KR20010006392A - 안정한 활성 인체 ｏｂ 단백질 및 항체 ｆｃ 사슬 복합체를 함유하는 조성물 및 방법 - Google Patents
안정한 활성 인체 ｏｂ 단백질 및 항체 ｆｃ 사슬 복합체를 함유하는 조성물 및 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 OB 단백질 조성물 및 그와 관련된 방법에 관한 것이다. 본 발명은 생리학적 pH 에서 안정한 활성 OB 단백질 현탁액을 제공한다. 그러한 OB 단백질 현탁액은 비만 체중 수치, 당뇨병 및 다른 증상의 치료 또는 조절에 있어 유용하다.
Description
비만증에 대한 분자적 근거는 잘 알려져 있지 않지만, "OB 유전자" 와 코딩 단백질("OB 단백질")을 확인함으로써 체지방 침적을 조절하는 데에 신체 메카니즘을 이용하는 방법이 부분적으로 밝혀졌다[Zhang 등의 Nature 372 : 425 - 432 (1994) ; 및 Nature 374 : 479 (1995) 의 교정본 참조]. 발명의 명칭이 "체중 조절 인자, 그에 해당하는 핵산과 단백질 및 그것의 진단적 용도와 치료학적 용도" 이고, 1996년 2월 22일자로 공개된 PCT 공개 번호 제 WO 96/05309 호에는 OB 단백질 및 이와 관련된 조성물 및 방법에 관하여 상세히 기술되어 있으며, 이 문헌은 본원에서 참고문헌으로 인용되었다. 인체 OB 단백질에 대한 아미노산 서열은 제 WO 96/05309 호(본원에서 참고문헌으로 인용됨)의 서열 번호 : 4 및 6(공개 공보의 p 172 - 174 에 기술되어 있음)에 기술되어 있으며, 성숙 단백질의 초기 아미노산 잔기는 22 에 위치하며 발린 잔기이다. 성숙한 단백질은 146 개(또는 위치 49 의 글루타민이 없을 경우에는 145, 서열 번호 : 6 참조)의 잔기로 이루어진다.
OB 단백질은 정상인 야생형 마우스는 물론 ob/ob 돌연변이 마우스(OB 유전자 산물 제조시에 결함으로 인해 비만해진 마우스)에서도 생체내 활성도를 갖는다. 생물학적 활성도는 무엇보다도 체중 감량으로 나타난다[Barinaga, "obese" Protein Slims Mice, Science 269 : 475 - 476 (1995) 및 Friedman, "The Alphabet of Weight Control," Nature 385 : 119 - 120 (1997) 개괄 참조]. 예를들어, ob/ob 돌연변이 마우스에 있어서 OB 단백질 투여로 인해 혈청 인슐린 수준과 혈청 글루코스 수준이 감소하는 것으로 알려져 있다. 또한 OB 단백질을 투여하면 체지방이 감소하는 것으로도 알려져 있다. 이러한 현상은 비만이 아닌 정상 마우스 뿐만 아니라 ob/ob 돌연변이 마우스에서도 관찰되었다[Pelleymounter 등의 Science 269 : 540 - 543 (1995) ; Halaas 등의 Science 269 : 543 - 546 (1995) 참조]. 또한 Campfield 등의 Science 269 : 546 - 549 (1995) 문헌도 참조하라(OB 단백질의 마이크로그램 투여량을 말초 및 중추 투여하면 ob/ob 및 음식물에 의해 유래된 비만이지만 db/db 비만은 아닌 마우스의 체중 및 음식물 섭취를 감소시켰다). 그러나 이러한 보고서 중 어느 것에도 최고치의 투여량에서 조차 독성에 관하여 관찰한 것은 없었다.
인체 투여용 제약학적 조성물을 제조할 경우에, 인체 아미노산 서열은 약 2 mg 활성 단백질/ml 이상처럼 상대적으로 높은 농도의 생리학적 pH 에서 불용성인 것으로 나타났다. 인체와 같은 고등 포유동물 내로 치료학적 유효량을 주사하기에는 .5 mg/kg/일 또는 1.0 mg/kg/일이나 그 이하의 범위와 같은 킬로그램 체중 당 밀리그램 단백질 투여량이 바람직하다. 주사량이 많아지는 것을 피하기 위해 단백질 농도를 증가시키는 것이 필수적인데, 이것이 환자에게 불쾌함이나 고통을 줄 수도 있다.
재조합 DNA 기술의 발달과 더불어, 치료학적 용도의 재조합 단백질의 이용성에서도 단백질 제제형이 발달되었다. 단백질 변이 및 융합 단백질에 관하여 기술하고 있는 논문에는 Francis, Focus on Growth Factors 3 : 4 - 10 (1992) 가 있다.
이러한 변이 중 하나는 면역글로불린의 Fc 부위를 이용하는 것이다. 항체는 두 개의 기능상 독립적인 부분을 포함하는데, 그 중 하나는 항원에 결합하는 가변 도메인으로서 "Fab" 로 알려져 있으며 다른 하나는 보체 세포나 식세포와 같은 효과 작용기에 결합하는 불변 도메인으로서 "Fc" 로 알려져 있다. 면역 글로불린의 Fc 부분은 긴 세포질 반감기를 갖는 반면에, Fab 의 반감기는 짧다[Capon 등의 Nature 337 : 525 - 531 (1989) 참조].
치료학적 단백질은 긴 반감기를 갖도록 Fc 도메인을 사용하여 구성하거나, 면역글로불린의 Fc 단백질에 모두 존재하는 Fc 수용체 결합 기능, 단백질 A 결합 기능, 보체 결합 기능 및 태반 전달 기능 등을 결합하여 구성하였다. 동일문헌을 참조하라. 예를들어 IgG1 항체의 Fc 부위를, 호지킨병 종양 세포, 퇴행성 림프종 세포, T-세포 백혈병 세포 및 그외의 악성 세포 형태에서 발현되는 CD30 수용체에 결합하는 분자인 CD30-L 의 N-말단 단부에 융합시켰다[미국 특허 번호 제 5,480,981 호 참조]. 시토킨의 짧은 혈행 반감기를 늘리기 위해 항-염증제이자 항-거부반응제인 IL-10 을 마우스의 Fcγ2a 와 융합시켰다 [Zheng, X. 등의 The Journal of Immunology, 154 : 5590 - 5600 (1995) 참조]. 인체 IgG1 의 Fc 단백질과 결합시킨 종양 괴사 인자 수용체를 패혈쇽 환자 치료에 이용하는 것에 관하여도 연구되었다[Fisher, C. 등의 N. Engl. J. Med., 334 : 1697 - 1702 (1996) ; Van Zee, K. 등의 The Journal of Immunology, 156 : 2221 - 2230 (1996) 참조]. 또한 Fc 를 CD4 수용체와 융합시켜 AIDS 치료용 치료 단백질을 생산하기도 하였다[Capon 등의 Nature, 337 : 525 - 531 (1989) 참조]. 그외에도, 인터루킨 2 의 짧은 반감기를 극복하고 그것의 전신 독성을 완화시키기 위해 인터루킨 2 의 N-말단을 IgG1 또는 IgG3 의 Fc 부분과 융합시켰다 [Harvill 등의 Immunotechnology, 1 : 95 - 105 (1995) 참조].
인슐린의 경우, 현탁액 제제에 관하여 보고되어 있다. 그러나 인슐린을 적용할 수 있는 조건이 OB 단백질을 포함한 다른 모든 단백질에 적용되는 조건이 되는 것은 아니다. 인슐린은 특별한 물리학적·화학적 특성을 갖는 상당히 작은 단백질로서 이러한 특성은 제제화 조건을 결정하는 데 있어 중요하다. Brange, Galenics of Insulin, Springer-Verlag 1987 문헌은 인슐린 현탁액에 관하여 기술하고 있다(p. 36) ; Schlichtkrull 등의 문헌 또한 참조하라. 지속적인 효과를 갖는 인슐린 제제에 관하여는 Hassellblatt 등의 Handbook of Experimental Pharmacology New Series, Vol. XXXII-1/2 Springer-Verlag Berlin, Heidelburg, New York (1975) 문헌의 pp. 729 - 777 에 기술되어 있다.
현재까지, 생리학적 pH 및 적어도 약 2 mg/ml 농도에서 안정한 인체 OB 단백질 제제에 관하여 보고된 것은 없으며, 더욱이 적어도 약 50 mg/ml 또는 그 이상의 농도에서 안정한 활성 인체 OB 단백질에 관하여 보고된 것은 없다. 동결형이나 동결건조형은 보관시에는 보다 안정하지만, 본원에서 기술한 바와 같이 즉석에서 제조하여 사용하는 현탁액 형태보다는 덜 바람직하다. 동결형은 일정한 동결 온도에서 보관해야 하는데, 일반 소비자들이 사용하는 냉장고와 냉동기로는 그것의 해동 주기 때문에 일정한 온도를 유지하는 것이 불가능하다. 또한, 동결건조형은 희석 및 혼합 단계가 필요하므로 불편하고, 환자의 순응도를 떨어뜨릴 수 있다. 생산자의 입장에서 볼 때, 동결 액체를 제조, 보관 및 운송하는 비용이 비쌀 뿐 아니라 즉석에서 제조하여 사용하는 제제형보다 훨씬 복잡한 관리가 필요하다. 또한, 동결건조 제제형에 사용할 수 있는 적당한 희석액을 제조하는 것은 이러한 희석 단계를 필요로 하지 않는 것에 비해 비용도 많이 들 뿐 아니라 비효율적이다. 적은 부피로 주사할 수 있는 활성 OB 단백질을 함유하는 인체 제약학적 조성물의 농축형의 필요성이 요구된다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 특정한 현탁액 제제형이 생리학적 pH 와 적어도 약 2 mg/ml 의 농도에서 안정한 OB 단백질의 제제라고 생각하는 관찰에서 유래한다. 본원에서 사용한 '생리학적 pH' 라는 용어는 pH 약 6.0 에서 8.0 을 나타낸다. 그러한 조성물을 사용하여 치료용 OB 단백질의 상대적 저용량을 적출하였다. 본원에서 상세하기 설명한 바와 같이, 침전제를 사용하여 다음과 같은 특징을 갖는 인체 OB 단백질의 현탁액을 제조하였다 :
1. 용액 형태의 인체 OB 단백질에 비해 향상된 생리학적 pH 에서의 안정성.
10 mg/ml 또는 그보다 높은 농도와 pH 7 에서의 인체 OB 단백질 현탁액은 하기 실시예에 설명되어 있다. 이 인체 OB 단백질 현탁액을 발전된 HPLC 로 용해(생리학적 pH 가 아닌 천연형에서 인체 OB 단백질에 대한 pH 4) 가능한 가장 높은 pH 용액에 동일한 농도로 비교하였다. 또한 하기에 설명한, 5 mg/ml 의 농도와 pH 7 에서의 Fc-OB 융합 단백질 현탁액은 저장시에 비교되는 Fc-OB 융합 단백질 용액에서 보다 덜 분해한 산물을 나타낸다.
2. 용액 형태의 인체 OB 단백질과 비교한 인체 OB 단백질 현탁액의 주사 시기에 따른 서방성 프로필.
실시예에서는 본 발명에서 고도로 농축된 인체 OB 단백질 현탁액을 사용한 서방성 효과를 하기에 기술할 것이다. 그러한 서방성 효과는 물질의 활성도가 상대적으로 오랜 기간동안 유지되며 용액내에 인체 OB 단백질과 비교한 바와 같이 상대적으로 높은 효력과 소량을 주입해도 된다는 점에서 유리하다.
따라서 본 발명의 목적은 적어도 약 2 mg 단백질/ml 농도를 나타내는 생리학적 pH 에서 활성 인체 OB 단백질의 안정한 제제에 관한 것이다. 예를들어, 적어도 2 mg/ml 의 농도와 pH 7.0 에서 활성 인체 OB 단백질의 안정한 제제가 제공된다. 상기 제한 농도는 인체에 투여가 유효한 현탁액 형태이며, 하기에 기술한 바와 같이, 실시예에서는 생리학적 pH(예를들어 pH 6.0 과 pH 8.0 사이임)에서 100 mg/ml 만큼 높은 농도를 제공한다.
다른 면에서, 본 발명은 적어도 약 10 mg/ml 농도를 나타내는 pH 범위가 약 6.0 에서 8.0 내에 활성 인체 OB 단백질의 안정한 제제에 관한 것이다.
여전히 다른 면에서, 본 발명은 약 6.0 내지 8.0 의 pH 와 적어도 약 0.5 mg/ml 의 농도에서 면역글로불린의 Fc 부위를 부착하여 유도된 활성 인체 OB 단백질의 안정한 제제에 관한 것이다. 특히, 약 pH 7.5 와 5 mg/ml 내지 50 mg/ml 의 농도에서 활성 Fc-OB 융합 단백질의 안정한 제제를 제공한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 2 mg 단백질/ml 또는 그보다 높은 농도와 pH 6.5 내지 7.5 에서 안정한 활성 인체 OB 단백질의 제제형을 제공한다. 특별히, 20 mg/ml 내지 100 mg/ml 의 농도와 pH 7.0 에서 안정한 활성 인체 OB 단백질의 제제형을 제공한다.
다른 면에서, 본 발명은 10 mg/ml 또는 그보다 높은 농도와 pH 5.0 내지 8.0 에서 안정한 활성 인체 OB 단백질의 제제형을 제공한다.
여전히 다른 면에서, 본 발명은 0.5 mg/ml 또는 그보다 높은 농도와 pH 6.0 내지 8.0 에서 면역글로불린의 Fc 부위를 부착하여 유도된 안정한 활성 인체 OB 단백질의 제제형을 제공한다. 특별히, 5 mg/ml 내지 50 mg/ml 의 농도와 약 pH 7.5 에서 안정한 활성 Fc-OB 융합 단백질의 제제형을 제공한다.
본 발명의 또다른 양상은 상기의 제약학적 조성물, 그러한 조성물의 제조 방법, 본 발명의 조성물을 사용한 치료 방법, 및 그러한 치료를 위한 본 발명의 조성물을 포함한 약제 제조방법을 포함한다.
본 발명은 안정한 활성 인체 OB 단백질 조성물에 관한 것으로, 이러한 조성물은 농도가 높고 생리학적 pH 또는 그 부근의 pH 를 갖는다. 또한 본 발명은 조성물 및 이러한 조성물의 제조방법과 이용방법을 제공한다.
도 1A 와 1B 는 실시예 1 의 본 발명의 인체 OB 현탁액(1A)과 실시예 1 에 기술한 바와 같은 대조 인체 OB 단백질 수용액(1B)에 대한 마우스에서의 투여량 반응곡선을 나타낸 것이다.
도 2 는 본 발명의 OB 단백질 현탁액과 실시예 1 에 기술한 바와 같은 대조 인체 OB 단백질 용액에 대한 개에서의 OB 혈청 수준을 설명하는 그래프이다.
도 3 은 7 주 동안 37 ℃ 에서 인체 OB 단백질 제제형의 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 기록을 나타낸 것이다 : 실시예 1 의 인체 OB 단백질 아연 현탁액은 중간에 표시되어 있고, 실시예 1 의 대조 인체 OB 단백질 용액은 가장 위의 라인이며 -80 ℃ 에서 56 일 동안 보관한 인체 0B 단백질 현탁액은 가장 밑의 라인이다.
도 4 는 19 ℃ 에서 56 일 동안 보관한 인체 OB 단백질 제제형의 RP-HPLC 기록을 나타낸 것이다 : 실시예 1 의 인체 OB 용액은 제일 위의 라인이고, 실시예 2 의 인체 OB 결정형의 현탁액은 중간 라인이며, 실시예 2 의 -80 ℃ 에서 56 일 동안 보관한 결정형의 현탁액은 제일 밑의 라인이다.
도 5A - 5C 는 인체 met Fc-OB 단백질의 DNA 서열(서열 번호 : 1)과 아미노산 서열(서열 번호 : 2)을 나타낸 것이다.
도 6A - 6C 는 인체 met Fc-OB 단백질 변이체의 DNA 서열(서열 번호 : 3)과 아미노산 서열(서열 번호 : 4)을 나타낸 것이다.
도 7 은 재조합 메티오닌 인체 Fc-OB 단백질에 대한 역상 HPLC 에 의해 결정된 바와 같이, asp 108 에서 이소 asp 형성 비율을 도시한 그래프이다.
단백질 성분이 액상 성분에서 침전되고 현탁되는 점에서, 본 발명의 안정한 활성 OB 단백질 조성물은 일반적으로 현탁액으로 분류된다. 조성물에는 활성 OB 단백질 성분, 침전제, pH 조절제, 및 액상 담체가 포함된다. 본 발명의 OB 단백질은 비결정형 이거나 결정형이다.
인체내 치료학적 또는 미용학적 조성물로 사용할 경우, 천연의 인체 OB 단백질(Zhang 등의, Nature, 상기문헌 참조)의 아미노산 서열과 선택적으로 박테리아 발현에 발생하는 N-말단 메티오닌 잔기를 함유한 OB 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 본원에서 사용한 OB 단백질을 제조하기 위해 재조합 DNA 방법을 사용할 경우에 본원에서 참고 문헌으로 인용한 PCT 출원 번호 제 WO 96/05309 호를 참조하라. 그러한 변화가 단백질의 전체적 접힘 또는 단백질의 활성도를 보존하는 한 선택한 아미노산에서 변화가 일어날 수 있다. 하기에 설명한 표 1, 보존적 아미노산 치환은 특별한 특성(염기, 산, 극성, 소수성, 방향족, 크기 (소형))으로 사용될 수 있다. 일반적으로 본원에서 참고 문헌으로 인용한 Ford 등의, 단백질 발현 및 정제 2 : 95 - 107, 1991 을 참조하라. 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20 - 25 까지의 잔기를 갖는 소형 링커 펩티드, 또는 폴리-히스티딘계, 항원성 에피토프 또는 결합 도메인과 같이 정제를 촉진하는 소형 연장과 같은 소형 아미노 말단 연장은 본 발명에 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 현탁액에서 증가된 안정성을 나타내는 인체 OB 단백질은 생리학적 pH 에 노출시, 수용액에서 소수성 부위를 노출시킨다. 부가적으로, OB 단백질 성분에 면역글로불린의 Fc 부위를 접촉시켜 유도된 인체 OB 단백질은 본 발명의 현탁액에서 증가된 안정성을 나타낸다.
일반적으로, 면역글로불린의 Fc 부위를 유전학적 또는 화학적으로 인체 OB 단백질에 융합하였다. Fc 부위를 OB 단백질의 N-말단에 융합시키는 것이 바람직하다. 바람직한 Fc-OB 융합 단백질의 경우, 본원에서 참고문헌으로 인용한 계류중인 미국 출원 번호 제 08/770,973 호를 참조하라. 바람직하게, 인체 면역글로불린 IgG-1 중쇄(Ellison, J.W. 등의, Nucleic Acids Res. 10 : 4071 - 7079 (1982) 참조)의 아미노산 서열을 갖는 Fc 부위를 사용하였다. 바람직한 Fc 부위는 서열 번호 : 2(도 5 참조)에서 설명하고 있다. 서열 번호 : 2 의 재조합 Fc-OB 서열은 378 아미노산 Fc-OB 단백질(메티오닌 잔기를 포함하지 않음)이다. 도 5 에서 Fc-OB 단백질의 첫번째 아미노산 잔기인 글루타민산은 -1 위치에서 메티오닌을 갖는 +1 로서 언급된다. Fc 부분의 변이체 또는 유사체는, 예를들어, 아미노산 잔기 또는 염기쌍의 다양한 치환으로 인해 생성될 수 있다.
Fc 서열의 이황화 교차 결합의 형성을 방지하기 위해, 시스테인 잔기를 삭제하거나 다른 아미노산으로 치환한다. 특히, 서열 번호 : 2 의 위치 5 에서 아미노산은 시스테인 잔기이다. 위치 5 에서 시스테인 잔기를 삭제하거나 하나 또는 그 이상의 아미노산으로 치환한다. 예를들어, 위치 5 에서 시스테인 잔기 대신에 알라닌 잔기로 치환하여 변이체 아미노산 서열을 수득하였다. 마찬가지로, 서열 번호 : 2 의 위치 5 에서 시스테인은 세린 또는 다른 아미노산으로 치환되거나 삭제된다.
위치 1, 2, 3, 4 및 5 에서 아미노산의 삭제에 의해 제조된 변이체 또는 유사체는 373 아미노산 Fc-OB 단백질(메티오닌 잔기를 포함하지 않음)을 생성하였다. 이러한 서열은 서열 번호 : 4(도 6 참조)에서 시작한다. 이러한 위치에서 치환하는 것은 또한 가능하며 본 발명의 범주 내에 포함된다.
Fc 수용체 결합 부위와 보체(c1q) 결합 부위를 제거하도록 4 개의 아미노산 치환기를 도입하여 변형시켰다. 이러한 변이체 변형은 위치 15 에서 로이신이 글루타민산으로 치환되고, 위치 98 에서 글루타민산이 알라닌으로 치환되며, 위치 100 및 102 에서 라이신이 알라닌으로 치환되는 것을 포함한다(서열 번호 : 4 의 번호 체계에 따름).
마찬가지로, 하나 또는 그 이상의 티로신 잔기는 페닐알라닌 잔기로도 대체할 수 있다. 상기에 서술한 바와 같이, 그러한 변화가 융합 단백질의 전체 접힘 또는 활성도를 보존 하는 한 선택한 아미노산에서 변화가 일어날 수 있다.
더욱이, Fc 부위는 또한 길이를 다양화 하는 화학적 아미노산인 "링커" 성분에 의해 Fc-OB 융합 단백질의 인체 OB 단백질에 연결될 수 있다.
그러한 화학적 링커는 본 분야에 잘 알려져 있다. 아미노산 링커 서열은 다음과 같은 것을 포함하지만 이에 국한된 것은 아니다 :
(a) ala, ala, ala ;
(b) ala, ala, ala, ala ;
(c) ala, ala, ala, ala, ala ;
(d) gly, gly ;
(e) gly, gly, gly ;
(f) gly, gly, gly, gly, gly ;
(g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly ;
(h) gly-pro-gly ;
(i) gly, gly. pro, gly, gly ; 및
(j) (a) 항에서 (i) 항 까지의 조합.
본 발명의 침전제는 양이온 성분을 갖는 염일 수 있으며, 칼슘, 마그네슘, 아연, 나트륨, 철, 코발트, 망간, 칼륨 및 니켈 중에서 선택할 수 있다. 바람직하게, 염은 제약학적 조성물에 사용할 경우 양립가능할 것이다.
침전제는 폴리에틸렌 글리콜 또는 다음 단락에서 설명한 것 같이 다른 수용성 폴리머 같은 단백질을 침전시키는 것으로 알려진 제약학적으로 용인가능한 약물 중에서 대안적으로 선택할 수 있다. 유용한 침전제는 중성 pH 에서 OB 단백질의 침전을 유도하지만 생리학적으로 양립가능한 용매로 희석할 경우에는 가역적이거나 재용해된다. 적절한 침전제 없이, OB 단백질을 중성 pH 에서 생리학적으로 양립가능한 용매로 희석할 경우 가역저이지 않은 형태로 침전되었다.
바람직한 pH 범위는 약 pH 4.0 에서 8.0 이며, 더 바람직한 범위는 약 pH 6.5 에서 7.5 이다. 제약학적 조성물에 대한 가장 바람직한 pH 는 본원에서 사용한 OB 단백질이 선택된 단백질 농도에서 최대의 생물학적 활성도를 보유할 수 있는 pH 를 말한다. 비-생리학적 pH 에서, 본 발명의 OB 단백질 현탁액은 또한 장점을 갖고 있다. 5.0 보다 낮은 pH 에서, 본 발명의 OB 단백질 현탁액은 동일 pH 용액에서 OB 단백질의 동일 농도보다 더 안정하다(유효기간에 의해). 예를들어, pH 4.0 과 50 mg/ml 의 농도에서, 본 발명의 현탁액은 시험관내 투여시 당량 용액에서 보다 높은 생물학적 활성도를 나타낸다.
완충용액은 조성물을 침전시키는 특징을 변화시키지 않는 바람직한 pH 를 보유한 완충용액 중에서 선택할 수 있다. 바람직하게, 제약학적 제제형에 관해서 완충용액을 사용한다. 트리스, MES 및 PIPES 는 비결정형과 결정형 둘 다에 사용할 수 있다. 인산염은 결정형에 대한 바람직한 완충용액이다.
용이한 치료학적 투여에 있어, 최종 현탁액의 농도는 5 mg/ml 내지 100 mg/ml 가 바람직하다.
이용방법
치료학. 치료학적 용도는 몸무게 조절, 당뇨병 치료 또는 예방, 혈액 지질 감소(및 관련 조건 치료), 무지방 신체 질량 증가 및 인슐린 감수성 증가를 포함한다. 또한, 본 조성물은 상기 조건의 치료나 경감을 위한 하나 또는 그 이상의 의약 제조에 사용할 수 있다. 투여방법은, 다른 방법도 있지만, 전형적으로 폐 수송으로 사용 될 수 있는 주사를 이용한다. 예를들어, 참고 문헌으로 인용한 PCT 제 WO 96/05309 호, 페이지 83 et seg. 를 참조 하라. 본 발명의 현탁액을 10 마이크론 또는 바람직하게, 0.5 내지 5 마이크론 보다 작은 평균 크기를 갖는 입자로 분무-건조 시킬 수 있다.
몸무게 조절. 본 조성물 및 방법은 몸무게 감소를 위해 사용할 수 있다. 다른 방법을 조사해 보면, 본 발명의 조성물은 바람직한 몸무게 또는 비만 수치를 유지하는데 사용할 수 있다. 마우스 모델에서 입증한 바와 같이(상기 참조), 본 발명의 OB 단백질을 투여하면 몸무게가 감소한다. 몸무게 감소는 하기 부수적인 조건을 치료하는 것과 관계가 있으며, 따라서 치료학적 적용으로 성립된다. 부가적으로, 본원의 미용학적 용도는 몸무게 조절이 외관을 좋게 하는 데에만 적합하다.
당뇨병 치료. 본 발명의 조성물 및 방법은 제 11 형 당뇨병 치료나 예방에 사용할 수 있다. 제 11 형 당뇨병은 비만과 상관관계가 있을 수 있으므로, 몸무게를 감소시키는 본 발명의 용도(바람직한 몸무게를 유지하거나, 비만 수치를 감소시키거나 유지한다)는 또한 당뇨병을 완화시키거나 당뇨병의 발생을 막을 수 있다. 더욱이, 몸무게를 감소시키기에 충분한 투여량이 아닐 경우 조차도, 본 발명의 조성물은 당뇨병을 예방하거나 완화시킬 것이다.
혈액 지질 감소. 본 발명의 조성물 및 방법은 혈액 지질 수준 조절에 이용할 수 있다. 관념적으로, 혈액 지질 수준이 감소하는 것만이 바람직하거나 혈액 지질 수준의 감소를 유지시키는 것이 바람직한 상황에서의 투여량은 몸무게를 감소시키기에는 불충분할 것이다. 따라서 비만 환자의 초기 치료 중에, 투여량을 투여하면 몸무게 감소와 함께 부수적으로 혈액 지질 수준이 감소될 것이다. 일단 몸무게가 충분히 빠지면, 몸무게가 늘어나는 것은 막되 원하는 혈액 지질 수준을 유지시키기에 충분한 투여량을 투여하거나, 본원에서 설명한 바와같이 다른 상태로 투여할 수 있다. 이들 투여량은 OB 단백질의 효과가 가역적이므로 실험에 근거하여 결정할 수 있다. 예를들어, Campfield 등의 Science 269 : 546 - 549 (1995), 547 을 참조하라. 따라서, 몸무게 감소를 원하지 않을 때 몸무게 감소를 야기시키는 투여량이 관찰되면, 원하는 혈액 지질 수준은 이루되 바람직한 몸무게를 유지시키기 위해 보다 적은 양을 투여해야 한다. 예를들어, 본원에서 참고 문헌으로 인용한 PCT 출원 제 WO 97/06816 호를 참고하라.
무지방 질량 증가 또는 인슐린 감수성 증가. 관념적으로 무지방 신체 질량 증가만을 원하는 경우에, 투여량은 몸무게를 감소시키기에는 불충분할 것이다. 따라서 비반 환자의 초기 치료 중에, 투여량을 투여하면 몸무게 감소와 함께 부수적으로 지방 조직이 감소되고 무지방 질량이 증가할 것이다. 일단 몸무게가 충분히 빠지면, 몸무게가 다시 늘어나는 것은 막되 원하는 무지방 질량을 증가(또는 무지방 질량이 감소하는 것을 막음)시키기에는 충분한 투여량을 투여할 것이다. 각 개체의 인슐린 감수성을 증가시키기 위해, 유사한 투여량 조건이 고려될 것이다. 몸무게는 감소시키지 않으면서 무지방 질량을 증가시키면, 당뇨병 치료를 위해 각 개체에 투여하는 인슐린(또는 잠재적으로 아밀린 및 아밀린 길항물질 또는 작용물질 혹은 티아졸리딘디온류나 그 외의 가능한 당뇨병 치료 약물)의 양을 충분히 감소시킬 수 있다. 전반적인 효력을 증가시키기 위해, 유사한 투여량 조건이 고려될 것이다. 전반적으로 효력 증가와 함께 부수적으로 무지방 질량을 증가시키려면 몸무게 감소를 야기시키기에 불충분한 투여량을 사용하면 될 것이다. 적혈구 증가(및 혈액 내 산소첨가) 및 골 재흡수 감소 또는 골다공증과 같은 그 외의 효과 또한 몸무게를 감소시키지 않고 얻을 수 있다. 본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 출원 제 WO 97/18833 호를 참고하라.
조합 치료. 본 조성물 및 방법은 식이 변화 및 운동과 같은 다른 치료와 연합하여 사용할 수 있다. 당뇨병 치료에 유용한 의약[예를들어, 인슐린 및 잠재적으로 아밀린과 아밀린 길항물질 또는 작용물질 혹은 티아졸리딘디온류(본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 출원 제 WO 98/08512 를 참조하라.)나 그 외의 가능한 당뇨병 치료 약물], 콜레스테롤 및 혈압강하제(예를들어, 혈액 지질 수준을 감소시키는 의약 또는 그 외의 심혈관 의약), 활성을 증가시키는 의약(예를 들어, 암페타민), 이뇨제(액상의 배설물을 위한 것) 및 식욕 억제제(신경펩타이드 γ 수용체에 작용하는 약제나 세로토닌 재흡수 억제제 같은 것)과 같은 의약이 있다. 이러한 의약의 투여는 동시에 또는 순차적으로 실시할 수 있다. 게다가 본 방법은 신체의 종합적인 외관을 변화시키기 위해 계획된 미용외과수술(예를들어, 신체 질량 감소를 위해 계획된 지방흡입이나 레이저 수술 또는 신체 질량의 외관을 증가시키기 위해 계획된 이식 수술)과 같은 외과수술 과정과 연합하여 사용할 수 있다. 동맥반과 같은 지방 침착물에 의해 혈관이 차단됨으로써 야기되는 유독 상태를 완화시키기 위해 계획된 바이패스외과수술 또는 그 외의 심장외과수술의 건강상의 이점은 본 조성물 및 방법의 부수적인 이용을 증가시킬 것이다. 초음파나 레이저같이 담석을 제거하는 방법 또한 본 치료방법을 사용하기 전이나 사용중에 또는 그 후에 사용할 수 있다. 더욱이 본 방법은 골절, 근육 손상 치료나 외과수술 또는 무지방 조직 질량을 증가시킴으로서 개선되는 다른 치료법에 대해 보조적으로 사용할 수 있다.
다음의 실시예들은 본 발명을 좀 더 충분히 설명하고자 하는 것이지, 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 실시예 1 은 pH 7.0 에서 100 mg/ml 의 농도인 비 결정형의(다음 실시예에 나오는 결정형에 대조되는 것) 인체 OB 단백질 현탁액의 제조를 설명하는 것이다. 실시예 2 는 결정형의 OB 단백질 현탁액의 제조를 설명하는 것이다. 실시예 3 은 OB 단백질 용액에 비해 개선된 OB 단백질 현탁액의 투여량 반응을 입증한 것이다. 실시예 4 는 개를 모델로 본 발명 현탁액의 시간 지연에 따른 작용 프로필을 입중하는 것이다. 실시예 5 는 비 결정형 Fc-OB 단백질 현탁액의 제조를 설명하는 것이다. 실시예 6 과 7 은 본 발명 현탁액의 안정성 향상을 입증하는 것이다.
실시예 1 : 비 결정형 OB 단백질 현탁액의 제조.
이 실시예는 본 발명의 인체 OB 단백질 현탁액중 하나의 제조를 설명하는 것이다. 비 결정형 인체 OB 단백질 현탁액은 아연염과의 침전반응에 의해 제조되었다. 6.0 에서 8.0 의 최종 pH 에서 액체의 농도가 100 mg 단백질/ml 가 되게 하였다. pH 4.0 인 인체 OB 단백질 용액을 대조 조성물로서 사용하였다.
조성물 :
단백질 성분 : 아미노산 번호 22(Val)에서 시작하여 아미노산 번호 167 에서 끝나며 N-말단에 메티오닌 잔기를 가지는, PCT 출원 제 WO 96/05309 의 서열 번호 : 4 에 기술되어 있는 재조합 메티오닌 인체 OB 단백질("rmetHu-렙틴") :
침전제 : 염화아연
완충액 : 트리스, MES 및 PIPES
최종 pH : 6.0 - 8.0
제조 프로토콜 : 재조합 메티오닌 인체 OB 단백질("rmetHu-렙틴") 용액을 물에 넣어 약 40 mg/ml 로 농도를 조정하고, HCl 로 pH 3.0 으로 산성화 하였다. 염화아연이 첨가되고, 현탁액을 적절한 완충액의 첨가에 의해 거의 중성 pH(대략 pH 7.0)로 조정되었다. 트리스, MES 및 PIPES 완충액이 잘 사용된다. 완충액 10 - 15 mM, 아연 20 - 1000 μM, pH 6.0 - 8.0 및 rmetHu-렙틴 10 mg/ml 가 최종 조건의 전형이다. 4 ℃ 에서 여러시간 놓아두어 작은 분자들을 침전시키고 상층액을 제거하여 현탁액을 농축시킨다. 이 과정은 최대의 농도가 얻어질때까지 여러차례 반복해야 하고, 약 100 mg/ml 의 현탁액이 사용된다.
대조 조성물 : 대조 조성물로서는 10 mM 아세테이트 및 5 % w/v 소르비톨을 포함하는 pH 4.0 의 20 mg/ml 재조합 메티오닌 인체 OB 단백질(상기한 것과 같은) 용액을 사용한다.
실시예 2 : 결정형 OB 단백질 현탁액의 제조.
이 실시예는 본 발명의 결정형 OB 단백질 현탁액의 제조를 설명하는 것이다.
단백질 성분 : 상기의 실시예 1 에서 사용한 재조합 메티오닌 인체 OB 단백질.
과정 : 4 ℃ 에서, 1 mM HCl 에 용해되어 있는 15 mg/ml 농도의 rmetHu-렙틴과 4 M NaCl, 100 mM 트리스, pH 8.5, 2 % v/v 에탄올을 1 : 1 비율로 혼합한다. 14 ℃ 와 25 ℃ 사이를 대여섯 시간에 걸쳐 서서히 온도를 조정하고, 최종 온도에서 가온 기간을 적어도 2 시간 동안 유지함으로써 자연스럽게 결정을 형성한다. 결정형을 안정화시키는 적절한 용매에서 원심분리 및 재현탁에 의해 얻어진 결정을 주입하기 위해 "모액"(예를들어, 결정형을 얻어낸 액체)을 좀더 안정한 용매로 바꾸어 준다. 적절한 대체 용매에는 20 - 25 % 폴리에틸렌 글리콜(대략 4,000 달톤에서 20,000 달톤의 분자량을 갖는 것으로, "대략" 이라는 말은 공업용 PEG 제조에서의 분자량 평균치를 의미한다), 되도록이면 pH 6.0 에서 pH 8.0 사이의 적절한 중성 pH 완충제 및 pH 6.0 에서 pH 7.5 사이의 10 mM 인산염 완충액, 2 % 에탄올 v/v 가 있다. 제조시에 일반적으로, 대개 0.25 M 이하의 잔류 염이 남을 수 있다.
실시예 3 : OB 단백질 용액에 비해 개선된 OB 단백질 현탁액의 투여량 반응.
이 실시예는 OB 단백질 현탁액이 용액상의 OB 단백질보다 좀 더 효능이 있다는 것을 입증하는 것이다. 정상인 무지방 마우스에게 본 발명의 현탁액과 OB 단백질 용액을 체중의 kg 당 단백질 1, 10 및 50 mg 씩 같은 양을 5 일간 매일 주사하였다. 주사한 OB 단백질의 질량 단위당 체중은 동량의 용액을 주사한 마우스보다 현탁액을 주사한 마우스에서 더 많이 감소했다. 이것은 도 1A 및 도 1B 에 나타나 있다. 도 1A 는 실시예 1 의 현탁액을 주사했을 때의 체중변화율을 보여준다. 도 1B 는 실시예 1 의 대조용액을 주사했을 때의 체중변화율을 보여준다.
이것은 같은 양을 투여시 본 발명의 현탁액이 용액 형태로 주사한 것보다 좀 더 효능이 있다는 것을 설명한다. 특정의 이론과 결부시키려는 것은 아니지만, 현탁액과 용액을 비교하였을때 현탁액의 흡수율이 더 느리기 때문일 것이다. 현탁액은 혈액으로 들어가기 전에 용해 되는데, 이러한 서방성 효과는 더 높은 효능을 야기한다. 질량을 기준으로 했을때, 현탁액은 용액보다 더 적은 양의 단백질을 투여할 수 있다. 게다가, 5 일째의 용액투여시(투여 마지막 날) 10 에서 50 mg/kg 의 투여량 사이에서 차이점이 없었다(아래의 표 2 참조). 현탁액이 용액처방 보다 더 명확한 반응 곡선을 보여준다.
방법 :
동물 : 정상인 CD-1 마우스를 사용.
표준체중 : 약 20 그램.
투약 : 5일간 같은 장소에서 SC 를 각각 주사하였다.
취급 : 동물은 무리지어 수용하고, 무제한으로 먹이를 주었다.
조성물 :
용액 : 실시예 1 에서 사용된, 20 mg/ml 농도의 rmetHu-렙틴 용액
현탁액 : 실시예 1 에서 사용된, pH 7.0, 10 mM MES 완충액, 500 mM 아연, 20 mg/ml 조건의 rmetHu-렙틴 현탁액.
PBS : 인산 완충 식염수가 위약으로 사용되었다(단백질이 없이 PBS 와 유사한 현탁액상 또는 용액상만을 대조군으로 사용한 반응, 데이터는 나타내지 않음).
실시예 4 : 개에서의 OB 단백질 혈청 수치.
이 실시예는 본 발명 현탁액의 시간 지연에 따른 작용 프로필을 입증하는 것이다.
방법 : 비글(사냥개 종류)에게 rmetHu-렙틴 현탁액 또는 용액을 투여한다. 혈청을 뽑아서 도 2 에 나타난것처럼 시간마다 OB 단백질 수치를 잰다.
사용된 조성물 :
용액 : 실시예 1 에서 사용된 용액, 5 mg/kg/하루.
현탁액 : 실시예 2 에서 사용된 현탁액을 사용. 표 참조.
동물 : 표 3 에 나타난 데이터는 3 마리의 평균치이다.
동물은 정상인 비글이다.
취급 : 동물들을 각각 개별 수용하고, 무제한으로 먹이를 주었다.
효과적인 동물 취급 경험을 따른 것이다.
분석 : Hotta et al, J. Biol. chem 271 : 255327 - 25331 (1996)에서 처럼 항체 분석법을 사용하였다.
결과 : 도 2 에서 보는 바와 같이, 용액의 농도는 단백질 투여 후 1 - 2 시간 지점에서 피크에 도달했으나, 현탁액의 농도는 훨씬 뒤늦게, 10 - 12 시간 후에 피크에 도달한다. 이것은 현탁액이 더 장기간 동안 최소의 효과량을 지속한다는 것을 입증하는 것이다.
실시예 5 : 비 결정형 Fc-OB 단백질 현탁액의 제조.
이 실시예는 본 발명의 인체 Fc-OB 단백질 현탁액 중 하나의 제조를 설명하는 것이다. 비 결정형 인체 Fc-OB 단백질 현탁액은 아연염과의 침전반응에 의해 제조되었다. pH 7.5 인 인체 Fc-OB 단백질 용액을 대조 조성물로서 사용하였다.
조성물 :
단백질 성분 : 아미노산 1 - 227 을 가지는 단백질의 Fc 부분과 아미노산 228 - 373 을 가지는 단백질의 인체 OB 단백질 부분을 포함하는 373 아미노산 융합 단백질이며 N-말단에 메티오닌 잔기를 가지는, 서열 번호 : 4 에 기술되어 있는 재조합 메티오닌 인체 Fc-OB 단백질("rmetHu-Fc-렙틴") :
침전제 : 염화아연
완충액 : 100 mM 트리스
최종 pH : 7.5
제조 프로토콜 : rmetHu-Fc-렙틴 용액은 100 mM 트리스 완충액에서 약 5 mg/ml 로 농도를 조정하고, pH 7.5 로 맞춘다. 현탁액을 형성하기 위해 염화아연을 첨가하였다.
대조 조성물 : 대조 조성물로서는 100 mM 트리스를 포함하는 pH 7.5 의 5 mg/ml rmetHu-Fc-렙틴 용액을(상기한 것과 같은) 사용한다.
실시예 6 : 본 발명의 인체 OB 단백질 현탁액의 안정성.
이 실시예는 본 발명 현탁액의 비 결정형 및 결정형 둘 다 좀 더 향상된 안정성 분석 조건하에서 용액상의 물질보다 더 안정하다는 것을 입증하는 것이다.
도 3 은 7 주간 37 ℃ 에서, 본 발명 현탁액의 아연 비 결정형과 (실시예 1 에서 나온 것) 용액형(실시예 1 에서 나온것)을 비교한 RP-HPLC 기록을 나타내는 것이다. 보는 바와같이, 본 발명 현탁액은(가운데 라인) 용액형(제일 위의 라인) 보다는 낮은 피크를(분석 결과 낮게 나타남) 보인다. 제일 아래의 라인은 대조군으로서, 7 주간 -80 ℃ 에서 보관한 아연 비 결정형의 분석을 나타낸다.
도 4 는 실시예 2 의 결정형 현탁액과 용액형(실시예 1 의 것)을 비교한 RP-HPLC 기록을 나타내는 것이다. 시료는 19 ℃ 에서 56 일간 보관되었다(결정형은 37 ℃ 에서 자신의 결정 구조를 잃어버리므로, 37 ℃ 에 보관하는 것은 적당한 조건이 아니다). 도 4 는 현탁액형 (주 피크 = 94 %) 보다 용액형(주 피크 = 86 %)에서 더 분해된 형태의 피크를 보인다. 제일 아래의 라인은 대조군으로서 -80 ℃ 에서 56 일간 보관된 결정형의 분석을 나타낸다. 분해가 더 천천히 일어난다 하더라도, 4 ℃ 에서 관찰되는 결과는 유사하다.
주요 분해 산물은 아미노산 108 번에 위치하는 염 형태의 아스파르트산으로 여겨진다(PCT 출원 제 WO 96/05309 에 기술된 서열 번호 : 4 에 따르면, "Val" 잔기를 위치 번호 1 로 사용한다). 분자의 안정성을 향상시키는 다른 아미노산처럼, 이 위치에서 좀 더 안정한 화학 성분을 실험적으로 선별할 수 있다. 종합하면, 본 발명의 현탁액은 용액상의 OB 단백질 보다 더 안정하다.
실시예 7 : 본 발명의 인체 Fc-OB 단백질 현탁액의 안정성.
이 실시예는 본 발명 Fc-OB 단백질 현탁액이 좀 더 향상된 안정성 분석 조건하에서 용액상의 물질보다 더 안정하다는 것을 입증하는 것이다.
본 발명 현탁액의 아연 비 결정형(실시예 5 에서 나온것)과 용액형 (실시예 5 에서 나온것)을 4 ℃, 29 ℃, 37 ℃ 에서 2 주간 보관하여 안정성 연구를 실시하였다. 도 7 에서 보는 바와 같이, 29 ℃ 및 37 ℃ 에서 보관된 Fc-렙틴 현탁액이 각각 같은 온도에서 보관된 Fc-렙틴 용액형보다 OB 단백질의 아미노산 108 번에 위치하는 염 형태의 아스파르트산과 관련있는 분해 산물의 비율이 더 낮게 나타났다.
* * *
본 발명은 상기에 기술되어 있으나, 본 분야의 숙련된 기술자들에 의한 변형 및 수정이 일어날 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 범주내에 속하는 모든 동가의 변형물을 첨부한 청구의 범위에 포함시키고자 한다.
Claims (13)
- OB 단백질 성분의 N-말단에 면역글로불린의 Fc 부위를 결합시킴으로써 유도한, 약 6.0 내지 약 8.0 의 pH 및 적어도 0.5 mg/ml 의 농도를 갖는 인체 OB 단백질 현탁액.
- 제 1 항에 있어서, 상기 인체 Fc-OB 단백질의 Fc 부분은 다음 중에서 선택함을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액 :(a) 서열 번호 : 2 및 4 에 나타나 있는 Fc 아미노산 서열 ;(b) 다음 위치 중 하나 또는 그 이상을 결실시키거나 다른 아미노산으로 치환시킨 (a) 항의 아미노산 서열(서열 번호 : 2 의 번호 체계 사용) :(ⅰ) 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기를 알라닌 또는 세린 잔기로 치환 ;(ⅱ) 하나 또는 그 이상의 티로신 잔기를 페닐알라닌 잔기로 치환 ;(ⅲ) 위치 5 의 아미노산을 알라닌으로 치환 ;(ⅳ) 위치 20 의 아미노산을 글루타민산으로 치환 ;(ⅴ) 위치 103 의 아미노산을 알라닌으로 치환 ;(ⅵ) 위치 105 의 아미노산을 알라닌으로 치환 :(ⅶ) 위치 107 의 아미노산을 알라닌으로 치환 ;(ⅷ) 위치 1, 2, 3, 4 및 5 의 아미노산을 결실 ;(ⅸ) Fc 수용체 결합 부위를 제거하기 위해 하나 또는 그 이상의 잔기를 치환하거나 결실 ;(ⅹ) 보체(C1q) 결합 부위를 제거하기 위해 하나 또는 그 이상의 잔기를 치환하거나 결실 : 및(xi) ⅰ - ⅹ 항의 조합 ; 및(c) N-말단에 메티오닌 잔기를 갖는 (a)항 또는 (b)항의 아미노산 서열.
- 제 1 항에 있어서, 상기 농도는 적어도 5 mg/ml 임을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
- 제 1 항에 있어서, 상기 농도는 5 mg/ml 내지 50 mg/ml 임을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
- 제 1 항에 있어서, 상기 pH 는 7.0 임을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
- 제 2 항에 있어서, 상기 인체 OB 단백질은 rmetHu-Fc-렙틴임을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
- 제 1 항에 있어서, 현탁액은 제약학적으로 용인가능한 침전제를 함유함을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
- 제 1 항에 있어서, 현탁액은 염 및 수용성 중합체 중에서 선택한 침전제를 함유함을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
- 제 1 항에 있어서, 현탁액은 칼슘, 마그네슘, 아연, 나트륨, 철, 코발트, 망간, 칼륨 및 니켈 중에서 선택한 침전제를 함유함을 특징으로 하는 인체 OB 단백질 현탁액.
- 제 1 항의 인체 OB 현탁액의 유효량을 투여함으로써 다음 중에서 선택한 증상을 갖는 개체를 치료하는 방법 :(a) 체중 조절,(b) 비만 조절,(c) 당뇨병,(d) 혈액내 지질 수준 조절,(e) 무지방 질량 증가 및(f) 인슐린 감수성 증가.
- 다음 단계를 포함하는 인체 OB 단백질 현탁액의 제조방법 :(ⅰ) OB 단백질 성분의 N-말단에 면역글로불린의 Fc 부위를 결합시킴으로써 유도한 용액내 인체 OB 단백질 및 침전제를 적당한 조건하에서 화합시키는 단계 ;(ⅱ) 상기 인체 OB 단백질을 침전시키는 단계 ;(ⅲ) 침전된 인체 OB 단백질을 모으는 단계 : 및(ⅳ) 선택적으로, 상기 인체 OB 단백질을 희석액 내로 재현탁시키는 단계.
- 제 11 항에 있어서, 상기 인체 OB 단백질을 pH 가 6.0 내지 8.0 인 희석액 내로 재현탁시킴을 특징으로 하는 제조방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 인체 OB 단백질은 rmetHu-Fc-렙틴임을 특징으로 하는 제조방법.
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