JP7153726B2 - Ｈｍ－３融合タンパク質及びその適用 - Google Patents

Description

本発明は、バイオ製薬の技術分野に属し、より具体的には、遅効型ＨＭ－３融合タンパク質分子及びその適用に関する。

自己免疫疾患とは、生体が自己抗原に対して免疫反応を起こすことで、自らの組織を損傷してしまうことによって発生する疾患であり、適時に効果的に制御しなければ、自己免疫疾患は非常に深刻な結果をもたらし、最後的に生命さえも脅かすことになる。一般的な自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、強皮症、甲状腺機能亢進症、若年性糖尿病、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、潰瘍性大腸炎及び各種の皮膚病、自己免疫性肝炎等がある。

関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＲＡ）は、関節滑膜炎を特徴とする慢性全身性自己免疫疾患である。滑膜炎は、持続的に発作を繰り返し起こして、関節軟骨と骨の破壊、関節の機能障害、ひいては身体障害をもたらし得る。血管炎疾患は、全身の各臓器に影響を及ぼすので、この疾患をリウマチ性疾患とも称する。

関節リウマチに代表される炎症性自己免疫疾患は、発症率と障害率が高く、中国には１０００万人以上の患者があり、人類の健康と生活の質とに影響を与える重大な疾患である。ＴＮＦα阻害剤は、現在関節リウマチの治療に用いられる主要なバイオ医薬品であり、２０１３年、ヒュミラ（ｈｕｍｉｒａ）、エンブレル（ｅｎｂｒｅｌ）、レミケード（ｒｅｍｉｃａｄｅ）等の３つのＴＮＦα阻害剤の売上総額は２８１．０８億ドルであり、世界のリウマチ関連市場における売上総額の８４．５８％を占める。しかしながら、ＴＮＦ阻害剤は必ずメトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）と併用することでしか、より治療効果を発揮することができないが、一部の関節リウマチ患者はメトトレキサートに対して不耐容であるため、このような患者に対しては併用型治療レジメンを使用できない。なお、臨床統計では、ＴＮＦα阻害剤を併用する治療レジメンを採用した後でも、約３０％～４０％の患者は依然として該治療レジメンに反応せず、主要治療指標（症状を２０％緩和する）に達することができないことを示している。したがって、現在主要な製薬会社はそれぞれ関節リウマチの治療のためのバイオ医薬品の注目すべき標的として、ＴＮＦα阻害剤の研究に加えて、ＪＡＫ阻害剤、インターロイキン阻害剤、炎症性細胞浸潤阻害剤、シクロフィリン及びインテグリン阻害剤に関しても積極的に研究しており、これらの薬物はＴＮＦα阻害剤と互いに補完して、異なる種類の関節リウマチ患者に複数の種類の薬物オプションを提供することができる。

いわゆる新生血管（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、既存の血管から新しく分岐した螺旋状の毛細血管である。妊娠等の一定条件で、人体には新しい血管が形成され得るが、これ以外で新生血管が形成されると、特定の疾患を引き起こすことになり、これらの疾患をまとめて「新生血管疾患」といい、例えば、癌、滲出型黄斑変性等である。滲出型黄斑変性は、血管新生型黄斑変性ともいい、脈絡膜新生血管が形成されたことが主な臨床の特徴である。

骨関節炎は変形性疾患であり、加齢、肥満、緊張（ｓｔｒａｉｎ）、トラウマ、関節の先天異常、関節の奇形等の多くの要因による関節軟骨の変形性損傷、関節辺縁と軟骨下骨の反応性増殖であり、骨関節病、変形性関節炎、加齢関節炎、肥大性関節炎等ともいわれる。臨床症状は、緩やかに進行する関節痛、圧痛、こわばり、関節の腫れ、可動域制限及び関節奇形等である。

ＨＭ－３は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸配列（ＲＧＤ配列）を含有する１８アミノ酸残基のポリペプチドであり、そのアミノ酸配列は以下の通りである。

Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ。

ＨＭ－３は、ＣＮ１３１４７０５Ｃに開示されている既知の構造であり、インテグリンαｖβ３に対して高い親和性を有し、インテグリンαｖβ３のシグナル伝達経路を遮断することで、ＶＥＧＦとＴＮＦαとの発現が抑止されて、内皮細胞の遊走及び新生血管の生成が阻害され、更にＲＡ滑膜増殖が阻害される。マウスの急性、亜急性、慢性炎症のｉｎ ｖｉｖｏ試験では、ＨＭ－３は血管新生と炎症反応とを同時に阻害することができ、コラーゲン関節炎ＤＢＡ／１マウスの滑膜組織のＶＥＧＦとＴＮＦαとの含有量を調節し、ＲＡ症状を効果的に緩和し、その治療効果はメトトレキサートより優れていることを示している。

ＨＭ－３分子は、薬効が明確で、安全性が優れている利点を有しているが、該小ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期は２７．６６±７．３７分だけであり、該製品を臨床に適用すると、毎日１回～２回の投与を必要とし、臨床適用が大きく制限されている。当該分野において、分子構造に修飾又は修正を行うことは、半減期が短く、連続投与を必要とする問題の解決のために通常用いられる方法であり、そのうち、化学修飾が最も幅広く適用されている。

中国特許出願ＣＮ１０２４１７５４０Ａには、半減期がＨＭ－３よりはるかに長いポリエチレングリコール修飾のＨＭ－３：ｍＰＥＧ－ＳＣ－ＨＭ－３が開示されている。

しかしながら、ＰＥＧ修飾技術自体には、各種の問題が存在する。ＰＥＧ修飾は、タンパク質を覆うことで免疫原性を低下させ、半減期を延長させるものであり、これによりＰＥＧ修飾が全てのタンパクに適合することはできなくなる。即ち、一部のタンパク質は修飾部位が露出していないので正常な修飾が不可能になり、一部のタンパク質は活性部位が覆われて活性が低下し、一部のタンパク質は修飾後に発生した立体配座変化により活性低下又は凝集しやすくなってしまう。ＰＥＧ修飾の生成物は、ＰＥＧ分子の分解により薬物のタンパク質を徐々に露出することを必要とするが、低分子量のＰＥＧは腎毒性があり、高分子量のＰＥＧはｉｎ ｖｉｖｏ分解機序が不明であり、これはＰＥＧ修飾の薬物に明らかな投与リスクをもたらしている。なお、ＰＥＧ修飾は複雑なタンパク質処理過程に関連し、且つＰＥＧ分子の長さが異なるため、ＰＥＧ修飾の生成物の分子量が不均一になってしまい、生産コストが増加すると同時に、完成品の均一性が低下して、工業化が難しくなる。

本発明は、ＨＭ－３タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が短く、ポリペプチドの合成コストが高く、工業生産に不適である等の問題を克服するために、ＨＭ－３－Ｆｃ融合タンパク質及びその適用を提供する。

本発明は、ＨＭ－３及びＦｃを融合タンパク質に調製すると、ＨＭ－３の半減期を延長でき、それと同時に薬物の活性が向上することを見出した。本発明において、該融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏとのいずれにおいてもより高い生物活性及び安定性を発現し、炎症反応を顕著に阻害でき、自己免疫疾患、新生血管疾患、骨関節炎の症状を緩和すると同時に遅効型血漿半減期を有することを見出した。

このために、本発明は、活性ポリペプチドＨＭ－３とヒト由来のＩｇＧ－Ｆｃフラグメント又はＩｇＧ－Ｆｃ突然変異体フラグメントとが結合して形成されるＨＭ－３－Ｆｃ融合タンパク質を開示する。

本発明の融合タンパク質は、ＨＭ－３とヒト由来のＩｇＧ－Ｆｃフラグメント又はＩｇＧ－Ｆｃフラグメントの突然変異体とがＣ末端又はＮ末端、或いはＣ末端及びＮ末端により同時に結合されることによって調製され、その結合はリンカーペプチドにより結合することができる。

本発明の融合タンパク質は、以下の構造により説明できる。

（ＨＭ－３）_ｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＩｇＧ－Ｆｃ、
ＩｇＧ－Ｆｃ－Ｌｉｎｋｅｒ－（ＨＭ－３）_ｎ、又は
（ＨＭ－３）_ｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＩｇＧ－Ｆｃ－Ｌｉｎｋｅｒ－（ＨＭ－３）_ｎ；

ここで、ｎは１、２、３、４又は５から選択される。

ここで、リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）はリンカーペプチドを表し、前記リンカーペプチドは、以下のものから選択される。

（１）（ＧＧＧＧＳ）_ａ、ここで、ａは１、２、３、４、５又は６である。
（２）Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｂＡ、ここで、ｂは１、２、３、４、５又は６である。
（３）（ＡＰ）_ｃ、ここで、ｃは１～１８である。
（４）Ｇ_ｄ、ここで、ｄは１～１５である。

好ましいリンカーペプチドは（ＧＧＧＧＳ）_ａ配列であり、繰り返し数ａは３、４又は５が好ましい。

ここで、前記ＩｇＧ－Ｆｃはヒト由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃフラグメント又はその突然変異体フラグメントであり、これらのうち、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４のＦｃ又はその突然変異体が好ましく、突然変異体ｍＩｇＧ４－Ｆｃが最も好ましい。

本発明の融合タンパク質は、以下の配列の融合タンパク質が好ましい。

ＴＳＬ－１融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＩｇＧ２－Ｆｃ；
ＴＳＬ－２融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ；
ＴＳＬ－３融合タンパク質：ＩｇＧ２－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３；
ＴＳＬ－４融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３；
ＴＳＬ－５融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＩｇＧ４－Ｆｃ
ＴＳＬ－６融合タンパク質：ＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１３融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１４融合タンパク質：ＨＭ－３－ＨｙＦｃ
ＴＳＬ－１５融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－Ｇ５－ＨＭ－３－Ｇ８－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１６融合タンパク質：ＨｙＦｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１７融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４Ａ－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１８融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＡＰ）_９－ＨＭ－３

本発明の融合タンパク質は、ＨＭ－３ポリペプチドとＬｉｎｋｅｒとが共有結合により結合されてから、再び合成方法によりＬｉｎｋｅｒの別の一端とＩｇＧ－Ｆｃが結合される合成方法により調製できる。

例えば、酵母、ＣＨＯ、ＳＰ２／０、ＢＨＫ及び／又はＨＥＫ２９３細胞を採用して発現（ｅｘｐｒｅｓｓ）する遺伝子組み換えの方法によっても得られるが、ＣＨＯ細胞及び／又はＨＥＫ２９３細胞を採用して発現することが好ましい。

本発明の融合タンパク質は、薬物のｉｎ ｖｉｖｏにおける作用時間を延長させ、半減期を延長し、患者のアドヒアランス（ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）及びコンプライアンス（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）を向上できる。

本発明は、医薬用途に適合する、注射剤、カプセル、錠剤、丸薬、点鼻スプレー又はエアゾールから選択される製剤の形で存在し、投与形態は経口、静脈注射、静脈点滴、皮下又は筋肉注射からなる、本発明の融合タンパク質を含有する薬物組成物を更に提供する。

本発明は、本発明の融合タンパク質を使用して自己免疫疾患治療用の薬物を調製する際の適用を更に提供する。前記自己免疫疾患は関節リウマチであり、薬物動態学特性を有することが好ましい。

本発明は、本発明の融合タンパク質を使用して新生血管治療用の薬物を調製する際の適用を更に提供する。前記新生血管疾患は滲出型加齢黄斑変性、腫瘍転移であることが好ましい。

本発明の融合タンパク質は、眼科薬として使用でき、眼部、特に房水及び硝子体において薬物動態学特性を有する。

本発明は、本発明の融合タンパク質を使用して骨関節炎治療用の薬物を調製する際の適用を更に提供する。

本発明の融合タンパク質は、軟骨細胞に対して保護作用を果たすことができ、軟骨細胞病理学的変化により骨関節炎の予防及び治療作用を発揮し、それと同時に薬物動態学特性を有する。

本発明の融合タンパク質を、遺伝子組み換え方法を採用して調製する場合、まず本発明の融合タンパク質をコーディングするＤＮＡ分子を合成し、前記ＤＮＡのヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列は、配列表１の配列が好ましい。

本発明は、遺伝子組み換え方法を採用して調製する場合、合成したＤＮＡ分子をプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）により組み換え発現ベクターにするが、好ましくは哺乳動物細胞発現ベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に調製する。

本発明は、更に発現ベクターを宿主細胞、好ましくは哺乳動物発現細胞、より好ましくはＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞にトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）する。宿主細胞発現を培養し、細胞培養液から本発明の融合タンパク質を単離して、精製・単離すれば本発明の融合タンパク質が得られる。このため、本発明は、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー用カラムを好ましく使用して精製を行う、本発明の融合タンパク質の精製方法を更に提供する。

ＴＳＬ－４タンパク質のアフィニティーキャプチャー図である。 ＴＳＬ－４タンパク質の更なる単離精製図である。 ２０１６０３０８バッチの電気泳動図である。 ２０１６０３０８バッチのＨＰＬＣ－ＳＥＣ図である。 ＴＳＬ－５及びＴＳＬ－６の精製後の電気泳動図である。 ＴＳＬ－１～４融合タンパク質のマウス脾臓リンパ球増殖の阻害作用の比較図である。 ＴＳＬ－１３～１８融合タンパク質のマウス脾臓リンパ球増殖の阻害作用の比較図である。 ３種類のＦｃフラグメント、２種類の連結方向の融合タンパク質のマウス脾臓リンパ球増殖の阻害作用の比較図である。 ３種類のＬｉｎｋｅｒ融合タンパク質のマウス脾臓リンパ球増殖の阻害作用の比較図である。 異なる数のＨＭ－３を含有する融合タンパク質のマウス脾臓リンパ球増殖の阻害作用の比較図である。 ＴＳＬ－１～４融合タンパク質のヒトマクロファージＵ９３７の炎症性因子ＴＮＦ－αに対する阻害作用の比較図である。 ＴＳＬ－１～４融合タンパク質のゼブラフィッシュの血管形成に対する阻害率の比較図である。 ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの体重に対する影響を表す図である。 ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの足裏の厚さに対する影響を表す図である。 ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの足首の幅に対する影響を表す図である。 ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの足囲に対する影響を表す図である。 ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの関節炎スコアに対する影響を表す図である。 ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの脾臓及び胸腺の重量に対する影響を表す図である。 ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの足の重量に対する影響を表す図である。 １２．５ｍｇ／ｋｇのＴＳＬ－４の皮下注射１回後の血漿中濃度（ｐｌａｓｍａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の時間曲線のグラフである。 ３７．５ｍｇ／ｋｇのＴＳＬ－４の皮下注射１回後の血漿中濃度の時間曲線のグラフである。 ４．１７ｍｇ／ｋｇのＴＳＬ－４の皮下注射１回後の血漿中濃度の時間曲線のグラフである。 用量が異なるＴＳＬ－４の皮下注射１回後のラットの平均血漿中濃度の時間曲線のグラフである。 血漿中のＴＳＬ－４のピーク濃度（Ｃｍａｘ）と投与用量との関係図である。 薬物血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ：ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｃｕｒｖｅ）と投与用量との関係図である。 関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した後、６つの時点におけるＰＥＴ／ＣＴスキャンの放射線吸収のグラフである。 関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した後、それぞれ４８ｈ及び１２０ｈの時点におけるＰＥＴ／ＣＴスキャンの放射線吸収のグラフである。 関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を左足関節腔内注射した後の６つの時点における放射線吸収のグラフである。 関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した後、それぞれ４８ｈ、１２０ｈの時点で組織の放射線吸収を採集したグラフである。

以下、実施例により本発明を更に説明する。

実施例１：ＨＭ－３融合タンパク質の分子設計

ＨＭ－３－Ｆｃ融合タンパク質は、活性部分ＨＭ－３ポリペプチド、Ｌｉｎｋｅｒ、及びヒト由来ＩｇＧ－Ｆｃフラグメント又はＩｇＧ－Ｆｃ突然変異体フラグメントからなる３つの部分から構成され、その具体的な設計方法は以下の通りである。

１．Ｆｃフラグメントの選択

ヒトＩｇＧ型抗体には、重鎖の差異により、それぞれＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４という４種類の亜型がある。従来の研究成果では、４種類の亜型のいずれも血漿中半減期、細胞毒性等の特徴においてある程度差異が存在し（表１参照）、且つＦｃフラグメントと直接関連することを示している。ＩｇＧ３のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が最も短く、そのＦｃフラグメントはシャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）として目的タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長するには不適であり、試験によりまず排除された。Ｆｃフラグメントが補体、Ｆｃ受容体への親和力により抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ作用）及び補体依存性細胞障害能力（ＣＤＣ作用）の作用機能が確定され、ＩｇＧ１とＩｇＧ３は最強のＡＤＣＣ、ＣＤＣ作用を有し、試験により、健康な細胞を標的とする融合タンパク質を構築するには不適であると確定されたので、ＩｇＧ１とＩｇＧ３のＦｃフラグメントのいずれもスクリーニング後に排除された。

開発される適応症が自己免疫疾患であるため、標的は正常な体細胞であり、シグナル伝達経路のみを阻害することを必要とし、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期をできるだけ延長させるので、ＡＤＣＣ作用及びＣＤＣ作用が低いか、ないことを必要とする。これにより、ＨＭ－３融合タンパク質のＦＣ部分は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４のＦｃフラグメントを選択することがより好ましい。本発明は、天然Ｆｃフラグメントの特性を更に改良するために、範囲を拡大してＩｇＧ２とＩｇＧ４のＦｃフラグメント突然変異体もスクリーニング範囲内に取り入れた。

２．Ｌｉｎｋｅｒの選択

Ｌｉｎｋｅｒは、機能性タンパク質及びシャペロンタンパク質を連結するポリペプチド鎖であり、Ｌｉｎｋｅｒの配列及び長さは融合タンパク質の機能に対して極めて重要な作用を有する。Ｌｉｎｋｅｒの選択は、以下の各点を考慮すべきである。

１）適切な長さを要求し、短すぎると空間におけるタンパク質間の相対的独立を確保できず、長過ぎるとＬｉｎｋｅｒの断裂、及び免疫原性を引き起こすリスクが増加する可能性がある。２）Ｌｉｎｋｅｒの配列は切断を避けるために、プロテアーゼ切断部位を含むことができない。３）Ｌｉｎｋｅｒは天然Ｌｉｎｋｅｒ、人工Ｌｉｎｋｅｒを選択できる。４）ＬｉｎｋｅｒはリジッドＬｉｎｋｅｒ及びフレキシブルＬｉｎｋｅｒに分けることができる。

本発明は、多くの実験を通して、４種類の人工設計のＬｉｎｋｅｒを実証用の代替品とする。

（１）（ＧＧＧＧＳ）_ａは最も幅広く使用されるフレキシブルＬｉｎｋｅｒであり、ここで、ａは１、２、３、４、５又は６であってもよい。
（２）Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｂＡはα－螺旋リジッドＬｉｎｋｅｒであり、ここでｂは１、２、３、４、５又は６であってもよい。
（３）（ＡＰ）_ｃは直鎖リジッドＬｉｎｋｅｒであり、ここで、ｃは１～１８であってもよい。
（４）Ｇ_ｄは（ＧＧＧＧＳ）_ｎに類似しているフレキシブルＬｉｎｋｅｒであり、ここで、ｄは１～１５であってもよい。

３．ＨＭ－３とＦｃ部分との融合順序

アミノ酸配列の方向の唯一性により、２つのタンパク質の融合には２種類の連結形態が存在し、Ｎ末端の連結は、機能性タンパク質をＦｃフラグメントのＮ末端に連結することをいい、Ｃ末端の連結は、機能性タンパク質をＦｃフラグメントのＣ末端に連結することをいう。

４．代替用融合タンパク質の構造設計

上記の融合タンパク質の設計に考慮すべき因子を組み合わせて、少なくとも３００種類を超える融合タンパク質構造を生成可能であり、１つずつ発現させて薬効を実証するのは現実的ではないので、単一因子の比較の構想から、まず、最も用いられる（ＧＧＧＧＳ）_３Ｌｉｎｋｅｒを選択して、以下の６種類の分子を設計した。

ＴＳＬ－１融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＩｇＧ２－Ｆｃ；
ＴＳＬ－２融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ；
ＴＳＬ－３融合タンパク質：ＩｇＧ２－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３；
ＴＳＬ－４融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３；
ＴＳＬ－５融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＩｇＧ４－Ｆｃ；
ＴＳＬ－６融合タンパク質：ＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３。

その後、上記の６種類の構造に基づいて、単一因子を替え、ＨｙＦｃ、リジッドＬｉｎｋｅｒ、オーバーラップペプチド等の設計構想を導入することで、６種類の新しい融合タンパク質構造を形成した。

ＴＳＬ－１３融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１４融合タンパク質：ＨＭ－３－ＨｙＦｃ
ＴＳＬ－１５融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－Ｇ５－ＨＭ－３－Ｇ８－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１６融合タンパク質：ＨｙＦｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１７融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４Ａ－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１８融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＡＰ）_９－ＨＭ－３

以上のアミノ酸配列は配列表の通りである。

上記の１２種類の融合タンパク質を最も代表的な代替用タンパク質構造として、細胞の発現とｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性実験とを同時に行って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効実験の結果を獲得し、異なる比較方法により、各々の構造変数を比較でき、最適な融合タンパク質構造をスクリーニングする。その後、ｉｎ ｖｉｖｏにおける薬力学、薬物動態学、毒物学等によりドラッガビリティー（Ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）を評価することで、更に関節リウマチ等の自己免疫疾患治療用の新規薬物に開発される。

実施例２：ベクターの構築

１２種類の融合タンパク質は同じ設計アプローチによるものであり、同じ発現ベクターを使用するので、発現ベクターの一過性トランスフェクトの構築過程は完全に一致し、ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ３（ＴＳＬ－４）融合タンパク質を例として、発現ベクターの構築過程を説明する。

ＴＳＬ－４融合タンパク質はｍＩｇＧ４－Ｆｃフラグメントを採用して１つのＨＭ－３分子と連結し、Ｌｉｎｋｅｒは（ＧＧＧＧＳ）_ａを採用し、ここで、ａは３である。

ＴＳＬ－４の各部分を構成するアミノ酸配列を、ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ３の順序に従って接合した後の配列は配列表１２の通りである。

ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ３融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列は配列表１の通りである。

ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３等の真核細胞の分泌発現に適応するために、必要とするＫｏｚａｋ配列及びシグナルペプチドを添加して、完全なｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ３発現配列が得られ、ＤＮＡ配列は配列表２の通りである。

バイオテクノロジー企業に委託して上記のＤＮＡ配列を全合成（Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）し、サブクローニングによりｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により市販されている発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒと連結して、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ３が得られた。発現ベクターはＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに保存し、グリセリン管の形式で、実験室に移送して、－８０℃で保存した。

実施例３：発現ベクターの保存菌株の長期保存

無菌条件で、ｐｃＤＮＡ３．４－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ３を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αグリセリン管を解凍し、１％の接種量で、１００ｕｇ／ｍｌのＡｍｐ耐性／ＬＢ培地を５０ｍｌ含有する２５０ｍｌの振盪培養フラスコ中に接種し、３７℃、１６０ｒｐｍで一晩振盪培養した。

その後、無菌条件で、菌液中に２５ｍｌの無菌の６０％グリセリンを添加し、十分に均一混合した後、菌液を、１ｍｌ／本で無菌の１．５ｍｌ遠心管に分注して、グリセリン管の調製を完成し、－８０℃で長期保存した。

実施例４：発現ベクターの調製

細胞のトランスフェクトに用いられる全てのベクターは無菌を必要とし、且つエンドトキシンを制御するので、全ての発現ベクターの調製は、いずれもＲｏｃｈｅ社のＧｅｎｏｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを用いてプラスミドの大量抽出を行い、プラスミドに対して無菌処理を行った。

（１）プラスミド抽出の１日前の朝に、－８０℃で１本のグリセリン管を取り出し、無菌条件で、菌液を１％の接種量で、１００ｕｇ／ｍｌのＡｍｐ耐性／ＬＢ培地を５ｍｌ含有する試験管中に接種し、３７℃、１６０ｒｐｍで６～８ｈ振盪培養した。

（２）無菌条件で、試験管中の菌液を全部１００ｕｇ／ｍｌのＡｍｐ耐性／ＬＢ培地を５００ｍｌを含有する２Ｌの振盪培養フラスコに入れて、３７℃、１６０ｒｐｍで、一晩振盪培養した。

（３）Ｒｏｃｈｅ社のＧｅｎｏｐｕｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔを使用してプラスミドの大量抽出を行った。方法は以下の通りである。

ａ．４℃、３０００～５０００ｇで、５～１０ｍｉｎ遠心し、５００ｍｌの大腸菌を収集した。２４ｍｌの懸濁バッファー（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ＲＮａｓｅ含有）を添加し、菌体を十分に再懸濁した。
ｂ．２４ｍｌの細胞溶解バッファー（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、反転させて６～８回均一混合し、室温で２～３分間静置した。
ｃ．２４ｍｌの中和バッファー（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）を添加してからすぐに反転させて６～８回均一混合すると、綿状の沈殿物が現れた。
ｄ．ライセートを浄化した。４℃、１２０００ｇ以上の速度で、４５ｍｉｎ以上遠心し、上澄みを慎重に吸着カラムに移動させた。
ｅ．吸着カラムにキット付随のペーパーリングを付けて、三角フラスコの口に置き、吸着材料に６ｍｌの平衡化バッファー（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）を滴下した。
ｆ．ｅで得られたクリーンなバクテリアライセートを吸着カラム中に添加し、重力により自然に流し、フロースルー（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）液を廃棄した。
ｇ．１２ｍｌの洗浄バッファー（Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ）を吸着カラム中に添加し、重力により自然に流し、フロースルー液を廃棄した。２回繰り返した。
ｈ．クリーンベンチ中で、吸着カラムをエンドトキシンのない、無菌の丸底の高速遠心管（５０ｍｌ）上に置き、５０℃に予熱された１４ｍｌの溶出バッファー（Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、重力により自然に流した。
ｉ．２０ｍｌイソプロパノールを添加し、プラスミドＤＮＡを沈殿させ、４℃、１５０００ｇ超で、３０ｍｉｎ遠心し、クリーンベンチ中で、慎重に上澄みを廃棄した（このステップで特に注意すべきことは、プラスミドが固形沈殿物を形成せず、遠心管の底部に粘稠液体を形成する場合があるので、ピペットを使用して上層の大部分の液体を除去し、その後、残りの上澄みを慎重に無菌の底の尖った遠心管、例えば１５ｍｌの遠心管又は５０ｍｌの遠心管に移し、できるだけプラスミド含有粘稠液体を吸込まないようにした。その後、底の尖った遠心管を観察し、予期せずに吸込んだプラスミド含有粘稠液体を丸底遠心管に吸い戻した。）。
ｊ．予め冷却した７５％エタノールを４ｍｌ使用し、遠心管の蓋を締めて遠心管を回転させ、７５％エタノールで遠心管内部全体を濡らして、管壁に残る可能性のあるプラスミドを洗う一方、遠心管内壁全体に対して殺菌を行った。４℃、１５０００ｇ超で、１０ｍｉｎ遠心した。１回繰り返した。
ｋ．クリーンベンチで、７５％エタノールを捨て、１０ｕｌのピペットで残りの液体を慎重に吸込み、遠心管を吸収紙上に逆置きして約２０分乾燥させた。
ｌ．クリーンベンチで、２００～４００ｕｌの無菌ｄｄＨ２Ｏを使用して、固形プラスミドを完全に浸漬し、遠心管の蓋を締め、４℃で、遠心管を傾斜させて一晩静置し、プラスミドを完全に溶解させた。クリーンベンチで、プラスミドを無菌１．５ｍｌ遠心管中に移し、２ｕｌを取って濃度検出に用いた。濃度検出結果によれば、無菌ｄｄＨ２Ｏを使用してプラスミド濃度を１ｕｇ／ｕｌに調整し、無菌の０．２２μｍろ過膜を使用し膜を通させて殺菌し、５ｕｌのプラスミドを取って非耐性ＬＢ培地を５ｍｌ含有する試験管中に接種し、３７℃で一晩振盪培養し、無菌を確認した。こうして、無菌プラスミドの調製を完成した。４℃又は－２０℃でプラスミドＤＮＡを保存した。

こうして、発現ベクターの調製を完成した。

実施例５：融合タンパク質の迅速な発現

ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社のＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍは、２９３Ｆ細胞（スクリーニングされたＨＥＫ２９３細胞）一過性トランスフェクトによる市販のタンパク質迅速調製キットであり、融合タンパク質の迅速な獲得に用いられる。用いられた１２種類の融合タンパク質の調製はいずれも下記の実験プロトコルに従って行った。

１．Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍの取扱説明書によれば、２Ｌの振盪培養フラスコを使用して実験を行う場合、ボトルごとの細胞の最終体積は８００ｍｌである。

２．トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、回復から計算し、少なくとも３回の継代を行った。継代過程において、実験の必要に応じて、培養規模を順次に拡大した。

３．一過性トランスフェクトの１日前、２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの生細胞密度で総体積が１２００ｍｌであるＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに移し、３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍで、振盪培養した。

４．一過性トランスフェクトの当日、まず前日に培養された細胞数を数え、細胞密度は３～５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、生存率は９５％を超えることを必要とする。細胞密度を３×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、各２Ｌの振盪培養フラスコ中の細胞体積を６８０ｍｌに調整した。

５．８００ｕｇプラスミドＤＮＡを４０ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに再溶解し、軽く均一混合した。

６．２．１６ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ ＲｅａｇｅｎｔをＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍに添加し、４０ｍｌに定容した。軽く均一混合し、室温で５ｍｉｎ培養した（長時間の培養は形質転換効率に影響を及ぼす）。

７．上記の２種類の溶液を混合し、軽く均一混合し、室温で２０～３０ｍｉｎ培養した。プラスミド－トランスフェクト試薬混合液の準備を完成した。

８．８０ｍｌプラスミド－トランスフェクト試薬混合液をステップ４の細胞培養液中に添加し、合計７６０ｍｌとした。

９．３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍで１８ｈ振盪培養した。

１０．４ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ １及び４０ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ ２を添加した。これまでの総体積は８０４ｍｌである。

１１．３７℃、８％ＣＯ_２、１２５ｒｐｍで振盪培養した。

１２．トランスフェクト後の６日目に発酵を終了し、サンプリングし、免疫比濁計を使用して収量を検出し、タンパク質精製を行った。

実施例６：融合タンパク質の精製

１２種類の融合タンパク質のいずれも、実質的にＦｃ融合タンパク質であるので、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー用カラムを使用して特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）の捕捉を行い、実際の精製過程において、精製パラメータが完全に一致することが見出されたので、ここで、あるバッチのＴＳＬ－４タンパク質の精製を例として、融合タンパク質の精製プロセスを説明する。

１．サンプル前処理：Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ×２５遠心機、５００ｍｌの遠心カップを採用し、２０１６０３０８バッチの１．６０Ｌ発酵ブロスを７５００ｒｍｐ、４℃で２０ｍｉｎ遠心し、得られた約１．４６Ｌの上澄み液を次のステップのプロテインＡの捕捉に用いた。

２．目的タンパク質のアフィニティーキャプチャー：

クロマトカラムの情報は以下の通りである。

フィラー Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ
クロマトカラム ＸＫ５０／２０
カラム高（ｃｍ） １０
クロマトカラム横断面積（ｃｍ^２） １９．６２
フィラー体積（ｍＬ） １９６．２

方法の情報は以下の通りである。

１）まず、５００ｍｌの０．２Ｍ ＮａＯＨで滅菌し、流速は１０ｍｌ／ｍｉｎである。

２）２０ｍＭ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．０バッファーでクロマトカラムを平衡化させ、体積は約１０００ｍｌで、流速は２０ｍｌ／ｍｉｎである。

３）ローディング：サンプルは予めｐＨを中性に調整し、流速は２０ｍｌ／ｍｉｎである。

４）２０ｍＭ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．０バッファーでクロマトカラムを洗浄し、約８００ｍｌで、流速は２０ｍｌ／ｍｉｎである。

５）５０ｍＭ クエン酸－クエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣＬ ｐＨ３．０バッファーで目的タンパク質を溶出し、ピークの起点２０ｍＡｕから収集を開始し、ピーク後２０ｍＡｕで収集を停止し、流速は２０ｍｌ／ｍｉｎである。

６）クロマトカラムは、最後に、５００ｍｌ ０．２Ｍ ＮａＯＨ溶液でクロマトカラムを洗浄し、ｄｄＨ_２Ｏ水で中性になるまで洗浄した後、２０％エタノールでクロマトカラムを保存した。

サンプルの体積は合わせて約１３８ｍｌであり、１Ｎ ＮａＯＨ ２０ｍｌでｐＨ４．１２～７．０に調整し、溶離液が略混濁から透明になった。測定結果は図１に示す通りである。

３．ゲルクロマトグラフィーにてさらなる分離精製を行った。

クロマトカラムパラメータ：

フィラー Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００
クロマトカラム ＸＫ５０／６０
カラム高（ｃｍ） ５８
クロマトカラム横断面積（ｃｍ^２） １９．６２
フィラー体積（ｍＬ） １１３８
流速 ｍｌ／ｍｉｎ
ローディング １～１０％のローディング量

方法の情報

１）０．５Ｍ ＮａＯＨ ３００ｍｌでクロマトカラムを滅菌し、流速は１０ｍｌ／ｍｉｎであり、その後超純水で略中性になるまで洗浄する。

２）ｐＨ ７．４のＰＢＳバッファーでクロマトカラムを平衡化させ、平衡体積は約１５００ｍｌで、流速は１０ｍｌ／ｍｉｎである。

３）ローディング：サンプルはプロテインＡ溶離液で、ローディング量は４０ｍｌである。

４）サンプルを収集し、ピーク３は目的タンパク質のピークであり、ピーク３を収集し、ピークの起点１０ｍＡｕから収集を開始し、ピーク後１０ｍＡｕで収集を停止する。

５）最後に、０．１Ｍ ＮａＯＨでクロマトカラムを保存し、流速は１０ｍｌ／ｍｉｎである。

測定結果は図２に示す通りである。

４．サンプルの限外ろ過による濃縮：ピーク３のサンプルを合わせて限外ろ過による濃縮を行い、限外ろ過膜は１０ｋＤａを用いて、サンプルを目的タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌ超になるまで濃縮し、その後サンプルを分注し、－８０℃の冷蔵庫に保存した。このバッチの最初のサンプル合計体積は約５５０ｍｌで、濃度は約０．２９ｍｇ／ｍｌで、最終的には２７ｍｌまで濃縮し、濃度は約５．５３ｍｇ／ｍｌである。サンプルを分注し、冷凍保存した。

５．最終サンプルの純度

図３に示すように、２０１６０３０８バッチの電気泳動純度は約９６．９％である。図４に示すように、２０１６０３０８バッチのＨＰＬＣ－ＳＥＣ純度は約９９．３％である。

同様の精製プロセスに従って、１２種類の融合タンパク質の発現と調製に成功した。

ＴＳＬ－１融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＩｇＧ２－Ｆｃ；
ＴＳＬ－２融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ；
ＴＳＬ－３融合タンパク質：ＩｇＧ２－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３；
ＴＳＬ－４融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３。
ＴＳＬ－５融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＩｇＧ４－Ｆｃ
ＴＳＬ－６融合タンパク質：ＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１３融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１４融合タンパク質：ＨＭ－３－ＨｙＦｃ
ＴＳＬ－１５融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－Ｇ_５－ＨＭ－３－Ｇ_８－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１６融合タンパク質：ＨｙＦｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１７融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４Ａ－ＨＭ－３
ＴＳＬ－１８融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＡＰ）_９－ＨＭ－３

タンパク質の調製過程において、図５に示すように、ＴＳＬ－５、６の２種類の融合タンパク質には重大な二量体分解の問題があることが発見され、多くはモノマー形態で存在し、これはＩｇＧ４－Ｆｃを使用して調製した融合タンパク質が二量体を安定に形成できないことを表すものであり、このため、ＴＳＬ－５とＴＳＬ－６の２種類の融合タンパク質の設計スキームを排除した。

実施例７：融合タンパク質のマウス脾臓リンパ球増殖を阻害する実験

実験方法：マウスを眼窩放血により殺し、直ちに７５％エタノールに入れて５～１０ｍｉｎ浸漬させ、クリーンベンチ中で脾臓を取り出してＰＢＳ中に入れた。脾臓を無菌細胞ふるい上（２００メッシュ）に置き、注射器ヘッドで研磨し、途中にＰＢＳの継続的添加を必要とし、研磨液を収集して遠心（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、トリス－塩化ナトリウム溶液で細胞を３回洗浄し、再度培地で１回洗浄した後、培地で再懸濁した。最後に、細胞に対してトリパンブルーによる生細胞染色を行い、生存率は９５％以上である。生細胞濃度を２×１０^６個／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートの各ウェルに細胞１００μＬを添加し、それと同時にＣｏｎＡ（コンカナバリン、脾細胞増殖を刺激）及び薬物を添加し、グループごとに６つの重複ウェルを設置した。

９６ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター中で４８ｈ培養した。９６ウェルプレート中に５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを１ウェル当たり２０μＬ添加し、インキュベーター中で４ｈ培養し続けた。９６ウェルプレート中の培養液を除去し、ウェルごとに１００μＬのＤＭＳＯを添加し、軽く均一混合した。プレートリーダーを利用し、波長５７０ｎｍ、対照波長６３０ｎｍで吸光度を測定した。

次の式に従って、増殖阻害率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ＰＩ）を計算した。

式１

ここで、Ａｔｅｓｔは投与グループの吸光度で、Ａｃｏｎｔｒｏｌは陰性対照群の吸光度である。試験で得られた結果をｍｅａｎ±ＳＤにより表し、統計学的ｔ検定を行い、＊Ｐ＜０．０５は有意差を、＊＊Ｐ＜０．０１は極大有意差（ｅｘｔｒｅｍｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）を表す。結果により、関節リウマチに対する融合タンパク質の薬効をスクリーニングした。

１回目の実験でＴＳＬ－１－４を検出し、具体的な投与スキームは表２の通りである。

実験結果：図６に示すように、ＨＭ－３融合タンパク質ＴＳＬ－１、ＴＳＬ－２、ＴＳＬ－３、ＴＳＬ－４の抗関節リウマチ活性をスクリーニングするために、実験においてマウス脾臓リンパ球の増殖実験を採用して、ＨＭ－３融合タンパク質ＴＳＬ－１、ＴＳＬ－２、ＴＳＬ－３、ＴＳＬ－４に対して最初のスクリーニングを行った結果、ＨＭ－３、ｍＰＥＧ－ＳＣ－ＨＭ－３、ＨＭ－３融合タンパク質ＴＳＬ－１、ＴＳＬ－２、ＴＳＬ－３、ＴＳＬ－４の最適な阻害率はそれぞれ１７．９％±８．８％、４０．５％±９．３％、３９．６％±９．４％、３４．１％±１１．７％、６１．４％±１．６％、６３．３％±１１．０％である。ここで、ＨＭ－３融合タンパク質ＴＳＬ－３、ＴＳＬ－４の阻害率が陽性対照群より高く、且つ陰性群と比較して極大有意差を有する。

２回目の実験でＴＳＬ－１３～１８を検出し、具体的な投与スキームは表３の通りである。Ｐ４対照群は、ＴＳＬ－４融合タンパク質を対照薬として使用した。

実験結果

図７は、ＴＳＬ－１３～１８の各グループの薬物のＣｏｎＡ刺激された脾臓細胞の増殖に対する阻害作用を表す。Ｐ４陽性薬群、溶媒群のいずれもＣｏｎＡ群と比べて、マウス脾臓リンパ球の増殖阻害率が顕著に向上したが（Ｐ＜０．０５）、ＴＳＬ－１３～１８の各グループの薬物において、ＣｏｎＡ群と比べて、ＴＳＬ－１７とＴＳＬ－１８の２つのサンプルの各濃度勾配のみが、マウス脾臓リンパ球の増殖阻害率において顕著に向上したが（Ｐ＜０．０５）、阻害範囲はＰ４陽性薬群より小さかった。

実施例８：１２種類の代替用融合タンパク質構造の単一因子の比較

まず、実施例６で言及したように、精製過程において、ＴＳＬ－５とＴＳＬ－６の融合タンパク質が所期の正常な二量体状態を安定的に保持できないので、ＴＳＬ－５とＴＳＬ－６のこの２種類の天然のヒト由来ＩｇＧ４－Ｆｃフラグメントによる融合タンパク質は排除され、それと同時にＩｇＧ４－Ｆｃは代替用融合タンパク質のＦｃフラグメントとして使用されなくなることが見出された。マウス脾臓リンパ球の増殖阻害の実験結果に基づいて、残りの１０種類の代替用融合タンパク質に対して単一構造因子の比較を行った。

１、Ｆｃフラグメント及び連結方向の比較

ＧＧＧＧＳ＊３Ｌｉｎｋｅｒを統合リンカーとして選択し、天然のヒト由来ＩｇＧ４－Ｆｃを排除した後、ＩｇＧ２－Ｆｃ、ｍＩｇＧ４－Ｆｃ及びＨｙＦｃの３種類の代替用Ｆｃフラグメントを共有し、２種類の連結方向を組み合わせて、合計６種類の代替用融合タンパク質ＴＳＬ－１、２、３、４、１４、１６をそれぞれ形成し、各サンプルの最適な阻害率は表４に示す通りである。

図８に示すように、データを比較すると、以下の結果が得られる。

１）ＨｙＦｃに基づいて構築された融合タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効は、対照サンプルＴＳＬ－４融合タンパク質より顕著に低いので、ＨｙＦｃのシャペロンとしてのＨＭ－３薬効延長の役割を排除した。

２）Ｃ末端連結形態、即ちＨＭ－３がＦｃフラグメントのＣ末端に連結される形態は、その薬効がＮ末端連結形態より顕著に優れるので、Ｎ末端連結形態を排除した。

３）同じくＣ末端連結形態であるが、ＴＳＬ－４の薬効がＴＳＬ－３よりわずかに高いので、一旦ｍＩｇＧ４－ＦｃがＩｇＧ２－Ｆｃより優れると考えられるが、しばらくＩｇＧ２－Ｆｃを排除せず、後続の実験でＴＳＬ－３とＴＳＬ－４を更に比較した。

２、Ｌｉｎｋｅｒの単一因子比較

図９に示すように、ＴＳＬ－４、ＴＳＬ－１７、ＴＳＬ－１８のいずれもｍＩｇＧ４－Ｆｃ及びＣ末端連結形態を使用し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効を比較することで、Ｌｉｎｋｅｒをスクリーニングした。マウス脾臓リンパ球の増殖阻害実験の結果は、ＴＳＬ－１７とＴＳＬ－１８がいずれもＴＳＬ－４より細胞阻害率が低いことを示すので、３種類のタイプのＬｉｎｋｅｒにおいて、Ａ（ＥＡＡＡＫ）_ｎＡと（ＡＰ）_ｎの２種類のリジッドＬｉｎｋｅｒはＨＭ－３のＦｃ融合タンパク質の構築には不適であるという結論が得られた。

３、単一のＨＭ－３と複数のＨＭ－３の融合タンパク質の比較

理論的には、融合タンパク質分子にはより多くのＨＭ－３が含まれ、投与用量が同じ場合により強い薬効をもたらす。このような構想に基づいて、ＴＳＬ－１３はＦｃフラグメントの両端にＨＭ－３が連結されるように設計され、ＴＳＬ－１５はＦｃフラグメントのＣ末端に２つのＨＭ－３が連結されるように設計された。

図１０に示すように、マウス脾臓リンパ球の増殖阻害実験において、いずれもｍＩｇＧ４－Ｆｃ及びＧＧＧＧＳ＊３Ｌｉｎｋｅｒを使用することで、ＴＳＬ－２、４、１３、１５のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効を比較し、複数のＨＭ－３の薬効への作用を分析した。

比較したところ、ＴＳＬ－１３、１５のいずれも薬効がＴＳＬ－４タンパク質より低く、複数のＨＭ－３では薬効向上の価値が発現されなかったので、複数のＨＭ－３を含有する融合タンパク質の設計スキームを排除した。

複数回の比較により、ＨＭ－３がＦｃのＣ末端に連結され、ＧＧＧＧＳ＊３Ｌｉｎｋｅｒ（フレキシブルＬｉｎｋｅｒ）を使用して単一のＨＭ－３分子に連結することがＨＭ－３の薬効を最大限に保持でき、ＩｇＧ２－ＦｃとｍＩｇＧ４－Ｆｃの２種類のＦｃフラグメントを比較すると、ｍＩｇＧ４－Ｆｃの効果がわずかに優れるが、ＩｇＧ２－Ｆｃを排除するには不十分であるので、ＴＳＬ－３とＴＳＬ－４のこの２種類のタンパク質構造を後続の実験で更に比較した。

実施例９：ＨＭ－３融合タンパク質のヒトマクロファージＵ９３７の阻害反応におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効のスクリーニング

実験方法：ヒトマクロファージＵ９３７を、１０％のウシ胎児血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭｌ－１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２の恒温インキュベーターにおいて培養し、大体２日ごとに溶液を１回取り替えた。対数増殖期におけるＵ９３７細胞を取って収集及び再懸濁し、細胞濃度を５×１０^５個／ｍＬに調整し、９６ウェルプレート中に細胞を１００μＬ／ウェルで添加し、ｎ＝３であり、一晩置き、翌日、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で誘導すると同時に、薬物を投与して治療を行い、それぞれ陽性対照薬群ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ＨＭ－３ポリペプチド群、ｍＰＥＧ－ＳＣ－－ＨＭ－３ポリペプチド群、ＨＭ－３融合タンパク質（ＴＳＬ－１、ＴＳＬ－２、ＴＳＬ－３、ＴＳＬ－４）群に分け、具体的な投与スキームは表５の通りである。

薬物が４８時間作用した後、細胞培養液を収集し、遠心し、上澄みを取り、ＥＬＩＳＡ方法により上澄み液におけるＴＮＦ－αの含有量を測定した。試験で得られた結果をｍｅａｎ±ＳＤにより表し、統計学的ｔ検定を行い、＊Ｐ＜０．０５は有意差を、＊＊Ｐ＜０．０１は極大有意差を表す。結果により、関節リウマチに対するＨＭ－３融合タンパク質の薬効をスクリーニングした。

実験結果：図１１に示すように、ＨＭ－３融合タンパク質ＴＳＬ－１、ＴＳＬ－２、ＴＳＬ－３、ＴＳＬ－４の抗関節リウマチ活性をスクリーニングするために、実験においてＥＬＩＳＡ方法を採用して、ＬＰＳにより誘導されたマクロファージ上澄み液におけるＴＮＦ－αの含有量を検出することで、ＨＭ－３融合タンパク質ＴＳＬ－１、ＴＳＬ－２、ＴＳＬ－３、ＴＳＬ－４の抗関節リウマチ活性を特定した。その結果、ＨＭ－３融合タンパク質ＴＳＬ－３、ＴＳＬ－４における用量（９μＭ）が最適な阻害作用を発現し、細胞上澄み液におけるＴＮＦ－α含有量は３８．６±１２．９ｐｇ／ｍＬ及び２２．２±８．９ｐｇ／ｍＬであり、陰性群（７７．６±１９．６ｐｇ／ｍＬ）と比較して極大有意差を有する。なお、ＨＭ－３の高用量群及び低用量群の細胞上澄み液におけるＴＮＦα含有量はそれぞれ５８．９±１０．６ｐｇ／ｍＬ、８３．９±２０．４ｐｇ／ｍＬである。ｍＰＥＧ－ＳＣ－ＨＭ－３の高用量群及び低用量群の細胞上澄み液におけるＴＮＦ－α含有量はそれぞれ４５．６±５．９ｐｇ／ｍＬ、５７．３±２．７ｐｇ／ｍＬであり、阻害作用の点から、ＴＳＬ－４はポリペプチドＨＭ－３及びｍＰＥＧ－ＳＣ－ＨＭ－３よりはるかに優れている。

実施例１０：ＨＭ－３融合タンパク質のゼブラフィッシュ体内における抗血管形成作用に対する薬効のスクリーニング

実験方法：蛍光血管の遺伝子組み換えゼブラフィッシュをランダムに選択して６ウェルプレート中に１ウェル当たり３０匹入れ、それぞれ静脈注射してＨＭ－３ポリペプチド、ＴＳＬ－１融合タンパク質、ＴＳＬ－２融合タンパク質、ＴＳＬ－３融合タンパク質及びＴＳＬ－４融合タンパク質を２０ｎｇ／匹及び６６ｎｇ／匹の用量で、陽性対照薬Ａｖａｓｔｉｎを５００ｎｇ／匹の用量で投与し、注射体積はいずれも２０ｎＬ／匹であり、２０ｎＬ／匹のバッファーを注射したゼブラフィッシュは溶媒対照群であり、何の処理もしなかったゼブラフィッシュは正常対照群である。２４ｈの処理後、グループごとに１０匹のゼブラフィッシュをランダムに選択し、蛍光顕微鏡を使用して蛍光血管の遺伝子組み換えゼブラフィッシュのｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｖｅｉｎ ｖｅｓｓｅｌ（ＳＩＶｓ）を観察し、撮影して画像を保存し、Ｎｉｋｏｎ ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｄ ３．１０高級画像処理ソフトウェアで画像分析を行い、実験グループのｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｖｅｉｎ ｖｅｓｓｅｌの面積（Ｓ）を計算した。血管形成阻害率の計算式は以下の通りである。

式２

分散分析及びダネットのｔ検定により統計学分析を行い、結果はＭｅａｎ±ＳＥで表し、ｐ＜０．０５は有意差を有することを表す。

実験結果

図１２に示すように、陽性対照薬Ａｖａｓｔｉｎ ５００ｎｇ／匹のグループのゼブラフィッシュのｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｖｅｉｎ ｖｅｓｓｅｌの面積（３７８５３）を正常対照群（５３１９３）と比較するとｐ＜０．００１（正常対照群と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）であり、その血管形成阻害率は２９％である。これは、Ａｖａｓｔｉｎが明らかな血管形成阻害作用を有することを示す。

ＨＭ－３ポリペプチド、ＴＳＬ－１、ＴＳＬ－２、ＴＳＬ－３及びＴＳＬ－４融合タンパク質が２０ｎｇ／匹の用量である場合、ゼブラフィッシュのｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｖｅｉｎ ｖｅｓｓｅｌの面積はそれぞれ５２１８６、３９９２９、４２８２８、４０７０５及び３３８６９であり、正常対照群（５３１９３）と比較して、血管形成阻害率はそれぞれ２％、２５％、１９％、２３％及び３６％である。実験結果によれば、ＨＭ－３ポリペプチドの注射用量が２０ｎｇ／匹である場合、血管形成阻害作用を有しなく、ＴＳＬ－１、ＴＳＬ－２、ＴＳＬ－３及びＴＳＬ－４融合タンパク質の注射用量が２０ｎｇ／匹である場合に、いずれも明らかな血管形成阻害作用を有し、そのうちＴＳＬ－４の血管形成阻害作用が最も良かった。

ＨＭ－３、ＴＳＬ－１、ＴＳＬ－２、ＴＳＬ－３及びＴＳＬ－４が６６ｎｇ／匹の用量である場合、ゼブラフィッシュのｓｕｂｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｖｅｉｎ ｖｅｓｓｅｌの面積はそれぞれ４２４９２、３７０２２、３２３７４、３８６６０及び２８２９７であり、正常対照群（５３１９３）と比較して、その血管形成阻害率はそれぞれ２０％、３０％、３９％、２７％及び４７％である。これは５種類の融合タンパク質の注射用量が６６ｎｇ／匹である場合に、いずれも明らかな血管形成阻害作用を有することを示し、そのうちＴＳＬ－４の血管形成阻害作用が最も良かった。

実施例１１：マウスＩＩ型コラーゲン関節炎慢性炎症モデル

実験方法：Ｂａｌｂ／ｃマウスを取り、一次免疫を行い、ウシＩＩ型コラーゲン濃度は４ｍｇ／ｍＬであり、試験当日（０日）に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とＣＩＩ溶液を等体積で均一混合して、乳化し、Ｂａｌｂ／ｃマウスの正常対照群を除いて、他の各グループの各マウスはその尾根部に乳化剤５０μＬを皮内注射して感作（Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）させ、２１日後に、同じ用量の乳化剤で尾根部にて二次免疫を行い、今回のアジュバントは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用した。概ね試験の２９日目に、モデルマウスの足趾関節が赤く腫れる等の関節炎症状が現れればモデル構築に成功したことを示す。

治療方法

実験の３０日目に、モデル構築グループの動物をランダムに以下のように分けた。

Ｇ１（正常対照群）；
Ｇ２（モデル群）；
Ｇ３（陽性薬物アダリムマブ群）；
Ｇ４（ＨＭ－３群）；
Ｇ５（ｍＰＥＧ－ＳＣ－ＨＭ－３群）；
Ｇ６（ＴＳＬ－４、５０ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）；
Ｇ７（ＴＳＬ－４、２５ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）；
Ｇ８（ＴＳＬ－４、２５ｍｇ／ｋｇ、７日に１回で総２回投与）；
Ｇ９（ＴＳＬ－４、２５ｍｇ／ｋｇ、１４日に１回で総１回投与）；
Ｇ１０（ＴＳＬ－４、１２．５ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）；
Ｇ１１（ＴＳＬ－４、１２．５ｍｇ／ｋｇ、７日に１回で総２回投与）；
Ｇ１２（ＴＳＬ－４、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１４日に１回で総１回投与）；

合計１２グループで、Ｇ１（正常対照群）及びＧ２（モデル群）はマウスが１２匹であることを除いて、他のグループは各８匹である。正常対照群及びモデル対照群はいずれも生理食塩水を皮下注射し、投与体積は０．１ｍＬ／１０ｇで、隔日に１回で総８回投与し、陽性薬物アダリムマブ群はアダリムマブ８ｍｇ／ｋｇを皮下注射し、投与体積は０．１ｍＬ／１０ｇで、２週間に１回で総１回投与し、１５日間の治療完了後、更に１５日間観察した。具体的な投与スキームは表６の通りである。

関節炎指標の評価

マウスの体重測定：電子天秤を利用して各マウスの体重を測定し、２日おきに１回測定した。

足裏の厚さ測定：ノギスを利用して各マウスの左右の後足の足裏の厚さを測定し、２日おきに１回測定した。

足関節の幅測定：ノギスを利用して各マウスの左右の足関節の幅を測定し、２日おきに１回測定した。

関節炎指数（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎｄｅｘ、ＡＩ）のスコア：足爪関節採点法を採用して、各マウスの関節炎症の重症度に対してスコアを付ける。０：赤く腫れることがない；１：小趾関節が赤く腫れる；２：趾関節、足趾のいずれも赤く腫れる；３：足関節以下の部分がいずれも赤く腫れる；４：趾関節、足趾、足関節のいずれも赤く腫れる。実験の終了まで２日おきに１回スコアを付けた。

病理学的指標の評価

眼窩血を採血し、血清を分離した。動物を頸椎脱臼により殺した後、脾臓、胸腺を分離し、称量し、脾臓係数を計算し、脾臓と胸腺をホルマリン固定液に入れて固定した。脛骨下端の内踝及び外踝上端の連結部分から切断し、足首関節を含む足全体の重量を称量し、組織の病理学的検査をするためにホルマリン固定液に入れて固定する。

実験結果：ＴＳＬ－４の異なる投与スキームは、マウスＩＩ型コラーゲン関節炎モデルに対して異なる治療効果を有する。そのうちＧ３群（陽性薬物アダリムマブ群）、Ｇ４群（ＨＭ－３群）、Ｇ５群（ｍＰＥＧ－ＳＣ－ＨＭ－３群）、Ｇ６群（ＴＳＬ－４、５０ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）、Ｇ７群（ＴＳＬ－４、２５ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）、Ｇ８群（ＴＳＬ－４、２５ｍｇ／ｋｇ、７日に１回で総２回投与）、Ｇ１０群（ＴＳＬ－４、１２．５ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）が良好な治療効果を発現し、足の厚さ、足首の幅、足囲、関節炎スコア、脾臓の重量、足の重量はいずれもモデル群と比較して有意差（＊ｐ＜０．０５）を有する。そのうち、Ｇ５群（ｍＰＥＧ－ＳＣ－ＨＭ－３群）、Ｇ６群（ＴＳＬ－４、５０ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）、Ｇ７群（ＴＳＬ－４、２５ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）、Ｇ８群（ＴＳＬ－４、２５ｍｇ／ｋｇ、７日に１回で総２回投与）の治療効果がＧ３群（陽性薬物アダリムマブ群）より優れるが、両者を比較すると有意差はなく、足の厚さ、足首の幅、足囲、関節炎スコアによると、治療の初期にはＧ３群（陽性薬物アダリムマブ群）の効果が他の群より優れ、治療の中期と後期にはＧ５群（ｍＰＥＧ－ＳＣ－ＨＭ－３群）、Ｇ６群（ＴＳＬ－４、５０ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）、Ｇ７群（ＴＳＬ－４、２５ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）、Ｇ８群（ＴＳＬ－４、２５ｍｇ／ｋｇ、７日に１回で総２回投与）の治療効果はＧ３群（陽性薬物アダリムマブ群）より優れ、なお、Ｇ４群（ＨＭ－３群）とＧ１０群（ＴＳＬ－４、１２．５ｍｇ／ｋｇ、５日に１回で総３回投与）の治療効果がＧ３群（陽性薬物アダリムマブ群）よりわずかに低く、Ｇ２群（モデル群）と比較すると有意差（＊ｐ＜０．０５）を有するが、Ｇ３群（陽性薬物アダリムマブ群）と比較すると有意差がないことが見出された。体重の動的曲線とｉｎ ｖｉｔｒｏにおける正常な細胞に対する毒性実験から、各治療群は明らかな中毒性副作用がないことが見出された。

１．ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの体重に対する影響

図１３に示すように、実験の６０日目の終了時、Ｇ３群、Ｇ４群、Ｇ５群、Ｇ６群、Ｇ７群、Ｇ８群、Ｇ１０群の体重は２１．０±１．５、２０．９±１．５、２１．５±１．３、２０．８±１．８、２１．１±１．６、２０．８±１．７、２１．５±１．５ｇであり、モデル群（Ｇ２群、１９．５±１．６ｇ）と比較して、顕著に増加した。

２．ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの足裏の厚さに対する影響

図１４に示すように、実験の６０日目の終了時、Ｇ３群、Ｇ４群、Ｇ５群、Ｇ６群、Ｇ７群、Ｇ８群、Ｇ１０群のマウス足裏の厚さは３．０４±０．１１、３．０６±０．２３、２．９４±０．１３、２．９２±０．１１、２．９４±０．０７、２．９９±０．１７、３．１５±０．０７ｍｍであり、モデル群（Ｇ２群、３．８５±０．３０ｍｍ）と比較して極大有意差を有する。

３．ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの足首の幅に対する影響

図１５に示すように、実験の６０日目の終了時、Ｇ３群、Ｇ４群、Ｇ５群、Ｇ６群、Ｇ７群、Ｇ８群、Ｇ１０群の足首の幅は４．２３±０．０８、４．２１±０．１５、３．９９±０．１２、３．９６±０．０９、３．９８±０．０８、４．００±０．１６、４．２６±０．１３ｍｍであり、モデル群（Ｇ２群、４．８３±０．２０ｍｍ）と比較して顕著に増加した。

４．ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの足囲に対する影響

図１６に示すように、実験の６０日目の終了時、Ｇ３群、Ｇ４群、Ｇ５群、Ｇ６群、Ｇ７群、Ｇ８群、Ｇ１０群の足囲はそれぞれ１１．４２±０．２０、１１．４１±０．５３、１０．８８±０．２８、１０．８０±０．２６、１０．８７±０．１４、１０．９７±０．３２、１１．６４±０．１９ｍｍであり、モデル群（Ｇ２群、１３．６２±０．６４ｍｍ）と比較して極大有意差を有する。

５．ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの関節炎スコアに対する影響

図１７に示すように、実験の６０日目の終了時、Ｇ３群、Ｇ４群、Ｇ５群、Ｇ６群、Ｇ７群、Ｇ８群、Ｇ１０群のマウスの関節炎スコアはそれぞれ７．６±０．９、７．８±１．４、６．１±１．２、６．５±１．１、６．６±１．１、７．１±０．６、８．６±１．８であり、モデル群のマウスの関節炎スコア（Ｇ２群、１１．５±１．７）と比較して極大有意差を有する。

６．ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの脾臓及び胸腺に対する影響

図１８に示すように、実験の６０日目の終了時、Ｇ３群、Ｇ４群、Ｇ５群、Ｇ７群、Ｇ８群、Ｇ１０群の脾臓は９４．６±６．７ｍｇ、９４．２±１３．３ｍｇ、９６．０±５．２ｍｇ、９５．１±９．５ｍｇ、９５．８±１１．４ｍｇ、９７．５±５．１ｍｇであり、モデル群（Ｇ２群、１１４．６±１４．５ｍｇ）と比較すると有意差を有する。マウスの胸腺は、モデル群（３９．９±８．９ｍｇ）と正常対照群の胸腺の重量（２５．９±６．２ｍｇ）を比較すると有意差（＊ｐ＜０．０５）を有することを除いて、その他の各グループとモデル群を比較すると、いずれも有意差を有しない。

７．ＴＳＬ－４のＩＩ型コラーゲン関節炎マウスの足の重量に対する影響

図１９に示すように、実験の６０日目の終了時、Ｇ５群、Ｇ６群、Ｇ７群、Ｇ８の足重は、１７４．６±１１．７ｍｇ、１７６．２±８．９ｍｇ、１７６．４±９．７ｍｇ、１７７．１±７．８ｍｇであり、モデル群（Ｇ２群、２１９．３±２０．６ｍｇ）と比較して有意差を有する。

以上の結果から、本出願のＴＳＬ－４融合タンパク質を５日に１回投与し（Ｇ６、Ｇ７、Ｇ１０群）、ひいては７日に１回投与（Ｇ８群）する場合に、依然としてＧ４群（１日に２回投与）、Ｇ５群（２日に１回投与）と同様の治療効果を実現でき、且つ投与用量は等モルで換算したＧ４、Ｇ５、Ｇ７群の投与用量に相当することがわかる。これは、本出願の融合タンパク質の半減期が顕著に延長されたことを示す。

実施例１２：ＴＳＬ－４の薬物動態学分析

１、ＳＤラットへの投与形態

（１）ＳＤラットは、メスとオスを半分ずつ１８匹購入し、動物が適応するように１週間飼養する。

（２）メスとオスを半々に３つのグループに分けて、その体重を記録する。

（３）ＴＳＬ－４は、それぞれ４．１７、１２．５、３７．５ｍｇ／ｋｇで、背中に１回皮下投与し、眼窩から採血するが、サンプリング時点はそれぞれ０ｈ、０．５ｈ、１ｈ、３ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ、８ｈ、１０ｈ、１２ｈ、１６ｈ、２０ｈ、２４ｈ、２８ｈ、４１ｈ、５３ｈ、６５ｈ、７７ｈである。１２０００ｒｐｍ／ｍｉｎで遠心し、上澄み２００μＬを取り、ＰＢＳ溶液を使用して１：３の比率で希釈し、ＥＰ管内に入れて－８０℃の冷蔵庫に保存する。

（４）ペニシリン／ストレプトマイシンを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ法により生体サンプルを測定する。

２、血漿中濃度の検出形態

ペニシリン／ストレプトマイシンを使用するサンドイッチＥＬＩＳＡ法の基本手順の確立

（１）コーティング：ＨＭ－３モノクローナル抗体用コーティング液（ＣＢＳ）を一定濃度で希釈し、ＥＬＩＳＡ用プレートに入れて、一晩コーティングする。

（２）プレートの洗浄：コーティング液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、軽く叩いて乾燥させる。

（３）ブロッキング：ブロッキング液を添加し、３７．５℃でブロッキングし、プレートの洗浄過程を繰り返し、軽く叩いて乾燥させる。

（４）測定するサンプルの添加：ＥＬＩＳＡ用プレートに測定するサンプルを添加し、重複ウェルを設置し、３７．５℃で培養し、プレートの洗浄過程を繰り返し、軽く叩いて乾燥させる。

（５）ペニシリン／ストレプトマイシンの添加：比率に従って希釈したペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、３７．５℃で培養する。プレートの洗浄過程を繰り返し、軽く叩いて乾燥させる。

（６）酵素標識したペニシリン／ストレプトマイシンを添加した反応：５％の脱脂粉乳溶液を利用して一定の比率で希釈したＨＲＰ酵素標識したペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、３７．５℃で培養する。プレートの洗浄過程を繰り返し、軽く叩いて乾燥させる。

（７）基質の添加：一定体積ＬのＴＭＢ基質を添加し、遮光して反応させる。

（８）終了：定量の終了液体を添加し、反応を終了させる。

（９）検出：プレートリーダーでＯＤ４５０ｎｍを読み取る。

３．実験結果

３．１ ＳＤラットに１２．５ｍｇ／ｋｇのＴＳＬ－４を１回皮下注射した薬物動態学研究の結果

ラットに１回の皮下注射で１２．５ｍｇ／ｋｇのＴＳＬ－４を投与した後の血漿中濃度－時間曲線結果は図２０の通りであり、血漿中濃度測定結果は表７の通りであり、薬物動態学パラメータ結果は表１０の通りである。

ＮＡは検出下限よりも低いことを示す。

３．２ ＳＤラットに３７．５ｍｇ／ｋｇのＴＳＬ－４を１回皮下注射した後の薬物動態学実験の結果

ラットに１回の皮下注射で３７．５ｍｇ／ｋｇのＴＳＬ－４を投与した後の血漿中濃度－時間曲線結果は図２１の通りであり、血漿中濃度測定結果は表８の通りであり、薬物動態学パラメータ結果は表１０の通りである。

ＮＡは検出下限よりも低いことを示す

３．３ ＳＤラットに低用量のＴＳＬ－４を１回皮下注射した後の薬物動態学実験の結果

ラットに１回の皮下注射で４．１７ｍｇ／ｋｇのＴＳＬ－４を投与した後の血漿中濃度－時間曲線結果は図２２の通りであり、血漿中濃度測定結果は表９の通りであり、薬物動態学パラメータ結果は表１０の通りである。

ＮＡは検出下限よりも低いことを示す

３．４ ＳＤラットに１回の皮下注射で異なる用量のＴＳＬ－４を投与した薬物動態学的パラメータの比較

ラットに１回の皮下注射で異なる用量のＴＳＬ－４を投与した後の平均血漿中濃度－時間曲線は図２３の通りであり、血漿中ＴＳＬ－４ピーク濃度（Ｃｍａｘ）と投与用量との関係は図２４の通りであり、薬物血中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）と投与用量との関係は図２５の通りであり、主な薬物動態学的パラメータの比較結果は表１０の通りである。

以上の結果によれば、ＳＤラットに高、中、低用量（３７．５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、４．１７ｍｇ／ｋｇ）のＴＳＬ－４を１回皮下注射した後、各用量群のＡＵＣ_０－∞はそれぞれ９００６．６６８±３８５９．５１９、１４７５０１．４±２８３５１．８４、１７６１１０±３９５９６．４５μｇ／Ｌ・ｈであり、投与用量と良好な一次関係（Ｒ^２＝０．９４２１）を形成し、Ｃｍａｘはそれぞれ１．５３１±０．１２２、１４．０４５±３．１８２、３７．８６３±８．３９６μｇ／ｍＬであり、投与用量と良好な一次関係（Ｒ^２＝０．９７２９）を形成し、吸収半減期Ｔ_{１／２ｋａ}はそれぞれ２．８２４±０．６９７ｈ、３．７８８±０．８４８ｈ、４．４７８±０．２２３ｈであり、消失半減期Ｔ_{１／２ｋｅ}はそれぞれ３０．７１０±３．１００ｈ、３２．３２１±４．９３５ｈ、３４．３５６±１．５７８ｈであり、ピーク到達時間Ｔ_ｍａｘはそれぞれ７．４±０．５５ｈ、７±０．７０７ｈ、７±０．７０７ｈである。ＣＬはそれぞれ１．３８３±０．５２８Ｌ／ｈ／ｋｇ、０．０７０７５９±０．０３６９Ｌ／ｈ／ｋｇ、０．０５６９±０．０３３６Ｌ／ｈ／ｋｇである。

高、中、低用量（３７．５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、４．１７ｍｇ／ｋｇ）のＴＳＬ－４を１回皮下注射した後、ＴＳＬ－４はＳＤラット体内で一次反応過程を示し、一次薬物動態学特徴と合致し、Ｃ－Ｔ曲線は２コンパートメントモデルと合致する。高、中、低用量群のＴＳＬ－４のいずれもＴ_{１／２ｋｅ}が比較的長いのは、ＴＳＬ－４がＳＤラット体内で緩やかに消失することを示す。

実施例１３：ＴＳＬ－４組織分布

実験目的：

（１）小動物のＰＥＴ／ＣＴ生体スキャンにより、関節炎モデルラットに^８９Ｚｒ－ＨＭ－３を１回皮下注射した後の足関節及び全身のその他の組織の分布を研究する。

（２）分離された組織をガンマカウントで検出することにより、関節炎モデルラットに^８９Ｚｒ－ＨＭ－３を１回皮下注射した後の足関節及び全身のその他の組織の分布を研究する。

（３）小動物のＰＥＴ／ＣＴ生体スキャンにより、関節炎モデルラットに^８９Ｚｒ－ＨＭ－３を１回足関節腔内注射した後の足関節及び全身のその他の組織の分布を研究する。

実験方法：

ＩＩ型コラーゲン誘導の関節炎モデルラットのモデル構築方法：３ｍＬの不完全フロイントアジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｉｎｃ、バッチ番号１６０１１１）及び３ｍＬのＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｉｎｃ、バッチ番号１６０３４６）を氷上で、乳剤を水中に滴下した時に分散しなくなるまでホモジナイザーで乳化させた。Ｗｉｓｔａｒラット（Ｓｈａｎｇｈａｉ ＳＬＡＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、メス、１３０～１５０ｇ、認証番号２０１５０００５２６３８７、２０１５０００５２７３２０）の尾の複数のポイントに皮内注射（２ポイント、各ポイントごとに０．１５ｍＬの乳剤を注射）して、各ラットに０．３ｍＬの乳剤を注射し、皮膚表面に局所的な隆起を形成した。約２週間後、ラットの発症状況を観察し、称量してスコアを付けた。

関節炎モデルラットにそれぞれ^８９Ｚｒ－ＨＭ－３、遊離^８９Ｚｒを皮下投与した後、１ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、１２０ｈ、１９２ｈの時点で小動物ＰＥＴ／ＣＴを使用して標準ＣＴとＰＥＴ全身スキャンを行い、関節炎モデルラットに^８９Ｚｒ－ＨＭ－３を左足関節腔内投与した後、１ｈ、２４ｈ、４８ｈ、１２０ｈ、１９２ｈ、３６０ｈで小動物ＰＥＴ／ＣＴを使用して標準ＣＴとＰＥＴ全身スキャンを行った。ＣＴ画像を組み合わせて、関節炎モデルラットの心臓、肝臓、肺、腎臓、脳、足関節腔、脊椎、筋肉をスケッチし、上記の組織の放射線吸収値ＳＵＶと％ＩＤ／ｇを得た。

関節炎モデルラットに^８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下投与した後、それぞれ４８ｈ、１２０ｈの時点で、まず標準ＣＴとＰＥＴ全身スキャンを行った後、すぐ微小灌流法で足関節腔液及び全血、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸（幽門部付近）、膵臓、脊椎、筋肉、生殖腺、脳組織を採取し、称量後に放射免疫測定用管に入れ、ガンマカウントで関節腔液、全血及び組織中の放射線吸収値を検出する。ガンマカウント結果により、関節炎モデルラットの血液及び組織中の放射線吸収値％ＩＤ／ｇを算出した。

ａ：投与後１ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈの時点で複数ベッドの全身スキャン（ベッドごとに１０ｍｉｎＰＥＴスキャン）を、１２０ｈ、１９２ｈの時点で複数ベッドの全身スキャン（ベッドごとに１５ｍｉｎＰＥＴスキャン）、３６０ｈの時点で複数ベッドの全身スキャン（ベッドごとに２０ｍｉｎＰＥＴスキャン）を行う。
ｂ：心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胃、小腸（幽門部付近）、膵臓、脊椎、筋肉、生殖腺、脳を含む１２の臓器の組織を採取する。
ｃ：関節炎モデルラットのスキャンの１０ｍｉｎ前に麻酔する。具体的な麻酔方法は、３～５％のイソフルラン、０．５～２Ｌ／ｍｉｎの空気を使用してＳＤラットの麻酔を誘導し、１～３％イソフルラン、０．５～１Ｌ／ｍｉｎの空気を使用してＳＤラットの麻酔を維持する。実験過程において、最初の記録表に動物の体重、初回の注射用量及び測定時間、注射時間、残留用量及び測定時間、小動物ＰＥＴ／ＣＴの異なる時点のスキャン時間等の詳細情報を正確に記録する。

実験結果

１．被験物質の標記

表１３～１５に示すように、バッチ番号１６１２１５０１、１６１２１５０２、Ｌ１７０１１１０１の^８９Ｚｒ－ＨＭ－３の品質制御は実験要求を満たしている。

２．ＰＥＴ／ＣＴスキャン実験

表１６に示すように、関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した後、１ｈの時点で腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（０．０４±０．０１）、その次は肺＞左足関節腔＝右足関節腔＝脊椎＞心臓＝筋肉＞肝臓である。１２ｈの時点で心臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（０．９０±０．０４）、その次は腎臓＞肝臓＞肺＞左足関節腔＞右足関節腔＞脊椎＞筋肉である。２４ｈの時点で腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（１．２８±０．０５）、その次は心臓＞肝臓＞左足関節腔＞右足関節腔＞肺＞脊椎＞筋肉である。４８ｈの時点に腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（２．０８±０．１９）、その次は心臓＞右足関節腔＞肝臓＞左足関節腔＞肺＞脊椎＞筋肉である。１２０ｈの時点で腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（３．８９±０．０８）、その次は脊椎＞肝臓＞心臓＞右足関節腔＞左足関節腔＞肺＞筋肉である。１９２ｈの時点で腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（４．４２±０．１１）、その次は脊椎＞肝臓＞右足関節腔＞左足関節腔＞心臓＞肺＞筋肉である。

関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した後、心臓は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も低く（０．０１±０．０１）、２４ｈの時点で最も高くなり（１．０２±０．１２）、その後経時的に徐々に低下する。肺、左足関節腔、右足関節腔は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も低く、それぞれ０．０４±０．０６、０．０１±０．００、０．０１±０．００であり、４８ｈの時点で最も高くなり、それぞれ０．５０±０．０９、０．５２±０．０９、０．７３±０．４２であり、その後経時的に徐々に低下する。肝臓、腎臓、脊椎は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も低く、それぞれ０．００±０．００、０．０４±０．０１、０．０１±０．００であり、経時的に徐々に増加し、１９２ｈの時点で最も高くなり、それぞれ１．０２±０．２７、４．４２±０．１１、１．０２±０．０５である。筋肉は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も低く（０．０１±０．０１）、１２０ｈの時点で最も高くなる（０．１４±０．０４）。具体的な結果は図２６の通りである。

表１７に示すように、関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した後、４８ｈの時点で、まずＰＥＴ／ＣＴスキャンをした後、組織を採取してガンマカウントすると、腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（２．６０±０．０９）、その次は心臓＞肝臓＞肺＞脊椎＞左足関節腔＞右足関節腔＞筋肉である。関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した後、１２０ｈの時点でまずＰＥＴ／ＣＴスキャンをした後、組織を採取してガンマカウントすると、腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（３．７２±０．７０）、その次は心臓＞肝臓＞脊椎＞肺＞左足関節腔＞右足関節腔＞筋肉である。具体的な結果は図２７の通りである。

表１８に示すように、関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を左足関節腔内注射した後、１ｈの時点で左足関節腔の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（４２．２０±１７．３３）、その次は心臓＞肝臓＞腎臓＞肺＞右足関節腔＞脊椎＞筋肉である。２４ｈの時点で左足関節腔の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（６．５０±３．０６）、その次は腎臓＞心臓＞肝臓＞肺＞右足関節腔＞脊椎＞筋肉である。４８ｈの時点で左足関節腔の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（２．７５±０．６４）、その次は腎臓＞心臓＞右足関節腔＞肝臓＞肺＞脊椎＞筋肉である。１２０ｈの時点で腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（２．７８±０．４４）、その次は左足関節腔＞肝臓＞右足関節腔＞脊椎＞心臓＞肺＞筋肉である。１９２ｈの時点で腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（３．０４±０．５２）、その次は左足関節腔＞肝臓＞脊椎＞右足関節腔＞心臓＞肺＞筋肉である。３６０ｈの時点で腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（２．７０±０．５４）、その次は左足関節腔＞脊椎＞肝臓＞右足関節腔＞心臓＞肺＞筋肉である。

関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を左足関節腔内注射した後、心臓、肺は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇがそれぞれ０．５９±０．９４、０．２５±０．４２であり、２４ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高くなり、それぞれ１．１５±０．１４、０．７１±０．３９であり、その後経時的に徐々に低下する。左足関節腔は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（４２．２０±１７．３３）、その後経時的に徐々に低下し、３６０ｈの時点で最も低くなる（１．６９±０．２９）。右足関節腔、筋肉は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も低く、それぞれ０．１１±０．１８、０．０６±０．１０であり、４８ｈの時点で最も高くなり、それぞれ０．７３±０．０５、０．１９±０．０３であり、その後経時的に徐々に低下する。肝臓は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も低く（０．４０±０．６５）、２４ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高くなり（０．８８±０．２１）、その後経時的にわずかに低下する。腎臓は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も低く（０．３９±０．５７）、１９２ｈの時点で最も高くなり（３．０４±０．５２）、その後経時的に徐々に低下する。脊椎は１ｈの時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も低く（０．１０±０．１７）、その後経時的に徐々に増加し、３６０ｈの時点で最も高くなる（０．８２±０．１３）。具体的な結果は図２８の通りである。

表１９に示すように、２ｈの時点で心臓の放射性％ＩＤ／ｇが最も高く（１．０８）、その次は腎臓＞肝臓＝脊椎＞肺＞右足関節腔＞筋肉＞左足関節腔であり、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、１２０ｈ、１９２ｈの時点で、脊椎の放射性％ＩＤ／ｇがいずれも最も高く、それぞれ２．４３、３．６４、４．０５、５．３５、５．３８であり、いずれも同じ時点の他の組織よりはるかに高い。

３．ガンマカウント実験

表２０に示すように、関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した後、４８ｈの時点で全血及び組織を採取すると、全血の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（２．３２±０．２０）、その次は肺＞腎臓＞生殖腺＞肝臓＞脾臓＞心臓＞腸＞脊椎＞関節腔液＞膵臓＞胃＞筋肉である。実験動物に８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した後、１２０ｈの時点で全血及び組織を採取すると、腎臓の放射線吸収％ＩＤ／ｇが最も高く（２．１６±１．９４）、その次は全血＞肺＞生殖腺＞脾臓＞関節腔液＞肝臓＞腸＞脊椎＞膵臓＞心臓＞胃＞筋肉である。具体的な結果は図２９の通りである。

４．結果

実験結果によれば、遊離８９Ｚｒは投与１２ｈ後、主に骨格に分布され、８９Ｚｒは１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、１２０ｈ、１９６ｈの時点で骨格中の放射線吸収％ＩＤ／ｇが他の組織よりはるかに高い。これは、８９Ｚｒ－ＨＭ－３が関節炎モデルラット体内で実質的に、比較的安定であることを示す。脳は全時点で放射線吸収％ＩＤ／ｇが非常に低く、同じ時点の筋肉の放射線吸収％ＩＤ／ｇに近接するか、それより低い。これは８９Ｚｒ－ＨＭ－３が血液脳関門を透過しにくいことを示す。関節炎モデルラットに８９Ｚｒ－ＨＭ－３をそれぞれ皮下注射、左足関節腔内注射した後、心臓の放射線吸収は２４ｈの時点でいずれも最も高く、その後経時的に徐々に低下し、足関節腔（非投与部位）の放射線吸収は４８ｈの時点でいずれも最も高く、その後経時的に徐々に低下し、腎臓、肝臓の放射線吸収は経時的に徐々に上昇するか、又は高いレベルを維持する。

表２１に示すように、ＤＡＳ３．２．８ソフトウェアによる非コンパートメントモデル分析において、８９Ｚｒ－ＨＭ－３を皮下注射した関節炎モデルラットの半減期は１２０．６８±３１．９９ｈであり、８９Ｚｒ－ＨＭ－３を左足関節腔内注射した関節炎モデルラットの半減期は９８．３５±３６．８３ｈである。

実施例１４：ＨＭ－３融合タンパク質ＴＳＬ－４の過酸化水素で損傷した骨組織細胞に対する保護作用

１、実験方法

全ての細胞実験は無菌の安全キャビネット内で操作し、操作台は使用前後に無菌（ＵＶ照射及び７５％医療用アルコール）処理を行うことと、細胞の廃液を廃液容器に収集し、実験中に用いられた廃棄ピペット及びピペットチップは高圧滅菌袋に入れて、後に高圧滅菌消毒を行うこととした。

軟骨細胞はＴ７５フラスコで３～４日培養した。融合率が８０％に到達した後、元の培養液を除去し、無菌ＰＢＳを添加して細胞を２～３回洗浄した後、適量の消化液を添加して、細胞が（培養容器）壁から離れた後に再び新しい培養液を添加した。遠心で消化液を含む細胞液を除去し、再び適量の新鮮な培養液を添加し、適切な濃度の細胞懸濁液に調製して、細胞継代又は細胞実験に用いた。細胞継代は、Ｐ１からＰ５が終わるまで、各継代ごとに凍結保存した。継代数がＰ２～Ｐ５である細胞を細胞実験に用いた。

２００μＬ／ウェルの接種量で、密度が２．５＊１０^４個／ｍＬである細胞懸濁液を９６ウェルの細胞培養プレートに接種し、合計３グループを調製し、１つのグループは対照群であり、他の２つのグループは過酸化水素を投与して刺激した。なお、無細胞の培養液を調製しブランク群とした。グループごとに重複ウェルを４～５とした。細胞培養プレートをインキュベーターに入れて、２４時間培養した。２日目に、培養液を異なる実験グループに交換し、グループごとの投与体積は１００μｌであり、それぞれ２４時間又は４８時間培養した。

実験プランに従って培養を終了した後、各実験グループは細胞培養体積の１／１０にそれぞれ１０μＬの５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴを添加して、細胞とＭＴＴとをインキュベーターで４時間培養した。その後、上澄み液を慎重に除去し、次いで、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、均一混合後、プレートリーダーにおいて、試験波長５７０ｎｍで、吸光度を測定した。細胞の相対活性比（％）計算式：実験グループの吸光度（ウェルごと）／対照群吸光度の平均値＊１００％。全ての実験グループは平均数±標準偏差（式３）で表す。グループ間の差異は、Ｐｒｉｓｍ７．０ソフトウェアで分析し、一元配置分散分析で検定した。＊Ｐ＜０．０５は統計的差を有し、＊＊Ｐ＜０．０１は統計的有意差を、＊＊＊Ｐ＜０．００１は統計的極大有意差を意味する。

式３

２、主な実験材料

（１）ラットの軟骨細胞、商品番号：ＲＡＴ－ｉＣｅｌｌ－ｓ００３、ｉＣｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ。

（２）モデル構築製剤：ＬＩＲＣＯＮ医療用アルコールである３％過酸化水素消毒液（Ｈ_２Ｏ_２、過酸化水素）（０．９Ｍ）、バッチ番号：１７０９２８、ＳｈａｎＤｏｎｇ ＬＩＲＣＯＮ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ｃｏｍｐａｎｙ。

（３）細胞培養液系：初代軟骨細胞のベース培養液＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％細胞培養添加剤＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）（商品番号：ＰｒｉＭｅｄ－ｉＣｅｌｌ－０２０、ｉＣｅｌｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ）

（４）細胞継代関連の試薬：ＰＢＳ滅菌生理食塩水（ｐＨ＝７．２）（商品番号：Ｃ０２２１Ａ、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；消化液：０．０２％ＥＤＴＡ及び０．２５％トリプシン含有溶液（商品番号：２５２０００５６、Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；一般の熱失活滅菌血清（商品番号：１０１００１４７、ｇｉｂｃｏ社）。

（５）ＭＴＴ関連試薬：ＭＴＴ（チアゾールブルー）（商品番号：Ｍ２１２８－５００ｍｇ、ｓｉｇｍａ社）；ＤＭＳＯ（Ｄ５８７９－５００ｍｌ、ｓｉｇｍａ社）。

３．実験結果

実験１：過酸化水素のモデル構築時間と用量の最適化

過酸化水素の実験濃度範囲は０．０１、０．１、０．５、１、１０ｍＭである。過酸化水素のモデル構築時間と用量を確定するために、２４時間、４８時間及び７２時間の３つのモデル構築時間を選択し、各用量の過酸化水素は２つの検出ウェルを準備した。

上記の結果によれば、軟骨細胞は過酸化水素に刺激されてから２４時間、４８時間及び７２時間後の細胞活性の変化が類似し、細胞活性は過酸化水素濃度の上昇につれて低下した。また、１ｍＭと１０ｍＭの過酸化水素のいずれも、この３つの時点で対照群（０ｍＭ過酸化水素）より濃度が顕著に低下したので、過酸化水素のモデル構築時間は２４時間とした。なお、過酸化水素の用量選択は、対照群に対する相対活性が０．５程度であるのが最適である。実験結果は、過酸化水素の用量は０．１～１ｍＭの範囲内で選択すべきであることを示す。

実験２：ＨＭ－３融合タンパク質ＴＳＬ－４の用量の最適化

ＴＳＬ－４の選択される濃度範囲は０．１、０．３、１、３、９、２７μＭである。

ＴＳＬ－４の軟骨細胞の細胞活性に対する影響の有無を特定するために、２４時間、４８時間及び７２時間の３つの培養時間を選択し、各用量のＴＳＬ－４溶液は２つの検出ウェルを準備した。

上記の結果によれば、ＴＳＬ－４は２４時間、４８時間及び７２時間で細胞活性に対して顕著な影響がなく、且つ各用量のＴＳＬ－４と対照群（０μＭ ＴＳＬ－４）とは有意差がない。このため、ＴＳＬ－４の投与時間は２４時間とした。ただし、ＴＳＬ－４の用量は１～２７μＭの範囲内で差異がないので、再度低用量のＴＳＬ－４の細胞活性に対する影響を検出すべきである。

上記の結果によれば、ＴＳＬ－４の０．１～３μＭの範囲内における細胞活性に対する影響に顕著な差異がない。

前期実験の各濃度のＴＳＬ－４のいずれも細胞活性に対して影響がないため、ＴＳＬ－４原溶液の濃度（２９３μＭ）に基づき、１：５の希釈比率に従って、２９．３μＭから０．２３μＭに希釈した。

同様に、各濃度のＴＳＬ－４（０．２３～２９．３μＭ）及び軟骨細胞を２４時間培養すると、細胞活性に対して大きな変化がないので、０．２３、１．１７、５．８６、２９．３μＭを後続実験におけるＴＳＬ－４の投与濃度として選択した。

実験３：ＴＳＬ－４の過酸化水素で損傷した軟骨細胞に対する保護作用の検出

ＴＳＬ－４の過酸化水素で損傷した軟骨細胞に対する保護作用を検出するために、実験は合計３グループに分けた。それぞれ対照群（過酸化水素とＴＳＬ－４とを含有せず、新鮮な培養液のみを添加）、過酸化水素のモデル構築群（異なる濃度の過酸化水素を含有する細胞培養液のみを添加）及びＴＳＬ－４投与群（過酸化水素含有）である。ＴＳＬ－４の過酸化水素で損傷した軟骨細胞に対する保護作用を検出するために、ＴＳＬ－４と過酸化水素とを軟骨細胞とともに２４時間培養した。過酸化水素の用量は０．１、０．２５、０．５、１ｍＭを選択し、ＴＳＬ－４の用量は０．２３、１．１７、５．８６、２９．３μＭである。

異なる用量の過酸化水素存在の条件下で、適量濃度のＴＳＬ－４と軟骨細胞を２４時間培養し、各投与群における細胞の相対活性（対照群に対する相対吸光度％）は以下式４により以下のように表される。

式４

上記の結果によれば、０．２５ｍＭと０．５ｍＭの過酸化水素濃度における１．１７μＭ又は５．８６μＭのＴＳＬ－４は過酸化水素で損傷した軟骨細胞の活性を顕著に改善できる。なお、０．１ｍＭの過酸化水素の刺激下で、０．２３μＭと２９．３μＭのＴＳＬ－４及び過酸化水素群は細胞活性に対して顕著な阻害作用を有し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。

実施例１４の実験１において、測定された過酸化水素の最適なモデル構築濃度は０．１～１ｍＭの範囲内であり、この実験で過酸化水素の濃度を０．５ｍＭと１ｍＭとした場合、細胞活性比（％）はいずれも約５％付近まで低下した。これは、過酸化水素のモデル構築が不安定で、結果に差異が発生しやすいことを示す。この原因は、異なる軟骨細胞の継代数（この実験の軟骨細胞継代数はＰ４である）が軟骨細胞の抗酸化能力を低下させたためであり得る。文献から知られていることによれば、軟骨細胞は２Ｄ単細胞培養環境下で、細胞が線維化しやすく、その発現するＩＩ型コラーゲンタンパク質と多糖のいずれも減少していた。ＴＳＬ－４の過酸化水素で損傷した軟骨細胞に対する保護作用を正確に検出するために、上記の実験結果によれば、過酸化水素のモデル構築濃度が０．５ｍＭより低くなるべきであるが、０．２５ｍＭの濃度の過酸化水素が軟骨細胞を刺激する細胞活性比は７０％程度であるので、０．２５ｍＭ～０．５ｍＭの過酸化水素濃度範囲内で別の濃度、例えば０．３５ｍＭの濃度の過酸化水素を選択する必要がある。なお、過酸化水素濃度が０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭである場合、ＴＳＬ－４の最適な投与濃度が１．１７μＭと５．８６μＭであるときに統計学差異を有し（Ｐ＜０．０５）、逆に、０．２３μＭと２９．３μＭの濃度のＴＳＬ－４投与実験は０．１ｍＭの過酸化水素が、軟骨細胞活性の刺激に対して顕著な細胞活性阻害を有する。このため、実験を２回繰り返し、ＴＳＬ－４の投与濃度は１．１７μＭと５．８６μＭとした。

０．２５ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．５ｍＭのモデル構築製剤である過酸化水素が存在する条件下で、１．１７μＭと５．８６μＭのＴＳＬ－４と軟骨細胞を２４時間培養し、各投与群における細胞の相対活性（対照群に対する相対吸光度％）は以下式５により以下のように表される。

式５

上記の結果から、３つの用量の（０．２５ｍＭ、０．３５ｍＭ、０．５ｍＭ）過酸化水素の刺激下で、１．１７μＭと５．８６μＭのＴＳＬ－４のいずれも過酸化水素で損傷した軟骨細胞の活性に対する改善効果を発現するが、ただし、０．３５ｍＭの過酸化水素条件下で、５．８６μＭのＴＳＬ－４が軟骨細胞に対して顕著な細胞活性の改善作用を有する。一元配置分散分析で各投与群と対応濃度のモデル群との差異を比較し、＊は統計学差異があることを示し、Ｐ＜０．０５である。このため、５．８６μＭのＴＳＬ－４を０．２５～０．５ｍＭの過酸化水素とともに２４時間培養すると、モデル群は過酸化水素で損傷した軟骨細胞の活性を顕著に改善できる。

以上、まとめると、ＴＳＬ－４を過酸化水素とともに培養する場合、軟骨細胞活性に対して比較的に顕著な改善作用を有するので、ＴＳＬ－４を過酸化水素とともに２４時間培養するのが最適な投与時間である。過酸化水素のモデル構築濃度が０．２５～０．５の範囲内である場合、ＴＳＬ－４とともに培養すると比較的顕著な細胞活性の改善作用を有するが、ＴＳＬ－４の投与濃度は１．１７μＭと５．８６μＭの条件下で、比較的高い細胞活性の改善作用を有する。

Claims (9)

1. 活性ポリペプチドＨＭ－３とヒト由来ＩｇＧ－Ｆｃフラグメント又はＩｇＧ－Ｆｃ突然変異体フラグメントが連結して形成され、連結形態は、ＨＭ－３がリンカーペプチドを介して又は直接ヒト由来ＩｇＧ－Ｆｃフラグメント又はＩｇＧ－Ｆｃ突然変異体フラグメントのＮ末端と連結するか、又はＣ末端と連結するか、又はＣ、Ｎ末端と同時に連結する形態であり、その一般式は（ＨＭ－３）_ｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＩｇＧ－Ｆｃ、ＩｇＧ－Ｆｃ－Ｌｉｎｋｅｒ－（ＨＭ－３）_ｎ、又は（ＨＭ－３）_ｎ－Ｌｉｎｋｅｒ－ＩｇＧ－Ｆｃ－Ｌｉｎｋｅｒ－（ＨＭ－３）_ｎであり、ここで、ｎは１、２、３、４又は５から選択され、
   前記リンカーペプチドは、
   （１）（ＧＧＧＧＳ） _ａ 、ここで、ａは１、２、３、４、５又は６である、
   （２）Ａ（ＥＡＡＡＫ） _ｂ Ａ、ここで、ｂは１、２、３、４、５又は６である、
   （３）（ＡＰ） _ｃ 、ここで、ｃは１～１８である、
   （４）Ｇ _ｄ 、ここで、ｄは１～１５である、
   から選択されることを特徴とする融合タンパク質。
2. 前記リンカーペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）_ａ配列であり、繰り返し数ａが３、４又は５から選択されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 前記ＩｇＧ－Ｆｃ配列は、ヒト由来ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ又はその突然変異体であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
4. 前記融合タンパク質は、
   ＴＳＬ－１融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＩｇＧ２－Ｆｃ、
   ＴＳＬ－２融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ、
   ＴＳＬ－３融合タンパク質：ＩｇＧ２－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３、
   ＴＳＬ－４融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３、
   ＴＳＬ－１３融合タンパク質：ＨＭ－３－（ＧＧＧＧＳ）_３－ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３、
   ＴＳＬ－１４融合タンパク質：ＨＭ－３－ＨｙＦｃ、
   ＴＳＬ－１５融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－Ｇ５－ＨＭ－３－Ｇ８－ＨＭ－３、
   ＴＳＬ－１６融合タンパク質：ＨｙＦｃ－（ＧＧＧＧＳ）_３－ＨＭ－３、
   ＴＳＬ－１７融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－Ａ（ＥＡＡＡＫ）_４Ａ－ＨＭ－３、
   ＴＳＬ－１８融合タンパク質：ｍＩｇＧ４－Ｆｃ－（ＡＰ）_９－ＨＭ－３
   から選択されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
5. 遺伝子組み換え技術を採用して調製し、ここで採用される発現細胞は、酵母、ＣＨＯ、ＳＰ２／０、ＢＨＫ及び／又はＨＥＫ２９３から選択されることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
6. 医薬用途に適合する、注射剤、カプセル、錠剤、丸薬、点鼻スプレー又はエアゾールから選択される製剤の形で存在し、投与形態は経口、静脈注射、静脈点滴、皮下又は筋肉注射からなる、請求項１に記載の融合タンパク質を含有する薬物組成物。
7. 自己免疫疾患、新生血管疾患、骨関節炎治療用の薬物の調製における請求項１に記載の融合タンパク質の使用。
8. 請求項７に記載の自己免疫疾患は、関節リウマチである。
9. 請求項７に記載の新生血管疾患は、滲出型加齢黄斑変性である。

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