GG en la secuencia LPETGG en el anticuerpo se escinde por la Sortasa A, y el intermedio resultante se liga al terminal N libre de G3 en la carga útil del ligador para generar un nuevo enlace de péptido, formando de esta manera la secuencia de aminoácidos resultante LPXTG3.
Preparación del conjugado
Los conjugados (es decir, el compuesto de la fórmula (II)) de la presente divulgación se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica. En algunas realizaciones, el conjugado se prepara mediante la conjugación específica del sitio catalizada por ligasa de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno y un compuesto de fórmula (I), en la que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se modifica mediante una secuencia de reconocimiento de ligasa.
El anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo y el compuesto de la fórmula (I) están unidos entre sí a través de las secuencias de reconocimiento específicas de ligasa de los sustratos. La secuencia de reconocimiento depende de la ligasa particular empleada. En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo con modificaciones terminales basadas en la secuencia de reconocimiento introducidas en el terminal C de la cadena ligera y/o la cadena pesada, y el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se conjuga con el compuesto de fórmula (I), bajo la catálisis de la ligasa de ingeniería de tipo silvestre u optimizada o cualquier combinación de los mismos, y bajo condiciones adecuadas de reacción catalítica.
En una realización específica, la ligasa es la Sortasa A y la reacción de conjugación se puede representar mediante el siguiente esquema:
El triángulo representa una porción de un anticuerpo; el pentágono representa una porción de un compuesto de fórmula (II); y Gn representa la fracción (Gly)n. n, x y J son respectivamente como se definió anteriormente. Cuando se conjuga con Gn, que es la secuencia de reconocimiento correspondiente del sustrato aceptor, el enlace de péptido en dirección ascendente de la glicina en la secuencia LPXTGJ se escinde por la Sortasa A, y el intermedio resultante se une al terminal N libre de Gn para generar un nuevo enlace de péptido. La secuencia de aminoácidos resultante es LPXTGn. Las secuencias Gn y LPXTGJ son como se definió anteriormente.
Por lo tanto, en una realización, la fracción Gn en el compuesto de la fórmula (I) es la secuencia de reconocimiento del sustrato aceptor de ligasa de una ligasa; y el anticuerpo se modifica para comprender la secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa con el fin de conectarse con la fracción de Gn en el compuesto de la fórmula (I);
preferiblemente
(a) la ligasa es una Sortasa seleccionada de la Sortasa A, Sortasa B, Sortasa C, Sortasa D y SortasaL. plantarum;preferiblemente Sortasa A deStaphylococcus aureus;y/o
(b) la secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa es LPXTGJ, J está ausente o es Gm, donde G es glicina, m es un número entero de 1 a 10, x es cualquier aminoácido individual que sea natural o no natural; preferiblemente, la secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa es LPXTG o LPETGG; y/o
la conexión de LPXTGJ con Gn da como resultado LPXTGn.
El compuesto de la fórmula (I) de la presente divulgación tiene una estructura definida, una composición definida y una alta pureza, de tal manera que cuando se lleva a cabo la reacción de conjugación con un anticuerpo, se introducen menos impurezas o no se introducen otras impurezas. Cuando se utiliza dicho intermedio para la conjugación específica del sitio catalizada por ligasa con un anticuerpo modificado que contiene una secuencia de reconocimiento de ligasa, se obtiene un ADC homogéneo con una calidad altamente controlable.
Metabolismo del conjugado en un entorno fisiológico
Cuando un ligador parcial o completo se escinde en las células tumorales, se libera la carga útil. A medida que el ligador se escinde en una posición de conexión con el compuesto antitumoral, el compuesto antitumoral se libera en su estructura intrínseca para exhibir su efecto antitumoral intrínseco.
En una realización, la fracción GGFG (Gly-Gly-Phe-Gly) comprendida por el compuesto de fórmula (1) se puede escindir por enzimas lisosomales (tales como catepsina B y/o catepsina L).
En una realización, el compuesto de la fórmula (I) comprende un espaciador autoinmolativo. En una realización, el espaciador autoinmolativo es un acetal o un heteroacetal. En una realización, la fracción -GGFG-NH-CH2-O-comprendida por el compuesto de fórmula (I) representa una combinación de un sitio de enzima de restricción y un espaciador autoinmolativo, que se escindiría en la célula y liberaría la molécula objetivo (como el compuesto antitumoral).
Composición farmacéutica y preparación farmacéutica
Otro objeto de la divulgación es proporcionar una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la presente divulgación, y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica de la presente divulgación se puede administrar de cualquier manera, siempre y cuando logre el efecto de prevenir, aliviar, prevenir o curar los síntomas de un humano o animal. Por ejemplo, se pueden preparar varias formas de dosificación adecuadas de acuerdo con la ruta de administración, especialmente inyecciones tales como polvo liofilizado para inyección, inyección o polvo estéril para inyección.
El término “farmacéuticamente aceptable” significa que cuando entra en contacto con los tejidos del paciente dentro del alcance del juicio médico normal, no surgirá toxicidad indebida, irritación o reacción alérgica, etcétera, que tiene relaciones razonables de ventaja-desventaja y sea eficaz para el uso previsto.
El término portador farmacéuticamente aceptable se refiere a aquellos materiales portadores que son farmacéuticamente aceptables y que no interfieren con las bioactividades y propiedades del conjugado. Ejemplos de portadores acuosos incluyen pero no se limitan a solución salina tamponada, y similares. El portador farmacéuticamente aceptable también incluye materiales portadores que acercan la composición a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH, agentes tamponadores, agentes de ajuste de toxicidad y similares, y acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio, y similares.
En una realización, la composición farmacéutica de la presente divulgación tiene una relación fármaco a anticuerpo (DAR) de un entero o no entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, tal como aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 8, aproximadamente 1 a aproximadamente 6, aproximadamente 1 a aproximadamente 4, aproximadamente 2 a aproximadamente 5, aproximadamente 2 a aproximadamente 4, o aproximadamente 3 a aproximadamente 4. En una realización particular, el conjugado de la presente divulgación tiene una DAR de aproximadamente 4. En una realización particular, el conjugado de la presente divulgación tiene una DAR de aproximadamente 3.3 a aproximadamente 3.75, especialmente aproximadamente 3.4 a aproximadamente 3.65.
Método de tratamiento y uso
Los conjugados de la presente divulgación son útiles para el tratamiento de tumores. Los tumores susceptibles al tratamiento conjugado incluyen aquellos caracterizados por antígenos específicos asociados al tumor o receptores de superficie celular, y estos serán reconocidos por la molécula objetivo (anticuerpo) en el conjugado y se pueden destruir por la carga útil/citotoxina en el conjugado.
En otro aspecto, se proporciona un conjugado de la presente divulgación o una composición farmacéutica de la presente divulgación para uso en el tratamiento de un tumor.
En una realización preferida, el conjugado de la presente divulgación formado por la conjugación del anticuerpo anti-HER2 y la citotoxina de molécula pequeña se puede unir específicamente a HER2 en la superficie de la célula tumoral y destruir selectivamente las células tumorales que expresan HER2. En otra realización preferida, el anticuerpo anti-HER2 es un anticuerpo HER2 anti-humano. En otra realización preferida, se proporciona un conjugado de la presente divulgación o una composición farmacéutica de la presente divulgación para uso en el tratamiento de una enfermedad, trastorno o afección seleccionada de tumores positivos para HER2. En una realización más preferida, la enfermedad, trastorno o afección se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer urotelial, y similares.
La dosificación del conjugado administrado al sujeto se puede ajustar en gran medida. La dosificación puede variar de acuerdo con la ruta de administración particular y las necesidades del sujeto, y se puede someter al criterio del profesional de la salud.
Efectos beneficiosos
Los nuevos inhibidores de la topoisomerasa I de molécula pequeña proporcionados en la presente divulgación, ya sea utilizados solos o como componente de ADC, podrían mostrar una mayor actividad, estabilidad y propiedades fisicoquímicas sobre la técnica anterior.
El conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención utiliza una carga útil de ligador especialmente diseñada, y puede lograr una gran eficacia y efectos de destrucción de espectadores. Al mismo tiempo, tiene una DAR más baja y, por lo tanto, puede reducir los efectos secundarios y aumentar el índice terapéutico, lo cual es de especial importancia para la destrucción de espectadores. El conjugado de anticuerpo-fármaco de la presente invención es más estable en su estructura tal como la estructura de succinimida abierta en anillo.
La presente divulgación utiliza un ligador con una estructura única y utiliza una ligasa para catalizar la conjugación de la molécula objetivo (anticuerpo) y la carga útil. El conjugado de la presente divulgación tiene buena homogeneidad y alta actividad. Además, la toxicidad del intermedio de carga útil del ligador es mucho menor que la de la carga útil libre y, por lo tanto, el proceso de fabricación del fármaco es menos perjudicial, lo que es ventajoso para la producción industrial.
El conjugado de la presente divulgación logra al menos uno de los siguientes efectos técnicos:
(1) Alta actividad inhibidora contra las células objetivo y fuerte efecto de destrucción de espectadores.
(2) Buenas propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, solubilidad, estabilidad física y/o química).
(3) Buenas propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, buena estabilidad en el plasma, vida media adecuada y duración de la acción).
(4) Buena seguridad (baja toxicidad en células o tejidos normales no objetivo, y/o menos efectos secundarios, ventana de tratamiento más amplia), etc.
(5) Diseño altamente modular, ensamble simple de múltiples fármacos.
Ejemplos
Ejemplo de preparación
Con el fin de ilustrar más claramente los objetos y las soluciones técnicas, la presente divulgación se describe con más detalle a continuación con referencia a ejemplos específicos. Se debe entender que los ejemplos no pretenden limitar el alcance de la divulgación. Los métodos experimentales específicos que no se mencionaron en los siguientes ejemplos se llevaron a cabo de acuerdo con el método experimental convencional.
Instrumentos, materiales y reactivos
A menos que se indique lo contrario, los instrumentos y reactivos utilizados en los ejemplos están disponibles comercialmente. Los reactivos se pueden utilizar directamente sin purificación adicional.
MS: Espectrómetro de masas Thermo Fisher Q Exactive Plus, Water2795-Quattro micro triple cuadrupolo HPLC: Waters 2695, Agilent 1100, Agilent 1200
HPLC semipreparativa: Lisure HP plus 50D
Citometría de flujo: CytoFLEX S
HIC-HPLC: Butil-HIC; fase móvil A: PB25 mM, (N H ^S O 42M, pH 7.0; fase móvil B: PB25 mM, pH 7.0; caudal: 0.8 ml/min; tiempo de adquisición: 25 min; cantidad de inyección: 20 |jg; temperatura de la columna: 25 °C; longitud de onda de detección: 280 nm; temperatura de la cámara de muestras: 8 °C.
SEC-HPLC: columna: TSK-gel G3000 SWXL, TOSOH 7.8 mm ID x 300 mm, 5 jm ; fase móvil: KH2PO40.2 M, KCl 0.25 M, pH 6.2; caudal: 0.5 ml/min; tiempo de adquisición: 30 min; volumen de inyección: 50 jl; temperatura de la columna: 25 °C; longitud de onda de detección; 280 nm; temperatura de la bandeja de muestras: 8 °C. CHO se obtuvo de Thermo Fisher Scientific; pcDNA 3.3 se obtuvo de Life Technology; HEK293F se obtuvo de Prejin; reactive de transfección PEIMAX se obtuvo de Polyscience; MabSelect Sure ProA se obtuvo de GE; Capto S ImpAct se obtuvo de GE; Rink-amida-MBHA-resina y resina de dicloro se obtuvieron de Nankai synthesis; HCC1954 se obtuvo deATCC CAT# CRL-2338; SK-BR-3 se obtuvo de ATCC CAT# HTB-30; BT-474 se obtuvo de ATCC CAT# HTB-20; las células NCI-N87 se obtuvieron de ATCC CAT# CRL-5822; MCF7 se obtuvo deATCC CAT# HTB-22; MDA-MB-231 se obtuvo deATCC CAT# HTB-26; MDA-MB-468 se obtuvo de ATCC CAT# HTB-132; CFPAC-1 se obtuvo deATCC CAT# CRL-1918; NCI-H2110 se obtuvo deATCC CAT# CRL-5924; JIMT-1 se obtuvo de Wuxi Apptech; Capan-1 se obtuvo deATCC CAT# CRL-1573; el anticuerpo Trastuzumab se prepara de acuerdo con la secuencia conocida; la enzima recombinante optimizada Sortasa A derivada deStaphylococcus aureusse prepara enE. coli.
En algunos casos, el orden para llevar a cabo los esquemas de reacción anteriores puede variar para facilitar la reacción o para evitar productos de reacción no deseados. Se proporcionan los siguientes ejemplos para que la invención se pueda entender más completamente. Estos ejemplos son solo ilustrativos y no se deben interpretar como una limitación de la invención de ninguna manera.
Ejemplo 1: Preparación de moléculas pequeñas de carga útil
Intermedio 11
Etapa A: N-(2-bromo-5-fluorofenil)acetamida: A una solución agitada de anhídrido acético (214 g, 2.10 mol) en ácido acético (500 ml) se agregó H2SO4 con. (3 ml), seguido con 2-bromo-5-fluoroanilina (100 g, 526.27 mmol) en porciones a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 3 h, luego se vertió en 2000 ml de agua helada. Se formó un precipitado, que se recolectó por filtración y se secó al vacío a temperatura ambiente para proporcionar N-(2-bromo-5-fluorofenil)acetamida (105 g) como sólido amarillo. RMN 1H (400 MHz, DMsO-d6) 6 7.68 (dd, J = 8.9, 6.0 Hz, 1H), 7.61 (ddd, J = 10.7, 5.3, 3.1 Hz, 1H), 7.02 (ddd, J = 8.9, 8.0, 3.1 Hz, 1H), 2.11 (s, 3H). LCMS m/z 232.0(M+H).
Etapa B: N-(5-fluoro-2-(1-hidroxiciclobutil)fenil)acetamida: A una solución agitada de N-(2-bromo-5-fluorofenil)acetamida (105 g, 452.48 mmol) en THF (1000 ml) se agregó n-BuLi (594 ml, 1.6 M en n-hexano, 950.22 mmol) en forma de gotas durante 1 h a -78 °C. Luego de terminación, la mezcla se agitó durante 0.5 h bajo N2. Luego se agregó una solución de ciclobutanona (38.06 g, 542.98 mmol) en THF (50 ml) en forma de gotas a -78 °C durante 0.5 h, la mezcla se agitó a -78 °C a temperatura ambiente durante 6 h. La mezcla se vertió en 500 ml de NH4Cl ac. saturado a 0 °C. Se extrajo con acetato de etilo (500 ml x 3), se lavó con solución salina (250 ml x 2), se secó sobre Na2SO4 y se concentró. La mezcla se trituró con (PE/EA = 1:1, 100 ml) durante 10 min, se filtró y la torta se recolectó y secó al vacío para proporcionar N-(5-fluoro-2-(1-hidroxiciclobutil)fenil)acetamida (24 g) como sólido amarillo. LCMS m/z 206.1 (M-18+H), 246.1(M+Na).
Etapa C: N-(3-fluoro-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-il)acetamida: A una mezcla agitada de N-(5-fluoro-2-(1-hidroxiciclobutil)fenil)acetamida (24 g, 107.50 mmol) en CH2Ch (170 ml) y agua (170 ml) se agregó nitrato de plata (AgNOa) (5.48 g, 32.25 mmol) y persulfato de potasio (K2S2O8) (58.12 g, 215.01 mmol), la mezcla se agitó a 30 °C durante 6 h. La mezcla se filtró en Celita y se lavó con CH2Ch (100 ml), el filtrado se concentró y purificó por FCC(EA/PE = 0-40 %) para proporcionar N-(3-fluoro-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-il)acetamida (14 g) como un sólido amarillo claro.<l>C<m>S m/z 222.1 (<m>+H).
Etapa D: N-(3-fluoro-7-(hidroxiimino)-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-il)acetamida: A una mezcla agitada de N-(3-fluoro-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-il)acetamida (14 g, 63.28 mmol) en THF (500 ml) a 0 °C se agregó nitrito de 1-butilo (8.48 g, 63.28 mmol), seguido de t-BuOK (8.52 g, 75.94 mmol). La mezcla se agitó a 0 °C durante 2 h. Luego de terminación, la mezcla se acidificó con HCl (2 N) para ajustar el pH = 3. La mezcla se extrajo conacetato de etilo (200 ml x 3), se lavó con solución salina (100 ml x 2), se secó sobre Na2SO4 y se concentró bajo presión reducida. La mezcla cruda se trituró con éter de tert-butil metilo (200 ml) durante 10 min, se filtró y la torta se recolectó y secó al vacío para proporcionar N-(3-fluoro-7-(hidroxiimino)-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-il)acetamida (12 g) como sólido amarillo. LCMS m/z 251.1 (M+H).
Etapa E: N,N'-(3-fluoro-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1,7-diil)diacetamida: A una solución de N-(3-fluoro-7-(hidroxiimino)-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1-il)acetamida (12 g, 47.96 mmol) en anhídrido acético (90 ml) y THF (90 ml) se agregó Pd/C al 10 % (1 g), la mezcla se agitó a 25 °C bajo atmósfera de H2 durante 16 h. Después de enfriar a 0 °C, se agregó Et3N (20 ml) en forma de gotas, la mezcla se agitó a 0 °C durante 1 h. Se filtró en Celita, el filtrado se vertió en agua helada (500 ml). Se extrajo con acetato de etilo (500 ml x 3), se lavó con solución salina (250 ml x 2), se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se trituró con éter de tertbutil metilo (120 ml) durante 10 min, se filtró y la torta se recolectó y secó al vacío para dar N,N'-(3-fluoro-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1,7-diil)diacetamida (7.9 g) como sólido amarillo. LC<m>S m/z 279.1(M+H).
Etapa F: N,N'-(3-fluoro-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1,7-diil)diacetamida: A una solución de N,N'-(3-fluoro-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1,7-diil)diacetamida (7.9 g, 28.39 mmol) en MeOH (150 ml) se agregó HCl ac. (2 N, 150 ml), la mezcla se agitó a 50 °C durante 7 h. Después de enfriar a 0 °C, se agregó NaHCO3 ac. sat.
en forma de gotas para ajustar el pH = 8. Se extrajo con acetato de etilo (200 ml x 3), se lavó con solución salina (200 ml x 2), se secó sobre Na2SO4 y concentró bajo presión reducida para dar N,N'-(3-fluoro-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1,7-diil)diacetamida (6.0 g) como sólido amarillo. Rm N 1H (400 MHz, Cloroformo-d) 5 6.57 (s, 3H), 6.18 (td, J = 11.1, 2.4 Hz, 2H), 4.52 (dt, J = 13.3, 5.0 Hz, 1H), 3.13 (ddd, J = 17.5, 13.0, 4.6 Hz, 1H), 3.00-2.81 (m, 1H), 2.69 (dtd, J = 9.4, 4.6, 2.5 Hz, 1H), 2.09 (s, 3H), 1.79 (qd, J = 13.0, 4.3 Hz, 1H). LCMS m/z 237.1 (M+H).
Etapa G: N-(8-amino-5-cloro-6-fluoro-1-oxo-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-il)acetamida: A una solución de N,N'-(3-fluoro-8-oxo-5,6,7,8-tetrahidronaftalen-1,7-diil)diacetamida (4.0 g, 16.93 mmol) en DMF (80 ml) se agregó NCS (2.26 g, 16.93 mmol) en porciones a 0 °C, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla se vertió en 200 ml de agua helada. Se formó un precipitado, que se recolectó por filtración y se secó al vacío a temperatura ambiente para proporcionar N-(8-amino-5-cloro-6-fluoro-1-oxo-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-il)acetamida (4.0 g) como sólido amarillo. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 58.11 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.71 (s, 2H), 6.62 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 4.53 (ddd, J = 13.0, 8.0, 4.7 Hz, 1H), 3.18 - 3.04 (m, 1H), 2.91 (ddd, J = 17.5, 12.4, 4.8 Hz, 1H), 2.21 - 2.08 (m, 1H), 1.99- 1.83 (m, 4H). LCMS m/z 271.0(M+H).
Etapa H: N-((9S)-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H, 12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-1-il)acetamida: A una mezcla de N-(8-amino-5-cloro-6-fluoro-1-oxo-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-il)acetamida (4.0 g, 14.78 mmol) en tolueno (400 ml) se agregó (S)-4-etil-4-hidroxi-7,8-dihidro-1H-pirano[3,4-f]indolizina-3,6,10(4H)-triona (4.28 g, 16.25 mmol), p-toluenosulfonato de piridinio (1.11 g, 4.43 mmol)y o-cresol (10 ml), la mezclase calentó a reflujo bajo N2durante24 h. El solvente se eliminó bajo presión reducida y la mezcla se purificó mediante FCC(THF/CH2Cl2=0-60 %) para proporcionar N-((9S)-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-1-il)acetamida (4.1 g) como sólido marrón. LCMS m/z 498.1 (M+H).
Etapa I: (9S)-1-amino-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-1,2,3,9,12,15-hexahidro-10H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-diona: Una mezcla de N-((9S)-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-1-il)acetamida (2.0 g, 4.02 mmol) en 20 ml de HCl ac. con. se agitó a 70 °C bajo N2 durante 36 h. La mezcla se concentró bajo presión reducida para dar clorhidrato de (9S)-1-amino-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-1,2,3,9,12,15-hexahidro-10H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6, ]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-diona puro (2 g) como sólido marrón. LCMS (ESI) m/z 456.1 [M+H]+.
Intermedio 12
Intermedio 12: Se sintetizó bromhidrato de (9S)-1-amino-4-bromo-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-1,2,3,9.12,15-hexahidro-10H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indoiizino[1,2-b]quinolina-10,13-diona a partir de 2-bromo-5-fluoroanilina utilizando un procedimiento similar al anterior para el intermedio 11. LCMS (ESI) m/z 500.0 [M+H]+.
Intermedio 13
Intermedio 13: Se sintetizó clorhidrato de (9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metoxi-1,2,3,9,12,15-hexahidro-10H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-diona a partir de 2-bromo-5-fluoro-4-metoxianilina utilizando el mismo procedimiento como anteriormente para el intermedio 11. LCMS (ESI) m/z 452.1 [M+H]+.
Procedimiento de C730 y C731
C730 y C731 se prepararon mediante prep-HPLC a partir de clorhidrato de (9S)-1-amino-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-1,2,3,9,12,15-hexahidroi0H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]Indolizino[1,2-B]quinolina-10,13-diona (intermedio 11) como sal de TFA.
Tabla I.
Condiciones de HPLC anteriores: Equipo: Agilent 1200; Columna cromatográfica: Waters XBridge C184.6*50 mm, 3.5 um; Flujo: 2.0 mL/min; Eluido de gradiente: 5.0 %-95.0 %-95.0 %-5.0 %-5.0 %, 0.00 min-1.50 min-2.50 min-2.52 min-3.00 min; Temperatura: 40 °C; Fase móvil: A: Acetonitrilo, B: H2O (TFA AL 0.05 %); Longitud de onda: 214 nm/254 nm.
Procedimiento de C518
Etapa J: N-((1S,9S)-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-1-il)-2-hidroxiacetamida: A una solución de clorhidrato de (9S)-1-amino-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-1,2,3,9,12,15-hexahidro-10H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-diona (50 mg, 0.10 mmol) en 2 ml de DMF, se agregó ácido 2-hidroxiacético (11.6 mg, 0.15 mmol), HATU (57.9 mg, 0.15 mmol) y seguido con Et3N (20.5 mg, 0.20 mmol) en forma de gotas a 0 °C, la mezcla se agitó a 0 °C a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se vertió en 10 ml de agua helada, se extrajo con acetato de etilo (20 ml x 3), se lavó con solución salina (20 ml x 2), se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó mediante prep-HPLC para dar N-((1S,9S)-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H
benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-1-il)-2-hidroxiacetamida (6 mg) como sólido amarillo y N-((1R,9S)-4-cloro-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-1-il)-2-hidroxiacetamida (5 mg) como sólido amarillo.
Los compuestos preparados en la tabla II a continuación se hicieron reaccionar y se trataron posteriormente de la misma manera que en el Ejemplo C518.
Tabla II.
Condiciones de HPLC anteriores: Equipo: Agilent 1200; Columna cromatográfica: Waters XBridge C184.6*50 mm, 3.5 um; Flujo: 2.0 ml/min; Eluido de gradiente: 5.0 %-95.0 %-95.0 %-5.0 %-5.0 %, 0.00 min-1.50 min-2.50 min-2.52 min-3.00 min; Temperatura: 40 °C; Fase móvil: A: Acetonitrilo, B: H2O (TFA al 0.05 %); Longitud de onda: 214 nm/254 nm.
Los compuestos preparados en la tabla III se sintetizaron a partir del intermedio 12 o del intermedio 13 utilizando un procedimiento similar al anterior para el C518.
Tabla III.
Condiciones de HPLC anteriores: Equipo: Agilent 1200; Columna cromatográfica: Waters XBridge C184.6*50 mm, 3.5 um; Flujo: 2.0 ml/min; Eluido de gradiente: 5.0 %-95.0 %-95.0 %-5.0 %-5.0 %, 0.00 min-1.50 min- 2.50 min-2.52 min-3.00 min; Temperatura: 40 °C; Fase móvil: A: Acetonitrilo, B: H2O (TFA al 0.05 %); Longitud de onda: 214 nm/254 nm.
Procedimiento de C589
Etapa K: (S)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-1-il)-3-hidroxibutanamida: A una solución de mesilato de (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-1,2,3,9,12,15-hexahidro-10H,13H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-diona (50 mg, 0.10 mmol, CAS: 169869-90-3) en 2 ml de DMF se agregó ácido (S)-3-hidroxibutanoico (15.6 mg, 0.15 mmol), HATU (57.9 mg, 0.15 mmol) y seguido con Et3N (20.5 mg, 0.20 mmol) en forma de gotas a 0 °C, la mezcla se agitó a 0 °C a temperatura ambiente durante 2 h. La mezcla se vertió en 10 ml de agua helada, se extrajo con acetato de etilo (20 ml x 3), se lavó con solución salina (20 ml x 2), se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó mediante prep-HPLC para dar (S)-N-((1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidroxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-1-il)-3-hidroxibutanamida (9.4 mg) como sólido amarillo.
Los compuestos preparados en la tabla IV a continuación se hicieron reaccionar y se trataron posteriormente de la misma manera que en el Ejemplo C589.
Tabla IV.
Condiciones de HPLC anteriores: Equipo: Agilent 1200; Columna cromatográfica: Waters XBridge C184.6*50 mm, 3.5 um; Flujo: 2.0 ml/min; Eluido de gradiente: 5.0 %-95.0 %-95.0 %-5.0 %-5.0 %, 0.00 min-1.50 min- 2.50 min-2.52 min-3.00 min; Temperatura: 40 °C; Fase móvil: A: Acetonitrilo, B: H2O (TFA al 0.05 %); Longitud de onda: 214 nm/254 nm.
Ejemplo 2: Preparación de ligadores
2.1 Preparación de HX20113 de ligador
HX20113 se sintetizó por una síntesis convencional de polipéptidos en fase sólida utilizando rink-amida-MBHA-resina. Se utilizó Fmoc para proteger el aminoácido en la unidad de ligamiento. El reactivo de conjugación se seleccionó entre HOBT, HOAt/DIC, DCC, EDCI o HATU. Después de la síntesis, la resina se escindió con ácido trifluoroacético. El producto se purificó mediante HPLC, se liofilizó y almacenó para uso. Masa teórica: 1207.59, medida: [M-H]- = 1206.7.
Preparación de HX20111 ligador
HX20111 se sintetizó mediante una síntesis convencional de polipéptidos en fase sólida utilizando rink-amida-MBHA-resina. Se utilizó Fmoc para proteger el aminoácido en la unidad de ligamiento. El reactivo de conjugación se seleccionó entre HOBT, HOAt/DIC, DCC, EDCI o HATU. Después de la síntesis, la resina se escindió con ácido trifluoroacético. El producto se purificó mediante HPLC, se liofilizó y almacenó para uso. Masa teórica: 1383.P70, medida: [M-H]' = 1382.6.
Ejemplo 3: Preparación de intermedios de carga útil del ligador
3.1 Preparación de Mc-GGFG-Dxd intermedio
El intermedio Mc-GGFG-Dxd está disponible comercialmente o se prepara siguiendo los procedimientos como se describen en el documento EP2907824. Este compuesto se utiliza para preparar el intermedio de carga útil del ligador (compuesto de la fórmula (I)), y también se utiliza para conectarse directamente al anticuerpo (modificado opcionalmente) para preparar los ADC de referencia LC1184(8) y LC1184(4).
3.2 Preparación de H0019
Se pesaron 4.33 g de Fmoc-Gly-Gly-OH y 6.84 g de Pb(OAc)4 y se agregaron en un matraz de fondo redondo de un solo cuello de 500 ml. Se agregó THF/Tolueno anhidro (120/40 ml) bajo atmósfera de nitrógeno y se agitó para disolución. A continuación se agregaron 1.16 ml de piridina al sistema de reacción. El sistema de reacción se calentó a 80 °C y se sometió a reflujo durante 5 horas bajo atmósfera de nitrógeno. Se tomaron muestras y se detectaron mediante HPLC para monitorizar la reacción.
El sistema de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y la torta de filtro se lavó con EA 3 veces. Los filtrados se combinaron y concentraron hasta secado. Se realizó cromatografía en columna (PE: EA= 100: 0~50: 100) para dar alrededor de 2000 mg del producto objetivo en sólido blanco con un rendimiento del 44 %.
Síntesis de H0005-a
Se pesaron 200 mg de HX21008-A y se agregaron a un matraz de fondo redondo de un solo cuello de 100 ml. Luego se agregaron 15 ml de THF y se agitó para disolver. Luego se agregaron H0005 (316 mg, 3.0 eq) y TSOH H2O (15 mg, 0.15 eq) al sistema de reacción. El sistema de reacción se hizo reaccionar a temperatura ambiente. Se tomaron muestras y se detectaron por TLC (PE/EA=1: 1) para monitorizar la reacción. La materia prima básicamente desapareció y se detectó un nuevo punto.
Se agregó una solución de bicarbonato de sodio saturado para apagar la reacción. La extracción se realizó con EA 3 veces. La fase orgánica se combinó y se lavó con solución salina, se secó con sulfato de magnesio anhidro y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (PE: EA= 5: 1 ~ 1: 1) para dar aproximadamente 165 mg del producto objetivo en aceite incoloro con un rendimiento del 60 %. MS: [M+H]+ = 503.4.
Síntesis de H0005-b
Se pesaron 200 mg de H0005-a y se agregaron en un matraz de fondo redondo de un solo cuello de 100 ml. A continuación, se agregaron 10 ml de EtOH y 5 ml de EAcon disolución completa. Luego, se agregaron 40 mg de carbono paladio al sistema de reacción bajo atmósfera de nitrógeno, y el sistema de reacción se purgó con gas hidrógeno tres veces. El sistema de reacción se mantuvo bajo atmósfera de hidrógeno y se agitó durante 0.5 horas a temperatura ambiente. Se tomaron muestras y se detectaron mediante TLC (DCM/MeOH=10: 1) para monitorizar la reacción. La materia prima básicamente desapareció y se detectó un nuevo punto.
El sistema de reacción se filtró y la torta de filtro se lavó con EA 3 veces. Los filtrados se combinaron y concentraron hasta secado para dar un producto de 200 mg en sólido blanco con un rendimiento del 100 %. El producto se puede utilizar directamente en la siguiente reacción sin purificación. [M+H]+ = 413.3.
Síntesis de H0005
Se pesaron 2.0 g de dicloro resina y se colocaron en un tubo de síntesis de polipéptidos. Se agregó DCM (10 ml) y se hinchó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El solvente se eliminó por succión al vacío. La resina se lavó dos veces con DCM, con un volumen de 7 ml y un tiempo de 1 minuto para cada lavado. El solvente se eliminó por succión al vacío. A continuación, se pesó H0005-b (200 mg) y se agregó a un tubo de centrífuga de 50 ml. Se agregó DCM (aproximadamente 10 ml). El sólido se disolvió por agitación. Se agregó a la resina anterior. Se realizó una agitación para empapartoda la resina en la solución (si había resina adherida a la pared del tubo, se utilizaba una pequeña cantidad de DCM para lavar la pared del tubo). La agitación se realizó durante 4-5 horas. Una vez completada la reacción, se agregó una cantidad adecuada de metanol. La agitación se llevó a cabo durante 30 min. El solvente se eliminó por succión al vacío. La resina se lavó con DMF una vez, metanol una vez, DMF una vez, metanol una vez y DMF dos veces en secuencia, con un volumen de 10 ml y un tiempo de 1 minuto para cada lavado. El solvente se eliminó por succión al vacío. Se tomó una pequeña cantidad de resina seca para la detección de ninhidrina. La resina era incolora y transparente, y la solución era amarillenta, lo que indicaba que estaba capacitada para la siguiente etapa de acoplamiento.
La desprotección se realizó dos veces al agregar 10 ml de solución prefabricada de piperidina/DMF al 20 % y al reaccionar durante 10 minutos cada vez. Una vez completada la reacción, la solución se eliminó por succión al vacío. La resina se lavó con DMF dos veces, metanol una vez, DMF una vez, metanol una vez y DMF dos veces en secuencia, con un volumen de 10 ml y un tiempo de 1 minuto para cada lavado. El solvente se eliminó por succión al vacío. Se tomó una pequeña cantidad de resina seca para detección de ninhidrina. Tanto la resina como la solución eran de color azul oscuro.
A un tubo de centrífuga de 50 ml se le agregaron 563 mg de Fmoc-Phe-OH, 197 mg de HOBt. Luego se agregaron aproximadamente 7 ml de DMF. El sólido se disolvió por agitación. Luego se agregó 0.24 ml de DIC. Se activó durante 10-30 minutos para dar la solución de reacción activada.
Se agregaron 3 equivalentes molares de solución de reacción activada a la resina. Se realizó una agitación para empapar completamente la resina en la solución (si había resina adherida a la pared del tubo, se utilizaba una pequeña cantidad de DCM para lavar la pared del tubo). La agitación se realizó durante 2-3 horas. Una vez completada la reacción, el solvente se eliminó por succión al vacío. La resina se lavó con DMF dos veces, metanol una vez, DMF una vez, metanol una vez y DMF dos veces en secuencia, con un volumen de 10 ml y un tiempo de 1 minuto para cada lavado. El solvente se eliminó por succión al vacío. Se tomó una pequeña cantidad de resina seca para la detección de ninhidrina. La resina era incolora y transparente, y la solución era amarillenta, lo que indicaba que estaba calificada para la siguiente etapa de acoplamiento.
La desprotección se realizó dos veces al agregar 10 ml de solución prefabricada de piperidina/DMF al 20 % y al reaccionar durante 10 minutos cada vez. Una vez completada la reacción, la solución se eliminó por succión al vacío. La resina se lavó con DMF dos veces, metanol una vez, DMF una vez, metanol una vez y DMF dos veces en secuencia, con un volumen de 10 ml y un tiempo de 1 minuto para cada lavado. El solvente se eliminó por succión al vacío. Se tomó una pequeña cantidad de resina seca para la detección de ninhidrina. Tanto la resina como la solución eran de color azul oscuro.
A un tubo de centrífuga de 50 ml se le agregaron 531 mg de Fmoc-GG-OH, 197 mg de HOBt. Luego se agregaron aproximadamente 10 ml de DMF. El sólido se disolvió por agitación. Luego se agregó 0.24 ml de DIC. Se activó durante 10-30 minutos para dar la solución de reacción activada.
Se agregó a la resina 3 equivalentes molares de la solución de reacción activada. Se realizó una agitación para empapar completamente la resina en la solución (si había resina adherida a la pared del tubo, se utilizaba una pequeña cantidad de DCM para lavar la pared del tubo). La agitación se realizó durante 2-3 horas. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se eliminó por succión al vacío. La resina se lavó con DMF dos veces, metanol una vez, DMF una vez, metanol una vez y DMF dos veces en secuencia, con un volumen de 10 ml y un tiempo de 1 minuto para cada lavado. El solvente se eliminó por succión al vacío. Se tomó una pequeña cantidad de resina seca para la detección de ninhidrina. La resina era incolora y transparente, y la solución era amarillenta, lo que indicaba que estaba calificada para la siguiente etapa de acoplamiento.
La desprotección se condujo dos veces al agregar 10 ml de solución prefabricada de piperidina/DMF al 20 % y reaccionando durante 10 minutos cada vez. Una vez completada la reacción, la solución se eliminó por succión al vacío. La resina se lavó con DMF dos veces, metanol una vez, DMF una vez, metanol una vez y DMF dos veces en secuencia, con un volumen de 10 ml y un tiempo de 1 minuto para cada lavado. El solvente se eliminó por succión al vacío. Se tomó una pequeña cantidad de resina seca para la detección de ninhidrina. Tanto la resina como la solución eran de color azul oscuro. Luego, se colocaron 462 mg de MC-OSu en un tubo de centrífuga de 50 ml, se agregó aproximadamente 10 ml de DMF. El sólido se disolvió por agitación. A continuación, se agregaron 0.24 ml de DIEAa la resina. Se realizó una agitación para empapar completamente la resina en la solución (si había resina adherida a la pared del tubo, se utilizaba una pequeña cantidad de DCM para lavar la pared del tubo). La agitación se llevó a cabo durante 2-3 horas. Una vez completada la reacción, la solución de reacción se eliminó por succión al vacío. La resina se lavó con DMF dos veces, metanol una vez, DMF una vez, metanol una vez y DMF dos veces en secuencia, con un volumen de 10 ml y un tiempo de 1 minuto para cada lavado. El solvente se eliminó por succión al vacío. Se tomó una pequeña cantidad de resina seca para la detección de ninhidrina. La resina era incolora y transparente, y la solución era amarillenta, lo que indicaba que estaba calificada para la siguiente etapa de acoplamiento.
La resina se lavó dos veces con 10 ml de metanol. A continuación, el solvente se eliminó completamente mediante succión al vacío. La resina se vertió y se pesó. El tampón de lisis se preparó en un matraz cónico de 250 ml, en el que: la relación de TFE/DCM fue de 80 %/20 %, y el volumen fue de 7-8 veces el peso de la resina peptídica. El tampón de lisis se agregó a la resina peptídica, se agitó bien. La resina se empapó completamente en el tampón de lisis y la lisis se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2-3 horas. A continuación, el tampón de lisis se filtró utilizando un simple filtro hecho de una jeringa, y la resina se lavó con 1-2 ml de DCM y se desechó. A continuación, se agregaron 150 ml de éter anhidro preenfriado al tampón de lisis, se agitó bien y luego se dejó reposar durante 20-30 minutos. Utilizando un tubo de centrífuga de 50 ml, el sistema anterior se centrifugó en una centrífuga a 3500 rpm durante 3 minutos, y el sobrenadante se vertió y desechó. El sólido se agitó con éter anhidro preenfriado, se lavó una vez bajo ultrasonidos, se centrifugó a 3500 rpm durante 3 minutos, y el sobrenadante se vertió y se desechó. El sólido se colocó en un tubo de centrífuga y se dejó secaral aire, y luego se sometió a una purificación preparativa para dar 125 mg de producto en sólido blanco con un rendimiento del 40 %. [M+H]+ = 645.4.
Síntesis de H0013
Se pesaron 150 mg de materia prima H0005 y 55 mg de TSTU y se agregaron en un matraz de fondo redondo de un solo cuello de 10 ml, y se agregó DMF anhidro (3 ml) bajo atmósfera de nitrógeno y se agitó durante 20 min. A continuación, se agregaron 18 mg de TSN00643 y 20 pl de DIEA en secuencia al sistema de reacción. La agitación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 2 horas bajo atmósfera de nitrógeno. Se tomaron muestras y se detectaron por HPLC para monitorizar la reacción. El pico de materia prima desapareció por completo y se detectaron nuevos picos.
El sistema de reacción se sometió a una purificación preparativa, y el producto objetivo se recolectó y liofilizó para dar aproximadamente 22 mg de producto en un sólido amarillento. [M+H]+ =1062.7.
Síntesis de H0019
Se pesó H0013 (30 mg) y se agregó a un matraz de fondo redondo de un solo cuello de 10 ml, se agregó agua purificada (2 ml). Se realizó la agitación para disolver. Se agregó al sistema de reacción una solución de DMF (2 ml) que contenía HX20111 (19.5 mg) y se agitó. Después de reaccionar durante la noche, se utilizó HPLC para controlar la reacción hasta que toda la materia prima se convirtió en productos intermedios. Luego, el sistema de reacción se enfrió a 0 ~ 10 °C, y se agregó una solución de LiOH al 0.5 % al sistema de reacción a temperatura controlada hasta que el pH del sistema de reacción fue de aproximadamente 12. La reacción se agitó durante 20 minutos y la reacción se monitoreó por HPLC hasta que se consumieron todos los intermedios y luego se agregó ácido acético al 30 % (1.5 ml) al sistema de reacción para apagar la reacción.
El sistema de reacción se sometió a una purificación preparativa, y el producto objetivo se recolectó y liofilizó para dar aproximadamente 25 mg de producto en sólido amarillento. [(M+3H)/3]+ = 1182.3.
3.3 H0020, H0021, H0034 y H0035
Los siguientes intermedios de carga útil del ligador H0020, H0021, H0034 y H0035 se pueden preparar utilizando rutas y reactivos sintéticos similares. Los intermedios H0014, H0015, H0026 y H0032 se sintetizan utilizando un método similar para H0013, y luego se utilizan para sintetizar H0020, H0021, H0034 y H0035, respectivamente.
Se pesaron HX20111 y MC-GGFG-Dxd intermedio (relación molar ~1:2) y disolvieron en agua y DMF, respectivamente, y luego se mezclaron completamente para dar una mezcla, que se hizo reaccionar a 0-40 °C durante 0.5-30 h. Luego de terminación la reacción, se agregó directamente la mezcla de reacción con una cantidad adecuada de solución de Tris Base u otra solución que promueva la reacción de apertura del anillo, y la reacción se realizó a 0-40 °C durante otras 0.2-20 h. Una vez completada la reacción, el producto se purificó mediante HPLC semi-preparativa/preparativa y se liofilizó para obtener el intermedio de carga útil del ligador LB302-2-4. Masa teórica: 3486.52, medida: [(M+3H)/3]+ = 1163.3.
3.5 Preparación de LB302-2-1
Se puede preparar LB302-2-1 utilizando rutas y reactivos sintéticos similares.
Ejemplo 4 Construcción del vector de expresión de anticuerpos, expresión, purificación e identificación de anticuerpos
4.1 Producción del anticuerpo HER2 anti-humano modificado Ab0001-LCCTi_-HC
Los plásmidos de expresión para el anticuerpo Ab0001-LCCT|_-HC (cadena ligera SEQ ID NO: 9, cadena pesada: SEQ ID NO: 10) se construyeron de la siguiente manera. La secuencia del anticuerpo Ab0001-LCCTL-HC: basada en la secuencia de aminoácidos de Trastuzumab y GALPETGG se introdujo en el terminal C de la cadena ligera, en la que LPETGG es la secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa y GAes una secuencia espaciadora. Los plásmidos se transfectaron en células CHO y se estableció la población celular y se cribó una población celular altamente expresada, que se cultivó con referencia al proceso de cultivo de Trastuzumab en un reactor 5-10l, y se recolectó el sobrenadante.
4.2 La purificación del anticuerpo Ab0001-LCCT|_-HC
La purificación de Ab0001-LCCTL-HC se llevó a cabo en un proceso estándar utilizando la combinación de cromatografía de afinidad MabSelect y cromatografía de intercambio catiónico de Sepharose S, los productos purificados se disolvieron en el tampón de fármaco Trastuzumab original (histidina-HCl 5 mM, trehalosa al 2 %, Polisorbato 20 al 0.009 %, PH 6.0), y se congelaron en pequeñas alícuotas.
4.3 El control de calidad del anticuerpo Ab0001-LCCTL-HC
La pureza del anticuerpo purificado Ab0001-LCCTL-HC es del 98.5 % mediante SDS-PAGE; el contenido de polímero de alto peso molecular de la muestra es menor de 0.4 % mediante SEC-HPLC; el contenido de endotoxinas es menor de 0.098 UE/mg.
4.4 Preparación de otros anticuerpos antihumanos modificados
De acuerdo con un método similar, se introdujo una modificación terminal basada en la secuencia de reconocimiento de ligasa en el terminal C de la cadena ligera y/o pesada del Trastuzumab, respectivamente, dando un anticuerpo modificado.
Los anticuerpos HER2 anti-humano modificados basados en Ab0001 (Trastuzumab) se enumeran en la siguiente tabla. LPETGG en la secuencia de modificación terminal es una secuencia de reconocimiento del sustrato donante de ligasa, y GAes una secuencia espaciadora.
Anticuerpos HER2 anti-humano modificados
*: “-” indica que no hay modificación del terminal
Ejemplo 5: Preparación de conjugados de anticuerpo-molécula pequeña
5.1 Los intermedios de la carga útil del ligador se conjugaron respectivamente a un anticuerpo de una manera específica del sitio por una ligasa para formar un ADC. El método para la reacción de conjugación se puede encontrar en el documento WO2015165413A1. Los ADC resultantes se enumeran en la siguiente tabla:
5.2 Los ADC de referencia LC1184(8) y LC1184(4) se preparan respectivamente al conectar directamente el intermedio Mc-GGFG-Dxd a Ab0001-LCCTL-HC (conjugación de Cys, es decir, conjugación a través de conexiones formadas por estructura(s) de maleimida con grupo(s) tiol de Cys). El método para la reacción de conjugación es conocido en la técnica. LC1184(8) tiene ocho Mc-GGFG-Dxd introducido a las cisteínas reducidas entre cadenas. LC1184(4) tiene cuatro Mc-GGFG-Dxd introducidos a las cisteínas reducidas entre cadenas.
Ejemplo de efecto 1: Efecto de las moléculas pequeñas en la proliferación celular
Propósito del estudio: En este experimento, se detectó la viabilidad celular utilizando Cell Titer-Glo para evaluar los efectos de los compuestos de moléculas pequeñas en la proliferación de una estirpe celular tumoral SK-BR-3 con alto contenido de HER2, y para analizar los efectos de los compuestos de moléculas pequeñas en la proliferación de células tumorales.
Materiales y Equipos
PBS: Gibco, Cat# 10010-023); Tripsina: Gibco, Cat# 25200056); FBS: Gibco, Cat# 10270-106); Ensayo de Viabilidad de Células Luminiscentes CellTiter-Glo®: Promega, Cat#G7573); 5Ade McCoy: Gibco, Cat# 16600 082); L15: Hyclone, Cat# SH30525.01); DMEM: Gibco, Cat# 11995-065). Placa de 96 pocillos: Corning/3603; Placa de pocillo profundo de 96 pocillos: Thermo/278743; Tubo EP de 15 ml: Thermo/339650; Tubo EP de 1.5 ml: Beaver.
Siembra en placa de células - Día 1
(1) Examen microscópico de células
(2) Digestión: digerida utilizando 2 ml de tripsina al 0.25 % durante 3 minutos;
(3) Centrífuga: 1000 rpm durante 5 min;
(4) Recuento de células
A. Dilución de células:
B. Siembra en placa de células: en 100 pl/pocillo
C. Incubación: 37 °C, CO2 al 5 %, durante la noche
Prueba de células
(1) Examen microscópico
(2) Preparación de fármaco:
A. Preparación de tampón para la preparación de muestras: la cantidad deseada de tampón para la preparación de muestras se preparó utilizando el medio de cultivo (FBS al 10 %) para las células de prueba;
B. Preparación de la muestra: la muestra se diluyó desde la primera concentración hasta la concentración deseada en una placa de pocillos profunda de 96 pocillos.
Compuestos de prueba: Se preparan diez concentraciones finales a partir de la dilución con el medio celular: 1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064, 0.0128, 0.00256 y 0.000512 nM.
Puromicina de control positivo: Se utilizó una solución madre de 2.5 mg/ml y se diluyó con el medio celular. Se preformó una dilución de 250 veces, y luego se preformó una dilución de 2 veces al aplicar los compuestos para alcanzar la concentración de prueba de 5 pg/ml para puromicina.
(3) Aplicación de los compuestos: para cada concentración de la serie diluida, el compuesto se aplicó por triplicado. En 100 pl/pocillo.
(4) Después de que se agregó el fármaco, las células se incubaron en la incubadora durante 120 h.
Prueba de viabilidad celular
(1) Preparación de reactivos de detección: Se permitió que el reactivo de detección del Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo se calentara a temperatura ambiente con protección contra la luz (2) Preparación de las células: Las células que se van a probar se sacaron de la incubadora y se equilibraron a temperatura ambiente (25 °C) durante 30 min.
(3) Detección de ATP: Se desechó el medio de cultivo y se agregaron 100 pl/pocillo de DMEM, 50 pl/orificio de CTG en una placa de 96 pocillos, se protegió de la luz utilizando papel de aluminio y se osciló utilizando un oscilador de vórtice a temperatura ambiente de 200 rpm durante 10 min.
(4) Procedimiento de detección: Después de establecer el procedimiento, se colocó la placa de fondo transparente de pared negra en el instrumento sin su cubierta.
(5) Adquisición de datos.
5. Procesamiento y análisis de datos
Se utilizó el software GraphPad para procesar los datos. La tasa de inhibición de la proliferación celular se graficó contra la concentración de la muestra de control o de la muestra de prueba utilizando un modelo de curva de cuatro parámetros para el ajuste de los datos, y se obtuvieron respectivamente los valores R2 (redondeado a 4 dígitos significativos) e IC50 (redondeado a 4 dígitos significativos) o EC50 de la muestra de control y de la muestra de prueba. Si era necesario, se calculó la actividad biológica relativa de la muestra A, es decir, la actividad de relación. Dxd se utilizó como muestra de control para el cálculo de la actividad de relación.
Tasa de inhibición de la proliferación celular (%) = (valor de luminiscencia del grupo tratado con fármaco - valor de luminiscencia del grupo puro)/(valor de luminiscencia del grupo de control blanco - valor de luminiscencia del grupo puro) x 100; en el que el grupo puro se refiere al grupo tratado con puromicina
Actividad de relación de la muestra (%) = (Valor de IC50 de la muestra de control/valor de IC50 de la muestra de prueba) x 100
Actividad de relación de la muestra de control (%) = (Valor de IC50 de la muestra de control/valor de IC50 de la muestra de control anterior) x 100
6. Verificación de resultados
R2 Valor > 0.950; CV % entre poros paralelos: < 30 %.
Resultados:
Los resultados se enumeran en la siguiente tabla.
Ejemplo de efecto 2: Efecto de los conjugados dirigidos a HER2 sobre la proliferación celularPropósito del estudio: La viabilidad celular se detectó mediante el ensayo CellTiter-Glo para evaluar los efectos de losADC en la proliferación de dos estirpes celulares tumorales con alto contenido de HER2 SK-BR-3, NCI-N87 y una estirpe celular tumoral HER2 negativa a MDA-MB-468, y para analizar los efectos de losADC en la proliferación de células tumorales.
Materiales y Equipos
PBS: Gibco, Cat# 10010-023); Tripsina: Gibco, Cat# 25200056); FBS: Gibco, Cat# 10270-106); Ensayo de Viabilidad de Células Luminiscentes CellTiter-Glo®: Promega, Cat#G7573); 5Ade McCoy: Gibco, Cat# 16600 082); L15: Hyclone, Cat# SH30525.01); DMEM: Gibco, Cat# 11995-065). Placa de 96 pocillos: Corning/3603; Placa de pocillo profundo de 96 pocillos: Thermo/278743; Tubo EP de 15 ml: Thermo/339650; Tubo EP de 1.5 ml: Beaver.
Siembra en placa de células - Día 1
(1) Examen microscópico de células
(2) Digestión: digerida utilizando 2 ml de tripsina al 0.25 % durante 3 minutos;
(3) Centrífuga: 1000 rpm durante 5 min;
(4) Recuento de células
A. Dilución de células:
B. Siembra en placa de células: en 100 pl/pocillo
C. Incubación: 37 °C, CO2 al 5 %, durante la noche
Prueba de células
(1) Examen microscópico
(2) Preparación de fármacos:
A. Preparación de tampón para la preparación de muestras: la cantidad deseada de tampón para la preparación de muestras se preparó utilizando el medio de cultivo (FBS al 10 %) para las células de prueba;
B. Preparación de la muestra: la muestra se diluyó desde la primera concentración hasta la concentración deseada en una placa de pocillos profunda de 96 pocillos.
Muestras de prueba: Se preparan diez concentraciones finales a partir de la dilución con el medio celular: 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064, 0.0128, 0.00256, 0.000512 y 0.0001024 nM.
Puromicina de control positivo: Se utilizó una solución madre de 10 mg/ml y se diluyó con el medio celular. Se preformó una dilución de 100 veces, y luego se preformó una dilución de 10 veces al aplicar los compuestos para alcanzar la concentración de prueba de 5 pg/ml para puromicina.
(4) Aplicación de los compuestos: para cada concentración de la serie diluida, el compuesto se aplicó por triplicado. En 100 pl/pocillo.
(5) Después de que se agregó el fármaco, las células se incubaron en la incubadora durante 120 h.
Detección de viabilidad celular
(1) Preparación de reactivos de detección: Se permitió que el reactivo de detección del Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo se calentara a temperatura ambiente con protección contra la luz (2) Preparación de las células: Las células que se van a probar se sacaron de la incubadora y se equilibraron a temperatura ambiente (25 °C) durante 30 min.
(3) Detección de ATP: Se desechó el medio de cultivo y se agregaron 100 pl/pocillo de DMEM, 50 pl/agujero de CTG en la placa de 96 pocillos, se protegió de la luz con papel de aluminio y se osciló utilizando un oscilador de vórtice a temperatura ambiente de 200 rpm durante 10 min.
(4) Procedimiento de detección: Después de establecer el procedimiento, se colocó la placa de fondo transparente de pared negra en el instrumento sin su cubierta.
(5) Adquisición de datos.
5. Procesamiento y análisis de datos
Se utilizó el software GraphPad para procesar los datos. La tasa de inhibición de la proliferación celular se graficó en función de la concentración de la muestra de control o de la muestra de prueba utilizando un modelo de curva de cuatro parámetros para el ajuste de los datos, y se obtuvieron respectivamente los valores R2 (redondeado a 4 dígitos significativos) e IC50 (redondeado a 4 dígitos significativos) o EC50 de la muestra de control y de la muestra de prueba.
Tasa de inhibición de la proliferación celular (%) = (valor de luminiscencia del grupo tratado con fármaco - valor de luminiscencia del grupo puro)/(valor de luminiscencia del grupo de control blanco - valor de luminiscencia del grupo puro) x 100; en el que el grupo puro se refiere al grupo tratado con puromicina
6. Verificación de resultados
R2 Valor > 0.950; CV % entre poros paralelos < 30 %.
Resultados:
Los resultados se muestran en la siguiente tabla y en la Figura 1, Figura 2 y Figura 3.
En SK-BR-3 y NCI-N87 de alta expresión de HER2, los conjugados (CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518, LC302-2-1(4) y LC302-2-4(4)) exhibieron una eficacia sobresaliente. Los valores de IC50 de los conjugados son más bajos que la carga útil de la molécula pequeña Dxd. En las células negativas a HER2, los conjugados exhibieron una eficacia mínima. No se observó citotoxicidad en la célula HER2 negativa a MDA-MB-468, lo que demuestra la estabilidad de los conjugados, con una liberación reducida de la carga útil fuera del objetivo y, por lo tanto, una buena seguridad. Estos indican que los conjugados ejercen actividad citotóxica dependiente de HER2 de una manera dependiente de dosis, exhibiendo una buena capacidad de orientación, una eficacia sobresaliente y una buena seguridad.
Ejemplo de efecto 3: Evaluación del efecto de destruir a los espectadores
Propósito del experimento: Las actividades de destrucción de espectadores de los ADC (CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518 y L<c>302-2-4(4)) en células MDA-MB-468 se probaron en un sistema de cocultivo de una estirpe celular tumoral HER2 positiva SK-BR-3 y una estirpe celular tumoral HER2 negativa MDA-MB-468, y compararon el efecto destrucción de espectadores con un ADC de referencia (LC1184 (8)) con una estructura similar a DS8201a.
Materiales y Equipo
L15: Hyclone, SH30525.01; 5A de McCoy: Gibco, 16600-082; FBS: Gibco, 10099-141; kit de ensayo de gen indicador de luciferasa de luciferasa de luciérnaga: Beyotime, RG006; tubo de centrífuga de 50 ml: corning, 430829; tubo de centrífuga de 15 ml: corning, 430791; placa de 96 pocillos: corning, 3599; Incubadora de células de CO2: Thermo; Centrífuga: Thermos, L550; Microscopio: Nikon, ISZ; Contador de células: Countstar, IC 1000; Lector de placas Cytation3: BioTek, Cytation3; Lector de microplacas multimodo HTX: BioTek, Synergy HTX; SK-BR-3: ATCC, H<t>B-30; MDA-MB-468-Luc-GFP: preparado internamente utilizando la infección por lentivirus.
Método experimental
1) Recolección y conteo de células.
2) La densidad celular se ajustó a 1*105 células/ml
3) Se preparó la mezcla de células, en la que SKBR3: MDA-MB-468-Luc-GFP=4: 1, 5 ml.
Siembra en placa de células: 1*104 células/pocillo, 100 pl/pocillo
Muestras de prueba: Se preparan tres concentraciones finales a partir de la dilución con el medio celular: 50, 10 y 1 nM.
4) El fármaco se administró al día siguiente, 100 pl/pocillo.
5) Se incubó en una incubadora de CO2 al 5 % a 37 °C durante 120 h.
® se lavó mediante PBS para eliminar células muertas, y se detectó por el lector de placas Cytation3;
© Kit de ensayo de gen indicador de luciferasa de Biyuntia: lisado en incubadora a 37 °C durante 10 min utilizando tampón de lisis de 100 pl. Se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos. Se tomó 100 pl de sobrenadante. Se agregó 100 pl de sustrato. La quimioluminiscencia se detectó mediante un lector de microplacas (ganancia: 200).
Resultado:
Se utilizaron dos métodos (conteo de fluorescencia GFP y método de luminiscencia de sustrato de luciferasa) para determinar los efectos de la destrucción de espectadores (Figura 4a, 4b y Figura 5).
Los conjugados (CH-2-593, CH-2-589, CH-2-518 y LC302-2-4(4)) muestran efectos sobresalientes de la destrucción de espectadores en las detecciones que utilizan ambos métodos. CH-2-593 muestra un efecto de la destrucción de espectadores comparable o más fuerte que LC1184 (8).
Efecto Ejemplo 4 Evaluación de conjugados in vivo
4.1 En el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama humano JIMT-1
Las células de cáncer de mama humano JIMT-1 5x106 (medio HER2) se inocularon subcutáneamente en el flanco derecho en ratones SCID Beige. Después de 7 días, cuando el volumen tumoral alcanzó 142 mm3 en promedio, los ratones portadores de tumor fueron asignados y administrados por vía intravenosa de LC1184(8) y otros cinco conjugados diferentes a 5 mg/kg. El volumen tumoral se midió dos veces por semana con calibradores. La LC1184(8) mostró una mejor eficacia que la LC1184(4), lo que sugiere que con la misma carga útil, una mayor DAR resultaría en una mejor eficacia. LC302-2-1(4) y LC302-2-4(4) mostraron mejor eficacia que LC1184(8) (Figura 6). El conjugado de la presente invención logra una gran eficacia en DAR menor. 4.2 En el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas humano Capan-1 (1)
Las células de cáncer de páncreas humano Capan-1 5x106 (HER2 bajo) se inocularon subcutáneamente en el flanco derecho en ratones sin pelaje BALB/c para generar un modelo de xenoinjerto. A los 8 días, cuando el volumen tumoral alcanzó 178 mm3 en promedio, a los ratones portadores de tumor se les administró por vía intravenosa LC1184(8) y otros cinco conjugados diferentes a 5 mg/kg. El volumen tumoral se midió dos veces por semana con calibradores. LC1184(8) mostró mejor eficacia que LC1184(4). LC302-2-1(4) y LC302-2-4(4) mostraron una eficacia comparable a LC1184(8) (Figura 7).
4.3 En el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas humano Capan-1 (2)
Propósito del estudio: El objetivo de la investigación es evaluar la eficacia antitumoral in vivo de CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518 y LC302-2-4(4) en el tratamiento del modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas humano Capan-1 subcutáneo en ratones BALB/c sin pelaje hembra.
Diseño del estudio:
Cultivo Celular: Las células tumorales Capan-1 (ATCC-HTB-79) se mantendrán in vitro como un cultivo monocapa en IMDM suplementado con suero fetal bovino al 20 %, Antibiótico-Antimicótico al 1 % a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % en el aire. Las células tumorales se subcultivarán de forma rutinaria dos veces por semana mediante tratamiento con tripsina-EDTA. Las células que crezcan en una fase de crecimiento exponencial se recolectarán y contarán para la inoculación del tumor.
Animales: BALB/c sin pelaje, hembra, 6~8 semanas, con un peso aproximado de 18~20 g. Se necesitará un total de 48 (30 más 60 %) para el estudio, que se comprarán a Shanghai Lingchang Laboratory Animal Co., LTD. u otros proveedores certificados.
Inoculación tumoral: Cada ratón será inoculado subcutáneamente en el flanco derecho con células tumorales Capan-1 (5x106) en 0.2 ml de PBS con Matrigel (1:1) para el desarrollo tumoral. Los animales serán aleatorizados y el tratamiento se iniciará cuando el volumen promedio del tumor alcance aproximadamente l 50~200 mm3 para el estudio de eficacia. La administración del artículo de prueba y el número de animales en cada grupo se muestran en la siguiente tabla de diseño experimental.
Grupos y Tratamientos
N: número de animales;
Volumen de dosificación: se ajustó el volumen de dosificación en base al peso corporal de 10 ml/kg. La duración del experimento se ajustará de acuerdo con el volumen del tumor.
Alojamiento de animales: Se permitirá un período de aclimatación de aproximadamente una semana entre la llegada del animal y la inoculación del tumor para acostumbrar a los animales al entorno de laboratorio. Los ratones se mantendrán en un ambiente especial libre de patógenos y en jaulas de ventilación individuales (3 ratones por jaula). Todas las jaulas, lecho y el agua se esterilizarán antes de su uso. Cuando trabajen en la sala de ratones, los investigadores utilizarán bata de laboratorio y guantes de látex o vinilo. Cada jaula estará claramente etiquetada con una tarjeta de jaula que indica el número de animales, sexo, cepa, fecha de recepción, tratamiento, número de estudio, número de grupo y la fecha de inicio del tratamiento. Las jaulas con comida y agua se cambiarán dos veces por semana. Las condiciones previstas para el entorno de la sala de los animales y el fotoperiodo serán las siguientes:
Temperatura 20~26 °C
Humedad 40~70 %
Ciclo de luz: 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad
Materiales Dietéticos: Todos los animales tendrán libre acceso a una dieta estándar de laboratorio comercial certificado. Las concentraciones máximas permitidas de contaminantes en la dieta son controladas y analizadas rutinariamente por los fabricantes. El agua del grifo municipal esterilizada en autoclave, apta para el consumo humano, estará disponible para los animales ad libitum. Se considera que no se conocen contaminantes en los materiales dietéticos que puedan influir en el crecimiento tumoral.
Asignación a grupos: Antes de comenzar el tratamiento, se pesarán todos los animales y se medirán los volúmenes tumorales. Dado que el volumen del tumor puede afectar a la eficacia de cualquier tratamiento, los ratones se asignarán a grupos utilizando un software de aleatorización basado en Excel que realiza una aleatorización estratificada en base a sus volúmenes tumorales. Esto garantiza que todos los grupos sean comparables en el valor de referencia.
Observaciones: El protocolo y cualesquier enmienda(s) o procedimiento relacionado con el cuidado y uso de animales en este estudio serán revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de WuXi AppTec antes de su realización. Durante el estudio, el cuidado y uso de los animales se realizará de acuerdo con las regulaciones de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). Después de la inoculación, los animales se revisaran diariamente para detectar morbilidad y mortalidad. En el momento del seguimiento rutinario, se revisara a los animales para detectar cualquier efecto del crecimiento tumoral y los tratamientos sobre el comportamiento normal, como la movilidad, el consumo de alimentos y agua, el aumento/pérdida de peso corporal (el peso corporal se medirá dos veces por semana), formación de esteras en los ojos/pelo y cualesquier otros efectos anormales. La mortalidad y los signos clínicos observados se registrarán sobre la base del número de animales dentro de cada subconjunto.
Criterios de valoración: el criterio principal de valoración es determinar si se puede retrasar el crecimiento del tumor o si se pueden curar los ratones. Los tamaños de los tumores se medirán dos veces por semana en dos dimensiones utilizando un calibrador, y el volumen se expresará en mm3 utilizando la fórmula: V= 0.5ax b2 dondeaybson los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. A continuación, los tamaños de los tumores se utilizan para calcular los valores de TGI(%) y de la tasa relativa de proliferación tumoral T/C(%). El TGI se calcula para cada grupo utilizando la fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] X 100; Ti es el volumen tumoral promedio de un grupo de tratamiento en un día determinado, T0 es el volumen tumoral promedio del grupo de tratamiento el primer día de tratamiento, Vi es el volumen tumoral promedio del grupo de control vehículo el mismo día que Ti, y V0 es el volumen tumoral promedio del grupo vehículo en el primer día de tratamiento.
El valor de T/C(%) se calcula para cada grupo utilizando la fórmula: TIC %= T<rtv>/C<rtv>x 100 % (T<rtv>: volumen tumoral promedio relativo (RTV) del grupo de tratamiento: C<rtv>: volumen tumoral promedio relativo (RTV) del grupo de control del vehículo el mismo día con Trtv). El volumen tumoral relativo (RTV) se calcula para cada grupo utilizando la fórmula: RTV = Vt/Vü; V0 es el volumen del tumor en el primer día de tratamiento, Vt es el volumen del tumor en un día determinado.
Terminación:
1) Pérdida de peso corporal: Cualquier animal que exhiba una pérdida de peso corporal del 20 % en un día dado será sacrificado humanitariamente o se contactará al personal veterinario.
2) Carga tumoral: La carga tumoral no debe exceder los 3,000 mm3 Cada animal será sacrificado inmediatamente cuando su volumen tumoral alcance los 3,000 mm3.
Ulceración: Si se produce ulceración tumoral, se aplicarán los siguientes procedimientos:
• Los animales con tumores ulcerados se monitorizarn al menos 3 veces por semana con una frecuencia creciente, hasta diariamente, dependiendo de los signos clínicos.
• Los tumores ulcerados, que no han formado costras, se deben limpiar con una solución limpiadora de heridas adecuada (por ejemplo, Novalsan). La crema antibiótica se debe aplicar a la ulceración/lesión solo si así lo indica el personal veterinario.
Los criterios para la eutanasia incluyen si la lesión (cumple con uno o más):
• No cicatriza ni forma costras en 1 semana.
• Tiene un diámetro mayor de 5 mm.
• Se cavita.
Desarrolla signos de infección (tales como la presencia de pus) o sangrado, o si el animal muestra signos de malestar (por ejemplo, lamidos y mordiscos excesivos dirigidos al sitio) o signos sistémicos de enfermedad (letargo, disminución de la actividad, disminución del consumo de alimentos, disminución de la condición corporal o pérdida de peso). Póngase en contacto con el personal veterinario para discutir las posibles excepciones.
3) Signos clínicos: Los animales se deben sacrificar si se encuentra moribundo (a menos que la IACUC otorgue un permiso especial basado en una justificación adecuada, que se debe incluir en el protocolo y se debe proporcionar un mayor cuidado de apoyo, tal como fluidos SQ calientes, taza de alimento Diet Gel junto al animal para que puedan alcanzar la comida, jaula en una almohadilla térmica para calor suplementario, etc. Nota: una condición moribunda indica que es poco probable que un animal sobreviva). Si tiene preguntas sobre estos criterios de valoración, póngase en contacto con el personal veterinario.
Los ejemplos clínicos de morbilidad pueden incluir:
• Encorvado.
• Decúbito persistente y falta de respuesta a la manipulación u otros estímulos.
• Signos de insuficiencia grave de un órgano o sistema.
•'Demacración.
• Hipotermia.
• Déficits del SNC: convulsiones.
• Respiratorios: frecuencia respiratoria rápida, respiración dificultosa, tos, estertores.
• IG: diarrea que dure > 2 días, ictericia.
Cualquier animal que presente los problemas clínicos anteriores será sacrificado humanamente mediante CO2. La necropsia no se realizará en caso de muerte inesperada.
Análisis estadístico: Para la comparación entre dos grupos, se utilizará una prueba t de muestra independiente. Para la comparación entre tres o más grupos, se realizará un ANOVA de un factor. Si se obtiene un estadístico F significativo (una relación entre la varianza del tratamiento y la varianza del error), se aplicarán procedimientos de comparación mu/tiple después del ANOVA. Todos los datos se analizarán con el programa SPSS 17.0.p< 0.05 se considera estadísticamente significativo.
Resultados:
Todos los conjugados muestran efectos inhibidores tumorales sobresalientes ((Figura 8a y Figura 8b).
4.4 En el modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico humano NCI-N87
Propósito del estudio: El objetivo de la investigación es evaluar la eficacia antitumoral in vivo de CH-2-589, CH-2-593, CH-2-518 y LC302-2-4(4) en el tratamiento del modelo de xenoinjerto de cáncer gástrico humano subcutáneo NCI-N87 en ratones BALB/c sin pelaje hembra.
Diseño del estudio:
Cultivo celular: Las células tumorales NCI-N87 (ATCC, Manassas, VA, cat # CRL-5822) se mantendrán in vitro como un cultivo monocapa en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 10 %, antibióticoantimicótico al 1 %, a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % en el aire. Las células tumorales se subcultivarán de forma rutinaria dos veces por semana mediante tratamiento con tripsina-EDTA. Las células que crezcan en una fase de crecimiento exponencial se cosecharan y contarán para la inoculación del tumor.
Animales: BALB/c sin pelaje, hembra, 6~8 semanas, con un peso aproximado de 18~22 g. Se necesitará un total de 36 (30 más 20 %) para el estudio, que se comprarán a Shanghai Lingchang Laboratory Animal Co., LTD. u otros proveedores certificados.
Inoculación tumoral: Cada ratón se inoculará por vía subcutánea en el flanco derecho con células tumorales NCI-N87 (10 x 106) en 0.2 ml de PBS con Matrigel (1:1) para el desarrollo tumoral. Los animales serán aleatorizados y el tratamiento se iniciará cuando el volumen promedio del tumor alcance aproximadamente los 150-200 mm3 para el estudio de eficacia. La administración del artículo de prueba y el número de animales en cada grupo se muestran en la siguiente tabla de diseño experimental.
Grupos y Tratamientos
N: número de animales;
Volumen de dosificación: se ajustó el volumen de dosificación en base al peso corporal de 10 ml/kg.
La duración del experimento se ajustará de acuerdo con el volumen del tumor.
Resultados:
Todos los conjugados muestran efectos inhibidores tumorales sobresalientes (Figura 9a y Figura 9b).
Ejemplo de efecto 5: Estabilidad sérica ex vivo de los conjugados
Para el estudio de estabilidad sérica ex-vivo, los conjugados LC302-2-1(4), LC302-2-4(4) y LC1184(8) se inocularon en suero humano combinado a 37 °C, respectivamente. A 0, 24, 48 y 96 h, los conjugados se capturaron por el antígeno, luego desglicosilados por la glicosidasa y disociados por el ácido. Los sobrenadantes se recolectaron y centrifugaron, y luego se detectaron mediante LC-MS de alta resolución para determinar DAR.
LC302-2-1(4) y LC302-2-4(4) son bastante estables después de incubarse en suero durante 96 horas. No hay una disminución observable en los DAR de CL302-2-1(4) y LC302-2-4(4) después de incubación durante 96 h. Sin embargo, el DAR de LC1184(8) disminuyó de 7.8 a 2.6 después de la incubación durante 96 h (Figura 10).

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de la fórmula (I):
    R0 es alquilo C1-3; n es cuaquier entero de 2 a 5; k1 y k2 son independientemente 1, 3, o 5; i es independientemente un entero de 1 a 20; j es independientemente un entero de 1 a 20; P1 y P2 son independientemente una carga útil que tiene la siguiente estructura:
    2. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la estructura de la fórmula (I-1)
    en la que, P1, P2, R0, opSu, n, i y j son como se define en la reivindicación 1 3. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, en el que R0 es metilo; y/o n es 3; y/o i es 4; y/o j es 8 o 12. 4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que R0 es metilo; n es 3; i es 4; y j es 12. 5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se selecciona de
    6. Un conjugado que tiene la estructura de la formula (II):
    en la que, A es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo; el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se modifica para conectarse con la fracción de (Gly)n en el compuesto de la fórmula (I); z es un entero de 1 a 4; P1, P2, R0, opSu, n, k1, k2, i, y j son como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 7. El conjugado de la reivindicación 6, que se selecciona de:
    8. El conjugado de la reivindicación 6 o 7, en el que el anticuerpo es Trastuzumab. 9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. 10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que el conjugado tiene una relación fármaco a anticuerpo (DAR) de un entero o no entero de 1 a 8, particularmente 3 a 4. 11. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 9 o 10 para uso en tratar una enfermedad; en la que la enfermedad es un tumor; preferiblemente un tumor que comprende células tumorales positivas para HER2; más preferiblemente el tumor que comprende células tumorales positivas para HER2 comprende además células tumorales con baja expresión de<h>ER2; en las que las células tumorales con baja expresión de HER2 expresan niveles más bajos de HER2 que las células tumorales positivas para HER2. 12. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que el compuesto tiene una estructura seleccionada de las siguientes fórmulas:
    13. Un compuesto de la fórmula (1):
    P tiene una estructura de las siguientes:
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