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JP7159304B2 - 腫瘍および／または癌の処置のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス、医薬組成物、およびそれらの使用 - Google Patents

腫瘍および／または癌の処置のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス、医薬組成物、およびそれらの使用 Download PDF

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Description

本開示は、バイオテクノロジーの分野に、特に、腫瘍および／または癌の処置のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス、医薬組成物、およびそれらの使用に関する。
２０１３年１月に世界保健機関ウェブサイトで公開された人口の死因についての最新の報告に従うと、約７６０万人が２００８年に癌で死んだ。これらは世界のトータルの死の１３％を占めており、この数は毎年急速に増加している。この数は２０３０年までに１３１０万を超えるであろうということが見積もられている。中国では、悪性腫瘍の発生率は年あたり３％から５％の率で増大している。２００２年に、中国における悪性腫瘍の新たなケースの数は２１９万に達した。２０２０年までに、新たな患者数は毎年３００万を超えるであろう。癌は世界の抜きん出た死因の１つになっている。その上、腫瘍の処置は今日の医療分野の重点かつ難点になっており、増々多くの注目を受けている。
腫瘍発生は多因子かつ多ステップのプロセスである。主な理由は、細胞が外的な発癌性因子（物理的な放射線、化学物質、およびウイルスなどを包含する）によって刺激され、細胞が損傷し、細胞内のＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの遺伝子材料が変化を生じ、さらに細胞内のシグナル変換経路の異常および乱れを引き起こし、細胞が狂った増殖を示し、アポトーシスに抵抗し、分化を停止し、組織侵入および移動の能力を備え、最終的に、人体の重要な臓器の機能に影響して生命を脅かすことである。今のところ、腫瘍の主な処置方法は外科治療、放射線治療、化学療法、生物学的治療、および免疫療法を包含する。これらの方法はいくらかの程度までは腫瘍をコントロールすることを助け得るが、それらはなお問題を根本的には解決し得ない。
腫瘍溶解性ウイルス治療もまた生物学的治療の分野に属する。腫瘍溶解性ウイルスの研究は１９５０年代まで遡り得る。当時、ある子宮頚癌患者が狂犬病ウイルスに感染した後に腫瘍退縮を有することが見いだされた。いくつかの癌患者では腫瘍はそれらがウイルスに感染した後で自然寛解したという現象を受けて、腫瘍溶解性ウイルスの研究の第一波の盛り上がりはここから始まった。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞に感染した後に標的細胞内で選択的に複製し、最終的には腫瘍細胞が溶解し死ぬことを引き起こし得るウイルスのクラスを言う。この型のウイルスは、それらの特異性に依拠して腫瘍細胞内で複製して腫瘍細胞を溶解し、細胞溶解後に放出されるウイルスはさらに周辺の腫瘍細胞に感染し得る。同時に、それらは、正常細胞および組織には損傷効果を有さないかまたは小さめに影響する。腫瘍溶解性ウイルスは通常は２つのクラスに分けられ得る。１つのクラスは野生型ウイルスおよび天然に変異した弱毒ウイルス株であり、かかるウイルス、例えばレオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、および自律複製するパルボウイルスなどは、ある種の腫瘍細胞に対する親和性を天然に有する。これらのウイルスはある種の腫瘍細胞内で増幅し細胞を溶解し得、天然の特異的な腫瘍溶解活性を有する。もう１つのクラスは、ウイルスゲノムが遺伝子操作された後にのみ腫瘍細胞内で複製し得るウイルスである。今のところ、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、およびヒトワクシニアウイルスが遺伝子操作されている。腫瘍溶解性ウイルスとしてのアデノウイルスの研究は相対的に早く、腫瘍溶解メカニズムは相対的にはっきりしている。さらにその上、アデノウイルス５型の研究はアデノウイルスのなかでもよりはっきりしている。アデノウイルスが発見されて間もなく、それは頭頸部悪性物を処置するために用いられた。アデノウイルスの注射後に、腫瘍は異なる程度に縮小したが、腫瘍は処置後に再発しがちであり、効果は維持することが困難であった。１９９６年までに、ビショフらは、Ｅ１Ｂの一部を除去された組換え体アデノウイルスＯｎｙｘ－０１５がｐ５３異常の腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍殺傷を引き起こし得るということを最初に報告した。腫瘍溶解性アデノウイルス研究はもう一度広範な注目を受けており、急速に発展している。よって、多くの新たな型の腫瘍溶解性アデノウイルスが現れている。２００６年に、中国は、上海三維生物技術有限公司によって開発されたヒト組換え体アデノウイルス５型Ｈ１０１（Ｅ１Ｂ５５ＫおよびＥ３遺伝子を削除された腫瘍溶解性アデノウイルス）を承認した（ＮＤＡ：国薬准字Ｓ２００６００２７）。このヒト組換え体アデノウイルスはｐ５３変異体腫瘍細胞内で特異的に複製し、腫瘍細胞を溶解し得る。腫瘍溶解性アデノウイルスは日増しに悪性腫瘍の処置のための新たな方法になっている。
加えて、腫瘍免疫療法もまた腫瘍との戦いにおける非常に重要な手段である。それは主に抗体治療、Ｔ細胞療法、および腫瘍ワクチンを包含する。抗体は癌の新たな創薬標的と呼ばれる。それらは、腫瘍の周りの免疫細胞を標的化することによってエフェクター細胞を活性することを助け、より有効な抗腫瘍免疫を促進し得る。それらは、補体依存的な細胞傷害性によってまたは腫瘍細胞アポトーシスを誘導することによってもまた腫瘍細胞を殺傷し得る。Ｔ細胞療法は、インビトロで拡大培養された腫瘍特異的な自家Ｔ細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ）を体に静脈内投与する方法である。腫瘍ワクチン療法は、体の免疫系を制御することによって特異的抗体およびエフェクターＴ細胞を産生する方法であり、これは特異的能動免疫療法ともまた呼ばれる。大量の臨床実験が、腫瘍免疫療法は腫瘍の処置に非常に有益な効果を有するということを証明しているが、腫瘍免疫療法の最も困難な問題は腫瘍の逃避である。腫瘍の免疫逃避メカニズムと腫瘍に対する体の免疫応答との間には非常に込み入った関係性がある。腫瘍免疫療法のプロセスでは、腫瘍特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が早い段階で活性化され、腫瘍がより後の段階まで成長するとそれらの殺傷機能を失う。通常は、第１のシグナルに加えて、Ｔ細胞活性化は一連の共刺激分子が第２のシグナルを提供することを要求し、それによって初めてＴ細胞が生理的な活性化の閾値に達し、正常な免疫応答を生ずるようにさせることができる。第１のシグナルは、ＡＰＣによって提示されるＭＨＣ－抗原ペプチドを介して抗原特異的なＴ細胞に提供される。共刺激分子によって提供される第２のシグナルが不在である場合には、それはＴ細胞の不応性または特異的な免疫寛容性に、およびアポトーシスにさえも至るであろう。よって、正および負の共刺激シグナルとそれらの間のバランスとの制御は、体の免疫応答のプロセス全体において重要な制御的役割を発揮する。
腫瘍および／または癌の免疫療法では、より有効な処置レジメンおよびそのために開発された医薬の必要がなおある。
当分野の上述の問題を解決するために、本開示は、腫瘍および／または癌の処置のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス、医薬組成物、およびそれらの使用を提供する。
具体的には、本開示は次を提供する。
（１） 単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムは、腫瘍細胞によるＰＤＬ１の発現を阻害することができる外来性のｓｈＲＮＡのコード配列をインテグレーションされる。
（２） （１）に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、外来性のｓｈＲＮＡのコード配列は配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りである。
（３） （１）に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはＥ１Ｂ１９Ｋ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子、およびＥ３領域の全ての遺伝子を欠失する。
（４） （１）または（３）に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはＥ１Ａ遺伝子のコード配列を含み、好ましくは、Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列はＣＭＶプロモーターのコントロール下にある。
（５） （１）に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスはアデノウイルス５型を遺伝子改変することによって得られる。
（６） 医薬組成物であって、医薬組成物は、活性成分としての（１）から（５）のいずれか１つに従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む。
（７） （６）に従う医薬組成物であって、医薬組成物は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを５×１０７から５×１０１２ｖｐ／日の範囲である用量で含む。
（８） （６）に従う医薬組成物であって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与されるように製剤される。
（９） （１）から（５）のいずれか１つに従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを調製するためのベクターであって、ベクターはプロモーターのコントロール下の外来性のｓｈＲＮＡのコード配列を含有し、ｓｈＲＮＡのコード配列は配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りである。
（１０） （９）に従うベクターであって、ベクターはｐＳｈｕｔｔｌｅを基本バックボーンとして用い、基本バックボーンは、作動可能に連結された外来性のｓｈＲＮＡのコード配列の発現をコントロールするプロモーター、外来性のｓｈＲＮＡのコード配列、Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列の発現をコントロールするプロモーター、およびＥ１Ａ遺伝子のコード配列を順に含む。
（１１） （９）または（１０）に従うベクターを含む宿主細胞。
（１２） （１１）に従う宿主細胞であって、宿主細胞はベクターを安定発現する。
（１３） 単離されたｓｈＲＮＡであって、ｓｈＲＮＡのコード配列は配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りであり、ｓｈＲＮＡは腫瘍細胞によるＰＤＬ１の発現を阻害することができる。
（１４） 腫瘍および／または癌の処置のための医薬の調製のための、（１）から（５）のいずれか１つに従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの使用。
（１５） （１４）に従う使用であって、腫瘍および／または癌は肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌を包含する。
（１６） 腫瘍および／または癌を処置するための方法であって、（１）から（５）のいずれか１つに従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを腫瘍および／または癌患者に投与することを含む。
（１７） （１６）に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは、５×１０７から５×１０１２ｖｐ／日の範囲である用量で、１日１回または２回、連続１から７日に渡って与えられる。
（１８） （１６）に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与される。
（１９） （１６）に従う方法であって、腫瘍および／または癌は肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌を包含する。
（２０） 単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはＥ１Ｂ１９Ｋ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子、およびＥ３遺伝子領域の全ての遺伝子を欠失し、好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはＥ１Ａ遺伝子のコード配列を含み、より好ましくは、Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列はＣＭＶプロモーターのコントロール下にある。
本発明は先行技術と比較して次の利点および有益な効果を有する。
本発明は、Ｅ１Ｂ１９Ｋ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子、および全てのＥ３遺伝子のコード領域を腫瘍溶解性アデノウイルスから欠失させることと、同時に、腫瘍溶解性アデノウイルスが外来性のｓｈＲＮＡのコード配列を保有するようにさせ、それによって、もたらされる組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞内で選択的に複製しかつ腫瘍細胞によるＰＤＬ１発現を阻害することができるｓｈＲＮＡを発現するようにさせることとを最初に提案する。この概念によって提供される腫瘍溶解性アデノウイルスは優れた腫瘍殺傷効果を有し、正常細胞内でのその複製能力は腫瘍細胞内でのものよりもかなり低く、その結果、正常細胞に対するその毒性は低く、その安全性は改善された。加えて、腫瘍細胞によるＰＤＬ１蛋白質の発現レベルはウイルスが発現するｓｈＲＮＡによって顕著に縮減され得、よって、Ｔリンパ球に対する腫瘍細胞の免疫抑制は縮減された。結果として、ＴおよびＮＫリンパ球の抗腫瘍免疫殺傷効果は強化された。本発明は、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解殺傷効果とＴまたはＮＫリンパ球の抗腫瘍免疫刺激効果との相乗効果が、腫瘍溶解性アデノウイルスにｓｈＲＮＡコード配列をインテグレーションすることによって達成され得るということをもまた見いだした。
加えて、本発明の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは腫瘍細胞内で選択的に複製し、同時に、腫瘍細胞によるＰＤＬ１の発現を阻害することができるｓｈＲＮＡを発現するので、免疫細胞（Ｔリンパ球およびＮＫ細胞を包含する）の抗腫瘍免疫効果は強化された。よって、体の抗腫瘍免疫応答は相乗的に刺激され得、それゆえに、本発明の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスはＮＫ細胞と共に用いられ得る。本発明の概念に基づいて提供される医薬組成物および方法は、腫瘍細胞内で選択的に複製し、および腫瘍細胞を殺傷し、さらに体の爾後の免疫応答を引き起こす組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの役割を充分に発揮し、同時に、腫瘍細胞を殺傷するＮＫ細胞の機能をもまた充分に発揮する。組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞内で選択的に複製し得るという利点もまた巧妙に利用され、その結果、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを含有する腫瘍細胞がＮＫ細胞の特異的標的になるようにした。これは、さらに、腫瘍殺傷機能の改善された相乗効果をもたらす。
さらにその上、本開示に従う研究によって、組み合わせ治療にとって最も良好な相乗効果を達成し、同時に相互の制約を回避するような、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞のそれぞれの用量レベル、それらの投与順序、および投与間隔が提供され、それによって腫瘍および／または癌のための有効な処置を提供した。
定義
本願において用いられる用語「腫瘍」、「癌」、「腫瘍細胞」、および「癌細胞」は、当分野において通常認識される意味を包摂する。
本願において用いられる用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍細胞を溶解し得るウイルスを言う。
本願において用いられる用語「治療有効量」は、検出測定可能な治療もしくは阻害効果を見せるかまたは抗腫瘍応答を誘起するために有用な機能性薬剤または医薬組成物の量を言う。効果は当分野において公知のいずれかのアッセイ方法によって検出測定され得る。
本願において用いられる用語「投与する」または「投与」は、化合物、複合物、または組成物（ウイルスおよび細胞を包含する）を対象に提供することを言う。
本願において用いられる用語「患者」はヒトまたは非ヒト生物を言う。それゆえに、本願に記載される方法および組成物はヒトおよび獣類の疾患両方に適用可能である。ある種の実施形態では、患者は腫瘍を有する。いくつかのケースでは、患者は同時に１つ以上の型の癌に罹患し得る。
本願において用いられる用語「相乗効果」は、それらの個々の効果の合計よりも多大な効果を生ずる２つ以上の薬剤から生起する効果を言う。
本願において用いられる用語「ｐｆｕ」または「プラーク形成単位」はプラークを形成するウイルス数を言う。
本願において用いられる用語「ＶＰ」はウイルス粒子数を言う。
本願において用いられる用語「ＶＰ／ｋｇ」は患者の体重のキログラムあたりのウイルス粒子数を言う。
本願において用いられる用語「ＴＣＩＤ５０」は５０％培養組織感染量を表し、培養細胞の５０％において感染に至り、細胞変性効果を引き起こすウイルス用量を言う。
本願において用いられる用語「ＭＯＩ」または「多重感染度」は、ウイルス数および細胞数の間の比、すなわち細胞あたりのウイルス感染を開始するために用いられるウイルス粒子数を言う。ＭＯＩ＝ｐｆｕ／細胞数、すなわち細胞数×ＭＯＩ＝トータルのＰＦＵ。
図１は、ＰＣＲによって増幅されたアデノウイルス５型のＥ１Ａ遺伝子のゲル電気泳動像を示している。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーであり、レーン１はＨ１０１ゲノムＤＮＡ鋳型から増幅されるＰＣＲ産物である。 図２は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａプラスミドの陽性クローンのＰＣＲスクリーニング結果を示している。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーであり、レーン１～３は候補クローンである。 図３は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａプラスミドの構築プロセスおよび構築されたプラスミドのマップを示している。 図４は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１ＡプラスミドからＰＣＲによって増幅されるＥ１Ａ発現カセットの略図（左）およびゲル電気泳動像（右）を示している。レーンＭはＤＮＡ分子量マーカーであり、レーン１～２はＰＣＲ産物である。 図５はｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａプラスミドの候補のＰＣＲスクリーニング結果を示している。レーンＭは分子量マーカーであり、レーン１～１３は候補プラスミドであり、レーンＮＣはＰＣＲ系の負のコントロールであり（すなわち、水を鋳型として用いることによって増幅されたＰＣＲ産物）、レーンＰＣはＰＣＲ系の正のコントロールである（すなわち、鋳型は目当ての断片を含有するｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１ＡプラスミドＤＮＡである）。 図６は、ＢｇｌＩＩによる消化後のｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａプラスミドの候補の鑑定結果を示している。レーンＭは分子量マーカーであり、サンプル１～３は候補プラスミドであり、各サンプルは２つのレーンを有する。レーンＮは未消化の候補プラスミドであり、レーンＢはＢｇｌＩＩによる消化後の候補プラスミドである。 図７は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａプラスミドの構築プロセスおよび構築されたプラスミドのマップを示している。 図８は、Ｕ２５１およびＨ４６０細胞のヒトＰＤＬ１のｍＲＮＡに対する本開示の実施形態に従う３種類のｓｈＰＤＬ１の阻害効果を示している。横軸は、Ｕ２５１およびＨ４６０細胞が４種類のｓｈＲＮＡによって処置された２４ｈおよび４８ｈ後に採集された細胞サンプルの４つの群を表し、縦軸は、細胞がコントロールｓｈＲＮＡによって処置された後の細胞のＰＤＬ１のｍＲＮＡの発現レベルに対して、細胞が各ｓｈＲＮＡによって処置された後の細胞のＰＤＬ１のｍＲＮＡの発現レベルの比を表す。 図９は、２９３Ｔ細胞の外来性のｈＰＤＬ１発現に対する本開示の実施形態に従う３種類のｓｈＰＤＬ１の阻害効果を示している。左図はウエスタンブロットの結果であり、これは、異なるｓｈＰＤＬ１による処置後の細胞サンプルのｈＰＤＬ１（ＦＬＡＧタグを包含する）発現の変化および細胞の細胞内蛋白質参照β－アクチンの発現を示している。右図は、ウエスタンブロットの結果に基づいて、細胞内蛋白質参照β－アクチンを正規化参照として用いてｈＰＤＬ１バンドのグレースケールスキャン値を示している。横軸は、サンプルが異なるｓｈＰＤＬ１によって処置された後の２９３細胞サンプルの群を表す。「コントロール」は、ｈＰＤＬ１（ＦＬＡＧタグを含有する）を発現するｐｃＤＮＡ３．３－ｈＰＤＬ１－ＦＬＡＧのみをトランスフェクションしたコントロール群を指す。縦軸はβ－アクチンによって正規化した標的蛋白質のグレースケールスキャン値である。 図１０は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａプラスミドの構築プロセスおよび構築されたプラスミドのマップを示している。 図１１は消化後のｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａプラスミドの鑑定結果を示している。レーンＭは分子量マーカーであり、レーンＣはＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによる消化後のコントロールプラスミド（ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａ）であり、レーン１～７はＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによる消化後の候補プラスミドである。 図１２は、ＢＪ５１８３細菌におけるｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１ＡプラスミドおよびｐＡｄＥａｓｙ－１の間の相同組換えプロセスの略図を示している。 図１３は、ｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａプラスミドの構築過程におけるｐＳｈｕｔｔｌｅ関連プラスミドおよびｐＡｄＥａｓｙ－１の間の相同組換えのプロセスの略図を示している。 図１４は、ＰａｃＩによる消化後の構築された陽性のｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａプラスミドの鑑定結果を示している。レーンＭは分子量マーカーであり、レーン１～８は異なるプラスミドのＰａｃＩ消化産物である。具体的には、レーン１はＣ－４．５ＫのＰａｃＩ消化産物であり、レーン２は１－４．５ＫのＰａｃＩ消化産物であり、レーン３はＣ－３ＫのＰａｃＩ消化産物であり、レーン４は１－３ＫのＰａｃＩ消化産物であり、レーン５は２－４．５ＫのＰａｃＩ消化産物であり、レーン６は３－４．５ＫのＰａｃＩ消化産物であり、レーン７は２－３ＫのＰａｃＩ消化産物であり、レーン８は３－３ＫのＰａｃＩ消化産物である。 図１５は、ＡＤ２９３細胞におけるそれぞれｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１ＡプラスミドおよびｐＡｄＥａｓｙ－ＣＭＶ－Ｅ１Ａコントロールプラスミドからのウイルスパッケージングのプロセスの略図である。 図１６は本開示の実施形態に従う１２ウェルプレートのサンプル配置の略図を示している。図に示されている通り、細胞をそれぞれＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ）、およびコントロール腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって指示されているＭＯＩ値で処置した。「ＮＣ」はいずれかのウイルス処置なしのブランクコントロール群を意味する。 図１７は、例１で本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））の異なる細胞内での複製の比較結果を示している。ＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）は系のコントロールウイルスとして用いた。横軸は腫瘍溶解性ウイルスの異なる群を表し、縦軸は細胞のＧＡＰＤＨ遺伝子を正規化参照として用いた腫瘍溶解性アデノウイルス特異的遺伝子Ｅ１Ａのコピー数の倍数を表す。 図１８は、例２の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１およびコントロール群パクリタキセルのＵ２５１細胞に対する殺傷効果を示している。横軸は細胞を処置するために用いた異なるウイルス感染用量（単位：ＭＯＩ）を表し、縦軸は細胞がウイルスによって処置された後の細胞成長の阻害率（％）を表す。左図は４８時間の実験の結果を示し、右図は７２時間の実験の結果を示す。「＊＊＊」はｐ＜０．００１を指示する。 図１９は、例２の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１およびコントロール群パクリタキセルのＡ５４９細胞に対する殺傷効果を示している。横軸は細胞を処置するために用いた異なるウイルス感染用量（単位：ＭＯＩ）を表し、縦軸は細胞がウイルスによって処置された後の細胞成長の阻害率（％）を表す。左図は４８時間の実験の結果を示し、右図は７２時間の実験の結果を示す。 図２０は、例２の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１およびコントロール群パクリタキセルのＨｅｌａ細胞に対する殺傷効果を示している。横軸は細胞を処置するために用いた異なるウイルス感染用量（単位：ＭＯＩ）を表し、縦軸は細胞がウイルスによって処置された後の細胞成長の阻害率（％）を表す。左図は４８時間の実験の結果を示し、右図は７２時間の実験の結果を示す。 図２１は、例２の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１の異なる細胞に対するＩＣ５０（７２ｈ）用量の比較結果を示している。横軸は異なる種類の腫瘍細胞群を表し、縦軸は、細胞が７２時間に渡ってウイルスとインキュベーションされたときに対応する腫瘍細胞の５０％を殺傷し得るウイルス数（単位：ＭＯＩ）を表す。 図２２は、例３の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１の、Ａ５４９／ｈＰＤ－Ｌ１－ＦＬＡＧ細胞株の過剰発現されたｈＰＤ－Ｌ１に対する阻害効果を示している。上図はウエスタンブロットの結果を示しており、これは、異なるウイルスによる処置後の細胞サンプルのｈＰＤＬ１（ＦＬＡＧタグを包含する）の発現変化および細胞の細胞内蛋白質参照β－アクチンの発現を指示している。「コントロール」はいずれかのウイルス処置なしのブランクコントロール群を言う。下図は、ウエスタンブロットの結果に基づいて、細胞内蛋白質参照β－アクチンを正規化参照として用いて得られたｈＰＤＬ１バンドのグレースケールスキャン値を示している。横軸は異なる群を表し、縦軸はグレースケールスキャン値を表す。 図２３は、例３の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、ならびにコントロール群Ｈ１０１のＨｅｌａ／ｈＰＤ－Ｌ１－ＦＬＡＧ細胞株の過剰発現されたｈＰＤ－Ｌ１に対する阻害効果を示している。上図はウエスタンブロットの結果を示しており、これは、異なるウイルスによる処置後の細胞サンプルのｈＰＤＬ１（ＦＬＡＧタグを包含する）の発現変化および細胞の細胞内蛋白質参照β－アクチンの発現を指示している。「コントロール」はいずれかのウイルス処置なしのブランクコントロール群を言う。下図は、ウエスタンブロットの結果に基づいて、細胞内蛋白質参照β－アクチンを正規化参照として用いて得られたｈＰＤＬ１バンドのグレースケールスキャン値を示している。 図２４は、細胞内のｐ５３およびＲｂシグナル伝達経路の略図を示している。 図２５は、例４の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１およびコントロール群パクリタキセルのＨＣＴ１１６細胞に対する殺傷効果を示している。横軸は細胞を処置するために用いた異なるウイルス感染用量（単位：ＭＯＩ）を表し、縦軸はウイルスによる処置後の細胞成長の阻害率（％）を表す。図Ａは４８時間の実験の結果を示し、図Ｂは７２時間の実験の結果を示す。 図２６は、例４の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１およびコントロール群パクリタキセルのＰＡＮＣ１細胞に対する殺傷効果を示している。横軸は細胞を処置するために用いた異なるウイルス感染用量（単位：ＭＯＩ）を表し、縦軸はウイルスによる処置後の細胞成長の阻害率（％）を表す。図Ａは４８時間の実験の結果を示し、図Ｂは７２時間の実験の結果を示す。 図２７は、例４の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１およびコントロール群パクリタキセルのＨＴ２９細胞に対する殺傷効果を示している。横軸は細胞を処置するために用いた異なるウイルス感染用量（単位：ＭＯＩ）を表し、縦軸はウイルスによる処置後の細胞成長の阻害率（％）を表す。図Ａは４８時間の実験の結果を示し、図Ｂは７２時間の実験の結果を示す。 図２８は、例４の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１およびコントロール群パクリタキセルのＨ４６０細胞に対する殺傷効果を示している。横軸は細胞を処置するために用いた異なるウイルス感染用量（単位：ＭＯＩ）を表し、縦軸はウイルスによる処置後の細胞成長の阻害率（％）を表す。図Ａは４８時間の実験の結果を示し、図Ｂは７２時間の実験の結果を示す。 図２９は、例４の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－４．５Ｋ（２－４．５Ｋ）、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ（３－４．５Ｋ））、および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）、ならびにコントロール群Ｈ１０１の異なる細胞に対するＩＣ５０（７２ｈ）用量の比較結果を示している。横軸は異なる型の腫瘍細胞群を表し、縦軸は、細胞が７２時間に渡ってウイルスとインキュベーションされたときに対応する腫瘍細胞の５０％を殺傷し得るウイルス数（単位：ＭＯＩ）を表す。 図３０は、例５の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）のヒト乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のｈＰＤＬ１発現に対する阻害効果を示している。図Ａはウエスタンブロットの結果を示しており、これは、異なるウイルスによる処置後の細胞サンプルのｈＰＤＬ１の発現変化および細胞の細胞内蛋白質参照β－アクチンの発現を指示している。「コントロール」はいずれかのウイルス処置なしのブランクコントロール群を言う。図Ｂは、ウエスタンブロットの結果に基づいて、細胞内蛋白質参照β－アクチンを正規化参照として用いたｈＰＤＬ１バンドのグレースケールスキャン値を示している。横軸は異なる群を表し、縦軸はグレースケールスキャン値である。 図３１は、例５の、細胞が本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置された後の、ＦＡＣＳによって検出測定された細胞膜上のｈＰＤＬ１を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞のパーセンテージ変化を示している。「コントロール」はいずれかのウイルス処置なしのブランクコントロール群を言う。横軸は異なる群を表し、縦軸はｈＰＤＬ１を発現する細胞のパーセンテージ（％）を表す。 図３２は、例５の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）による処置後の、ＦＡＣＳによって検出測定された細胞膜上のｈＰＤＬ１を発現するＨＣＴ１１６腫瘍細胞のパーセンテージ変化を示している。「コントロール」はいずれかのウイルス処置なしのブランクコントロール群を言う。横軸は異なる群を表し、縦軸はｈＰＤＬ１を発現する細胞のパーセンテージ（％）を表す。 図３３は、例５の、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの背中に皮下接種されたＨＣＴ１１６細胞のｈＰＤＬ１発現に対する、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）の阻害効果を示している。これはウエスタンブロットによって検出測定されている。ウエスタンブロットの結果が図に示されており、これは異なるウイルスによる処置後の細胞サンプルのｈＰＤＬ１の発現変化および細胞の細胞内蛋白質参照β－アクチンの発現を指示している。「コントロール」はいずれかのウイルス処置なしのブランクコントロール群を言う。図では、各群について３つのローディングウェルがあり、各ローディングウェルのサンプルはそれぞれ同じ群の３匹の異なるヌードマウスからである。 図３４は、図３３のウエスタンブロットの結果に基いて、細胞内蛋白質参照β－アクチンを正規化参照として用いて得られたｈＰＤＬ１バンドのグレースケールスキャン値を示している。横軸は異なる群を表し、縦軸はグレースケールスキャン値を表す。 図３５は、例６の、ＨＣＴ１１６細胞に対する本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）（ＭＯＩ＝１）およびＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝５：１）の組み合わせの相乗的な殺傷効果を示している。横軸は異なる群を表し、縦軸は対応する阻害率のパーセンテージ値を表す。 図３６は、例６の、ＨＣＴ１１６細胞に対する本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）（ＭＯＩ＝３およびＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝５：１）の組み合わせの相乗的な殺傷効果を示している。横軸は異なる群を表し、縦軸は対応する阻害率のパーセンテージ値を表す。 図３７は、例６の、Ａ５４９細胞に対する本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）（ＭＯＩ＝３０）およびＮＫ細胞（Ｅ：Ｔ＝５：１）の組み合わせの相乗的な殺傷効果を示している。横軸は異なる群を表し、縦軸は対応する阻害率のパーセンテージ値を表す。 図３８は、例７の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置されたＨＣＴ１１６腫瘍を持つＮＯＤ－ＳＣＩＤ免疫不全マウスの腫瘍体積の変化を示している。横軸上の灰色の三角は投与の時点を指示し、横軸は投与後の時間（日）を表し、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）を表す。 図３９は、例７の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置されたＨＣＴ１１６腫瘍を持つＮＯＤ－ＳＣＩＤ免疫不全マウスのＴ／Ｃの変化を示している。横軸上の灰色の三角は投与の時点を指示し、横軸は投与後の時間（日）を表し、縦軸はＴ／Ｃ（％）を表す。 図４０は、例７の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置されたＨＣＴ１１６腫瘍を持つＮＯＤ－ＳＣＩＤ免疫不全マウスの体重の変化を示している。横軸上の灰色の三角は投与の時点を指示し、横軸は投与後の時間（日）を表し、縦軸は体重（ｇ）を表す。 図４１は例７の屠殺後のマウスから取られた腫瘍の写真を示している。マウスはＨＣＴ１１６腫瘍を持つＮＯＤ－ＳＣＩＤ免疫不全マウスであり、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置された。 図４２は、例７の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置されたＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの腫瘍体積の変化を示している。横軸上の灰色の三角は投与の時点を指示し、横軸は投与後の時間（日）を表し、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）を表す。 図４３は、例７の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置されたＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスにおける腫瘍の相対的な増殖率（Ｔ／Ｃ）の変化を示している。横軸上の灰色の三角は投与の時点を指示し、横軸は投与後の時間（日）を表し、縦軸はＴ／Ｃ（％）を表す。 図４４は、例７の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置されたＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの体重の変化を示している。横軸上の灰色の三角は投与の時点を指示し、横軸は投与後の時間（日）を表し、縦軸は体重（ｇ）を表す。 図４５は例７の屠殺後のマウスから取られた腫瘍の写真を示す。マウスはＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスであり、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置された。 図４６は、例８の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置されたＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの腫瘍体積の変化を示している。横軸上の灰色の三角は投与の時点を指示し、横軸は投与後の時間（日）を表し、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）を表す。 図４７は、例８の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置されたＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの相対的な増殖率（Ｔ／Ｃ）の変化を示している。横軸上の灰色の三角は投与の時点を指示し、横軸は投与後の時間（日）を表し、縦軸はＴ／Ｃ（％）を表す。 図４８は、例８の、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置されたＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの体重の変化を示している。横軸上の灰色の三角は投与の時点を指示し、横軸は投与後の時間（日）を表し、縦軸は体重（ｇ）を表す。 図４９は、例８の、屠殺したマウスから取られた腫瘍の写真（図Ａ）および各群の腫瘍重量の統計結果（図Ｂ）を示している。マウスはＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスであり、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置された。図Ｂでは、横軸は異なる群を表し、縦軸は腫瘍重量（ｇ）を表す。 図５０は、例８でＦＡＣＳによって測定されたマウスの各群の腫瘍、血液、および脾臓のＮＫ細胞数の正規化された統計結果を示している。マウスはＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスであり、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置された。図Ａは腫瘍の結果を示し、図Ｂは血液の結果を示し、図Ｃは脾臓の結果を示す。各グラフの横軸は実験で設けた異なる群を表し、縦軸は正規化後のＮＫ細胞数を表す。 図５１は、例８でＦＡＣＳによって測定されたマウスの各群の腫瘍、血液、および脾臓のＴ細胞数の正規化された統計結果を示している。マウスはＨＣＴ１１６を持つＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスであり、本開示に従って構築された腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ（１－４．５Ｋ）および系のコントロールウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ（Ｃ－４．５Ｋ）によって処置された。図Ａは腫瘍の結果を示し、図Ｂは血液の結果を示し、図Ｃは脾臓の結果を示す。各グラフの横軸は実験で設けた異なる群を表し、縦軸は正規化後のＴ細胞数を表す。
本開示は、付随する図面を参照して好ましい実施形態の次の詳細な記載によってさらに説明される。ただし、これは本発明を限定するわけではない。種々の改変または改善が本開示の範囲から外れることなしに然るべくなされ得、よって、これらは本開示の範囲内であるということは当業者には明らかであろう。
本開示では、用語「腫瘍」、「癌」、「腫瘍細胞」、および「癌細胞」は当分野において通常認識される意味を包摂する。
人体は、呼吸器系、循環器系、消化器系などを包含する十大システムを含む複雑なシステムである。これらのシステムは協調連携し、これが全ての種類の込み入った生命活動の正常な機能を許す。腫瘍が生ずるときには、人体は複数の密接に相関する免疫効果またはメカニズムによって抗腫瘍応答を発生し、細胞媒介性免疫および液性免疫を包含し、種々の免疫エフェクター分子およびエフェクター細胞が関わる。通常は、細胞媒介性免疫は抗腫瘍プロセスにおいて主導的な役割を発揮し、液性免疫はいくつかの状況では相乗的な役割を発揮するということが信じられている。本開示は、腫瘍細胞内で選択的に複製し腫瘍細胞を殺傷する腫瘍溶解性アデノウイルスの特徴を利用することと、同時に、腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞によるＰＤＬ１発現を阻害することができる外来性のｓｈＲＮＡのコード配列を保有するようにさせ、それによって組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍を選択的に溶解し体の抗腫瘍免疫効果を強化する役割を相乗的に発揮することを可能にすることとを提案する。本概念に基づいて、本開示の発明者は、実験研究および理論的検討から、上の相乗効果が、腫瘍溶解性アデノウイルスのＥ１Ｂ１９Ｋ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子、および全てのＥ３遺伝子のコード領域を欠失させることと、外来性のｓｈＲＮＡコード配列をそのゲノムにインテグレーションすることとによって達成され得るということを見いだした。
加えて、アデノウイルスなどの多くのＤＮＡウイルスはホストの細胞周期を変調させ得る。これは、主に、ウイルスが、宿主細胞の細胞周期制御蛋白質に作用して静止期細胞が細胞周期に入ることを許す蛋白質を産生するからであり、それによってウイルスＤＮＡの複製を容易化する。異なるウイルスが異なるメカニズムで細胞周期に影響し、アデノウイルスは主にＲｂおよびｐ５３細胞シグナル伝達経路（図２４）を介して宿主細胞周期に干渉する（Ｃｈｅｎ Ｊｉａｎｆａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ，Ｔｕｍｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｒｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３１（４）：２４３－２４５参照）。腫瘍溶解性アデノウイルスの腫瘍溶解機能は、この原理に基づいて宿主細胞のサイクリンの発現を変調させることによって達成される。アデノウイルスのゲノムは制御機能を有する４つの初期転写単位（すなわち、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４）と１つの後期転写単位とを含む。図２４に示されている通り、Ｅ１は２つの部分Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂに分けられる。Ｅ１ＡはＲｂに結合し、遊離のＥ２Ｆを放出し、細胞はＧ１期からＳ期に入る。アデノウイルスは２つの蛋白質Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ１Ｂ１９ｋをコードおよび産生し、それぞれｐ５３およびＢａｘを阻害する。その結果、宿主細胞の分裂および増殖はｐ５３細胞シグナル伝達経路によって阻害されず、大量の宿主細胞が静止期から分裂期に入る。結果として、アデノウイルスは大量に複製および繁殖する。しかしながら、Ｅ１Ａ遺伝子が除去されたアデノウイルスは、宿主細胞に感染したときに遊離のＥ２Ｆを放出するためのＥ１Ａ蛋白質をコードし得ず、Ｇ１期細胞はＳ期に入り得ない。類似に、Ｅ１Ｂ遺伝子が除去されたアデノウイルスはＥ１Ａ蛋白質を産生して宿主細胞がＧ１期からＳ期に入ることを許し得るものの、分裂周期に入る細胞はｐ５３シグナル伝達経路を介してアポトーシスを生ずるか、または分裂阻害されるであろう。よって、Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂ遺伝子を欠失するアデノウイルスは正常なＲｂおよびｐ５３細胞シグナル伝達経路を有する宿主細胞内では複製および増殖し得ず、異常なＲｂまたはｐ５３シグナル伝達経路を有する腫瘍細胞内でのみ増殖し得る。初期の腫瘍溶解性アデノウイルスＯｎｙｘ－０１５およびＨ１０１は、両方とも、アデノウイルスのＥ１Ｂ５５Ｋ遺伝子の削除（Ｅ３領域の配列の部分的なまたは完全な削除）によってｐ５３変異体腫瘍細胞内でのそれらの選択的複製を達成する。かかるウイルスが正常な宿主細胞に感染したときには、Ｅ１Ａ蛋白質をコードおよび産生してＲｂ－Ｅ２Ｆ結合体が分離して遊離のＥ２Ｆを放出するようにさせ得、感染した細胞がＧ１期からＳ期に入る場合であっても、細胞内のアデノウイルスは有効に複製し得ない。なぜなら、ｐ５３抑制蛋白質Ｅ１Ｂ５５Ｋがコードおよび産生され得ず、分裂期に入る感染した細胞はｐ５３シグナル伝達経路を介する分裂阻害またはアポトーシスを生じるからである。異常なｐ５３シグナル伝達経路を有する細胞では、分裂段階に入る感染した細胞はｐ５３シグナル伝達経路を介する分裂阻害またはアポトーシスを生じないであろう。その結果、細胞は大量に増殖し、細胞内のアデノウイルスは大量に複製して細胞溶解を引き起こす。しかしながら、後に、実験は、正常細胞内の前記２種類のウイルスの選択的複製が予想ほど理想的ではないということを証明した。理由は、それらがＥ１Ｂ５５Ｋのみを削除されており、Ｅ１Ｂ１９Ｋの正常な発現をなお保持し、図２４に従うと、Ｅ１Ｂ５５ＫおよびＥ１Ｂ１９Ｋはｐ５３シグナル伝達経路において類似の効果を行使するということであり得る。よって、Ｅ１Ｂ５５Ｋの削除は野生型ｐ５３の機能を阻害し得ないが、Ｅ１Ｂ１９Ｋ蛋白質の正常な発現はｐ５３の下流のＢａｘの機能をなお阻害し得、その結果、腫瘍溶解性アデノウイルスは正常細胞内でもまた複製し得る。本開示に記載される腫瘍溶解性アデノウイルスでは、Ｅ３領域の削除に加えて、Ｅ１Ｂ５５ＫおよびＥ１Ｂ１９Ｋ遺伝子が両方とも同時に削除されており、その結果、ウイルスは先行技術の腫瘍溶解性アデノウイルスと比較して腫瘍細胞内でのより良好な選択的複製、正常細胞内でのより低い複製能力、および正常細胞に対するより良好な安全性を有した。
他方で、ＰＤ－Ｌ１（ＰＤＬ１またはＢ７－Ｈ１ともまた呼ばれる）はＢ７ファミリーに属し、ＩｇＶおよびＩｇＣ様領域、膜貫通領域、ならびに細胞質領域を有する。この分子は広い組織発現スペクトルといくつかの腫瘍細胞株における高発現とを有する。多くの研究は、分子が腫瘍の免疫逃避メカニズムに関係しているということを示した。腫瘍の周りの微小環境は腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１の広い発現を誘導し得、発現されたＰＤ－Ｌ１は腫瘍の発生および成長にとって有利である。腫瘍細胞および腫瘍微小環境中のＡＰＣによって発現されたＰＤ－Ｌ１はＴ細胞上の受容体ＰＤ１と相互作用して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路によって腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化を抑制し、Ｔ細胞によって媒介される腫瘍免疫応答を下方制御する。加えて、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル伝達経路をブロックすることが、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の増殖を促進し、浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ－ガンマの分泌を上方制御し、腫瘍成長を有効に阻害し得るということを示す研究がある。これは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路をブロックすることが、免疫応答を誘導することを目的とする腫瘍免疫応答における重要な役割を発揮するということを指示している。その上、実験は、腫瘍ワクチンと組み合わせて抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を用いる腫瘍免疫療法が、腫瘍ワクチンの免疫活性化効果を有効に強め、処置効果に対する腫瘍微小環境の影響を縮減し得るということを証明した。
上の理論的な研究および検討に基づいて、本開示の腫瘍溶解性アデノウイルスは、それがより強い腫瘍溶解殺傷能力を具備するようにさせるためにそのゲノムを再構成されたのみならず、ｓｈＰＤＬ１（ＰＤＬ１発現を阻害するためのｓｈＲＮＡ）を発現することができるコードカセットをもまた追加された。細胞内ＰＤＬ１のｍＲＮＡはｓｈＰＤＬ１によって効率的に分解され得、それによって、ＰＤＬ１の遺伝子サイレンシング、腫瘍細胞によるＰＤＬ１の発現の縮減、Ｔ細胞阻害シグナルに向かうＰＤ１／ＰＤＬ１シグナル伝達経路の伝達の減弱、および腫瘍に対するＴ細胞の殺傷効果の強化を実現することが期待される。よって、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍溶解剤として単独で用いられ得るのみならず、ｓｈＰＤＬ１コードカセットのための有効なベクターとしてもまた用いられ得て、ウイルス複製と併せてｓｈＰＤＬ１が大量に発現されることを許し、それによってウイルス治療および遺伝子治療の二重の機能を同時に発揮する。
従って、本開示は単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを提供し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムは、腫瘍細胞によるＰＤＬ１発現を阻害することができる外来性のｓｈＲＮＡのコード配列をインテグレーションされる。
好ましくは、外来性のｓｈＲＮＡのコード配列は配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りである。
好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスはＥ１Ｂ１９Ｋ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子、およびＥ３領域の全ての遺伝子を欠失する。
それが腫瘍細胞に入った後に腫瘍溶解性ウイルスによって引き起こされる腫瘍細胞溶解の可能なメカニズムは次の通りである。（１）ウイルス蛋白質の直接的な細胞傷害性：例えばアデノウイルスによって産生される細胞死蛋白質および後期蛋白質は両方とも腫瘍細胞の溶解を有効に媒介し得る。（２）抗腫瘍免疫応答の発生：一方で、ウイルスは、種々のサイトカインに対する腫瘍細胞の敏感さを増大させることによって腫瘍を殺傷し得る。例えば、アデノウイルスは、感染した腫瘍細胞内で複製およびＥ１Ａ蛋白質を発現することによって、腫瘍壊死因子によって媒介される腫瘍殺傷を強化する。他方で、腫瘍細胞がウイルスに感染した後に、腫瘍細胞表面のウイルス抗原は主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原との複合体を形成し、これは細胞傷害性Ｔリンパ球によって容易に認識され得、それによってウイルス感染した腫瘍細胞に対する特異的な攻撃を媒介する。（３）放射線療法および化学療法に対する腫瘍細胞の敏感さの強化：アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の発現産物は強力な化学増感剤である。腫瘍細胞内で、Ｅ１Ａ遺伝子の発現産物はｐ５３蛋白質の高レベル発現を誘導し得、それによって、化学療法および放射線療法によって引き起こされるＤＮＡの損傷を強化する。
よって、好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはＥ１Ａ遺伝子コード配列を包含する。より好ましくは、Ｅ１Ａ遺伝子コード配列はＣＭＶプロモーターのコントロール下にあり、それによって、Ｅ１Ａの発現を増大させることによって腫瘍細胞に対する腫瘍溶解殺傷効果を強化する。
好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスはアデノウイルス５型を遺伝子改変することによって得られる。アデノウイルス５型の１つの例はＨ１０１である。
好ましい実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスゲノムは、ＥＳ配列後に、Ｕ６プロモーターおよびヒトＰＤＬ１のｓｈＲＮＡ（ｓｈＰＤＬ１）を包含するコードカセットとＣＭＶプロモーター、Ｅ１Ａコード領域およびその３’ＵＴＲ領域、ならびにＳＶ４０ポリＡを包含するＥ１Ａ発現カセットとをインテグレーションする。
本開示の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは種々のヒト腫瘍細胞に対する強い殺傷効果を有する（例えば、ヒト神経膠細胞腫細胞Ｕ２５１、ヒト肺癌細胞Ａ５４９、ヒト子宮頚癌細胞Ｈｅｌａ、ヒト大細胞肺癌Ｈ４６０、ヒト結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６、ヒト膵臓癌細胞ＰＡＮＣ１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ２９など）。正常なヒト初代細胞内でのウイルスの複製能力はヒト腫瘍細胞内でのウイルスの複製能力よりもかなり低い（約２桁の差）。ウイルスによって発現されたヒトｓｈＰＤＬ１は、ヒト腫瘍細胞の高発現されるＰＤＬ１蛋白質のレベルを有意に縮減し得る。
本開示によって開発された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスに基づいて、本開示は医薬組成物をもまた提供し、医薬組成物は活性成分としての本開示に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む。
好ましくは、医薬組成物は治療有効量の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを含む。より好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの治療有効量は５×１０７から５×１０１２ｖｐ／日の範囲である用量である。
腫瘍溶解性ウイルスは当分野の通常の投与経路によって投与され得る。例えば腫瘍内注射によって投与または静脈内投与される。
本開示の医薬組成物は、当分野において公知の他の活性成分、例えばインターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）などをもまた含有し得、その用量および投与経路はそれらのそれぞれの従来の様式で行われ得る。他の活性成分が含まれる場合には、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは他の活性成分と混合されることなしに独立して医薬組成物中に存在し得る。例えば、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは別個の容器に別個に含有される。
当業者は、本開示の医薬組成物が好適な薬学的に許容される添加剤をさらに包含し得ることを理解するであろう。
別の態様では、本開示に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを調製するためのベクターが提供され、ベクターはプロモーターのコントロール下の外来性のｓｈＲＮＡコード配列を含み、ｓｈＲＮＡコード配列は配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りである。
具体的な実施形態では、ベクターはｐＳｈｕｔｔｌｅを基本バックボーンとして用い、基本バックボーンは、作動可能に連結された外来性のｓｈＲＮＡコード配列の発現をコントロールするプロモーター、外来性のｓｈＲＮＡコード配列、Ｅ１Ａ遺伝子コード配列の発現をコントロールするプロモーター、およびＥ１Ａ遺伝子コード配列を順に含む。
別の態様では、本開示に従うベクターを含有する宿主細胞が提供される。好ましくは、宿主細胞はベクターを安定発現する。
別の態様では、単離されたｓｈＲＮＡが提供され、ｓｈＲＮＡのコード配列は配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りであり、ｓｈＲＮＡは腫瘍細胞によるＰＤＬ１の発現を阻害することができる。
別の態様では、腫瘍および／または癌の処置のための医薬の調製のための、本開示に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの使用が提供される。
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
本開示の別の態様は、腫瘍および／または癌を処置するための方法をもまた提供し、本開示に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを腫瘍および／または癌患者に投与することを含む。
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
本開示の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは、治療有効量で、１日１回または２回、連続１から７日に渡って投与される（連続１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日を包含する）。治療有効量は好ましくは５×１０７～５×１０１２ｖｐ／日の範囲である用量である（例えば、５×１０７から５×１０１２ｖｐ／日、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日）。
必要な場合には、本開示の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは、他の医薬、例えばインターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）などとの組み合わせでもまた用いられ得、その用量および投与経路はそれらのそれぞれの従来の様式で行われ得る。
具体的な状況および必要に基づいて、本開示に従う腫瘍および／または癌の処置のための方法は患者に１回または複数回適用され得る。
腫瘍溶解性ウイルスは当分野の通常の投与経路によって投与され得る。例えば、それらは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与され得る。
本開示の別の態様に従うと、単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが提供され、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはＥ１Ｂ１９Ｋ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子、およびＥ３領域の全ての遺伝子を欠失する。好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはＥ１Ａ遺伝子コード配列を含み、より好ましくは、Ｅ１Ａ遺伝子コード配列はＣＭＶプロモーターのコントロール下にある。
腫瘍溶解性アデノウイルスは強い腫瘍殺傷効果を有し、正常細胞内でのその複製能力は腫瘍細胞内でのその複製能力よりもずっと低い。よって、それは正常細胞に対する低い毒性、ゆえに改善された安全性を有する。
本開示の別の態様では、本開示の発明者は、システム思考との組み合わせによる上述の腫瘍溶解性アデノウイルスに基づく新たな組み合わせ治療をもまた提案する。現行では、多くの非細胞傷害性の抗腫瘍医薬は化学療法と組み合わせられたときに腫瘍患者の長期生存を改善しない。その原因は、これらの化学療法におけるシステム思考の欠如であり得る。例えば、従来の化学療法は主として細胞ライフサイクルのある種の段階、例えばＲＮＡまたはＤＮＡの合成および有糸分裂に干渉するので、主として成長が速い細胞を標的化する。結果的に、これらの化学療法は腫瘍細胞を殺傷すると同時に、免疫系の損傷をもまた引き起こし得る。免疫系が減弱するときには、腫瘍細胞は必然的に「頭をもたげる」。システム思考は全体観に基づくアプローチであり、医薬作用、疾患、システム、および人体の間の相関および相互作用を総合的に考慮する。上述のシステム思考に基づいて、本発明は、免疫機能を改善するための他のアプローチを採用し、種々の治療を系統的に組み合わせることによって、効力を最大化し、同時に免疫系の損傷を最小化することが可能である。従って、本発明は新規の組み合わせ治療を提供し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞を組み合わせて用いることによって腫瘍および／または癌を処置する。特に、本発明は、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞を組み合わせて用いることのみによって相乗効果を達成し得る。
よって、本開示は、さらに、
（ａ） 第１の薬学的に許容される担体中に本開示の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを含む第１の医薬組成物と、
（ｂ） 第２の薬学的に許容される担体中にＮＫ細胞を含む第２の医薬組成物と、
を含む治療薬を提供する。
好ましくは、第１の医薬組成物および第２の医薬組成物は互いに混合されることなしに独立して医薬組成物中に存在する。
いくつかの実施形態では、第１の薬学的に許容される担体および第２の薬学的に許容される担体は同じである。他の実施形態では、第１の薬学的に許容される担体および第２の薬学的に許容される担体は異なる。
いくつかのケースでは、治療薬は医薬の組み合わせとしてもまた解釈され得る。
いくつかの実施形態では、第１の医薬組成物の活性成分は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであり、第２の医薬組成物の活性成分はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、第１の医薬組成物は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを治療有効量で含み（好ましくは、第１の医薬組成物は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを５×１０７～５×１０１２ｖｐ／日、より好ましくは５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、より好ましくは５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、より好ましくは１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、なおより好ましくは３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日の範囲の用量で含む）、第２の医薬組成物はＮＫ細胞を１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲の用量で含む（好ましくは１×１０８から５×１０９細胞／日、より好ましくは１×１０９から４×１０９細胞／日、なおより好ましくは１×１０９から３×１０９細胞／日）。
本開示は医薬組成物をもまた提供し、医薬組成物の活性成分は本開示の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスとＮＫ細胞とを包含する。好ましくは、医薬組成物の活性成分は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞からなる。
好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞は互いに混合されることなしに独立して医薬組成物中に存在する。
腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞を殺傷するメカニズムは通常は類似である。種々の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与される。腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞との接触をするときに、それらは腫瘍細胞に感染し、それらに入るであろう。腫瘍溶解性ウイルスは主に腫瘍細胞内で複製および生殖するが、正常細胞内では複製しないかまたはほとんど複製しないので、感染した腫瘍細胞内では、大量の子孫腫瘍溶解性ウイルスが産生され、腫瘍細胞の溶解および死に至り得る。腫瘍細胞が溶解するときには、大量の腫瘍抗原および子孫腫瘍溶解性ウイルスが放出され得、それから、抗原がさらにインビボの免疫系を活性化し得、インビボのＮＫ細胞およびＴ細胞を刺激して残りの腫瘍細胞を攻撃し続ける。同時に、子孫腫瘍溶解性ウイルスはまだ感染していない腫瘍細胞に感染し得る。
ＮＫ細胞は幅広いスペクトルの腫瘍細胞を殺傷し得る免疫細胞であり、ＮＫ細胞は腫瘍細胞を正常細胞から見分け得る。ＮＫ細胞が腫瘍細胞との接触をするときに、それらは腫瘍細胞を異常細胞として認識し得、多種の相乗的プロセス、例えば受容体認識、抗体による標的認識（ＡＤＣＣ）、ならびに腫瘍細胞を間接的に殺傷することができるグランザイム、パーフォリン、およびインターフェロンの放出を介して腫瘍細胞を殺傷するであろう。インビトロの研究は、健康なＮＫ細胞はそのライフサイクルの間に最高で２７個の腫瘍細胞を殺傷し得るということを指示している。
ＮＫ細胞は抗ウイルス機能をもまた有する。正常細胞がウイルスによって感染される場合には、ウイルスは大量に複製し、感染した細胞は老化変性を呈し、それらの細胞膜上の蛋白質群の組成変化を示すであろう。このプロセスの間に、ＮＫ細胞は感染した細胞を敏感かつ有効に認識し、上に記載されているようにそれらが腫瘍細胞を殺傷するために用いる類似のアプローチによってこれらの細胞を殺傷し得、それによって正常細胞内でのウイルスの複製および増殖を阻害する。その後、抗原の刺激およびインターフェロンなどの免疫因子の効果の存在下で、他の型の免疫細胞がウイルスと戦い続けるであろう。
本開示では、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞の個々の特徴を考慮しており、それらを巧妙に組み合わせようとする。一緒に組み合わせられたときには、ＮＫ細胞の抗ウイルスメカニズムは腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細胞にもまた適用可能であり、ＮＫ細胞の抗腫瘍メカニズムを補完する。加えて、組み合わせ治療は、腫瘍溶解性ウイルスに感染した腫瘍細胞がＮＫ細胞の特異的標的になることを許し、これはそれらの腫瘍殺傷効果を改善し得る。腫瘍溶解性ウイルスは癌細胞内で選択的に複製するのみならず、それらを内側から殺傷するが、細胞膜上の蛋白質受容体群が変化することをもまた引き起こし、それゆえにＮＫ細胞による癌細胞の認識を容易化し得る。その結果、ＮＫ細胞は癌細胞を外側から攻撃し得る。よって、腫瘍溶解性ウイルスおよびＮＫ細胞は癌細胞を相乗的に殺傷し、改善された効力を達成する。
本開示のＮＫ細胞は自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞を包含する。ＮＫ細胞はインビトロ拡大されたＮＫ細胞であり得る。ＮＫ細胞の大量インビトロ拡大培養技術は当分野において公知であり、高度に発展している（例えば、“Ｓｏｍａｎｃｈｉ ＳＳ，Ｌｅｅ ＤＡ．Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｋ５６２ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｏ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｏｕｎｄ ＩＬ２１．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１６；１４４１：１７５－９３”または“Ｐｈａｎ ＭＴ，Ｌｅｅ ＳＨ，Ｋｉｍ ＳＫ，Ｃｈｏ Ｄ．Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｋ５６２ Ｆｅｅｄｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１６；１４４１：１６７－７４”参照）。臨床データからは、自家ＮＫ細胞、半同種ＮＫ細胞（同種ＮＫ細胞に属する）、または臍帯血由来ＮＫ細胞が、人体への再輸注後に、毒性または長期依存性が観察されず、処置が安全かつ有効であることが確認されている。
処置に有用なＮＫ細胞の純度は自家ＮＫ細胞では８５％以上、同種ＮＫ細胞では９０％以上であり得、その中の不純物細胞はＮＫ－Ｔおよび／またはγδＴ細胞であり得る。好ましくは、ＮＫ細胞活性（生存率）は９０％以上であり、ＮＫ細胞殺傷活性は８０％以上である。
本開示の組み合わせ戦略に基づいて、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞のそれぞれの用量レベル、それらの投与順序、および投与の間隔についてさらなる検討および改善がなされる。これらは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの抗腫瘍効力、ＮＫ細胞の抗腫瘍効力、および腫瘍細胞に対する２つの組み合わせの最も良好な相乗的な殺傷効果を決定する上で極めて重要である。
よって、好ましくは、医薬組成物または治療薬は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを治療有効量で含み（好ましくは、医薬組成物または治療薬は、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを、５×１０７～５×１０１２ｖｐ／日、より好ましくは５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、より好ましくは５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、より好ましくは１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、なおより好ましくは３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日の用量で含む）、医薬組成物または治療薬はＮＫ細胞を１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量で包含する（好ましくは１×１０８から５×１０９細胞／日、より好ましくは１×１０９から４×１０９細胞／日、なおより好ましくは１×１０９から３×１０９細胞／日）。
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは当分野において通常用いられる経路によって投与され得る。例えば、それらは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与され得る。
ＮＫ細胞は当分野において通常用いられる経路によって投与され得る。例えば、それらは静脈内投与され得る。
具体的な実施形態では、本開示に従う医薬組成物または治療薬の活性成分は、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを５×１０７から５×１０１２ＶＰ／日の範囲である用量で（例えば、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日など）、ＮＫ細胞を１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量で（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、１×１０９から３×１０９細胞／日など）包含する。好ましくは、医薬組成物または治療薬の活性成分は、５×１０７から５×１０１２ＶＰ／日の範囲である用量の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス（例えば、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日など）と、１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量のＮＫ細胞（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、１×１０９から３×１０９細胞／日など）とからなる。
当業者は、本開示に従う医薬組成物または治療薬が好適な医薬添加剤をもまた包含し得ることを理解し得る。
本開示に従う医薬組成物または治療薬は、当分野において公知の他の活性成分、例えばインターロイキン－２（ＩＬ－２）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）などをもまた包含し得る。
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物または治療薬は１つ以上の薬学的に許容される担体を含む。医薬製剤は当分野において公知の手続きによって調製され得る。例えば、化合物および同類を包含する活性成分は、通常の添加剤、希釈剤（例えば、リン酸緩衝液または食塩水）、組織培養培地、および担体（例えば、自家血漿またはヒト血清アルブミン）によって製剤され、懸濁液として投与され得る。他の担体はリポソーム、ミセル、ナノカプセル、ポリマーナノ粒子、固体脂質粒子を包含し得る（例えばＥ．Ｋｏｒｅｎ ａｎｄ Ｖ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｌｉｆｅ，６３：５８６－５９５，２０１１参照）。本願において開示される医薬組成物または治療薬の製剤のための技術の詳細は科学および特許文献に良く記載されている。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）の最新版を参照。
本開示に従う医薬組成物または治療薬は種々の腫瘍および／または癌を処置するために用いられ得、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌を包含するが、これらに限定されない。
本開示の医薬組成物または治療薬の適用方法は次の通りである。最初に、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを腫瘍および／または癌患者に投与する。それから、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの投与の１８～７２時間（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）後に、ＮＫ細胞を腫瘍および／または癌患者に投与する。「組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの投与の１８～７２時間（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）後に、ＮＫ細胞を腫瘍および／または癌患者に投与する」は、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの最初の投与との間の時間間隔が１８～７２時間の範囲であるか（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）、またはＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの直近の投与との間の時間間隔が１８～７２時間の範囲である（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）ということを意味する。好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの直近の投与との間の時間間隔は１８～７２時間の範囲である（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）。より好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの直近の投与との間の時間間隔は２４～４８時間の範囲である。
本開示の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは治療有効量で（例えば、５×１０７から５×１０１２ｖｐ／日、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日）、１日１回または２回、連続１から７日に渡って（例えば、１日１回、連続１から６日に渡って）与えられ、ＮＫ細胞は、１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量レベルで（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、または１×１０９から３×１０９細胞／日）、１日１回、連続１から６日に渡って与えられる。本開示の別の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは、治療有効量で（例えば、５×１０７から５×１０１２ｖｐ／日、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日）、隔日で連続２から６日に渡って与えられ、ＮＫ細胞は、１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量レベルで（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、または１×１０９から３×１０９細胞／日）、隔日で連続２から６日に渡って与えられる。ＮＫ細胞が組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの投与の１８から７２時間後に腫瘍および／または癌患者に与えられるはずである限りは、上述の実施形態のいずれか１つまたはいずれかの他の代替的な実施形態が本開示に従って採用され得る。組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞は間をおいて投与され得るか（例えば、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを第１日に投与し、ＮＫ細胞を第２日に投与し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを第３日に投与し、ＮＫ細胞を第４日に投与するなど）、または逐次に投与され得るか（例えば、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを第１日に投与し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第２日に投与し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第３日に投与し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第４日に投与するなど）、あるいは他の用量レジメンを用いて投与され得る（例えば、最初に、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを連続１から７日に渡って１日１回または２回（例えば、連続１から６日に渡って１日１回）投与し、１８から７２時間の間隔の後に、ＮＫ細胞を連続１から６日に渡って１日１回投与する）。好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは最初に投与され、ＮＫ細胞は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの全ての用量を投与した１８から７２時間後に投与される。本開示の好ましい実施形態では、最初に、腫瘍および／または癌患者は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを与えられ、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは治療有効量で１回のみ与えられる（例えば、５×１０７から５×１０１２ｖｐ、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ、５×１０８から１×１０１２ＶＰ、１×１０９から５×１０１１ＶＰ、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ）。組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの投与の１８から７２時間後に、腫瘍および／または癌患者はＮＫ細胞を投与され、ＮＫ細胞は１×１０７から１×１０１０細胞の範囲である用量レベルで１回のみ投与される（例えば、１×１０８から５×１０９細胞、１×１０９から４×１０９細胞、または１×１０９から３×１０９細胞）。
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは腫瘍または癌細胞内で選択的に複製し得、それらの量は一定時間後にピークに達するであろう。本開示の発明者は、一定時間のウイルス複製後に、腫瘍細胞内の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺傷効果を促進し得ることを発見した。よって、本開示において提案される組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞の投与の間隔は、それらの機能のピーク値がオーバーラップすることを可能にし得る。
本開示は、腫瘍および／または癌の処置のための医薬の調製のための、本開示の治療薬の使用をもまた提供する。
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌を包含するが、これらに限定されない。
本開示は、腫瘍および／または癌の処置のための相乗効果を有する組み合わせ医薬のキットをもまた提供し、本開示に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを含有する第１の容器とＮＫ細胞を含有する第２の容器とを包含し、第１の容器は第２の容器とは別個である。キットは、さらに、投与のタイミングおよび経路を定める説明書を含む。好ましくは、キットは、それぞれ本開示に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞を含有する独立した容器と、投与のタイミングおよび経路を定める説明書とからなる。
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌を包含するが、これらに限定されない。
好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを含有するキットの第１の容器は治療有効量の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを包含し（例えば、５×１０７から５×１０１２ＶＰ／日、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日）、ＮＫ細胞を含有する第２の容器は、１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量を提供するために十分である量のＮＫ細胞を包含する（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、１×１０９から３×１０９細胞／日など）。
ＮＫ細胞は自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択され得る。ＮＫ細胞はインビトロ拡大から得られる自家ＮＫ細胞またはインビトロ拡大から得られる同種ＮＫ細胞であり得る。
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは当分野において通常用いられる経路によって投与され得る。例えば、それらは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与され得る。
ＮＫ細胞は当分野において通常用いられる経路によって投与され得る。例えば、それらは静脈内投与され得る。
別の態様では、本開示は、腫瘍および／または癌の処置のための方法をもまた提供し、逐次の様式で次のステップを含む。
１） 本開示に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを腫瘍および／または癌患者に投与すること、
２） 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの投与の１８～７２時間（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）後に、本開示に従うＮＫ細胞を腫瘍および／または癌患者に投与すること。
「組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの投与の１８～７２時間（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）後に、本開示に従うＮＫ細胞を腫瘍および／または癌患者に投与する」は、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの最初の投与との間の時間間隔が１８～７２時間の範囲であるか（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）、またはＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの直近の投与との間の時間間隔が１８～７２時間の範囲である（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）ということを意味する。好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの直近の投与との間の時間間隔は１８～７２時間の範囲である（例えば、２０～７０時間、２２～４８時間、２４～４８時間、３０～４８時間など）。より好ましくは、ＮＫ細胞の最初の投与と組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの直近の投与との間の時間間隔は２４～４８時間の範囲である。
腫瘍および／または癌は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌などを包含するが、これらに限定されない。
本開示の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは、治療有効量で（例えば、５×１０７から５×１０１２ｖｐ／日、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日）、連続１から７日に渡って１日１回または２回（例えば、連続１から６日に渡って１日１回）与えられ、ＮＫ細胞は、１×１０７から１×１０１０細胞／日の範囲である用量レベルで（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、または１×１０９から３×１０９細胞／日）、連続１から６日に渡って１日１回与えられる。本開示の別の好ましい実施形態では、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは、治療有効量で（例えば、５×１０７から５×１０１２ｖｐ／日、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ／日、５×１０８から１×１０１２ＶＰ／日、１×１０９から５×１０１１ＶＰ／日、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ／日）、連続２から６日に渡って隔日で与えられ、ＮＫ細胞は、１×１０７から１×１０１０細胞／日の用量レベルで（例えば、１×１０８から５×１０９細胞／日、１×１０９から４×１０９細胞／日、または１×１０９から３×１０９細胞／日）、連続２から６日に渡って隔日で与えられる。ＮＫ細胞が組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの投与の１８から７２時間後に腫瘍および／または癌患者に与えられるはずである限りは、上述の実施形態のいずれか１つまたはいずれかの他の代替的な実施形態が本開示に従って採用され得る。組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞は間をおいて投与され得るか（例えば、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを第１日に投与し、ＮＫ細胞を第２日に投与し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを第３日に投与し、ＮＫ細胞を第４日に投与するなど）、または逐次に投与され得るか（例えば、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを第１日に投与し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第２日に投与し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第３日に投与し、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞を逐次の順番で第４日に投与するなど）、あるいは他の用量レジメンを用いて投与され得る（例えば、最初に、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを連続１から７日に渡って１日１回または２回（例えば、連続１から６日に渡って１日１回）投与し、１８から７２時間の間隔の後に、ＮＫ細胞を連続１から６日に渡って１日１回投与する）。好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは最初に投与され、ＮＫ細胞は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの全ての用量を投与した１８から７２時間後に投与される。本開示の好ましい実施形態では、最初に、腫瘍および／または癌患者は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを与えられ、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは治療有効量で１回のみ与えられる（例えば、５×１０７から５×１０１２ｖｐ、５×１０７から１．５×１０１２ＶＰ、５×１０８から１×１０１２ＶＰ、１×１０９から５×１０１１ＶＰ、３×１０１０から３×１０１１ＶＰ）。組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの投与の１８から７２時間後に、腫瘍および／または癌患者はＮＫ細胞を投与され、ＮＫ細胞は１×１０７から１×１０１０細胞の範囲である用量レベルで１回のみ投与される（例えば、１×１０８から５×１０９細胞、１×１０９から４×１０９細胞、または１×１０９から３×１０９細胞）。
具体的な状況および必要に基づいて、本開示に従う腫瘍および／または癌の処置のための方法は患者に１回または複数回適用され得る。
ＮＫ細胞は自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択され得る。ＮＫ細胞はインビトロ拡大から得られる自家ＮＫ細胞またはインビトロ拡大から得られる同種ＮＫ細胞であり得る。
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは当分野において通常用いられるそれぞれの経路によって投与され得る。例えば、それらは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与され得る。
ＮＫ細胞は当分野において通常用いられる経路によって投与され得る。例えば、それらは静脈内投与され得る。
本願の以降においては、本開示は例によってさらに説明または記載されるが、これらの例は本開示の保護の範囲を限定することを意図されていない。
別様に定められていない限り、次の例に用いられる実験法は生物工学の分野の従来の実験手続き、操作、材料、および条件を用いて行う。
別様に定められていない限り、それぞれの試薬の全てのパーセンテージ濃度（％）は体積によるパーセンテージ（％（ｖ／ｖ））を指示する。
次の例に用いた材料は次の通りである。
１． 細胞ＡＤ２９３、ＭＲＣ－５、Ｈｅｌａ、Ａ５４９、Ｕ２５１、ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ１、ＨＴ２９、Ｈ４６０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１はＡＴＣＣから購入した。ＨＵＶＥＣはＡｌｌＣｅｌｌｓバイオテクノロジー（上海）社から購入した。
２． 腫瘍溶解性アデノウイルスＨ１０１は上海三維生物技術有限公司から購入した。
３． ＮＫ細胞
実験に用いたＮＫ細胞の起源は次の通りである。
各例に用いたＮＫ細胞は杭州康万達医薬科技有限公司によって培養および凍結保存されたヒトＮＫ細胞であった。ヒトＮＫ細胞は次のプロセスによって調製した。当分野の通常用いられる技術として、採血針を尺骨静脈に挿入して、免疫細胞ＰＢＭＣの抽出のために健康人の末梢静脈血を採集した。放射線照射済みＫ５６２フィーダー細胞（杭州鼎云生物技術有限公司から購入）を用いて、自家血漿培養によってＮＫ細胞を拡大し、ＮＫ細胞は最高で９０％の最終純度、最高で９０％の生存可能性、および最高で８５％のインビトロ腫瘍細胞殺傷率を有した。
４． マウスは北京維通利華実験動物技術有限公司から購入した。
５． ＰＢＳ調合：８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１３６ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．６ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．２～７．４。
６． 次の例に用いた細胞計数方法を下に記載する。
ＣＣＫ８アッセイ：１０μｌのＣＣＫ８溶液を各ウェルの細胞に追加し、それから細胞をインキュベータ内で、３７℃で１～４時間に渡ってインキュベーションし、それからシェーカー上で低速で５分に渡って振盪した。結晶物を充分に溶解および均一混合させ、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度値（ＯＤ４５０）を測定した。阻害率の計算式は次の通りである。細胞増殖阻害率（ＩＲ％）＝１－（ＯＤ４５０試験産物－ＯＤ４５０ブランク）／（ＯＤ４５０負のコントロール－ＯＤ４５０ブランク）×１００％。
ＭＴＴアッセイ：１０μｌのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルの細胞に追加し、それから細胞をインキュベータ内で、３７℃で４時間に渡ってインキュベーションし、培養培地を吸って捨て、１５０μｌのＤＭＳＯを各ウェルに追加し、それからシェーカー上で低速で１０分に渡って振盪した。結晶物を充分に溶解および均一混合させ、マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍの吸光度値（ＯＤ４９０）を測定した。阻害率の計算式：細胞増殖阻害率（ＩＲ％）＝１－（ＯＤ４９０試験産物－ＯＤ４９０ブランク）／（ＯＤ４９０負のコントロール－ＯＤ４９０ブランク）×１００％。
トリパンブルー染色法を用いる細胞計数：細胞をＰＢＳによって洗浄し、トリプシンを用いて消化し、それから細胞をＰＢＳに懸濁した。懸濁液に、０．０４％（ｗ／ｖ）の終濃度でトリパンブルー溶液を追加した。それから、細胞計数を顕微鏡下で行った。これの間に、死細胞は青く染色され、生細胞は未染色のままであった。生細胞数を最終的なデータとして用いた。
７． 培養プレート
各例に用いた６ウェル細胞培養プレート（ウェルあたり２ｍｌ）、１２ウェル細胞培養プレート（ウェルあたり１ｍｌ）、２４ウェル細胞培養プレート（ウェルあたり５００μｌ）、９６ウェル細胞培養プレート（ウェルあたり１００μｌ）は全てコーニング社から得た。
調製例１： Ｅ１Ａ遺伝子発現ベクターの構築
２つのＰＣＲプライマー（Ｐ１：ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧ（配列番号１）およびＰ２：ＴＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧＴＡＡＣＣＡＡＧＡＴＴＡ（配列番号２）。注：プライマーＰ１の５’端にはＢｇｌＩＩ制限部位を追加し、これは下線で示す）を、ヒトアデノウイルス５型（ＡＤ５）ゲノムＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ（すなわち、国立生物工学情報センター。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）のＧｅｎｂａｎｋのアクセッション：ＡＣ＿０００００８）に基づいて設計した。上海三維生物技術有限公司によって産生された腫瘍溶解性ウイルス（Ｈ１０１）のゲノムＤＮＡを抽出し、鋳型として用い、ＡＤ５ゲノムＤＮＡの５５１～１７１４の１１６４ｂｐ配列を高フィデリティＰＣＲによって鋳型から増幅した。実際のサイズは１１７３ｂｐである（図１参照）。この配列はＥ１Ａ遺伝子のコード領域（Ｅ１Ａプロモーター配列を包含しない）および部分的な３’ＵＴＲ領域を包含する。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩによって消化し、ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶ（Ａｇｉｌｅｎｔから購入）のマルチクローニング部位領域（ＭＣＳ）のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＶ部位の間にクローニングし、それによって中間体ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａを得た。得られたｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ陽性クローンはＰ１およびＰ２によるＰＣＲによって確認した。結果は図２に示し、構築プロセスは図３に示した。得られた陽性クローンをシーケンシングし、シーケンシング結果はＡＤ５ゲノムＤＮＡ上の対応する配列と完全に一致した。
ＰＣＲプライマーＰ３およびＰ４（Ｐ３：ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧＧ（配列番号３）およびＰ４：ＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣ（配列番号４）。注：各プライマーの５’端にはＳａｌＩ制限部位を追加し、これは下線で示す）をさらに設計し、得られたｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｅ１Ａ陽性クローンを高フィデリティＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。ＰＣＲ産物はＣＭＶプロモーターとＥ１Ａ遺伝子断片とＳＶ４０ポリＡとを包含するＥ１Ａ発現カセットを含有する。ＰＣＲ産物のサイズは２０１７ｂｐである（図４）。
Ｅ１Ａ発現カセットの得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩによって消化し、ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（Ａｇｉｌｅｎｔから購入）のＭＣＳ領域のＳａｌＩ部位にクローニングした。Ｅ１Ａ発現カセットを挿入された陽性クローンをプライマーＰ３およびＰ４によるＰＣＲによってスクリーニングし（図５）、ＢｇｌＩＩによる消化によって確認した。Ｅ１Ａ発現カセットが正しい向きに挿入されたクローンはＢｇｌＩＩ酵素消化後に７２００ｂｐおよび１４００ｂｐ断片を生じ、Ｅ１Ａ発現カセットが反対向きに挿入されたクローンはＢｇｌＩＩ酵素消化後に７９７０ｂｐおよび６３０ｂｐ断片を生ずるであろう（図６）。図６のプラスミド＃２を爾後の実験のために選択した。中間体ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａが最後に得られた。構築プロセスは図７に示す。得られたｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａ陽性クローンをシーケンシングし、結果は予想される配列と完全に一致した。
調製例２： ｓｈＲＮＡ発現ベクターの構築
それぞれＰＤＬ１のコード領域のｍＲＮＡの１６８～１９０、４３０～４５２、および５８９～６１１の３つの領域を標的化する３つのｓｈＲＮＡ配列（ｓｈＰＤＬ１－１（ｓｈＰＤＬ１－＃１ともまた言う）、ｓｈＰＤＬ１－２（ｓｈＰＤＬ１－＃２ともまた言う）、およびｓｈＰＤＬ１－３（ｓｈＰＤＬ１－＃３ともまた言う）。これらはそれぞれ配列番号１６、配列番号１９、および配列番号２２である）を、ＮＣＢＩウェブサイトのＧｅｎｂａｎｋのヒトＰＤＬ１バリアント１配列（アクセッション：ＮＭ＿０１４１４３）に基づいて設計した。加えて、ヒトＰＤＬ１のｍＲＮＡとは無関係である負のコントロール配列ｓｈＰＤＬ１－ＮＣを設計した。配列は次の通りである。
（１）ｓｈＰＤＬ１－１
合成センス配列（配列番号１４）：
Figure 0007159304000001
合成アンチセンス配列（配列番号１５）：
Figure 0007159304000002
ｓｈＲＮＡのＤＮＡ（配列番号１６）：
Figure 0007159304000003
（２）ｓｈＰＤＬ１－２
合成センス配列（配列番号１７）：
Figure 0007159304000004
合成アンチセンス配列（配列番号１８）：
Figure 0007159304000005
ｓｈＲＮＡのＤＮＡ（配列番号１９）：
Figure 0007159304000006
（３）ｓｈＰＤＬ１－３
合成センス配列（配列番号２０）：
Figure 0007159304000007
合成アンチセンス配列（配列番号２１）：
Figure 0007159304000008
ｓｈＲＮＡのＤＮＡ（配列番号２２）：
Figure 0007159304000009
（４）ｓｈＰＤＬ１－ＮＣ
合成ＮＣセンス配列（配列番号２３）：
Figure 0007159304000010
合成ＮＣアンチセンス配列（配列番号２４）：
Figure 0007159304000011
ｓｈＮＣのＤＮＡ（配列番号２５）：
Figure 0007159304000012
ｓｈＲＮＡ配列の両端のそれぞれＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに対して相補的な付着末端を用いて、４つの配列をｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏベクター（上海生工生物技術有限公司から入手可能）上のＢｂｓＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に繋げた。結果として、ｓｈＰＤＬ１を発現することができる４つのベクター（ｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ｓｈＰＤＬ１－ＮＣ、ｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ｓｈＰＤＬ１－１、ｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ｓｈＰＤＬ１－２、およびｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ｓｈＰＤＬ１－３）が得られた。
試験例１： ｓｈＰＤＬ１の阻害効果の検出測定
ｈＰＤＬ１のｍＲＮＡ（ヒトＰＤＬ１のｍＲＮＡ）に対するｓｈＰＤＬ１の阻害効果をＵ２５１およびＨ４６０細胞において検出測定した。Ｕ２５１およびＨ４６０細胞をそれぞれ１２時間前に１２ウェルプレートにウェルあたり２×１０５細胞で播種した。各ウェルのＵ２５１およびＨ４６０細胞を１．６μｇのｓｈＲＮＡ発現ベクターＤＮＡ：４μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００の比でトランスフェクションした。２つの細胞サンプルをそれぞれ２４時間および４８時間に取った。トータルＲＮＡを抽出し、逆転写を行った後に、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡレベルをコントロールとしてリアルタイムＰＣＲを行って、細胞のヒトＰＤＬ１のｍＲＮＡの発現レベルを検出測定した。結果は、コントロールと比較して、ｓｈＰＤＬ１－＃１、２、３の全てが一定時間以内にｈＰＤＬ１のｍＲＮＡに対する阻害効果を見せるということを示した。ｓｈＰＤＬ１－＃１はｈＰＤＬ１のｍＲＮＡに対する最も有意な阻害効果を有した（図８）。
加えて、３つのｓｈＰＤＬ１の阻害効果を蛋白質レベルでもまた試験した。２９３Ｔ細胞を、それぞれプラスミドｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ｓｈＰＤＬ１－ＮＣ、ｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ｓｈＰＤＬ１－１、ｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ｓｈＰＤＬ１－２、およびｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ｓｈＰＤＬ１－３によって、ｐｃＤＮＡ３．３－ｈＰＤＬ１－３×ＦＬＡＧと共に等モル比（１：１）で一過的にトランスフェクションした。プラスミドｐｃＤＮＡ３．３－ｈＰＤＬ１－３×ＦＬＡＧは３×ＦＬＡＧタグと融合したヒトＰＤＬ１蛋白質を発現する。４８時間後に細胞サンプルを採集し、細胞溶解後にウエスタンブロット分析を行った。結果は、ｓｈＰＤＬ１－＃１が過剰発現されたｈＰＤＬ１を有意に縮減し得ることを証明した（図９参照）。
ｐｃＤＮＡ３．３－ｈＰＤＬ１－３×ＦＬＡＧプラスミドの構築プロセスは次の通りであった。最初に、２つのプライマー（Ｐ１１：ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＡＴ（配列番号１１）、Ｐ１２：ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＴＧＴＡＴＣＡＣ（配列番号１２））をＮＣＢＩのヒトＰＤＬ１遺伝子のｍＲＮＡ配列に基づいて設計した。Ｕ２５１細胞のトータルＲＮＡをＴｒｉｚｏｌによって抽出し、鋳型として用いてＲＴ－ＰＣＲを行ってｈＰＤＬ１のｃＤＮＡを得た。これをそれからｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＩＲＥＳ－ｈｒＧＦＰ－１ベクター（Ａｇｉｌｅｎｔから購入）にクローニングし、ｈＰＤＬ１をその下流のＦＬＡＧタグと融合して発現し、中間体ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＨＰＤＬ１－ＩＲＥＳ－ｈｒＧＦＰ－１を得た。別のプライマー（Ｐ１５：ＣＧＣＣＴＡＴＴＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＧ（配列番号１３））を設計し、プライマーＰ１１と一緒に用いて、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ｈＰＤＬ１－ＩＲＥＳ－ｈｒＧＦＰ－１上のｈＰＤＬ１ｃＤＮＡ－ＦＬＡＧ－ＩＲＥＳ－ｈｒＧＦＰを包含する配列を増幅した。それから、断片をｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）にクローニングしてｐｃＤＮＡ３．３－ｈＰＤＬ１－ＦＬＡＧベクターを得た。挿入された断片をシーケンシングし、配列が完全に正しいことを確認した。
調製例３： 腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）のゲノムＤＮＡの調製
１． ｓｈＰＤＬ１の阻害効果が確認された後に、Ｕ６プロモーターおよびｓｈＰＤＬ１の配列全体を包含するコードカセットをｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａベクターにクローニングした。ｐＳＧＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ｓｈＰＤＬ１ベクターをＳａｃＩによって消化し、それによって形成された付着末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって消化して平滑末端を得た。それから、エタノール／酢酸アンモニウムを用いて沈殿および回収を行った。Ｕ６プロモーターおよびｓｈＰＤＬ１配列を包含するコードカセット配列をＫｐｎＩによる消化によって回収した。同時に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１ＡベクターをＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶによって消化し、回収した。最後に、３つのｓｈＰＤＬ１コードカセットをそれぞれｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａベクターに繋げて、図１０に示されている通り最終的なベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａを得た。いくつかのコロニーをプラスミド抽出のために選択し、ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって鑑定した。正しいクローンは３７０ｂｐのバンドを生ずるであろう（図１１参照）。正しいｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａプラスミドをシーケンシングのために選択した。結果は、配列が完全に正しいことを示した。
２． ４つのプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａ（コントロールプラスミド）、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－２－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、およびｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－３－ＣＭＶ－Ｅ１ＡをＰｍｅＩによって消化して線状化し、ＢＪ５１８３株にトランスフェクションした。これの中で、トランスフェクションされたプラスミドとＡＤ５アデノウイルスゲノムＤＮＡ（Ｅ１およびＥ３領域を欠失する）を含有するｐＡｄＥａｓｙ－１プラスミド（Ａｇｉｌｅｎｔから購入）との間において相同組換えを行った。よって、ＣＭＶ－Ｅ１Ａ－ＳＶ４０ｐＡ発現カセットおよび／またはＵ６－ｓｈＰＤＬ１コードカセットがアデノウイルスＡＤ５のゲノムＤＮＡ中にインテグレーションされ、それによって、目当ての遺伝子を発現しかつ複製し得る腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）のゲノムＤＮＡを得た（図１２）。
具体的な実験プロセスは次の通りである。
（１） ＢＪ５１８３コンピテントセルの調製
我々の研究室において－８０℃に保存したＢＪ５１８３株（ｐＡｄＥａｓｙ－１プラスミドが移入された）をＬＢ／Ａｍｐ培地に接種し、３７℃かつ２００ＲＰＭにおいて一晩培養し活性化させた。ＢＪ５１８３コンピテント細菌を生工生物工程株式会社のスーパーコンピテントセル調製キット（Ｂ５２９３０３－００４０）を用いて調製し、チューブに１００μｌずつ小分けし、用時まで－８０℃で保存した。
（２） ｐＳｈｕｔｔｌｅ関連プラスミドとｐＡｄＥａｓｙ－１プラスミドとの間の相同組換え
各ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－２－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、およびｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－３－ＣＭＶ－Ｅ１Ａの１μｇのプラスミドＤＮＡを取り、それぞれ１μｌのＰｍｅＩによって消化した。３７℃での１．５時間の反応後に、１μｌのアルカリホスファターゼを追加して線状化ＤＮＡ断片を脱リン酸化した。それから、消化産物を１００μｌのＢＪ５１８３コンピテント細菌に直接的に追加して、従来の形質転換を行った。最後に、形質転換された細菌溶液をＫａｎａ耐性ＬＢプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。次の日に、プレート上に現れたコロニーを拾い、ＬＢ／Ｋａｎａに接種し、一晩培養してプラスミドＤＮＡを抽出し、従来のＰａｃＩ消化を行った。消化産物を電気泳動によって分析した。相同組換えが起こる位置に依存して、相同組換えの３種類の異なるモードが起こり得る（図１３）。ＰａｃＩによる消化後に４．５Ｋｂまたは３Ｋｂ断片を生じ得るプラスミドは、正しい相同組換えを起こしたプラスミドである。消化産物の電気泳動結果（図１４）は、正しい相同組換えがｐＡｄＥａｓｙ－１プラスミドとそれぞれｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１Ａ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－２－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、およびｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－３－ＣＭＶ－Ｅ１Ａとの間において起こり、腫瘍溶解性アデノウイルス（全てＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１と呼ぶ）およびそのコントロールウイルスをパッケージングするためのゲノムＤＮＡ（ｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１＃１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、ｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１＃２－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、ｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１＃３－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、およびｐＡｄＥａｓｙ－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ）が首尾よく得られたということを証明している。もたらされた陽性クローン内に挿入されたｓｈＰＤＬ１コードカセットおよびＥ１Ａ発現カセットをシーケンシングし、完全に正しいことを確認した。
調製例４： 腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）のパッケージングおよび増幅
（１） 腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）をパッケージングするためのゲノムＤＮＡの調製
ｐＡｄＥａｓｙ－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、ｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１＃１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、ｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１＃２－ＣＭＶ－Ｅ１Ａ、およびｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１＃３－ＣＭＶ－Ｅ１Ａのそれぞれの２μｇのプラスミドＤＮＡに、２μｌのＰａｃＩ酵素を追加し、３７℃での２時間の反応後に、エタノール／酢酸アンモニウムによるＤＮＡの沈殿を行い、７０％エタノールによってリンスした。それから、ＤＮＡ沈殿を１０μｌの純ｄｄＨ２Ｏに溶解し、ＡＤ２９３にトランスフェクションしてウイルスパッケージングを行った。
（２） 腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）のパッケージング
良好な成長状態のＡＤ２９３細胞を１日前に６ウェルプレートに接種し、接種細胞数は、次の日にトランスフェクションを行うときに細胞の６０～７０％コンフルエントを達成することが適当である。調製した線状化ＤＮＡ（約２μｇ）およびＱＩＡＧＥＮから購入したＡｔｔｒａｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（６μｌ）を均一混合し、ＡＤ２９３細胞に追加した。混合物を上下左右に均一混合し、細胞インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）内に置き、さらに約１０～１４日に渡って培養する。細胞変性を２～３日毎に観察する。細胞の小片が「数珠状」になり、大量の細胞が脱落するまで徐々に拡大したときに、細胞を穏やかに吹き叩いて細胞および培養上清を収穫し得る。これらは－８０℃で保存するか、または直接的にさらなる増幅を行った。プロセスを図１５に示す。
（３） 腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）の増幅
類似に、良好な成長状態のＡＤ２９３細胞を１日前に６ｃｍペトリ皿に接種し、接種細胞数は、次の日にトランスフェクションを行うときに細胞の７０～８０％コンフルエントを達成することが適当である。先に採集したウイルス上清の８００～１０００μｌを各６ｃｍペトリ皿に追加し、混合物を上下左右に均一混合した後に、細胞培養培地によってさらに培養した。通常は、大量の細胞が４８時間後に丸くなり、剥離した。このときに細胞および培養上清を採集し得る。爾後に、ウイルスのさらなる増幅を１０ｃｍペトリ皿で行い、細胞密度はウイルスが接種されるときに好ましくは約７０％である。先に採集したウイルス上清の１２００～１５００ｍｌを各１０ｃｍペトリ皿に追加し、４８時間後に大量の細胞が変性剥離したときに細胞および上清を採集した。最後に、ウイルスをさらに１５ｃｍペトリ皿で増幅し、細胞密度が約７０％であるときに、１０ｃｍペトリ皿から採集したウイルス培養上清の２ｍｌを追加した。均一混合後に、細胞をさらに４８時間に渡って培養して細胞および培養上清を採集した。ウイルスはそれから１５ｃｍペトリ皿で所望のウイルス量まで反復的に増幅され得る。
（４） 腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）力価の決定
アデノウイルスの力価を測定するための方法は、ＶＰ法、ＧＴＵ／ＢＦＵ法、プラーク法、ＴＣＩＤ５０法、およびＨｅｘｏｎ染色（キット）法を包含する。ＴＣＩＤ５０法およびＨｅｘｏｎ染色法はより正確であり、再現率が高い。この例では、得られたウイルス上清中の活性なウイルス粒子数（単位：ＰＦＵ／ｍｌ）をＨｅｘｏｎ染色法によって測定した。結果を下に示す。本開示に記載される３種類のｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａプラスミドおよび１種類のコントロールプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＭＣＳ－Ｅ１ＡをｐＡｄＥａｓｙ－１プラスミドと相同組換えさせて、６種類のｐＡｄＥａｓｙ－Ｕ６－ｓｈＰＤＬ１－ＣＭＶ－Ｅ１Ａプラスミドおよび２種類のｐＡｄＥａｓｙ－ＣＭＶ－Ｅ１Ａを生じた（図１３参照。各種類のプラスミドは２つの正しい様式の相同組換えを行い得、そして２つの正しいプラスミドを得る。ＰａｃＩによる消化後に、それぞれ４．５Ｋまたは３Ｋのバンドを生じ得る）。相同組換えによって得られた８種類のプラスミドを用いて、ＡＤ２９３によってウイルスをパッケージングして、８種類の腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－Ｃ－４．５Ｋ、ＯＡｄ－Ｃ－３Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－４．５Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃１－３Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ２＃１－４．５Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃２－３Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－４．５Ｋ、およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１＃３－３Ｋを得た。これらはそれぞれ次の通り略称される。Ｃ－４．５Ｋ、Ｃ－３Ｋ、１－４．５Ｋ、１－３Ｋ、２－４．５Ｋ、２－３Ｋ、３－４．５Ｋ、および３－３Ｋ。それらのうち、Ｃ－４．５ＫおよびＣ－３Ｋは同じ配列を有する同一種類のウイルスであり、１－４．５Ｋおよび１－３Ｋは同じ配列を有する同一種類のウイルスであり、２－４．５Ｋおよび２－３Ｋは同じ配列を有する同一種類のウイルスであり、３－４．５Ｋおよび３－３Ｋは同じ配列を有する同一種類のウイルスである。
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例１： 細胞（腫瘍細胞および正常細胞）内での腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）の複製能力
細胞（ＨＵＶＥＣ、ＭＲＣ－５、Ｈｅｌａ、Ａ５４９、およびＵ２５１）をウェルあたり１．５×１０５細胞の量で１２ウェルプレートに播種した。培養培地の体積（ＨＵＶＥＣ細胞はＡｌｌｃｅｌｌｓ専用培地で培養した。細胞および培地両方はＡｕｓｓｅｌｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（上海）有限公司から購入した。ＭＲＣ－５細胞はＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で培養した。Ｈｅｌａ細胞はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ培地で培養した。Ａ５４９細胞はＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ培地で培養した。Ｕ２５１細胞はＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養した。全ての培地はＧｉｂｃｏ社から購入した）は１ｍｌであった。１２時間後に、培地を除去し、細胞をＰＢＳによって１回リンスし、５００μｌのウイルス懸濁液（調製例４によって調製した）を図１６に示されている通り１０のウイルス多重感染度（ＭＯＩ）で追加した。ウイルスを細胞と一緒に９０分に渡ってインキュベーションした後で、ウイルス懸濁液を除去し、細胞をＰＢＳによって２回リンスした。この時点を０時間と見なし、細胞サンプルの一部をトリプシン処理によって取った。細胞サンプルの別の一部を４８時間後に取った。０時間および４８時間に収穫した細胞サンプルのゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、アデノウイルス５型Ｅ１Ａ遺伝子（Ｐ５：ＴＣＣＧＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＴ（配列番号５）およびＰ６：ＴＣＣＴＣＣＧＧＴＧＡＴＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡ（配列番号６））、Ｈｅｘｏｎ遺伝子（Ｐ７：ＣＣＡＴＴＡＣＣＴＴＴＧＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴ（配列番号７）およびＰ８：ＧＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＴＡＴＴＴＡＧＴＡＴＣ（配列番号８））、ならびにヒトＧＡＰＤＨ遺伝子（Ｐ９：ＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＴＧＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴＴＡＧＡＴ（配列番号９）およびＰ１０：ＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＡＴＧＴＡＡ（配列番号１０））の特異的プライマーを用いてＱ－ＰＣＲを行った。ウイルスが４８時間に渡って細胞に感染した後の細胞内でのウイルスの複製能力をＱ－ＰＣＲ結果に基づいて分析した。異なる細胞内での腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）の複製能力の比較は図１７に示されている通りであった。
図１７に示されている結果は、本開示に従って構築された４種類の腫瘍溶解性アデノウイルス（コントロールウイルスＣ－４．５Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１ウイルス１－４．５Ｋ、２－４．５Ｋ、および３－４．５Ｋ）が、試験された細胞内での異なる複製能力を有するということを指示した。本開示に従う腫瘍溶解性ウイルスは試験された腫瘍細胞内で非常に強い複製能力を見せ、不死化ヒト胎児肺線維芽細胞株内での強い複製能力をもまた見せた。しかしながら、それらはヒト初代細胞ＨＵＶＥＣ内では非常に低い複製能力を見せた。ヒト正常細胞内での複製能力は腫瘍細胞株または腫瘍形成傾向を有する細胞株（例えば、不死化ヒト胎児肺線維芽細胞株ＭＲＣ５）内でのものよりも約４２～４４４倍低い。よって、本開示の腫瘍溶解性アデノウイルスは選択的複製の面では強い腫瘍細胞選好性を示し、それゆえに将来の臨床応用の面ではより高い安全性を有し、ウイルスの使用量の面ではより大きい余地を有するということが信じられる。
例２： 腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）の殺傷能力
この例では、本開示に従う腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）の殺傷能力をＣＣＫ８アッセイによって試験した。細胞（Ｕ２５１、Ｈｅｌａ、およびＡ５４９）をウェルあたり１．５×１０３細胞で９６ウェルプレートに播種した。培養培地の体積（Ｕ２５１細胞はＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養した。Ｈｅｌａ細胞は培地ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳで培養した。Ａ５４９細胞は培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳで培養した。全ての培地はＧｉｂｃｏ社から購入した）は各ウェルについて１００μｌである。１２時間後に、５０μｌの培地を除去し、ウイルス（それぞれ調製例４で調製したコントロールウイルスＣ－４．５Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１ウイルス１－４．５Ｋ、２－４．５Ｋ、および３－４．５Ｋ）および純粋な培地の５０μｌ混合物をそれぞれ１、３、１０、３０、１００、および３００の多重感染度（ＭＯＩ）で追加した（この時点を０時間として記録した）。各ＭＯＩについて３つのデュプリケートを設けた。１０μｌのＣＣＫ８（同仁化学研究所から購入）を４８時間および７２時間の時点で追加した。４５０ｎｍの培養物の吸光度値を１時間のインキュベーション後に測定した。得られた吸光度値に従って、細胞に対する異なるウイルスの殺傷能力を決定した。市販の腫瘍溶解性アデノウイルスＨ１０１をコントロールとして用いた。実験では、同じ細胞を同じＭＯＩのウイルス量によって処置し、同じ時点で吸光度値を測定した。加えて、１μＭのパクリタキセル溶液を系の正のコントロールとして用いた。３種類の腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）の用量依存的殺傷効果および半数殺傷用量（ＩＣ５０）を図１８～２１に示した。
結果は、Ｕ２５１、Ａ５４９、およびＨｅｌａ細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルス（コントロールウイルスＣ－４．５Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１ウイルス１－４．５Ｋ、２－４．５Ｋ、および３－４．５Ｋ）の殺傷効果が有意な用量依存性を見せるということを示した。市販の腫瘍溶解性アデノウイルスＨ１０１と比較して、本開示に従う腫瘍溶解性アデノウイルスは類似の殺傷効果を示し、Ｕ２５１細胞に対する殺傷効果はＨ１０１のものより優れてさえもいた。これは殺傷効果の統計分析によって有意な差を有した。加えて、７２ｈにおける異なる細胞に対する本開示の腫瘍溶解性ウイルスの半数殺傷用量（ＩＣ５０）を比較することによって、ヒトグリオーマ細胞Ｕ２５１に対する腫瘍溶解性ウイルスのＩＣ５０が最も低いことが見いだされる。これは、腫瘍溶解性ウイルスがヒトグリオーマの処置においてより重要な臨床的価値を有し得ることを指示している。
例３： 腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）によって発現されたｓｈＰＤＬ１の効力
本開示の腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）によって発現されたｓｈＰＤＬ１の効力の検出測定を容易化するために、この例では、ＦＬＡＧタグ付きｈＰＤＬ１を安定発現し得る２つの細胞株Ａ５４９／ｈＰＤＬ１－ＦＬＡＧおよびＨｅｌａ／ｈＰＤＬ１－ＦＬＡＧを構築した。構築プロセスは次の通り略述される。例２に従って得られたｐｃＤＮＡ３．３－ｈＰＤＬ１－ＦＬＡＧベクター（ｐｃＤＮＡ３．３－ｈＰＤＬ１－ＦＬＡＧ－ＩＲＥＳ－ｈｒＧＦＰベクターともまた言う）をｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００によってＡ５４９細胞およびＨｅｌａ細胞にトランスフェクションした。ベクターはネオマイシン遺伝子を保有するので、Ｇ４１８を追加して３回のスクリーニングを行い、ＦＬＡＧタグ付きｈＰＤＬ１およびＧＦＰ蛋白質を安定発現することができるＡ５４９／ｈＰＤＬ１－ＦＬＡＧおよびＨｅｌａ／ｈＰＤＬ１－ＦＬＡＧ細胞株を最後に得た。
上の２つの細胞株を、Ｈ１０１および本開示に従う４種類の腫瘍溶解性アデノウイルス（調製例４で調製したコントロールウイルスＣ－４．５Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１ウイルス１－４．５Ｋ、２－４．５Ｋ、および３－４．５Ｋ）によって１０の多重感染度（ＭＯＩ）で処置した。細胞サンプルをウイルス感染の４８時間後に収穫し、溶解後にウエスタンブロット分析を行って、ＦＬＡＧタグ付きｈＰＤＬ１の発現レベルの変化を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて検出測定した。結果を図２２および２３に示した。ウエスタンブロットの結果は、Ａ５４９細胞およびＨｅｌａ細胞が腫瘍溶解性アデノウイルスによって処置された後に、ｈＰＤＬ１の発現レベルが異なる程度で増大するということを示した。しかしながら、同じ細胞がそれぞれ３種類のＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１腫瘍溶解性ウイルスによって処置された後には、ｈＰＤＬ１のもともと増大した発現は異なる程度で阻害された。特に、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１－１（１－４．５Ｋ）は最も有意な阻害効果を見せた。結果は先のＱ－ＰＣＲ結果およびコトランスフェクション後のウエスタンブロット結果と一致した。
調製例５： 腫瘍溶解性アデノウイルスの超遠心精製手続き
１） 超遠心前の腫瘍溶解性アデノウイルスの溶液の調製
２９３細胞を１５ＣＭ皿上で、調製例４で得られたアデノウイルス培養上清によってウイルス上清対細胞培養培地の２：２０の体積比（ＡＤ：ＤＭＥＭ＝２：２０）で感染させ、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で約３６時間に渡ってさらにインキュベーションした。細胞の約５０％の細胞変性効果（ＣＰＥ）が顕微鏡下で観察され、細胞が浮いたときに、吹き叩くことまたは掻き取ることなどによってペトリ皿の細胞および培養液を採集し、４℃で短時間保存、または－２０℃もしくは－８０℃で長期保存した。一般的に、１回の超遠心によって精製されるウイルス量は、６０から８０個の１５ｃｍペトリ皿（培地上清および感染した２９３細胞を包含する）によって産生されるウイルス量である。採集した腫瘍溶解性ウイルスを含有する２９３細胞および培養上清を３０００ＲＰＭで３０分に渡って４℃において遠心した。上清および沈殿をそれぞれ爾後の実験に付した。Ａ） 遠心上清は新たなフラスコに移し、４℃で一時的に保存し、細胞に感染させることによってウイルス増幅に用いた。ウイルス増幅の終わりまでに、全ての上清をＰＥＧ８０００溶液（２０％ＰＥＧ８０００を含有する２．５ＭのＮａＣｌの水溶液）と２：１の比で混合し、氷上で１時間または一晩に渡って沈殿させた。それから、２０分の１２０００ＲＰＭの遠心後に、上清を捨て、ウイルス沈殿を保持した。最後に、それが完全に分散されるまで、ウイルス沈殿を適当量の１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）溶液に再懸濁した。５分の７０００ＲＰＭの遠心後に、ウイルス含有上清を保持し、ウイルス含有上清を超遠心のための勾配塩化セシウム遠心チューブに直接的にローディングした。Ｂ） 遠心後の細胞沈殿は、小量の１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）によって穏やかに（吹き叩くことなしに）洗浄して、細胞表面の培地を洗浄および除去した。１０から１２個の１５ｃｍペトリ皿からの細胞沈殿を３ｍｌのＴｒｉｓ－Ｃｌに再懸濁し、細胞懸濁液を小分けし、－２０℃で保存した。精製前の保存時間は２ヶ月よりも多くはない。サンプルを採集した後に、細胞懸濁液を３７℃の水浴によって融解し、３０秒に渡って激しく振盪し、－８０℃冷凍庫に戻すか、またはドライアイス／純粋なエタノール混合物中に置いて細胞懸濁液を急速凍結した。凍結融解プロセスを３～５回繰り返して、細胞膜を完全に破壊し、それによってウイルスを細胞から放出してウイルス溶液を得た。ウイルス溶液を直ちに精製しない場合には、それは－２０℃で保存され得る。超遠心による精製前に、このステップで得られたウイルス溶液を３７℃の水浴によって融解し、１６０００ＲＰＭの速度で室温において１０分に渡って遠心した。ウイルス含有上清を採集し、これは一時的に氷上で低温保存され得る。
２） 塩化セシウム密度勾配遠心によるＡＤウイルス精製
塩化セシウム密度勾配遠心は種々のウイルスの単離および精製のためになお最も常用される方法である。主に、これはＣｓＣｌ溶液中における異なるウイルスの異なる浮遊密度に依拠しており、細胞ライセート中の他の成分からそれらを分離する。標的ウイルスの特異的なバンドを採集した後で、ＰＤ－１０脱塩カラムを用いて塩化セシウムを除去し、精製されたウイルスが最後に得られた。非常に高純度のウイルスがこの方法を用いて得られ得る。具体的な精製手続きは次の通りである。
１． 最初の超遠心のための塩化セシウム密度勾配の調製：１．６ｍｌの軽いＣｓＣｌ（１．２ｇ／ｍｌ）をベックマン超遠心チューブに追加した後に、１．０５ｍｌの重いＣｓＣｌ（１．４５ｇ／ｍｌ）をゆっくり底部に追加した。超遠心チューブの体積に応じて、追加される軽いＣｓＣｌおよび重いＣｓＣｌの体積は２．５ｍｌの軽いＣｓＣｌおよび２．５ｍｌの重いＣｓＣｌにもまた変えられ得る（注：このステップでは、軽いＣｓＣｌおよび重いＣｓＣｌを混合しない。それらの間のはっきりした境界を維持する）。
２． ３～７ｍｌのウイルス含有上清を軽いＣｓＣｌの液体表面上に穏やかに追加し、それから超遠心チューブを遠心スリーブに入れた。２つの対向する遠心チューブを秤量して釣り合わせ、それから遠心ローターの対応する２つのフックに掛けた（注：操作はプロセス全体を通して穏やかでなければならない）。
３． 遠心チューブを完全にきちんと掛けた後で、遠心を４００００ＲＰＭで１時間１５分に渡って２０℃において行った。
４． 遠心が終了した後に、バイオセーフティキャビネット内の鉄製の架台上のユニバーサルクランプに遠心チューブをしっかり固定した。１８Ｇ針を取り付けた５ｍｌシリンジを用いて、無傷のウイルス粒子の最も下のバンドの下（～１ｃｍ）で遠心チューブを注意深く穿刺し、バンドのみを吸い出し、氷上で短時間保存した。
５． 第２の超遠心のためのＣｓＣｌ溶液の調製：等体積で均一混合した６ｍｌのＣｓＣｌ溶液（３ｍｌの軽いＣｓＣｌおよび３ｍｌの重いＣｓＣｌ）を超遠心チューブに追加し、ステップ４で採集したウイルス溶液を、調製したＣｓＣｌ溶液の液体表面上に注意深く灌注した。灌注したチューブもまた超遠心チューブスリーブに注意深く入れ、遠心ローター上に置かれるべき対向する２つのチューブを秤量し、釣り合わせた。それから、釣り合った遠心チューブを遠心ローターに掛けた（注：操作はプロセス全体を通して穏やかでなければならない）。
６． 遠心パラメータを設定する：２０℃、４０，０００ＲＰＭ、１８時間遠心。
７． 遠心が終了した後に、バイオセーフティキャビネット内の鉄製の架台上のユニバーサルクランプに遠心チューブを注意深くしっかり固定した。１８Ｇ針を取り付けた５ｍｌシリンジを用いて、無傷のウイルス粒子のバンドの下（～１ｃｍ）で遠心チューブを注意深く穿刺し、バンドを吸い出し、氷上で短時間保存した。
８． バイオセーフティキャビネット内で、ＰＤ－１０脱塩カラム（カラム体積は５ｍｌである）を取り出し、カラムの底部の端を切り落とし、それからカラムを鉄製の架台上に固定する。その結果、カラム内の保存液は重力の作用下で自然に流れ出し得る。カラム体積の３から４倍（１５から２０ｍｌ）の透析溶液（１ｍＭのＭｇＣｌ２および１０％グリセロールを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（ｐＨ７．４）。濾過滅菌後に４℃で保存）を追加して、脱塩カラムを徹底的に洗浄し、保存溶液を完全に交換した。
９． １０個の付番した１．５ｍｌ遠心チューブをウイルス採集のために用意した。
１０． 追加した透析液が完全に流れ出た後に、第２の超遠心によって採集したウイルス溶液を空のＰＤ－１０カラムに追加した。体積差に応じて、用意した遠心チューブによってカラム内の濾過された溶液を採集した（１．２～１．５ｍｌ／チューブ）。
１１． 透析液をさらに追加して濾過を行った。追加量は各回に２．５ｍｌである。１０個の遠心チューブが採集されるまで、濾過された溶液を用意した遠心チューブに連続的に採集した。
１２． １１個の１．５ｍｌ遠心チューブを用意し、９０μｌの０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを各チューブに追加した。１０μｌのウイルスを１０個のウイルス採集チューブのそれぞれから取り、前もってＳＤＳを追加し然るべく付番した遠心チューブに追加した。１０μｌの透析液を、ＳＤＳを追加した遠心チューブに追加し、系のコントロールとした。ウイルスおよびＳＤＳ溶液を十分に混合した後に、混合物を時々振盪しながら１５～３０分に渡って室温に置いた。それから、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度値を測定し、ウイルス溶液中のウイルス粒子数の光学濃度を式（１ＯＤ２６０＝１×１０１２ＶＰ）に従って計算した。ＯＤ２６０値は採集液中のウイルスＤＮＡ濃度を反映し、ＯＤ２８０値は採集液中の蛋白質濃度を反映する。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の比は約１．２～１．３である。
１３． 得られたウイルスを然るべく希釈した後で、適当な希釈度の２つの希釈液を選択し、それぞれについて１００μｌを取って、２４ウェルプレートに接種された適切な濃度のＡＤ２９３細胞に感染させる。４８時間後に、アデノウイルス力価測定キット（上海コウ翔生物技術有限公司）によってウイルスの正確な力価を検出測定する。
濃度および実験要件に応じて、超遠心精製した高品質ウイルス液を異なる体積の異なるきれいな遠心チューブに分けた。それらは日付およびウイルス名をマークして用時まで－８０℃で保存した。
例４： 腫瘍細胞（ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ１、ＨＴ２９、およびＨ４６０）に対する腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）の殺傷能力
この例では、腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）の殺傷能力をＭＴＴアッセイによって試験した。ヒト腫瘍細胞（ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ１、ＨＴ２９、およびＨ４６０）を９６ウェルプレートに播種し、ウェルあたりの播種細胞数は３×１０３細胞であり、各ウェルの培養培地は１００μｌであった（ＨＣＴ１１６細胞は培地マッコイ５Ａ＋１０％ＦＢＳで培養した。ＰＡＮＣ－１細胞は培地ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養した。ＨＴ２９細胞は培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳで培養した。Ｈ４６０細胞はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳで培養した。全ての培地はＧｉｂｃｏ社から購入した）。１２時間後に、５０μｌの培地を捨て、ウイルス（用いたウイルスはそれぞれコントロールウイルスＣ－４．５Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１ウイルス１－４．５Ｋ、２－４．５Ｋ、および３－４．５Ｋであった。これらは調製例５に記載されている方法に従って調製した）および血清不含培地の５０μｌ混合物を追加し（この時点を０時間として記録した）、多重感染度（ＭＯＩ）はそれぞれ１、３、１０、３０、１００、および３００であった。各ＭＯＩについて３つのデュプリケートを設けた。１０μｌのＭＴＴ溶液（索莱宝生物科技有限公司から購入）（５ｍｇ／ｍｌ、すなわち０．５％ＭＴＴ）をそれぞれ４８時間および７２時間の時点で各ウェルに追加し、４時間に渡ってさらにインキュベーションを行った。それから、細胞に接触することおよび捨てることなしに、全ての培養培地を注意深く捨てた。１５０μｌのＤＭＳＯを各ウェルに追加し、シェーカー上で低速で１０分に渡って振盪して結晶物を十分に溶解し、４９０ｎｍの吸光度値をマイクロプレートリーダーによって測定した。市販の腫瘍溶解性アデノウイルスＨ１０１をコントロールとしてこの実験に用い、同じ細胞を同じＭＯＩのウイルス量によって処置し、吸光度値を同じ時点で同時に測定した。加えて、１μＭパクリタキセル溶液を系の正のコントロールとして用いた。データはグラフパッドプリズム５．０４を用いて分析し、用量反応曲線をプロットし、ＩＣ５０を計算した。阻害率の計算式は次の通りである。細胞増殖の阻害率（ＩＲ％）＝１－（ＯＤ試験サンプル－ＯＤブランク）×１００％。４種類の腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルス（ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１）の用量依存的殺傷効果および半数殺傷用量（ＩＣ５０）の結果を図２５～２９に示した。
結果は、本開示に従って調製した腫瘍溶解性アデノウイルス（コントロールウイルスＣ－４．５Ｋ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１ウイルス１－４．５Ｋ、２－４．５Ｋ、および３－４．５Ｋ）のＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ１、ＨＴ２９、およびＨ４６０に対する殺傷効果が顕著な用量依存性を見せ、全てのウイルスが強い殺傷能力を有することを示した。市販の腫瘍溶解性アデノウイルスＨ１０１と比較して、本開示に従うウイルスは類似の殺傷効果を有した。将来の臨床応用上、本開示の腫瘍溶解性アデノウイルスは上述の種類の腫瘍の処置に用いられ得ることが期待される。
例５： 腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１によって発現されたｈＰＤＬ１の効力
この例は、細胞によるインビトロ機能アッセイおよび腫瘍を持つマウスモデルによるインビボ機能アッセイを包含する。実験に用いた腫瘍溶解性アデノウイルスはコントロールウイルスＣ－４．５ＫおよびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１ウイルス１－４．５Ｋであった（用いたウイルスは調製例５に従って調製した）。
１． インビトロの腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１によって発現されたｓｈＰＤＬ１機能を検出測定するための細胞アッセイ
（１） ヒト乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する細胞アッセイ
実験に用いた細胞株はヒトＰＤＬ１の発現レベルが高いヒト乳癌細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１であった。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を６ウェルプレートの３つのウェルにウェルあたり１×１０６細胞の量で播種した。１２時間後に、１×１０７ＰＦＵ（ＭＯＩ＝１０）の腫瘍溶解性アデノウイルスＣ－４．５Ｋまたは１－４．５Ｋを含有するウイルスおよび血清不含Ｌ１５培地（Ｌ１５培地はＧｉｂｃｏから購入した）の１００μｌ混合物を、それぞれ、２つのウェルのそれぞれに追加した。１００μｌの血清不含培地を残りの１つのウェルに追加し、ブランクコントロールとした。６ウェルプレートを穏やかに上下左右に均一混合して、ウイルスが可能な限り培養ウェル内に均一に分布するようにさせた。３７℃かつ５％ＣＯ２の２４時間のインキュベーション後に、細胞をトリプシン消化した後に、細胞サンプルを収穫した。収穫した細胞サンプルをきれいなＰＢＳによって２回リンスし、収穫した細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を加えたＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、および１／２０のカクテルプロテアーゼ阻害剤）に懸濁し、氷上に置いて、３０分に渡って溶解した。細胞サンプルを時々振盪しながら均一混合し、１２０００ＲＰＭで５分に渡って遠心し、それから上清および細胞ペレットを収穫し、それぞれ－２０℃で保存した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の３つの群の収穫した上清のｈＰＤＬ１蛋白質レベルを従来のウエスタンブロッティングによって検出測定した。一次抗体はＮｏｖｕｓｂｉｏからのウサギ由来ＰＤＬ１抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＢＰ２－１５７９１）であった。各群はトリプリケートであった。ウエスタンの結果およびグレースケールスキャン値分析を図３０に示した。
ウエスタン実験の上の結果に従うと、本開示に従うＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１腫瘍溶解性ウイルスによって処置されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のｈＰＤＬ１の発現レベルは有意に変化したことが分かる。ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１処置群（１－４．５Ｋ群）のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のｈＰＤＬ１の発現レベルはコントロール群と比較して約７２．４％縮減されたが、腫瘍溶解性ウイルスコントロール群（Ｃ－４．５Ｋ群）のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のｈＰＤＬ１の発現レベルは有意に変化しなかった。
次に、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２ウェルプレートの３つのウェルにウェルあたり１×１０４細胞で接種した。１２時間後に、１×１０５ＰＦＵ（ＭＯＩ＝１０）の腫瘍溶解性アデノウイルスＣ－４．５Ｋまたは１－４．５Ｋおよび血清不含培地の混合物をそれぞれ３つのウェルのうち２つのウェルに追加した。等体積の血清不含培地を残りの１つのウェルに追加し、ブランクコントロールとした。１２ウェルプレートを穏やかに上下左右に均一混合して、ウイルスが可能な限りウェル内に均一に分布するようにさせた。３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で２４時間に渡って培養した後に、細胞サンプルを収穫し、ＣＤ２７４フローサイトメトリー抗体（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）を用いてＦＡＣＳを行い、細胞サンプル中のｈＰＤＬ１を発現する細胞のパーセンテージを検出測定した。全ての群はトリプリケートであった。フローサイトメトリー結果を図３１に示した。
実験結果は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が本開示に従う腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１によって処置された後には、細胞膜上のｈＰＤＬ１が検出測定され得る細胞のパーセンテージはいずれかの処置なしのブランクコントロール群と比較して約５％縮減されるが、腫瘍溶解性ウイルスコントロール群（Ｃ－４．５Ｋ群）では、ｈＰＤＬ１が検出測定され得る細胞のパーセンテージはいずれかの処置なしのブランクコントロール群と比較して約９％増大することを示した。これは、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞を刺激した後に腫瘍細胞表面のｈＰＤＬ１発現の増大を誘導し得るという関連文献の申し立てと整合している（例えば、科学文献“Ｄｍｉｔｒｉｙ Ｚａｍａｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．ＰＤ－Ｌ１ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１８；１２８（４）：１４１３-１４２８．”；“Ｚｕｑｉａｎｇ Ｌｉｕ， ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｗｏｒｋｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７ Ｍａｒ ２７；８：１４７５４－１４７６５．”；または“Ｐｒａｖｅｅｎ Ｋ．Ｂｏｍｍａｒｅｄｄｙ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｍａｙ ９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７７－０１８－００１４－６”参照）。結果は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１腫瘍溶解性ウイルスによって処置した後では、腫瘍溶解性ウイルスの刺激によって誘導されるｈＰＤＬ１発現が増大した腫瘍細胞のパーセンテージが、刺激前のパーセンテージの９５％に縮減され得るということを指示した。ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１腫瘍溶解性ウイルスによって発現されたｓｈＰＤＬ１が、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞のｈＰＤＬ１の発現レベルを実際にノックダウンし、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞表面にｈＰＤＬ１を発現する細胞数を減少させるということもまた充分に証明された。
（２） ヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６に対する細胞アッセイ
ヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６を１２ウェルプレートの３つのウェルにウェルあたり１×１０４細胞で播種した。１２時間後に、１×１０５ＰＦＵ（ＭＯＩ＝１０）の腫瘍溶解性アデノウイルスＣ－４．５Ｋまたは１－４．５Ｋおよび血清不含培地の混合溶液をそれぞれ２つのウェルに追加した。等体積の血清不含培地マッコイ５Ａを残りの１つのウェルに追加し、ブランクコントロールとした。１２ウェルプレートを穏やかに上下左右に均一混合して、ウイルスが可能な限りウェル内に均一に分布するようにさせた。３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ内で２４時間に渡って培養した後に、細胞サンプルをトリプシン消化によって収穫し、ＣＤ２７４のフローサイトメトリー抗体を用いてＦＡＣＳを行って、細胞サンプル中のｈＰＤＬ１を発現する細胞のパーセンテージを検出測定した。全ての群はトリプリケートであった。フローサイトメトリー結果を図３２に示した。
実験結果は、ＨＣＴ１１６細胞が本開示に従う腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１によって処置された後に、ｈＰＤＬ１が細胞膜上に検出測定され得る細胞のパーセンテージはいずれかの処置なしのブランクコントロール群と比較して約１９．１％縮減されるが、腫瘍溶解性ウイルスコントロール群（Ｃ－４．５Ｋ群）では、ｈＰＤＬ１が検出測定され得る細胞のパーセンテージはいずれかの処置なしのブランクコントロール群と比較して約５．３％増大するということを示した。これは、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞を刺激した後に腫瘍細胞表面のｈＰＤＬ１発現の増大を誘導し得るという関連文献の申し立てと整合している（例えば、科学文献“Ｄｍｉｔｒｉｙ Ｚａｍａｒｉｎ，ｅｔ ａｌ．ＰＤ－Ｌ１ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１８；１２８（４）：１４１３-１４２８．”；“Ｚｕｑｉａｎｇ Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｗｏｒｋｓ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７ Ｍａｒ ２７；８：１４７５４－１４７６５．”；または“Ｐｒａｖｅｅｎ Ｋ．Ｂｏｍｍａｒｅｄｄｙ， ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８ Ｍａｙ ９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７７－０１８－００１４－６”参照）。結果は、ＨＣＴ１１６細胞をＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１腫瘍溶解性ウイルスによって処置した後に、腫瘍溶解性ウイルスの刺激によって誘導されるｈＰＤＬ１発現が増大した腫瘍細胞のパーセンテージは、刺激前のパーセンテージの８０．９％まで縮減され得るということを指示した。ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１腫瘍溶解性ウイルスによって発現されたｓｈＰＤＬ１が、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞のｈＰＤＬ１の発現レベルを実際にノックダウンし、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞表面にｈＰＤＬ１を発現する細胞数を減少させるということもまた充分に証明された。
２． インビボの腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１によって発現されたｓｈＰＤＬ１の機能の検出測定のための腫瘍を持つマウスモデルの実験
この部では、ヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６を９匹のＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの背中に皮下接種した。各ヌードマウスに接種した細胞数は５×１０６であった。約９日後に、腫瘍が皮下に形成した後に、マウスをランダムに３群に分けた。第１の群はいずれかの処置なしのブランクコントロール群であった。第２の群では、腫瘍内注射によって皮下腫瘍にコントロール腫瘍溶解性アデノウイルスＣ－４．５Ｋを注射した。ヌードマウスあたりの注射したウイルス量は１×１０９ＰＦＵであり、注射体積は１００μｌであった。第３の群でもまた、腫瘍内注射を用いて、腫瘍溶解性アデノウイルス１－４．５Ｋを皮下腫瘍に注射した。ヌードマウスあたりの注射したウイルス量は１×１０９ＰＦＵであり、注射体積は１００μｌであった。注射はかかる用量および様式で３日に渡って１日１回行い、第４日には処置を行わなかった。ヌードマウスを第５日に屠殺して腫瘍組織を収穫した。プロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液（調合は上述と同じである）を組織サンプルの一部に追加し、これらをそれからホモジナイズして組織の蛋白質を抽出した。腫瘍組織のｈＰＤＬ１の蛋白質発現レベルをウエスタンブロットによって検出測定した。結果は図３３および図３４に示した。
図３３に示されているウエスタン結果のバンドをスキャンしてグレー値に変換し、これらはそれぞれのハウスキーピング遺伝子（β－アクチン）のグレー値に対して正規化し、それから図３４の散乱分布マップを得た。それぞれの中央値に基づいて、ＢＡＬＢ／Ｃの皮下接種されたＨＣＴ１１６細胞をコントロール腫瘍溶解性アデノウイルス（Ｃ－４．５）によって処置した後には、この群のｈＰＤＬ１の発現レベルはいずれかの処置なしのブランクコントロール群と比較して２０％上方制御されたということが分かる。対照的に、ＢＡＬＢ／Ｃの皮下接種されたＨＣＴ１１６細胞を腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１によって処置した後には、この群のｈＰＤＬ１の発現レベルは腫瘍溶解性アデノウイルスコントロール群のものと比較して２５％縮減され、発現レベルはいずれかの処置なしのブランクコントロール群のものよりもまた低かった。よって、この結果は、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５）によって発現されたｓｈＰＤＬ１がインビボのヒト腫瘍細胞移植物のｈＰＤＬ１の発現を実際に縮減することを証明した。
例６： ヒト腫瘍細胞株に対する腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１およびヒトＮＫ細胞の組み合わせ殺傷実験
本開示の腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１は１つのｓｈＰＤＬ１発現カセットを含み、これは感染した腫瘍細胞内でｓｈＰＤＬ１を発現し得、それによって腫瘍細胞のｈＰＤＬ１の発現レベルをノックダウンし、腫瘍細胞表面のｈＰＤＬ１の存在を縮減する。最終的に、免疫細胞（Ｔ細胞またはＮＫ細胞を包含する）のＰＤ１への腫瘍細胞表面のｈＰＤＬ１の結合によって引き起こされる免疫細胞活性化に対する免疫抑制効果が、減弱または抹消され得る。よって、この例は、主に細胞レベルで、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）（調製例５に記載されている方法によって調製した）およびヒトＮＫ細胞がヒト腫瘍細胞を殺傷する上で相乗効果を有するかどうかを検出測定した。実験では、トリパンブルー染色法を用いて、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）およびヒトＮＫ細胞がヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６およびヒト肺癌細胞Ａ５４９に対する組み合わせ殺傷プロセスの相乗効果を見せるかどうかを検出測定した。
トリパンブルー染色は死／生細胞を計数するための古典的方法である。細胞が損傷しているかまたは死んでいるときには、トリパンブルーは変性した細胞膜を透過し得、崩壊したＤＮＡに結合および染色するが、生細胞は色素が細胞に入ることを防止する。それゆえに、死細胞および生細胞は鑑別され得る。
１． ヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６に対する細胞アッセイ
トリパンブルー染色試験によって、ＨＣＴ１１６細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）の殺傷用量が約ＭＯＩ＝１～３であるときに、殺傷率は４０％および６０％の間であるということが決定された。ＨＣＴ１１６細胞に対するヒトＮＫ細胞の殺傷用量がＮＫ：ＨＣＴ１１６（Ｅ：Ｔ比）を約５：１とするときには、殺傷率は１０％および２０％の間である。殺傷用量はそれぞれ比較的好適であり、これらは組み合わせ殺傷実験に適していた。
最初に、ＨＣＴ１１６細胞を２４ウェルプレートにウェルあたり２×１０４細胞で播種した。１２時間後に、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）を異なるＭＯＩ（ＭＯＩ＝１、３）で追加した。均一に混合した後に、３７℃のＣＯ２インキュベータに戻し、さらに６時間に渡ってインキュベーションした。それから、ウイルスを含有する培地上清を除去し、細胞をきれいなＰＢＳによって１回穏やかに洗浄し、それから新しい完全培地（マッコイ５Ａ＋１０％ＦＢＳ）を追加した。ウイルスの除去の１８時間後に、エフェクター細胞対標的細胞の所定の比（Ｅ：Ｔ＝５：１）に従って、活性化ＮＫ細胞（凍結ＮＫ細胞を回復後に培養した）を各ウェルに追加した。実験群は１－４．５Ｋ＋ＮＫ群であった。ＮＫ細胞を追加した２４時間後に細胞を収穫し、トリパンブルーによって染色し、生細胞数を計数した。実験では、１つのＨＣＴ１１６細胞群を、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）またはＮＫ細胞のいずれも追加しないブランクコントロール群として用いた。１つの群では、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）を対応する時点で追加したが、ただしＮＫ細胞を追加せず、１－４．５Ｋ群とした。１つの群では、ＮＫ細胞を対応する時点で追加したが、ただし腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）を追加せず、ＮＫ群とした。全てのコントロール群は対応する時点で対応する培地交換操作を行った。全ての実験は３回以上繰り返し、平均を統計分析に用いた。
腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）のＭＯＩが１であり、かつＮＫ細胞のエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）が５：１であるときの結果を図３５に示した（Ｘ軸は異なる群を表し、Ｙ軸は対応する阻害率のパーセンテージを表す）。腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）およびＮＫ細胞の組み合わせ投与はＨＣＴ１１６細胞に対する有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約８３％であるということが示された。対照的に、この実験では、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）単独の投与の阻害率は約５１％であり、ＮＫ細胞単独の投与の阻害率は約１４％であった。図では２つの合計を点線で示した。加えて、ブランク群の阻害率は約０であった（図には示されていない）。
腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）のＭＯＩが３であり、かつＮＫ細胞のエフェクター対標的細胞比（Ｅ：Ｔ）が５：１であるときの結果を図３６に示した（Ｘ軸は異なる群を表し、Ｙ軸は対応する阻害率のパーセンテージを表す）。腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）およびＮＫ細胞の組み合わせ投与はＨＣＴ１１６細胞に対する有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約９１％であるということが示された。対照的に、この実験では、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）単独の投与の阻害率は約５８％であり、ＮＫ細胞単独の投与の阻害率は約１４％であった。図では２つの合計を点線で示した。加えて、ブランク群の阻害率は約０であった（図には示されていない）。
２． ヒト肺癌細胞Ａ５４９に対する細胞アッセイ
トリパンブルー染色試験によって、Ａ５４９細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）の殺傷用量が約ＭＯＩ＝３０であるときには、殺傷率は４０％および６０％の間であるということが決定された。Ａ５４９細胞に対するヒトＮＫ細胞の殺傷用量が約５：１のＥ：Ｔ比であるときには、殺傷率は１０％および２０％の間である。殺傷用量はそれぞれ比較的好適であり、これらは組み合わせ殺傷実験に適していた。
最初に、Ａ５４９細胞を２４ウェルプレートにウェルあたり２×１０４細胞で播種した。１２時間後に、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）をＭＯＩ＝３０で追加した。均一に混合した後に、３７℃のＣＯ２インキュベータに戻し、さらに６時間に渡ってインキュベーションした。それから、ウイルスを含有する培地上清を捨て、細胞をきれいなＰＢＳによって穏やかに１回洗浄し、それから新しい完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ）を追加した。ウイルスを除去した１８時間後に、エフェクター細胞対標的細胞の所定の比（Ｅ：Ｔ＝５：１）に従って、活性化ＮＫ細胞（凍結ＮＫ細胞を回復後に培養した）を各ウェルに追加した。実験群は１－４．５Ｋ＋ＮＫ群であった。ＮＫ細胞を追加した２４時間後に、細胞を収穫し、生細胞数をトリパンブルー染色によって計数した。実験では、１つのＡ５４９細胞群では、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）またはＮＫ細胞のいずれも追加せず、ブランクコントロール群とした。１つの群では、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）を対応する時点で追加したが、ＮＫ細胞は追加せず、１－４．５Ｋ群とした。１つの群では、ＮＫ細胞を対応する時点で追加したが、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）は追加せず、ＮＫ群とした。全てのコントロール群は対応する時点で対応する培地交換操作を行った。全ての実験は３回以上繰り返し、平均を統計分析に用いた。
結果を図３７に示した（Ｘ軸は異なる群を表し、Ｙ軸は対応する阻害率のパーセンテージを表す）。腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）およびＮＫ細胞の組み合わせ投与はＡ５４９細胞に対する有意な相乗的な殺傷効果を有し、相乗的な阻害率は約８３％であるということが示された。対照的に、この実験では、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）単独の投与の阻害率は約４５％であり、ＮＫ細胞単独の投与の阻害率は約１６．９％であった。図では２つの合計を点線で示した。加えて、ブランク群の阻害率は約０であった（図には示されていない）。
例７： 免疫不全マウスに皮下接種されたヒト腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１のインビボ成長阻害アッセイ
この例では、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ免疫不全マウスにヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６を皮下接種して（マウスあたりの皮下接種した細胞数は５×１０６細胞であった）、腫瘍を持つマウスモデルを調製した。これを用いて、ＨＣＴ１１６に対する腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）の成長阻害効果を検出測定した。コントロール腫瘍溶解性ウイルスＣ－４．５Ｋを負のコントロールウイルスとして用いた。実験に用いたコントロールウイルスＣ－４．５ＫおよびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１ウイルス１－４．５Ｋは調製例５に記載されている方法によって調製した。腫瘍を皮下接種された体積要件を満たす１２匹の腫瘍を持つマウスを選択し（腫瘍体積は９０～１２０ｍｍ３であった）、ランダムな群分けの様式で群あたり３匹のマウスで４つの群に分ける。第１群はコントロール群（ブランクコントロール）であり、各マウスには１００μｌのアデノウイルス保存溶液（すなわち、１ｍＭのＭｇＣｌ２および１０％グリセロールを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（ｐＨ７．４））を毎回注射した。第２群は中用量コントロール腫瘍溶解性ウイルス群（Ｃ－４．５Ｋ（中））であり、各マウスには１×１０８ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルスＣ－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。第３群は中用量腫瘍溶解性ウイルス群（１－４．５Ｋ（中））であり、各マウスには１×１０８ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。第４群は高用量腫瘍溶解性ウイルス群（１－４．５Ｋ（高））であり、各マウスには１×１０９ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。実験ではトータルで３回の投与を行い、医薬は隔日で投与した。最初の投与は群分けの日に始めた（第０日として記録した）。マウスの腫瘍直径および体重を週に２回測定した。第２１日の後に、マウスを屠殺し、撮像のために腫瘍を取った。実験結果をそれぞれ図３８、３９、４０、および４１に示した。
上の結果のまとめ：ＮＯＤ－ＳＣＩＤ免疫不全マウスに皮下接種されたＨＣＴ１１６腫瘍細胞を腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）を用いて処置したときには、腫瘍細胞の成長をある程度まで阻害し得る。中用量群（１－４．５Ｋ（中））およびコントロールウイルス群（Ｃ－４．５Ｋ（中））と比較して、高用量群（１－４．５Ｋ（高））は優れた成長阻害活性を示し、有意な用量依存的挙動を示したが（図３８参照）、相対的な腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）は４０％以下には達しなかった（図３９参照）。腫瘍成長を阻害する面では、等しい用量のＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）およびコントロールバックボーンウイルスＣ－４．５Ｋ群を比較すると、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）ウイルスによって発現されたｓｈＰＤＬ１は腫瘍細胞のｈＰＤＬ１の発現レベルの減少を引き起こしたが、より良好な腫瘍抑制効果を示さなかった（図３８、３９、４１参照）。マウスの全ての群について体重の有意な変化はなく、腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）およびコントロールウイルス群（Ｃ－４．５Ｋ）がＮＯＤ－ＳＣＩＤ欠損マウスに対する有意な毒性を示さないということを指示した（図４０参照）。
次に、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスにヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６を皮下接種して（マウスあたりの皮下接種された細胞数は５×１０６細胞であった）、腫瘍を持つマウスモデルを調製した。これを用いて、ＨＣＴ１１６に対する腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）の成長阻害効果を検証した。コントロール腫瘍溶解性ウイルスＣ－４．５Ｋを負のコントロールウイルスとして用いた。腫瘍を皮下接種された腫瘍体積要件を満たす２５匹の腫瘍を持つマウスを選択し（腫瘍体積は９０～１２０ｍｍ３であった）、ランダムな群分けの様式で群あたり５匹のマウスで５つの群に分ける。第１群はコントロール群（ブランクコントロール）であり、各マウスには１００μｌのアデノウイルス保存溶液を毎回注射した。第２の群は中用量コントロール腫瘍溶解性ウイルス群（Ｃ－４．５Ｋ（中））であり、各マウスには１×１０８ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルスＣ－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。第３の群は低用量腫瘍溶解性ウイルス群（１－４．５Ｋ（低））であり、各マウスには１×１０７ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。第４の群は中用量腫瘍溶解性ウイルス群（１－４．５Ｋ（中））であり、各マウスには１×１０８ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。第５の群は高用量腫瘍溶解性ウイルス群（１－４．５Ｋ（高））であり、各マウスには１×１０９ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。実験ではトータルで５回の投与を行い、医薬は隔日で投与した。最初の投与は群分けの日に始めた（第０日として記録した）。マウスの腫瘍直径および体重を週に２回測定した。第２８日の後に、マウスを屠殺し、撮像のために腫瘍を取った。実験結果をそれぞれ図４２、４３、４４、および４５に示した。
上の結果のまとめ：ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに皮下接種されたＨＣＴ１１６腫瘍細胞を処置するために用いた腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）の実験では、高用量群および中用量群両方は優良な抗腫瘍効果を示した（図４２参照）。高用量群の相対的な腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）は４０％未満に達し、中用量群の相対的な腫瘍成長率（Ｔ／Ｃ％）もまた実験中に４０％未満に達した（図４３参照）。より重要なことに、高用量群のヌードマウスの背中の腫瘍は顕著な「腫瘍溶解性」現象を示した。すなわち、表面が潰瘍化し、潰瘍化部分の痂皮化および脱落後に、初期の接種部位の腫瘍組織は基本的に除去された。動物の身体状態および体重の観点からは、高用量群の１匹のヌードマウスでは、腫瘍細胞が背中の脊柱筋に付着し、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）の阻害効果があまり顕著ではなく、高用量群の他の４匹のヌードマウスでは、背中に接種された腫瘍細胞の成長は有効に阻害され、これらの４匹のヌードマウスの体は他の群のヌードマウスよりも滑らかかつ強壮であった。ＯＡＤ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）による処置後に、４匹のヌードマウスのうち２匹のヌードマウスの背中に接種された腫瘍細胞は肉眼では見えなかった（図４４および４５参照）。同じ用量のバックボーンコントロール腫瘍溶解性ウイルス群（Ｃ－４．５Ｋ）およびＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）中用量群を比較することによって、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）中用量群のヌードマウスに皮下接種された腫瘍の成長もまた相対的に有意な阻害効果を示すということが見いだされた（図４２、４３、および４５参照）。よって、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）中用量群のｓｈＰＤＬ１発現カセットによって発現されたｓｈＰＤＬ１によって引き起こされる腫瘍細胞のＨＰＤＬ１発現レベルの減少は、腫瘍成長を抑制する上で鍵となる役割を発揮するということが信じられた。ウイルス保存溶液群のヌードマウスは有意な体重減少を示し、それらのほとんどは腫瘍成長に関連する悪性の消耗症体質を示した。
例８： ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに皮下接種されたヒト腫瘍細胞ＨＣＴ１１６に対する腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１の成長阻害の検証
ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに皮下接種されたＨＣＴ１１６細胞に対する成長阻害についてＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）の有効な用量をさらに確認するために、この例は動物モデルのサンプルサイズを拡大して、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）の有効な用量をさらに検証した。ヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６をＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに皮下接種して、腫瘍を持つマウスモデルを調製した。各ヌードマウスの細胞接種量は５×１０６細胞であった。腫瘍を皮下接種された腫瘍体積要件を満たす３５匹の腫瘍を持つマウスを選択し（腫瘍体積は８０～１３０ｍｍ３であった）、ランダムな群分けの様式で群あたり７匹のマウスで５つの群に分ける。第１群はコントロール群（ブランクコントロール）であり、各マウスには１００μｌのアデノウイルス保存溶液（すなわち、１ｍＭのＭｇＣｌ２および１０％グリセロールを含有する１０ｍＭのＴｒｉｓ溶液（ｐＨ７．４））を毎回注射した。第２の群は中用量コントロール腫瘍溶解性ウイルス群（Ｃ－４．５Ｋ（１×１０８））であり、各マウスには１×１０８ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルスＣ－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。第３の群は高用量コントロール腫瘍溶解性ウイルス群（Ｃ－４．５Ｋ（１×１０９））であり、各マウスには１×１０９ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルスＣ－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。第４の群は中用量腫瘍溶解性ウイルス群（１－４．５Ｋ（１×１０８））であり、各マウスには１×１０８ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。第５の群は高用量腫瘍溶解性ウイルス群（１－４．５Ｋ（１×１０９））であり、各マウスには１×１０９ＰＦＵの腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋを含有する１００μｌのウイルス懸濁液を毎回注射した。実験ではトータルで５回の投与を行い、医薬は隔日で投与した。最初の投与は群分けの日に始めた（第０日として記録した）。マウスの腫瘍直径および体重を週に２回測定した。コントロール群およびコントロール腫瘍溶解性ウイルス群の腫瘍を持つヌードマウスの腫瘍が潰瘍化したので、第２５日に実験を止め、全ての３５匹のマウスを屠殺した。腫瘍を秤量および撮像のために取り、同じマウスの血液および脾臓と一緒に、それぞれ細胞懸濁液を調製した。ＢＡＬＢ／ＣヌードマウスのＮＫ細胞およびＴ細胞を検出測定するために、フローサイトメトリー抗体（抗マウスＣＤ４９ｂ抗体および抗マウスＣＤ３抗体。これらの両方はＥｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した）をそれらに追加し、染色後に、ＦＡＣＳを行って、腫瘍の腫瘍細胞、血液、および脾臓のＮＫおよびＴ細胞の割合の変化を分析した。実験結果をそれぞれ図４６、図４７、図４８、図４９、図５０、および図５１に示す。
血液細胞懸濁液の調製：マウスの眼球を摘出した後に、血液を取り、抗凝固チューブに追加し、振盪して均一混合し、それから氷上に置いた。血液を５００×ｇで５分に渡って遠心した後に上清を捨て、それから赤血球溶解溶液（天根生化科技（北京）有限公司から購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．：＃１２２－０２）を細胞沈殿に追加し、これを徹底的に混合し、室温で１０～１５分に渡って反応させた。再び５分の５００×ｇの遠心後に、上清を捨て、細胞沈殿を保持した。細胞を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに再懸濁し、５００×ｇで５分に渡って遠心し、それから上清を捨てて、細胞沈殿を保持した。細胞沈殿を２つの部分に分けた。１つの部分はいずれかの処置なしのコントロールとして用い、別の部分には抗ＢＡＬＢ／ＣマウスＣＤ３およびＣＤ４９ｂフローサイトメトリー抗体を追加し、均一混合し、室温において３０分に渡って暗所で反応させ、それからＦＡＣＳを行った。
脾臓細胞懸濁液の調製：マウスを解剖し、マウスの脾臓を取り、１．５ｍｌ遠心チューブ内に置き、一時的に氷上で保存した。１％ＢＳＡを含有する５ｍｌのＰＢＳ溶液をきれいな６ｃｍペトリ皿に追加した。脾臓をナイロンメッシュによって包み、ペトリ皿上で磨り潰して、脾臓細胞を充分に放出した。細胞懸濁液を５００×ｇで５分に渡って遠心した後に、上清を捨て、赤血球溶解溶液を細胞沈殿に追加し、これを徹底的に混合し、室温で１０～１５分に渡って反応させた。再び５分の５００×ｇの遠心後に、上清を捨て、細胞沈殿を保持した。細胞を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに再懸濁し、５００×ｇで５分に渡って遠心し、それから上清を捨てて細胞沈殿を保持した。細胞沈殿を２つの部分に分けた。１つの部分はいずれかの処置なしのコントロールとして用い、別の部分には抗ＢＡＬＢ／ＣマウスＣＤ３およびＣＤ４９ｂフローサイトメトリー抗体を追加し、均一混合し、室温において３０分に渡って暗所で反応させ、それからＦＡＣＳを行った。
腫瘍組織細胞懸濁液の調製：マウスを解剖し、皮下腫瘍を取り、１．５ｍｌ遠心チューブ内に置き、一時的に氷上で保存した。各腫瘍組織から等体積の小片を切り取り、別の一連の遠心チューブ内に置く。それから５００μｌのコラゲナーゼを追加した。眼科剪刀によって腫瘍を細かい小片に切り、３７℃で３０分に渡って反応させた。細胞懸濁液を５００×ｇで５分に渡って遠心した後に、上清を捨て、赤血球溶解溶液を細胞沈殿に追加し、徹底的に混合し、室温で１０～１５分に渡って反応させた。再び５分の５００×ｇの遠心後に、上清を捨て、細胞沈殿を保持した。細胞を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに再懸濁し、５００×ｇで５分に渡って遠心し、それから上清を捨てて細胞沈殿を保持した。細胞沈殿を２つの部分に分けた。１つの部分はいずれかの処置なしのコントロールとして用い、別の部分には抗ＢＡＬＢ／ＣマウスＣＤ３およびＣＤ４９ｂフローサイトメトリー抗体を追加し、均一混合し、室温において３０分に渡って暗所で反応させ、それからＦＡＣＳを行った。
上の結果のまとめ：ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに皮下接種されたＨＣＴ１１６腫瘍細胞を処置するために用いた腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）の実験では、高用量群および中用量群両方は優良な抗腫瘍効果を示した（図４６参照）。中用量群の相対的な腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）は４０％に達し、高用量群は４０％未満に達した（図４７参照）。コントロールウイルスＣ－４．５Ｋ（１×１０８）群および目的の腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋ（１×１０８）群によって達成されたＨＣＴ１１６細胞に対する成長阻害効果を比較することによって、腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋが優れた成長阻害効果を示し、腫瘍体積の統計分析では、２つの群の間に非常に有意な差があることが見いだされた。コントロールウイルスＣ－４．５Ｋ（１×１０９）群および目的の腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋ（１×１０９）群によって達成されるＨＣＴ１１６細胞の成長に対する阻害効果を比較することによって、投与の初期段階においては、両方のウイルスが皮下接種されたＨＣＴ１１６に対する非常に強い成長阻害効果を示すが、実験の第１０日には、１－４．５Ｋ群とは違って、Ｃ－４．５Ｋ群は腫瘍成長に対する持続的な阻害効果を見せないということが見いだされた。Ｃ－４．５Ｋ（１×１０９）群のヌードマウスの皮下腫瘍は成長し始めたが、１－４．５Ｋ（１×１０９）群のヌードマウスの皮下腫瘍は実験の第１７日まで持続的に阻害された。２つの群の間には腫瘍体積の有意な差もまたあった。上の結果を総合的に分析すると、Ｃ－４．５Ｋおよび１－４．５Ｋ腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍溶解性ウイルスの特徴を充分に見せたということが信じられる。その上、１－４．５ＫはｓｈＰＤＬ１を発現し得るので、Ｃ－４．５Ｋと比較してＨＣＴ１１６細胞の成長に対するより長い阻害効果を示した。この例は、腫瘍溶解性ウイルス１－４．５Ｋによって発現されたｓｈＰＤＬ１がヒト腫瘍細胞のｈＰＤＬ１の発現レベルを変化させ、これが腫瘍細胞の周りの免疫抑制効果を減弱または抹消し得、それによって周囲の免疫細胞を活性化するということを充分に反映した。従って、腫瘍に対する組み合わせ殺傷効果が達成された。マウスの全ての５つの群の体重に有意な変化はなく、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに対する有意な毒性は腫瘍溶解性アデノウイルスの両方で見いだされないということを指示している（図４８参照）。マウスの各群の腫瘍を撮像および秤量した後に（図４９参照）、１－４．５Ｋ実験群およびＣ－４．５Ｋ実験群の腫瘍重量の間には有意な差があることが見いだされた。腫瘍、血液、および脾臓のＮＫおよびＴ細胞のＦＡＣＳ分析によって、１－４．５Ｋ腫瘍溶解性ウイルスを投与されたマウスの腫瘍組織および血液中のＮＫ細胞は、コントロール群（対照群）およびＣ－４．５コントロール腫瘍溶解性ウイルス群のものよりも大いに高いということが見いだされた。１－４．５Ｋ腫瘍溶解性ウイルス群の血液中のＮＫ細胞はコントロール群の血液中のものの２倍高く、腫瘍組織中のＮＫ細胞はコントロール群のものよりも５倍高かった。動物の各群の脾臓のＮＫ細胞は有意に変化しなかった（図５０参照）。Ｔ細胞の分析は、各群の血液中のＴ細胞の割合は有意に変化しないが、１－４．５Ｋ（１×１０８）実験群の脾臓および腫瘍組織のＴ細胞はＣ－４．５Ｋ（１×１０８）群の同じ組織のＴ細胞と比較して有意に増大するということを明らかにした（図５１参照）。
上の実験結果（例７および８参照）の総合的な分析は、遺伝学的バックグラウンドが異なる２種類の免疫不全マウスに皮下接種されたヒト結腸癌細胞ＨＣＴ１１６を処置するために同じ腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）を用いたときに、腫瘍阻害効果の有意な差が得られるということを示した。ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）は、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの皮下接種されたＨＣＴ１１６について優良な腫瘍成長阻害および腫瘍クリアランスの効果を示したが、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ免疫不全マウスに皮下接種された同じ種類の細胞に対する同じ用量（１×１０９）のＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果は、顕著ではなかった。ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスに皮下接種されたＨＣＴ１１６を、ｓｈＰＤＬ１発現カセットを含有しない別のバックボーンコントロールウイルス（Ｃ－４．５Ｋ）によって同じ濃度（１×１０９）で処置したときには、投与の初期段階においてのみ、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）腫瘍溶解性ウイルスに類似の腫瘍阻害効果を見せた。しかしながら、ＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）とは違って、バックボーンコントロールウイルス（Ｃ－４．５Ｋ）は投与を止めた後に持続的に腫瘍成長を阻害し得ない。通常、体の免疫系による殺傷およびクリアランスを回避するために、腫瘍細胞はＰＤＬ１またはＰＤＬ２などのリガンドをそれらの表面に高発現するであろう。ＰＤ－１へのこれらのリガンドの結合は、ＰＤ－１の細胞内ドメインのチロシンリン酸化に至り、チロシンホスファターゼＳＨＰ－２をリクルートし、それによってＴＣＲシグナル伝達経路のリン酸化を縮減し、ＴＣＲ経路の下流の活性化シグナル、Ｔ細胞活性化、およびサイトカイン産生を縮減するであろう。よって、免疫細胞が不活性状態である免疫抑制性の微小環境が腫瘍の周りに形成されるであろう。加えて、免疫不全マウス株の観点からは、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ免疫不全マウスはより高レベルの免疫不全を有し、Ｔ細胞が体内に欠失し、Ｂ細胞は存在するが機能を欠失し、ＮＫ細胞の機能は極めて低い。また、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの免疫不全の程度は低く、Ｔ細胞がまた体内に欠失し、Ｂ細胞は存在するが機能を欠失するものの、マウスは機能が無傷のＮＫ細胞、マクロファージ、および主に樹状細胞からなる抗原提示細胞を保持する。文献では、マウスのＮＫ、マクロファージ、または樹状細胞が腫瘍成長阻害プロセスにおいて重要な組み合わせ殺傷効果を発揮し得るということが報告されている（例えば次の科学文献を参照：“Ｋｅｖｉｎ Ｃ．Ｂａｒｒｙ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ－ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ａｘｉｓ ｄｅｆｉｎｅｓ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１８ Ｊｕｎ ２５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９１－０１８－００８５－８．”）。腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）およびそのバックボーンコントロールウイルスＣ－４．５Ｋは、前者がｓｈＰＤＬ１を発現し得る発現カセットを含有するという点で異なる。これは感染した腫瘍細胞内でｓｈＰＤＬ１を発現し得、ｓｈＰＤＬ１はヒト腫瘍細胞のｈＰＤＬ１レベルを縮減し、これは腫瘍の周りの環境における免疫抑制性状態をさらに減弱または除去する。最終的に、それは腫瘍成長に対するより長い阻害を維持するであろう。加えて、文献では、マウス免疫細胞表面のＰＤ１およびヒト細胞表面のＰＤＬ１が互いに結合し、免疫抑制性のシグナルを伝達し得るということが報告されている。翻って、ヒト腫瘍細胞のｈＰＤＬ１の発現はｓｈＰＤＬ１発現によって縮減された（例えば次の科学文献を参照：“Ｄａｖｉｄ Ｙｉｎ－ｗｅｉ Ｌｉｎ， ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｓｅｍｂｌｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆｖ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ．２００８ Ｆｅｂ ２６；１０５（８）：３０１１－６．”；“Ｃｌｅｍｅｎｔ Ｖｉｒｉｃｅｌ．ｅｔ ａｌ．ｈｕｍａｎ ＰＤ－１ ｂｉｎｄｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ｔｏ ｉｔｓ ｈｕｍａｎ ｌｉｇａｎｄｓ： Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｔｕｄｙ．Ｊ Ｍｏｌ Ｇｒａｐｈ Ｍｏｄｅｌ．２０１５ Ａｐｒ；５７：１３１－４２．”；または“Ａａｒｏｎ Ｔ．Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ＩｍｍｕｎｏＰＥＴ ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒ ｄｅｓｉｇｎ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．２０１７ Ａｐｒ；５８（４）：５３８－５４６．”）。よって、ヒト腫瘍細胞ＨＣＴ１１６内で腫瘍溶解性アデノウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）によって発現されたｓｈＰＤＬ１は腫瘍細胞のｈＰＤＬ１発現の減少をもたらし、これが腫瘍組織の周囲の免疫細胞（ＮＫ、マクロファージ、または樹状細胞）に対する阻害効果を減弱および解除し、それによって、ＨＣＴ１１６の成長を阻害する持続的能力を見せたということが信じられる。
この部の結果もまた、腫瘍溶解性ウイルスＯＡｄ－ｓｈＰＤＬ１（１－４．５Ｋ）およびヒトＮＫ細胞がインビトロの腫瘍細胞の組み合わせ殺傷プロセスにおいて示した上記の相乗効果と整合している。

Claims (30)

  1. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、
    組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、腫瘍細胞によるＰＤＬ１の発現を阻害することができる外来性のｓｈＲＮＡのコード配列をインテグレーションされ、
    組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、Ｅ１Ｂ１９Ｋ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子、およびＥ３領域の全ての遺伝子を欠失しており、
    組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列を含み、
    Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列が、プロモーターのコントロール下にある、
    単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
  2. 外来性のｓｈＲＮＡのコード配列が配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りである、請求項１に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
  3. Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列がＣＭＶプロモーターのコントロール下にある、請求項１に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
  4. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスがアデノウイルス５型を遺伝子改変することによって得られる、請求項１に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
  5. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを調製するためのベクターがプロモーターのコントロール下の外来性のｓｈＲＮＡのコード配列を含み、ｓｈＲＮＡのコード配列が配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りである、請求項１に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
  6. ベクターがｐＳｈｕｔｔｌｅを基本バックボーンとして用い、基本バックボーンが、作動可能に連結された外来性のｓｈＲＮＡのコード配列の発現をコントロールするプロモーター、外来性のｓｈＲＮＡのコード配列、Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列の発現をコントロールするプロモーター、およびＥ１Ａ遺伝子のコード配列を順に含む、請求項５に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
  7. 宿主細胞がベクターを安定発現する、請求項５または６に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
  8. 医薬組成物が、活性成分としての請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物。
  9. 医薬組成物が組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを５×１０７から５×１０１２ｖｐ／日の範囲である用量で含む、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが、腫瘍内注射によって投与または静脈内投与されるように製剤される、請求項８に記載の医薬組成物。
  11. 腫瘍および／または癌の処置のための医薬の調製のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの使用。
  12. 腫瘍および／または癌が、肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌を包含する、請求項１１に記載の使用。
  13. 医薬組成物の活性成分が、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスと、ＮＫ細胞とを含む、医薬組成物。
  14. 医薬組成物の活性成分が、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞からなる、請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞が互いに混合されることなしに独立して医薬組成物中に存在する、請求項１３に記載の医薬組成物。
  16. 医薬組成物が組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを５×１０ ７ から５×１０ １２ ｖｐ／日の範囲である用量で含み、ＮＫ細胞を１×１０ ９ から３×１０ ９ 細胞／日の範囲の用量で含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
  17. ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
  18. ＮＫ細胞がインビトロ拡大から得られる自家ＮＫ細胞またはインビトロ拡大から得られる同種ＮＫ細胞である、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍内注射によって投与または静脈内投与されるように製剤され、ＮＫ細胞が静脈内投与されるように製剤される、請求項１３に記載の医薬組成物。
  20. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびＮＫ細胞をそれぞれ独立に含む別々の容器と、投与のタイミングおよび経路を定める説明書を含む、腫瘍および／または癌の処置のための相乗効果を有する組み合わせ医薬のキットであって、
    組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、
    組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、腫瘍細胞によるＰＤＬ１の発現を阻害することができる外来性のｓｈＲＮＡのコード配列をインテグレーションされ、
    組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、Ｅ１Ｂ１９Ｋ遺伝子、Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子、およびＥ３領域の全ての遺伝子を欠失しており、
    組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列を含み、
    Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列が、プロモーターのコントロール下にある、
    キット。
  21. 外来性のｓｈＲＮＡのコード配列が配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りである、請求項２０に記載のキット。
  22. Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列がＣＭＶプロモーターのコントロール下にある、請求項２０に記載のキット。
  23. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスがアデノウイルス５型を遺伝子改変することによって得られる、請求項２０に記載のキット。
  24. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを調製するためのベクターがプロモーターのコントロール下の外来性のｓｈＲＮＡのコード配列を含み、ｓｈＲＮＡのコード配列が配列番号１６、１９、および２２のいずれか１つに示されている通りである、請求項２０に記載のキット。
  25. ベクターがｐＳｈｕｔｔｌｅを基本バックボーンとして用い、基本バックボーンが、作動可能に連結された外来性のｓｈＲＮＡのコード配列の発現をコントロールするプロモーター、外来性のｓｈＲＮＡのコード配列、Ｅ１Ａ遺伝子のコード配列の発現をコントロールするプロモーター、およびＥ１Ａ遺伝子のコード配列を順に含む、請求項２４に記載のキット。
  26. 宿主細胞がベクターを安定発現する、請求項２４または２５に記載のキット。
  27. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを含む容器は、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを５×１０ ７ から５×１０ １２ ｖｐ／日の範囲である用量で含み、ＮＫ細胞を含む容器は、ＮＫ細胞を１×１０ ９ から３×１０ ９ 細胞／日の範囲の用量で含む、請求項２０に記載のキット。
  28. ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞および同種ＮＫ細胞から選択される、請求項２０に記載のキット。
  29. ＮＫ細胞がインビトロ拡大から得られる自家ＮＫ細胞またはインビトロ拡大から得られる同種ＮＫ細胞である、請求項２８に記載のキット。
  30. 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍内注射によって投与または静脈内投与されるように製剤され、ＮＫ細胞が静脈内投与されるように製剤される、請求項２０に記載のキット。
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