CN111089977A - 一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，该方法包括：a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12‑96h，得到第一培养物，检测第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；b、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12‑96h，得到第二培养物，检测第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；c、将溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2‑8h，得到第三培养物，检测第三培养物中的细胞因子水平并计算溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，细胞因子包括白细胞介素‑2和/或γ‑干扰素；如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示待测溶瘤病毒的有效性高于参比溶瘤病毒。本公开的检测方法能较真实地检测溶瘤病毒的有效性。
Description
技术领域
本公开涉及生物医药技术领域，具体涉及一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法。
背景技术
溶瘤病毒是通过对天然存在的致病力较弱的病毒进行基因改造而形成的特殊病毒。溶瘤病毒能利用肿瘤细胞中畸变的信号通路(如抑癌基因的失活或缺陷)而选择性地感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内大量繁殖从而摧毁肿瘤细胞，但是其无法感染正常细胞。同时，溶瘤病毒还能激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死残余的肿瘤细胞。溶瘤病毒作为肿瘤治疗的生物药，需要筛选其对肿瘤患者治疗的有效性和安全性。
相关技术中，利用肿瘤细胞进行2D培养得到的单层细胞系或者PDX模型进行溶瘤病毒有效性的检测。
然而，利用上述检测方法检测得到的溶瘤病毒有效性数据与临床研究阶段得到的溶瘤病毒有效性数据存在较大差异。作为生物药的溶瘤病毒，其药物有效性和安全性与肿瘤微环境及患者自身免疫系统对药物的反应关系密切，因此急需更能真实模拟患者体内肿瘤的模型和检测方法，对溶瘤病毒的有效性进行评判，从而筛选出具有更大临床转化价值的溶瘤病毒药物。
发明内容
本公开提供了一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，该方法中使用的类器官能够更真实模拟患者体内肿瘤异质性及药物反应情况，本检测方法建立了一种快速从溶瘤病毒复制能力、溶瘤能力及诱导宿主抗肿瘤免疫作用等三个方面评价溶瘤病毒对不同患者肿瘤溶瘤有效性的方法，可用于临床前期药物有效性测试及临床入组病人的筛选。
为了实现上述目的，本公开提供一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，该方法包括：
a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第一培养物，检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；
b、将所述溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第二培养物，检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；
c、将所述溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2-8h，得到第三培养物，检测所述第三培养物中的细胞因子水平并计算所述溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，所述细胞因子包括白细胞介素-2和/或γ-干扰素；
如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示所述待测溶瘤病毒的有效性高于所述参比溶瘤病毒。
可选地，步骤a中还包括将肿瘤类器官进行第一预培养的步骤，然后再将第一预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第一预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于5000-10000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为500-1000μL，肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；
步骤b中还包括将肿瘤类器官进行第二预培养的步骤，然后再将第二预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第二预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于300-1000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为30-80μL，肿瘤类器官培养液的用量为100-150μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；
步骤c中，所述将溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养，包括：c1、将含有免疫细胞和肿瘤类器官的细胞悬液接种在培养皿中，加入肿瘤类器官培养液培养2-8h，得到混合培养液，其中所述细胞悬液中免疫细胞和肿瘤细胞的浓度为0.1-1×107个/mL，免疫细胞：肿瘤类器官细胞＝(2-8)：1，相对于0.5-2mL所述细胞悬液，所述肿瘤类器官培养液的用量为2-3mL；c2、将所述混合培养液与溶瘤病毒混合培养3-5h，所述溶瘤病毒的用量为1-100MOI。
可选地，步骤a中，所述检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平，包括：
a1、获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒；
a2、将所述待测病毒与所述溶瘤病毒的宿主细胞混合培养12-96h，然后检测所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度；其中，所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度越高，所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平越高。
可选地，步骤a1中，所述获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒，包括：
将所述第一培养物进行冻融处理2-8次，然后进行离心并收集上清液，得到待测病毒液，所述待测病毒液中含有所述待测病毒。
可选地，步骤b中，利用CCK8试剂盒检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；
步骤c中，利用ELISA试剂盒检测所述第三培养物中的细胞因子水平。
可选地，步骤c中所述免疫细胞从患者外周血中分离得到。
可选地，步骤a、步骤b和步骤c中所述的混合培养在肿瘤类器官培养液中进行，所述肿瘤类器官培养液包括DMEM/F12培养基和生长因子；所述生长因子包括Glutamax、HEPES、Gastrin、nicotinamide、A83-01、Noggin、n-Acetylcysteine、青链霉素、EGF和BSA中的至少一种。
可选地，所述生长因子中，所述Glutamax的浓度为0.5-2％、所述HEPES的浓度为5-15mM、所述Gastrin的浓度为5-15nM、所述nicotinamide的浓度为5-15mM、所述A83-01的浓度为250-600ng/mL、所述Noggin的浓度为50-150ng/mL、所述n-Acetylcysteine的浓度为0.5-2mM、所述青链霉素的浓度为50-150μg/mL、所述EGF的浓度为50-150ng/mL、所述BSA的浓度为0.001-0.005mg/mL。
可选地，所述肿瘤类器官的制备方法包括：
将肿瘤细胞、温敏性水凝胶和肿瘤类器官培养液混合并进行培养，每隔2-4天更换一次培养基，直至显微镜下观察到直径不小于0.5mm的肿瘤类器官。
可选地，相对于20000个所述肿瘤细胞，所述温敏性水凝胶的用量为1500-2000μL，所述肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL。
通过上述技术方案，本公开的方法采用肿瘤类器官作为溶瘤病毒有效性检测的肿瘤细胞模型，由于肿瘤类器官能够较好地反映患者体内肿瘤组织的生物学特性，因此，本公开方法的检测结果能较真实地反映溶瘤病毒在患者体内对肿瘤组织溶瘤作用的有效性。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开提供一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，该方法包括：a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第一培养物，检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；b、将所述溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第二培养物，检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；c、将所述溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2-8h，得到第三培养物，检测所述第三培养物中的细胞因子水平并计算所述溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，所述细胞因子包括白细胞介素-2和/或γ-干扰素；如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示所述待测溶瘤病毒的有效性高于所述参比溶瘤病毒。
本公开的发明人发现，现有的溶瘤病毒有效性检测方法检测得到的溶瘤病毒有效性数据与临床研究阶段得到的溶瘤病毒有效性数据存在较大差异的可能原因在于：现有的溶瘤病毒有效性检测方法中采用的肿瘤细胞模型无法真实模拟患者体内的肿瘤组织的生物学特性，导致现有的溶瘤病毒有效性检测过程无法真实模拟溶瘤病毒在患者体内的作用过程，例如，现有溶瘤病毒有效性检测方法中采用的由肿瘤细胞经2D培养得到的单层细胞系，其无法体现肿瘤异质性，也无法模拟患者体内的微环境，而且随着常规肿瘤细胞系传代代次的增加，肿瘤细胞通常会表现出与原代肿瘤细胞不同的生物学特性，比如在基因型上产生突变、表型上生长更快或者对特定药物敏感性增加等，因此，常规肿瘤细胞系无法真实模拟患者体内的肿瘤组织的生物学特性。本公开的发明人尝试利用肿瘤类器官作为溶瘤病毒有效性检测的肿瘤细胞模型，出乎意料地发现其检测结果能较真实地检测溶瘤病毒在患者体内对肿瘤组织溶瘤作用的有效性。
在上述技术方案中，第一培养物中溶瘤病毒的复制水平反映的是溶瘤病毒感染肿瘤细胞后继续复制增殖的能力，第一培养物中溶瘤病毒的复制水平越高，表明溶瘤病毒感染肿瘤细胞后继续复制增殖的能力越强，感染肿瘤细胞后继续复制增殖能力强的溶瘤病毒能在肿瘤细胞内继续复制产生更多的溶瘤细胞，从而进一步提高溶瘤细胞杀伤肿瘤组织的效果；第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率反映的是溶瘤病毒感染肿瘤细胞后杀伤肿瘤细胞的能力，第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率越高，表明溶瘤病毒感染肿瘤细胞后杀伤肿瘤细胞的能力越强；第三培养物中溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，反映的是溶瘤病毒感染肿瘤细胞后诱导宿主免疫系统产生抗肿瘤免疫作用的能力，第三培养物中的白细胞介素-2和/或γ-干扰素的水平越高，溶瘤病毒的细胞因子促表达能力越强，溶瘤病毒感染肿瘤细胞后诱导宿主免疫系统产生抗肿瘤免疫作用的能力也越强。本公开的方法通过上述三方面检测，能够全面表征溶瘤病毒杀伤肿瘤细胞的有效性。
本公开的上述方法采用肿瘤类器官作为溶瘤病毒有效性检测的肿瘤细胞模型，由于肿瘤类器官能够较好地反映患者体内肿瘤组织的生物学特性，因此，本公开方法的检测结果能较真实地反映溶瘤病毒在患者体内对肿瘤组织溶瘤作用的有效性。
根据本公开，优选地，步骤a中还包括将肿瘤类器官进行第一预培养的步骤，然后再将第一预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第一预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于5000-10000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为500-1000μL，肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；步骤b中还包括将肿瘤类器官进行第二预培养的步骤，然后再将第二预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第二预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于300-1000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为30-80μL，肿瘤类器官培养液的用量为100-150μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；步骤c中，所述将溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养，包括：c1、将含有免疫细胞和肿瘤类器官的细胞悬液接种在培养皿中，加入肿瘤类器官培养液培养2-8h，得到混合培养液，其中所述细胞悬液中免疫细胞和肿瘤细胞的浓度为0.1-1×107个/mL，免疫细胞：肿瘤类器官细胞＝(2-8)：1，相对于0.5-2mL所述细胞悬液，所述肿瘤类器官培养液的用量为2-3mL；c2、将所述混合培养液与溶瘤病毒混合培养3-5h，所述溶瘤病毒的用量为1-100MOI。
根据本公开，步骤a中所述检测第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平的方法可以是领域内常规的，能检测溶瘤病毒复制水平的方法均可用于本公开。优选地，步骤a中，所述检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平，包括：a1、获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒；a2、将所述待测病毒与所述溶瘤病毒的宿主细胞混合培养12-96h，然后检测所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度；其中，所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度越高，所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平越高。
优选地，步骤a1中，所述获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒，包括：将所述第一培养物进行冻融处理2-8次，然后进行离心并收集上清液，得到待测病毒液，所述待测病毒液中含有所述待测病毒。其中，所述冻融处理的最低温度为-20--80℃，最高温度为10-25℃；所述离心的条件包括：离心转速为5000-10000rpm/min，离心时间为30-60min。
优选地，步骤b中，可以利用CCK8试剂盒检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；步骤c中，可以利用ELISA试剂盒检测所述第三培养物中的细胞因子水平。
优选地，步骤c中所述免疫细胞可以从患者外周血中分离得到。其中，从患者外周血中分离所述免疫细胞的方法可以是领域内的常规方法，在此不再赘述。
根据本公开，步骤a、步骤b和步骤c中所述的混合培养在肿瘤类器官培养液中进行，所述肿瘤类器官培养液的组成可以在较宽的范围内选择，例如，本公开所述肿瘤类器官培养液可以包括DMEM/F12培养基和生长因子；所述生长因子可以包括Glutamax、HEPES、Gastrin、nicotinamide、A83-01、Noggin、n-Acetylcysteine、青链霉素、EGF和BSA中的至少一种。
根据本公开，所述生长因子中各类生长因子的浓度可以在较大的范围内变化，例如，所述生长因子中，所述Glutamax的浓度为0.5-2％、所述HEPES的浓度为5-15mM、所述Gastrin的浓度为5-15nM、所述nicotinamide的浓度为5-15mM、所述A83-01的浓度为250-600ng/mL、所述Noggin的浓度为50-150ng/mL、所述n-Acetylcysteine的浓度为0.5-2mM、所述青链霉素的浓度为50-150μg/mL、所述EGF的浓度为50-150ng/mL、所述BSA的浓度为0.001-0.005mg/mL。
根据本公开，本公开涉及的肿瘤类器官的制备方法可以是本领域常规的，例如，本公开所述肿瘤类器官的制备方法包括：将肿瘤细胞、温敏性水凝胶和肿瘤类器官培养液混合并进行培养，每隔2-4天更换一次培养基，直至显微镜下观察到直径不小于0.5mm的肿瘤类器官。
优选地，在上述肿瘤类器官的制备方法中，相对于20000个所述肿瘤细胞，所述温敏性水凝胶的用量可以为1500-2000μL，所述肿瘤类器官培养液的用量可以为2000-3000μL。
下面通过实施例来进一步说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。
本公开实施例所涉及的原料、试剂、仪器和设备，如无特殊说明，均可通过购买获得。
在本公开实施例中未注明具体实验温度时，实验温度均为室温(20-25℃)。本公开实施例中使用的试剂来源如下：
DMEM/F12培养基购于美国HyClone公司；Cosmo温敏性水凝胶购于日本Cosmo Bio公司；胎牛血清蛋白(fetal bovine serum FBS)购于内蒙古金源康生物工程有限公司；青霉素、链霉素购于上海生工生物工程股份有限公司；胶原蛋白水解酶(Collagenase)购于美国Sigma--Aldrich。
本公开实施例中使用的肿瘤类细胞培养液为自主配置，包括：DMEM/F12培养基和1％的Glutamax(Gibco，35050061)、10mM的HEPES(Gibco，15630080)、10nM的Gastrin(Sigma，G9145)、10mM的nicotinamide(Sigma，N06365)、500ng/mL的A83-01(Tocris，2939)、100ng/mL的Noggin(Peprotech，120-10C)、1mM的n-Acetylcysteine(Sigma，A9165)，100μg/ml的青链霉素、50ng/mL的EGF(Peprotech，AF-100-15)和0.4g/100mL的BSA(Sigma，9048-46-8)等生长因子。
实施例
1、培养肿瘤类器官
将新取出的肺癌肿瘤穿刺组织或手术组织样本保存于肿瘤类器官培养液中，并于48小时内4度冷链运输至实验室。
除去肿瘤类器官培养液，将样本置于6cm培养皿中；配置含有2％FBS、2mg/ml胶原蛋白水解酶的DMEM/F12培养基作为酶解液，酶解液经过滤除菌且37℃温浴后，加入放置有样本的培养皿中，其中，1g样本对应加入8ml酶解液；用消毒灭菌后的剪刀将样本组织块剪碎至肉糜状，并用10ml移液管将剪碎的组织块转移至24孔板中，放入37℃恒温培养箱酶解2h，酶解过程中每隔30分钟使用移液器吹打酶解组织，促进酶解效果；之后，将酶解后的混合液放入细胞研磨筛中，加入酶解液进行二次研磨酶解，充分研磨后收集滤液，并将酶解液于300g的离心条件下离心3min，弃上清，沉淀加入10ml肿瘤类器官培养液重悬，得到肿瘤细胞。
将细胞数量为20000的肿瘤细胞种植到每孔含有40μl Cosmo温敏性水凝胶的96孔板中，每孔加入150μl肿瘤类器官培养液，放置于37℃恒温培养箱培养，培养过程中每3天更换培养基，直至显微镜下观察到直径大于0.5mm的肺癌肿瘤类器官。
2、检测感染肿瘤类器官中肿瘤细胞后的溶瘤病毒的复制水平
在6孔板中接种肿瘤类器官细胞悬液，以使肿瘤细胞的数量为6000个/孔，其中，每孔含500μl Cosmo温敏性水凝胶及1.5mL肿瘤类器官培养液；将接种后的6孔板放入37℃的恒温培养箱中预培养96小时后取出，使用0.01-1MOI溶瘤病毒(将新城疫病毒NDV溶瘤病毒作为待测溶瘤病毒，将腺病毒ProstAtak溶瘤病毒作为参比溶瘤病毒)分别感染肿瘤类器官24，48和72小时；收集类器官细胞和培养产生的细胞上清，冻融3次，离心收集上清，得到待测病毒液；在96孔板中接种溶瘤病毒的宿主细胞(如新城疫病毒NDV的宿主细胞为DF1细胞)悬液(100μL/孔)，放入培养箱预培养24小时；将待测病毒液10倍比稀释(10-1-10-11)，并分别加入96孔板的每列，每个稀释梯度的病毒8个复孔，继续37℃培养5～7天后观察病变，计算病毒滴度，滴度用Reed-Muench两氏法精确算出。测试结果如表1。
3、检测溶瘤病毒对肿瘤类器官中肿瘤细胞的杀伤率
在96孔板中接种肿瘤类器官细胞悬液，以使每孔中含有400-700个肿瘤细胞，其中，每孔含40μl Cosmo温敏性水凝胶及150μl类器官培养液；将接种后的96孔板放入培养箱预培养96小时后取出，使用0.01-1MOI溶瘤病毒(将新城疫病毒NDV溶瘤病毒作为待测溶瘤病毒，将腺病毒ProstAtak溶瘤病毒作为参比溶瘤病毒)分别感染肿瘤类器官24，48和72小时；用CCK8试剂盒(Cell Counting Kit 8)检测细胞活力，分别在培养的第23、47和71小时，向每孔加入10μL的CCK8溶液，继续培养1小时，用酶标仪测定450nM处吸光度，计算溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率(％)。测试结果如表2。
4、检测溶瘤病毒诱导宿主免疫系统产生抗肿瘤免疫作用的能力
取新抽取的患者外周血，于800×g/min的离心条件下离心10min，取上层血浆灭活后离心并吸取上清，转移至离心管中备用；向血液下层沉淀中加入生理盐水，形成生理盐水血样混合液；取等体积的淋巴细胞分离液于新的离心管中，将上述生理盐水血样混合液缓慢加入至淋巴分离液上层，于18-20℃、800×g/min的条件下离心20min，取中间的白膜层置新的离心管中，随即加入三倍体积的PBS清洗两遍后，获得PBMCs；将PBMCs置于含有100ng/mL CD3、1000IU/mL IL-2、1ng/mL IL-1α的1640培养基中，扩增至细胞数量0.1-1×107个/mL，获得足够数量的免疫细胞。
在6cm平皿中接种0.1-1×107个/mL的免疫细胞和肿瘤类器官细胞，其中，免疫细胞：肿瘤类器官细胞＝3：1，加入肿瘤类器官培养液4ml，放入培养箱预培养24小时；使用10MOI溶瘤病毒(将新城疫病毒NDV溶瘤病毒作为待测溶瘤病毒，将腺病毒ProstAtak溶瘤病毒作为参比溶瘤病毒)在37℃下感染上述培养后的混合细胞4小时；吸取上清液，按ELISA试剂盒说明检测细胞上清液中的细胞因子白细胞介素-2和γ-干扰素的浓度，并计算溶瘤病毒的细胞因子促表达能力。测试结果如表3。
对比例1
按照实施例中步骤2的方法进行操作，不同的是，使用肺癌经2D培养的A549细胞系替换步骤2中的肺癌肿瘤类器官，并以正常胚肺成纤维细胞系MRC-5作为阴性对照，放入培养箱中与培养24小时后，使用0.01-1MOI溶瘤病毒(将新城疫病毒NDV溶瘤病毒作为待测溶瘤病毒，将腺病毒ProstAtak溶瘤病毒作为参比溶瘤病毒)感染，检测溶瘤病毒的复制水平。检测结果见表1。
对比例2
按照实施例中步骤3的方法进行培养，不同的是，使用肺癌经2D培养的A549细胞系替换步骤2中的肺癌肿瘤类器官，并以正常胚肺成纤维细胞系MRC-5作为阴性对照，放入培养箱中与培养24小时后，使用0.01-1MOI溶瘤病毒(将新城疫病毒NDV溶瘤病毒作为待测溶瘤病毒，将腺病毒ProstAtak溶瘤病毒作为参比溶瘤病毒)感染，检测溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率。检测结果见表2。
对比例3
按照实施例中步骤3的方法进行培养，不同的是，使用肺癌经2D培养的A549细胞系替换步骤2中的肺癌肿瘤类器官，并以正常胚肺成纤维细胞系MRC-5作为阴性对照，放入培养箱中与培养24小时后，使用0.01-1MOI溶瘤病毒(将新城疫病毒NDV溶瘤病毒作为待测溶瘤病毒，将腺病毒ProstAtak溶瘤病毒作为参比溶瘤病毒)感染，检测上清液中细胞因子白细胞介素-2和γ-干扰素的浓度，并计算溶瘤病毒的细胞因子促表达能力。检测结果见表3。
表1
由表1可以看出，NDV溶瘤病毒及ProstAtak溶瘤病毒在A549细胞系和肺癌类器官中均可以复制扩增，但是NDV溶瘤病毒及ProstAtak溶瘤病毒在肺癌类器官中的复制水平均弱于其在A549细胞系中的复制水平，说明肺癌类器官具有的肿瘤微环境能够影响溶瘤病毒在肿瘤细胞中的复制。肺癌类器官中，NDV溶瘤病毒复制能力弱于ProstAtak溶瘤病毒；A549细胞系中，NDV溶瘤病毒复制能力优于ProstAtak溶瘤病毒。
表2
由表2可以看出，NDV溶瘤病毒及ProstAtak溶瘤病毒对A549细胞系和肺癌类器官中的肿瘤细胞均有杀伤作用，但是NDV溶瘤病毒及ProstAtak溶瘤病毒对肺癌类器官中的肿瘤细胞的杀伤能力均弱于其对A549细胞系中的肿瘤细胞的杀伤能力，说明肺癌类器官具有的肿瘤微环境能够影响溶瘤病毒对肺癌细胞的杀伤能力。肺癌类器官中，NDV溶瘤病毒的溶瘤能力弱于ProstAtak溶瘤病毒；在A549细胞系中，NDV溶瘤病毒的溶瘤能力明显优于ProstAtak溶瘤病毒。
表3
由表3可以看出，NDV溶瘤病毒及ProstAtak溶瘤病毒在A549细胞系和肺癌类器官中均能诱导免疫细胞产生细胞因子，但是NDV溶瘤病毒及ProstAtak溶瘤病毒在肺癌类器官中的诱导免疫细胞产生细胞因子的能力均弱于其在A549细胞系中诱导免疫细胞产生细胞因子的能力，说明肺癌类器官具有的肿瘤微环境能够影响溶瘤病毒诱导免疫细胞产生细胞因子，因此，利用肿瘤类器官检测溶瘤细胞诱导免疫细胞产生细胞因子的能力的检测结果，能更加真实地反映溶瘤病毒在不同患者体内肿瘤组织中诱导免疫细胞产生细胞因子的能力。肺癌类器官中，NDV溶瘤病毒诱导免疫细胞产生细胞因子的能力弱于ProstAtak溶瘤病毒；在A549细胞系中，NDV溶瘤病毒诱导免疫细胞产生细胞因子的能力明显优于ProstAtak溶瘤病毒。
测试实施例1
将新城疫病毒NDV溶瘤病毒作为待测溶瘤病毒，将腺病毒ProstAtak溶瘤病毒作为参比溶瘤病毒，在PDX小鼠中分别注射10000pfu的NDV溶瘤病毒与ProstAtak溶瘤病毒，30天后观察PDX小鼠肿瘤体积缩小比率，6个月后计算PDX小鼠的平均生存期，结果见表4。
PDX小鼠模型的建立方法包括：将肿瘤患者的肿瘤组织通过皮下移植方法移植至重症免疫缺陷型小鼠(NSG)体内，并使肿瘤组织在小鼠体内生长，得到PDX小鼠模型。
表4
| 溶瘤病毒 | 瘤体缩小比率，％ | 小鼠平均生存期，天 |
| NDV溶瘤病毒 | 7.36 | 93±2 |
| ProstAtak溶瘤病毒 | 15.82 | 122±3 |
在肺癌类器官中，NDV溶瘤病毒的病毒复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均弱于ProstAtak溶瘤病毒，并且得到了PDX小鼠动物模型的验证；
在A549细胞系中，NDV溶瘤病毒的病毒复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均优于ProstAtak溶瘤病毒，与PDX小鼠动物模型的体内验证结果相差较大。
上述实验说明：使用类器官作为溶瘤病毒有效性检测的体外细胞模型，检测结果能较真实地反映溶瘤病毒在患者体内对肿瘤组织溶瘤作用的有效性。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
Claims (10)
1.一种利用类器官检测溶瘤病毒有效性的方法，其特征在于，该方法包括：
a、将溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第一培养物，检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平；
b、将所述溶瘤病毒与肿瘤类器官混合培养12-96h，得到第二培养物，检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；
c、将所述溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养2-8h，得到第三培养物，检测所述第三培养物中的细胞因子水平并计算所述溶瘤病毒的细胞因子促表达能力，所述细胞因子包括白细胞介素-2和/或γ-干扰素；
如果待测溶瘤病毒的复制水平、对肿瘤细胞的杀伤率和细胞因子促表达能力均高于参比溶瘤病毒，则指示所述待测溶瘤病毒的有效性高于所述参比溶瘤病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中还包括将肿瘤类器官进行第一预培养的步骤，然后再将第一预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第一预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于5000-10000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为500-1000μL，肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；
步骤b中还包括将肿瘤类器官进行第二预培养的步骤，然后再将第二预培养后的肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养；所述第二预培养包括：将肿瘤类器官与温敏性水凝胶、肿瘤类器官培养液混合，培养12-96h，其中，相对于300-1000个肿瘤类器官中的肿瘤细胞，温敏性水凝胶的用量为30-80μL，肿瘤类器官培养液的用量为100-150μL；将肿瘤类器官与溶瘤病毒进行混合培养时，溶瘤病毒的用量为0.01-1MOI；
步骤c中，所述将溶瘤病毒、免疫细胞和肿瘤类器官混合培养，包括：c1、将含有免疫细胞和肿瘤类器官的细胞悬液接种在培养皿中，加入肿瘤类器官培养液培养2-8h，得到混合培养液，其中所述细胞悬液中免疫细胞和肿瘤细胞的浓度为0.1-1×107个/mL，免疫细胞：肿瘤类器官细胞＝(2-8)：1，相对于0.5-2mL所述细胞悬液，所述肿瘤类器官培养液的用量为2-3mL；c2、将所述混合培养液与溶瘤病毒混合培养3-5h，所述溶瘤病毒的用量为1-100MOI。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，所述检测所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平，包括：
a1、获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒；
a2、将所述待测病毒与所述溶瘤病毒的宿主细胞混合培养12-96h，然后检测所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度；其中，所述待测病毒在所述宿主细胞中的病毒滴度越高，所述第一培养物中的溶瘤病毒的复制水平越高。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤a1中，所述获取所述第一培养物中的溶瘤病毒，得到待测病毒，包括：
将所述第一培养物进行冻融处理2-8次，然后进行离心并收集上清液，得到待测病毒液，所述待测病毒液中含有所述待测病毒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b中，利用CCK8试剂盒检测所述第二培养物中溶瘤病毒对肿瘤细胞的杀伤率；
步骤c中，利用ELISA试剂盒检测所述第三培养物中的细胞因子水平。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c中所述免疫细胞从患者外周血中分离得到。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤a、步骤b和步骤c中所述的混合培养在肿瘤类器官培养液中进行，所述肿瘤类器官培养液包括DMEM/F12培养基和生长因子；所述生长因子包括Glutamax、HEPES、Gastrin、nicotinamide、A83-01、Noggin、n-Acetylcysteine、青链霉素、EGF和BSA中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生长因子中，所述Glutamax的浓度为0.5-2％、所述HEPES的浓度为5-15mM、所述Gastrin的浓度为5-15nM、所述nicotinamide的浓度为5-15mM、所述A83-01的浓度为250-600ng/mL、所述Noggin的浓度为50-150ng/mL、所述n-Acetylcysteine的浓度为0.5-2mM、所述青链霉素的浓度为50-150μg/mL、所述EGF的浓度为50-150ng/mL、所述BSA的浓度为1-5mg/mL。
9.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述肿瘤类器官的制备方法包括：
将肿瘤细胞、温敏性水凝胶和肿瘤类器官培养液混合并进行培养，每隔2-4天更换一次培养基，直至显微镜下观察到直径不小于0.5mm的肿瘤类器官。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，相对于20000个所述肿瘤细胞，所述温敏性水凝胶的用量为1500-2000μL，所述肿瘤类器官培养液的用量为2000-3000μL。
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