CN113774031B

CN113774031B - 一种复制型人腺病毒及其应用

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Publication number: CN113774031B
Application number: CN202010523284.8A
Authority: CN
Inventors: 陈凌; 关素华; 刘波
Original assignee: Guangzhou N Biomed Ltd
Current assignee: Guangzhou N Biomed Ltd
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2040-06-10
Also published as: CN113774031A; WO2021249035A1

Abstract

本发明公开了一种复制型人腺病毒及其应用。载体全序列如SEQ ID NO.21所示。本发明一些实例所述的复制型人腺病毒，在负载相关核酸序列后，可以直接注射于实体肿瘤，包括但不限于H1299，还包括Skov‑3、U251等肿瘤后，经鉴定，该腺病毒不仅可以在肿瘤细胞中复制并直接杀死肿瘤细胞，在所感染肿瘤细胞裂解后感染其周围肿瘤细胞；同时对正常人体细胞没有杀伤作用，具有意料之外的溶瘤效果。

Description

一种复制型人腺病毒及其应用

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，特别涉及重组溶瘤腺病毒、用于制备重组溶瘤腺病毒的重组溶瘤腺病毒载体及其应用。

背景技术

癌症由自身因素(遗传基因突变，自然衰老等)或环境因素(如吸烟，紫外辐射，化学物质，病毒感染等)引起。根据WHO报道，肿瘤目前已经是继心血管疾病的世界第二大死因，全球有近1/6的死亡是由癌症造成的。2018年全球癌症死亡人数达960万。预计到2025年，全球每年新增癌症病例数将高达2449万例。其中，肺癌的死亡人数最多，随后是结直肠癌，胃癌，肝癌和乳腺癌。

治疗癌症的经典方法主要是手术，化学疗法，和放射性疗法。手术切除效果有限，对转移癌细胞没有作用；放疗和化疗副作用大，尽管靶点药物在很大程度上改善了患者生活质量，但耐受性是化疗一直面临的一个难题。近年来，免疫疗法已成为癌症治疗领域的热点。免疫疗法的原理是通过激活机体自身的免疫系统来消灭肿瘤细胞，具有疗效好，副作用小和防止复发等优点。

近几年溶瘤病毒在癌症治疗领域又重新兴起。溶瘤病毒(oncolytic virus)，是一类具有复制能力，能够直接裂解肿瘤细胞的病毒。早在1912年，意大利医生就发现一名子宫颈癌患者在感染狂犬病病毒后肿瘤随之消退。2005年中国批准了世界上第一个溶瘤腺病毒(H101)上市，但临床疗效目前还未得到国际认可。该病毒敲除了E1B-55K和E3区大部分基因。E1B-55K蛋白能够抑制抗癌基因p53的表达，阻止P53介导的感染细胞的凋亡。由于正常的细胞中的P53蛋白功能完好，而大部分肿瘤丧失P53功能，因此，E1B-55K基因的删除使病毒能特异性在缺乏有功能的p53的肿瘤细胞内复制。然而，E1B-55K蛋白是病毒mRNA从细胞核输出必需的蛋白，因此，H101复制能力和溶瘤能力比野生毒株明显减弱。2015年，FDA批准了第一个溶瘤病毒疗法T-vec(单纯疱疹病毒-1)用于治疗手术切除后复发的黑色素瘤。作为第三代溶瘤病毒，T-vec删除了γ34.5基因，使其具有肿瘤细胞靶向性，同时它还携带了GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落因子)增强抗肿瘤免疫能力。

溶瘤病毒是免疫疗法的一个重要分支，其可以通过多种不同的作用途径杀伤肿瘤细胞，并破坏肿瘤免疫抑制的微环境诱导长期的肿瘤特异性免疫反应，同时还可以通过携带治疗基因使其在肿瘤细胞中特异地，长时间地表达，从而增强抗肿瘤疗效。另外，溶瘤病毒与其他抗癌药物的联合用药的实验结果如联合免疫检查点抑制剂等方面都显现出良好的抗肿瘤效果。近年来，许多病毒包括痘苗病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒以及柯萨奇病毒已经作为溶瘤剂进行了临床试验。

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含4.7kb，两端各有长约100～600bp的反向末端重复序列。人腺病毒(Human adenoviruses，HAdV)属于腺病毒科(Adenoviridae)，根据免疫学、生物学、生物化学特性不同，将其分为A～G7个亚种，共有52个血清型，不同的血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现。腺病毒侵入宿主细胞后至少能引起3种感染：慢性、潜伏性感染：常在淋巴细胞内发生，潜伏感染时外放的病毒量极少，细胞坏死也不明显，故临床上感染不明显，潜伏感染的机制尚不清楚。溶解性感染：病毒在细胞内如人类上皮细胞中经历复制过程，通过溶解细胞作用使细胞死亡。肿瘤样变异：此时病毒繁殖只进行最初几步，然后腺病毒DNA与细胞DNA整合并复制，但不产生感染性病毒，腺病毒抗原性较稳定。

周立,何婉婉,朱桢楠,et al.溶瘤腺病毒靶向癌症治疗的临床研究进展[J].中国生物工程杂志,2013,33(12):105-113.指出，溶瘤腺病毒能够特异性地感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中完成感染-复制周期，从而特异性地杀伤和裂解肿瘤细胞但不损伤其他正常细胞和组织，因此成为目前最具研究前景的抗肿瘤药物之一。不同的病毒有着复杂的生物学特性，而目前人类完全熟悉的病毒资源仍旧比较匮乏。尤其大多临床前实验资料均是来自免疫缺陷动物体内人肿瘤移植模型，与人在体内环境、组织细胞的生物学特性等方面都存在很大差异。已有的溶瘤腺病毒之间并无明显的共性，难以基于腺病毒的序列确定其是否具有溶瘤效果，但大多数腺病毒对肿瘤细胞不敏感，不具有溶瘤的特性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的至少一种不足，提供一种溶瘤腺病毒载体及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种复制型人腺病毒，其全序列如SEQ ID NO.：21所示，其中的抗性筛选基因可使用公知的筛选基因替换。

在一些实例中，所述复制型人腺病毒的全序列如SEQ ID NO.：21所示。

在一些实例中，所述病毒的E1区和E3区被删除。

在一些实例中，所述病毒可在动物细胞、人源细胞或人体内复制。

在一些实例中，所述复制型人腺病毒的构建方法包括：

S1)PCR扩增获得NBOV1901基因组的左右两端，连接在抗性载体质粒A得到pT-NBOV1901(L+R)，线性化后与NBOV1901基因组重组得到基因组质粒pNBOV1901；

S2)PCR扩增获得从SrfI至整个E3区左右臂连接至抗性载体质粒B上，线性化后与PacI酶切的NBOV1901进行重组，得到去除SrfI至整个E3区的基因组质粒pNBOV1901△E3-SrfI；

S3)以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增获得E3gp19K上游片段：SrfI至E3gp19K，和E3gp19K下游片段：E3gp19K至E3区包含E3-14.7K基因片段，将E3gp19K上游片段、E3gp19K下游片段和酶切后的构建载体三个片段重组连接至pNBOV1901△E3-SrfI左右臂之间，线性化后与pNBOV1901△E3-SrfI进行重组，得到修改了SrfI酶切位点的基因组质粒pNBOV1901△E3gp19K；

S4)PCR扩增获得E1区左右臂连接至抗性载体质粒B上，线性化后与SrfI酶切的pNBOV1901△E3gp19K重组，得到去除E1区的基因组质粒pNBOV1901△E3gp19K△E1；

S5)PCR扩增获得去除E1b19K、pRB基因的E1区基因组，连接至含有E1区左右臂的抗性载体质粒B上，线性化后与酶切后的pNBOV1901△E3gp19K△E1进行重组，得到敲除E1b19K、pRB基因的基因组质粒pNBOV1910，即所述复制型人腺病毒。

在一些实例中，抗性载体质粒A和抗性载体质粒B具有不同的抗性。

在一些实例中，抗性载体质粒A和抗性载体质粒B独立选自氨苄抗性载体质粒或卡那霉素抗性载体质粒。这些抗性质粒更为成熟，易于获得，同时筛选成本也更低。

在一些实例中，包括：

S1)PCR扩增获得NBOV1901基因组的左右两端，连接在氨苄抗性载体质粒得到pT-NBOV1901(L+R)，线性化后与NBOV1901基因组重组得到基因组质粒pNBOV1901；

S2)PCR扩增获得从SrfI至整个E3区左右臂，连接至卡那霉素抗性载体质粒上，线性化后与PacI酶切的NBOV1901进行重组，得到去除SrfI至整个E3区的基因组质粒pNBOV1901△E3-SrfI；

S4)PCR扩增获得E1区左右臂，连接至卡那霉素抗性载体质粒上，线性化后与SrfI酶切的pNBOV1901△E3gp19K重组，得到去除E1区的基因组质粒pNBOV1901△E3gp19K△E1；

S5)PCR扩增获得去除E1b19K、pRB基因的E1区基因组，连接至含有E1区左右臂的卡那霉素抗性载体质粒上，线性化后与酶切后的pNBOV1901△E3gp19K△E1进行重组，得到敲除E1b19K、pRB基因的基因组质粒pNBOV1910。

本发明的第二个方面，提供：

本发明第一个方面所述复制型人腺病毒作为重组溶瘤病毒载体的应用。

在一些实例中，所述重组溶瘤病毒载体负载有表达以下分子的核酸序列：

对肿瘤具有治疗效果的分子；

生物学报告示踪分子。

在一些实例中，所述对肿瘤具有治疗效果的分子选自肿瘤抑制因子、肿瘤杀伤因子、肿瘤微环境调节因子、肿瘤细胞表面特异性结合因子；

所述生物学报告示踪分子选自β-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白、荧光素酶。

在一些实例中，所述重组溶瘤病毒载体还负载有表达肿瘤特异性识别因子的核酸序列。

在一些实例中，所述肿瘤特异性识别因子选自肿瘤表位特异性识别因子、肿瘤细胞选择性复制因子。

这些分子或序列可是本领域技术人员已知的。

在一些实例中，所述肿瘤选自肺癌、肝癌，胃癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌。

在一些实例中，所述载体的原E1区和E3区的至少一个区域用于整合外源基因。

本发明的第三个方面，提供：

一种组合物，该组合物中含有本发明第一个方面所述的复制型人腺病毒。

在一些实例中，所述组合物中包括：a)免疫调控剂；b)免疫调控细胞；c)放射性治疗物；d)光疗法化合物；或e)化学治疗化合物中的至少一种。

在一些实例中，述组合物中还含有药学上可接受的佐剂、稀释剂或赋形剂。

本发明的第四个方面，提供：

一种溶瘤制剂，包括本发明第一个方面所述的复制型人腺病毒。

在一些实例中，所述复制型人腺病毒负载有表达以下分子的核酸序列：

对肿瘤具有治疗效果的分子；

生物学报告示踪分子。

本发明的第五个方面，提供：

组合物在制备预防或治疗肿瘤或肿瘤检测制剂中的应用，所述组合物如本发明第三个方面所述。

在一些实例中，所述肿瘤选自乳腺癌、脑癌、肺癌、鼻咽癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、皮肤癌、前列腺癌、输卵管癌、尿道癌、泌尿生殖系统癌、子宫内膜异位症、宫颈癌、骨癌或癌症的转移性病变。

本发明的有益效果是：

本发明一些实例所述的复制型人腺病毒，在负载相关核酸序列后，可以直接注射于实体肿瘤，包括但不限于H1299，还包括Skov-3、U251等肿瘤后，经鉴定，该腺病毒不仅可以在肿瘤细胞中复制并直接杀死肿瘤细胞，在所感染肿瘤细胞裂解后感染其周围肿瘤细胞；同时对正常人体细胞没有杀伤作用，具有意料之外的溶瘤效果。

本发明一些实例所述的复制型人腺病毒对于多种肿瘤细胞H1299、U251、Skov-3等具有双重靶向性。

附图说明

图1是利用同源重组对NBOV1901的基因组环化的原理(A)，及pNBOV1901的酶切鉴定结果(B)；

图2是敲除NBOV1901从SrfI至整个E3区基因组原理图(A)，及pNBOV1901△E3-SrfI的PCR和酶切鉴定结果(B)；

图3是敲除NBOV1901E3gp19K基因原理图(A)及pNBOV1901△E3gp19K酶切结果(B)；

图4是敲除NBOV1901E1基因原理图(A)及pNBOV1901△E3gp19K的PCR及酶切鉴定结果(B)；

图5是敲除NBOV1901E1B19K、pRB基因原理图(A)及pNBOV1910酶切结果(B)；

图6是复制型腺病毒NBOV1901重组腺病毒的生产及纯化结果；

图7是复制型腺病毒NBOV1901重组腺病毒在各种肿瘤细胞双向筛选结果；

图8是复制型腺病毒NBOV1901重组腺病毒非核心区域改造对H1299细胞溶瘤效果影响；

图9是复制型腺病毒NBOV1901重组腺病毒在H1299小鼠肿瘤模型上的实验结果；

图10是现有溶瘤腺病毒的溶瘤作用。

图1～5中，M代表15000bp DNA Marker。

具体实施方式

本发明的新型腺病毒载体pNBOV1901改造自从人的咽拭子样品中分离到的一株腺病毒NBOV1901(全序列的GenBank:MH558113.1)。NBOV1901不同于目前已报道的腺病毒，为一种新型人腺病毒。腺病毒的E1A基因是病毒调节细胞周期的必需基因，通过E1A基因上CR2结合位点与细胞的Rb蛋白结合，使细胞周期由G1期进入S期。本发明的肿瘤靶向性腺病毒载体pNBOV1910，删除了E1A-CR2，使得该病毒的E1A不能与宿主细胞的Rb蛋白结合。因此，pNBOV1910只能选择性地在处于分裂期的细胞如肿瘤细胞中复制而不在正常细胞中复制，从而增加溶瘤的特异性和安全性。

腺病毒的E1B19K与细胞Bcl-2基因同源，可以通过与Beclin-1结合，抑制细胞凋亡。而E3gp19K蛋白可以在内质网上与MHC I类分子的重链结合阻止其转运到细胞表面，并且可以延缓MHC I的表达。因此，删除这两个基因能够提高病毒的肿瘤选择性及在肿瘤中的扩散能力，并激活宿主免疫反应，从而增强疫毒对肿瘤细胞的杀伤能力。

本腺病毒转录单位编码一系列具有相关功能的多肽，E1A单元编码两种主要蛋白质，它们激活转录并诱导宿主细胞进入细胞周期的S期；E1B编码两种阻断细胞凋亡的蛋白质；E2编码三种直接参与DNA复制的蛋白质；E3编码调节宿主对感染的反应的产物；较晚的mRNAs家族与衣壳成分的生产和组装有关。E4产物介导转录、RNA剪接和翻译调节；mRNA核输出并调节DNA复制和凋亡。E1B19K和E3的删除不会影响腺病毒的复制并且可以为外源基因的插入腾出空间

一种复制型腺病毒载体pNBOV1901，由如下方法制备得到：将NBOV1901基因组环化，敲除E3gp19K、E1b19K、pRB基因得到。

在一些实例中，在腺病毒质粒中引入编码RGD肽的基因，构成靶向性骨架质粒。

一种复制型人NBOV1901型溶瘤腺病毒载体制备方法，包含如下步骤：

氨苄抗性载体质粒、卡那霉素抗性载体质粒也可以使用其他周知的筛选质粒替换，只要可以实现产物的有效分离即可。

在一些实例中，步骤S1的具体方法为：

以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增得到NBOV1901基因组左右两端L-NBOV1901和R-NBOV1901作为重组臂连接到线性化的T载体上，得到pT-NBOV1901(L+R)，同时在pT-NBOV1901(L+R)的左右臂之间引入了EcoRI、BamHI作为酶切位点，EcoRI+BamHI双酶切pT-NBOV1901(L+R)线性化后与NBOV1901基因组重组，得到pNBOV1901。

进一步的，在一些实例中，步骤S1的具体方法为：

以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增得到NBOV1901基因组左右两端L-NBOV1901和R-NBOV1901，使用Exnase重组酶将L-NBOV1901和R-NBOV1901和线性化的T载体进行三片段重组得到pT-NBOV1901(L+R)，同时在pT-NBOV1901(L+R)的左右臂之间引入了EcoRI、BamHI作为酶切位点，pT-NBOV1901(L+R)用EcoRI+BamHI双酶切线性化后与NBOV1901基因组重组，得到pNBOV1901。

在一些实例中，步骤S2的具体方法为：

以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增获得从SrfI至整个E3区左右臂基因L-ΔE3-SrfI及R-ΔE3-SrfI，连接到线性化的T载体上，得到pT-ΔE3-SrfI(L+R)，线性化后与经过PacI酶切的pNBOV1901基因组进行重组，得到敲除ΔE3-SrfI同时在ΔE3-SrfI位置引入唯一的酶切位点PacI的基因组质粒pNBOV1901△E3-SrfI。

进一步的，在一些实例中，步骤S2的具体方法为：

以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增获得E3-SrfI区左右两端同源臂L-△E3-SrfI和R-△E3-SrfI，使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pVax-△E3-SrfI。线性化后与PacI酶切线性化的pNBOV1901同源重组，经氨苄抗性筛选后得到敲除E3-SrfI区基因同时引入唯一的线性化酶切位点swaI的质粒pNBOV1901△E3-SrfI。

在一些实例中，步骤S3的具体方法为：

以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增获得E3gp19K上游片段(SrfI至E3gp19K)和E3gp19K下游片段(E3gp19K至E3区，包含E3-14.7K基因片段)，Exnase重组酶三片段重组连接到pVAX-ΔE3-SrfI(L+R)左右臂之间，得到pVAX-ΔE3gp19K载体质粒，线性化后与PacI酶切的pNBOV1901△E3-SrfI基因组质粒进行同源重组，经氨苄抗性基因筛选得到敲除E3gp19K的pNBOV1901△E3gp19K基因组质粒。

在一些实例中，步骤S4的具体方法为：

以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-ΔE1及R-ΔE1，连接到线性化的T载体上，得到pVAX-ΔE1(L+R)，线性化后与SrfI酶切的pNBOV1901ΔE3gp19K同源重组，经氨苄抗性筛选得到敲除E1基因并在E1基因区引入唯一的线性化酶切位点SrfI的质粒pNBOV1901△E3gp19K△E1。

进一步的，在一些实例中，步骤S4的具体方法为：

以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-ΔE1及R-ΔE1和以pVAX载体为模板PCR获得pVAX的骨架使用Exnase重组酶进行三片段连接得到pVAX-△E3gp19K△E1(L+R)，pVAX-△E3gp19K△E1(L+R)使用Bstz17I+SgrAI双酶切，pNBOV1901ΔE3gp19K使用SrfI进行酶切进行线性化，将两者酶切回收的片段进行同源重组得到敲除E1基因同时引入唯一酶切位点SrfI的基因组质粒pNBOV1901△E3gp19K△E1。

在一些实例中，步骤S5的具体方法为：

以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增获得缺失E1b19K、pRB基因的E1区基因，连接到pVAX-△E3gp19K△E1(L+R)左右臂之间，线性化后与SrfI酶切的pNBOV1901△E3gp19K△E1基因组进行同源重组，经氨苄抗性基因筛选得到敲除E1b19K、pRB基因的基因组质粒pNBOV1910。

进一步的，在一些实例中，步骤S5的具体方法为：

以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增获得缺失E1b19K、pRB基因的E1区基因并与SrfI酶切线性化的pVAX-△E3gp19K△E1(L+R)使用Exnase重组酶进行重组得到pVAX-△E1B19K_pRB，pVAX-△E1B19K_pRB使用Bstz17I+SgrAI双酶切，pNBOV1901ΔE3gp19KΔE1使用SrfI进行酶切进行线性化，将两者酶切回收的片段进行同源重组经氨苄抗性基因筛选得到缺失E1b19K、pRB基因的基因组质粒pNBOV1910。

在一些实例中，所述重组腺病毒载体pNBOV1910使用AsisI酶切进行线性化，乙醇沉淀回收后转染293细胞进行病毒拯救、扩增培养，以CsCl密度梯度离心法纯化得到NBOV1910。

本发明术语“外源序列”是指非NBOV1901型腺病毒来源的任何DNA序列。本领域普通技术人员应当理解，外源序列可以是外源基因表达框，也可以是shRNA或miRNA的表达框等。

在以下实施例中，根据本领域技术人员的理解，外源基因表达框可包含真核启动子、外源基因编码序列、转录终止子。所述外源基因编码序列可以是但不仅限于绿色荧光蛋白、其他病毒抗原、shRNA等的编码序列。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

实施例1：NBOV1901基因组的环化

1.构建环化NBOV1901基因组的穿梭质粒pT-NBOV1901(L+R)。

参照图1A，以NBOV1901的基因组为模板，PCR获得NBOV1901基因组的左臂(L-NBOV1901)和右臂(R-NBOV1901)。

L-NBOV1901引物：

L-NBOV1901-F：gcgggatccgaattcttaatgcgatcgccatcatcaataatataccttat(SEQID NO.：1)

L-NBOV1901-R：tatctgcatgagcatgatgatatcctttgacccggaacgcgg(SEQ ID NO.：2)

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，30s；cycles 28；72℃，5min；12℃保存。

R-NBOV1901引物：

R-NBOV1901-F：ccgcgttccgggtcaaaggatatcatcatgctcatgcagata(SEQ ID NO.：3)

R-NBOV1901-R：gaagcgagatcgaattcttagcgatcgccatcatcaataaatacctta(SEQ IDNO.：4)

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，1min；cycles 28；72℃，5min；12℃保存。

2.构建pNBOV1901。

pT-NBOV1901(L+R)使用EcoRI+BamHI进行酶切线性化，然后和NBOV1901的基因组共转化BJ5183感受态细胞进行重组，氨苄抗性平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pNBOV1901，使用不同的酶切方式进行鉴定(图1B)，pNBOV1901在基因组的两侧引入了两个AsisI酶切位点，方便后续对改造后的NBOV1901的基因组进行线性化进行病毒拯救。

实施例2：SrfI至E3区基因的敲除，构建pNBOV1901ΔE3_SrfI质粒的构建

1.构建SrfI至E3区基因敲除的穿梭质粒pVax-ΔE3_SrfI(L+R)。

参照图2A，以NBOV1901的基因组为模板，PCR获得SrfI至E3区基因的左臂(L-ΔE3_SrfI)和右臂(R-ΔE3_SrfI)。

L-ΔE3_SrfI引物：

L-ΔE3_SrfI-F：gatatacgcgtgtatac cttcccaggatggcaccca(SEQ ID NO.：5)

L-ΔE3_SrfI-R：gtaagtaatttattgtgtgtttatg ttaattaa ctgtgtgaccgctgctgt(SEQ ID NO.：6)

R-ΔE3引物：

R-ΔE3_SrfI-F：acagcagcggtcacacag ttaattaa cataaacacacaataaattacttac(SEQ ID NO.：7)

R-ΔE3_SrfI-R：ccgcccagtagaagcgccggtg ccgcccgttttaatttccatgtt(SEQ IDNO.：8)

PCR条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃30s；72℃，50s；cycles 28；72℃，5min；12℃保存。

L-ΔE3_SrfI、R-ΔE3_SrfI和Bstz17I+SgrAI双酶切pVax载体获得的质粒骨架使用Exnase酶进行三片段连接得到pVax-ΔE3_SrfI(L+R)。

2.构建pNBOV1901ΔE3_SrfI

pVax-ΔE3_SrfI(L+R)使用Bstz17I+SgrAI双酶切，pNBOV1901使用PacI进行酶切，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，用氨苄抗性平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pNBOV1901ΔE3_SrfI，使用不同的酶切方式进行鉴定(图2B)，pNBOV1901ΔE3_SrfI在敲除基因区引入唯一酶切位点PacI，方便后续克隆操作。

实施例3：构建pNBOV1901ΔE3gp19K质粒

1.构建敲除E3gp19K的穿梭载体pVAX-△E3gp19K。

参照图3A，以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增获得除E3gp19K外从SrfI(位点)至整个E3区基因片段。

E3gp19K上游片段P1-E3-SrfI△E3gp19K：

E3gp19K-F1：gtcacagggtgcggtcgccaggacagggtataactcacct(SEQ ID NO.：9)

E3gp19K-R1：ggaatacaagcaagcggaaaa tcatcttggatgtcgcccccag(SEQ ID NO.：10)

E3gp19K下游片段P2-E3-SrfI△E3gp19K；

E3gp19K-F2：ctgggggcgacatccaagatga ttttccgcttgcttgtattcc(SEQ ID NO.：11)

E3gp19K-R2：ccgcccagtagaagcgccggtg ccgcccgttttaatttccatgtt(SEQ ID NO.：8)

P1-E3-SrfI△E3gp19K、P2-E3-SrfI△E3gp19K和PacI酶切后的pVAX-△E3-SrfI(L+R)使用Exnase酶进行三片段连接得到pVAX-△E3gp19K。

2.构建pNBOV1901ΔE3gp19K质粒

pVAX-△E3gp19K使用Bstz17I+SgrAI双酶切，pNBOV1901ΔE3_SrfI使用PacI进行酶切，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，用氨苄抗性平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pVAX-△E3gp19K，使用不同的酶切方式进行鉴定(图3B)。

实施例4：构建pNBOV1901△E3gp19K△E1质粒

1.构建敲除E1区基因的穿梭载体pVAX-△E3gp19K△E1(L+R)。

参照图4A，以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-ΔE1及R-ΔE1。

L-ΔE1引物：

L-ΔE1-FW:cagatatacgcgtgtataccatcatcaataatatacct(SEQ ID NO.：12)

L-ΔE1-RW:agacagcaagacacttgctatcgatttttagtcccggtgttgga(SEQ ID NO.：13)

R-ΔE1引物：

R-ΔE1-FW:tccaacaccgggactaaaaatcgatagcaagtgtcttgctgtct(SEQ ID NO.：14)

R-ΔE1-RW:gcccagtagaagcgccggtggaattcatctgaactcaaagcgtg(SEQ ID NO.：15)

M-ΔE1、R-ΔE1和Bstz17I+SgrAI双酶切pVax载体获得的质粒骨架使用Exnase酶进行三片段连接得到pVAX-△E3gp19K△E1(L+R)。

2.构建pNBOV1901△E3gp19K△E1。

pVAX-△E3gp19K△E1(L+R)使用Bstz17I+SgrAI双酶切，p NBOV1901ΔE3gp19K使用SrfI进行酶切，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，用氨苄抗性平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pNBOV1901△E3gp19K△E1，使用不同的酶切方式进行鉴定(图4B)，pNBOV1901△E3gp19K△E1在敲除基因区引入唯一酶切位点SrfI，方便后续克隆操作。

实施例5：构建载体pNBOV1901△E3gp19K△E1B19K_pRB，即pNBOV1910

1.构建敲除E1B19K、pRB基因的穿梭载体穿梭载体pVAX-△E1B19K_pRB。

参照图5A，以NBOV1901基因组为模板，PCR扩增获得缺失E1b19K、pRB基因的E1区基因。

P1-△E1B19K_pRB引物：

P1-△E1B19K_pRB-FW：caacaccgggactaaaaatgagacatattatctgcc(SEQ ID NO.：16)

P1-△E1B19K_pRB-RW:atcctcgtcgtcactgggtgg atcgaccacctccggtacaa(SEQ IDNO.：17)

P2-△E1B19K_pRB引物：

P2-△E1B19K_pRB-FW:ttgtaccggaggtggtcgat ccacccagtgacgacgaggat(SEQ IDNO.：18)

P2-△E1B19K_pRB-RW:gatgggtttcttcgctccat gaggtcaaatgtaaccaaga(SEQ IDNO.：19)

P3-△E1B19K_pRB引物：

P3-△E1B19K_pRB-FW:tcttggttacatttgacctc atggagcgaagaaacccatc(SEQ IDNO.：20)

P3-△E1B19K_pRB-RW:tcttggttacatttgacctc atggagcgaagaaacccatc(SEQ IDNO.：20)

P1-△E1B19K_pRB、P2-△E1B19K_pRB、P3-△E1B19K_pRB和SrfI酶切后的pVAX-△E1(L+R)使用Exnase酶进行四片段连接得到pVAX-△E1B19K_pRB。

2.构建pNBOV1901△E3gp19K△E1B19K_pRB

pVAX-△E1B19K_pRB使用Bstz17I+SgrAI双酶切，pNBOV1901ΔE3gp19KΔE1使用SrfI进行酶切，将两者酶切回收的片段共转化BJ5183感受态细胞进行重组，用氨苄抗性平板进行抗性筛选，将筛选得到单克隆扩增后提取其质粒转化XL感受态细胞，提取质粒得到pNBOV1910，使用不同的酶切方式进行鉴定(图5B)。

经测序，pNBOV1910如SEQ ID NO.：21所示。

实施例6：复制型腺病毒NBOV1901重组腺病毒的生产及纯化结果

pNBOV1910用AsisI线性化后进行病毒拯救，拯救出毒以后逐步扩大培养，在对毒种进行PCR和酶切鉴定确认后进行大扩培养，收集细胞，CsCl密度梯度离心纯化病毒，结果如图6所示，收集得到的病毒，-80度保存。从图中可以看出，pNBOV1910保留了复制型腺病毒NBOV1901生产性能，复制能力未有减弱。

实施例7：不同剂量NBOV1910、NBOV1901在H1299等肿瘤细胞溶瘤效果

对数生长期的各肿瘤细胞铺板5*10^3cell/well，培养24h，每孔病毒量TCID50分别为1250、250、50、10、2、0梯度进行病毒稀释，稀释后每孔添加100μl感染细胞孵育1h，培养24-72小时(72hpi)或96hpi测定肿瘤细胞杀伤效果。

实验结果如图7所示。接毒72h后CCK-8检测结果，结果显示随着病毒浓度的增加对肿瘤细胞杀伤作用更强。改造得到的NBOV1910具有良好的溶瘤效果，在某些剂量区间具有更好的溶瘤效果。

实施例8：不同剂量NBOV1901ΔE3ΔE1B19K_pRb、NBOV1910、NBOV1901在H1299肿瘤细胞溶瘤效果

对数生长期的各肿瘤细胞铺板5×10^3cell/well，培养24h，每孔病毒量TCID50分别为1250、250、50、10、2、0梯度进行病毒稀释，稀释后每孔添加100μl感染细胞孵育1h，培养72小时(72hpi)或96hpi测定肿瘤细胞杀伤效果。

图8为接毒72h后CCK-8检测结果，结果显示复制型溶瘤腺病毒NBOV1901可变区的改造不影响其溶瘤效果。

实施例9：NBOV1910、NBOV1901小鼠体内抗肿瘤效果

用Balb/c_nude小鼠模型，在5-6周龄的Balb/c_nude小鼠大腿与背腹部交界或前腿后肋下皮肤松弛处接种5×10^6cell的H1299细胞。当肿瘤生长到200mm³时，用1×10¹¹VP病毒在瘤内注射分别注射PBS、NBOV1910和NBOV1901，然后观察肿瘤大小和肿瘤清除率。

实验结果如图9所示，说明治疗组NBOV1910、NBOV01能够显著抑制肿瘤生长，具有治疗肿瘤的潜力。

图10是现有溶瘤腺病毒的溶瘤作用(参见Taki M,Kagawa S,Nishizaki M,etal.Enhanced oncolysis by a tropism-modified telomerase-specific replication-selective adenoviral agent OBP-405(‘Telomelysin-RGD’)[J].Oncogene,2005,24(19):3130-3140.)，可见NBOV1910、NBOV1901在非小细胞肺癌细胞具有更好的效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州恩宝生物医药科技有限公司

<120> 一种复制型人腺病毒及其应用

<130>

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

gcgggatccg aattcttaat gcgatcgcca tcatcaataa tataccttat 50

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

tatctgcatg agcatgatga tatcctttga cccggaacgc gg 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

ccgcgttccg ggtcaaagga tatcatcatg ctcatgcaga ta 42

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

gaagcgagat cgaattctta gcgatcgcca tcatcaataa atacctta 48

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

gatatacgcg tgtatacctt cccaggatgg caccca 36

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

gtaagtaatt tattgtgtgt ttatgttaat taactgtgtg accgctgctg t 51

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 7

acagcagcgg tcacacagtt aattaacata aacacacaat aaattactta c 51

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 8

ccgcccagta gaagcgccgg tgccgcccgt tttaatttcc atgtt 45

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 9

gtcacagggt gcggtcgcca ggacagggta taactcacct 40

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 10

ggaatacaag caagcggaaa atcatcttgg atgtcgcccc cag 43

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 11

ctgggggcga catccaagat gattttccgc ttgcttgtat tcc 43

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 12

cagatatacg cgtgtatacc atcatcaata atatacct 38

<210> 13

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 13

agacagcaag acacttgcta tcgattttta gtcccggtgt tgga 44

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 14

tccaacaccg ggactaaaaa tcgatagcaa gtgtcttgct gtct 44

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 15

gcccagtaga agcgccggtg gaattcatct gaactcaaag cgtg 44

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 16

caacaccggg actaaaaatg agacatatta tctgcc 36

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 17

atcctcgtcg tcactgggtg gatcgaccac ctccggtaca a 41

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 18

ttgtaccgga ggtggtcgat ccacccagtg acgacgagga t 41

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 19

gatgggtttc ttcgctccat gaggtcaaat gtaaccaaga 40

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 20

tcttggttac atttgacctc atggagcgaa gaaacccatc 40

<210> 21

<211> 32767

<212> DNA

<213> 腺病毒

<400> 21

catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60

ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120

gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggtaaaagt gacgtttttg 180

gtgtgcgccg gtgtacacgg gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240

taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300

agtgaaatct gaataattct gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360

gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420

cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg cgtagtgtat ttatacccgg 480

tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540

tccaacaccg ggactaaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600

aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660

tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc 720

cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt 780

gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca 840

cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa 900

ccttgtaccg gaggtggtcg atccacccag tgacgacgag gatgaagagg gtgaggagtt 960

tgtgttagat tatgtggagc agcccgggca cggttgcagg tcttgtcatt atcaccggag 1020

gaatacgggg gacccagata ttatgtgttc gctttgctat atgaggacct gtggcatgtt 1080

tgtctacagt aagtgaaatt atgggcagtg ggtgatagag tggtgggttt ggtgtggtaa 1140

tttttttttt aatttttgca gttttgtggt ttaaagaatt ttgtattgta attttttaaa 1200

aggtcctgtg tctgaacctg agcctgagcc cgagccagaa ccggagcctg caagacctac 1260

tcggcgtcct aaaatggtgc ctgctatcct gagacgcccg acatcacctg tgaccagaga 1320

atgcaatagt agtacggata gctgtgactc cggtccttct aacacacctc ctgagataca 1380

cccggtggtc ccgctgtgcc ccattaaacc agttgccgtg agagttggtg ggcgtcgcca 1440

ggctgtggaa tgtatcgagg acttgcttaa cgagcctggg caacctttgg acttgagctg 1500

taaacgcccc aggccataag gtgtaaacct gtgattgcgt gtgtggttaa cgcctttgtt 1560

tgctgaatga gttgatgtaa gtttaataaa aagggtgaga taatgtttaa cttgcatggc 1620

gtgttaaatg gggcggggct taaagggtat ataatgcgcc gtgggctaat cttggttaca 1680

tttgacctca tggagcgaag aaacccatct gagcgggggg tacctgctgg attttctggc 1740

catgcatctg tggagagcgg tggtgagaca caagaatcgc ctgctactgt tgtcttccgt 1800

ccgcccggca ataataccga cggaggagca gcagcagcag cagcagcagc aggaggaagc 1860

caggcggcgg cggcggcagg agcagagccc atggaacccg agagccggcc tggaccctcg 1920

ggaatgaatg ttgtacaggt ggctgaactg tttccagaac tgagacgcat tttaaccatt 1980

aacgaggatg ggcagggact aaagggggta aagagggagc ggggggcttc tgaggctata 2040

gaggaggcta ggaatctaac ttttagctta atgaccagac accgtcctga gtgtgttact 2100

tttcagcaga ttaaggataa ttgtgctaat gagcttgatc tgctggcgca gaagtattcc 2160

atagagcagc tgaccactta ctggctgcag ccaggggatg attttgagga ggctattagg 2220

gtatatgcaa aggtggcact taggccagat tgcaagtaca agattagcaa acttgtaaat 2280

atcaggaatt gttgctacat ttctgggaac ggggccgagg tggagataga tacggaggat 2340

agggtggcct ttagatgtag catgataaat atgtggccgg gggtgcttgg catggacggg 2400

gtggttttta tgaatgtgag gtttactggc cccaatttta gcggtacggt tttcctggcc 2460

aataccaacc ttatcctaca cggtgtaagc ttctatgggt ttaacaatac ctgcgtggaa 2520

gcctggaccg atgtaagggt tcggggctgt gccttttact tctgctggaa gggggtggtg 2580

tgtcgcccca aaagcagggc ttcaattaag aaatgcctct ttgaaaggtg taccttgggt 2640

atcctgtctg agggtaactc cagggtgcgc cacaatgtgg cctccgactg tggttgcttc 2700

atgctagtga aaagcgtggc tgtgattaag cataacatgg tgtgtggcaa ctgcgaggac 2760

agggcctctc agatgctgac ctgctcggac ggcaactgtc acctgctgaa gaccattcac 2820

gtagccagcc actctcgcaa ggcctggcca gtgtttgagc acaacatatt gacccgctgt 2880

tccttgcatt tgggtaacag gaggggggtg ttcctacctt accaatgcaa tttgagtcac 2940

actaagatat tgcttgagcc cgagagcatg tccaaggtga acctgaacgg ggtgtttgac 3000

atgaccatga agatctggaa ggtgctgagg tacgatgaga cccgcaccag gtgcagaccc 3060

tgcgagtgtg gcggtaaaca tattaggaac cagcctgtga tgctggatgt gaccgaggag 3120

ctgaggcccg atcacttggt gctggcctgc acccgcgctg agtttggctc tagcgatgaa 3180

gatacagatt gaggtactga aatgtgtggg cgtggcttaa gggtgggaaa gaatatataa 3240

ggtggggggt ctcatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgcca tgagcaccaa 3300

ctcgtttgat ggaagcattg tgagctcata tttgacaaca cgcatgcccc catgggccgg 3360

ggtgcgtcag aatgtgatgg gctccagcat tgatggtcgc cccgtcctgc ccgcaaactc 3420

tactaccttg acctacgaga ccgtgtctgg aacgccgttg gagactgcag cctccgccgc 3480

cgcttcagcc gctgcagcca ccgcccgcgg gattgtgact gactttgctt tcctgagccc 3540

gcttgcaagc agtgcagctt cccgttcatc cgcccgcgat gacaagttga cgactctttt 3600

ggcacaattg gattctttga cccgggaact taatgtcgtt tctcagcagc tgttggagct 3660

gcgccagcag gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc aatgcggttt aaaacataaa 3720

taaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt cttgctgtct ttatttaggg 3780

gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt cgttgagggt cctgtgtatt 3840

ttttccagga cgtggtagag gtggctctgg atgttcagat acatgggcat aagcccgtct 3900

ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg gggtggtgtt gtagatgatc 3960

cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt ccttcagaag caagctgatt 4020

gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt taagctggga tgggtgcata 4080

cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt tggctatgtt cccagccata 4140

tccctcctgg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag tgtatccggt gcacttggga 4200

aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact tggagacgcc cttgtgacct 4260

ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg gcccacgggc ggcggcctgg 4320

gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt ccaggataag atcgtcatag 4380

gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg gtatgatggt tccatccggt 4440

ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg ctttgagttc agatgggggg 4500

atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg gggtagggga gatcagctgg 4560

gaagaaagca cgttcctgag cagctgcgac ttaccgcagc cggtgggccc gtaaatcaca 4620

cctattaccg gctgcaactg gtagttaaga gagctgcagc tgccgtcatc cctgagcagg 4680

ggggccactt cgttaagcat gtccctgact cgcatgtttt ccctgaccaa atccgccaga 4740

aggcgctcgc cgcccagcga tagcagttct tgcaaggaag caaagttttt caacggtttg 4800

aggccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa gcagttccag gcggtcccac 4860

agctcggtca cgtgctctac ggcatctcga tccagcatat ctcctcgttt cgcgggttgg 4920

ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag acgggccagg gtcatgtctt 4980

tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac ggtgaagggg tgcgctccgg 5040

gctgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct ggtgctgaag cgctgccggt 5100

cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt gtcatagtcc agcccctccg 5160

cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc gccgcacgag gggcagtgca 5220

gacttttgag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga ttccggggag taggcatccg 5280

cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca ggtgagctct ggccgttcgg 5340

ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt cttacctctg gtttccatga 5400

gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc cccgtataca gacttgagag 5460

gcctgtcctc gagcggtgtt ccgcggtcct cctcgtatag aaactcggac cactctgaga 5520

cgaaggctcg cgtccaggcc agcacgaagg aggctaagtg ggaggggtag cggtcgttgt 5580

ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat gtcgccctct tcggcatcaa 5640

ggaaggtgat tggtttgtag gtgtaggcca cgtgaccggg tgttcctgaa ggaggggtat 5700

aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc atcgctgtct gcgagggcca 5760

gctgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag cgggcatgac ttctgcgcta aggttgtcag 5820

tttccaaaaa cgaggaggat ttgatgttca cctggcccgc ggtgatgcct ttgagggtgg 5880

ccgcgtccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc aagcttggtg gcaaacgacc 5940

cgtagagggc gttggacagc aacttggcaa tggagcgcag ggtttggttt ttgtcgcgat 6000

cggcacgctc cttggccgcg atgtttagct gcacgtattc acgcgcaacg caccgccatt 6060

cgggaaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ccaggcgcac gcgccaaccg cggttgtgca 6120

gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag gcgctcgttg gtccagcaga 6180

ggcggccgcc cttgcgcgag caaaatggcg gtagggggtc tagctgcgtc tcgtctgggg 6240

ggtccgcgtc cacggtaaag acccctggca gcaggcgcgc gtcgaagtag tctatcttgc 6300

atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggctgc aagcgcgcgc tcgtatgggt 6360

tgagtggggg accccatggc atggggtggg tgagcgcgga ggcgtacatg ccgcaaatgt 6420

cgtaaacgta gaggggctcc ctgagtattc caagatatgt agggtagcat cttccaccgc 6480

ggatgctggc gcgcacgtaa tcgtatagtt cgtgcgaggg agcgaggagg tcgggaccga 6540

ggttgctacg ggcgggctgc tctgctcgga agacgatctg cctgaagatg gcatgcgagt 6600

tggatgatat ggttggacgc tggaagacgt tgaagctagc gtctgtgaga cctaccgcgt 6660

cacgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgttgac cagctcggcg gtgacctgca 6720

cgtctagggc gcagtagtcc agggtttcct tgatgatgtc atacttatcc tgtccctttt 6780

ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc tttccagtac tcttggatcg 6840

gaaacccgtc ggcctccgaa cggtaagagc ctagcatgta gaactggttg acggcctggt 6900

aggcgcagca tcccttttct acgggtagcg cgtatgcctg tgcggccttc cggagcgagg 6960

tgtgggtgag cgcaaaggtg tccctgacca tgactttgag gtactggtat ttgaagtcaa 7020

tgtcgtcgca tccgccctgc tcccagagca aaaagtccgt gcgctttttg gaacgcgggt 7080

ttggcagggc gaaggtgaca tcgttgaaga gtatctttcc cgcgcgaggc ataaagttgc 7140

gtgtgatgcg gaagggtccc ggcacctcgg aacggttgtt aattacctgg gcggcgagca 7200

cgatctcgtc aaagccgttg atgttatggc ccacgatgta aagttccaag aagcgcgggg 7260

tgcccttgat ggagggcaat tttttaagtt cctcgtaggt gagctcttca ggggagctga 7320

gcccgtgctc tgacagggcc cagtctgcaa gatgagggtt ggaagcgacg aatgagctcc 7380

acaggtcacg ggccattagc gtctgcagct ggtcgcgaaa ggttctaaac tggcgaccta 7440

tggccatttt ttctggggtg atgcagtaga aggtaagcgt gtcttgttcc cagcggtccc 7500

atccaagttc cacggctagg tctctcgcgg cggttactag aggctcatct ccgccgaact 7560

tcatgaccag catgaagggc acgagctgct tcccaaaggc ccccatccaa gtataggtct 7620

ctacatcgta ggtgacaaag agacgctcgg tgcgaggatg cgagccgatc gggaagaact 7680

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gacgggccga acactcgtgc tggcttttgt aaaaacgtgc gcagtactgg cagcggtgca 7800

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gaccgtctgg ctgctcgagg ggagttacgg tggatcgtac caccacgccg cgcgagctca 7980

aagtccagat gtccgcgcgc ggcggtcgga gcttgatgac aacatcgcgc agatgggagc 8040

tgtccatggt ctggagctcc cgcggcgtca ggtcaggcgg gagctcttgc aggtttacct 8100

cgcatagacg ggtgagggcg cgggctaggt ccaggtgata cctgatttcc aggggctggt 8160

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ctcctgcacg tctcctgagt tgtcttgata ggcgatctcg gccatgaact gctcgatctc 8580

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ctcggtgacg gcgcggccgt tctcgcgggg gcgcagttgg aagacgccgc ccgtcatgtc 9240

ccggttatgg gttggcgggg tgctgccgtg cggcagggat acggcgctaa cgatgcatct 9300

caacaattgc tgtgtaggta ctccgccgcc gagggacctg agcgagtccg catcgaccgg 9360

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gtaattaaag taggcggtct tgagacggcg gatggtcgac agaagcacca tgtccttggg 9540

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ggcgacaacg cgctcggcta atatggcctg ctgcacctgc gtgagggtag actggaagtc 9840

atccatgtcc acaaagcggt ggtatgcgcc cgtgttgatg gtgtaagtgc agttggccat 9900

aacggaccag ttaacggtct ggtgacccgg ctgcgagagc tcggtgtacc tgagacgcga 9960

gtaagccctt gagtcaaaga cgtagtcgtt gcaagtccgc accaggtact ggtatcccac 10020

caaaaagtgc ggcggcggct ggcggtagag gggccagcgt agggtggccg gggctccggg 10080

ggcgaggtct tccaacataa ggcgatgata tccgtagatg tacctggaca tccaggtgat 10140

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gcccgaggag atgcgggatc gaaagtttca cgcggggcgc gagctgcggc atggcctgaa 11100

ccgcgagcgg ttgctgcgcg aggaggactt tgagcccgac gcgcggaccg ggattagtcc 11160

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ggagattaac tttcaaaaaa gctttaacaa ccacgtgcgc acgcttgtgg cgcgcgagga 11280

ggtggctata ggactgatgc atctgtggga ctttgtaagc gcgctggagc aaaacccaaa 11340

tagcaagccg ctcatggcgc agctgttcct tatagtacag cacagcaggg acaacgaggc 11400

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cgccattaac tattccatgc tcagtctggg caagttttac gcccgcaaga tataccatac 11580

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tgagtacgag ccagaggacg gcgagtacta agcggtgatg tttctgatca gatgatgcaa 12000

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gggccagact attttttcca gaccagtaga caaggcctgc agaccgtaaa cctgagccag 12600

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gcgctggggc aggaggacac gggcagcctg gaggcaaccc tgaactacct gctgaccaac 12900

cggcggcaga agatcccctc gttgcacagt ttaaacagcg aggaggagcg catcttgcgc 12960

tatgtgcagc agagcgtgag ccttaacctg atgcgcgacg gggtaacgcc cagcgtggcg 13020

ctggacatga ccgcgcgcaa catggaaccg ggcatgtatg cctcaaaccg gccgtttatc 13080

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agctttcgca ggccaagcag cttgtccgat ctaggcgctg cggccccgcg gtcagatgct 13380

agtagcccat ttccaagctt gatagggtct cttaccagca ctcgcaccac ccgcccgcgc 13440

ctgctgggcg aggaggagta cctaaacaac tcgctgctgc agccgcagcg cgaaaagaac 13500

ctgcctccgg cgtttccgaa caacgggata gagagcctag tggacaagat gagtagatgg 13560

aagacgtatg cgcaggagca cagggatgtg cccggcccgc gcccgcccac ccgtcgtcaa 13620

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gtcctggatt tgggagggag tggcaacccg tttgcgcacc ttcgccccag gctggggaga 13740

atgttttaaa aaaaaaaaaa agcatgatgc aaaataaaaa actcaccaag gccatggcac 13800

cgagcgttgg ttttcttgta ttccccttag tatgcggcgc gcggcgatgt atgaggaagg 13860

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ccccttcgat gctcccctgg acccgccgtt cgtgcctccg cggtacctgc ggcctaccgg 13980

ggggagaaac agcatccgtt actctgagtt ggcaccccta ttcgacacca cccgtgtgta 14040

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catcaatctt gacgaccggt cgcactgggg cggcgacctg aaaaccatcc tgcataccaa 14220

catgccaaat gtgaacgagt tcatgtttac caataagttt aaggcgcggg tgatggtgtc 14280

gcgctcgctt actaaggaca aacaggtgga gctgaaatat gagtgggtgg agttcacgct 14340

gcccgagggc aactactccg agaccatgac catagacctt atgaacaacg cgatcgtgga 14400

gcactacttg aaagtgggca ggcagaacgg ggttctggaa agcgacatcg gggtaaagtt 14460

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atatacaaac gaagccttcc atccagacat cattttgctg ccaggatgcg gggtggactt 14580

cacccacagc cgcctgagca acttgttggg catccgcaag cggcaaccct tccaggaggg 14640

ctttaggatc acctacgatg acctggaggg tggtaatatt cccgcactgt tggatgtgga 14700

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gaagcgcgct gaggccgagg cagcggccga agctgccgcc cccgctgcgg aggctgcaca 14940

acccgaggtc gagaagcctc agaagaaacc ggtgattaaa cccctgacag aggacagcaa 15000

gaaacgcagt tacaacctaa taagtaatga cagcaccttc acccagtacc gcagctggta 15060

ccttgcatac aactacggcg accctcaggc cgggatccgc tcatggaccc tgctttgcac 15120

tcctgacgta acctgcggct cggagcaggt atactggtcg ttgcccgaca tgatgcaaga 15180

ccccgtgacc ttccgctcca cgagccagat cagcaacttt ccggtggtgg gcgccgagct 15240

gttgcccgtg cactccaaga gcttctacaa cgaccaggcc gtctactccc agctcatccg 15300

ccagtttacc tctctgaccc acgtgttcaa tcgctttccc gagaaccaga ttttggcgcg 15360

cccgccagcc cccaccatca ccaccgtcag tgaaaacgtt cctgctctca cagatcacgg 15420

gacgctaccg ctgcgcaaca gcatcggagg agtccagcga gtgaccatta ctgacgccag 15480

acgccgcacc tgcccctacg tttacaaggc cctgggcata gtctcgccgc gcgtcctatc 15540

gagccgcact ttttgagcaa gcatgtccat ccttatatcg cccagcaata acacaggctg 15600

gggcctgcgc ttcccaagca agatgtttgg cggggccaag aagcgctccg accaacaccc 15660

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ggtggaactg ttgcacgcga ccgcgcccag gcggcgggta cagtggaaag gtcgacgcgt 16440

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gggcgtgcag accgtggacg ttcagatacc caccaccagt agcactagta ttgccactgc 16920

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gtttcgcgtt tcagcccccc ggcgtccgcg ccgttcgagg aagtacggcg ccgccagcgc 17100

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ggtctttgtg gttcttgcag atatggccct cacctgccgc ctccgtttcc cggtgccggg 17400

attccgagga agaatgcacc gtaggagggg catggccggc cacggcctga cgggcggcat 17460

gcgtcgtgcg caccaccggc ggcggcgcgc gtcgcaccgt cgcatgcgcg gcggtatcct 17520

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ggccttgcag gcgcagagac actgattaaa aacaagttgc atgtggaaaa atcaaaataa 17640

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tcggcaccag caatatgagc ggtggcgcct tcagctgggg ctcgctgtgg agcggcatta 17820

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cctctggcat tagcggggtg gtggacctgg ccaaccaggc agtgcaaaat aagattaaca 18000

gtaagcttga tcaccgccct cccgtagagg agccttcacc ggccgtggag acagtgttgc 18060

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tatgttgggt caacaagcaa tgccaaacag acccaattac atcgctttta gggacaattt 19560

tattggcctt atgtattaca acagcactgg taacatgggt gtccttgctg gacaagcatc 19620

acagctaaat gccgtggtag acttgcagga cagaaacaca gagctgtcat atcaactttt 19680

gcttgattct attggcgata gaaccagata cttttccatg tggaatcagg ctgtagacag 19740

ctatgatcca gatgtcagaa tcattgaaaa tcatggaact gaggatgagt tgccaaatta 19800

ctgcttccca cttggcggta taggggtaac tgacacctac caaggtataa aatcaaacgg 19860

aaacggtaat cctcaaaact ggaccaaaaa tgacgatttt gcggcacgta atgaaatagg 19920

tgtgggaaac aactttgccc tggagattaa ccttaatgcc aacctatgga gaaatttcct 19980

ctactccaac attgcactgt acctgcctga caagctaaaa tacactccta caaatgtgga 20040

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ctacaacgtt gcccaatgca acatgaccaa agactggttc ttggtacaga tgctagccaa 20880

ctacaacata ggctaccagg gcttttatat cccagaaagc tataaggacc gcatgtactc 20940

cttctttaga aacttccagc ccatgagccg tcaggtggtg gacgatacca aatacaagga 21000

ctaccaacag gtgggcatcc tccaccagca caataactct ggctttgttg gttacctcgc 21060

tcccaccatg cgagagggac aggcctaccc cgccaacttc ccctacccgc ttataggcaa 21120

gaccgcggtt gacagtatta cccagaaaaa gtttctttgc gaccgcaccc tttggcgcat 21180

tccattctcc agtaacttta tgtccatggg tgcactcaca gacctgggcc aaaaccttct 21240

ctatgcaaac tccgcccacg cgctagatat gacttttgag gtggatccca tggacgagcc 21300

cacccttctt tatgttttgt ttgaagtctt tgacgtggtc cgtgtgcacc agccgcaccg 21360

cggcgtcatc gagaccgtgt acctgcgcac gcccttctcg gctggcaacg ccacaacata 21420

aagaagcaag caacatcaac aacagctgcc gccatgggct ccagtgagca ggaactaaaa 21480

gccattgtca aagatcttgg ttgtgggcca tattttttgg gcacctatga caagcgcttc 21540

ccaggctttg tttccccaca caagctcgcc tgcgccatag ttaacacggc cggtcgcgag 21600

actgggggcg tacactggat ggcctttgcc tggaacccgc gctcaaaaac atgctacctc 21660

tttgagccct ttggcttttc tgaccaacgt ctcaagcagg tttaccagtt tgagtacgag 21720

tcactcctgc gccgtagcgc cattgcctct tcccccgacc gctgtataac gctggaaaag 21780

tccacccaaa gcgtgcaggg gcccaactcg gccgcctgtg gcctattctg ctgcatgttt 21840

ctccacgcct ttgccaactg gccccaaact cccatggatc acaaccccac catgaacctt 21900

attaccgggg tacccaactc catgcttaac agtccccagg tacagcccac cctgcgtcgc 21960

aaccaggaac agctctacag cttcctggag cgccactcgc cctacttccg cagccacagt 22020

gcgcagatta ggagcgccac ttctttttgt cacttgaaaa acatgtaaaa ataatgtact 22080

aggagacact ttcaataaag gcaaatgttt ttatttgtac actctcgggt gattatttac 22140

ccccaccctt gccgtctgcg ccgtttaaaa atcaaagggg ttctgccgcg catcgctatg 22200

cgccactggc agggacacgt tgcgatactg gtgtttagtg ctccacttaa actcaggcac 22260

aaccatccgc ggcagctcgg tgaagttttc actccacagg ctgcgcacca tcaccaacgc 22320

gtttagcagg tcgggtgccg atatcttgaa gtcgcagttg gggcctccgc cctgcgcgcg 22380

cgagttgcga tacacagggt tgcagcactg gaacactatt agcgccgggt ggtgcacgct 22440

ggccagcacg ctcttgtcgg agatcagatc cgcgtccagg tcctccgcgt tgctcagggc 22500

gaacggagtc aactttggta gctgccttcc caaaaagggt gcatgcccag gctttgagtt 22560

gcactcgcac cgtagtggca tcagaaggtg accgtgcccg gtctgggcgt taggatacag 22620

cgcctgcatg aaagccttga tctgcttaaa agccacctga gcctttgcgc cttcagagaa 22680

gaacatgccg caagacttgc cggaaaactg attggccgga caggccgcgt catgcacgca 22740

gcaccttgcg tcggtgttgg agatctgcac cacatttcgg ccccaccggt tcttcacgat 22800

cttggccttg ctagactgct ccttcagcgc gcgctgcccg ttttcgctcg tcacatccat 22860

ttcaatcacg tgctccttat ttatcataat gctcccgtgt agacacttaa gctcgccttc 22920

gatctcagcg cagcggtgca gccacaacgc gcagcccgtg ggctcgtggt gcttgtaggt 22980

tacctctgca aacgactgca ggtacgcctg caggaatcgc cccatcatcg tcacaaaggt 23040

cttgttgctg gtgaaggtca gctgcaaccc gcggtgctcc tcgtttagcc aggtcttgca 23100

tacggccgcc agagcttcca cttggtcagg cagtagcttg aagtttgcct ttagatcgtt 23160

atccacgtgg tacttgtcca tcaacgcgcg cgcagcctcc atgcccttct cccacgcaga 23220

cacgatcggc aggctcagcg ggtttatcac cgtgctttca ctttccgctt cactggactc 23280

ttccttttcc tcttgcgtcc gcataccccg cgccactggg tcgtcttcat tcagccgccg 23340

caccgtgcgc ttacctccct tgccgtgctt gattagcacc ggtgggttgc tgaaacccac 23400

catttgtagc gccacatctt ctctttcttc ctcgctgtcc acgatcacct ctggggatgg 23460

cgggcgctcg ggcttgggag aggggcgctt ctttttcttt ttggacgcaa tggccaaatc 23520

cgccgtcgag gtcgatggcc gcgggctggg tgtgcgcggc accagcgcat cttgtgacga 23580

gtcttcttcg tcctcggact cgagacgccg cctcagccgc ttttttgggg gcgcgcgggg 23640

aggcggcggc gacggcgacg gggacgacac gtcctccatg gttggtggac gtcgcgccgc 23700

accgcgtccg cgctcggggg tggtttcgcg ctgctcctct tcccgactgg ccatttcctt 23760

ctcctatagg cagaaaaaga tcatggagtc agtcgagaag gaggacagcc taaccgcccc 23820

ctttgagttc gccaccaccg cctccaccga tgccgccaac gcgcctacca ccttccccgt 23880

cgaggcaccc ccgcttgagg aggaggaagt gattatcgag caggacccag gttttgtaag 23940

cgaagacgac gaggatcgct cagtaccaac agaggataaa aagcaagacc aggacgacgc 24000

agaggcaaac gaggaacaag tcgggcgggg ggaccaaagg catggcgact acctagatgt 24060

gggagacgac gtgctgttga agcatctgca gcgccagtgc gccattatct gcgacgcgtt 24120

gcaagagcgc agcgatgtgc ccctcgccat agcggatgtc agccttgcct acgaacgcca 24180

cctgttctca ccgcgcgtac cccccaaacg ccaagaaaac ggcacatgcg agcccaaccc 24240

gcgcctcaac ttctaccccg tatttgccgt gccagaggtg cttgccacct atcacatctt 24300

tttccaaaac tgcaagatac ccctatcctg ccgtgccaac cgcagccgag cggacaagca 24360

gctggccttg cggcagggcg ctgtcatacc tgatatcgcc tcgctcgacg aagtgccaaa 24420

aatctttgag ggtcttggac gcgacgagaa acgcgcggca aacgctctgc aacaagaaaa 24480

cagcgaaaat gaaagtcact gtggagtgct ggtggaactt gagggtgaca acgcgcgcct 24540

agccgtgctg aaacgcagca tcgaggtcac ccactttgcc tacccggcac ttaacctacc 24600

ccccaaggtt atgagcacag tcatgagcga gctgatcgtg cgccgtgcac gacccctgga 24660

gagggatgca aacttgcaag aacaaaccga ggagggccta cccgcagttg gcgatgagca 24720

gctggcgcgc tggcttgaga cgcgcgagcc tgccgacttg gaggagcgac gcaagctaat 24780

gatggccgca gtgcttgtta ccgtggagct tgagtgcatg cagcggttct ttgctgaccc 24840

ggagatgcag cgcaagctag aggaaacgtt gcactacacc tttcgccagg gctacgtgcg 24900

ccaggcctgc aaaatttcca acgtggagct ctgcaacctg gtctcctacc ttggaatttt 24960

gcacgaaaac cgcctcgggc aaaacgtgct tcattccacg ctcaagggcg aggcgcgccg 25020

cgactacgtc cgcgactgcg tttacttatt tctgtgctac acctggcaaa cggccatggg 25080

cgtgtggcag cagtgcctgg aggagcgcaa cctgaaggag ctgcagaagc tgctaaagca 25140

aaacttgaag gacctatgga cggccttcaa cgagcgctcc gtggccgcgc acctggcgga 25200

cattatcttc cccgaacgcc tgcttaaaac cctgcaacag ggtctgccag acttcaccag 25260

tcaaagcatg ttgcaaaact ttaggaactt tatcctagag cgttcaggaa ttctgcccgc 25320

cacctgctgt gcgcttccta gcgactttgt gcccattaag taccgtgaat gccctccgcc 25380

gctttggggt cactgctacc ttctgcagct agccaactac cttgcctacc actccgacat 25440

catggaagac gtgagcggtg acggcctact ggagtgtcac tgtcgctgca acctatgcac 25500

cccgcaccgc tccctggtct gcaattcgca actgcttagc gaaagtcaaa ttatcggtac 25560

ctttgagctg cagggtccct cgcctgacga aaagtccgcg gctccggggt tgaaactcac 25620

tccggggctg tggacgtcgg cttaccttcg caaatttgta cctgaggact accacgccca 25680

cgagattagg ttttacgaag accaatcccg cccgccaaat gcggagctta ccgcctgcgt 25740

cattacccag ggccacatcc ttggccaatt gcaagccatc aacaaagccc gccaagagtt 25800

tctgctacga aagggacggg gggtttacct ggacccccag tccggcgagg agctcaaccc 25860

aatccccccg ccgccgcagc cctatcagca gccgcgggcc cttgcttccc aggatggcac 25920

ccaaaaagaa gctgcagctg ccgccgccgc cacccacgga cgaggaggaa tactgggaca 25980

gtcaggcaga ggaggttttg gacgaggagg aggagatgat ggaagactgg gacagcctag 26040

acgaagcttc cgaggccgaa gaggtgtcag acgaaacacc gtcaccctcg gtcgcattcc 26100

cctcgccggc gccccagaaa ttggcaaccg ttcccagcat cgctacaacc tccgctcctc 26160

aggcgccgcc ggcactgccc gttcgccgac ccaaccgtag atgggacacc actggaacca 26220

gggccggtaa gtctaagcag ccgccgccgt taacccaaga gcaacaacag cgccaaggct 26280

accgctcgtg gcgcgggcac aagaacgcca tagttgcttg cttgcaagac tgtgggggca 26340

acatctcctt cgcccgccgc tttcttctct accatcacgg cgtggccttc ccccgtaaca 26400

tcctgcatta ctaccgtcat ctctacagcc cctactgcac cggcggcagc ggcagcggca 26460

gcaacagcag cggtcacaca gaagcaaagg cgaccggata gcaagactct gacaaagccc 26520

aagaaatcca cagcggcggc agcagcagga ggaggagcgc tgcgtctggc gtccaacgaa 26580

cccgtatcga cccgcgagct tagaaacagg atttttccca ctctgtatgc tatatttcaa 26640

caaagcaggg gccaagaaca agagctaaaa ataaaaaaca ggtctctgcg ctccctcacc 26700

cgcagctgcc tgtatcacaa aagcgaagat cagcttcggc gcacgctgga agacgcggag 26760

gctctcttca gcaaatactg cgcgctgact cttaaggact agtttcgcgc cctttctcaa 26820

atttaagcgc gaaaactacg tcatctccag cggccacacc cggcgccagc acctgtcgtc 26880

agcgccatta tgagcaagga aattcccacg ccctacatgt ggagttacca gccacaaatg 26940

ggacttgcgg ctggagctgc ccaagactac tcaacccgaa taaactacat gagcgcggga 27000

ccccacatga tatcccgggt caacggaatc cgcgcccacc gaaaccgaat tctcctcgaa 27060

caggcggcta ttaccaccac acctcgtaat aaccttaatc cccgtagttg gcccgctgcc 27120

ctggtgtacc aggaaagtcc cgctcccacc actgtggtac ttcccagaga cgcccaggcc 27180

gaagttcaga tgactaactc aggggcgcag cttgcgggcg gctttcgtca cagggtgcgg 27240

tcgccaggac agggtataac tcacctgaaa atcagagggc gaggtattca gctcaacgac 27300

gagtcggtga gctcctctct tggtctccgt ccggacggga catttcagat cggcggcgct 27360

ggccgctctt catttacgcc ccgtcaggcg atcctaactc tgcagacctc gtcctcggag 27420

ccgcgctccg gaggcattgg aactctacaa tttattgagg agttcgtgcc ttcagtttac 27480

ttcaacccct tttctggacc tcccggccac tacccggacc agtttattcc caactttgac 27540

gcggtgaaag actcggcgga cggctacgac tgaatgacca gtggagaggc agagcaactg 27600

cgcctgacac acctcgacca ctgccgccgc cacaagtgct ttgcccgcgg ctccggtgag 27660

ttttgttact ttgaattgcc cgaagagcat atcgagggcc cggcgcacgg cgtccggctc 27720

accacccagg tagagcttac acgtagcctg attcgggagt ttaccaagcg ccccctgcta 27780

gtggagcggg agcggggtcc ctgtgttctg accgtggttt gcaactgtcc taaccctgga 27840

ttacatcaag atctttgttg tcatctctgt gctgagtata ataaatacag aaattagaat 27900

ctactggggc tcctgtcgcc atcctgtgaa cgccaccgtt tttacccacc caaagcagac 27960

caaagcaaac ctcacctccg gtttgcacaa gcgggccaat aagtacctta cctggtactt 28020

taacggctct tcatttgtaa tttacaacag tttccagcga gacgaagtaa gtttgccaca 28080

caaccttctc ggcttcaact acaccgtcaa gaaaaacacc accaccaccc tcctcacctg 28140

ccgggaacgt acgagtgcgt caccggttgc tgcgcccaca cctacagcct gagcgtaacc 28200

agacattact cccatttttc caaaacagga ggtgagctca actcccggaa ctcaggtcaa 28260

aaaagcattt tgcggggtgc tgggattttt taattaagta tatgagcaat tcaagtaact 28320

ctacaagctt gtctaatttt tctggaattg gggtcggggt tatccttact cttgtaattc 28380

tgtttattct tatactagca cttctgtgcc ttagggttgc cgcctgctgc acgcacgttt 28440

gtacctattg tcagcttttt aaacgctggg ggcgacatcc aagatgagat taaatgagac 28500

atgattcctc gagttcttat attattgacc cttgttgcgc ttttctgtgc gtgctctaca 28560

ttggccgcgg tcgctcacat cgaagtagat tgcatcccac ctttcacagt ttacctgctt 28620

tacggatttg tcacccttat cctcatctgc agcctcgtca ctgtagtcat cgccttcatt 28680

cagttcattg actgggtttg tgtgcgcatt gcgtacctca ggcaccatcc gcaatacaga 28740

gacaggacta tagctgatct tctcagaatt ctttaattat gaaacggagt gtcatttttg 28800

ttttgctgat tttttgcgcc ctacctgtgc tttgctccca aacctcagcg cctcccaaaa 28860

gacatatttc ctgcagattc actcaaatat ggaacattcc cagctgctac aacaaacaga 28920

gcgatttgtc agaagcctgg ttatacgcca tcatctctgt catggttttt tgcagtacca 28980

tttttgccct agccatatat ccataccttg acattggctg gaatgccata gatgccatga 29040

accaccctac tttcccagtg cccgctgtca taccactgca acaggttatt gccccaatca 29100

atcagcctcg ccccccttct cccaccccca ctgagattag ctactttaat ttgacaggtg 29160

gagatgactg aatctctaga tctagaattg gatggaatta acaccgaaca gcgcctacta 29220

gaaaggcgca aggcggcgtc cgagcgagaa cgcctaaaac aagaagttga agacatggtt 29280

aacctacacc agtgtaaaag aggtatcttt tgtgtggtca agcaggccaa acttacctac 29340

gaaaaaacca ctaccggcaa ccgcctcagc tacaagctac ccacccagcg ccaaaaactg 29400

gtgcttatgg tgggagaaaa acctatcacc gtcacccagc actcggcaga aacagagggc 29460

tgcctgcact tcccctatca gggtccagag gacctctgca ctcttattaa aaccatgtgt 29520

ggtattagag atcttattcc attcaactaa cataaacaca caataaatta cttacttaaa 29580

atcagtcagc aaatctttgt ccagcttatt cagcatcacc tcctttcctt cctcccaact 29640

ctggtatctc agccgccttt tagctgcaaa ctttctccaa agtttaaatg ggatgtcaaa 29700

ttcctcatgt tcttgtccct ccgcacccac tatcttcata ttgttgcaga tgaaacgcgc 29760

cagaccgtct gaagacacct tcaaccccgt gtatccatat gacacagaaa ccgggcctcc 29820

aactgtgccc tttcttaccc ctccatttgt ttcacccaat ggtttccaag aaagtccccc 29880

tggagttctc tctctacgcg tctccgaacc tttggacacc tcccacggca tgcttgcgct 29940

taaaatgggc agcggtctta ccctagacaa ggccggaaac ctcacctccc aaaatgtaac 30000

cactgttact cagccactta aaaaaacaaa gtcaaacata agtttggaca cctccgcacc 30060

acttacaatt acctcaggcg ccctaacagt ggcaaccacc gctcctctga tagttactag 30120

cggcgctctt agcgtacagt cacaagcccc actgaccgtg caagactcca aactaagcat 30180

tgctactaaa gggcccatta cagtgtcaga tggaaagcta gccctgcaaa catcagcccc 30240

cctctctggc agtgacagcg acacccttac tgtaactgca acacccccgc taactactgc 30300

cacgggtagc ttgggcatta acatggaaga tcctatttat gtaaataatg gaaaaatagg 30360

aattaaaata agcggtcctt tgcaagtagc acaaaactcc gatacactaa cagtagttac 30420

tggaccaggt gtcaccgttg aacaaaactc ccttagaacc aaagttgcag gagctattgg 30480

ttatgattca tcaaacaaca tggaaattaa aacgggcggt ggcatgcgta taaataacaa 30540

cttgttaatt ctagatgtgg attacccatt tgatgctcaa acaaaactac gtcttaaact 30600

ggggcaggga cccctgtata ttaatgcatc tcataacttg gacataaact ataacagagg 30660

cctatacctt tttaatgcat caaacaatac taaaaaactg gaagttagca taaaaaaatc 30720

cagtggacta aactttgata atactgccat agctataaat gcaggaaagg gtctggagtt 30780

tgatacaaac acatctgagt ctccagatat caacccaata aaaactaaaa ttggctctgg 30840

cattgattac aatgaaaacg gtgccatgat tactaaactt ggagcgggtt taagctttga 30900

caactcaggg gccattacaa taggaaacaa aaatgatgac aaacttaccc tgtggacaac 30960

cccagaccca tctcctaact gcagaattca ttcagataat gactgcaaat ttactttggt 31020

tcttacaaaa tgtgggagtc aagtactagc tactgtagct gctttggctg tatctggaga 31080

tctttcatcc atgacaggca ccgttgcaag tgttagtata ttccttagat ttgaccaaaa 31140

cggtgttcta atggagaact cctcacttaa aaaacattac tggaacttta gaaatgggaa 31200

ctcaactaat gcaaatccat acacaaatgc agttggattt atgcctaacc ttctagccta 31260

tccaaaaacc caaagtcaaa ctgctaaaaa taacattgtc agtcaagttt acttgcatgg 31320

tgataaaact aaacctatga tacttaccat tacacttaat ggcactagtg aatccacaga 31380

aactagcgag gtaagcactt actctatgtc ttttacatgg tcctgggaaa gtggaaaata 31440

caccactgaa acttttgcta ccaactctta caccttctcc tacattgccc aggaataaag 31500

aatcgtaaac ctgttgcatg ttatgtttca acgtgtttat ttttcaattg cagaaaattt 31560

caagtcattt ttcattcagt agtatagccc caccaccaca tagcttatac agatcaccgt 31620

accttatcaa actcacagaa ccctagtatt caacctgcca cctccctccc aacacacaga 31680

gtacacagtc ctttctcccc ggctggcctt aaaaagcatc atatcatggg taacagacat 31740

attcttaggt gttatattcc acacggtttc ctgtcgagcc aaacgctcat cagtgatatt 31800

aataaactcc ccgggcagct cacttaagtt catgtcgctg tccagctgct gagccacagg 31860

ctgctgtcca acttgcggtt gcttaacggg cggcgaagga gaagtccacg cctacatggg 31920

ggtagagtca taatcgtgca tcaggatagg gcggtggtgc tgcagcagcg cgcgaataaa 31980

ctgctgccgc cgccgctccg tcctgcagga atacaacatg gcagtggtct cctcagcgat 32040

gattcgcacc gcccgcagca taaggcgcct tgtcctccgg gcgcagcagc gcaccctgat 32100

ctcacttaaa tcagcacagt aactgcagca cagcaccaca atattgttca aaatcccaca 32160

gtgcaaggcg ctgtatccaa agctcatggc ggggaccaca gaacccacgt ggccatcata 32220

ccacaagcgc aggtagatta agtggcgacc cctcataaac acgctggaca taaacattac 32280

ctcttttggc atgttgtaat tcaccacctc ccggtaccat ataaacctct gattaaacat 32340

ggcgccatcc accaccatcc taaaccagct ggccaaaacc tgcccgccgg ctatacactg 32400

cagggaaccg ggactggaac aatgacagtg gagagcccag gactcgtaac catggatcat 32460

catgctcgtc atgatatcaa tgttggcaca acacaggcac acgtacatac acttcctcag 32520

gattacaagc tcctcccgcg tcagaaccat atcccaggga acaacccatt cctgaatcag 32580

cgtaaatccc acactgcagg gaagacctcg cacgtaactc acgttgtgca ttgtcaaagt 32640

gttacattcg ggcagcagcg gatgatcctc cagtatggta gcgcgggttt ctgtctcaaa 32700

aggaggtaga cgatccctac tgtacggagt gcgccgagac aaccgagatc gtgttggtcg 32760

tagtgtc 32767

Claims

1.一种复制型人腺病毒在制备治疗肿瘤的制剂中的应用，其特征在于，所述复制型人腺病毒核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；

所述复制型人腺病毒的构建方法包括：

S1)PCR扩增获得NBOV1901基因组的左右两端，连接在抗性载体质粒A得到pT-NBOV1901(L+R)，线性化后与NBOV1901基因组重组得到基因组质粒pNBOV1901；所述NBOV1901基因组的全序列的GenBank号为：MH558113 .1；

S5)PCR扩增获得去除E1b19K、pRB基因的E1区基因组，连接至含有E1区左右臂的抗性载体质粒B上，线性化后与酶切后的pNBOV1901△E3gp19K△E1进行重组，得到敲除E1b19K、pRB基因的基因组质粒pNBOV1910，即所述复制型人腺病毒；

所述PCR扩增获得去除E1b19K、pRB基因的E1区基因组的引物序列如SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：20所示；

所述抗性载体质粒A和所述抗性载体质粒B具有不同的抗性；

所述肿瘤为非小细胞肺癌。

2.一种用于治疗非小细胞肺癌的组合物，其特征在于：其含有权利要求1中所述的复制型人腺病毒。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中包括：a)免疫调控剂；b)免疫调控细胞；c)放射性治疗物；d)光疗法化合物；或e)化学治疗化合物中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还含有药学上可接受的佐剂、稀释剂或赋形剂。

5.组合物在制备治疗肿瘤制剂中的应用，其特征在于：所述组合物如权利要求2～4任一项所述；所述肿瘤为非小细胞肺癌。