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JP7404252B2 - 生体分子のコンジュゲートおよびその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、生体分子のコンジュゲートおよびその使用に関する。
天然のシステインに連結することによって抗体に作用剤をコンジュゲートすることは、抗体の使用をさらに進めるべく使用されている。毒素および薬剤などの分子は、抗体にコンジュゲートされて抗体－薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成している。プロボディ（ｐｒｏｂｏｄｙ）を生成するための切断－マスキング用ペプチド配列と抗体との融合体は、腫瘍の局所的な活性化のために使用されている。しかし、このペプチドは、抗体の末端に限定され、活性化配列は、マスキングペプチド由来の低い活性化率と高い免疫原性とを有するペプチドにより限定される。
現行上市されている巨大分子薬剤の一般的な副作用は、免疫毒性である。免疫毒性には、免疫抑制、免疫原性の生成、過感受性、自己反応性、および有害な免疫刺激が含まれる。これらの副作用は、主に外体性の巨大分子によって引き起こされる。体内に進入した後、異質の巨大分子は、その免疫原性のために患者に免疫応答を惹起するものとなる。正常組織では、免疫とは刺激されるものであり、自己免疫応答は、抗体やサイトカインなどの巨大分子薬剤が抗原または受容体に結合した後に生じるものとなる。この時、それは患者にとって非常に危険である。例えば、非小細胞肺がんを現用のＰＤ－１抗体であるキイトルーダおよびオプジーボにより治療する間、重篤な肺炎が起こる可能性があり、それは患者の死に繋がることさえありうる。同様の作用は、ＣＴＬＡ４抗体（ヤーボイ）４１ＢＢ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０などの臨床使用においても報告された。非小細胞肺がんに対するオプジーボとヤーボイとの併用療法では、患者の５５％が３～４という高グレードのＡＥを示し、患者の３６％が薬剤毒性のために薬剤治療を停止しなければならなかった。それゆえ、新しい機能を有し高度な能力のある生体分子コンジュゲートがこの分野に求められており、そのようなコンジュゲートは、血中および正常組織中での薬剤活性を遮断することによって全体的な毒性と免疫毒性とを減少させ、病態の微小環境で活性薬剤を強化し、ＤＭＰＫおよび血清の半減期を調整し、抗体のＦａｂの免疫原性を減少させ、活性生体分子の結合親和性を調整し、有効性を増強するためのものである。
本開示は、以下の構造：
Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５
を有する生体分子のコンジュゲートを提供し、式中、
Ｒ５は、１つまたは複数のシステイン残基が変異により導入された生体分子を表し；
ｃｙｓは、Ｒ５に含まれるシステイン残基（複数可）を表し；
Ｓは、前記システイン残基（複数可）の硫黄原子（複数可）を表し；
Ｒ１は、Ｒ５がその抗原、リガンド、または受容体に結合するのを防止する基であり；
Ｒ２は、不在であるか、またはＲ２は、１つもしくは複数のタンパク質分解酵素により活性化することのできる切断可能なリンカーアーム、もしくは病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合であり；
Ｒ３は、不在であるか、またはＲ３は、Ｒ２が切断された後に自動的に脱落することのできるリンカーアーム、もしくは病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合であり；但し、Ｒ２が不在であるとき、Ｒ３は、病態の微小環境において酸性で活性化することのできる前記化学結合であり；
Ｒ４は、Ｒ５に含まれる前記システイン残基（複数可）の硫黄原子（複数可）を介して共有結合によりＲ５に連結された基であり、部分Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３が切断された後にＲ５の抗原、リガンド、または受容体への結合能を回復、維持、または促進する基である。
上記の式では、Ｒ１－Ｒ２が、Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５から、タンパク質分解酵素によってまたは病態の微小環境の酸条件下で切断されると、Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５が放出される。すると、Ｒ３が自動的に脱落してＲ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５が放出された後に、Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５の持つＲ５の抗原、リガンド、または受容体への結合能が回復、維持、または改善されるものとなる。
本開示の１つまたは複数の実施形態では、生体分子コンジュゲートのＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、本開示の他の部分にあるように記載される。
本開示はまた、以下の構造：
Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５
化合物を提供し、式中、
Ｒ４は、－Ｒ４－ａ－Ｒ４－ｂ－Ｒ４－ｃ－によって表され、Ｒ４は、－Ｒ４－ａ－Ｒ４－ｂ－Ｒ４－ｃ－によって表され、Ｒ４－ａは：
および
からなる群から選択され、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、ＨおよびＣ１－６アルキルまたはＣ１－６アルコキシルからなる群から選択され；
Ｒ４－ｂは：
および
からなる群から選択され、式中、式Ｒ４－ｂ１では、Ｒｃは、不在であるか、またはＣ１－１２アルキル、Ｃ１－１２アルコキシ－Ｃ１－１２アルキル、Ｃ１－１２アルキル－Ｃ３－８シクロアルキル、（Ｃ１－４アルキル－Ｏ）ｐ－Ｃ１－１２アルキル、Ｃ１－１２アルキルカルボニルアミノ－（Ｃ１－４アルキル－Ｏ）ｐ－Ｃ１－１２アルキル、フェニル－Ｃ１－１２アルキル、Ｃ３－８シクロアルキル、Ｃ１－１２アルキル－Ｃ３－８シクロアルキル－Ｃ１－１２アルキル、およびＣ１－１２アルキル－フェニル－Ｃ１－１２アルキルからなる群から選択され；式Ｒ４－ｂ２では、Ｒｃは、アミノ基のＮ原子で置換されたＲａ－１およびＲａ－２を有するＣ１－１２アルキルアミノであり、式４－ｂ３では、Ｒｃは、Ｒａ－１、Ｒａ－２、およびＲ２－３により置換されているアルキルの終端に最後のＣ原子を有するＣ１－１２アルキルであり、式中、Ｒａ－１、Ｒａ－２、およびＲａ－３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ１－１２アルキル－ＯＨ、およびＣ１－１２アルキル－ＮＲ’’Ｒ’’’からなる群から選択され、式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、それぞれ独立して、ＨおよびＣ１－１２アルキルからなる群から選択され；式Ｒ４－ｂ２およびＲ４－ｂ３では、Ｒ４－ｂは、Ｒａ－１、Ｒａ－２、およびＲａ－３のうち少なくとも１つを介してＲ４－ｃに連結し；
Ｒ４－ｃは、
および
からなる群から選択され、式中、Ｒｘは、Ｈ、ハロ、およびＣ１－４アルキルからなる群から選択され；ｐは、１から１０の範囲の整数、例えば１から５の整数などであり；ｑは、１から４の整数、例えば１から２の整数などであり；但し、Ｒ４－ａが式Ｒ４－ａ２、Ｒ４－ａ３、およびＲ４－ａ４からなる群から選択されるとき、Ｒ４－ｃが不在であり；
上式で、Ｒ３は、Ｒ４のＲ４－ｃを介してＲ４に連結し、Ｒ４－ａの各式に示された波線は、Ｒ４－ａがＲ４－ｂに連結する位置を標示する。
また、提供されるのは、Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４によって表される化合物であり、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、本開示の任意の実施形態にあるように規定される。
本開示は、本明細書に記載される生体分子のコンジュゲートまたはＲ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５化合物の、抗腫瘍薬剤の製造における使用を提供する。
本開示は、本明細書に記載される生体分子のコンジュゲートを含む医薬組成物を提供する。
本開示は、治療有効量の本明細書に記載される生体分子のコンジュゲートまたはＲ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５化合物を、それを必要とする対象に提供することを含む、腫瘍を治療または予防するための方法を提供する。
本開示はまた、化合物Ｓ１～Ｓ６４および本開示の他の部分に記載される化合物、ならびに本明細書に記載される変異を含有する抗体およびサイトカインを含む、化合物を提供する。
抗体の軽鎖のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 抗ＰＤ１抗体の軽鎖の点変異についてのＣｏ－ＩＰスクリーニングを示す図である。 抗体の構造を示す図である。 可変領域のループ４の配列が保存されていることを示す図である。 ２つの抗体の可変領域が同じ生殖系列の抗体の可変領域のフレームワークに由来する可能性があることを示す図である。 いくつかの抗体の重鎖のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 いくつかの抗体の軽鎖のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 ＰＤ１ Ａｂ－Ｃ２８のコンジュゲーションを示す図である。 活性化前後のＰＤ１ Ａｂ－Ｃ２８コンジュゲートのＰＤ１との結合を示す図である。 活性化可能な結合アームを含有し病態の微小環境で活性化される、生体分子のコンジュゲートの概要図である。 ＩＦＮ－ガンマの分泌を示す図である。 生存曲線である。 死亡曲線である。 Ｔ細胞の増殖を示す図である。 抗ＰＤ１抗体のコンジュゲートが、ＭＣ３８結腸がんに罹患したマウスにおいて、腫瘍の成長を阻害することを示す図である。 ＩＬ２－Ｃ４１変異体のコンジュゲーションを示す図である。 活性化前後のＩＬ２－Ｃ４１コンジュゲートのＩＬ２受容体アルファとの結合を示す図である。 ＩＬ２変異体コンジュゲーション（ＩＬ２－Ｔｈｒ４１Ｃｙｓ、すなわち、ＩＬ２－Ｃ４１）がＴ細胞の増殖に及ぼす効果を示す図である。 ＩＬ２コンジュゲートがＣＤ４／ＣＤ８の増殖に及ぼす効果を示す図である。 ＩＬ２のコンジュゲートがＢ１６Ｆ１０腫瘍の成長を阻害することを示す図である。 抗ＰＤ－１抗体との組合せのＩＬ２のコンジュゲートが、ＭＣ３８腫瘍の成長を阻害することを示す図である。 変異体ＩＬ２、ＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅ、およびｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素切断後の回復型活性ＩＬ２のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す図である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏの酵素切断前後のＩＬ２ＴＭＥＡｋｉｎｅとＩＬ２ＲαまたはＲβとの結合活性を標示するＥＬＩＳＡの結果を示す図である。 ウェスタンブロットおよび対応の結果によって検出されたＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７の量を示す図である。 ＩＬ２ＴＭＥＡｋｉｎｅが、ＩＬ２に比べて血漿中で半減期が長く曝露が高いことを標示する、ｉｎ ｖｉｖｏの薬物動態試験を示す図である。 肺（湿重量）の測量値と、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色された切片とを示す図であり、ＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅが肺に野生型ＩＬ２よりも低い毒性を誘導することを標示する。 ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ／Ｓ８７Ｃ－Ｓ４７ａｎｄＩＬ２－Ｒ３８Ｄ／Ｅ６１Ｒ／Ｓ８７Ｃ－Ｓ４７が肺にほぼ毒性を誘導しないことを標示する、肺の測量値の図である。 治療後の腫瘍体積を示す図である。 腫瘍における活性ＩＬ２の曝露が高いことを示す図であり、このことは、肺および心臓において抗腫瘍効果の有効性が高く活性ＩＬ２の曝露が低いことに一致し、これは肺水腫の毒性が低いことに一致する。 ５つ位置全てが高い効率でＳ１３リンカーにコンジュゲートされたことを示す、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの結果を示す図である。 ８つの選択された抗体配列を示す図である。 抗体の選択された変異部位に各種Ｒ４基を部位特異的にコンジュゲートすることによって、Ｒ４基をスクリーニング用に選択的に換えることができたことを示す図である。 異なる部位へのコンジュゲーションが、異なる程度で結合活性の回復を示すことを示す図である。 ヒトＣＴＬＡ－４タンパク質との結合活性が有意に減少したＴＭＥＡｂｏｄｙが、受容体遮断活性の劇的な減少をも示すことを示す図である。 ＣＴＬＡ－４に対する結合活性の減少したＴＭＥＡｂｏｄｙが、Ｔ細胞の活性化の機能的な有効性の障害を示し、プロテアーゼにより媒介される活性化がＴＭＥＡｂｏｄｙの活性を復活できることを示す図である。 イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙが、ＷＴイピリムマブと同様の有効性で、腫瘍においてＴｒｅｇ集団を有意に下方制御することを示す図である。 ＴＭＥＡｂｏｄｙが、マウス血清中において、３７℃で９６時間後に有意に分解することなく、高い安定性を示すことを示す図である。 ＣＴＬＡ－４ ＴＭＥＡｂｏｄｙが、Ｓ４７官能基によるコンジュゲーションによって、ＷＴ－イピリムマブおよびＣＴＬＡ－４プロボディに比較して、半減期および曝露の増加を示すことを示す図である。 イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙが、ＷＴイピリムマブと同等の有効性で腫瘍サイズを制御するのに対して、対照のヒトＩｇＧは、何ら有効性を示せないことを示す図である。 ＴＭＥＡｂｏｄｙが、ＷＴイピリムマブと同等かまたはそれより低い抗体価で、極めて低い免疫応答を動物に引き起こすことを示す図である。 併用療法コンジュゲートにおいて抗ＣＴＬＡ４ ＴＭＥＡｂｏｄｙのコンジュゲートにより免疫系を保護することによって、一次抗体に比較して自己免疫を低減できたことを示す図である。 Ｒ４－７のコンジュゲーションの後、または４０ｋＤコンジュゲート型ＴＭＥＡｂｏｄｙのプロテアーゼによる切断の後に、Ｎｉｖ－ｓｅ００１が、ＷＴニボルマブの４３２％という活性の増加を示すことを示す図である。 Ｒ４－７によるコンジュゲーションの後、または４０ｋＤの官能基にコンジュゲートされたＮｉｖ－ｓｅ００５のプロテアーゼによる切断の後に、Ｎｉｖ－ｓｅ００５の結合活性が、ＷＴニボルマブと同等のレベル（ＷＴの１２５％）に復活することを示す図である。 ペムブロリズマブＴＭＥＡｂｏｄｙおよびニボルマブＴＭＥＡｂｏｄｙが、ＷＴのペムブロリズマブ抗体またはニボルマブ抗体と同等の有効性で腫瘍サイズを制御するのに対して、対照のヒトＩｇＧが何ら有効性を示せなかったことを示す図である。 併用療法における抗ＣＴＬＡ４ ＴＭＥＡｂｏｄｙまたは抗ＰＤ１ ＴＭＥＡｂｏｄｙが、一次抗体に比較して自己免疫を低減できたことを示す図である。 治療後の腫瘍体積を示す図である。
実施形態
本開示の範囲内で、上記に述べられた技術的特徴のそれぞれ、および以降に本明細書に述べられる技術的特徴のそれぞれ、例えば実施例などは、互いに組み合わされて好適な技術的解決策を構成することができることを理解するべきである。さらに、本開示は、記載される具体的な実施形態に限定されず、それゆえにもちろん変わることがある。また、別段に規定のない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有することを理解されたい。本明細書に記載されるものに同様または等しい任意の方法および材料も、本発明の実践または試験に使用することができるとはいえ、好適な方法および材料がこれより記載される。本明細書に述べられた全ての刊行物は、その刊行物が関連して引用される方法および／または材料を開示および記載するために、本明細書に参照により組み込まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される際に、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、別段にコンテキストが明確に記述しない限り、複数の指示を含むことに留意しなければならない。それゆえ、例えば、「ａｎ 抗体」への言及は複数の抗体を含み、「ｔｈｅ 抗体」への言及は１つまたは複数の抗体および当業者に公知のそれらの等価物などを含む。特許請求の範囲はどの任意選択的な要素も除外するように起草されうることにさらに留意されたい。そのため、本陳述は、特許請求の範囲の要素の記載またはの「負の」限定の使用に関連する、「のみ（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみ（ｏｎｌｙ）」など排他的な用語の使用のための先行的根拠として、役割を果たすことが意図されている。
本開示の目的の１つは、改変型生体分子を提供することであり、この分子は、病態の微小環境でのみ、例えば腫瘍の微小環境または炎症性環境などでのみ活性化されて、そのリガンドとの同じまたは向上さえした結合能を有する生体分子（Ｒ５）を病態の微小環境に放出し、それによって、生体分子の標的向性および有効性を向上させ、薬剤耐性を克服し、毒性を低減する。
本開示では、改変型生体分子はコンジュゲートであり、それは生体分子と、共有結合により生体分子に連結される機能性部分とを含む。本開示での使用に適した生体分子は、目的の生物学的な機能または活性を有する生体分子であることがあり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、様々な機能性タンパク質が挙げられる。目的の生物学的な機能または活性としては、以下に限定されないが、酵素学および免疫学における機能または活性が挙げられる。そのため、本開示での使用に適した生体分子としては、以下に限定されないが、抗体またはその機能性断片、酵素、融合タンパク質（タンパク質－抗体融合体など）、抗体薬剤コンジュゲート、サイトカイン、および任意の他の遺伝子工学的に作出された生体分子が挙げられる。
本明細書に使用される際に、用語「抗体」は、所望の生物活性（Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861）を呈示する限り、最も広い意味に用いられ、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体断片をカバーする。文脈中および図中では、抗体は、「Ａｂ」と略記される。
基本的な抗体の構造単位は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成される四量体を含むことが知られており、各対は、１つの軽鎖と１つの重鎖とを有する。各鎖のＮ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００個から１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のＣ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を画定する。重鎖（ＶＨ）の可変領域および軽鎖（ＶＬ）の可変領域は、それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し、そのようなものとしては、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が挙げられる。これらの６つのＣＤＲは、抗体の抗原結合部位を形成する。可変領域の残りのアミノ酸は、比較的保存されており、フレームワーク領域（ＦＲ）とよばれる。ＶＨおよびＶＬは、それぞれ４つのフレームワーク領域を含有し、それらはそれぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４とよばれる。
抗体は、マウス型、ヒト型、ヒト化、キメラであるか、または他の種に由来しうる。本明細書に開示されるイムノグロブリンは、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはイムノグロブリン分子のサブクラスとすることができる。イムノグロブリンは、任意の種を由来とすることができる。しかし、一態様では、イムノグロブリンは、ヒト、マウス、またはウサギの起源である。
抗体断片は、完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合性領域または可変領域を含む。好ましくは、抗体の断片は、機能性断片であり、すなわち、無傷の抗体の抗原結合能を保持する。抗体断片または機能性断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；ならびに単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）などが挙げられる。
本明細書で使用される融合タンパク質は、抗体の抗原結合性ドメインと、任意選択的にサイトカインとを含有してよい。本融合タンパク質に含有される抗体の抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＣＤ２２、ＣＤ３、ＴＲＯＰ２、糖タンパク質ＮＭＢ、グアニル酸シクラーゼＣ、ＣＥＡ、ＣＤ７９ｂ、ＰＳＭＡ、ＥＮＰＰ３、メソテリン、ＣＤ１３８、ＮａＰｉ２ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＦＯＬＲ１、ＤＬＬ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ１４２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２５、ＳＬＴＲＫ６、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＡＧＳ－２２、Ｃ４．４Ａ、ＦＧＦＲ２、Ｌｙ６Ｅ、ＭＵＣ１６、ＢＣＭＡ、ｐカドヘリン、エフリン－Ａ、ＬＡＭＰ１、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＰＤＬ１、ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＣＭＡ、ＷＴ１，ＭＵＣ１、ＣＤ２０、ＣＤ２３，ＲＯＲ１、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１７４、ＣＤ３０、ＣＤ１３３、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＬｅｗｉｓＹ、メソテリン、ＳＳ１，ＣＥＡ、ＣＤ１７１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＵＣ－１、およびＭＡＧＥ－Ａ３からなる群から選択される抗原に対する抗原結合性ドメインとしてもよいし、本明細書に記載される任意の抗体の抗原結合性ドメインとしてもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質は、二重特異性抗体であり、これは、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＣＤ２２、ＣＤ３、ＴＲＯＰ２、糖タンパク質ＮＭＢ、グアニル酸シクラーゼＣ、ＣＥＡ、ＣＤ７９ｂ、ＰＳＭＡ、ＥＮＰＰ３、メソテリン、ＣＤ１３８、ＮａＰｉ２ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＦＯＬＲ１、ＤＬＬ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ１４２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２５、ＳＬＴＲＫ６、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＡＧＳ－２２、Ｃ４．４Ａ、ＦＧＦＲ２、Ｌｙ６Ｅ、ＭＵＣ１６、ＢＣＭＡ、ｐカドヘリン、エフリン－Ａ、ＬＡＭＰ１、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＰＤＬ１、ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＣＭＡ、ＷＴ１，ＭＵＣ１、ＣＤ２０、ＣＤ２３，ＲＯＲ１、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１７４、ＣＤ３０、ＣＤ１３３、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＬｅｗｉｓＹ、メソテリン、ＳＳ１，ＣＥＡ、ＣＤ１７１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＵＣ－１、およびＭＡＧＥ－Ａ３からなる群から選択される抗原に対する抗原結合性ドメインを含有するか、または、本明細書に記載される任意の抗体に由来する抗原結合性ドメインを含有する。好ましくは、二重特異性抗体は、単鎖の二重特異性抗体であり、それは、同じまたは異なる抗体に由来する２つのｓｃＦｖを含有する。
一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体－サイトカイン融合タンパク質であり、これは、抗体またはその機能性断片と、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＰ、およびＴＲＡＩＬからなる群から選択されるサイトカインとを含有する。そのような融合タンパク質の例は、抗ＰＤ－ｌ抗体または抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合性ドメインＩＬ２との融合タンパク質である。
本明細書に使用される抗体は、当技術分野に公知の任意の抗体またはその機能性断片としてよい。例えば、本明細書に使用される抗体は、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ｂ－ＣＤ４０抗体、もしくは抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗補体Ｃ５抗体、抗ＲＳＶ－Ｆタンパク質、抗ＧＤ２抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗糖タンパク質受容体ｌｉｂ／Ｉｌｌａ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＩＬ２Ｒ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗インテグリンα４抗体、抗ｌｇＥ抗体、抗ＰＤＧＦＲａ抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＳＬＡＭＦ７抗体、抗ＬＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体からなる群から選択される抗体またはその機能性断片としてよい。
好適な実施形態では、本明細書に使用される抗体は、ウトミルマブ、ウレルマブ、ＡＤＧ１０６、ポテリジオ（商標）（モガムリズマブ）、ポテリジオ（商標）（モガムリズマブ）、ベキサール（商標）（トシツモマブ）、ゼヴァリン（商標）（イブリツモマブ・チウキセタン）、リツキサン（商標）（リツキシマブ）、アーゼラ（商標）（オファツムマブ）、ガザイバ（商標）（オビヌツズマブ）、ベスポンサ（商標）（イノツズマブ・オゾガマイシン）、ゼナパックス（商標）（ダクリズマブ）、バリルマブ、セラリズマブ、アドセトリス（商標）（ブレンツキシマブ・ベドチン）、マイロターグ（商標）（ゲムツズマブ）、ダラザレックス（商標）（ダラツムマブ）、ＣＤＸ－１１４０、ＳＥＡ－ＣＤ４０、ＲＯ７００９７８９、ＪＮＪ－６４４５７１０７、ＡＰＸ－００５Ｍ、ＣｈｉＬｏｂ７／４、キャンパス（商標）（アレムツズマブ）、ラプティバ（商標）（エファリズマブ）、ソリリス（商標）（エクリズマブ）、ヤーボイ（商標）（イピリムマブ）、トレメリムマブ、アービタックス（商標）（セツキシマブ）、ベクティビックス（商標）（パニツムマブ）、ポートラーザ（商標）（ネシツムマブ）、ＴｈｅｒａＣＩＭ（商標）（ニモツズマブ）、シナジス（商標）（パリビズマブ）、ユニツキシン（商標）（ジヌツキシマブ）、ＴＲＸ－５１８、ＭＫ－４１６６、ＭＫ－１２４８、ＧＷＮ－３２３、ＩＮＣＡＧＮ０１８６、ＢＭＳ－９８６１５６、ＡＭＧ－２２８、レオプロ（商標）（アブシキシマブ）、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）、パージェタ（商標）（ペルツズマブ）、カドサイラ（商標）（Ａｄｏ－トラスツズマブ・エムタンシン）、ＧＳＫ－３３５９６０９、ＪＴＸ－２０１１、シムレクト（商標）（バシリキシマブ）、タイサブリ（商標）（ナタリズマブ）、ＢＭＳ－９８６０１６、ＲＥＧＮ３７６７、ＬＡＧ５２５、ゾレア（商標）（オマリズマブ）、タボリマブ、ＰＦ－０４５１８６００、ＢＭＳ－９８６１７８、ＭＯＸＲ－０９１６、ＧＳＫ－３１７４９９８、ＩＮＣＡＧＮ０１９４９、ＩＢＩ－１０１、キイトルーダ（商標）（ペムブロリズマブ）、オプジーボ（商標）（ニボルマブ）、ラルトルボ（商標）（オララツマブ）、テセントリク（商標）（アテゾリズマブ）、ＢＭＳ－９３６５５９、バベンチオ（商標）（アベルマブ）、イミフィンジ（商標）（デュルバルマブ）、プロリア（商標）（デノスマブ）、エムプリシティ（商標）（エロツズマブ）、ＭＴＩＧ７１９２Ａ、ＴＳＲ－０２２、ＭＢＧ－４５３、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、アバスチン（商標）（ベバシズマブ）、ルセンティス（商標）（ラニビズマブ）、サイラムザ（商標）（ラムシルマブ）、およびＪＮＪ－６１６１０５８８からなる群から選択される抗体またはその機能性断片としてよい。
本開示では、サイトカインは、当技術分野に一般に用いられる意味と構造とを有することがある。それは、一般的に、広範な生物活性を有する小タンパク質の１種を指し、このタンパク質は、単球、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などの免疫細胞、または内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞などの非免疫細胞を刺激することによって、合成および分泌される。サイトカインは、細胞の成長、分化、および作用、ならびに対応の受容体との結合を通じた免疫応答を調節することがある。適したサイトカインとしては、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子スーパーファミリー、コロニー刺激因子、走化性因子、成長因子などが挙げられる。
例示的なサイトカインとしては、以下に限定されないが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＰ、およびＴＲＡＩＬが挙げられる。
本開示では、生体分子のアミノ酸配列の適した位置（複数可）の１つまたは複数（５個未満または３個未満）のアミノ酸が、システインに変異され、生体分子は、本開示の機能性部分（Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４）に、システインのチオール基を介して共有結合により連結される。例えば、関心のある生体分子の関心のある１個または２個のアミノ酸が、機能性部分とのコンジュゲーションのためにシステインに変異される。抗体については、変異位置は、可変領域の相補性決定領域または非相補性決定領域に存在することがある。好ましくは、変異は、置換による変異である。さらに好ましくは、変異は、抗体の軽鎖の可変領域に発生する。一般的に、変異体は、調製することができ、次いで、対応の抗原に対するその結合活性を試験される。変異体が、野生型抗体に比較して、結合活性の７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を保持するならば、その変異位置のアミノ酸残基が、機能性部分に共有結合的に連結するためにシステインに変異されてよいものと考えられる。あるいは、ある特定の実施形態では、変異体をＲ４に連結することによって作製されたコンジュゲートが、結合活性の８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上を保持するならば、その変異位置のアミノ酸残基が、機能性部分を共有結合的に連結するためにシステインに変異されてもよいものと考えられる。
概して、抗体の軽鎖の可変領域のＣＤＲのＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、およびＹなどのうち１つまたは複数、さらに好ましくはＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｋ、およびＹのうち１つまたは複数、さらに好ましくはＧ、Ａ、Ｔ、Ｌ、およびＳのうち１つまたは複数が、システインに変異されてもよい。一部の実施形態では、抗体の重鎖の可変領域のＣＤＲのＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、およびＹなどのうち１つまたは複数、さらに好ましくはＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｋ、およびＹのうち１つまたは複数、さらに好ましくはＧ、Ａ、Ｔ、Ｌ、Ｙ、およびＳのうち１つまたは複数が、システインに変異されてもよい。変異が抗体の軽鎖の非ＣＤＲに起こる場合、軽鎖または重鎖の可変領域の非ＣＤＲのＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、およびＹなどのうち１つまたは複数、好ましくはＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｉ、Ｙ、およびＬ、さらに好ましくはＧ、Ａ、Ｔ、Ｙ、およびＳのうち１つまたは複数が、システインに変異されてもよい。一部の実施形態では、軽鎖または重鎖の可変領域の非相補性決定領域（ＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３など）のＳ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、およびＹ残基などのうち１つまたは複数が、システインに変異されてもよい。一部の実施形態では、置換変異が、以下の保存部位のうち１つまたは複数に導入されてもよい：ＶＨの非相補性決定領域（ＦＲ１、ＦＲ２、またはＦＲ３）のＧｌｎ３、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｕ４６、Ｔｈｒ６８、およびＡｓｐ７２、ならびにＶＬの非相補性決定領域（ＦＲ１，ＦＲ２ｏｒＦＲ３）のＴｈｒ５、Ｔｙｒ４９、Ａｒｇ６１、Ｓｅｒ６３、Ｓｅｒ６５、Ｓｅｒ６７、Ｔｈｒ７２、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７６、およびＡｓｐ８２。
例えば、一部の本開示の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブなど）の重鎖の変異位置は、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ａｌａ１６、Ｓｅｒ１７、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｙｒ２７、Ｔｈｒ２８、Ｔｈｒ３０、Ａｓｎ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｔｙｒ３５、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ｇｌｙ４９、Ｇｌｙ５０、Ｉｌｅ５１、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｎ５５、Ｇｌｙ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｌｙｓ６３、Ｌｙｓ６５、Ｔｈｒ６９、Ｌｅｕ７０、Ｔｈｒ７１、Ｔｈｒ７２、Ａｓｐ７３、Ｓｅｒ７４、Ｓｅｒ７５、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ７７、Ｔｈｒ７８、Ａｌａ７９、Ｌｅｕ８３、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ａｒｇ９９、Ａｓｐ１００、Ｔｙｒ１０１、Ａｒｇ１０２、Ａｓｐ１０４、Ｇｌｙ１０６、Ｇｌｙ１１１、Ｇｌｙ１１３、Ｔｈｒ１１４、１１５Ｔｈｒ、１１７Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１１９、Ｓｅｒ１２０、Ａｌａ１２１、Ｓｅｒ１２２、Ｔｈｒ１２３、Ｌｙｓ１２４、Ｇｌｙ１２５、およびＳｅｒ１２７からなる群から選択されてもよく；軽鎖の変異位置は、Ｉｌｅ２、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ａｌａ９、Ｔｈｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｌｅｕ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ａｌａ１９、Ｔｈｒ２０、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｌｙｓ２７、Ｇｌｙ２８、Ｓｅｒ３０、Ｔｈｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ｔｙｒ３４、Ｓｅｒ３５、Ｔｙｒ３６、Ｌｅｕ３７、Ｇｌｙ４５、Ａｌａ４７、Ｌｅｕ５０、Ｌｅｕ５１、Ｉｌｅ５２、Ｔｙｒ５３、Ｌｅｕ５４、Ａｌａ５５、Ｓｅｒ５６、Ｔｙｒ５７、Ｌｅｕ５８、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｙ６１、Ａｌａ６４、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｓｅｒ６９、Ｇｌｙ７０、Ｓｅｒ７１、Ｇｌｙ７２、Ｔｈｒ７３、Ａｌａ７６、Ｔｈｒ７８、Ｓｅｒ８０、Ｓｅｒ８１、Ｓｅｒ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｌｅｕ９８、Ｌｅｕ１００、Ｔｈｒ１０１、Ｐｈｅ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１１０、Ｌｙｓ１１１、およびＫ１３０からなる群から選択されてもよい。
あるいは、抗ＰＤ－１抗体（ニボルマブなど）の重鎖の変異位置は、Ｇｌｎ３、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ９、Ｇｌｙ１０、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１７、Ｌｙｓ２３、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｉｌｅ２７、Ａｓｎ３１、Ｔｈｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ａｌａ４９、Ｉｌｅ５１、Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５５、Ｓｅｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ａｓｐ６２、Ｓｅｒ６３、Ｌｙｓ６５、Ｇｌｙ６６、Ｔｈｒ６９、Ｉｌｅ７０、Ｓｅｒ７１、Ａｒｇ７２、Ａｓｐ７３、Ａｓｎ７４、Ｓｅｒ７５、Ｌｙｓ７６、Ａｓｎ７７、Ｔｈｒ７８、Ｌｅｕ７９、Ｌｅｕ８１、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ａｌａ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｔｈｒ９８、Ａｓｎ９９、Ａｓｐ１００、Ａｓｐ１０１、Ｔｙｒ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｇｌｙ１０６、Ｔｈｒ１０７、Ｌｅｕ１０８、Ｔｈｒ１１０、Ｓｅｒ１１２、Ｓｅｒ１１３、Ａｌａ１１４、Ｓｅｒ１１５、Ｔｈｒ１１６、Ｌｙｓ１１７、Ｇｌｙ１１８、およびＳｅｒ１２０からなる群から選択されてもよく；軽鎖の変異位置は、Ｉｌｅ２、Ｌｅｕ４、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ａｌａ９、Ｔｈｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｌｅｕ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ａｌａ１９、Ｔｈｒ２０、Ｌｅｕ２１、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ３３、Ａｌａ３４、Ｔｙｒ３６、Ｇｌｙ４１、Ａｌａ４３、Ｌｅｕ４６、Ｌｅｕ４７、Ｉｌｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ａｓｎ５３、Ａｒｇ５４、Ａｌａ５５、Ｔｈｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｉｌｅ５８、Ａｌａ６０、Ａｒｇ６１、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｔｈｒ６９、Ｔｈｒ７２、Ｌｅｕ７３、Ｔｈｒ７４、Ｉｌｅ７５、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ｌｅｕ７８、Ａｌａ８４、Ｓｅｒ９１、Ｓｅｒ９２、Ａｓｎ９３，Ａｒｇ９６、Ｔｈｒ９７、Ｐｈｅ９８、Ｇｌｙ９９、Ｇｌｙ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｉｌｅ１０６、Ｌｙｓ１０７、Ｔｈｒ１０９、Ａｌａ１１１、Ａｌａ１１２、Ｓｅｒ１１４、Ｉｌｅ１１７、およびＳｅｒ１２１からなる群から選択されてもよい。
抗ＣＴＬＡ－４抗体の重鎖の変異位置は、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ９、Ｇｌｙ１０、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１７、Ｌｅｕ１８、Ｌｅｕ２０、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｐｈｅ２７、Ｔｈｒ２８、Ｐｈｅ２９、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｈｒ３３、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｌｙｓ４３、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５，Ｇｌｕ４６、Ｔｈｒ４９、Ｐｈｅ５０、Ｉｌｅ５１、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５５、Ｌｙｓ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ａｓｐ６２、Ｓｅｒ６３、Ｌｙｓ６５、Ｇｌｙ６６、Ｔｈｒ６９、Ｉｌｅ７０、Ｓｅｒ７１、Ｓｅｒ７５、Ｌｙｓ７６、Ｔｈｒ７８、Ｌｅｕ７９、Ｌｅｕ８１、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ａｌａ８８、Ｇｌｙ８９、Ａｓｐ９０、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｔｙｒ９４、Ｔｙｒ９５、Ａｌａ９７、Ｐｈｅ９８、Ｔｈｒ９９、Ｇｌｙ１００、Ｌｅｕ１０２、Ｇｌｙ１０３、Ａｓｐ１０６、Ｔｙｒ１０７、Ｇｌｙ１０９、Ｇｌｙ１１１、Ｔｈｒ１１２、Ｌｅｕ１１３、Ｔｈｒ１１５、Ｓｅｒ１１７、Ｓｅｒ１１８、Ａｌａ１１９、Ｓｅｒ１２０、Ｔｈｒ１２１、およびＬｙｓ１２２からなる群から選択されてもよく；軽鎖の変異位置は、Ｉｌｅ２、Ｌｅｕ４、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ９、Ｔｈｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｌｅｕ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ａｌａ１９、Ｔｈｒ２０、Ｌｅｕ２１、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２８、Ｇｌｙ３０、Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｌｅｕ３４、Ａｌａ３５、Ｔｙｒ３７、Ｌｙｓ４０、Ｇｌｙ４２、Ａｌａ４４、Ｌｅｕ４７、Ｌｅｕ４８、Ｉｌｅ４９、Ｔｙｒ５０、Ｇｌｙ５１、Ａｌａ５２、Ｐｈｅ５３、Ｓｅｒ５４、Ａｌａ５６、Ｔｈｒ５７、Ｇｌｙ５８、Ｉｌｅ５９、Ｓｅｒ６４、Ｇｌｙ６５、Ｓｅｒ６６、Ｇｌｙ６７、Ｓｅｒ６８、Ｇｌｙ６９、Ｔｈｒ７０、Ａｓｐ７１、Ｔｈｒ７３、Ｌｅｕ７４、Ｔｈｒ７５、Ｉｌｅ７６、Ｓｅｒ７７、Ｌｅｕ７９、Ａｌａ８５、Ｔｙｒ９２、Ｇｌｙ９３、Ｓｅｒ９４、Ｓｅｒ９５、Ｔｈｒ９８、Ｐｈｅ９９、Ｇｌｙ１００、Ｇｌｙ１０２、Ｔｈｒ１０３、Ｌｙｓ１０４、Ｉｌｅ１０７、Ｌｙｓ１０８、Ｔｈｒ１１０、Ａｌａ１１２、Ａｌａ１１３、Ｓｅｒ１１５、Ｓｅｒ１２８、Ｇｌｙ１２９、およびＴｈｒ１３０からなる群から選択されてもよい。
抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブの重鎖の変異位置は、Ｇｌｎ３、Ａｒｇ１９、Ｌｅｕ２０、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｐｈｅ２７、Ｔｈｒ２８、Ｐｈｅ２９、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｈｒ３３，Ｍｅｔ３４，Ｈｉｓ３５、Ｇｌｙ４４、Ｐｈｅ５０、Ｉｌｅ５１、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５５、Ａｓｎ５６、Ａｓｎ５７、Ｌｙｓ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ｔｈｒ６９、Ｓｅｒ７１、Ａｒｇ７２、Ａｓｐ７３、Ａｓｎ７４、Ｓｅｒ７５、Ｌｙｓ７６、Ａｓｎ７７、Ｔｈｒ９９、Ｇｌｙ１００、Ｔｒｐ１０１、Ｌｅｕ１０２、Ｇｌｙ１０３およびＰｒｏ１０４からなる群から選択されてもよく；軽鎖の変異位置は、Ｇｌｎ６、Ａｒｇ２４、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｎ２７、Ｓｅｒ２８，Ｖａｌ２９、Ｇｌｙ３０、Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｉｌｅ４９、Ｔｙｒ５０、Ｇｌｙ５１、Ａｌａ５２、Ｐｈｅ５３、Ｓｅｒ５４、Ａｒｇ５５、Ａｌａ５６、Ｐｈｅ５３、Ｓｅｒ５４、Ａｒｇ５５、Ａｌａ５６、Ｔｈｒ５７、Ｇｌｙ５８、Ｉｌｅ５９，Ｐｒｏ６０、Ａｓｐ６１、Ａｒｇ６２、Ｓｅｒ６８、Ｇｌｙ６９、Ｔｈｒ７０、Ｇｌｎ９０、Ｇｌｎ９１、Ｔｙｒ９２、Ｇｌｙ９３、Ｓｅｒ９４、Ｓｅｒ９５，Ｐｒｏ９６ａｎｄＴｒｐ９７からなる群から選択されてもよい。
抗ＴＮＦα抗体の重鎖の変異位置は、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ９、Ｇｌｙ１０、Ｌｅｕ１１、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１７、Ｌｅｕ１８、Ｌｅｕ２０、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｈｒ２８、Ａｓｐ３０、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３２、Ａｌａ３３、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ｓｅｒ４９、Ａｌａ５０、Ｉｌｅ５１、Ｔｈｒ５２、Ａｓｎ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｙ５６、Ｉｌｅ５８、Ａｓｐ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ａｓｐ６２、Ｓｅｒ６３，Ｇｌｕ６５、Ｇｌｙ６６、Ｐｈｅ６８、Ｔｈｒ６９、Ｉｌｅ７０、Ｓｅｒ７１、Ａｓｐ７３、Ａｓｎ７４、Ａｌａ７５、Ｌｙｓ７６、Ｓｅｒ７８、Ｌｅｕ７９、Ｔｙｒ８０、Ｌｅｕ８１、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ａｌａ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｌｙｓ９８、Ｓｅｒ１００、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｔｈｒ１０４、Ａｌａ１０５、Ｓｅｒ１０６、Ｓｅｒ１０７、Ｌｅｕ１０８、Ａｓｐ１０９、Ｔｙｒ１１０、Ｇｌｙ１１２、Ｇｌｙ１１４、Ｔｈｒ１１５、Ｌｅｕ１１６、Ｔｈｒ１１８、Ｓｅｒ１２０、Ｓｅｒ１２１、Ａｌａ１２２、Ｓｅｒ１２３、およびＴｈｒ１２４からなる群から選択されてもよく；軽鎖の変異位置は、Ａｓｐ１、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ９、Ｓｅｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ａｌａ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ｔｈｒ２０、Ｉｌｅ２１、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｎ２７、Ｇｌｙ２８、Ｉｌｅ２９、Ａｒｇ３０、Ａｓｎ３１、Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ３３、Ａｌａ３４、Ｔｙｒ３６、Ｌｙｓ３９、Ｇｌｙ４１、Ｌｙｓ４２、Ａｌａ４３、Ｌｅｕ４８、Ｌｅｕ４７、Ｉｌｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｌａ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ｔｈｒ５３、Ｌｅｕ５４、Ｇｌｎ５５、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｓｅｒ６０、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｔｈｒ６９、Ａｓｐ７０、Ｔｈｒ７２、Ｌｅｕ７３、Ｔｈｒ７４、Ｉｌｅ７５、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ｌｅｕ７８、Ａｌａ８４、Ｔｈｒ８５、Ｔｙｒ９１、Ａｓｎ９２、Ａｒｇ９３、Ａｌａ９４、Ｔｙｒ９６、Ｔｈｒ９７、Ｐｈｅ９８、Ｇｌｙ９９、Ｇｌｙ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｉｌｅ１０６、Ｌｙｓ１０７、Ｔｈｒ１０９、およびＡｌａ１１１からなる群から選択されてもよい。
抗ＣＤ２８抗体の重鎖の変異位置は、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ａｌａ１６、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ２１、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｙｒ２７、Ｔｈｒ２８、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｇｌｙ４９、Ｔｙｒ５２、Ｇｌｙ５４、Ｔｈｒ５８、Ａｌａ６８、Ｔｈｒ６９、Ｔｈｒ７１、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７５、Ｓｅｒ７７、Ｔｈｒ７８、Ａｌａ７９、Ｓｅｒ８４、Ｌｅｕ８６、Ｓｅｒ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｔｈｒ９７、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｌｅｕ１０３、Ｇｌｙ１１３、Ｔｈｒ１１４、Ｔｈｒ１１５、Ｔｈｒ１１７、Ｓｅｒ１１９、Ｓｅｒ１２０、Ａｌａ１２１、Ｓｅｒ１２２、およびＴｈｒ１２３からなる群から選択されてもよく；軽鎖の変異位置は、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ９、Ｓｅｒ１０、Ｓｅｒ１１、Ｓｅｒ１２、Ａｌａ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ｔｈｒ２０、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２７、Ｉｌｅ２９、Ｔｙｒ３０、Ａｌａ４３、Ｌｅｕ４６、Ｌｅｕ４７、Ｔｙｒ４９、Ｌｙｓ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ｌｅｕ５４、Ｔｈｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｓｅｒ６０、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｔｈｒ６９、Ａｓｐ７０、Ｔｈｒ７２、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ａｌａ８４、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｙ９１、Ｔｈｒ９３、Ｔｙｒ９４、Ｔｙｒ９６、Ｔｈｒ９７、Ｐｈｅ９８、Ｇｌｙ９９、Ｇｌｙ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｔｈｒ１０９ａｎｄＡｌａ１１１からなる群から選択されてもよい。
抗４－１ＢＢ抗体の重鎖の変異位置は、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｓｅｒ３５、Ｌｙｓ５０、Ｔｙｒ５２、Ａｓｐ５５、Ｓｅｒ５６、Ｔｙｒ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｔｙｒ６０、Ｓｅｒ６１、Ｇｌｎ６５、Ｇｌｙ６６、Ｇｌｙ９９、Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ａｓｐ１０４、およびＴｙｒ１０５からなる群から選択されてもよく；軽鎖の変異位置は、Ｓｅｒ２３、Ｇｌｙ２４、Ａｓｐ２５、Ａｓｎ２６、Ｇｌｙ２８、Ａｓｐ２９、Ｇｌｎ３０、Ｔｙｒ３１、Ｇｌｎ４９、Ａｓｐ５０、Ｌｙｓ５１、Ａｓｎ５２、Ａｒｇ５３、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｙ５６、Ｔｈｒ８９、Ｔｙｒ９０、Ｔｈｒ９１、Ｇｌｙ９２、Ｇｌｙ９４ａｎｄＳｅｒ９５からなる群から選択されてもよい。
抗Ｈｅｒ２抗体（トラスツズマブなど）の重鎖の変異位置は、：Ａｒｇ１９、Ｌｙｓ３０、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３３、Ａｒｇ５０、Ｔｙｒ６２、Ａｓｎ５５、Ｔｙｒ５７、Ａｒｇ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｓｐ６２、Ｌｙｓ６５、Ａｓｐ１０２ａｎｄＴｙｒ１０５からなる群から選択されてもよく；軽鎖の変異位置は、Ａｓｐ１、Ｇｌｎ３、Ｇｌｎ２７、Ａｓｐ２８、Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４９、Ｔｙｒ５５、Ａｒｇ６６、Ａｓｐ７０、およびＴｙｒ９２からなる群から選択されてもよい。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブなど）の重鎖の変異位置は、Ｇｌｎ３、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ５４、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｓｐ６２、Ｌｙｓ６５、Ａｓｐ７３、Ｌｙｓ７６、Ａｓｎ７７、およびＡｒｇ９９からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ａｒｇ２４、Ｇｌｎ２７、Ａｓｐ２８、Ｔｙｒ４９、Ｔｙｒ５５、Ａｓｐ７０、Ｇｌｎ８９、Ｇｌｎ９０、Ｔｙｒ９１、およびＴｙｒ９３からなる群から選択される。
一部の好適な実施形態では、様々な抗体の変異位置は、好ましくは表５から表１９に挙げられた位置から選択され、それらの位置は、変異された後に結合活性の７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を保持するか、またはＲ４とコンジュゲートされた後に結合活性の８０％以上、好ましくは９０％以上を保持する。これらの変異位置としては、ＣＤＲおよび非ＣＤＲに含まれるものが挙げられる。例えば、抗ＰＤ－１抗体１の軽鎖の好適な変異位置としては、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｙ２８、Ｓｅｒ３０、Ｔｈｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ｓｅｒ３５、Ｔｙｒ３６、Ｌｅｕ３７、Ｌｅｕ５４、Ａｌａ５５、Ｓｅｒ５６、Ｔｙｒ５７、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｙ６１、Ｓｅｒ９５、Ｔｈｒ１０１、およびＧｌｙ１０４を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｙ２８、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ｓｅｒ３５、Ａｌａ５５、Ｓｅｒ５６、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｙ６１、およびＳｅｒ９５が挙げられる。抗ＰＤ－１抗体２の軽鎖の好適な変異位置としては、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ａｌａ３４、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｌａ５５、Ｔｈｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｉｌｅ５８、Ａｌａ６０、Ｓｅｒ９１、Ｓｅｒ９２、Ｔｈｒ９７、およびＧｌｙ９９を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ａｌａ３４、Ｓｅｒ５２、Ｓｅｒ５４、Ｔｈｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｓｅｒ９１、Ｓｅｒ９２、Ｔｈｒ９７、およびＧｌｙ９９が挙げられる。抗ＣＴＬＡ－４抗体の軽鎖の好適な変異位置としては、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２８、Ｇｌｙ３０、Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｌｅｕ３４、Ａｌａ３５、Ｇｌｙ５１、Ａｌａ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｌａ５６、Ｔｈｒ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｙ９３、Ｓｅｒ９４、Ｓｅｒ９５、Ｔｈｒ９８、およびＧｌｙ１００を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２８、Ｇｌｙ３０、Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ５１、Ｓｅｒ５４、Ｔｈｒ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｙ９３、Ｓｅｒ９４、Ｓｅｒ９５、およびＧｌｙ１００が挙げられる。抗ＣＤ２８抗体の軽鎖の好適な変異位置としては、Ｓｅｒ２６、Ｉｌｅ２９、Ｔｙｒ３０、Ｌｙｓ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ｇｌｙ９１、Ｔｈｒ９３、Ｔｙｒ９４、Ｔｙｒ９６、Ｔｈｒ９７、およびＧｌｙ９９を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｔｙｒ３０、Ａｌａ５１、Ｔｙｒ９６、Ｔｈｒ９７、およびＧｌｙ９９が挙げられる。抗ＴＮＦα抗体の軽鎖の好適な変異位置としては、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｙ２８、Ｉｌｅ２９、Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ３３、Ａｌａ３４、Ａｌａ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ｔｈｒ５３、Ｌｅｕ５４、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｙｒ９１、Ａｌａ９４、およびＴｈｒ９７を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｙ２８、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｙｒ９１、およびＡｌａ９４が挙げられる。
抗ＰＤ－１抗体１の重鎖の好適な変異位置としては、Ｔｈｒ３０、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３５、Ｇｌｙ５０、Ｉｌｅ５１、Ｓｅｒ５４、Ｇｌｙ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ｌｙｓ６３、Ｔｙｒ１０１、およびＧｌｙ１０６を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｔｈｒ３０、Ｇｌｙ５０、Ｓｅｒ５４、Ｇｌｙ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ｌｙｓ６３、およびＧｌｙ１０６が挙げられる。抗ＰＤ－１抗体２の重鎖の好適な変異位置としては、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ｉｌｅ５１、Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５５、Ｓｅｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ａｌａ６１、Ｓｅｒ６３、Ｌｙｓ６５、Ｇｌｙ６６、Ａｓｐ１０１、Ｇｌｙ１０４、Ｇｌｙ１０６、Ｔｈｒ１０７、およびＬｅｕ１０８を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ｔｙｒ５３、Ｇｌｙ５５、Ｓｅｒ５６、Ｓｅｒ６３、Ｌｙｓ６５、Ｇｌｙ６６、Ｇｌｙ１０４、Ｇｌｙ１０６、およびＴｈｒ１０７が挙げられる。抗ＣＴＬＡ－４抗体の重鎖の好適な変異位置としては、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｈｒ３３、Ｉｌｅ５１、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５５、Ｌｙｓ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ａｓｐ６２、Ｓｅｒ６３、Ｌｙｓ６５、Ｇｌｙ６６、Ｇｌｙ１００、Ｌｅｕ１０２、Ｇｌｙ１０３、Ａｓｐ１０６、およびＴｙｒ１０７を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｈｒ３３、Ｇｌｙ５５、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ｓｅｒ６３、Ｌｙｓ６５、Ｇｌｙ６６、Ｇｌｙ１００、およびＧｌｙ１０３が挙げられる。抗ＣＤ２８抗体の重鎖の好適な変異位置としては、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｙｒ２７、Ｔｈｒ２８、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｔｙｒ５２、Ｇｌｙ５４、Ｔｈｒ５８、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、およびＬｅｕ１０３を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｇｌｙ２６、Ｔｙｒ２７、Ｔｈｒ２８、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ５２、Ｇｌｙ５４、およびＬｅｕ１０３が挙げられる。抗ＴＮＦα抗体の重鎖の好適な変異位置としては、Ｔｙｒ３２、Ａｌａ３３、Ｉｌｅ５１、Ｔｈｒ５２、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｙ５６、Ｉｌｅ５８、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ１００、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｔｈｒ１０４、Ａｌａ１０５、Ｓｅｒ１０６、Ｓｅｒ１０７、Ｌｅｕ１０８、およびＴｙｒ１１０を挙げることができ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ａｌａ３３、Ｉｌｅ５１、Ａｌａ６１、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ１００、Ｔｈｒ１０４、およびＳｅｒ１０６が挙げられる。
同様に、変異が軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ、すなわちフレームワーク領域に発生する際に、様々な抗体の変異位置は、好ましくは、表７および表８に挙げられるものから選択されてもよく、それらの位置は、変異された後に結合活性の８０％以上、好ましくは９０％以上を保持する。例えば、本明細書に開示されるように抗ＰＤ－１抗体１の軽鎖については、フレームワーク領域内の好適な変異位置としては、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ａｌａ９、Ｔｈｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｌｅｕ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ａｌａ１９、Ｔｈｒ２０、Ｇｌｙ４５、Ａｌａ４７、Ｌｅｕ５０、Ｌｅｕ５１、Ｉｌｅ５２、Ａｌａ６４、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｓｅｒ６９、Ｇｌｙ７０、Ｓｅｒ７１、Ｇｌｙ７２、Ｔｈｒ７３、Ａｌａ７６、Ｔｈｒ７８、Ｓｅｒ８０、Ｓｅｒ８１、Ｉｌｅ１１０、およびＬｙｓ１１１が挙げられ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ａｌａ９、Ｌｅｕ１１、Ｌｅｕ１３、Ｓｅｒ１４、Ａｌａ４７、Ｌｅｕ５０、Ａｌａ６４、Ｇｌｙ６８、Ｓｅｒ６９、Ｓｅｒ７１、Ｇｌｙ７２、Ｔｈｒ７３、Ｓｅｒ８０、およびＩｌｅ１１０が挙げられる。本明細書に開示されるような抗ＰＤ－１抗体２の重鎖については、フレームワーク領域の好適な変異位置としては、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ９、Ｇｌｙ１０、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１７、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｈｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｔｈｒ６８、Ｓｅｒ７１、Ｓｅｒ７５、Ｔｈｒ７８、Ｔｈｒ８５、Ａｌａ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｔｈｒ９８、Ｔｈｒ１１０、Ｓｅｒ１１２、Ｓｅｒ１１３、Ａｌａ１１４、Ｓｅｒ１１５、Ｔｈｒ１１６、Ｌｙｓ１１７、Ｇｌｙ１１８、およびＳｅｒ１２０が挙げられ；さらに好ましくは、変異位置としては、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ９、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｇｌｙ４４、Ｔｈｒ６８、Ｓｅｒ７５、Ｔｈｒ７８、Ｔｈｒ８５、Ｔｈｒ１１０、Ｓｅｒ１１２、Ｓｅｒ１１３、Ｓｅｒ１１５、Ｔｈｒ１１６、Ｌｙｓ１１７、Ｇｌｙ１１８、およびＳｅｒ１２０が挙げられる。
他の機能性タンパク質、例えばサイトカインなどに関して、その変異体が、野生型タンパク質の結合活性（例えばその本来のリガンドの結合能）の７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上を保持する場合に、その位置のアミノ酸残基は、機能性部分に連結するためのシステインに変異されてもよいものと考えられる。例えば、ＩＬ２の変異位置は、アルファ受容体を遮断するように、Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３５、Ｔｈｒ３７，Ｍｅｔ３９、Ｔｈｒ４１、Ｌｙｓ４３、Ｌｙｓ４８、Ｌｙｓ４９、Ｌｙｓ６４、Ｌｅｕ７２、Ａｌａ７３、Ｓｅｒ７５、Ｌｙｓ７６、Ｌｅｕ９４、Ｔｈｒ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｔｙｒ１０７、Ａｌａ１０８、Ｔｈｒ１１１、およびＡｌａ１１２からなる群から選択されうるか；または、ベータ受容体を遮断するように、Ｌｅｕ１２，Ｈｉｓ１６、Ｌｅｕ１９，Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ２７、Ｓｅｒ７５、Ａｒｇ８１、Ｌｅｕ８５、Ｓｅｒ８７、Ｌｅｕ９４、Ｇｌｙ９８、Ｓｅｒ９９、Ｔｈｒ１０１、およびＴｈｒ１３３からなる群から選択されるか；または、ガンマ受容体を遮断するように、Ｌｅｕ３６、Ａｌａ５０、Ｔｈｒ５１、Ｔｈｒ１２３、Ｓｅｒ１２６、Ｓｅｒ１２７、およびＳｅｒ１３０からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＩＬ２の変異位置は、ＩＬ２のアルファ受容体を遮断するように、Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３５、Ｔｈｒ３７、Ｔｈｒ４１、Ｌｙｓ４３、Ｌｙｓ４８、Ｌｙｓ４９、Ａｌａ５０、Ｌｅｕ７２、Ａｌａ７３、Ｓｅｒ７５、Ｌｙｓ７６、Ｌｅｕ９４、Ｔｈｒ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ａｌａ１０８、Ｔｈｒ１１１、およびＡｌａ１１２からなる群から選択されうるか；または、ＩＬ２のベータ受容体を遮断するように、Ｌｅｕ１９、Ｇｌｙ２７、Ｓｅｒ７５、Ｌｅｕ８０、Ｓｅｒ８７、Ｌｅｕ９４、Ｇｌｙ９８、Ｓｅｒ９９、Ｔｈｒ１０１ａｎｄＴｈｒ１３３からなる群から選択されうるか；または、ＩＬ２のガンマ受容体を遮断するように、Ｌｅｕ３６、Ａｌａ５０、Ｔｈｒ５１、Ｔｈｒ１２３、Ｓｅｒ１２６、Ｓｅｒ１２７ａｎｄＳｅｒ１３０からなる群から選択される。
サイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ１０、およびＩＬ１５などのＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＩｌｅのうち１つまたは複数は、システインに変異されていてもよい。好ましくは、サイトカインのアミノ酸配列のＴｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、ＧｌｙａｎｄＳｅｒのうちいずれかが、システインに変異されている。
一部の実施形態では、ヒトＩＬ１０の変異位置は、Ｔｈｒ６、Ｓｅｒ８、Ｓｅｒ１１、Ｔｈｒ１３、Ｇｌｙ１７、Ａｒｇ２４、Ｓｅｒ３１、Ａｒｇ３２、Ｌｙｓ３４、Ｔｈｒ３５、Ｌｙｓ４０、Ｌｅｕ４６、Ｌｙｓ４９、Ｓｅｒ５１、Ｌｙｓ５７、Ｇｌｙ５８、Ｓｅｒ６６、Ｔｙｒ７２、Ｌｙｓ８８，Ｈｉｓ９０、Ｓｅｒ９３、Ｌｙｓ９９、Ｔｈｒ１００、Ａｒｇ１０４、Ｌｙｓ１１７、Ｓｅｒ１１８、Ｌｙｓ１１９、Ｌｙｓ１２５、Ｌｙｓ１３０、Ｌｙｓ１３４、Ｇｌｙ１３５、Ｔｙｒ１３７、Ｔｙｒ１４９、Ｔｈｒ１５５、Ｌｙｓ１５７、およびＡｒｇ１５９からなる群から選択されてもよい。
本開示の融合タンパク質については、１つまたは複数のシステインが、融合タンパク質の任意のタンパク質内に導入されてもよい。例えば、二重特異性抗体については、この変異（複数可）は、どちらかもしくは両方のｓｃＦｖのＣＤＲまたは非ＣＤＲの中に、またはどちらかもしくは両方の抗原結合性ドメインの中に、導入されてもよい。抗体とサイトカインとの融合タンパク質については、抗体とサイトカインとのどちらかまたは両方が、この変異（複数可）を含有していてもよい。
例示的な配列は配列番号１３～８３に参照されることがある。
生体分子の変異、トランスフェクション、発現、および精製は、当技術分野に公知の方法によって実施されてもよい。例えば、変異位置を有する生体分子の核酸が直接的に合成されてもよく、次いで、酵素消化によって得られた異なる断片の核酸分子が、発現ベクター内に連結されてもよく、そして、発現ベクターは、細菌または真核生物の宿主細胞に形質転換される。システイン変異を含有する生体分子は、宿主細胞における組換えを通じて取得されてもよい。
本開示での使用に適した細菌または真核生物の宿主細胞は、当技術分野で一般に使用される宿主細胞としてもよく、そのようなものとしては、以下に限定されないが、細菌、酵母、および哺乳動物細胞が挙げられる。有用な真核生物の宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、またはピキア・パストリスが挙げられる。
本開示での使用に適した発現ベクターは、当技術分野に公知のウイルスベースの発現ベクターであり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、バキュロウイルス、サルウイルス（ＳＶ４０）、レトロウイルス、ワクシニアベースのウイルスベクターが挙げられる。適した調節因子および選択マーカーを含有する発現ベクターが、変異体を安定的に発現する哺乳動物細胞株を調製するために使用されてもよい。例えば、ＧＳ真核動物発現系（Ｌｏｎｚａ）、ＤＨＦＲ真核動物発現系（インビトロジェン）、およびピキア・パストリス発現系（インビトロジェン）が、発現および調製に使用されてもよい。
本開示の生体分子は、当技術分野に公知の単離方法によって精製されてもよい。これらの方法としては、以下に限定されないが、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、およびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーが挙げられる。例えば、プロテインＧカラムが、細胞培養物の上清中または細胞質の抽出物中の生体分子を単離するために使用されてもよい。一部の実施形態では、生体分子は、「工学的改変」に供されて、生体分子を親和性マトリックスに捕捉することを可能にするアミノ酸配列を含有するものとされることがある。例えば、ポリペプチドを精製し易くために、タグが使用されてもよい。タグとしては、以下に限定されないが、ｃ－ｍｙｃ、ヘマゴニウム（hemagonium）、ポリＨｉｓ（例えば６Ｈｉｓ）、またはＦｌａｇ（商標）（Ｋｏｄａｋ）が挙げられる。そのような種類のタグは、ポリペプチド内の任意の位置に挿入されてもよく、そのようなものとしては、カルボキシ末端、またはアミノ末端が挙げられる。本開示の生体分子はまた、イムノアフィニティクロマトグラフィーによって精製されてもよい。
本開示での使用に適した機能性部分は、式Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４によって表されることがある。この機能性部分では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、任意の適した連結様式を介して合わせて連結されており、そのような連結様式としては、以下に限定されないが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合が挙げられる。本開示では、アミド結合は、「－ＣＯ－ＮＨ－」によって表されることがあり、エステル結合は、「－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－」によって表されることがあり、カルバメート結合は、「－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－」によって表されることがあり、ウレア結合は、「－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－」によって表されることがあり、ヒドラゾン結合は、「－ＣＨ＝Ｎ－ＮＨ－」によって表されることがある。
Ｒ１は、生体分子Ｒ５のための保護基である。それは、生体分子が他の分子によって干渉されるのを防止するために、生体分子がそのリガンドまたは受容体に結合することを防止する任意の群から選択されてもよく、例えば、生体分子が腫瘍または炎症性の微小環境などの病態の微小環境に到達する前にそのリガンドまたは受容体に結合するのを防止するものがある。適したＲ１は、ポリエチレングリコール－Ｃ１－５アルキルカルボニル、ナフチルカルボニル、キノリルカルボニル、フルオレニルカルボニル、アダマンチルカルボニル、
または
および
からなる群から選択されてもよく、式中、各Ｒは、独立してＣ１－４アルキルであり；各ｎは、独立して１から３００００の範囲の整数、例えば１から１５０００、１から５０００、１から２０００、１から３００、１から１５０、１から５０、１から２０、または３から１２の範囲の整数であり；ポリエチレングリコールまたはｐｅｇｍは、４４から１３２０００の範囲の分子量、例えば１０００から５００００または１００００から３００００の範囲のものなどを有するポリエチレングリコールを表し、；ｍは、ポリエチレングリコールの分子量を表し；波線は、Ｒ２に連結しているＲ１の位置を標示する。
一部の実施形態では、Ｒ１は、以下からなる群から選択される。
および
一般的に、変異位置が生体分子の機能性ドメインに、例えば抗体のＣＤＲに存在する場合、Ｒ１の分子量に特定の限定はなく、Ｒ１は比較的低い分子量を有することがある。変異位置が生体分子の機能性ドメインの外側に、例えば抗体の非ＣＤＲに存在する場合、Ｒ１は、好ましくは、Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４の分子量を２００超、好ましくは５００超、さらに好ましくは１０００超とするように選択され、それゆえに生体分子のコンジュゲートの分子量が、５０００超、好ましくは８０００超、さらに好ましくは１００００超となり、それによって病態の微小環境に達する前に生体分子がそのリガンドまたは受容体に結合することが、より良好に防止される。
本開示では、Ｒ２は、切断可能なリンカーアームである。それは、タンパク質分解酵素、プロテアーゼ、もしくはペプチダーゼにより活性化することのできるペプチド、または病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合であることがある。本開示では、タンパク質分解酵素、プロテアーゼ、またはペプチダーゼは、病態の微小環境に存在する様々なタンパク質分解酵素、プロテアーゼ、またはペプチダーゼであることがある。例えば、プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、ゼラチナーゼ、メタロプロテイナーゼ、またはアスパラギンペプチドリアーゼであることがある。一部の実施形態では、Ｒ２は、レグマイン、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カリクレイン、ｈＫｌ、ｈＫｌＯ、ｈＫ１５、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、アストロメリシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニダイン、ブロメライン、カルパイン、カスパーゼ、カスパーゼ－３、Ｍｉｒｌ－ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ－１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモスム（chymosm）、ペプスム（pepsm）、マトリプターゼ，レグマイン、プラスメプスム（plasmepsm）、ネペンテシン、メタロエクソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰｌ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰｌＯ、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＡＤＡＭｌＯ、ＡＤＡＭ１２、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、ネンテロキナーゼ（nenterokinase）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ，ｈＫ３）、インターロイキン－１１３転換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ－ａ）、メプリン、グランザイム、ジペプチジルペプチダーゼ、およびジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）のうち少なくとも１つによって切断されることがある。好適な実施形態では、本開示は、具体的には、腫瘍の微小環境において腫瘍細胞により多く発現および分泌される、レグマインに関する。また、腫瘍関連マクロファージ（Ｍ２型）は、レグマインの発現により単球および炎症性マクロファージ（Ｍ１型）とは異なる。本開示では、上記ペプチドは、タンパク質分解酵素の基質である。それは、タンパク質分解酵素によって認識し切断することができる。
本開示のＲ２は、－Ｒ２ａ－、－Ｒ２ｂ－、－Ｒ２ａ－Ｎ－、－Ｒ２ａ－Ｄ－、－Ｒ２ａ－ＡＡＮ－、－Ｒ２ａ－ＡＡＤ－、または－Ｒ２ａ－Ｒ２ｂ－によって表されることがあり；式中、Ｒ２ａは、１つまたは複数のタンパク質分解酵素によりアミド結合で切断することのできるペプチドであり；Ｒ２ｂは、Ｒ３と共にカルバメートを形成する側鎖にその窒素を有するペプチドの１種であって、このカルバメートは、１つまたは複数のタンパク質分解酵素により切断することができ；Ａは、アラニンであり；Ｎは、Ｒ３と共にカルバメートを形成する側鎖にその窒素を有するアスパラギンであって、このカルバメートは、レグマインにより切断することができ；Ｄは、Ｒ３と共にカルバメートを形成する側鎖にその窒素を有するアスパラギン酸であって、このカルバメートは、グランザイムＢにより切断することができる。Ｒ２ａとＲ２ｂとは、アミド結合を形成することによって連結することができる。レグマインとグランザイムＢがＲ２とＲ３との間の結合（カルバメートなど）を切断した後、Ｒ３は、速やかに自己放出を経ることができる。次いで、Ｒ４部分が保持されることがある。他の酵素がＲ２のアミド結合で切断することがあるが、それによっていくつかのアミノ酸残基がリンカーに留まり、それゆえにＲ３の自己放出が起こらないものとなる。そのようなＲ２の例としては、以下に限定されないが、ＬＴＰＲＬＧＰＡＡＮ（配列番号８４）、ＧＰＡＡＮ（配列番号８５）、およびＬＳＧＲＳＤＮ（配列番号８６）が挙げられる。
一部の実施形態では、タンパク質分解酵素により活性化することのできる適したペプチドは、トリペプチドであることがある。当技術分野に公知の病態の微小環境においてタンパク質分解酵素によって認識し切断する（活性化する）ことのできる任意の基質ペプチドは、本明細書に開示されるようなＲ２として使用されることがある。そのようなペプチドは、本開示に参照によりその実体が組み込まれるＷＯ２０１６／０２６４５８に開示される構造を有することがある。一部の実施形態では、本開示での使用に適したトリペプチド構造において、Ｒ１に連結されたアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＩｌｅからなる群から選択されてもよく、中位のアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、およびＡｓｎからなる群から選択されてよく、Ｒ３に連結されたアミノ酸残基は、ＡｓｎおよびＡｓｐからなる群から選択されてよい。概して、Ｒ２は、そのアミノ酸残基のアミノ基を介してアミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合の連結様式でＲ１に連結し、そのアミノ酸残基のカルボキシ基を介してアミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合の連結様式でＲ３に連結する。一部の本開示の好適な実施形態では、トリペプチドは、Ａｌａ－Ａｌａ－ＡｓｎおよびＡｌａ－Ａｌａ－Ａｓｐからなる群から選択される。Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎは、レグマインによって認識され切断されてもよく、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｐは、グランザイムによって認識され切断されてもよい。
一部の実施形態では、Ｒ２は、病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合であることがある。そのような結合としては、以下に限定されないが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合が挙げられる。Ｒ２が化学結合である際に、本明細書に開示される機能性部分は、式Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４によって表されることあり、式中、Ｒ１は、病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合によってＲ３に連結する。例えば、一部の実施形態では、Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４の構造は、以下のように表されることがある。
または
式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立してＮＲ’またはＯであり、Ｚは、ＨまたはＣ１－１０アルキルであり、好ましくはＣ１－４アルキルであり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１－４アルキルであり；Ｒ３は、Ｒ１およびＲ４に、ＸおよびＹをそれぞれ介してアミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、またはヒドラゾン結合の連結様式で連結する。
一部の実施形態では、Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４の構造は、以下のように表されることがある。
および
本開示では、Ｒ３は、Ｒ２の切断の後に自動的に脱落してＲ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５を放出することができる、自動的に切断可能なリンカーアームとしてもよい。例えば、そのようなリンカーアームとしては、以下に限定されないが、
および
が挙げられる。式中、ＸおよびＹは、それぞれ独立してＮＲ’またはＯであり、Ｚは、ＨまたはＣ１－１０アルキル、好ましくはＣ１－４アルキルであり；Ｒは、Ｃ１－４アルキルであり；ａｎｄＲ’は、ＨまたはＣ１－４アルキルであり；Ｒ４は、上記式のＹまたはＮを介して例えばアミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、およびヒドラゾン結合などの様式で、Ｒ３に連結する。一部の実施形態では、Ｒ３は、－ＮＨ－フェニル－ＣＨ２Ｏ－、－ＮＨ－フェニル－ＣＨ＝Ｎ－、－ＮＨ－フェニル－Ｃ（ＣＨ３）＝Ｎ－、－Ｏ－フェニル－ＣＨ＝Ｎ－、および－Ｏ－フェニル－Ｃ（ＣＨ３）＝Ｎ－からなる群から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ３は、病態の微小環境において酸性で活性化することのできる化学結合である。化学結合は、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、およびヒドラゾン結合からなる群から選択されることがある。
Ｒ３が酸性で活性化することのできる化学結合である際に、Ｒ１－Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５が酸性により活性化することができるのみとなるように、Ｒ２は不在であることがある。一方、Ｒ２が不在である際に、Ｒ３は、酸性で活性化することのできる化学結合でなければならない。
一部の実施形態では、Ｒ３は、以下の構造のうちのいずれかによって表される。
および
上記の式Ｒ３－１からＲ３－１２では、Ｒ２またはＲ２が不在であればＲ１は、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ウレア結合、およびヒドラゾン結合を形成する限り、上式のどちらかの端に連結することがある。
本開示では、Ｒ４は、Ｒ２およびＲ３の切断後に、生体分子の持つ抗原、リガンド、または受容体へのその結合能を回復、維持、低減、または促進することのできる結合基である。一部の実施形態では、結果として得られたＲ４－ｓ－Ｃｙｓ－Ｒ５は、Ｒ２およびＲ３の切断後に、本来のＲ５の持つその抗原、リガンド、または受容体への親和性の＞６０％を呈する。
適したＲ４は、－Ｒ４－ａ－Ｒ４－ｂ－Ｒ４－ｃ－によって表されることがあり、Ｒ４－ａは、
および
からなる群から選択され、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、ＨおよびＣ１－６アルキルまたはＣ１－６アルコキシルからなる群から選択され；
Ｒ４－ｂは、
および
からなる群から選択され、式中、式Ｒ４－ｂ１では、Ｒｃは、不在であるか、またはＣ１－１２アルキル、Ｃ１－１２アルコキシ－Ｃ１－１２アルキル、Ｃ１－１２アルキル－Ｃ３－８シクロアルキル、（Ｃ１－４アルキル－Ｏ）ｐ－Ｃ１－１２アルキル、Ｃ１－１２アルキルカルボニルアミノ－（Ｃ１－４アルキル－Ｏ）ｐ－Ｃ１－１２アルキル、フェニル－Ｃ１－１２アルキル、Ｃ３－８シクロアルキル、Ｃ１－１２アルキル－Ｃ３－８シクロアルキル－Ｃ１－１２アルキル、およびＣ１－１２アルキル－フェニル－Ｃ１－１２アルキルからなる群から選択され；式Ｒ４－ｂ２では、Ｒｃは、アミノ基のＮ原子で置換されたＲａ－１およびＲａ－２を有するＣ１－１２アルキルアミノであり、式４－ｂ３では、Ｒｃは、Ｒａ－１、Ｒａ－２、およびＲ２－３により置換されているアルキルの終端に最後のＣ原子を有するＣ１－１２アルキルであり、式中、Ｒａ－１、Ｒａ－２、およびＲａ－３は、それぞれ独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ１－１２アルキル－ＯＨ、およびＣ１－１２アルキル－ＮＲ’’Ｒ’’’からなる群から選択され、式中、Ｒ’’およびＲ’’’は、それぞれ独立して、ＨおよびＣ１－１２アルキルからなる群から選択され；式Ｒ４－ｂ２およびＲ４－ｂ３では、Ｒ４－ｂは、Ｒａ－１、Ｒａ－２、およびＲａ－３のうち少なくとも１つを介してＲ４－ｃに連結し；
Ｒ４－ｃは、
および
からなる群から選択され、式中、Ｒｘは、Ｈ、ハロ、およびＣ１－４アルキルからなる群から選択され；ｐは、１から１０の範囲の整数、例えば１から５の整数などであり；ｑは、１から４の整数、例えば１から２の整数などであり；但し、Ｒ４－ａが式Ｒ４－ａ２、Ｒ４－ａ３、およびＲ４－ａ４からなる群から選択されるとき、Ｒ４－ｃが不在であり；
上式で、Ｒ３は、Ｒ４にＲ４のＲ４－ｃを介して連結し、Ｒ４－ａの各式に示された波線は、Ｒ４－ａがＲ４－ｂに連結する位置を標示する。好ましくは、式Ｒ４ｃ－ＩＩＩ、Ｒｃ４－ＩＶ、Ｒ４ｃ－ＶＩ、およびＲ４ｃ－ＶＩＩでは、Ｒ３は、これらの基の炭素原子に連結する。
概して、Ｒ４は、マレイミド（Ｒ４－ａ１）、アセチレン（Ｒ４－ａ２）、ビニル（Ｒ４－ａ３）、一置換ブテン二酸（Ｒ４－ａ４）、または二置換マレイミド（Ｒ４－ａ４）．を介して、Ｒ５のシステインのＳ原子に連結する。
一部の実施形態では、Ｒ４は、
および
からなる群から選択され、式中、波線は、Ｒ３に連結しているＲ４の位置を標示する。
一部の実施形態では、Ｒ４は
によって表され、式中、
Ｒａは、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ１－１２アルコキシ、Ｃ１－１２アルキルカルボニル、任意選択的に１つまたは２つのハロゲンによって置換されたフェノキシまたはフェニルアミノ、Ｃ１－１２アルキルアミノ、Ｃ１－１２アルコキシ－Ｃ１－１２アルキルアミノ、Ｃ１－１２アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１－１２アルキル－Ｃ３－８シクロアルキルカルボニルオキシ、（Ｃ１－４アルキル－Ｏ）ｐ－Ｃ１－１２アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１－１２アルキルカルボニルアミノ－（Ｃ１－４アルキル－Ｏ）ｐ－Ｃ１－１２アルキルカルボニルオキシ、Ｃ１－１２アルキルカルボニルアミノ、およびフェニル－Ｃ１－１２アルキルカルボニルアミノからなる群から選択され；
ｐは、１から１０の範囲の整数、例えば１から５の範囲の整数などであり；
Ｒ３は、Ｒ４のＲａを介してＲ４に、およびＲ４のマレイミド基を介してＲ５のチオール基に連結され、
本開示のコンジュゲートでは、Ｒ４は、Ｒ５に含有されるシステインのＳを介して共有結合的にＲ５に連結する。Ｒ１－Ｒ２は、タンパク質分解酵素によって、または病態の微小環境の酸性条件下で、Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５から切断され、Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５が放出される。次いで、Ｒ３は、自動的に脱落し、Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５が放出される。Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５は、Ｒ５の持つそのリガンドまたは受容体への結合能を回復または促進することができる。
本開示では、標示された各式に使用される波線（複数可）は、波線（複数可）を含有する基と他の基との連結位置を標示し、抗体のアミノ酸残基について記述されたアミノ酸の位置番号の全ては、カバット付番規則に基づくことを理解するべきである。
Ｒ５は、上に記載されるように、１つまたは複数のアミノ酸残基がシステインに変異された生体分子を表す。Ｒ５は、実際には、導入されたシステインのチオール基の水素原子を含まない、生体分子の部分である。チオール基の水素原子が不在であることにより、Ｒ５を、本開示のＲ４に連結するための基と捉えることが可能になる。
本開示のコンジュゲートは、ＤＴＴ、ＴＣＥＰ、または他の還元剤によって変異体生体分子を還元すること；Ｃｕ２ＳＯ４、デヒドロアスコルビン酸、または他の酸化剤によって酸化すること；および次いで、酸化された生体分子（Ｒ５）を液相または固相の条件下でＲ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４にコンジュゲートすることを含む方法によって調製されてもよい。最終生成物は、液相に収集されてもよい。
そのため、コンジュゲートに加えて、本開示はまた、機能性部分、すなわち、Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４；Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４；Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５；Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５；および変異型生体分子を含み；式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ３、Ｒ５、およびそれらの連結様式、および変異型生体分子は、本開示の任意の部分または任意の実施形態にあるように定義される。一部の実施形態では、機能的部分は、Ｓ１－Ｓ６４によって示される。本開示では、－Ｓ－ｃｙｓ－はＲ４が変異によりＲ５に導入されたシステインのチオール基を介して共有結合的にＲ５に連結することを標示する。Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５は、タンパク質分解酵素によるかまたは病態の微小環境の酸性条件下で、Ｒ１－Ｒ２の切断によって作製されるコンジュゲートである。概して、Ｒ２からのＲ３の分離の後、以前にＲ２に連結されていたＲ３の基は、ヒドロキシ基（－ＯＨ）またはアミノ基（－ＮＨ２）を形成する。Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５は、Ｒ３の自動的な脱落の後に形成されたコンジュゲートである。概して、Ｒ３の自動的な脱落の後に、以前にＲ３に連結されていたＲ４基は、ヒドロキシ基（－ＯＨ）またはアミノ基（－ＮＨ２）を形成する。
本明細書に記載されるようなコンジュゲート、機能性部分、Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４、Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５、およびＲ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５は、当技術分野に公知の方法によって合成されてもよい。例えば、それらは、本願の実施例１に記載された方法に従って調製されてもよい。
本開示はまた、本明細書に記載されるようなコンジュゲートを含む医薬組成物を含む。この医薬組成物はさらに、医薬的に許容可能な担体を含むことがある。担体は、任意の医薬的に許容可能な担体または賦形剤としてよく、それらは剤形および投与方法に従って変わることがある。医薬的に許容可能な担体は、一般的に安全で非毒性であり、製薬産業で医薬組成物を製剤化する際に使用される任意の公知の物質を含むことがあり、そのようなものとしては、フィラー、希釈剤、凝固剤、接着剤、滑沢剤、流動化剤、安定剤、着色料、湿潤剤、崩壊剤などが挙げられる。適した医薬的に許容可能な担体としては、糖類、例えば、ラクトースまたはスクロース、マンニトールまたはソルビトールなど；セルロース製剤および／もしくはリン酸カルシウム、例えば、リン酸三カルシウムもしくはリン酸水素カルシウムなど；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプンを含むデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／もしくはポリビニルピロリドン；シリカ、タルク、ステアリン酸もしくはその塩、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウムなど；ならびに／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。医薬的に許容可能な担体を選択する際に、主な考慮されることは医薬組成物の投与方法である。これは当技術分野に周知である。
医薬組成物は、治療有効量または予防有効量のコンジュゲートを含むことがある。「有効量」は、成分の量が所望の反応を生じるには十分であることを示す。具体的な有効量は、様々な要因に依存するものとなり、そのような要因としては、治療される具体的な疾患、患者の身体的状態、例えば、体重、年齢、および性別など、治療の持続期間、併せて投与されている療法（もしあれば）、および使用された具体的な製剤が挙げられる。一般に、本明細書に記載される「有効量」とは、従来の生体分子の量である。しかし、一部の実施形態では、本医薬組成物に含有されるコンジュゲートの治療有効量または予防有効量は、従来の生体分子の量よりも低い可能性があるが、より良好な治療効果または予防効果を生じる可能性があり、それはなぜなら、生体分子が、病態の微小環境へ達する前にそのリガンドまたは受容体へ結合することのないように、保護基によって保護されているためである。
本開示の医薬組成物は、様々な適した剤形に製剤化されてもよく、そのようなものとしては、以下に限定されないが、錠剤、カプセル、注射剤などが挙げられ、期待される目的を達成するための任意の適した経路を介して投与することができる。例えば、それは、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉に、腹腔内に、経皮的に、経口的に、髄腔内に、頭蓋内に、経鼻的に、または外部に投与することができる。薬剤の用量は、患者の年齢、健康状態、および体重、並行して行われる治療、および治療の頻度などに依存することがある。本開示の医薬組成物は、それを必要とする任意の対象、例えば哺乳動物、特にヒトに投与されることがある。
腫瘍患者では、腫瘍細胞または腫瘍抗原を担持する抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、宿主によるＴ細胞の結合を介した腫瘍の免疫学的な殺傷を、部分的にまたは全体的に阻害する。しかし、本開示のコンジュゲートは、タンパク質分解酵素、特にレグマインまたはグランザイムによって、または病態の微小環境の酸性条件下で、活性化されて放出される。例えば、生体分子がＩＬ２である本開示のコンジュゲートは、抗ＣＤ２８抗体または抗ＰＤ－１抗体などは、Ｔ細胞の増殖を選択的に刺激するか、または抗腫瘍サイトカインを分泌するためのその機能を増強することができる。そのため、本開示のコンジュゲートは、個体の免疫関門を有効に突破し、病態の微小環境に達し、次いで、病態の微小環境で活性化されて放出されることが可能である。結果として、それは、腫瘍または炎症の微小環境において、選択的にＴ細胞の増殖または殺傷作用などを促進し、それによって低い自己免疫と高い有効性とを実現する。
そのため、本開示に開示されるコンジュゲート、Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５、または変異型生体分子のそれぞれは、腫瘍または炎症を治療するために使用されることがあり、腫瘍または炎症を治療するための医薬を調製するための活性成分として使用することができる。本明細書に記載される腫瘍または炎症は、本明細書に記載されるような生体分子によって治療されることが公知である任意の腫瘍または炎症とすることができ、そのようなものとしては、以下に限定されないが、膀胱、脳、乳房、子宮頸部、結腸・直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣、精巣、および血液などにおけるがんが挙げられる。特に、上記がんとしては、膀胱がん、脳がん、乳房がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、食道がん、腎がん、肝臓がん、肺がん、上咽頭がん、膵がん、前立腺がん、皮膚がん、胃がん、子宮がん、卵巣がん、精巣がん、および血液がんが挙げられる。
さらに含まれるのは、腫瘍または炎症を治療または予防するための方法であって、治療有効量または予防有効量の本明細書に記載されるコンジュゲートまたはその医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法である。この方法は、任意の公知の放射線療法または免疫療法との併用で使用されることがある。
本開示の生体分子のコンジュゲートは、以下の構造：
のいずれかによって表され、式中、サイトカインおよび抗体は、配列番号１～８３のいずれかからなる群から選択される、生体分子のコンジュゲートであってもよい。
本開示に使用される用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または同様の発現は、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」なども意味することが理解されるべきである。全ての重量パーセンテージまたは体積パーセンテージの和は、１００％に等しいものとすべきである。別段に特定のない限り、実施例に使用される様々な試薬および製品は商用製品である。別段に特定のない限り、実施例に述べられる方法は、従来の手法に従って実施された。以下の例は、本開示の範囲を限定することを意図されていない。
配列の情報を下記にまとめる。
実施例１：活性化可能な結合アームの化学構造の合成
Ｒ２がアミノ酸配列Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎを有し、Ｒ３がＰＡＢＣ（Ｒ３－５）である際の、合成スキームを下記に示す。
Ｒ１およびＲ４が異なる置換基である際に、表１に示される以下の化合物を得た。
Ｓ１５により例示される際の、具体的な合成プロセスを下記に示した。
１）Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（２０ｇ、０．０３ｍｏｌ）、２－（７－アザベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（１５ｇ、０．０４ｍｏｌ）、およびＤＭＦ（２００ｍＬ）を、三ツ口フラスコに添加し、３０分間攪拌した。ｐ－アミノベンジルアルコール（４．１ｇ、０．０３ｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（８．７ｇ、０．０６ｍｏｌ）を０℃でそれぞれ添加し、次いで、室温で３時間攪拌した。ＤＭＦの殆どを回転蒸発により除去した。残渣を酢酸酢酸（２００ｍＬ）に溶解し、飽和塩化アンモニウム溶液と次いで飽和塩化ナトリウム溶液とを用いて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、濾過した。溶媒を蒸発により除去した。粗生成物を叩いて、白色の固体のＦｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢＣ（２１．３ｇ；収率：９０％）を得た。
２）Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢＣ（１６．０ｇ、２２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）に溶解した。ピペリジン（３０ｍＬ）を添加し、次いで、室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発により除去した。残基を真空オーブンにて高真空下でさらに乾燥させて少量のピペリジンを除去し、９．８ｇの淡黄色の固体のＮＨ２－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢＣを生じ、これは精製せずに次の工程に使用することができた。
３）Ａｌｌｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＯＨ（５．０ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１１．６ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（５０ｍＬ）を、三ツ口フラスコに添加し、氷浴中で３０分間攪拌した。ＮＨ２－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢＣ（９．８ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７．８９ｇ、６１．２ｍｍｏｌ）を０℃でそれぞれ添加し、次いで、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発により除去した。残渣を酢酸酢酸（２００ｍＬ）に溶解し、飽和塩化アンモニウム溶液と次いで飽和塩化ナトリウム溶液とを用いて洗浄し、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した後、濾過した。溶媒を蒸発により除去した。結果として得られた粗生成物を再結晶化に供し、白色の固体のＡｌｌｏｃ－ＡＡＮ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢＣ（１３．０ｇ；収率：９０％）を得た。
４）Ａｌｌｏｃ－ＡＡＮ（Ｔｒｔ）－ＰＡＢＣ（１０．０ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解した。トリフルオロ酸（２０ｍＬ）を添加して、次いで、室温で４時間攪拌した。水による洗浄および分画の後、有機相を無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒を減圧下で蒸発により除去し、残りのトリフルオロ酸を高真空下で蒸発により除去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーによって単離し、Ａｌｌｏｃ－ＡＡＮ－ＰＡＢＣ（５．９ｇ；収率：８９％）を得た。
５）ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解したＡｌｌｏｃ－ＡＡＮ－ＰＡＢＣ（４６７ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を、三ツ口フラスコに添加した。ジクロロメタン中４－ニトロフェニルクロロホルメート（４０６ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン中ピリジン（１６０ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を、氷浴中、窒素ガス保護下でフラスコ内にそれぞれ滴下し、次いで、室温で一晩攪拌した。１－（６－アミノヘキシル）－１Ｈ－ピロロ－２，５－ジオン（２３５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を上記溶液中にバッチで添加し、室温で４時間反応させた。反応溶液を回転蒸発により乾燥した。結果として得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色の固体のＳ１５－１（５４０ｍｇ；収率：８０％）を得た。
６）ＤＭＦ（１０ｍｌ）、Ｓ１５－１（２０８ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、酢酸（２７４ｍｇ、４．６５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィンパラジウム（７２ｍｇ、０．０６２ｍｍｏｌ）、および水素化トリブチルスズ（１．１７ｇ、４．０３ｍｍｏｌ）を、連続的に一ツ口フラスコ内に添加した。フラスコ内の空気を窒素ガスに置換した後、Ｓ１５－１が完全に反応するまで混合物を室温で攪拌した。反応が完了した後、ＤＭＦを減圧下で蒸発により除去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離および精製し、Ｓ１５－２（白色の固体、１１６ｍｇ、収率：６２％）を得た。
７）Ｓ１５－Ｒ１（９４０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（９５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（１０ｍＬ）を、三ツ口フラスコに添加し、次いで、氷浴中で３０分間攪拌した。次いで、化合物Ｓ１５－２（１１０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を０℃でそれぞれ添加し、次いで、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発により除去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離および精製し、化合物Ｓ１５である白色の固体（４１８ｍｇ；収率：４０％）を得た。
Ｒ２がアミノ酸配列Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｐを有し、Ｒ３がＰＡＢＣである際の、合成スキームを下記に示す。
Ｒ１およびＲ４が異なる置換基である際に、表２に示される以下の化合物を得た。
Ｓ１６によって例示される際の、具体的な合成プロセスを下記に示した。
１）Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ａｌｌｏｃ）－ＯＨ（１３．２ｇ、０．０３ｍｏｌ）、２－（７－アザベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（１５ｇ、０．０４ｍｏｌ）、およびＤＭＦ（２００ｍＬ）を三ツ口フラスコに添加し、３０分間攪拌した。ｐ－アミノベンジルアルコール（４．１ｇ、０．０３ｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（８．７ｇ、０．０６ｍｏｌ）を０℃でそれぞれ添加し、次いで、室温で３時間攪拌した。ＤＭＦを回転蒸発により除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色の固体のＦｍｏｃ－Ａｓｐ（Ａｌｌｏｃ）－ＰＡＢＣ（１４．７ｇ；収率：８９％）を得た。
２）Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（Ａｌｌｏｃ）－ＰＡＢＣ（１４．０ｇ、２５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（８０ｍＬ）に溶解した。ピペリジン（３０ｍＬ）を添加し、次いで、室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発により除去した。残渣を真空オーブンにて高真空下でさらに乾燥させて、精製せずに次の工程に使用できる８．０ｇの淡黄色の固体のＮＨ２－Ａｓｐ（Ａｌｌｏｃ）－ＰＡＢＣを得た。
３）Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＯＨ（７．８ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）、ベンゾトリアゾール－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（１１．６ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（５０ｍＬ）を、三ツ口フラスコ内に添加し、氷浴で３０分間攪拌した。ＮＨ２－Ａｓｐ（Ａｌｌｏｃ）－ＰＡＢＣ（６．６ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７．８９ｇ、６１．２ｍｍｏｌ）を０℃でそれぞれ添加して、次いで、室温で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発により除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色の固体のＦｍｏｃ－ＡＡＤ（Ａｌｌｏｃ）－ＰＡＢＣ（１２．６ｇ；収率：９０％）を得た。
４）Ｆｍｏｃ－ＡＡＤ（Ａｌｌｏｃ）－ＰＡＢＣ（１２ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍＬ）に溶解した。ピペリジン（３０ｍＬ）を添加して、次いで、室温で２時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発により除去した。残渣を真空オーブンにて高真空でさらに乾燥させて、７．０ｇ淡黄色の固体を得、これを次の工程に直接的に使用した。
５）中間体Ｓ１６－Ｒ１（５２２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、２－（７－アザベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（４６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（２０ｍＬ）を、三ツ口フラスコ内に添加し、３０分間攪拌した。ＮＨ２－ＡＡＤ（Ａｌｌｏｃ）－ＰＡＢＣ（４６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３８．７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を０℃でそれぞれ添加し、次いで、室温で３時間攪拌した。ＤＭＦを回転蒸発により除去した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、Ｓ１６－１（白色の固体、２５１ｍｇ、収率：４５％）を得た。
６）Ｓ１６－１（２４０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）溶解されｉｎジクロロメタン（１０ｍＬ）を、三ツ口フラスコ内に添加した。ジクロロメタン中４－ニトロフェニルクロロホルメート（１８ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン中ピリジン（７．３ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）を、氷浴中、窒素ガス保護下でフラスコ内にそれぞれ滴下し、次いで、室温で一晩攪拌した。Ｒ４－７（１１ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を上記溶液中に添加し、室温で４時間反応させた。反応溶液を回転蒸発により乾燥した。結果として得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、白色の固体Ｓ１６－２（９６ｍｇ；収率：３８％）を得た。
７）ＤＭＦ（１０ｍｌ）、化合物Ｓ１６－２（９６ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）、酢酸（１２７ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィンパラジウム（３３ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）、および水素化トリブチルスズ（０．５４ｇ、１．８６ｍｍｏｌ）を、一ツ口フラスコ内に連続的に添加した。フラスコ内の空気を窒素ガスにより置換した後、化合物Ｓ１６－２が完全に反応するまで混合物を室温で攪拌した。反応が完了した後、ＤＭＦを減圧下で蒸発により除去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって単離および精製し、化合物Ｓ１６である白色の固体（５４ｍｇ；収率：６２％）を得た。
酸性で活性化可能な基を含有していた際の、合成スキームを以下に示した。
Ｓ２０によって例示される際の、具体的な合成プロセスを下記に示した。
１）Ｒ１－１０（３．１ｇ、０．０１ｍｏｌ）、２－（７－アザベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）（４．５６ｇ、０．０１２ｍｏｌ）、およびＤＭＦ（２０ｍＬ）を、三ツ口フラスコ内に添加し、３０分間攪拌した。Ｓ２０－１（１．３５ｇ、０．０１ｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、０．０３ｍｏｌ）を、０℃でそれぞれ添加し、次いで、室温で３時間攪拌した。ＤＭＦを回転蒸発により除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、淡黄色の油状物質Ｓ２０－２（２．５ｇ；収率：５９％）を得た。
２）Ｓ２０－２（９８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＲ４－１８（４２ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を秤量し、５０ｍＬ一ツ口フラスコ内に連続的に添加した。ジクロロメタン（５ｍＬ）を添加してＳ２０－２およびＲ４－１８を溶解した後、４Ａモレキュラーシーブス（８１ｍｇ）を添加した。フラスコ内の空気を窒素ガスに置換した後、混合物を室温で一晩反応させた。反応溶液を回転蒸発により乾燥した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物Ｓ２０である白色の固体（８１ｍｇ；収率：６０％）を得た。
Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４が異なる置換基であった際に、以下の表３の化合物を得た。
化合物Ｓ１－６４を質量スペクトル（ＭＳ）により確認し、それらの分子量を表４に示したが、これらは、その構造に基づき計算された分子量に一致した。
実施例２：抗体の可変領域のＣＤＲ内の変異後の結合活性の解析およびＲ４についてのスクリーニング
抗ＰＤ－１抗体１のアミノ酸配列は、ＷＯ２００８１５７１２Ａ１に開示されており、そのＤＮＡ配列を、宿主における発現用に最適化して合成した（ジーンウィズ社、蘇州、中国）。抗ＰＤ－１抗体２のアミノ酸配列は、ＷＯ２００６１２１１６８Ａ２に開示されており、そのＤＮＡ配列を、宿主における発現用に最適化して合成した（ジーンウィズ社、蘇州、中国）。抗ＣＴＬＡ－４抗体のアミノ酸配列は、米国特許出願公開第２０１５０２８３２３４号に開示されており、そのＤＮＡ配列を最適化して合成した（ジーンウィズ社、蘇州、中国）。抗ＴＮＦα抗体のアミノ酸配列は、米国特許出願公開第００９５３４０４６号に開示されており、そのＤＮＡ配列を、宿主における発現用に最適化して合成した（ジーンウィズ社、蘇州、中国）。抗ＣＤ２８抗体のアミノ酸配列は、米国特許出願公開第００７９３９６３８号に開示されており、そのＤＮＡ配列を、宿主における発現用に最適化して合成した（ジーンウィズ社、蘇州、中国）。合成されたＤＮＡを消化し、改変型ｐＴＴ５ベクター（バイオベクター）に連結して、ｐＴＴ５－ａｎｔｉ－ＰＤ－１－１、ｐＴＴ５－ａｎｔｉ－ＰＤ－１－２、ｐＴＴ５－ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４、ｐＴＴ５－ａｎｔｉ－ＴＮＦα、およびｐＴＴ５－ａｎｔｉ－ＣＤ２８を作製した。ｐＴＴ５－ａｎｔｉ－ＰＤ－１－１，ｐＴＴ５－ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４，ｐＴＴ５－ａｎｔｉ－ＴＮＦα、およびｐＴＴ５－ａｎｔｉ－ＣＤ２８を鋳型として使用し、コドンを変異位置でシステインのものに置き換えるようにプライマーを設計し、変異された断片を改変型ｐＴＴ５ベクター内へとＰＣＲおよび消化および構築することによって、システイン変異を導入した。
発現宿主をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ライフテクノロジーズ）とした。トランスフェクション前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（ギブコ）を含有する完全培地中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションの前日に、細胞を適切な密度で１５ｃｍ培養ディッシュ上に接種し、培養培地を低ＩｇＧ含有ＦＢＳ（ギブコ）に交換した。トランスフェクションの６時間後、または２日目に、培養培地をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３（ギブコ）に交換した。
トランスフェクションの当日、細胞がある特定の集密度に到達した際に、リポフェクタミン２０００（ライフテクノロジーズ）およびＰＥＩ（シグマ）を使用して、標的タンパク質を発現するプラスミドを２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。抗体発現プラスミドは、抗体の重鎖および軽鎖を含んでいた。トランスフェクション後の４日目および６日目に、培養上清をそれぞれ回収した。タンパク質または抗体の発現および活性を検出し、タンパク質または抗体を精製した。
抗体（Ａｂ）の重鎖および軽鎖内の可変領域の超可変領域は、抗体の抗原（Ａｇ）結合部位を構成する。抗原結合性部位が抗原エピトープの構造に相補的であることから、超可変領域は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ともよばれる。抗ＰＤ－１抗体１、抗ＰＤ－１抗体２、およびＣＴＡＬ４抗体の軽鎖の可変領域の配列をアラインメントし、それらのＣＤＲを図１に示した。
本開示では、その当初の抗体に比較した際の点変異を有する各変異体の活性を、ＥＬＩＳＡによって検出した。具体的には、９６ウェルプレートを、抗体の抗原によって一晩被覆し、次いで、１％ＢＳＡブロッキング剤（サーモフィッシャー）の共存下３７℃で２時間ブロッキングし、ＰＢＳＴにより３回洗浄した。対応の抗体または対応の変異体を添加し、３７℃で１時間結合させて、次いで、ＰＢＳＴにより３回洗浄した。ＨＲＰ酵素－コンジュゲート抗ヒトＩｇＧを添加し、３７℃で１時間結合させて、次いで、ＰＢＳＴにより３回洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を使用して、４５０ｎｍでの吸収を検出した。変異体が結合強度に及ぼす効果を、ＯＤ変異後／ＯＤ野生型によって計算した。
表５および表６に示されるような異なる位置に変異を有する３つの抗体の変異体の結合活性を、上記の方法に従って試験した。表５および表６では、Ａは結合活性９０～１１０％を表し、Ｂは結合活性７０～９０％を表し、下向き矢印の記号は７０％未満の結合活性を標示する。
結果では、異なる抗体の可変領域において、Ｇ、Ｓ、およびＴの一部分をＣに変異することにより、野生型抗体に比べて少ない効果が結合活性に及ぼされることが示され、それは元の結合活性の９０％以上であった。Ａ、ＩおよびＴの一部分をＣに変異することにより、野生型抗体の結合活性の７０～９０％という結合活性が生じた。
抗ＰＤ１抗体１の軽鎖の点変異についてのＣｏ－ＩＰスクリーニングから得られた結果を図２に示すが、ここでは、パネルａは、ＷＢによって検出された、野生型抗体の変異が発現に及ぼす効果を示し、パネルｂは、ＷＢによって検出された、変異型抗体のＰＤ１との結合を示す。
Ｒ４との結合後のＣＤＲに変異を有する抗体の変異体の結合活性の解析
表７～１６に示されるように、軽鎖または重鎖のＣＤＲに変異を有する抗体を、コンジュゲーション用の小分子のライブラリー中のＲ４にコンジュゲートし、それらの結合活性を、野生型抗体と比較して（抗体とのコンジュゲートの結合活性／野生型抗体の結合活性＊１００％）、分子間力を付与し結合活性を増強するものとなるコンジュゲーションの方式を得た。
表７および表８によれば、抗ＰＤ－１抗体１のＣＤＲのＡ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｔ、またはＫをＣに変異させてＲ４に結合した後、変異体は、結合効率＞８０％を保持することができた。
表９および表１０によれば、抗ＰＤ－１抗体２のＣＤＲのＧ、Ｓ、Ａ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、またはＴをＣに変異させてＲ４に結合した後、変異体は、結合効率＞８０％を保持することができた。
表１１および表１２によれば、抗ＣＴＬＡ－４抗体のＣＤＲのＡ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｔ、Ｋ、Ｙ、またはＤをＣに変異させてＲ４に結合した後、変異体は、結合効率＞８０％を保持することができた。
表１３および表１４によれば、抗ＣＤ２８抗体のＣＤＲのＧ、Ｓ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｙ、またはＴをＣに変異させてＲ４に結合した後、変異体は、結合効率＞８０％を保持することができた。
表１３および表１４によれば、抗ＴＮＦα抗体のＣＤＲのＡ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、またはＴをＣに変異させてＲ４に結合した後、変異体は、結合効率＞８０％を保持することができた。
実施例３：可変領域の非ＣＤＲ内の相同性の高い配列に変異を有する変異体の結合活性に関する解析とＲ１についてのスクリーニング
抗体は、２本の同一の軽鎖（ＬＣ）と２本の同一の重鎖（ＨＣ）とを含む４本のペプチド鎖からなる。これらの鎖は、ジスルフィド結合（複数可）および非共有結合によって単量体を形成する。２タイプの軽鎖、すなわちκおよびλと、５タイプの重鎖、すなわちμ、δ、γ、ε、およびαがある。抗体は、全体としては、定常領域と可変領域とに分けられる。可変領域は、Ｙ形状構造の２本のアームの末端に位置する。ヒト化抗体またはヒト抗体は、ある特定の一般性を有するが、すなわち、それらは全て、Ｙ形状構造の２本のアームの末端において重鎖または軽鎖に４つのループを含有する（図３）。３つのループは、可変性が高く、抗原との結合性に直接的に予期する。これらのループ内にある領域はＣＤＲと称され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ、これらの３つのループに存在する。他のループも同じ側に存在し、そこでは、抗体は、四次元空間から抗原に結合する。いくつかのループは、保存された構造を有するだけでなく、保存された配列も有する。
８つの上市抗体（図４の最初から最後までの抗体に示される、それぞれテセントリク（アテゾリズマブ）、ヤーボイ（イピリムマブ）、ヒュミラ（アダリムマブ）、キイトルーダ（ペムブロリズマブ）、オプジーボ（ニボルマブ）、アービタックス（セツキシマブ）、リツキサン（リツキシマブ）、およびパージェタ（ペルツズマブ））由来の軽鎖をアラインメントし、結果を図４に示した。各軽鎖の可変領域の４番目のループ（ＧＳＧＳＧＳＴ）は保存されていた。
抗ＰＤ－１抗体の軽鎖のＣＤＲの同じ側には４つのループがあり、そのうち３つのループが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含むＣＤＲであった。残りのループは、ＦＤＡに認可された多数の薬剤に比べて保存された構造および配列を有していた。このループの配列は、ＲＦＳＧＳＧＳＧＴであり、６４～７２位に位置していた（図４）。抗ＰＤ－１抗体１のループ４内の各アミノ酸残基を、Ｃｙｓに変異させて、Ｓ９またはＳ１３にコンジュゲートした。異なる長さのＲ１－Ｒ４へのコンジュゲーションが変異体のＰＤ－１との結合活性に及ぼす効果を、ＥＬＩＳＡによって検出した。結果を表１７に示した。コンジュゲートアームの立体構造または長さを変化させることによって、変異体の活性の７０％以上を阻害しうることを見出すことができた。
抗体を、イムノグロブリンスーパーファミリーの遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏでの組換えによって作製した。異なる抗原に対する抗体のいくつかのフレームワーク領域は、同じ生殖細胞系列抗体の遺伝子またはアミノ酸配列を由来とすることがある。例えば、Ｈｅｒ２抗体であるハーセプチン（トラスツズマブ）の重鎖は、抗ＰＤ－１抗体であるテセントリク（アテゾリズマブ）のものとは３つのＣＤＲが異なる。それらは同じ非ＣＤＲフレームワーク配列を有し、これらのフレームワーク配列は同じ生殖細胞系列抗体を由来とする（図５）。ハーセプチンとテセントリクの重鎖と同様に、ＰＤ－１抗体であるオプジーボ（ニボルマブ）とキイトルーダ（ペムブロリズマブ）の軽鎖は、可変領域の３つのＣＤＲが異なる。それらの非ＣＤＲフレームワーク領域は、同じ生殖系列抗体を由来とする（図５）。
同様の状況は、数多くの抗体に見出された。ＦＤＡによって認可された再成形された抗体（ＣＤＲ移植抗体ともよばれる）の例として、抗原とのその特異性を保持し異種性を低減するために、マウス由来抗体のＣＤＲが直接的にヒト由来抗体のＣＤＲに置き換えられた。ヒト化技術および遺伝子工学技術が成熟し、のちに開発されたヒト化された抗体は、主にヒト化抗体またはヒト抗体であった。しかし、そうであっても、数多くの上市抗体の重鎖は、依然として非常に高度な類似性を示している。例えば、図６は、７つの上市抗体［図６の最初から最後の抗体に示される、アバスチン（ベバシズマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、テセントリク（アテゾリズマブ）、ヒュミラ（アダリムマブ）、ヤーボイ（イピリムマブ）、オプジーボ（ニボルマブ）、およびパージェタ（ペルツズマブ）］の重鎖の類似性について比較した結果を示すが、類似性は８５％以上である。それらは、互いに主にＣＤＲが異なっており、可変領域のそれらのフレームワーク領域は、類似配列を有する。そうであっても、テセントリク（アテゾリズマブ）およびハーセプチン（トラスツズマブ）のフレームワーク構造は一致する（図５）。免疫チェックポイント抗体であるオプジーボ、キイトルーダ、およびヤーボイ（図７にそれぞれ示される最初から最後の抗体）の軽鎖可変領域を比較したところ、それらの相同性が９２％であることを見出すことができた。主な違いはＣＤＲであり、それらのフレームワーク領域の配列は互いに近いものであった（図７）。
保存されたフレームワーク領域を有する抗体について、重鎖および軽鎖の可変領域のフレームワーク領域（非ＣＤＲ）に変異を有するそれらの変異体ならびにそれらのコンジュゲートの活性を試験した。表１８および表１９に示された各アミノ酸位置をシステインに変異し、結果として得られた各変異体をＳ９またはＳ１３にコンジュゲートした。異なる長さを有するＲ１－Ｒ４側鎖とのコンジュゲーションがＰＤ－１とのその結合活性に及ぼす効果を、ＥＬＩＳＡによって試験した。結果を表１８および表１９に示した。図８は、ＰＤ１ Ａｂ－Ｃ２８（ＰＤ１－Ａｂ－Ｇｌｙ２８Ｃｙｓ）とＳ１３とのコンジュゲーションを示し、図９は、Ｓ１３とのコンジュゲート前後の抗ＰＤ１－Ａｂ－Ｃ２８とＰＤ１との結合を示す。
抗体可変領域の非ＣＤＲ領域に変異を有する変異体の結合活性の分析では、変異を非ＣＤＲ内に導入した際に、および変異体を小さなコンジュゲート分子Ｓ９にコンジュゲートした際に、結合活性に有意な効果がなかったことが示された。しかし、変異体をＳ１３にコンジュゲートした際に、結合活性が低減された。これらより、非ＣＤＲ内のアミノ酸残基をシステインに変異できること、次いで、大きな分子量を有するかまたは変異体の結合活性を遮断するための特異的な官能基を担持するＲ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４に、変異体をコンジュゲートできることを示す。この方法を用いて、変異体の活性を阻害することができた。
軽鎖に２つ以上の変異を有する抗ＰＤ１抗体を調製し、Ｓ１３とコンジュゲートした。１つの変異を有しＰＤ１抗原との９５％以上の結合活性を有する上述の抗ＰＤ１抗体の変異部位から、変異部位を選択した。活性化後の上記コンジュゲートの活性を検証し、結果を表２０に示した。
上記の結果は、２つ以上の変異を有する抗ＰＤ１抗体のコンジュゲートが活性化後にＰＤ１との結合活性の９５％以上を保持することができたことを実証している。
実施例４：生体分子Ｒ５についてのスクリーニング、Ｒ１、Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４とのコンジュゲーション、およびコンジュゲーション後の活性化
病態の微小環境でタンパク質分解酵素により活性化される間、活性化されたリンカーアームが生体分子に結合する部位およびその立体配座は、活性化効率に異なる効果をもたらす。立体障害および構造－活性相関は、活性化による切断の効果を決定する。酵素または病態環境中の酸による活性化に及ぼされる、病態環境における実施例３のコンジュゲートの生体分子の立体配座の効果を検討するために、以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化の検討を実施した。
活性化試験では、活性化に用いる１０マイクログラムのタンパク質分解酵素を、１ｍｇ／ｍＬのＰｅｇ１０００－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－Ｃｙｓ－Ｒ５コンジュゲートに添加して、３７℃で１時間反応した。活性化後に生じた小化合物Ｐｅｇ１０００の濃度を、ＨＰＬＣによって検出し、対照群に対する活性化または切断の効率（％）を計算した。各コンジュゲートの切断効率を以下の表２１に示す。
表２２および表２３に示されるように、自動的に脱落したアームＲ３は、その小さな分子量と直鎖構造のために、レグマインの活性化に効果を実質的に及ぼさず、Ｒ３－２は最も低い効果を生じた。
表２２および表２３では、生体分子にコンジュゲートしていない分子によって生じた活性化効率を、陽性対照として使用したのに対して、複素環化合物パクリタキセルの２位のヒドロキシにコンジュゲートされた分子によって生じた活性化効率を、陰性対照として使用した。Ｒ４の長さおよび側鎖基は、抗体の可変領域内または非可変領域内の変異部位にコンジュゲートした際に、コンジュゲート全体の切断効率に影響を及ぼした。生じるＲ４の鎖構造が長いほど、切断効率が増強された。検出されたように、Ａｌａ－Ａｌａ－ＡｓｎまたはＡｌａ－Ａｌａ－Ａｓｐにコンジュゲートし、次いで抗体に結合した後に、本開示のＲ４－１からＲ４－２５は全て、＞６０％の活性化効率を、および酸感受性の活性化では＞９０％の活性化効率を、変異体が保持することを可能にした。
Ｒ１選択の効果および結合能の回復の試験
ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて、リガンド分子ＰＤ１、ＴＮＦα、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８を１ｕｇ／ｍＬにそれぞれ希釈した。次いで、各希釈溶液を用いて、９６ウェルプレート（ヌンク）に一晩固定した。１×ブロッキングＢＳＡ（サーモフィッシャー）を用いて、プレートを２時間ブロッキングした。抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、および抗ＣＤ２８抗体の対応のコンジュゲートをそれぞれ等濃度で添加して、３７℃で１時間結合させた。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰ酵素－コンジュゲートヒト抗体を二次抗体として３７℃で１時間反応させて、次いで、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰ酵素により認識されるＴＭＢ基質（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を用いて、暗所中、３７℃で１５分間反応した。１／２体積の停止溶液を使用して、反応を停止させた。吸光強度（ＯＤ４５０）を読み取った。相対結合効率を、活性化前後のコンジュゲートの結合効率と野生型抗体の結合効率とのパーセンテージ比により計算した。結果を表２４～表２６に示した。
この結果は、Ｒ１にコンジュゲートすることによって、抗ＰＤ－１抗体の活性が阻害されるが抗体の活性化に影響を及ぼさないことを示している。Ｒ１のないコンジュゲートの活性化前のその抗原との結合効率は、野生型抗体の抗原との結合の６７．４％であった。しかし、活性化後、コンジュゲートの結合効率は、野生型抗体の結合の１４３％に向上した。Ｒ１を同じＲ２－Ｒ３－Ｒ４および変異型抗体に結合した後、それは、結果として得られたコンジュゲートがその抗原に結合するのを防止した。そして、この結合の防止は、Ｒ１の分子量の増加に伴って増加した。Ｓ１７は、コンジュゲートがその抗原に結合するのを完全に防止することができた。しかし、結合活性は、レグマインによる切断後に回復した。
この結果は、Ｒ１にコンジュゲートすることによって、抗ＴＮＦα抗体の活性が阻害されるが抗体の活性化に影響を及ぼさないことを示している。Ｒ１のないコンジュゲートの活性化前のその抗原との結合効率は、野生型抗体の抗原との結合の５７．９％であった。しかし、活性化後、コンジュゲートの結合効率は、野生型抗体の結合の１２５．６３％に向上した。Ｒ１を同じＲ２－Ｒ３－Ｒ４および変異型抗体に結合した後、それは、結果として得られたコンジュゲートがその抗原に結合するのを防止した。そして、この結合の防止は、Ｒ１の分子量の増加に伴って増加した。Ｓ１８は、コンジュゲートがその抗原に結合するのを完全に防止することができた。しかし、結合活性は、レグマインによる切断後に回復した。
この結果は、Ｒ１にコンジュゲートすることによって、抗ＣＤ２８抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体の活性が阻害されるが、抗体の活性化に影響を及ぼさないことを示している。
実施例４から、コンジュゲートの活性化効率と回復後の抗原へのその結合能が、抗体の変異位置によってある程度影響されたことを見出すことができた。しかし、Ｒ４を使用すると、酵素的な切断による予想された活性化効率を生じることができら。生体分子とそのリガンドとの間の結合については、活性化による切断後に生じたＲ４の露出基は、抗体変異体の結合能を調節することができた。異なる露出基は、異なる変異位置に異なる効果を及ぼした。Ｒ１およびＤ４についてスクリーニングすることによって、Ｒ１の妨害機能が、コンジュゲートのその抗原との結合能の完全な欠失をもたらすことを見出すことができた。しかし、この結合能は、酵素による標的切断後に回復または増強さえされた。このようなコンジュゲート型抗体は、病態の微小環境において標的酵素が高発現または分泌されている領域でのみ活性化されて抗体またはタンパク質を放出する。そのため、このような微小環境活性化型抗体は、図１０に示されるような新しい標的活性化型抗体である。
実施例５：抗体が免疫指標に促進または阻害
１．抗ＰＤ－１抗体はＴ細胞がＩＦＮ－γを分泌することを促進した
ヒト全血（上海瑞金病院）を希釈し、等量のＰＢＳに均一に混合した。希釈溶液を、リンパ球分離溶液含む別の遠沈管へ、遠沈管の壁伝いにゆっくりと移して、希釈溶液がリンパ球分離溶液の上に分離層を形成するようにした。界面を明瞭に保った。管を２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離後、遠沈管を取り出した。管内の溶液は層を形成していた。単核細胞層を５０ｍＬ遠沈管に抜き取った。５倍容量のＰＢＳを添加して均一に混合し、混合物を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、沈殿をＰＢＳに再懸濁した。次いで、結果として得られた混合物を、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、結果として得られたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、５％加熱非働化ヒト血清を含有するＲＰＭＩ１６４０完全培地に再懸濁した。ヒトＰＢＭＣを９６ウェルプレートにウェル当たり１～２×１０５細胞個の濃度で播種した。細胞を０．１ｕｇ／ｍＬ ＳＥＢにより３日間刺激した。非接着細胞（主に単核細胞）を採集して、新しい９６ウェルプレートに均一に播種した。変異のない各種濃度の抗ＰＤ－１抗体またはＰＤ－１－Ａｂ－Ｃｙｓ２８－Ｓ－Ｓ１３コンジュゲートを添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４日間培養した。上清を採集し、細胞毒性因子ＩＦＮ－γの濃度をＥＬＩＳＡキットによって検出した。結果は、図１１に示されるように、活性化された抗ＰＤ－１抗体が、ＩＦＮ－γを分泌する活性を僅差でまたは顕著にさえ向上して呈することを示していた。
この結果は、抗ＰＤ－１抗体コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化後に、抗ＰＤ－１抗体のＴ細胞への刺激が回復できただけではなく、切断後に生じた残りの基が抗体１つまたは複数の新しい官能基を導入できたことを示している。結果として、活性化後に、ＰＤ－１－Ａｂ－Ｃｙｓ２８－Ｓ－Ｓ１３は、そのような活性化Ｔ細胞の活性を増強した。このようなコンジュゲート型抗体は、病態の微小環境において標的酵素が高発現または分泌されている領域でのみ活性化されて抗体またはタンパク質を放出する。そのため、このような微小環境活性化型抗体は、新しい標的活性化型抗体である。
２．抗ＰＤ－１抗体および抗ＣＤ２８抗体のコンジュゲートは、身体の自己免疫を低減する
当技術分野に周知されているように、抗ＰＤ－１抗体は腫瘍の治療に有効な薬剤であるにも関わらず、現在の臨床研究で、抗ＰＤ－１抗体が２つの主要な課題を呈することが見出された。一方の課題は、患者が抗体の投与後に高熱と偽増悪という副作用を呈するものとなることであるが、その機構は不明である。我々は、非疾患環境での曝露時間または活性薬剤の用量を低減するように、抗体をコンジュゲートによって阻害または遮断し、局所環境に達した後に放出すれば、これらの副作用が改善される可能性があるものと推定した。この理由から、Ｉ型糖尿病に罹患した（ＮＯＤ）マウスを用いて実験を実施した。この種類のマウスの糖尿病は自己免疫疾患であり、その場合、自己活性化されたＴリンパ球細胞が膵島β細胞を破壊し、その結果、インスリンの分泌が不十分となる。まず、１０週齢の雌ＮＯＤ（北京維通利華実験動物技術有限公司）に、対照ＩｇＧ、低容量（１ｍｐｋ）、培地（５ｍｐｋ）、または高用量（１５ｍｐｋ）の抗体または抗体のコンジュゲートをそれぞれ、０日目に注射した。尿中グルコースおよび２つの血糖レベルを含む糖尿病の指標を、尿グルコースの新しい指標が観察されなくなるまで、１２日間にわたって毎日観察した。
ＰＤ－１－Ａｂ－Ｃｙｓ２８－Ｓ－Ｓ１３コンジュゲートによる自己免疫からの保護を図１２に示し、ＣＤ２８－Ａｂ－Ｃｙｓ－Ｓ－Ｓ１３コンジュゲートによる自己免疫からの保護を図１３に示した。
結果は、抗ＰＤ－１抗体のコンジュゲートによる免疫系の保護が、抗ＰＤ－１抗体に比べて約１５倍増加し、抗ＣＤ２８抗体のコンジュゲートによる免疫系の保護が、抗ＣＤ２８抗体に比べて約１０倍増加したことを示している。そのため、連結部分を用いてタンパク質または抗体の活性を妨害または低減した場合、ヒドロラーゼおよび疾患の微小環境外の生理的環境に起因して、抗ＰＤ－１抗体および抗ＣＤ２８抗体を活性化し難かったことから、コンジュゲートされたタンパク質または抗体の正常組織の関連リガンドとの結合が低減されたことが分かった。結果として、コンジュゲートは、一次抗体に比べて自己免疫を低減することができた。
３．抗ＣＤ２８抗体のコンジュゲートは、ＣＤ４細胞またはＣＤ８細胞を特異的に活性化する
ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、ヒト末梢血単核細胞から、ＣＤ８またはＣＤ４の磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）を用いて、キットの仕様書に示された特定のステップに従って単離し、計数し、ＣＦＳＥ仕様書に従って染色した。細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１～２×１０５細胞個の濃度で播種した。適切な量の対照抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体、０．３ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体または抗ＣＤ２８抗体のコンジュゲートをそれぞれ添加した。
結果を図１４に示す。この結果によれば、元の抗ＣＤ２８抗体に比較すると、重鎖コンジュゲートＣＤ２８－Ａｂ－Ｇｌｙ４４Ｃｙｓ（ＣＤ２８－Ａｂ－Ｃｙｓ４４－Ｓ－Ｓ１３）は、ＣＤ４ Ｔ細胞を選択的に活性化することができ、軽鎖コンジュゲートＣＤ２８－Ａｂ－Ｓｅｒ５２Ｃｙｓ（ＣＤ２８－Ａｂ－Ｃｙｓ５２－Ｓ－Ｓ１３）は、ＣＤ８ Ｔ細胞を選択的に活性化することができた。この結果が示しているのは、連結部分を使用してタンパク質または抗体の活性を妨害または低減すると、ヒドロラーゼが疾患の微小環境では低いレベルで発現し、ヒドロラーゼが抗体またはタンパク質にコンジュゲートされた連結部分を活性化しにくいために、抗体またはタンパク質が標的組織に達する前では、連結部分にコンジュゲートされた抗体の正常組織における関連抗原との結合が低減されていることを示している。連結部分とコンジュゲートされた抗体が、炎症性の微小環境などの疾患の微小環境に達すると、コンジュゲートされた連結部分は、Ｔｒｅｇの表面に発現しているレグマインによって活性化され、それによって、Ｔｒｅｇの増殖が刺激され、炎症性の反応が阻害される。腫瘍領域では、コンジュゲートされた連結部分は、ＣＤ８細胞の表面に発現しているグランザイムＢによって活性化され、それによって、ＣＤ８細胞の増殖が刺激され、腫瘍の進展が阻害される。設計されたコンジュゲートは、微小環境でヒドロラーゼによって調節され、抗体の活性は、コンジュゲートされた連結部分が加水分解された後にのみ放出される。結果として、連結部分にコンジュゲートされた抗体を、微小環境で高く濃縮することができた。最終的には、全体の効果、すなわち、副作用の低減と有効性の向上とを達成することができた。
実施例６：微小環境で活性化された抗ＰＤ－１抗体は、ＭＣ３８腫瘍を治癒させることができた
ヒトＰＤ－１融合タンパク質を形質転換されたトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス（上海南方模式生物研究中心）に、ＭＣ３８細胞をマウス当たり濃度２×１０６細胞で皮下接種した。１週間後、ＭＣ３８腫瘍を移植されたマウスを無作為に４群に分けた。週２回、２週間にわたって、第１群には１０ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１抗体キイトルーダを注射し、第２群には２ｍｇ／ｋｇ抗ＰＤ－１抗体キイトルーダを注射し、第３群には１ｍｇ／ｋｇＰＤ－１－Ａｂ－Ｇ２８Ｃ－Ｓ１３コンジュゲートを注射し、第４群には溶媒対照を注射した。マウス内の腫瘍を週３回記録した。結果を図１５に示した。
ヒトＰＤ－１融合タンパク質を形質転換されたマウスはトランスジェニックマウスである。その内在性のＰＤＣＤ１遺伝子は、ヒトＰＤＣＤ１に置き換えられ、それによってヒトＰＤＣＤ１タンパク質が発現される。そのようなマウスは、ヒト抗ＰＤ－１抗体に応答し、下流免疫を刺激することができる。結果は、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体がＭＣ３８腫瘍の成長を効果的に阻害することができたことを示しており、１頭のマウスが治癒し、５匹のマウスが８０％以上という顕著な阻害活性を示した。１ｍｇ／ｋｇのＰＤ－１－Ａｂ－Ｇ４７Ｃ－Ｓ１３コンジュゲートは、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ－１抗体キイトルーダよりも良好な阻害効果を生じた。この結果は、抗ＰＤ－１抗体のコンジュゲートが、実施例５に証明されたように、エフェクターＴ細胞の活性と腫瘍微小環境における抗体の濃縮とを増強することができたことを実証している。このように、コンジュゲートは元の抗体よりも向上した有効性を呈する。
実施例７ａ：微小環境で活性化されるＩＬ２タンパク質
ＩＬ２のアミノ酸配列は、天然のヒトＩＬ２タンパク質である。そのＤＮＡ配列を、宿主における発現用に最適化して合成した（ジーンウィズ社、蘇州、中国）。合成されたＤＮＡを消化して改変型ｐＴＴ５ベクター（バイオベクター）にライゲーションし、ｐＴＴ５－ＩＬ２を作製した。ｐＴＴ５－ＩＬ２を鋳型として使用し、変異位置でコドンをシステインのものに置き換えるようにプライマーを設計し、変異された断片を改変型ｐＴＴ５ベクター内へとＰＣＲ、消化、および構築することによって、変異型ベクターを構築した。ＩＬ２遺伝子の合成、変異、およびトランスフェクションを、実施例２に記載された方法にしたがって実施した。リガンドＩＬ２ＲａまたはＩＬ２Ｒｂとのその結合活性を、変異位置にしたがってＩＰおよびＥＬＩＳＡにより解析した。
微小環境における巨大分子の活性化を立証することは、抗体に限定されないが、様々なタンパク質に適用可能であり、サイトカインＩＬ２を本明細書に一例として使用した。その変異位置、活性、リンカーアーム、ならびに活性化後の活性および機能をスクリーニングした。結果を以下の表２７～表２９に示す。
この結果から、天然のＩＬ２に比べてその対応の受容体との８０％以上の結合活性を保持していた変異体について、リンカーアームの長さを調節することによって、それらの受容体結活性を阻害または妨害できることを見出すことができた。例えば、Ｌｙｓ３２、Ｔｈｒ４１、Ａｌａ７３、またはＬｅｕ１９をＣｙｓに変異した後に、結果として得られた各変異体をＳ３にコンジュゲートすることによって、それらの対応の受容体との結合活性の６０％を阻害することがあるのに対し；Ｌｙｓ３５、Ｌｙｓ４３、Ｌｅｕ７２、Ｌｙｓ７６、Ｌｅｕ９４、Ｔｈｒ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ａｌａ１０８、Ｔｈｒ１１１、Ａｌａ１１２、Ｇｌｙ９８、Ｓｅｒ９９、Ｔｈｒ１３３などをＣｙｓに変異した後に、結果として得られた各変異体をＳ１３にコンジュゲートすることによって、それらの対応の受容体との結合活性の６０％以上を阻害することがある。
結果は、自動的に脱落するアームＲ３が小さな分子鎖状構造を有するために、レグマインによる活性化が影響を受けないことを示している。
このように、コンジュゲートの活性化効率および活性化後の受容体とのその結合能は、タンパク質の変異位置によってある程度影響を受けることが分かった。しかし、Ｒ４を使用すると、標的酵素切断により活性化効率を生じることができた。生体分子とそのリガンドとの間の結合について、活性化による切断後に生じたＲ４の露出基は、変異型抗体の結合能を調節することができた。異なる露出基は、異なる効果を異なる変異位置に及ぼした。Ｒ１およびＤ４についてスクリーニングすることによって、Ｒ１の妨害機能により、コンジュゲートのその抗原との結合能が完全に失われることを見出すことができた。しかし、この結合能は、標的酵素による切断後に回復または増強さえされた。このようなコンジュゲート型タンパク質は、病態の微小環境中の標的酵素を高発現または分泌する領域でのみ、その活性を活性化または放出される。ゆえに、このようなタンパク質は、新しい標的活性化タンパク質である。
２つ以上の変異を有するＩＬ２変異体を調製し、Ｓ１３にコンジュゲートした。１つの変異を有し受容体との９５％以上の結合活性を有する上述のＩＬ２変異体の変異部位から、変異部位を選択した。活性化後のそのようなコンジュゲートの活性を検証し、結果を表３０に示した。
上記の結果は、２つ以上の変異を含むＩＬ２変異体のコンジュゲートが、活性化後に対応の受容体との９５％以上の結合活性を保持することができたことを実証している。
ＩＬ２タンパク質のコンジュゲートは、特異的にＣＤ４細胞またはＣＤ８細胞を活性化する。
ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とを、キットの仕様書に示された具体的なステップに従って、ヒト末梢血単核細胞からＣＤ８またはＣＤ４の磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）により単離し、計数し、ＣＦＳＥの仕様書にしたがって染色した。細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１～２×１０５細胞個の濃度で播種した。適切な量の対照抗ＣＤ３抗体、０．０５ｕｇ／ｍｌのＩＬ２タンパク質またはＳ１６にコンジュゲートされたコンジュゲートＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ１６コンジュゲートをそれぞれ添加した。図１６は、Ｓ１６とのＩＬ２－Ｔ４１Ｃ（ＩＬ２－Ｔｈｒ４１Ｃｙｓ）のコンジュゲーションを示す。図１７は、コンジュゲーション前後のＩＬ２受容体アルファとの結合を示す。図１８は、活性化前後でＩＬ２－Ｃ４１－Ｓ１６コンジュゲーションがＴ細胞の増殖に及ぼす効果を示す。．
天然のＩＬ２は、ＣＤ８およびＣＤ４に対し類似した刺激を呈する。しかし、微小環境で活性化される機能性部分にコンジュゲートした後、ＩＬ２－Ｔｈｒ３７ＣｙｓおよびＩＬ２－Ｔｈｒ４１Ｃｙｓは、ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を特異的に活性化し、ＣＤ４細胞の増殖を低減することができた。ＣＤ８細胞とＣＤ４細胞との細胞数の比は、元の１：１から４１０：１および１５７：１にそれぞれ増加した。ＩＬ２－Ｌｅｕ１９ＣｙｓおよびＩＬ２－Ｓｅｒ８７Ｃｙｓは、ＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を特異的に活性化することができ、ＣＤ４／ＣＤ８の細胞比は、４３５：１および１２６：１にそれぞれ増加した。結果を図１９に示す。この結果は、ＩＬ２を機能性部分にコンジュゲートしてその各受容体との結合活性を制御し、特異的な微小環境でそれを活性化することを可能にすることによって、ＣＤ８またはＣＤ４を選択的に活性化できたことを実証している。
ＩＬ２タンパク質のコンジュゲートは、メラノーマＢ１６Ｆ１０および結腸がんＭＣ３８の成長を効果的に阻害する。
マウス当たり０．５×１０６個のＢ１６Ｆ１０細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種した。１週間後、腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した際に、メラノーマを移植したマウスを無作為に４群に分けて群当たりマウス６頭とした。第１群には、毎週、２．５ｍｇ／ｋｇのＩＬ２－Ｔ３７Ｃ－Ｓ１４タンパク質コンジュゲートを注射した。第２群には、毎週、０．５ｍｇ／ｋｇのＩＬ２－Ｔｈｒ３７Ｃｙｓタンパク質コンジュゲートを注射した。第３群には、週２回、３ｍｇ／ｋｇのアルデスロイキン（対照）を注射した。第４群には、週２回、溶媒（対照）を注射した。全群に、３週間にわたって継続的に投与した。マウスの腫瘍を週２回測定し、マウスを週２回秤量した。
ヒトＰＤ－１融合タンパク質に形質転換されたトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＭＣ３８細胞をマウス当たり０．５×１０６細胞個の濃度で皮下接種した。１週間後、ＭＣ３８腫瘍を移植したマウスを無作為に４群に分けた。第１群には、２ｍｇ／ｋｇのＩＬ２－Ｔ３７Ｃ－Ｓ１４タンパク質コンジュゲートを注射した。第２群には、週２回、０．５ｍｇ／ｋｇのＩＬ２－Ｔｈｒ３７Ｃｙｓコンジュゲートと毎回１００μｇの抗ＰＤ－１抗体とを注射した。第３群には、週２回、３ｍｇ／ｋｇのアルデスロイキン（対照）を注射した。第４群には、週２回、溶媒（対照）を注射した。全群に、３週間にわたって継続的に投与した。マウスの腫瘍を週２回測定し、マウスを週２回秤量した。
結果を図２０および図２１に示すが、これらは、ＩＬ２－Ｔｈｒ３７Ｃｙｓコンジュゲートが、既存のＩＬ２製品であるアルデスロイキンに比べて、使用用量を低減して使用できただけでなく、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を治療する効果を顕著に増強できたことを実証している。そして、抗ＰＤ－１抗体との併用治療群では、治癒しているＭＣ３８マウスがあった。
上記の結果から、機能性部分を用いてタンパク質または抗体の活性を妨害または低減した場合、ヒドロラーゼおよび疾患の微小環境外の生理的環境によって、タンパク質にコンジュゲートされた機能性部分を活性化し難いことから、正常組織におけるタンパク質のその受容体またはリガンドとの結合を、標的組織に達する前に低減できたことを見出すことができた。しかし、疾患の微小環境では、ＩＬ２－Ｔｈｒ３７ＣｙｓおよびＩＬ２－Ｔｈｒ４１Ｃｙｓなどは、疾患の微小環境のヒドロラーゼによる影響を受け、グランザイムＢを高発現するＣＤ８細胞の表面で活性化され、それによって、ＣＤ８細胞の表面で受容体に結合し、ＣＤ８細胞を活性化した。結果として、機能性部分を有するタンパク質コンジュゲートは、標的とされた有効性を増強するとともに、免疫毒性を低減することができた。
同じ理由により、ＩＬ２－Ｌｅｕ１９ＣｙｓおよびＩＬ２－Ｓｅｒ８７Ｃｙｓを、レグマインを高発現するＴｒｅｇ細胞の表面で活性化し、活性化されたＩＬ２をＴｒｅｇ細胞の表面の受容体に結合させてＴｒｅｇ細胞の増殖を活性化させることが可能となった。
実施例７ｂ：腫瘍微小環境により活性化されるＩＬ２サイトカイン（ＩＬ２ＴＭＥＡｋｉｎｅ）
１．変異体ＩＬ２サイトカインの発現および精製
改変型ｐＴＴ５ベクター（バイオベクター）にライゲーションされた変異体ＩＬ２のＤＮＡ配列は、２９３Ｔ細胞での発現のために最適化し合成（ジーンウィズ社、蘇州、中国）したものである。変異体ＩＬ２のＤＮＡのトランスフェクションを実施した。４～７日間のインキュベーションの後、変異体ＩＬ２を含有する上清を採集した。
真核生物による発現では、変異体ＩＬ２遺伝子を含む発現ベクターｐＰＩＣＺα Ａを最適化し調製（ジーンウィズ社、蘇州、中国）した。野生型ＩＬ２のアミノ酸配列を下記に記載した。
ＡＰＡＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１１）。
発現ベクターｐＰＩＣＺα Ａを、プラスミド精製のために大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換した。次いで、ｐＰＩＣＺα Ａを、エレクトロポレーションによってＧＳ１１５に形質転換した。１００、３００、５００、１０００、１５００、２０００ｕｇ／ｍＬのゼオシン（商標）含有ＹＰＤプレート上で成長させた後に成長していたコロニーを得ることによって、形質転換されたコロニーを選択した。形質転換体を最終的に選択した後、組換えＧＳ１１５株を、バッフルフラスコにて激しい攪拌により、ＢＭＧＹ培地中３０℃で成長させてＯＤ６００値２～６とした。次いで、細胞を遠心分離によりペレットとし、ＢＭＭＹに再懸濁してＯＤ６００値１とし、異種タンパク質発現を誘導するために０．５％メタノールを毎日添加した。４日間の誘導後、分泌された変異体ＩＬ２タンパク質を含有する上清を、遠心分離により採集した。上清中の総タンパク質を、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜を用いて限外濾過により濃縮した。濃縮されたタンパク質を、緩衝液Ａ（５０ｍＭＨＡｃ／ＮａＡｃ，ｐＨ４．５）により２４時間超にわたって透析し、次いで、緩衝液Ａにより平衡化された陽イオン交換カラムにロードした。変異体ＩＬ２を、勾配濃度のＮａＣｌによりカラムから溶出し、溶出物を採集し濃縮した。濃縮された試料を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ ＨＲゲル濾過カラムにて、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を溶出緩衝液として用いてさらに精製した。
原核生物による発現では、変異体ＩＬ２遺伝子を含有する発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を、最適化し調製（ジーンウィズ社、蘇州、中国）した。野生型ＩＬ２のアミノ酸配列は、配列番号１２に記載されている。陽性クローンを大腸菌細胞（ＢＬ２１ＤＥ３）にて選択し形質転換した。イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いた標的タンパク質の誘導のための標準的な手順は、以下の通りとした。誘導された大腸菌細胞を遠心分離し、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＰＭＳＦを含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に細胞ペレットを再懸濁した。細胞を超音波処理により溶解し、遠心分離してＩＬ２タンパク質封入体（ＩＢ）を単離した。次いで、ＩＢペレットを、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび２％デオキシコール酸塩を含有する１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、ならびに蒸留水でそれぞれ洗浄した。ＩＢを６Ｍ塩化グアニジウム（ＧｕＨＣｌ）溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０中に調製）に可溶化し、穏やかなボルテックスにより室温で３０分間インキュベートした後、遠心分離した。上清をリフォールディング緩衝液（１０ｍＭ還元および１ｍＭ酸化グルタチオンを比１０：１で含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．０）により希釈し、タンパク質濃度およびＧｕＨＣｌをそれぞれ０．１ｍｇ／ｍＬおよび２Ｍで得るようにした。続いて、ＩＬ２をゆっくりリフォールディングさせるために、溶液を室温で１６時間保った。不溶性タンパク質を遠心分離によって除去した。上清を濃縮し、２Ｍ ＧｕＨＣｌを含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液により平衡化されたゲル濾過カラムＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ＨＲにロードした。
形質転換体によって生産される野生型ＩＬ２のアミノ酸配列を下記に示す。
ＰＴＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号１２）。
２．変異後のＩＬ２ＲαまたはＩＬ２Ｒβとの結合活性についての変異体のスクリーニング
様々なＩＬ２変異体を、２９３Ｔ細胞によって発現し、培地．に分泌させた。ＩＬ２変異体を含有する上清を、第１節に記載されたように遠心分離を介して取得した。次いで、１ｕｇのＨｉｓタグ付ＩＬ２ＲαまたはＩＬ２Ｒβを、上述の１ｍＬの上清に添加し、穏やかに振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。５０ｕＬの予洗浄済みＮｉ－ＮＴＡレジンを、上清とＩＬ２ＲαまたはＩＬ２Ｒβとの混合溶液に移し、穏やかに振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。混合物を、遠心分離に供し、上清を廃棄した。結果として得られたペレットを、２５ｍＭイミダゾールを含有する５００ｕＬのＰＢＳで３回洗浄した。ＩＬ２変異体とＩＬ２Ｒα／Ｒβとの量を、ＩＬ２抗体および抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより可視化した。
３．変異体ＩＬ２へのＳ４７のコンジュゲーション
変異体ＩＬ２タンパク質を、上記第１節に記載されたように生成して精製した。精製された変異体ＩＬ２を、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、濃度０．３ｍｇ／ｍＬでインキュベートした。ＴＣＥＰ溶液を変異体ＩＬ２にモル比１００：１で添加し、結果として得られた混合物を、穏やかに振盪しながら４℃で４時間インキュベートした。次いで、混合物を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）により、４℃で２時間透析した。その後、Ｓ４７を直ちに混合物にモル比２０：１で添加し、結果として得られた混合物を、穏やかに振盪しながら２５℃で１６時間インキュベートした。反応を停止し、残存するＳ４７を除去した。酵素切断の前に、ＩＬ２－Ｓ４７（ＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅ、腫瘍の微小環境により活性化されるＩＬ２サイトカイン）のコンジュゲートに使用された緩衝液を、酵素に使用された緩衝液に、透析を介して変換した。次いで、酵素をＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅ溶液に添加し、混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。図２２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素切断後の変異体ＩＬ２、ＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅ、および回復活性ＩＬ２についてのコロイダルブルー染色による、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。
４．ＩＬ２ＲαまたはＩＬ２Ｒβとの結合を遮断し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素切断後に結合活性を回復するＩＬ２ＴＭＥＡｋｉｎｅのスクリーニング
１ｕｇのＩＬ２Ｒα－Ｆｃ／ＩＬ２Ｒβ－Ｆｃ溶液を含有する６０ｕＬのＰＢＳ緩衝液を、ウェルに分注した。シールテープをプレートの上部に貼り、次いで、プレートを４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、テープを取り外して、各ウェルを吸引した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、２％ＢＳＡを含有する２００ｕＬのＰＢＳ緩衝液を各ウェルに分注することによってプレートをブロッキングし、次いで、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、６０ｕＬの系列希釈された試料を適切なウェルに添加した。プレートを室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、６０ｕＬの１ｕｇ／ｍＬ ＩＬ２ビオチン化抗体溶液を各ウェルに分注し、結果として得られた混合物を室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、次いで、６０ｕＬのストレプトアビジン溶液を各ウェルに分注した。次いで、プレートを室温で３０分間インキュベートした。３回洗浄した後、１００ｕｌのＨＲＰ基質溶液を各ウェルに分注し、プレートを３７℃で１５分間インキュベートした。発色を展開させた後、５０ｕＬの停止溶液を各ウェルに分注し、各ウェルの吸光度を直ちに波長４５０ｎｍで測定した。ＥＬＩＳＡの結果を図２３に示すが、ここでは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素切断前後のＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅのＩＬ２ＲαまたはＲβとの結合活性が示されている。野生型ＩＬ２とＩＬ２ＲαおよびＩＬ２Ｒβとの結合活性に比べて、ＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅは、ＩＬ２Ｒαにははるかに低い結合親和性で結合するが、ＩＬ２Ｒβにはほぼ同じ結合親和性で結合する。酵素による活性化後、ＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅのＩＬ２Ｒαとの結合親和性は、野生型ＩＬ２のＩＬ２Ｒαとのものに等しい。
５．様々なＩＬ２変異部位の概要
ＩＬ２受容体は、細胞表面で会合して以下のヘテロマーを形成する：中位親和性の受容体：ＩＬ２に対するＩＬ２Ｒβγ（Ｋｄ＝１ｎＭ）および低親和性の受容体：ＩＬ２に対するＩＬ２Ｒα（Ｋｄ＝１０ｎＭ）。低親和性の結合（Ｋｄ＝１０ｎＭ）ゆえに、結合親和性を回復するためのＲ４基に連結するのに用いる位置をスクリーニングするのは、抗体のＣＤＲ領域よりも容易である。我々は、Ｒ４－Ｓ－ＩＬ２とＩＬ２Ｒαとの間の結合親和性を増加させようとは思わなかったため、天然の結合親和性を回復することのできる、特別なＲ４を有するコンジュゲートＩＬ２を選択した。場合によっては、結合親和性を増強することのできるＲ４基がいくつかあるが、我々はそれらを薬剤候補として選択しなかった。我々は、Ｒ－１、Ｒ４－７、Ｒ４－５、Ｒ４－８、およびＲ４－１２を、我々のＣＭＣ開発における大規模合成用に選んだ。Ｓ４７はレグマインにより切断される。切断後、そのＲ４－７化学基は残される。薬剤候補を選択するために、我々はまた、スクリーニング発現と、ＩＬ２ＲαおよびＩＬ２Ｒβを結合するドメイン内のＩＬ２の全アミノ酸とのＳ４７のコンジュゲーション反応を実施した。我々は、将来性のある薬剤候補を取得したので、結果を以下の表３１～表３３に示す。
この結果は、２つ以上の変異部位を有するＩＬ２変異体のコンジュゲートが、活性化前後で９５％以上の対応の受容体との結合活性を保持できたことを実証している。
スクリーニング発現、結合活性、コンジュゲーション、切断，回復、および機能性アッセイの後、我々は、表３３に示されるように、１つまたは複数の安定な変異をＲαとの結合ドメイン上に、１つのコンジュゲーションをＲβとの結合ドメイン上に有する、薬剤候補を取得した。具体的には、Ｒαに結合するドメイン上の安定な変異部位は、Ａｒｇ３８およびＧｌｕ６１であり、そこでは、Ａｒｇ３８をＡｓｐに変異し、Ｇｌｕ６１をＡｒｇに変異し、それらはＩＬ２とＩＬ２Ｒαとの結合活性に影響を及ぼした。そのため、これらのコンジュゲーションは、腫瘍の微小環境で切断された後、Ｒαとの結合ドメイン上で、安定な変異体を放出する。
この結果は、Ｒ４のコンジュゲーションのライブラリースクリーニングおよび変異を用いると、Ｒαとの結合が２００倍に減少しＲβとの結合が１．３５倍に増加した新しい化学修飾ＩＬ２を得たことを実証している。
６．ヒト血清中での安定性
ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７溶液とヒト血清とを比１：１９（ｖ／ｖ）で混合し、混合物を３７℃で０時間、８時間、２４時間、および４８時間、それぞれインキュベートした。次いで、ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７の量をウェスタンブロットによって検出し、対応の結果を図２４に示した。ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７は、４８時間後にヒト血清中で安定であり、このことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト血清中で、ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７がＩＬ２よりもはるかに安定であった可能性があることを示している。ＩＬ２変異体の他のコンジュゲートのヒト血清中での安定性を表３５に示した。
７．マウスにおける薬物動態
マウスは、単回のＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７（０．８ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受け、サンプリング時間当たりマウスｎ＝３頭となるものとした。およそ２００ｕＬの血液をＫ２ＥＤＴＡ被覆チューブに採集した。遠心分離後に血漿を分離し、分析まで－８０℃で凍結した。次いで、定量ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７濃度を測定した。結果を図２５に示した。ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態試験は、ＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅがＩＬ２に比べて半減期が長く血漿中曝露が高いことを示していた。
８． 毒性
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、５日間にわたってＰＢＳもしくは２５ｕｇのＩＬ２の腹腔内注射を毎日、または等モルのＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７の腹腔内注射を５用量について５日毎に、それぞれ受けるものとした。マウスを屠殺し、肺を１０％ホルマリン溶液により固定し、パラフィン包埋された切片をヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。その結果を図２６に示す。肺の測量（湿重量）ならびにヘマトキシリンおよびエオシンにより染色された切片は、ＩＬ２ ＴＭＥＡｋｉｎｅが野生型ＩＬ２よりも低い毒性を肺に誘導することを示している。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＰＢＳ、２５ｕｇのＩＬ２－Ｔ４１Ｃ／Ｓ８７Ｃ－Ｓ４７、および等モルのＩＬ２－Ｒ３８Ｄ／Ｅ６１Ｒ／Ｓ８７Ｃ－Ｓ４７の腹腔内注射を、５用量について５日毎にそれぞれ受けるものとした。マウスを屠殺し、肺を１０％ホルマリン溶液により固定し、パラフィン包埋された切片をヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。その結果を図２７に示す。肺の測量は、ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ／Ｓ８７Ｃ－Ｓ４７およびＩＬ２－Ｒ３８Ｄ／Ｅ６１Ｒ／Ｓ８７Ｃ－Ｓ４７が毒性を肺にほぼ誘導しないことを示している。
９．ＢＡＬＢ／ＣマウスモデルにおいてＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７およびＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７の抗ＰＤ－１抗体との併用がＣＴ２６腫瘍モデルに及ぼす有効性の試験
試験目的：ＣＴ２６腫瘍モデルの治療のためのＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７およびＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７の抗ＰＤ－１抗体との併用の抗腫瘍の有効性を検討する。
試験薬剤：ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７、抗ＰＤ－１抗体、およびＩＬ２の注射剤であり、試験時にＰＢＳによって対応の濃度に希釈。
方法および結果：
１．動物：５週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス、全て雌。
２．腫瘍モデルの作製
１）ＣＴ２６細胞をアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入し、ＡＴＣＣにより提供された仕様書に従って識別した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培養溶液中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞を３日毎に継代し、９継代以内の細胞を使用した。
２）腫瘍モデルの作製。ＣＴ２６細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウスの背中に皮下注射した。腫瘍が約１００～２００ｍｍ３に成長した後、マウスを無作為に群分けし、薬剤治療を開始した。マウスを３１日目で麻酔後に殺した。
３）治療過程
各群に６頭の動物を含む５つの群があった。含めたのは、０日目、５日目、および１１日目に治療された対照群、ならびに３つの単剤群（抗ＰＤ－１抗体により２日目、４日目、７日目、９日目、１３日目、および１５日目に、またはＩＬ２により０日目、５日目、１１日目に、またはＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７により０日目、５日目、および１１日目に治療）、ならびにＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７治療（０日目、５日目、および１１日目に投与）が開始された後に抗ＰＤ－１抗体治療（２日目、４日目、７日目、９日目、１３日目、および１５日目に投与）を行った併用免疫療法群であった。
４）群分けおよび試験結果を表３６に示す。
腫瘍体積を週に２～３回モニタリングし、図２８に提示した。
５）結果および考察。表３６に示されるように、ＢＡＬＢ／ＣマウスのＣＴ２６腫瘍に及ぼされる退縮が、ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７の抗ＰＤ－１抗体との併用での注射後に大きく向上し、このことは、ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７の抗ＰＤ－１抗体との併用が、優れた抗腫瘍有効性をＣＴ２６腫瘍モデルに呈することを示している。
１０．腫瘍、肺、および心臓におけるＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７由来の活性ＩＬ２の体内分布
ＢＡＬＢ／Ｃマウスに対し、ＣＴ２６細胞を右側腹部に皮下移植した。移植後７日目に、腫瘍が２００ｍｍ３と測定された際に、動物にＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７（２ｍｇ／ｋｇ×１）を投与した。２４時間、４８時間、９６時間、および１９２時間後、腫瘍、肺、および心臓を採取して（観察時間当たりｎ＝２）、プロテアーゼ阻害剤および０．２５％酢酸を含有する氷冷ＰＢＳ中でホモジナイズし、遠心分離して上清を得た。ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７レベルを定量するためにＥＬＩＳＡを実施し、その際には、ＰＥＧ抗体を捕捉抗体として使用し、ＩＬ２ビオチン化抗体を検出抗体として使用した。ＩＬ２－Ｔ４１Ｃ－Ｓ４７および活性ＩＬ２レベルを定量するためにＥＬＩＳＡを実施し、その際には、ＩＬ２モノクローナル抗体を捕捉抗体として使用し、ＩＬ２ビオチン化抗体を検出抗体として使用した。結果を図２９に示したが、ここでは、腫瘍における活性ＩＬ２の曝露が高いことが標示されており、このことは、肺および心臓において抗腫瘍効果の有効性が高く活性ＩＬ２の曝露が低いことに一致し、これは肺水腫の毒性が低いことに一致する。
実施例８：高い活性化効率を得るための化学修飾リンカーの選択
Ｒ２－Ｒ３は、天然のペプチド配列リンカーに比べて高い活性化効率を示す、化学修飾リンカーである。Ｒ１が５ｋＤａのＰＥＧでありＲ４がＲ４－２および対照リンカー（表に示されるＣ１－Ｃ４）である各種Ｒ２－Ｒ３リンカーの活性化を、活性化アッセイで評価した。Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４コンジュゲートを溶解し、１０回希釈して終濃度０．１ｍＭ／ｍＬとした。３７℃で、試験化合物を１００μｇの酸性化ヒト乳房がん（ＭＤＡ－ＭＢ４３５）腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ６．０）に濃度１ｍｇ／ｍＬで添加した。腫瘍組織ホモジネート中の酵素は、Ｒ１を放出することができた。放出されたＲ１をＨＰＬＣにより検出し、それによって、リンカーの活性化効率を比較した。結果を表３７～表３９に示した。
ＭＤＡ－ＭＢ４３５腫瘍組織は、高い活性のレグマイン、グランザイムＢ、およびＭＭＰ２または他のプロテアーゼを呈する。アッセイでは、ＡＡＮ－Ｒ３－５、ＡＡＮ－Ｒ３－６、ＡＡＤ－Ｒ３－５、ＡＡＤ－Ｒ３－６、ＡＡＤ－３－７、およびＡＡＤ－Ｒ３－８は、比較的高い活性化効率（＞８０％）を有することが証明された。Ｒ２が不在である際に、Ｒ３－５は、ｐＨ６．０で安定であり、Ｒ３－２、Ｒ３－４、およびＲ３－６は、酸性（ｐＨ６．０）により活性化される、比較的高い活性化効率（＞６０％）を有するリンカーである。
実施例９：異なる腫瘍の微小環境における標的化された活性化を行うための異なる活性化可能なリンカーの活性化効率
Ｒ１を５ｋＤａのＰＥＧとし、かつＲ４をＲ４－２とした６つのＲ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４コンジュゲートを、各種ヒト腫瘍組織で検出した。Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４コンジュゲートをそれぞれ溶解し、１０回希釈して終濃度０．１ｍＭ／ｍＬとした。３７℃で、試験化合物を１００μｇの各種酸性化ヒト腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ６．０）に濃度１ｍｇ／ｍＬで添加した。腫瘍組織ホモジネート中の酵素は、Ｒ１を放出することができた。放出されたＲ１をＨＰＬＣにより検出し、それによって、リンカーの活性化効率を比較した。結果を表４０に示した。
実施例１０：化学修飾リンカーは、腫瘍組織プロテアーゼにより活性化された際に、各種生体分子に対し立体障害を示さない
Ｒ４－１は、例示されたＲ４基のうち最も短い化学基である。各種生体分子を、Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４にコンジュゲートし、ここでは、Ｒ１を５ｋＤａのＰＥＧとし、Ｒ２－Ｒ３を以下の表に示されるものとし、Ｒ４をＲ４－１とした。コンジュゲートを溶解し、１０回希釈して終濃度０．１ｍＭ／ｍＬとした。３７℃で、コンジュゲートをそれぞれ、１００μｇの各種酸性化ヒト腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ６．０）に濃度１ｍｇ／ｍＬで添加するか、またはレグマイン溶液（０．１ｕｇ／ｍｌ）もしくはグランザイムＢ溶液（０．１ｕｇ／ｍｌ）に添加した。腫瘍組織ホモジネート中の酵素は、Ｒ１を放出することができた。放出されたＲ１をＨＰＬＣにより検出し、それによって、リンカーの活性化効率を比較した。結果を表４１に示した。
この結果は、Ｒ２の切断部位が生体分子（Ｒ５）から遠いことを実証している。最も短いＲ４－１を用いてさえ、Ｒ２の切断は生体分子による影響を及ぼされず、活性化効率は影響を及ぼされなかった。
実施例１１：ヒト血清における化学修飾リンカーの安定性
化学修飾リンカーＲ２－Ｒ３の安定性を、ヒト血清中で試験した。Ｒ１を５ｋＤａのＰＥＧ（ＰＥＧ５００）とし、Ｒ２－Ｒ３を以下の表に示されたものとし、Ｒ４をＲ４－１とした、Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４コンジュゲートを調製した。このコンジュゲートを溶解し、１０回希釈して終濃度０．１ｍＭ／ｍＬとした。コンジュゲートを濃度１ｍｇ／ｍＬで、１００μｇのヒト血清に、３７℃で４８時間、それぞれ添加した。無傷のコンジュゲートは、ＥＬＩＳＡアッセイによって検出することができる。残存するコンジュゲートの濃度を比較することによって、安定性を計算することができた。結果を表４２および表４３に示した。
実施例１２：抗体／Ｓ１３リンカーの増加に伴うコンジュゲーション効率の増加
小規模のコンジュゲーションのために、各種バリアントについて５～１０ｍｇのＩｇＧを、限外濾過チューブ（メルクミリポア）により、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５へと、遠心分離の繰り返しによって緩衝液交換した。次いで、抗体を、ＤＴＴによりモル比１：２０～１：２００にて、室温で４～１６時間、穏やかに還元した。次いで、還元された抗体を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５内に透析し、Ｃｕ２ＳＯ４ｏｒデヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ，Ｓｉｇｍａ）によりモル比１：５０～１：２００にて、室温で１～３時間、再酸化した。次いで、フリーのスルフヒドリルを有する再酸化された抗体を、Ｓ１３化学リンカーにより比１：１０、１：２０、１：５０、または１：１００にて、室温で４時間、コンジュゲートした。コンジュゲーション効率を還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示した。表４４に示されるように、異なるコンジュゲーション効率を得た。
ＣＴＬＡ４－抗体の異なる位置におけるＣｙｓ変異によるＣＴＬＡ４－抗体（イピリムマブ、配列番号１４）：Ｓ１３リンカー＝１：１００条件のコンジュゲーション反応の際の、変異体部位を表４５に示した。ＣＴＬＡ４－抗体：Ｓ１３＝１：１００の条件では、図３０の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに示されるように、５つ位置全てが高い効率でＳ１３リンカーにコンジュゲートされる。
実施例１３：ヒトＣＴＬＡ－抗体の可変領域のフレームワーク（非ＣＤＲ）のコンジュゲーション効率および親和性の変化
我々は、ＣＴＬＡ－４抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）内で各非システインアミノ酸をシステインに変異して、実験に用いるシステイン変異体を作出した。いくつかの変異部位は、ほぼ１００％のコンジュゲーション効率を示した。各種変異体についてのコンジュゲーション効率は、ＣＴＬＡ４－抗体：Ｓ１３＝１：１００の条件では高く、これを表４６および表４７にまとめた。いくつかの変異は、非常に低いコンジュゲーションを示し、このことは、Ｃｙｓが抗体の内部に埋もれている可能性が有ることを示す。
Ｓ１３の高いコンジュゲーション効率（＞８０％）を有する変異体部位を、Ｒ４－７にコンジュゲートし、ＥＣ５０比（ＷＴ抗体のＥＣ５０：変異体抗体－Ｒ４－７のＥＣ５０＊１００％）として、ＥＬＩＳＡベースアッセイで相対結合活性について試験した。具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ヌンク）を１ｕｇ／ｍＬのＨｉｓ－ＣＴＬＡ－４タンパク質（シノバイオロジカル）で一晩被覆し、次いで、１％ＢＳＡブロッカー（サーモフィッシャー）により３７℃で２時間ブロッキングして、ＰＢＳＴにより３回洗浄した。Ｒ４－７コンジュゲーションを有する対応する抗体または対応する変異体を添加して、３７℃で１時間結合させて、次いで、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＨＲＰ酵素－コンジュゲート抗ヒトＩｇＧを添加し、３７℃で１時間結合させ、次いで、ＰＢＳＴで３回洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を用いて、吸光度を４５０ｎｍで検出した。データ解析をＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアにより実施し、各抗体またはコンジュゲートについてＥＣ５０を計算した。
ＦＲ領域中のＲ４－７－ｓ－ｃｙｓ－ＣＴＬＡ－４とＣＴＬＡ－４のＷＴ抗体の結合親和性を比較した後、表４８および表４９に示されるように、殆どの位置が結合親和性を維持する上で良好な効果を達成した（Ａ群、ＷＴ抗体に比べて＞６０％）のに対し、いくつかの位置は低い結合親和性呈した（Ｂ群、ＷＴ抗体に比べて＜６０％）ことを我々は見出した。
結合活性＜６０％（上記の表のクラスＢ）を有するこれらの部位について、我々は、それらを異なる化学リンカーにコンジュゲートして、結合活性をレスキューした。表５０に示されるように、それらのうちのいくつかについては、Ｒ４の特定の化学修飾を用いて、結合活性を復活させることができる。これらの結果は、これらの部位の側鎖が抗体／抗原相互作用に寄与する可能性があり、特定の化学リンカーが軽鎖構造を模倣し、天然のＷＴアミノ酸のような抗原に対する分子相互作用をもたらすことができることを示している。
Ｓ１３（５ｋＤの官能基）またはＳ４７（４０ｋＤの官能基）の化学リンカーにコンジュゲートされた際の選択された部位の遮断効果
我々は、Ｒ４－７または他のＲ４リンカーにコンジュゲートした後に活性を復活させることができた上記の部位を、腫瘍の微小環境で活性化される抗体（ＴＭＥＡｂｏｄｙ）のスクリーニングに用いる候補部位として選択したが、それはなぜなら、プロテアーゼ切断後、このコンジュゲート抗体が、抗体変異体－ｓ－Ｒ４形態と同一の構造に留まるものとなるためである。Ｓ１３（５ｋＤの官能基）にコンジュゲートされた後の遮断効果を、まず、実施例１のようなＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。表５１に示されるように、Ｓ１３リンカーとのコンジュゲーション後、それらのいくつかは、抗原タンパク質に対する結合活性の顕著な遮断効果を示した。我々はまた、表５１に示されるように、＜３０％活性を有するこれらの部位をクラスＡとして、他の部位をＢクラスとして分類した。
我々はさらに、より分子量の高い官能基を用いて遮断効率を向上できるか否かを検討した。Ｓ４７（４０ｋＤの官能基を含む）およびＳ６４（８０ｋＤの官能基を含む）をコンジュゲーションのために使用し、遮断効率を上記の方法により結合ＥＬＩＳＡアッセイにて測定した。結果を表５２にまとめたが、ここでは、分子量の増加によって、結合活性の遮断効率を顕著に向上できることが示されている。全ての部位は、Ｓ６４（８０ｋＤ）官能基にコンジュゲートされた際に＜３０％の活性を示した。
ヒトＣＴＬＡ－４抗体およびＰＤ－１抗体の可変領域のフレームワーク（非ＣＤＲ）におけるＲ４ライブラリーによるＲ４修飾抗体の結合親和性の向上
フレームワーク（非ＣＤＲ）領域は、保存された配列であり、ＣＤＲ領域に連結して異なる抗体を形成するのに用いられている。表５１および表５２に示されるように、いくつかのアミノ酸の側鎖が変わると結合が低減し（クラスＢ）、このことは、アミノ酸の側鎖が相互作用または空間をもたらして、ＣＤＲと共に抗原結合性の一助となりうることを示す。通常は、フレームワークと抗原との相互作用は、ＣＤＲ領域と抗原とのものよりも弱い。ＰＤ－１抗体（ニボルマブ）の選択された変異位置に異なるＲ４をコンジュゲートすることによって、我々は、野生型抗体に比べて、より高い親和性を得るかまたは化学修飾抗体の親和性を維持する機会がある。
この結果は、異なる抗体のＦＲ領域において、各種Ｒ４を保存された部位にコンジュゲートすることによって、結合活性を調整できることを示す。代表としてＧｌｙ４１では、Ｒ４－１とのコンジュゲーションによって、それは結合親和性の６２．６％を回復する機会がある。保存されたＶＨのＧｌｎ３、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｕ４６、Ｔｈｒ６８、Ａｓｐ７２、およびフレームワークのＴｈｒ５、Ｔｙｒ４９、Ａｒｇ６１、Ｓｅｒ６３、Ｓｅｒ６５、Ｓｅｒ６７、Ｔｈｒ７２、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７６、Ａｓｐ８２では、より高い親和性の結合コンジュゲーションをスクリーニングにより選出することができた。フレームワーク配列（ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３）は、全ての種類のヒト抗体で保存されており、ＦＲ領域のこれらの保存された部位に各種Ｒ４をコンジュゲートすることによって、任意の抗体が、結合親和性を維持するかまたは増加させる機会がある。
ヒト生殖系列抗体可変領域のフレームワーク（非ＣＤＲ）中の相同性の高い配列における変異体の結合活性の解析
ヒト抗体は、２本の同一の軽鎖（ＬＣ）と２本の同一の重鎖（ＨＣ）とを含む４本のペプチド鎖からなる。これらの鎖は、ジスルフィド結合（複数可）および非共有結合によって単量体を形成する。２タイプの軽鎖、すなわちκおよびλと、５タイプの重鎖、すなわちμ、δ、γ、ε、およびαがある。抗体は、全体としては、定常領域と可変領域とに分けられる。可変領域は、Ｙ形状構造の２本のアームの末端に位置する。ヒト化抗体またはヒト抗体は、ある特定の一般性を有するが、すなわち、それらは全て、Ｙ形状構造の２本のアームの末端において重鎖または軽鎖に４つのループを含有する。３つのループは、可変性が高く、抗原との結合性に直接的に予期する。これらのループ内にある領域はＣＤＲと称され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３はそれぞれ、これらの３つのループに存在する。
抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏで、イムノグロブリンスーパーファミリーの遺伝子の組換えによって産生される。各種抗原に対する抗体のいくつかのフレームワーク領域は、同じ生殖系列抗体の遺伝子配列またはアミノ酸配列を由来とすることがある。ＣＤＲ間にはフレームワーク配列（ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３）があり、それらは全ての種類のヒト抗体で保存されている。可変領域について、全ての種類のヒト抗体は、リーダー配列の場合には、開始コドンから可変領域遺伝子エクソンの前の最後のヌクレオチドまでの全体を、ＶＨ、ＶＫ、およびＶＬの場合には、Ｖ遺伝子エクソンの始め（ＦＲ１の１位残基）からヘプタマー組換えシグナル配列より前の最後のヌクレオチド／アミノ酸までの全体を示される。８つの選択された抗体配列を図３１に示す。
我々は、他の抗体の重鎖および軽鎖のＤＮＡ配列を、発現のために、同じ保存された位置に対応させて変異させた。ＦＲ領域中の他の部位およびＷＴ抗体の結合親和性と比較した。５つの抗体配列において、ＶＨ中の保存された部位Ｇｌｎ３、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｕ４６、Ｔｈｒ６８、およびＡｓｐ７２、ならびにＶＬ中の保存された部位Ｔｈｒ５、Ｔｙｒ４９、Ａｒｇ６１、Ｓｅｒ６３、Ｓｅｒ６５、Ｓｅｒ６７、Ｔｈｒ７２、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７６、およびＡｓｐ８２（アミノ酸の位置はカバット付番則に従って付番）を選択してＲ４－７にコンジュゲートした。
この結果は、異なる抗体のＦＲ領域において、ＶＨのＧｌｎ３、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｕ４６、Ｔｈｒ６８、またはＡｓｐ７２、およびＶＬのＴｈｒ５、Ｔｙｒ４９、Ａｒｇ６１、Ｓｅｒ６３、Ｓｅｒ６５、Ｓｅｒ６７、Ｔｈｒ７２、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７６、またはＡｓｐ８２という保存された部位にＲ４－６をコンジュゲートすることによって、野生型抗体または他の位置に比べて結合活性を維持することができ、それは元の結合活性の６０％以上であったことを示している。陰性対照の代表としてのＧｌｙ４１では、全ての抗体で結合親和性を失った（ＷＴ抗体の＜６０％）。
実施例１４
ＣＴＬＡ－４は、腫瘍の微小環境のＴ細胞表面上にある。我々は、抗体のＣＤＲ領域内の各アミノ酸を変異させ、結合親和性を維持または増加するために異なるＲ４基によってスクリーニングした。場合によっては、結合親和性を増強することのできたＲ４基がいくつかあったが、我々はそれらを開発における薬剤候補として選択しなかった。我々は、Ｒ－１、Ｒ４－７、Ｒ４－５、Ｒ４－８、およびＲ４－１２を、薬剤開発における大規模合成と安定性のために採択した。Ｒ４を含むコンジュゲート型ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｒ４の化学修飾成熟のライブラリースクリーニングによりいくつかの位置で結合活性＞６０％を回復することができる。
結果によれば、抗ＣＴＬＡ－４抗体のＣＤＲ内のＧ、Ａ、Ｓ、Ｌ、Ｔ、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、またはＹをＣに変異させて各種Ｒ４に結合させた後に、変異体は、結合効率＞６０％を保持することができた。
場合によっては、結合親和性を増強することができたＲ４基がいくつかあった。我々は、６０～１００％の間の結合親和性のＲ４－ｓ－Ｒ５を、薬剤開発における薬剤候補として選択した。我々は、Ｒ－１、Ｒ４－７、Ｒ４－５、Ｒ４－８、およびＲ４－１２を、薬剤開発における大規模合成と安定性のために採択した。Ｓ４７がレグマインにより切断されると、切断後、Ｒ４－７化学基が保持される。ＣＤＲのアミノ酸へのＳ４７のコンジュゲーション後、これらのコンジュゲートは全て、親和性の減少を伴ってＣＴＬＡ－４の結合を遮断することができる（ＷＴ ＣＴＬＡ－４の＜３０％の活性）。そのため、ＣＤＲ領域の位置または変異体は、腫瘍の微小環境により活性化される抗体のための一次薬剤候補とすることができる。
結果によれば、抗ＣＴＬＡ－４抗体のＣＤＲ上の天然のアミノ酸をシステインに変異させて各種Ｒ４に化学的にコンジュゲートした（Ｒ４ライブラリースクリーニング）後、変異体は、＞６０％の結合効率を保持することができた。ＣＤＲのアミノ酸とのＳ４７コンジュゲーション反応、これらの位置は全て、親和性の減少を伴ってＣＴＬＡ－４の結合を遮断することができる（ＷＴ ＣＴＬＡ－４の＜３０％の活性）。そのため、全てのＳ４７コンジュゲートは、腫瘍の微小環境により活性化される抗体のための一次薬剤候補とすることができる。
抗体の親和性を向上させるために、親和性成熟の間にＣＤＲループ上のアミノ酸を変異させた。実際は、適したＲ４にコンジュゲートすることによって、抗体親和性の最適化も達成することができる（本明細書では抗体の化学成熟と称される）。図３２に示されるように、抗体の選択された変異部位に異なるＲ４基を部位特異的にコンジュゲートすることによって、我々は、Ｒ４基をスクリーニング用に選択的に換えることができた。（１）天然のアミノ酸は、リガンドとのＨ結合または電荷相互作用を有さない。化学成熟は、新しい相互作用を誘発することができる。（２）天然のアミノ酸は、距離のためにリガンドとの弱いＨ結合または電荷相互作用を有する。化学成熟は、距離を（Ｒ４－ｂによって）調整して、最も良い距離をスクリーニングすることができる。（３）天然のアミノ酸は、Ｈ結合または電荷相互作用を有する。化学成熟は、相互作用基を変えて、最も良いＲ４－ｃ基をスクリーニングすることができる。（４）化学成熟はまた、ＮＨ２ ＋またはＯ－を増加させることによって、電荷を増加させることができる。その結果、新しい親和性成熟の１種として、Ｈ結合または電荷相互作用の相互作用を増加させる可能性がある。
我々は、同じＣＴＬＡ－４抗体で１つまたは２つの変異を有する３つの変異体にＲ４をコンジュゲートすることによって、抗体の化学成熟を実施した。その結果を表５７に示した。
適したＲ４基にコンジュゲートすることによる抗体のＣＤＲループ内の化学成熟によって、抗体親和性の最適化も達成することができる。
実施例１５
構築されたＣＴＬＡ－４ ＴＭＥＡｂｏｄｙの結合ＥＬＩＳＡ特性解析
薬剤開発において、我々は、さらに進んだ開発のために、遮断効率および復活した活性の良好な部位を収集した。Ｓ４７とのコンジュゲーション後、ヒト抗体は、腫瘍の微小環境により活性化される抗体となり、ＴＭＥＡｂｏｄｙと称される。
腫瘍の微小環境でのヒトＣＴＬＡ－４タンパク質に対する結合におけるＴＭＥＡｂｏｄｙの回復能力を評価するために、コンジュゲート型ＴＭＥＡｂｏｄｙをレグマインによりｉｎ ｖｉｔｒｏで消化し、消化産物を、ヒトＣＴＬＡ－４との回復した結合活性を評価するために用いた。構築されたＴＭＥＡｂｏｄｙのヒトＣＴＬＡ－４との結合特性の特徴を明らかにするために、０．５μｇ／ｍＬのＣＴＬＡ－４ Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク）上に、４℃で一晩インキュベートすることによって被覆した。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、２％ＢＳＡによって室温で２時間ブロッキングした。ＰＢＳＴで３洗浄した後、プレートを、系列濃度のコンジュゲート型ＴＭＥＡｂｏｄｙ、コンジュゲーション前のＴＭＥＡｂｏｄｙ（システイン変異体）、および対照の野生型（ＷＴ）イピリムマブ抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴにより３回洗浄し、１：５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート型ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ断片（シグマ）により、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴにより３回洗浄した後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、Ｓｏｌａｒｂｉｏ）およびＥＬＩＳＡ停止緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ）を用いて、プレートを展開した。次いで、４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）により測定した。次いで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェアによりデータを解析した。
表５８に示されるように、化学リンカーと各種変異体部位とのコンジュゲーションにより、異なる程度の遮断効率を生じることができる。遮断効率は、結合曲線のＥＣ５０値の倍変化により計算することができる。１０倍を超える遮断効率と復活能（ＷＴの＜２倍のＥＣ５０値）を有するコンジュゲート型ＴＭＥＡｂｏｄｙは、さらに進んだ開発のための良い候補であるものと考えられた。
同じＥＬＩＳＡ法を上記に記載されたように実施した。図３３に示されるように、異なる部位へのコンジュゲーションは、異なる程度で結合活性の回復を示した。いくつかの変異体部位は、消化後にＷＴイピリムマブと同等の結合活性を示した（＜２倍のＥＣ５０変化、またはすなわち、ＷＴの＞５０％の活性）。
ＴＭＥＡｂｏｄｙの抗原結合性を遮断した結果、イピリムマブの受容体遮断活性の減少を生じた
次いで、ＣＴＬＡ－４タンパク質とのＴＭＥＡｂｏｄｙの結合の減少によって、Ｂ７－１ ＣＴＬＡ－４相互作用に対するイピリムマブの遮断の有効性も減少するものとなることを証明するために、受容体遮断活性（ＲＢＡ）アッセイを利用した。０．５μｇ／ｍＬのヒトＣＴＬＡ－４Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ）をＭａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク）上に吸収させて、次いで、プレートを２％ＢＳＡによりブロッキングした。０．０２μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＢ７－１またはＢ７－２タンパク質と各種濃度のＴＭＥＡｂｏｄｙまたはＷＴのイピリムマブとを、プレートを用いて完全にインキュベートし、次いで、標準ＥＬＩＳＡの手順のようなストレプトアビジン－ＨＲＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とのインキュベーションとそれに続くＴＭＢ反応とを用いて、受容体遮断活性を測定した。
図３４に示されるように、ヒトＣＴＬＡ－４タンパク質との結合活性が有意に減少したＴＭＥＡｂｏｄｙは、受容体遮断活性の劇的な減少をも示した。ＩＣ５０の倍変化を、受容体遮断活性の減少を評価するための定量パラメーターとして使用することができた。
ＲＢＡアッセイに関する他の候補のデータを表５９にまとめた。
ＳＥＢ誘導型Ｔ細胞活性化アッセイにおいて、ＴＭＥＡｂｏｄｙの抗原結合性を遮断した結果、機能性の有効性の減少を生じた。
次に、ＴＭＥＡｂｏｄｙに観察された抗原結合活性および受容体遮断活性の減少が、イピリムマブの機能性の有効性の減少に寄与できるか否かを評価するために、ブドウ球菌腸毒素（ＳＥＢ）誘導型Ｔ細胞活性化アッセイを実施した。ＳＥＢは、Ｔリンパ球を強力に活性化してサイトカインの分泌を誘導することができるスーパー抗原である。健常ドナー由来の全ＰＢＭＣ細胞（Ａｌｌｃｅｌｌｓ）を、ウェル当たり１Ｅ５細胞個として、１０％ＦＢＳ（ギブコ）、１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、および各種濃度のＴＭＥＡｂｏｄｙ、ＷＴのイピリムマブ、またはそのアイソタイプ対照ヒトＩｇＧをそれぞれ含む１６４０培地（ギブコ）中で培養した。活性化の９６時間後、上清を遠心分離により収集して、ＥＬＩＳＡ法を用いるＩＬ２検出キット（Ｒ＆Ｄシステムズ）によりＩＬ２の放出を測定した。
図３５に示されるように、ＣＴＬＡ－４に対する結合活性の減少したＴＭＥＡｂｏｄｙは、Ｔ細胞の活性化の機能的な有効性の障害を示し、プロテアーゼにより媒介される活性化がＴＭＥＡｂｏｄｙの活性を復活できる。
このアッセイを、他のＴＭＥＡｂｏｄｙについても単一濃度（１０ｕｇ／ｍＬ）で行い、遮断効率を計算した（（ＷＴ－ＴＭＥＡｂｏｄｙ）／（ＷＴ－ｈＩｇＧ）＊１００％）。結果を表６０に示す。
イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙは、腫瘍においてＴｒｅｇを制御したが、末梢では制御しなかった
ＴＭＥＡｂｏｄｙが腫瘍の微小環境で特異的に活性化されたが末梢リンパ器官では活性化されなかったか否かを見極めるために、メカニズム試験を実施した。イピリムマブ療法について提唱されているメカニズムの１つは、イピリムマブが抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）効果を介してＴｒｅｇ細胞の集団を下方制御し、それゆえに腫瘍に対する免疫応答を活性化することができるというものである。ＣＤ４マーカー、ＣＤ２５マーカー、およびＦｏｘｐ３マーカーをそれぞれ用いたフローサイトメトリーにより、Ｔｒｅｇ集団を解析した。図３６に示されるように、イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙは、ＷＴイピリムマブと同様の有効性で、腫瘍においてＴｒｅｇ集団を有意に下方制御した。しかしながら、脾臓または末梢血では、イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙは、Ｔｒｅｇ集団の調節を非常に低く示したかまたは全く示さなかった。これらの結果は、イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙが、特異的な活性を腫瘍の微小環境で示したが、末梢リンパ器官または末梢血では示さなかったことを実証していた。
ＴＭＥＡｂｏｄｙはヒト血漿中で安定である
血清中でのＴＭＥＡｂｏｄｙの安定性を評価するために、１ｕｇのＣＴＬＡ－４ ＴＥＭＡｂｏｄｙ（Ｓ１３のコンジュゲーションを有するＩｐｉ０５３）を２０ｕＬのマウス血清に入れ、３７℃で２時間、４時間、２４時間、４８時間、および９６時間、それぞれ保った。次いで、試料を抗ヒトＦａｂＨＲＰ抗体（シグマ）によるウェスタンブロット用に調製した。ゲル強度をＩｍａｇｅＪソフトウェアにより分析し、相対強度をＧｒａｐｈＰａｄにより解析した。以下の図３７に示されるように、ＴＭＥＡｂｏｄｙは、マウス血清中において、３７℃で９６時間後に有意に分解することなく、高い安定性を示した。
ＣＴＬＡ－４ ＴＭＥＡｂｏｄｙは、Ｓ４７官能基とのコンジュゲーションにより、ＷＴ－イピリムマブおよびＣＴＬＡ－４プロボディに比べて半減期および曝露の増加を示した
ＴＭＥＡｂｏｄｙの薬物動態特性を調節する際の化学コンジュゲーションの潜在的な効果を評価するために、単回ＩＶ用量の１ｍｇ／ｋｇのＷＴイピリムマブまたはイピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙを、Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射した。０．５時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１日後、２日後、５日後、１０日後、１５日後、２０日後、総抗体および活性抗体の濃度の決定のＥＬＩＳＡ試験に用いるために血漿を収集した。総抗体濃度の決定には、抗ヒトＦｃ抗体（インビトロジェン）をＥＬＩＳＡプレート（ヌンク）上に被覆し、注射された抗体を抗ヒトＦａｂ ＨＲＰ二次抗体（インビトロジェン）によって検出した。活性抗体濃度の決定では、ヒトＣＴＬＡ－４タンパク質（シノバイオロジカル）をＥＬＩＳＡプレート上に被覆した。次いで、活性抗体を抗ヒトＦｃ ＨＲＰ二次抗体（インビトロジェン）によって検出した。標準曲線をＷＴイピリムマブまたはイピリムマブＴＥＭＡｂｏｄｙの系列希釈物によって描き、４パラメーターフィッティングを介して標準結合曲線を確立した。総抗体または活性抗体の濃度を、標準曲線へのＹ値の外挿を介して計算した。図３８（ａ）に示されるように、ＴＭＥＡｂｏｄｙの半減期は、４０ｋｄ官能基とのコンジュゲーション後に、ＷＴイピリムマブ抗体またはイピリムマブプロボディ（マスキングペプチドとしてＭＹ１１を、切断部分として２０１１を用いたＷＯ２０１８／０８５５５５Ａ１）に比べて増加した。さらに、ＣＴＬＡ－４ＴＭＥＡｂｏｄｙは、図３８（ｂ）に示されるように、血漿中で時間と共にイピリムマブプロボディよりも少ない活性化を示した。
マウス腫瘍モデルにおけるＴＭＥＡｂｏｄｙのｉｎ ｖｉｖｏ特性解析
さらに動物モデルで腫瘍を治療する際のＴＭＥＡｂｏｄｙのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の特徴を明らかにするために、イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙ、ならびにＷＴイピリムマブおよび対照ヒトＩｇＧを、ヒトＣＴＬＡ－４ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスのＭＣ３８結腸腺癌腫瘍モデルに投与した。ヒトＣＴＬＡ－４ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスに、２Ｅ６ＭＣ３８細胞を腹腔左下四分円部に皮下注射した。７日間の腫瘍成長後、動物を、類似の平均腫瘍体積を有する群に分けた。動物に、標示された単回用量の対照ヒトＩｇＧ、ＷＴイピリムマブ、または等モルのＴＭＥＡｂｏｄｙ（抗体の濃度、ｎ＝６）をそれぞれ投与し、各動物について腫瘍体積をモニタリングした。図３９に示されるように、イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙが、ＷＴイピリムマブと同等の有効性で腫瘍サイズを制御するのに対し、対照のヒトＩｇＧは、何ら有効性を示せなかった。腫瘍体積阻害率を表６１にまとめた。この結果は、イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙを腫瘍の微小環境内で活性化し、抗腫瘍免疫応答を惹起できたことを意味する。
表６１に示されるように、Ｓ４７－Ｉｐｉ０５３およびＳ４７－Ｉｐｉ０６６による腫瘍成長への阻害および治癒率は、同じモル濃度を用いてＷＴ（Ｉｐｉ）により治療された群に比べて大きく向上した。
ＣＴＬＡ－４ ＴＭＥＡｂｏｄｙは動物で低い免疫原性を示した
ＴＭＥＡｂｏｄｙの免疫原性を評価するために、３つの群のＢａｌｂ／ｃマウスｓ（各ｎ＝５）を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を含む５０μｇのイピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙ、ＷＴイピリムマブ、またはイピリムマブプロボディ（マスキングペプチドとしてＭＹ１１を、切断部分として２０１１を用いたＷＯ２０１８／０８５５５５Ａ１）により免疫した。一次免疫の１４日後、動物を、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含む２５μｇのイピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙ、ＷＴイピリムマブ、またはイピリムマブプロボディにより追加免疫した。追加免疫の７日後、血清を取得し、イピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙ、ＷＴイピリムマブ、またはイピリムマブプロボディに対する抗体力価について、それぞれ試験した。１％ヒト血清を血清希釈緩衝液中に使用して、ヒトＩｇＧの定常領域に対するどの抗体も遮断するものとした。図４０に示されるように、ＴＭＥＡｂｏｄｙが、ＷＴイピリムマブと同等かまたはそれより低い抗体価で、極めて低い免疫応答を動物に引き起こした。しかしながら、イピリムマブプロボディは、免疫原性の劇的な増加を引き起こし、それは軽鎖のＮ末端に含まれる外来配列に起因する可能性があった。
ＣＴＬＡ－４ ＴＭＥＡｂｏｄｙはｉｎ ｖｉｖｏで低い毒性を示す
抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４の抗体の併用がメラノーマの治療に有効（ＯＲＲ）であるにも関わらず、現在の臨床研究で、併用が５５％のグレード３～４のＴＲＡＥを呈し、患者の３０％がその療法を中断せねばならないことが見出されたことが、当技術分野に周知である。我々は、非疾患環境での曝露時間または活性薬剤の用量を低減するように、抗体をコンジュゲートによって阻害または遮断し、局所環境に達した後に放出すれば、これらのＴＲＡＥが改善される可能性があるものと推定した。この理由から、Ｉ型糖尿病に罹患した（ＮＯＤ）マウスを用いて実験を実施した。この種類のマウスの糖尿病は自己免疫疾患であり、その場合、自己活性化されたＴリンパ球細胞が膵島β細胞を破壊し、その結果、インスリンの分泌が不十分となる。まず、１０週齢の雌ＮＯＤ（北京維通利華実験動物技術有限公司）に、対照ＩｇＧ、高用量（１５ｍｐｋ）の抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４の抗体、または１５ｍｐｋ用量の抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４のＴＭＥＡｂｏｄｙ（Ｓ４７－Ｉｐｉ０５３）をそれぞれ、０日目に注射した。尿中グルコースおよび２つの血糖レベルを含む糖尿病の指標を、尿グルコースの新しい指標が観察されなくなるまで、１２日間にわたって毎日観察した。
コンジュゲートによる自己免疫からの保護を図４１に示した。結果は、併用療法コンジュゲートにおいて抗ＣＴＬＡ４ ＴＭＥＡｂｏｄｙのコンジュゲートにより免疫系を保護することによって、一次抗体に比較して自己免疫を低減できたことを示した。
実施例１６：ＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（ペムブロリズマブ）の生成および特性解析
上記のイピリムマブＴＭＥＡｂｏｄｙスクリーニングの実施例に示されたように、抗ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ）の複数の部位を、部位特異的コンジュゲーションのためにシステインに変異させた。抗ＰＤ－１抗体（ペムブロリズマブ）の重鎖の変異位置は、（カバット付番則または他の抗体付番則を用いずにＮ末端からＣ末端まで連続的に付番して）Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ａｌａ１６、Ｓｅｒ１７、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｙｒ２７、Ｔｈｒ２８、Ｔｈｒ３０、Ａｓｎ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｔｙｒ３５、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ｇｌｙ４９、Ｇｌｙ５０、Ｉｌｅ５１、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｎ５５、Ｇｌｙ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｌｙｓ６３、Ｌｙｓ６５、Ｔｈｒ６９、Ｌｅｕ７０、Ｔｈｒ７１、Ｔｈｒ７２、Ａｓｐ７３、Ｓｅｒ７４、Ｓｅｒ７５、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ７７、Ｔｈｒ７８、Ａｌａ７９、Ｌｅｕ８３、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ａｒｇ９９、Ａｓｐ１００、Ｔｙｒ１０１、Ａｒｇ１０２、Ａｓｐ１０４、Ｇｌｙ１０６、Ｇｌｙ１１１、Ｇｌｙ１１３、Ｔｈｒ１１４、１１５Ｔｈｒ、１１７Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１１９、Ｓｅｒ１２０、Ａｌａ１２１、Ｓｅｒ１２２、Ｔｈｒ１２３、Ｌｙｓ１２４、Ｇｌｙ１２５、およびＳｅｒ１２７からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ｉｌｅ２、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ａｌａ９、Ｔｈｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｌｅｕ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ａｌａ１９、Ｔｈｒ２０、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｌｙｓ２７、Ｇｌｙ２８、Ｓｅｒ３０、Ｔｈｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ｔｙｒ３４、Ｓｅｒ３５、Ｔｙｒ３６、Ｌｅｕ３７、Ｇｌｙ４５、Ａｌａ４７、Ｌｅｕ５０、Ｌｅｕ５１、Ｉｌｅ５２、Ｔｙｒ５３、Ｌｅｕ５４、Ａｌａ５５、Ｓｅｒ５６、Ｔｙｒ５７、Ｌｅｕ５８、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｙ６１、Ａｌａ６４、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｓｅｒ６９、Ｇｌｙ７０、Ｓｅｒ７１、Ｇｌｙ７２、Ｔｈｒ７３、Ａｌａ７６、Ｔｈｒ７８、Ｓｅｒ８０、Ｓｅｒ８１、Ｓｅｒ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｌｅｕ９８、Ｌｅｕ１００、Ｔｈｒ１０１、Ｐｈｅ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１１０、Ｌｙｓ１１１、およびＫ１３０からなる群から選択される。ヒトＦｃタグ付ＰＤ－１タンパク質（シノバイオロジカル）によるＥＬＩＳＡ特性解析を実施して、遮断効率および回復効率の良い候補部位を特定した。表６２に示されるように、遮断効率＞５倍（すなわち活性＜２０％）と酵素消化後に復活された活性（ＥＣ５０変化＜２倍、またはすなわち活性＞５０％）とを有する部位を、さらに別の展開のために選択した。
実施例１７：抗ＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（ペムブロリズマブ）の機能性特性解析
ヒトＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ）をウェル当たり１×１０５細胞個の濃度で９６ウェルプレートに播種した。細胞を０．１ｕｇ／ｍＬ ＳＥＢにより３日間刺激した。異なる濃度のＷＴ抗ＰＤ－１抗体、ＴＭＥＡｂｏｄｙ、または活性化されたＴＭＥＡｂｏｄｙを添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養した。上清を採集し、細胞毒性因子ＩＦＮ－γの濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）によって検出した。機能性の遮断効率および回復率を表６３にまとめた。
実施例１８：ＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（ニボルマブ）の生成および特性解析
上記のイピリムマブおよびペムブロリズマブのＴＭＥＡｂｏｄｙのスクリーニングの実施例に示されるように、抗ＰＤ－１抗体（ニボルマブ）の複数の部位を、部位特異的コンジュゲーションのためにシステインに変異させた。抗ＰＤ－１抗体（ニボルマブ）の重鎖の変異位置は、Ｇｌｎ３、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ９、Ｇｌｙ１０、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１７、Ｌｙｓ２３、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｉｌｅ２７、Ａｓｎ３１、Ｔｈｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ａｌａ４９、Ｉｌｅ５１、Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５５、Ｓｅｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ａｓｐ６２、Ｓｅｒ６３、Ｌｙｓ６５、Ｇｌｙ６６、Ｔｈｒ６９、Ｉｌｅ７０、Ｓｅｒ７１、Ａｒｇ７２、Ａｓｐ７３、Ａｓｎ７４、Ｓｅｒ７５、Ｌｙｓ７６、Ａｓｎ７７、Ｔｈｒ７８、Ｌｅｕ７９、Ｌｅｕ８１、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ａｌａ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｔｈｒ９８、Ａｓｎ９９、Ａｓｐ１００、Ａｓｐ１０１、Ｔｙｒ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｇｌｙ１０６、Ｔｈｒ１０７、Ｌｅｕ１０８、Ｔｈｒ１１０、Ｓｅｒ１１２、Ｓｅｒ１１３、Ａｌａ１１４、Ｓｅｒ１１５、Ｔｈｒ１１６、Ｌｙｓ１１７、Ｇｌｙ１１８、およびＳｅｒ１２０からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ｉｌｅ２、Ｌｅｕ４、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ａｌａ９、Ｔｈｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｌｅｕ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ａｌａ１９、Ｔｈｒ２０、Ｌｅｕ２１、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ３３、Ａｌａ３４、Ｔｙｒ３６、Ｇｌｙ４１、Ａｌａ４３、Ｌｅｕ４６、Ｌｅｕ４７、Ｉｌｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ａｓｎ５３、Ａｒｇ５４、Ａｌａ５５、Ｔｈｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｉｌｅ５８、Ａｌａ６０、Ａｒｇ６１、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｔｈｒ６９、Ｔｈｒ７２、Ｌｅｕ７３、Ｔｈｒ７４、Ｉｌｅ７５、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ｌｅｕ７８、Ａｌａ８４、Ｓｅｒ９１、Ｓｅｒ９２、Ａｓｎ９３、Ａｒｇ９６、Ｔｈｒ９７、Ｐｈｅ９８、Ｇｌｙ９９、Ｇｌｙ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｉｌｅ１０６、Ｌｙｓ１０７、Ｔｈｒ１０９、Ａｌａ１１１、Ａｌａ１１２、Ｓｅｒ１１４、Ｉｌｅ１１７ａｎｄＳｅｒ１２１からなる群から選択される。遮断効率＞５倍と酵素消化後に復活された活性（ＥＣ５０変化＜２倍）とを有する部位を、表６４に示すようにさらに別の展開のために選択した。
図４２に示されるように、Ｎｉｖ－ｓｅ００１は、Ｒ４－７のコンジュゲーションの後、または４０ｋＤコンジュゲート型ＴＭＥＡｂｏｄｙのプロテアーゼによる切断の後に、ＷＴニボルマブの４３２％という活性の増加を示した。これは、Ｒ４－７が本来のリジン残基よりも増加した結合活性をもたらしたことに起因する可能性がある。
Ｎｉｖ－ｓｅ００５は、Ｔｒｙ４９がシステインに変異されると、結合活性の喪失を示した。しかし、図４３に示されるように、Ｒ４－７によるコンジュゲーションの後、または４０ｋＤの官能基にコンジュゲートされたＮｉｖ－ｓｅ００５のプロテアーゼによる切断の後に、結合活性は、ＷＴニボルマブと同等のレベル（ＷＴの１２５％）に復活する。
実施例１９：抗ＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（ニボルマブ）の機能性特性解析
ヒトＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ）をウェル当たり１×１０５細胞個の濃度で９６ウェルプレートに播種した。細胞を０．１ｕｇ／ｍＬ ＳＥＢにより３日間刺激した。異なる濃度の抗ＰＤ－１抗体（ニボルマブ）、ＴＭＥＡｂｏｄｙ（ニボルマブ）、または活性化されたＴＭＥＡｂｏｄｙ（ニボルマブ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養した。上清を採集し、細胞毒性因子ＩＦＮ－γの濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ）によって検出した。機能性の遮断効率および回復率を表６５にまとめた。
実施例２０：マウス腫瘍の治療における抗ＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（ペムブロリズマブおよびニボルマブ）のｉｎ ｖｉｖｏ特性解析
動物モデルで腫瘍を治療する際の抗ＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の特徴をさらに明らかにするために、抗ＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（ペムブロリズマブをベースとしたＰｅｍ－ｓｅ０１０ ＴＭＥＡｂｏｄｙおよびニボルマブをベースとしたＮｉｖ－ｓｅ００７ ＴＭＥＡｂｏｄｙ）、ならびにＷＴＰＤ－１抗体ｓ（ペムブロリズマブおよびニボルマブ）および対照ヒトＩｇＧを、ヒトＰＤ－１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭＣ３８結腸腺癌腫瘍モデルに投与した。ヒトＰＤ－１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスに、２Ｅ６ＭＣ３８細胞を腹腔左下四分円部に皮下注射した。７日間の腫瘍成長後、動物を、類似の平均腫瘍体積を有する群に分けた。動物に１０ｍｇ／ｋｇの単回用量のＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（ＰＥＧリンカーを含まない抗体の濃度）、ＷＴ ＰＤ－１抗体、または対照ヒトＩｇＧを投与し、各動物について腫瘍体積をモニタリングした。
図４４に示されるように、ペムブロリズマブＴＭＥＡｂｏｄｙおよびニボルマブＴＭＥＡｂｏｄｙが、ＷＴのペムブロリズマブ抗体またはニボルマブ抗体と同等の有効性で腫瘍サイズを制御するのに対して、対照のヒトＩｇＧは何ら有効性を示せなかった。興味深いことに、Ｎｉｖ－ｓｅ００１ ＴＭＥＡｂｏｄｙは、腫瘍の治療において、おそらくはプロテアーゼ切断後に結合活性が増強されたために、ＷＴニボルマブよりも向上した有効性を示した。この結果は、これらの抗ＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙが腫瘍微小環境で活性化し、抗腫瘍免疫応答を引き起こすことができたことを意味する。
実施例２１：マウス腫瘍モデルにおける有効性試験のためのマウス抗ＰＤ－１抗体（Ｊ４３ｖ２）の生成
ハムスター抗マウスＰＤ－１抗体配列は、米国特許出願公開公報第２０１７００４４２５９号Ａ１に開示されていた。マウス内での免疫原性を低減するために、この抗体のこの重鎖を、マウスＩｇＧ２ａにリフォーマットした。上記のスクリーニング方法のように、遮断効率の高いＴＭＥＡｂｏｄｙのスクリーニングのために、複数の部位を設計した。最終的に、ＬＣ上のＳｅｒ９５を、その高効率の遮断（マウスＰＤ－１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡアッセイで３５倍）ゆえにＴＭＥＡｂｏｄｙの生成のために選択した。ＳＮ３８マウス腫瘍モデルに、ＷＴ Ｊ４３ｖ２抗体またはＪ４３ｖ２ ＴＭＥＡｂｏｄｙの１０ｍｇ／ｋｇの単回用量投与を行った（各群ｎ＝８）。投与後１７日目に、Ｊ４３ｖ２ ＴＭＥＡｂｏｄｙは、７５％の腫瘍阻害を示し、ＷＴ Ｊ４３ｖ２抗体（８３％）と同等の阻害有効性であった。この結果は、ＰＤ－１抗体を活性化することができ、その抗腫瘍活性ｉｎ ｖｉｖｏで発揮したことを示す。
実施例２２：マウス腫瘍モデルにおける有効性試験のための抗マウスＣＴＬＡ－４抗体（９Ｄ９）の生成
さらに別の機能性試験および毒性試験に用いるマウスＣＴＬＡ－４サロゲートＴＭＥＡｂｏｄｙを生成するために、我々は、抗マウスＣＴＬＡ－４抗体とその変異体バリアント（９Ｄ９クローン、ｍＩｇＧ２ｂアイソタイプ、ＷＯ２００７／１２３７３７Ａ２に示される配列）を作製して精製した。上記のスクリーニング方法のように、遮断効率の高いＴＭＥＡｂｏｄｙのスクリーニングのために、複数の部位を設計した。最終的に、ＬＣ上のＴｙｒ５４を、その高効率の遮断（マウスＣＴＬＡ－４タンパク質を用いたＥＬＩＳＡアッセイで２６倍）ゆえにＴＭＥＡｂｏｄｙの生成のために選択した。ＣＴ２６マウス腫瘍モデルに、ＷＴ ９Ｄ９抗体または９Ｄ９ ＴＭＥＡｂｏｄｙの１０ｍｇ／ｋｇの単回用量投与を行った（各群ｎ＝８）。投与後１７日目に、９Ｄ９ ＴＭＥＡｂｏｄｙは、６９％の腫瘍阻害を示し、ＷＴ ９Ｄ９抗体（７４％）と同等の阻害有効性であった。この結果は、９Ｄ９ ＴＭＥＡｂｏｄｙを活性化することができ、その抗腫瘍活性ｉｎ ｖｉｖｏで発揮したことを示す。
実施例２３：マウス型のＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙおよびＣＴＬＡ－４ ＴＭＥＡｂｏｄｙは、ＷＴ抗体よりも減少した毒性を示した
抗ＰＤ－１と抗ＣＴＬＡ－４の抗体の併用がメラノーマの治療に有効（ＯＲＲ）であるにも関わらず、現在の臨床研究で、併用が５５％のグレード３～４のＴＲＡＥを呈し、患者の３０％がその療法を中断せねばならないことが見出されたことが、当技術分野に周知である。我々は、非疾患環境での曝露時間または活性薬剤の用量を低減するように、抗体をコンジュゲートによって阻害または遮断し、腫瘍の局所環境に達した後に放出すれば、これらのＴＲＡＥが改善される可能性があるものと推定した。この理由から、Ｉ型糖尿病に罹患した（ＮＯＤ）マウスを用いて実験を実施した。この種類のマウスの糖尿病は自己免疫疾患であり、その場合、自己活性化されたＴリンパ球細胞が膵島β細胞を破壊し、その結果、インスリンの分泌が不十分となる。まず、０日目に、１０週齢の雌ＮＯＤ（北京維通利華実験動物技術有限公司）に、対照ＩｇＧ、高用量（１５ｍｐｋ）の抗マウスＰＤ－１抗体（Ｊ４３ｖ２）および抗マウスＣＴＬＡ－４抗体（９Ｄ９）を注射するか、またはこれら２つの抗体のうち一方もしくは両方をそのＴＭＥＡｂｏｄｙ体に置き換えた。尿中グルコースおよび２つの血糖レベルを含む糖尿病の指標を、尿グルコースの新しい指標が観察されなくなるまで、１２日間にわたって毎日観察した。
コンジュゲートによる自己免疫からの保護を図４５に示した。結果は、併用療法における抗ＣＴＬＡ４ ＴＭＥＡｂｏｄｙまたは抗ＰＤ１ ＴＭＥＡｂｏｄｙが、一次抗体に比較して自己免疫を低減できたことを示した。さらに、これらの２つのＴＭＥＡｂｏｄｙを併用した結果、対照群と同等のレベルで非常に低い毒性を生じた。
実施例２４：抗ＰＤ－１ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（特許ＷＯ２０１７／１２４０５０Ａｌ）の生成および特性解析
上記の方法の通りに、抗ＰＤ－１抗体配列を特許出願ＷＯ２０１７／１２４０５０Ａｌからダウンロードし、部位のスクリーニングを実施して、遮断効率の良いＴＭＥＡｂｏｄｙを特定した。抗ＰＤ－１抗体の重鎖の変異位置は、Ｓｅｒ２８、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ３６、Ｇｌｙ５０、Ｔｙｒ５１、Ｓｅｒ５３、Ｔｙｒ５４、Ａｓｐ５５、Ｓｅｒ５７、Ｌｙｓ５８、Ａｓｎ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｓｎ６１、Ｌｙｓ６５、Ａｓｎ６６、Ｔｈｒ６９、Ｔｈｒ７４、Ｇｌｙ１００、Ａｓｐ１０５、Ｔｙｒ１０６からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ｌｙｓ２４、Ｇｌｎ２７、Ｓｅｒ２８、Ａｓｐ３１、Ａｓｐ３２、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ３４、Ｇｌｎ３５、Ｌｙｓ３６、Ａｓｎ３７、Ｔｙｒ３８、Ｓｅｒ５８、Ａｒｇ６０、Ｇｌｕ６１、Ｓｅｒ６２、Ｇｌｙ６３、Ｇｌｙ７０、Ｓｅｒ７３、Ｔｈｒ７５、Ｇｌｎ９５、Ｇｌｎ９６、Ｔｙｒ９８、Ｔｈｒ１００、Ｔｙｒ１０２からなる群から選択される。結合ＥＬＩＳＡを、Ｆｃタグ付ヒトＰＤ－１タンパク質（シノバイオロジカル）を用いて実施し、遮断効率（ＥＣ５０変化＞５倍）および回復（ＥＣ５０変化＜２倍）の良い選択された部位を表６６にまとめた。
実施例２５：抗４－１ＢＢ ＴＭＥＡｂｏｄｙの生成および特性解析
４－１ＢＢ抗体配列を米国特許出願公開公報第２０１８／０１９４８５１Ａ１（クローンＭＯＲ７４８０．１）からダウンロードした。抗４－１ＢＢ抗体の重鎖の変異位置は、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｓｅｒ３５、Ｌｙｓ５０、Ｔｙｒ５２、Ａｓｐ５５、Ｓｅｒ５６、Ｔｙｒ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｔｙｒ６０、Ｓｅｒ６１、Ｇｌｎ６５、Ｇｌｙ６６、Ｇｌｙ９９、Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ａｓｐ１０４、Ｔｙｒ１０５からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ｓｅｒ２３、Ｇｌｙ２４、Ａｓｐ２５、Ａｓｎ２６、Ｇｌｙ２８、Ａｓｐ２９、Ｇｌｎ３０、Ｔｙｒ３１、Ｇｌｎ４９、Ａｓｐ５０、Ｌｙｓ５１、Ａｓｎ５２、Ａｒｇ５３、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｙ５６、Ｔｈｒ８９、Ｔｙｒ９０、Ｔｈｒ９１、Ｇｌｙ９２、Ｇｌｙ９４、Ｓｅｒ９５からなる群から選択される。ヒト４－１ＢＢタンパク質をＥＬＩＳＡ特性解析に使用して、遮断効率が良く（ＥＣ５０変化＞５倍）ならびにプロテアーゼ消化後の回復が良い（ＥＣ５０変化＜２倍）変異体部位を特定した。選択された部位を表６７および表６８にまとめた。
実施例２６：抗Ｈｅｒ２ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（トラスツズマブ）の生成および特性解析
トラスツズマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００７２）からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗Ｈｅｒ２ ＴＭＥＡｂｏｄｙを特定した。抗Ｈｅｒ２抗体（トラスツズマブ）の重鎖の変異位置は、Ａｒｇ１９、Ｌｙｓ３０、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３３、Ａｒｇ５０、Ｔｙｒ６２、Ａｓｎ５５、Ｔｙｒ５７、Ａｒｇ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｓｐ６２、Ｌｙｓ６５、Ａｓｐ１０２、Ｔｙｒ１０５からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ａｓｐ１、Ｇｌｎ３、Ｇｌｎ２７、Ａｓｐ２８、Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４９、Ｔｙｒ５５、Ａｒｇ６６、Ａｓｐ７０、Ｔｙｒ９２からなる群から選択される。Ｈｉｓタグ付Ｈｅｒ２タンパク質（シノバイオロジカル）をＥＬＩＳＡに使用した。遮断効率が良く回復が良い選択された部位を表６９にまとめた。
実施例２７：抗ＴＮＦａ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（アダリムマブ）の生成および特性解析
アダリムマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００５１）からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗ＴＮＦａ ＴＭＥＡｂｏｄｙを特定した。抗ＴＮＦα抗体の重鎖の変異位置は、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ９、Ｇｌｙ１０、Ｌｅｕ１１、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１７、Ｌｅｕ１８、Ｌｅｕ２０、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｈｒ２８、Ａｓｐ３０、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３２、Ａｌａ３３、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ｓｅｒ４９、Ａｌａ５０、Ｉｌｅ５１、Ｔｈｒ５２、Ａｓｎ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｙ５６、Ｉｌｅ５８、Ａｓｐ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ａｓｐ６２、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｕ６５、Ｇｌｙ６６、Ｐｈｅ６８、Ｔｈｒ６９、Ｉｌｅ７０、Ｓｅｒ７１、Ａｓｐ７３、Ａｓｎ７４、Ａｌａ７５、Ｌｙｓ７６、Ｓｅｒ７８、Ｌｅｕ７９、Ｔｙｒ８０、Ｌｅｕ８１、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ａｌａ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｌｙｓ９８、Ｓｅｒ１００、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｔｈｒ１０４、Ａｌａ１０５、Ｓｅｒ１０６、Ｓｅｒ１０７、Ｌｅｕ１０８、Ａｓｐ１０９、Ｔｙｒ１１０、Ｇｌｙ１１２、Ｇｌｙ１１４、Ｔｈｒ１１５、Ｌｅｕ１１６、Ｔｈｒ１１８、Ｓｅｒ１２０、Ｓｅｒ１２１、Ａｌａ１２２、Ｓｅｒ１２３、およびＴｈｒ１２４からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ａｓｐ１、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ９、Ｓｅｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ａｌａ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ｔｈｒ２０、Ｉｌｅ２１、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｎ２７、Ｇｌｙ２８、Ｉｌｅ２９、Ａｒｇ３０、Ａｓｎ３１、Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ３３、Ａｌａ３４、Ｔｙｒ３６、Ｌｙｓ３９、Ｇｌｙ４１、Ｌｙｓ４２、Ａｌａ４３、Ｌｅｕ４８、Ｌｅｕ４７、Ｉｌｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｌａ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ｔｈｒ５３、Ｌｅｕ５４、Ｇｌｎ５５、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｓｅｒ６０、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｔｈｒ６９、Ａｓｐ７０、Ｔｈｒ７２、Ｌｅｕ７３、Ｔｈｒ７４、Ｉｌｅ７５、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ｌｅｕ７８、Ａｌａ８４、Ｔｈｒ８５、Ｔｙｒ９１、Ａｓｎ９２、Ａｒｇ９３、Ａｌａ９４、Ｔｙｒ９６、Ｔｈｒ９７、Ｐｈｅ９８、Ｇｌｙ９９、Ｇｌｙ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｉｌｅ１０６、Ｌｙｓ１０７、Ｔｈｒ１０９、およびＡｌａ１１１からなる群から選択される。ＴＮＦａタンパク質（シノバイオロジカル）をＥＬＩＳＡ特性解析に使用し、遮断効率が良く（ＥＣ５０変化＞５倍）回復が良い（ＥＣ５０変化＜２倍）選択された部位を表７０にまとめた。
実施例２８：抗ＰＤ－Ｌ１ ＴＭＥＡｂｏｄｙ （アテゾリズマブ）の生成および特性解析
抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の重鎖配列および軽鎖配列をＤｒｕｇ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ１１５９５）からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗ＴＮＦａ ＴＭＥＡｂｏｄｙを特定した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体（アテゾリズマブ）の重鎖の変異位置は、Ｇｌｎ３、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ５４、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｓｐ６２、Ｌｙｓ６５、Ａｓｐ７３、Ｌｙｓ７６、Ａｓｎ７７、Ａｒｇ９９からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ａｒｇ２４、Ｇｌｎ２７、Ａｓｐ２８、Ｔｙｒ４９、Ｔｙｒ５５、Ａｓｐ７０、Ｇｌｎ８９、Ｇｌｎ９０、Ｔｙｒ９１、Ｔｙｒ９３からなる群から選択される。Ｆｃタグ付ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質（シノバイオロジカル）をＥＬＩＳＡ特性解析に使用し、遮断効率が良く（ＥＣ５０変化＞５倍）回復が良い（ＥＣ５０変化＜２倍）選択された部位を表７１にまとめた。
実施例２９：抗ＣＤ２８ ＴＭＥＡｂｏｄｙの生成および特性解析
抗ヒトＣＤ２８抗体重鎖配列および軽鎖配列を、米国特許第８７０９４１４号Ｂ２からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗ＣＤ２８ ＴＭＥＡｂｏｄｙを特定した。抗ＣＤ２８抗体の重鎖の変異位置は、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ａｌａ１６、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ２１、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｙｒ２７、Ｔｈｒ２８、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｇｌｙ４９、Ｔｙｒ５２、Ｇｌｙ５４、Ｔｈｒ５８、Ａｌａ６８、Ｔｈｒ６９、Ｔｈｒ７１、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７５、Ｓｅｒ７７、Ｔｈｒ７８、Ａｌａ７９、Ｓｅｒ８４、Ｌｅｕ８６、Ｓｅｒ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｔｈｒ９７、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｌｅｕ１０３、Ｇｌｙ１１３、Ｔｈｒ１１４、Ｔｈｒ１１５、Ｔｈｒ１１７、Ｓｅｒ１１９、Ｓｅｒ１２０、Ａｌａ１２１、Ｓｅｒ１２２、およびＴｈｒ１２３からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ９、Ｓｅｒ１０、Ｓｅｒ１１、Ｓｅｒ１２、Ａｌａ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ｔｈｒ２０、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２７、Ｉｌｅ２９、Ｔｙｒ３０、Ａｌａ４３、Ｌｅｕ４６、Ｌｅｕ４７、Ｔｙｒ４９、Ｌｙｓ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ｌｅｕ５４、Ｔｈｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｓｅｒ６０、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｔｈｒ６９、Ａｓｐ７０、Ｔｈｒ７２、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ａｌａ８４、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｙ９１、Ｔｈｒ９３、Ｔｙｒ９４、Ｔｙｒ９６、Ｔｈｒ９７、Ｐｈｅ９８、Ｇｌｙ９９、Ｇｌｙ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｔｈｒ１０９、およびＡｌａ１１１からなる群から選択される。Ｆｃタグ付ヒトＣＤ２８タンパク質（シノバイオロジカル）をＥＬＩＳＡ特性解析に使用して、遮断効率が良く（ＥＣ５０変化＞５倍）回復が良い（ＥＣ５０変化＜２倍）選択された部位を表７２に示す。
実施例３０：腫瘍の微小環境で活性化されるＩＬ－１０サイトカイン（ＩＬ－１０ＴＭＥＡｋｉｎｅ）
１．変異体ＩＬ－１０サイトカインの発現および精製
改変型ｐＴＴ５ベクター（バイオベクター）にライゲーションされた変異体ＩＬ－１０のＤＮＡ配列は、２９３Ｔ細胞の発現のために最適化し合成（ジーンウィズ社、蘇州、中国）したものである。変異体ＩＬ－１０のＤＮＡのトランスフェクションを実施し、４～７日間のインキュベーションの後、変異体ＩＬ－１０を含有する上清を採集した。
ピキア・パストリスでの発現では、変異体ＩＬ－１０遺伝子を含む発現ベクターｐＰＩＣＺαＡを最適化し調製（ジーンウィズ社、蘇州、中国）した。変異体ＩＬ－１０のアミノ酸配列を配列番号１に記載した。発現ベクターｐＰＩＣＺα Ａを、プラスミド精製のために大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換した。次いで、ｐＰＩＣＺα Ａを、エレクトロポレーションによってＧＳ１１５に形質転換した。１００、３００、５００、１０００、１５００、２０００ｕｇ／ｍＬのゼオシン（商標）含有ＹＰＤプレート上で成長させた後に成長していたコロニーを得ることによって、形質転換されたコロニーを選択した。形質転換体を最終的に選択した後、組換えＧＳ１１５株を、バッフルフラスコにて激しい攪拌により、ＢＭＧＹ培地中３０℃で成長させてＯＤ６００値２～６とした。次いで、細胞を遠心分離によりペレットとし、ＢＭＭＹに再懸濁してＯＤ６００値１とし、異種タンパク質発現を誘導するために０．５％メタノールを毎日添加した。４日間の誘導後、分泌された変異体ＩＬ－１０タンパク質を含有する上清を、遠心分離により採集した。上清中の総タンパク質を、１０ｋＤａ分子量カットオフ膜を用いて限外濾過により濃縮した。濃縮されたタンパク質を、緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＢＩＳ－ＴＲＩＳ、０．０６５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）により２４時間超にわたって透析し、次いで、緩衝液Ａにより平衡化された陽イオン交換カラムにロードした。変異体ＩＬ－１０を、０．０６５～０．４Ｍの範囲の勾配濃度のＮａＣｌによりカラムから溶出し、溶出物を採集し濃縮した。濃縮された試料を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１００ ＨＲゲル濾過カラムにて、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４を溶出緩衝液として用いてさらに精製した。
２．Ｓ４８を変異体ＩＬ－１０へコンジュゲートし、それをＩＬ－１０ＴＭＥＡｋｉｎｅという名称で呼んだ（腫瘍の微小環境で活性化されＩＬ－１－サイトカイン）。
変異体ＩＬ－１０タンパク質を、上記に記載されたように生成して精製した。精製された変異体ＩＬ－１０を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中、濃度０．５ｍｇ／ｍＬとして実施した。ＴＣＥＰ溶液を変異体ＩＬ－１０にモル比１００：１で添加し、穏やかに振盪しながら４℃で４時間インキュベートした。次いで、変異体 ＩＬ－１０ 溶液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）により、４℃で４時間透析した。その後、Ｓ４８を直ちに変異体 ＩＬ－１０ 溶液にモル比２０：１で添加し、穏やかに振盪しながら２５℃で１６時間インキュベートした。残存するＳ４８を除去することによって、反応を停止した。酵素切断の前に、ＩＬ－１０ＴＭＥＡｋｉｎｅ緩衝液を、透析を介して酵素緩衝液に交換した。活性化のために、酵素をＩＬ－１０ＴＭＥＡｋｉｎｅ溶液に添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。
３．ＩＬ－１０Ｒ１またはＲ２との結合を遮断し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素切断後に結合活性を回復するＩＬ－１０ＴＭＥＡｋｉｎｅのスクリーニング
１ｕｇのＩＬ－１０Ｒ１－Ｆｃ／ＩＬ－１０Ｒ２－Ｆｃ／Ｈｉｓ溶液を含有する６０ｕＬのＰＢＳ緩衝液を、ウェルに分注した。シールテープをプレートの上部に貼り、プレートを４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、テープを取り外して、各ウェルを吸引した。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、２％ＢＳＡを含有する２００ｕＬのＰＢＳ緩衝液を各ウェルに分注することによってプレートをブロッキングし、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、６０ｕＬの系列希釈された試料を適切なウェルに添加した。プレートを室温で１．５時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、６０ｕＬの２ｕｇ／ｍＬ ＩＬ－１０ビオチン化抗体溶液を各ウェルに分注し、室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、次いで、６０ｕＬのストレプトアビジン溶液を各ウェルに分注した。プレートを室温で３０分間インキュベートした。３回洗浄した後、１００ｕｌのＨＲＰ基質溶液を各ウェルに分注し、プレートを３７℃で１５分間インキュベートした。発色を展開させた後、５０ｕＬの停止溶液を各ウェルに分注し、各ウェルの吸光度を直ちに波長４５０ｎｍで測定した。
４．様々なＩＬ－１０変異部位の概要
細胞表面のＩＬ－１０受容体は、２つの異なる形態を形成する：高親和性の受容体：ＩＬ－１０に対するＩＬ－１０Ｒ１（Ｋｄ＝５０～２００ｐＭ）および低親和性の受容体：ＩＬ１０に対するＩＬ－１０Ｒ２。低親和性の結合（Ｋｄ＝１０ｎＭ）ゆえに、結合親和性を回復するためのＲ４基に連結するのに用いる位置をスクリーニングするのは、抗体のＣＤＲ領域よりも容易である。Ｒ４にコンジュゲートされたＩＬ－１０は、Ｒ４ライブラリースクリーニングの化学修飾成熟により、いくつかの位置で＞８０％の結合を回復することができる。薬剤候補を選択するために、我々はまた、スクリーニング発現と、ＩＬ－１０Ｒ１およびＩＬ－１０Ｒ２を結合するドメイン内のＩＬ－１０の全アミノ酸とのＳ４８のコンジュゲーション反応を実施した。我々は、将来性のある薬剤候補を取得したので、結果を以下の表７３に示す。
５．ＢＡＬＢ／ＣマウスモデルにおいてＩＬ１０－Ｋ３４Ｃ－Ｓ４８が４Ｔ１腫瘍モデルに及ぼす有効性の試験
試験目的：４Ｔ１腫瘍モデルの治療のためのＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるＩＬ１０－Ｋ３４Ｃ－Ｓ４８の抗腫瘍の有効性を検討する。試験薬剤：ＩＬ１０－Ｋ３４Ｃ－Ｓ４８およびＩＬ－１０の注射剤であり、試験時にＰＢＳによって対応の濃度に希釈。
方法および結果：
１．動物：５週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウス、全て雌。
２．腫瘍モデルの作製
１）４Ｔ１細胞をアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入し、ＡＴＣＣにより提供された仕様書に従って識別した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培養溶液中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞を３日毎に継代し、１３継代以内の細胞を使用した。
２）腫瘍モデルの作製。４Ｔ１細胞をＢＡＬＢ／Ｃマウスの背中に皮下注射した。腫瘍が約１００ｍｍ３に成長した後、マウスを無作為に群分けし、薬剤治療を開始した。マウスを２８日目で麻酔後に殺した。
３）治療過程。各群に６頭の動物を含む３つの群があった。含めたのは、毎日治療された対照群、ならびに２つの単剤群（１ｍｇ／ｋｇ ＩＬ－１０で毎日治療、またはＩＬ－１０－Ｋ３４Ｃ－Ｓ４８で毎日（１ｍｇ／ｋｇ ＩＬ－１０に等しい用量）であった。
４）群分けおよび試験結果を表７４に示す。
５）結果および考察。表７４に示されるように、ＩＬ－１０に比べて、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの４Ｔ１腫瘍に及ぼされる完全な退縮が、ＩＬ１０－Ｋ３４Ｃ－Ｓ４８の注射後に大きく向上し、このことは、ＩＬ１０－Ｋ３４Ｃ－Ｓ４８が、優れた抗腫瘍有効性を４Ｔ１腫瘍モデルに呈することを示している。
腫瘍体積を週に２～３回モニタリングしたので、図４６に提示する。
実施例３１：異なる組織における標的化された活性化を行うための異なる各種Ｒ２の活性化効率
Ｒ１をＳ１３、Ｒ３をＲ３－５、Ｒ４をＲ４－７、かつＲ２を表７５に示される群のそれぞれとしたコンジュゲートの切断効率を、異なる組織で評価した。コンジュゲートをそれぞれ溶解し、１０回希釈して濃度０．１ｍＭ／ｍＬとした。３７℃で、コンジュゲートを１００μｇの各種酸性化ヒト腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ６．０）に濃度０．２ｍｇ／ｍＬで添加した。腫瘍組織ホモジネート中の酵素は、Ｒ１を放出することができた。放出されたＲ１をＨＰＬＣにより検出し、それによって、リンカーの活性化効率を比較した。結果を表７５に示した。
この結果によれば、複数の酵素によって活性化された、引き伸ばされたＲ２は、ＡＡＮよりも高い活性化を呈する。しかし、複数の酵素を用いた活性化は、心臓および肺の組織に示されたような安定性の問題を引き起こすことがある。
実施例３２：抗ＶＥＧＦ ＴＭＥＡｂｏｄｙ（ベバシズマブ）の生成および特性解析
ベバシズマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ００１１２）からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗ＶＥＧＦ ＴＭＥＡｂｏｄｙを特定した。抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ）の重鎖の変異位置は、Ｔｙｒ３２、Ａｓｎ３５、Ｔｙｒ５４、Ｔｙｒ６０、Ｌｙｓ６５、Ａｒｇ６６、Ｔｙｒ１０２、Ｔｙｒ１０３、およびＴｙｒ１０９からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ｓｅｒ２４、Ｓｅｒ２６、Ａｓｐ２８、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ４９、Ｔｈｒ５１、Ｔｙｒ９１、Ｓｅｒ９２、およびＴｈｒ９３からなる群から選択される。Ｈｉｓタグ付ＶＥＧＦタンパク質をＥＬＩＳＡに使用した。遮断効率が良く回復が良い選択された部位を表７６にまとめた。
実施例３３：抗ＣＤ２０ＴＭＥＡｂｏｄｙ（リツキシマブ）の生成および特性解析
ベバシズマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００７３）からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗ＣＤ２０ ＴＭＥＡｂｏｄｙを特定した。抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）の重鎖の変異位置は、Ｔｙｒ３２、Ａｓｎ３３、Ｔｙｒ５２、Ａｓｎ５５、Ｌｙｓ６３、Ｌｙｓ６５、Ｔｙｒ１０１、Ｔｙｒ１０２、およびＴｙｒ１０７からなる群から選択され；軽鎖の変異位置は、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２８、Ｔｙｒ３１、Ｔｙｒ４８、Ｔｈｒ５０、Ａｓｎ５２、Ｔｈｒ９１、およびＴｈｒ９６からなる群から選択される。Ｈｉｓタグ付ＣＤ２０タンパク質をＥＬＩＳＡに使用した。遮断効率が良く回復が良い選択された部位を表７７にまとめた。
実施例３４：薬剤候補についての各種Ｒ４およびＲ５の遮断および切断スクリーニング
標示されたコンジュゲーションにおけるコンジュゲートの遮断および切断効果を評価した。コンジュゲートをそれぞれ溶解し、１０回希釈して終濃度０．１ｍＭ／ｍＬとした。３７℃で、コンジュゲートを１００μｇのＭＤＡ－ＭＢ２３１ヒト腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ７）に濃度１ｍｇ／ｍＬで８時間添加した。コンジュゲートされ放出された生体分子を、ＥＬＩＳＡにより結合を検出し、それによってリンカーの活性化効率を比較した。結果を表７８に示した。
表７９に標示されたコンジュゲーションにおけるコンジュゲートの遮断および切断効果を評価した。コンジュゲートをそれぞれ溶解し、１０回希釈して終濃度０．１ｍＭ／ｍＬとした。３７℃で、コンジュゲートをＭＭＰ２（ｐＨ６）に濃度１ｍｇ／ｍＬで１６時間添加した。コンジュゲートされ放出された生体分子を、ＥＬＩＳＡにより結合を検出し、それによってリンカーの活性化効率を比較した。結果を表７９に示した。
標示されたコンジュゲーションにおけるコンジュゲートの遮断および切断効果を評価した。コンジュゲートをそれぞれ溶解し、１０回希釈して終濃度０．１ｍＭ／ｍＬとした。３７℃で、コンジュゲートを１００μｇのＭＤＡ－ＭＢ２３１酸性化ヒト腫瘍組織ホモジネート（ｐＨ６．５）に添加した。コンジュゲートされ放出された生体分子を、ＥＬＩＳＡにより結合を検出し、それによってリンカーの活性化効率を比較した。結果を表８０に示した。
この結果によれば、これらの薬剤候補は、標示された活性化条件で遮断効果および活性化効果を呈する。
実施例３５：ＣＴ２６腫瘍免疫モデルにおける、マウスＣＴＬＡ－４抗体とコンジュゲートされた標示のＳ２７、Ｓ３９、Ｓ４０、Ｓ４７、Ｓ４８、およびＳ６５の有効性に関する試験
試験目的：免疫治療のための、マウスＣＴＬＡ－４抗体とコンジュゲートされたＳ２７、Ｓ３９、Ｓ４０、Ｓ４７、Ｓ４８、およびＳ６５の抗腫瘍の有効性を検討する。
試験薬剤：マウスＣＴＬＡ－４抗体（９Ｄ９）にコンジュゲートされたＳ２７、Ｓ３９、Ｓ４０、Ｓ４７、Ｓ４８、およびＳ６５であり、全て２０ｍｇ／ｋｇ（ＣＴＬＡ－４抗体の等モル）で使用。
腫瘍モデルの作製：
１）ＣＴ２６細胞をＡＴＣＣから購入した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ培養溶液中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞を３日毎に継代し、１５継代以内の細胞を使用した。
２）腫瘍免疫。放射線照射により死滅させた５×１０５個のＣＴ２６がん細胞（ＡＴＣＣから購入）を、マウスに腹腔内注射した。マウスを２週間毎に１回、３回注射した。免疫後、マウスに腫瘍細胞を注射し、薬剤を４週間にわたって毎週投与した。
３）腫瘍の作製。３２日目に、１０６個の生きた肺腫瘍細胞を、主要により免疫されたＣ５７マウスの背中に皮下注射した。腫瘍が０．３～０．４ｃｍに成長した際に治療を始めた。
４）腫瘍のＣＤ８＋Ｔ細胞の分析。腫瘍組織を均一化し、腫瘍中の個々の細胞を濾過し、分離し、緩衝液で２回洗浄し、次いで、白血球共通抗原であるＣＤ４５－ＰＥおよびＣＤ８－ＦＩＴＣで標示された抗体と共に、周囲温度で１時間培養した。細胞を、１％ウシ胎児血清を含有するリン酸緩衝液により２回洗浄し、次いで、白血球共通抗原（ＣＤ４５）陽性細胞中のＴリンパ球抗原（ＣＤ８）陽性細胞の比率について、フローサイトメトリーにより分析した。比率の増分はＴリンパ球細胞の増加を標示するが、このことから、腫瘍に対する動物の免疫は向上していた。
５）群分けおよび試験結果を表８１に示す。
６）結果および考察。マウスＣＴＬＡ－４抗体にコンジュゲートされたＳ２７、Ｓ３９、Ｓ４０、Ｓ４７、Ｓ４８、およびＳ６５の治療効果は、対照群およびＷＴ ＣＴＬＡ－４抗体治療群に比べて大きく向上した。ＷＴ ＣＴＬＡ－４抗体はＷＴ ＣＴＬＡ－４抗体治療時に１頭の死亡を生じたが、それは高用量治療の毒性によって引き起こされた可能性がある。マウスＣＴＬＡ－４抗体にコンジュゲートされたＳ２７、Ｓ３９、Ｓ４０、Ｓ４７、Ｓ４８、およびＳ６５の治療効果は、優れた効果を示し、腫瘍組織中のＣＤ８／ＣＤ４５Ｔ細胞の比率を高めた。
実施例３６：ＲＡマウスモデルにおけるＳ２７、Ｓ４７、Ｓ４８、またはＳ６５にコンジュゲートされたアダリムマブ（配列番号２９）の有効性に関する試験
ヒトＴＮＦ／β－グロビン（ＴＮＦグロビン）組換え遺伝子構築物を用いて、ＴｇＴＣマウスを生成した。上記構築物は、ｈＴＮＦα遺伝子の全コード領域とプロモーターとを含む２．８ｋｂの断片を含有し、この断片は、ｈＴＮＦαの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびポリアデニル化部位に換えて、ヒトβ－グロビンのそれらを含む０．７７ｋｂ断片に融合されている。上記断片を、次いで、ＦＶＢ／Ｊ近交系統の受精卵の前核内にマイクロインジェクションした。最後に、注射された受精卵を、８週齢の雌の偽妊娠ＩＣＲマウスの卵管内に移植した。トランスジェニック創始個体をＦＶＢ／Ｊ近交系統と戻し交配することによって、トランスジェニック系統を確立した。ルーチンの尾部ジェノタイピングと同様に、ジェノタイピングをＰＣＲにより実施して、トランスジェニック動物をスクリーニングした。導入遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、
５’－ＧＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＡＴＧＴＴＡＡＣＣＡ－３’（フォワードプライマー、配列番号８７）；および
５’－ＴＴＣＡＡＴＣＣＣＣＡＡＡＴＣＣＴＡＧＣＣ－３’（リバースプライマー、配列番号８８）とした。
ＰＣＲ反応を以下のように実施した：９４℃を４分間；９５℃を３０秒間、５７℃を４０秒間、７２℃を４０秒間で３５サイクル；７２℃を１０分間。
生理食塩水に溶解された各種抗ｈＴＮＦα抗体（アダリムマブ２ｍｇ／ｋｇ）およびコンジュゲート抗体（２ｍｇ／ｋｇのアダリムマブの等モル）を、３週間から１０週間にわたって毎週、ＴｇＴＣマウスに腹腔内投与（２ｍｇ／ｋｇ）するとともに、生理食塩水で処置されたＴｇＴＣマウスを対照として供した。臨床評価 離乳後、毎週の体重および四肢全ての関節炎スコアを記録した。各脚（指、足根、および足首）についての関節炎の臨床的重症度を、０から３までに及びスコアを帰属させることによって定量し；１を僅かな赤みおよび／または腫脹；２を顕著な浮腫状の腫脹；３を関節の変形および強直とした。マウス当たりの関節炎スコアを四肢の平均とした。群分けおよび試験結果を表８２に示す。
結果は、Ｓ２７、Ｓ４７、Ｓ４８、およびＳ６５にコンジュゲートされたアダリムマブが、関節炎スコアを大きく低減したことを示した。
実施例３７：抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３二重特異性ＴＭＥＡｂｏｄｙ生成および特性解析
トラスツズマブの重鎖配列および軽鎖配列を、Ｄｒｕｇ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０００７２）からダウンロードし、部位スクリーニングを実施して、遮断効率の良い抗Ｈｅｒ２のｓｃＦｖ体を特定した。軽鎖の変異位置は、Ａｓｐ１、Ｇｌｎ３、Ｇｌｎ２７、Ａｓｐ２８、Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４９、Ｔｙｒ５５、Ａｒｇ６６、Ａｓｐ７０、およびＴｙｒ９２からなる群から選択される。軽鎖の変異位置は、Ａｒｇ１９、Ｌｙｓ３０、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３３、Ａｒｇ５０、Ｔｙｒ６２、Ａｓｎ５５、Ｔｙｒ５７、Ａｒｇ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｓｐ６２、Ｌｙｓ６５、Ａｓｐ１０２、およびＴｙｒ１０５からなる群から選択される。上記の選択された変異体のｓｃＦｖ体を、Ｃ末端の６Ｈｉｓタグと共にＨＥＫ２９３で発現し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムにより精製し、対応する化学リンカーにコンジュゲートした。結合ＥＬＩＳＡは、Ｈｉｓタグ付ヒトＨｅｒ２タンパク質を抗原として、抗ヒトカッパ鎖を二次抗体として用いて行った。遮断効率を表８４にまとめた。
我々は、選択されたシステイン変異（軽鎖内のＴｙｒ４９）を有する抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦｖを、Ｃ末端の６Ｈｉｓタグを含有する抗ヒトＣＤ３ ｓｃＦｖに融合して、腫瘍およびＴ細胞を標的とする二重特異性抗体を形成した。これらのＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性個体を、ＨＥＫ２９３細胞で生産し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムにより精製した。変異体を有するこれらのＨｅｒ２／ＣＤ３二重特異性抗体を、Ｓ４７にさらにコンジュゲートして、ヒトＨｅｒ２タンパク質に対する３８倍に減少した結合活性を得た。レグマインによる消化後、両方の結合活性が復活した。
単鎖のＨｅｒ２／ＣＤ３ ＴＭＥＡｂｏｄｙは、表８４に示されるように、抗Ｈｅｒ２ ｓｃＦＶと抗ＣＤ３またはそのｓｃＦｖとの融合タンパク質にＳ２７、Ｓ４７、またはＳ４８をコンジュゲートすることによって作製した。
我々は、ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体を変異体ＩＬ－２（ＩＬ２－Ｓ８７Ｃ）に融合して、標的腫瘍関連抗原のＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２ＴＭＥＡｋｉｎｅまたはＰＤ－１／ＩＬ－２ＴＭＥＡｋｉｎｅを形成した。
これらのＩＬ２－Ｔ４１Ｃ変異体を含むＴＭＥＡｋｉｎｅを、Ｓ４７にさらにコンジュゲートした。ヒトＩＬ－２Ｒβに対する＞１３５倍に減少した結合活性を得た。レグマインによる消化後、ＩＬ－２Ｒβとの両方の結合活性が復活した。変異体ＩＬ－２（ＩＬ－２Ｒαとの結合の変異体Ｓ８７Ｃ）に融合されたＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１抗体を、Ｓ４７にさらにコンジュゲートして、表８５に示されるようなレグマイン活性化型融合型ＴＭＥＡｋｉｎｅを得た。
ヒトＰＢＭＣ移入マウスモデルにおける毒性のｉｎ ｖｉｖｏ特性解析
試験目的：静脈内注射を介した融合型ＴＭＥＡｂｏｄｙの急性毒性を検討すること。
動物：体重１９～２１ｇの第１クラスのＳＣＩＤマウスであり、全てのマウスは雌である。
方法および結果：ＳＣＩＤマウスを体重に従って無作為に２１群に分け、各群１０頭のマウスとした。表８６に示されるように、マウスに、Ｄ１、Ｄ７、およびＤ１４を１回のみ、３０ｍｇ／ｋｇ（抗体の等モル）の用量で静脈内注射した。対照試験は、３０ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧを注射することによって実施した。連続した２１日間にわたって毎日、下記の行動：立毛、毛の乱れおよびくすみ、倦怠、前屈、ならびに易怒反応の有無について、動物を観察し、表８６に示されるように体重および死亡を記録した。
結果および考察：第２群、第３群、第１０群、および第１４群の３０ｍｇ／ｋｇを受けたマウスに、立毛、毛の乱れおよびくすみ、倦怠、前屈、易怒反応はなく、死亡が観察された。表８６に示されるように、融合タンパク質のＭＴＤは３０ｍｇ／ｋｇ未満であり、この濃度では毒性または死亡が観察される可能性がある。
ヒトＰＢＭＣ移入マウスモデルにおける毒性のｉｎ ｖｉｖｏ特性解析
試験目的：静脈内注射を介した融合型ＴＭＥＡｂｏｄｙの急性毒性を検討すること。
動物：体重１９～２１ｇの第１クラスのＳＣＩＤマウスであり、全てのマウスは雌である。
方法および結果：ＳＣＩＤマウスを体重に従って無作為に２１群に分け、各群５頭のマウスとした。表８８に示されるように、融合タンパク質ならびにＤ１、Ｄ７、およびＤ１４でＳ４７を含む融合タンパク質コンジュゲートを、マウスに、１回のみ、３０ｍｇ／ｋｇ（抗体の等モル）の用量で静脈内注射した。対照試験は、３０ｍｇ／ｋｇの生理食塩水を注射することによって実施した。連続した２１日間にわたって毎日、下記の行動：立毛、毛の乱れおよびくすみ、倦怠、前屈、ならびに易怒反応の有無について、動物を観察し、表８７に示されるように体重および死亡を記録した。
結果および考察：全ての群の融合型ＴＭＥＡｋｉｎｅの３０ｍｇ／ｋｇを受けたマウスに、立毛、毛の乱れおよびくすみ、倦怠、前屈、易怒反応はなく、死亡が観察された。しかし、Ｓ４７との融合後、毒性が低減した。
マウス腫瘍モデルにおける単鎖のＣＤ３－Ｈｅｒ２ ＴＭＥＡｂｏｄｙのｉｎ ｖｉｖｏ特性解析
動物モデルにおいて腫瘍を治療する際の単鎖のＣＤ３－Ｈｅｒ２ ＴＭＥＡｂｏｄｙのｉｎ ｖｉｖｏ有効性の特徴をさらに明らかにするために、単鎖のＣＤ３－Ｈｅｒ２ ＴＭＥＡｂｏｄｙ、ならびに単鎖のＣＤ３－Ｈｅｒ２抗体を、腫瘍異種移植片内に投与した。腫瘍異種移植片を発生させるために、３×１０６個のＫＰＬ－４細胞を、雌の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ベージュマウスの右側の最後から２番目の鼠径部の乳房の脂肪体内に、同所移植した。移植後、治療の開始前に、腫瘍を成長させた（ＫＰＬ４で２０日間）。ＫＰＬ－４腫瘍（１００ｍｍ３）を有するマウスを、試験期間にわたって、標示された薬剤（５週間、毎日１０ｍｇ／ｋｇ）により治療した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した。腫瘍体積阻害率を表８８にまとめた。結果は、単鎖のＣＤ３－Ｈｅｒ２ ＴＭＥＡｂｏｄｙが腫瘍の微小環境で活性化され、単鎖のＣＤ３－Ｈｅｒ２抗体の有効性を増強できることを意味していた。
表８８に示されるように、Ｈｅｒ２／ＣＤ３ＴＭＥＡｂｏｄｙによる腫瘍成長への阻害および治癒率は、Ｈｅｒ２／ＣＤ３ ｓｃＦｖまたはＨｅｒ２／ＣＤ３抗体により治療された群に比べると、同じモル濃度を用いることによって大きく向上した。ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２ＴＭＥＡｋｉｎｅまたは抗体による腫瘍成長への阻害および治癒率は、有効性を示し、マウスを治癒させる。しかし、ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２融合型抗体群では、毒性によりマウスの死亡が引き起こされた。

Claims (15)

  1. 以下の構造：
    Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５
    を有し、式中、
    Ｒ５は、１つまたは複数のシステイン残基が変異により導入された生体分子を表し；
    ｃｙｓは、Ｒ５に含まれるシステイン残基（複数可）を表し；
    Ｓは、前記システイン残基（複数可）の硫黄原子（複数可）を表し；
    Ｒ４は、Ｒ５に含まれるシステイン残基の硫黄原子を介してＲ５と共有結合している基であり；
    前記Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４は、以下の構造：


    のいずれかによって表され、
    式中、Ｒ１は、下記（１）または（２）にあるように規定される、
    生体分子のコンジュゲート。
    （１）Ｒ１は、ポリエチレングリコール－Ｃ１－５アルキルカルボニル、

    からなる群から選択され、
    式中、各Ｒは、少なくとも独立してＣ１－４アルキルであり；各ｎは、独立して１から３００００の範囲の整数、例えば１～１５０、１～５０、１～２０、または３～１２などであり；前記ポリエチレングリコールまたはｐｅｇｍは、４４から１３２０００の範囲の分子量を有するポリエチレングリコール、例えば１０００から５００００または１００００から３００００の分子量を有するポリエチレングリコールであり；ｍは、前記ポリエチレングリコールの分子量を表し；波線は、Ｒ２に連結しているＲ１の位置を標示する、
    （２）Ｒ１は：

    からなる群から選択される。
  2. 以下の構造：
    Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５
    を有し、式中、
    Ｒ５は、１つまたは複数のシステイン残基が変異により導入された生体分子を表し；
    ｃｙｓは、Ｒ５に含まれるシステイン残基（複数可）を表し；
    Ｓは、前記システイン残基（複数可）の硫黄原子（複数可）を表し；
    Ｒ４は、Ｒ５に含まれるシステイン残基の硫黄原子を介してＲ５と共有結合している基であり；
    前記Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４は、以下の構造：
    のいずれかによって表され、
    ｎは、１から３００００の範囲の整数、例えば１～３０００、１～５００、１～３００、１～２０、または５～１２の範囲の整数などである、
    生体分子のコンジュゲート。
  3. 以下の構造：
    Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４－Ｓ－ｃｙｓ－Ｒ５
    を有し、式中、
    Ｒ５は、１つまたは複数のシステイン残基が変異により導入された生体分子を表し；
    ｃｙｓは、Ｒ５に含まれるシステイン残基（複数可）を表し；
    Ｓは、前記システイン残基（複数可）の硫黄原子（複数可）を表し；
    Ｒ４は、Ｒ５に含まれるシステイン残基の硫黄原子を介してＲ５と共有結合している基であり；
    前記Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ４は：
    からなる群から選択される、生体分子のコンジュゲート。
  4. Ｒ５は、そのアミノ酸のうち１つまたは複数がシステインに変異されているタンパク質であり、Ｒ５は、前記システインのチオール基を介してＲ４に連結し；
    好ましくは、Ｒ５は、そのアミノ酸のうち１つまたは複数がシステインに変異されている抗体である、
    請求項１に記載の生体分子のコンジュゲート。
  5. Ｒ５は、抗体であり、前記変異は、抗体分子の可変領域の非相補性決定領域にあり；好ましくは、前記生体分子のコンジュゲートは、最終的にコンジュゲーションを介して２００超に増えた分子量を得た、請求項１に記載の生体分子のコンジュゲート。
  6. Ｒ５は、そのタンパク質配列のそのアミノ酸のうち１つまたは複数がシステインに変異されているサイトカインを表す、請求項４に記載の生体分子のコンジュゲート。
  7. Ｒ５は、抗体分子の可変領域の相補性決定領域に１つまたは複数の変異を有する抗体を表し、好ましくは、Ｒ５は、前記相補性決定領域のＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸残基のうち１つまたは複数がシステインに変異された抗体を表す、請求項４に記載の生体分子のコンジュゲート。
  8. Ｒ５は、抗体分子の可変領域の非相補性決定領域に１つまたは複数の変異を有する抗体を表し、好ましくは、Ｒ５は、前記非相補性決定領域のＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸残基のうち１つまたは複数がシステインに変異された抗体を表す、請求項４に記載の生体分子のコンジュゲート。
  9. 前記生体分子は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、およびＹからなる群から選択されるアミノ酸残基のうち１つまたは複数がシステインに変異されたサイトカインである、請求項６に記載の生体分子のコンジュゲート。
  10. Ｒ５は、抗体の可変領域の非相補性決定領域に１つまたは複数の変異を有する抗体、好ましくは、ＶＨの非相補性決定領域のＧｌｎ３、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｕ４６、Ｔｈｒ６８、Ａｓｐ７２、およびＶＬの非相補性決定領域のＴｈｒ５、Ｔｙｒ４９、Ａｒｇ６１、Ｓｅｒ６３、Ｓｅｒ６５、Ｓｅｒ６７、Ｔｈｒ７２、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７６、Ａｓｐ８２のうち１つまたは複数がシステインに変異された抗体を表す、請求項４に記載の生体分子のコンジュゲート。
  11. 変異前に、
    Ｒ５が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＰ、およびＴＲＡＩＬからなる群から選択される生体分子に相当するか；
    Ｒ５が、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ｂ－ＣＤ４０抗体、もしくは抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗補体Ｃ５抗体、抗ＲＳＶ－Ｆタンパク質，抗ＧＤ２抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗糖タンパク質受容体ｌｉｂ／Ｉｌｌａ抗体、抗ＩＬ２Ｒ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗インテグリンα４抗体、抗ｌｇＥ抗体、抗ＰＤＧＦＲａ抗体、抗ＲＡＮＫＬ抗体、抗ＳＬＡＭＦ７抗体、抗ＬＴＩＧＩＴ抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体からなる群から選択される抗体もしくはその機能性断片に相当するか；または
    Ｒ５が、ウトミルマブ、ウレルマブ、ＡＤＧ１０６、ポテリジオ（商標）（モガムリズマブ）、ベキサール（商標）（トシツモマブ）、ゼヴァリン（商標）（イブリツモマブ・チウキセタン）、リツキサン（商標）（リツキシマブ）、アーゼラ（商標）（オファツムマブ）、ガザイバ（商標）（オビヌツズマブ）、ベスポンサ（商標）（イノツズマブ・オゾガマイシン）、ゼナパックス（商標）（ダクリズマブ）、バリルマブ、セラリズマブ、アドセトリス（商標）（ブレンツキシマブ・ベドチン）、マイロターグ（商標）（ゲムツズマブ）、ダラザレックス（商標）（ダラツムマブ）、ＣＤＸ－１１４０、ＳＥＡ－ＣＤ４０、ＲＯ７００９７８９、ＪＮＪ－６４４５７１０７、ＡＰＸ－００５Ｍ、Ｃｈｉ Ｌｏｂ ７／４、キャンパス（商標）（アレムツズマブ）、ラプティバ（商標）（エファリズマブ）、ソリリス（商標）（エクリズマブ）、ヤーボイ（商標）（イピリムマブ）、トレメリムマブ、アービタックス（商標）（セツキシマブ）、ベクティビックス（商標）（パニツムマブ）、ポートラーザ（商標）（ネシツムマブ）、ＴｈｅｒａＣＩＭ（商標）（ニモツズマブ）、シナジス（商標）（パリビズマブ）、ユニツキシン（商標）（ジヌツキシマブ）、ＴＲＸ－５１８、ＭＫ－４１６６、ＭＫ－１２４８、ＧＷＮ－３２３、ＩＮＣＡＧＮ０１８６、ＢＭＳ－９８６１５６、ＡＭＧ－２２８、レオプロ（商標）（アブシキシマブ）、ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）、パージェタ（商標）（ペルツズマブ）、カドサイラ（商標）（Ａｄｏ－トラスツズマブ・エムタンシン）、ＧＳＫ－３３５９６０９、ＪＴＸ－２０１１、シムレクト（商標）（バシリキシマブ）、タイサブリ（商標）（ナタリズマブ）、ＢＭＳ－９８６０１６、ＲＥＧＮ３７６７、ＬＡＧ５２５、ゾレア（商標）（オマリズマブ）、タボリマブ、ＰＦ－０４５１８６００、ＢＭＳ－９８６１７８、ＭＯＸＲ－０９１６、ＧＳＫ－３１７４９９８、ＩＮＣＡＧＮ０１９４９、ＩＢＩ－１０１、キイトルーダ（商標）（ペムブロリズマブ）、オプジーボ（商標）（ニボルマブ）、ラルトルボ（商標）（オララツマブ）、テセントリク（商標）（アテゾリズマブ）、ＢＭＳ－９３６５５９、バベンチオ（商標）（アベルマブ）、イミフィンジ（商標）（デュルバルマブ）、プロリア（商標）（デノスマブ）、エムプリシティ（商標）（エロツズマブ）、ＭＴＩＧ７１９２Ａ、ＴＳＲ－０２２、ＭＢＧ－４５３、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、アバスチン（商標）（ベバシズマブ）、ルセンティス（商標）（ラニビズマブ）、サイラムザ（商標）（ラムシルマブ）、およびＪＮＪ－６１６１０５８８からなる群から選択される抗体もしくはその機能性断片に相当する、
    請求項４に記載の生体分子のコンジュゲート。
  12. ＩＬ２の変異位置が、Ｌｙｓ３２、Ｌｙｓ３５、Ｔｈｒ３７、Ｍｅｔ３９、Ｔｈｒ４１、Ｌｙｓ４３、Ｔｙｒ４５、Ｌｙｓ４８、Ｌｙｓ４９、Ｌｙｓ６４、Ｌｅｕ７２、Ａｌａ７３、Ｓｅｒ７５、Ｌｙｓ７６、Ｌｅｕ９４、Ｔｈｒ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｔｙｒ１０７、Ａｌａ１０８、Ｔｈｒ１１１、Ａｌａ１１２、Ｌｅｕ１２、Ｈｉｓ１６、Ｌｅｕ１９、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ２７、Ｓｅｒ７５、Ａｒｇ８１、Ｌｅｕ８５、Ｓｅｒ８７、およびＡｓｎ８８からなる群から選択されるか；または
    ＩＬ１０の変異位置が、Ｔｈｒ６、Ｓｅｒ８、Ｓｅｒ１１．Ｔｈｒ１３、Ｇｌｙ１７、Ａｒｇ２４、Ｓｅｒ３１、Ａｒｇ３２、Ｌｙｓ３４、Ｔｈｒ３５、Ｌｙｓ４０、Ｌｅｕ４６、Ｌｙｓ４９、Ｓｅｒ５１、Ｌｙｓ５７、Ｇｌｙ５８、Ｓｅｒ６６、Ｔｙｒ７２、Ｌｙｓ８８、Ｈｉｓ９０、Ｓｅｒ９３、Ｌｙｓ９９、Ｔｈｒ１００、Ａｒｇ１０４、Ｌｙｓ１１７、Ｓｅｒ１１８、Ｌｙｓ１１９、Ｌｙｓ１２５、Ｌｙｓ１３０、Ｌｙｓ１３４、Ｇｌｙ１３５、Ｔｙｒ１３７、Ｔｙｒ１４９、Ｔｈｒ１５５、Ｌｙｓ１５７、およびＡｒｇ１５９からなる群から選択されるか；または
    抗ＰＤ－１抗体ペムブロリズマブの重鎖の変異位置が、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ａｌａ１６、Ｓｅｒ１７、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｙｒ２７、Ｔｈｒ２８、Ｔｈｒ３０、Ａｓｎ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｔｙｒ３５、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ｇｌｙ４９、Ｇｌｙ５０、Ｉｌｅ５１、Ａｓｎ５２、Ｓｅｒ５４、Ａｓｎ５５、Ｇｌｙ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｌｙｓ６３、Ｌｙｓ６５、Ｔｈｒ６９、Ｌｅｕ７０、Ｔｈｒ７１、Ｔｈｒ７２、Ａｓｐ７３、Ｓｅｒ７４、Ｓｅｒ７５、Ｔｈｒ７６、Ｔｈｒ７７、Ｔｈｒ７８、Ａｌａ７９、Ｌｅｕ８３、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ａｒｇ９９、Ａｓｐ１００、Ｔｙｒ１０１、Ａｒｇ１０２、Ａｓｐ１０４、Ｇｌｙ１０６、Ｇｌｙ１１１、Ｇｌｙ１１３、Ｔｈｒ１１４、１１５Ｔｈｒ、１１７Ｔｈｒ、Ｓｅｒ１１９、Ｓｅｒ１２０、Ａｌａ１２１、Ｓｅｒ１２２、Ｔｈｒ１２３、Ｌｙｓ１２４、Ｇｌｙ１２５、およびＳｅｒ１２７からなる群から選択され；軽鎖の変異位置が、Ｉｌｅ２、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ａｌａ９、Ｔｈｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｌｅｕ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ａｌａ１９、Ｔｈｒ２０、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｌｙｓ２７、Ｇｌｙ２８、Ｓｅｒ３０、Ｔｈｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ｔｙｒ３４、Ｓｅｒ３５、Ｔｙｒ３６、Ｌｅｕ３７、Ｇｌｙ４５、Ａｌａ４７、Ｌｅｕ５０、Ｌｅｕ５１、Ｉｌｅ５２、Ｔｙｒ５３、Ｌｅｕ５４、Ａｌａ５５、Ｓｅｒ５６、Ｔｙｒ５７、Ｌｅｕ５８、Ｓｅｒ６０、Ｇｌｙ６１、Ａｌａ６４、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｓｅｒ６９、Ｇｌｙ７０、Ｓｅｒ７１、Ｇｌｙ７２、Ｔｈｒ７３、Ａｌａ７６、Ｔｈｒ７８、Ｓｅｒ８０、Ｓｅｒ８１、Ｓｅｒ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｌｅｕ９８、Ｌｅｕ１００、Ｔｈｒ１０１、Ｐｈｅ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｉｌｅ１１０、Ｌｙｓ１１１、およびＫ１３０からなる群から選択されるか；；または
    抗ＰＤ－１抗体ニボルマブの重鎖の変異位置が、Ｇｌｎ３、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ９、Ｇｌｙ１０、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１７、Ｌｙｓ２３、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｉｌｅ２７、Ａｓｎ３１、Ｔｈｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３２、Ｇｌｙ３３、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ａｌａ４９、Ｉｌｅ５１、Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５５、Ｓｅｒ５６、Ｌｙｓ５７、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ａｓｐ６２、Ｓｅｒ６３、Ｌｙｓ６５、Ｇｌｙ６６、Ｔｈｒ６９、Ｉｌｅ７０、Ｓｅｒ７１、Ａｒｇ７２、Ａｓｐ７３、Ａｓｎ７４、Ｓｅｒ７５、Ｌｙｓ７６、Ａｓｎ７７、Ｔｈｒ７８、Ｌｅｕ７９、Ｌｅｕ８１、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ａｌａ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｔｈｒ９８、Ａｓｎ９９、Ａｓｐ１００、Ａｓｐ１０１、Ｔｙｒ１０２、Ｇｌｙ１０４、Ｇｌｙ１０６、Ｔｈｒ１０７、Ｌｅｕ１０８、Ｔｈｒ１１０、Ｓｅｒ１１２、Ｓｅｒ１１３、Ａｌａ１１４、Ｓｅｒ１１５、Ｔｈｒ１１６、Ｌｙｓ１１７、Ｇｌｙ１１８、およびＳｅｒ１２０からなる群から選択され；軽鎖の変異位置が、Ｉｌｅ２、Ｌｅｕ４、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ａｌａ９、Ｔｈｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｌｅｕ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ａｌａ１９、Ｔｈｒ２０、Ｌｅｕ２１、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２８、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ３３、Ａｌａ３４、Ｔｙｒ３６、Ｇｌｙ４１、Ａｌａ４３、Ｌｅｕ４６、Ｌｅｕ４７、Ｉｌｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｓｐ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ａｓｎ５３、Ａｒｇ５４、Ａｌａ５５、Ｔｈｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｉｌｅ５８、Ａｌａ６０、Ａｒｇ６１、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｔｈｒ６９、Ｔｈｒ７２、Ｌｅｕ７３、Ｔｈｒ７４、Ｉｌｅ７５、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ｌｅｕ７８、Ａｌａ８４、Ｓｅｒ９１、Ｓｅｒ９２、Ａｓｎ９３，Ａｒｇ９６、Ｔｈｒ９７、Ｐｈｅ９８、Ｇｌｙ９９、Ｇｌｙ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｉｌｅ１０６、Ｌｙｓ１０７、Ｔｈｒ１０９、Ａｌａ１１１、Ａｌａ１１２、Ｓｅｒ１１４、Ｉｌｅ１１７、およびＳｅｒ１２１からなる群から選択されるか；
    抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブの重鎖の変異位置が、Ｇｌｎ３、Ａｒｇ１９、Ｌｅｕ２０、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｐｈｅ２７、Ｔｈｒ２８、Ｐｈｅ２９、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｈｒ３３，Ｍｅｔ３４，Ｈｉｓ３５、Ｇｌｙ４４、Ｐｈｅ５０、Ｉｌｅ５１、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ａｓｐ５４、Ｇｌｙ５５、Ａｓｎ５６、Ａｓｎ５７、Ｌｙｓ５８、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ｔｈｒ６９、Ｓｅｒ７１、Ａｒｇ７２、Ａｓｐ７３、Ａｓｎ７４、Ｓｅｒ７５、Ｌｙｓ７６、Ａｓｎ７７、Ｔｈｒ９９、Ｇｌｙ１００、Ｔｒｐ１０１、Ｌｅｕ１０２、Ｇｌｙ１０３、およびＰｒｏ１０４からなる群から選択され；軽鎖の変異位置が、Ｇｌｎ６、Ａｒｇ２４、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｎ２７、Ｓｅｒ２８、Ｖａｌ２９、Ｇｌｙ３０、Ｓｅｒ３１、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｉｌｅ４９、Ｔｙｒ５０、Ｇｌｙ５１、Ａｌａ５２、Ｐｈｅ５３、Ｓｅｒ５４、Ａｒｇ５５、Ａｌａ５６、Ｐｈｅ５３、Ｓｅｒ５４、Ａｒｇ５５、Ａｌａ５６、Ｔｈｒ５７、Ｇｌｙ５８、Ｉｌｅ５９，Ｐｒｏ６０、Ａｓｐ６１、Ａｒｇ６２、Ｓｅｒ６８、Ｇｌｙ６９、Ｔｈｒ７０、Ｇｌｎ９０、Ｇｌｎ９１、Ｔｙｒ９２、Ｇｌｙ９３、Ｓｅｒ９４、Ｓｅｒ９５，Ｐｒｏ９６、およびＴｒｐ９７からなる群から選択されるか；
    抗ＴＮＦα抗体重鎖の変異位置が、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ９、Ｇｌｙ１０、Ｌｅｕ１１、Ｇｌｙ１５、Ｓｅｒ１７、Ｌｅｕ１８、Ｌｅｕ２０、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｈｒ２８、Ａｓｐ３０、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３２、Ａｌａ３３、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ｓｅｒ４９、Ａｌａ５０、Ｉｌｅ５１、Ｔｈｒ５２、Ａｓｎ５４、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｙ５６、Ｉｌｅ５８、Ａｓｐ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｌａ６１、Ａｓｐ６２、Ｓｅｒ６３，Ｇｌｕ６５、Ｇｌｙ６６、Ｐｈｅ６８、Ｔｈｒ６９、Ｉｌｅ７０、Ｓｅｒ７１、Ａｓｐ７３、Ａｓｎ７４、Ａｌａ７５、Ｌｙｓ７６、Ｓｅｒ７８、Ｌｅｕ７９、Ｔｙｒ８０、Ｌｅｕ８１、Ｓｅｒ８５、Ｌｅｕ８６、Ａｌａ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｌｙｓ９８、Ｓｅｒ１００、Ｔｙｒ１０１、Ｌｅｕ１０２、Ｓｅｒ１０３、Ｔｈｒ１０４、Ａｌａ１０５、Ｓｅｒ１０６、Ｓｅｒ１０７、Ｌｅｕ１０８、Ａｓｐ１０９、Ｔｙｒ１１０、Ｇｌｙ１１２、Ｇｌｙ１１４、Ｔｈｒ１１５、Ｌｅｕ１１６、Ｔｈｒ１１８、Ｓｅｒ１２０、Ｓｅｒ１２１、Ａｌａ１２２、Ｓｅｒ１２３、およびＴｈｒ１２４からなる群から選択され；軽鎖の変異位置が、Ａｓｐ１、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ９、Ｓｅｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ａｌａ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ｔｈｒ２０、Ｉｌｅ２１、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｇｌｎ２７、Ｇｌｙ２８、Ｉｌｅ２９、Ａｒｇ３０、Ａｓｎ３１、Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ３３、Ａｌａ３４、Ｔｙｒ３６、Ｌｙｓ３９、Ｇｌｙ４１、Ｌｙｓ４２、Ａｌａ４３、Ｌｅｕ４８、Ｌｅｕ４７、Ｉｌｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｌａ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ｔｈｒ５３、Ｌｅｕ５４、Ｇｌｎ５５、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｓｅｒ６０、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｔｈｒ６９、Ａｓｐ７０、Ｔｈｒ７２、Ｌｅｕ７３、Ｔｈｒ７４、Ｉｌｅ７５、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ｌｅｕ７８、Ａｌａ８４、Ｔｈｒ８５、Ｔｙｒ９１、Ａｓｎ９２、Ａｒｇ９３、Ａｌａ９４、Ｔｙｒ９６、Ｔｈｒ９７、Ｐｈｅ９８、Ｇｌｙ９９、Ｇｌｙ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｉｌｅ１０６、Ｌｙｓ１０７、Ｔｈｒ１０９、およびＡｌａ１１１からなる群から選択されるか；
    抗ＣＤ２８抗体の重鎖の変異位置が、Ｓｅｒ７、Ｇｌｙ８、Ｇｌｙ１５、Ａｌａ１６、Ｓｅｒ１７、Ｓｅｒ２１、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ｔｙｒ２７、Ｔｈｒ２８、Ｔｈｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ａｌａ４０、Ｇｌｙ４２、Ｇｌｙ４４、Ｇｌｙ４９、Ｔｙｒ５２、Ｇｌｙ５４、Ｔｈｒ５８、Ａｌａ６８、Ｔｈｒ６９、Ｔｈｒ７１、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７５、Ｓｅｒ７７、Ｔｈｒ７８、Ａｌａ７９、Ｓｅｒ８４、Ｌｅｕ８６、Ｓｅｒ８８、Ｔｈｒ９１、Ａｌａ９２、Ｔｈｒ９７、Ｓｅｒ９９、Ｔｙｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｌｅｕ１０３、Ｇｌｙ１１３、Ｔｈｒ１１４、Ｔｈｒ１１５、Ｔｈｒ１１７、Ｓｅｒ１１９、Ｓｅｒ１２０、Ａｌａ１２１、Ｓｅｒ１２２、およびＴｈｒ１２３からなる群から選択され；軽鎖の変異位置が、Ｔｈｒ５、Ｓｅｒ７、Ｓｅｒ９、Ｓｅｒ１０、Ｓｅｒ１１、Ｓｅｒ１２、Ａｌａ１３、Ｓｅｒ１４、Ｇｌｙ１６、Ｔｈｒ２０、Ｔｈｒ２２、Ａｌａ２５、Ｓｅｒ２６、Ｓｅｒ２７、Ｉｌｅ２９、Ｔｙｒ３０、Ａｌａ４３、Ｌｅｕ４６、Ｌｅｕ４７、Ｔｙｒ４９、Ｌｙｓ５０、Ａｌａ５１、Ｓｅｒ５２、Ｌｅｕ５４、Ｔｈｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｓｅｒ６０、Ｓｅｒ６３、Ｇｌｙ６４、Ｓｅｒ６５、Ｇｌｙ６６、Ｓｅｒ６７、Ｇｌｙ６８、Ｔｈｒ６９、Ａｓｐ７０、Ｔｈｒ７２、Ｔｈｒ７４、Ｓｅｒ７６、Ｓｅｒ７７、Ａｌａ８４、Ｔｈｒ８５、Ｇｌｙ９１、Ｔｈｒ９３、Ｔｙｒ９４、Ｔｙｒ９６、Ｔｈｒ９７、Ｐｈｅ９８、Ｇｌｙ９９、Ｇｌｙ１００、Ｇｌｙ１０１、Ｔｈｒ１０２、Ｔｈｒ１０９、およびＡｌａ１１１からなる群から選択されるか；
    抗４－１ＢＢ抗体の重鎖の変異位置が、Ｔｈｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｓｅｒ３５、Ｌｙｓ５０、Ｔｙｒ５２、Ａｓｐ５５、Ｓｅｒ５６、Ｔｙｒ５７、Ｔｈｒ５８、Ａｓｎ５９、Ｔｙｒ６０、Ｓｅｒ６１、Ｇｌｎ６５、Ｇｌｙ６６、Ｇｌｙ９９、Ｔｙｒ１００、Ｇｌｙ１０１、Ａｓｐ１０４、およびＴｙｒ１０５からなる群から選択され；軽鎖の変異位置が、Ｓｅｒ２３、Ｇｌｙ２４、Ａｓｐ２５、Ａｓｎ２６、Ｇｌｙ２８、Ａｓｐ２９、Ｇｌｎ３０、Ｔｙｒ３１、Ｇｌｎ４９、Ａｓｐ５０、Ｌｙｓ５１、Ａｓｎ５２、Ａｒｇ５３、Ｓｅｒ５５、Ｇｌｙ５６、Ｔｈｒ８９、Ｔｙｒ９０、Ｔｈｒ９１、Ｇｌｙ９２、Ｇｌｙ９４、およびＳｅｒ９５からなる群から選択されるか；または
    抗Ｈｅｒ２抗体の重鎖の変異位置が、Ａｒｇ１９、Ｌｙｓ３０、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３３、Ａｒｇ５０、Ｔｙｒ６２、Ａｓｎ５５、Ｔｙｒ５７、Ａｒｇ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｓｐ６２、Ｌｙｓ６５、Ａｓｐ１０２、およびＴｙｒ１０５からなる群から選択され；軽鎖の変異位置が、Ａｓｐ１、Ｇｌｎ３、Ｇｌｎ２７、Ａｓｐ２８、Ａｓｎ３０、Ｔｙｒ４９、Ｔｙｒ５５、Ａｒｇ６６、Ａｓｐ７０、およびＴｙｒ９２からなる群から選択されるか、
    抗ＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブの重鎖の変異位置が、Ｇｌｎ３、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ５４、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ａｓｐ６２、Ｌｙｓ６５、Ａｓｐ７３、Ｌｙｓ７６、Ａｓｎ７７、およびＡｒｇ９９からなる群から選択され；軽鎖の変異位置が、Ａｒｇ２４、Ｇｌｎ２７、Ａｓｐ２８、Ｔｙｒ４９、Ｔｙｒ５５、Ａｓｐ７０、Ｇｌｎ８９、Ｇｌｎ９０、Ｔｙｒ９１、およびＴｙｒ９３からなる群から選択される、
    請求項１１に記載の生体分子のコンジュゲート。
  13. Ｒ５は、システイン変異されている１つまたは複数のアミノ酸残基を含有する融合タンパク質であり；
    好ましくは、前記融合タンパク質は、抗体の抗原結合性ドメインと、任意選択的にサイトカインとを含有し；好ましくは、前記融合タンパク質は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＣＤ２２、ＣＤ３、ＴＲＯＰ２、糖タンパク質ＮＭＢ、グアニル酸シクラーゼＣ、ＣＥＡ、ＣＤ７９ｂ、ＰＳＭＡ、ＥＮＰＰ３、メソテリン、ＣＤ１３８、ＮａＰｉ２ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＦＯＬＲ１、ＤＬＬ３、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ１４２、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２５、ＳＬＴＲＫ６、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＡＧＳ－２２、Ｃ４．４Ａ、ＦＧＦＲ２、Ｌｙ６Ｅ、ＭＵＣ１６、ＢＣＭＡ、ｐカドヘリン、エフリン－Ａ、ＬＡＭＰ１、ＭＵＣ１、ＣＤ１９、ＰＤＬ１、ＨＥＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＢＣＭＡ、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＲＯＲ１、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１７４、ＣＤ３０、ＣＤ１３３、ｃＭｅｔ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＬｅｗｉｓＹ、メソテリン、ＳＳ１、ＣＥＡ、ＣＤ１７１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＵＣ－１、およびＭＡＧＥ－Ａ３からなる群から選択される抗原に対する抗原結合性ドメインを含有する二重特異性抗体であり；好ましくは、前記二重特異性抗体は、単鎖の二重特異性抗体であり；
    好ましくは、前記融合タンパク質は、抗体の抗原結合性ドメインと、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＴＲＡＰ、およびＴＲＡＩＬからなる群から選択されるサイトカインとを含有し；好ましくは、前記融合タンパク質は、抗ＰＤ－ｌ抗体とＩＬ２との融合タンパク質である、
    請求項１に記載の生体分子のコンジュゲート。

  14. からなる群から選択される化合物。
  15. 以下の構造：



    のいずれかによって表され、
    式中、サイトカインおよび抗体は、配列番号１～８３のいずれかからなる群から選択される、
    生体分子のコンジュゲート。
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