CN105646717B - 一种长效hiv融合抑制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种可用于治疗艾滋病的、长效HIV融合抑制剂及其应用。所述长效HIV融合抑制剂其包含抑制HIV膜融合的多肽部分及能够与人类免疫球蛋白Fc特异性结合的部分，经实验证实，其在恒河猴体内的半衰期约是第一个被FDA批准上市的HIV融合抑制剂T20的约11倍，并且对HIV‑1_IIIB和HIV‑1_Bal两种活病毒均具有很好的抗病毒活性，其IC50分别约为5.9nM和2.57nM，其抗病毒活性约是T20的3倍；其对细胞具有低毒性。本发明的长效HIV融合抑制剂IBP‑CP24多肽可用于制备长效化抗艾滋病病毒的药物，以及为延长蛋白和多肽药物在体内的半衰期提供新的策略。

Description

一种长效HIV融合抑制剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及具有较长体内半衰期的多肽抑制剂，具体涉及一种可用于治疗艾滋病的、长效HIV融合抑制剂及其应用。该多肽可用于制备长效化抗艾滋病病毒的药物。

背景技术

现有技术公开了艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome,简称AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,简称HIV)感染所导致的一种病死率极高的严重性传染病，其正在全球肆虐。据统计显示，自2000年起，全球累积新增艾滋病感染者3810万人，2530万人死于艾滋病。2015年联合国艾滋病规划署(The Joint UnitedNations Programme on HIV and AIDS,简称UNAIDS)针对全球艾滋病疫情评估分析的报告显示，在2014年全球范围内艾滋病感染者约有3690万人；新增感染者200万人；120万人死于艾滋病相关疾病(http://www.unaids.org)。但遗憾的是到目前为止仍然缺乏有效的药物及疫苗对HIV进行治疗和预防，临床上经FDA批准上市的HIV药物大多为蛋白类抑制剂药物，而这类药物需要频繁使用才得以维持其在体内的药效浓度。例如，T20是第一个被FDA(Foodand Drug Administration)批准上市的HIV融合抑制剂药物，但是由于T20的生物利用率较低，半衰期较短(约为4h左右)，每天需要注射两次，治疗成本高且由于反复注射容易造成药物皮肤敏感等副作用，并且T20容易产生耐药性，从而限制了其在临床上的应用。因此，如何研发出在血清中具有长效功能的HIV融合抑制剂成为HIV融合抑制剂研究领域急需解决的重要问题。

虽然近几年各国研究人员在研制长效蛋白药物技术方面有了一定的突破，尤其是通过PEG化学修饰及与血清白蛋白和Fc融合的方法来延长蛋白药物的半衰期，使得长效药物的新品种不断涌现。但是上述传统长效策略在小分子多肽药物上的应用存在着一定的局限性，比如，由于外来聚合物的引入，在生物体内会产生免疫原性；而且由于修饰位点的不同从而影响蛋白药物的活性；除此之外，在 选择聚合物策略时还需要解决聚合物和蛋白共轭等关键问题，研究实践表明，该问题相当复杂，解决起来比较困难。同时，Fc融合蛋白也存在以下几个问题：(1)该方法通常会导致预期以外的副反应，从而影响到药物的作用效果；(2)产生有活性的，糖基化程度高的Fc类物质需要通过真核表达的方法获得，而真核表达方式既消耗大量的时间，费用也非常昂贵且生产能力有限；(3)生产工艺复杂，每批次的质量难以控制。这些都成为限制Fc长效技术应用的瓶颈。人血清白蛋白是血浆中含量最多的蛋白，其已成为药物设计理想的载体蛋白；但将小分子多肽药物与其融合表达以提高半衰期的方式尚存在较多缺点，最主要的是由于融合了相对多肽药物分子量十余倍的大分子，空间位阻的问题被显著提升，药物的活性容易损失。因此，本领域急需新的长效技术来解决小分子多肽药物在体内半衰期的问题。

基于现有技术的现状，本申请的发明人提出IgG-Fc结合肽可以和人类的IgG-Fc进行可逆性结合，借助该结合肽可以和IgG-Fc结合的能力，达到延长多肽药物在体内半衰期的目的，由此，提供一种可用于治疗艾滋病的、长效HIV融合抑制剂，为延长HIV融合抑制剂小分子多肽药物在体内的半衰期提供一种新策略，同时为加速长效多肽小分子药物的研发提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提出了一种新型长效HIV融合抑制剂多肽。

本发明所述的长效HIV融合抑制由靶向HIV-1跨膜蛋白gp41的融合抑制剂CP24以及与人类免疫球蛋白Fc可逆性结合的小分子IgG-Fc结合肽(IBP)两部分组成。

本发明中，所述的靶向HIV-1跨膜蛋白gp41的融合抑制剂CP24由24个氨基酸组成，具体氨基酸序列为N-MTWEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS-C；

本发明中，所述的能与人类免疫球蛋白Fc结合的IgG-Fc结合肽由13个氨基酸组成，具体氨基酸序列为N-DCAWHLGELVWCT-C；

本发明所述的长效HIV融合抑制剂IBP-CP24由37个氨基酸组成，具体氨基酸序列为N-DCAWHLGELVWCTMTWEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS-C，其中，N-表示N端方向，C-表示C端方向(如图1所示)。

另一方面，本发明提供了用于治疗艾滋病的长效HIV融合抑制剂多肽，该多肽含有如下述两个部分：(1)靶向HIV-1跨膜蛋白gp41的融合抑制剂CP24，(2)与人类免疫球蛋白结晶片段(Fc)可逆性结合的IgG-Fc结合肽(IBP)；

所述的靶向HIV-1跨膜蛋白gp41的融合抑制剂CP24，其氨基酸序列为N端-MTWEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS-C端；

所述的能与人类免疫球蛋白Fc可逆性结合的IgG-Fc结合肽(IBP)的氨基酸序列为N端-DCAWHLGELVWCT-C端；

所述的IBP能与人类免疫球蛋白Fc的C_H2和C_H3区域特异性结合。

本发明还提供了一个核酸分子，其编码所述的多肽；以及提供了一个表达载体，其包含所述的核酸分子；以及提供了一个表达载体，其表达所述的多肽；

本发明中，所述的IgG-Fc结合肽IBP能与人类免疫球蛋白Fc的CH2和CH3结构域进行结合，本发明通过序列对比，结果显示恒河猴与人的免疫球蛋白Fc的氨基酸序列相似，而能与IBP结合的人免疫球蛋白Fc的CH2和CH3结构域的关键序列，与恒河猴的完全相同；因此，本发明中选择恒河猴作为动物研究模型。

本发明中，通过酶联免疫吸附反应(ELISA)实验检测IgG-Fc结合肽IBP及长效HIV融合抑制剂IBP-CP24能否与人和恒河猴的IgG-Fc进行结合，结果显示，人和恒河猴的IgG-Fc均能够与IBP及其修饰的HIV融合抑制剂结合，却不能和HIV融合抑制剂CP24进行结合(如图2所示)。

本发明通过HIV-1_IIIB(B，X4)感染系统及HIV-1_Bal(B，R5)感染系统上检测了HIV融合抑制剂CP24，IgG-Fc结合肽IBP及其修饰的HIV融合抑制剂对HIV-1_IIIB和HIV-1_Bal活病毒的抑制活性，结果显示IgG-Fc结合肽IBP对HIV-1_IIIB和HIV-1_Bal两种活病毒均没有抗病毒活性，而经其修饰的HIV融合抑制剂(即IBP-CP24)对HIV-1_IIIB和HIV-1_Bal两种活病毒均具有显著的抗病毒活性，其IC50分别约为5.9nM和2.57nM(如图3所示)；同时，本发明检测了一系列不同亚型(A，B，C，D，A/E，F及O)的HIV临床毒株以及T-20抗性毒株，结果显示IgG-Fc结合肽IBP对HIV临床毒株以及T-20抗性毒株均没有抗病毒活性，而经其修饰的HIV融合抑制剂对HIV临床毒株以及T-20抗性毒株均显示有显著的抗病毒活性，其IC50约在0.68-49.16nM范围内(如表1和表2所示)，实验结果表明 IgG-Fc结合肽IBP并不影响HIV融合抑制剂的活性。

表1是多肽对HIV-1临床毒株的抑制活性，包括HIV-1A,B,D,A/E,F及O亚型。

表1.

其中，IC50即半数抑制浓度，是指抑制50％HIV-1感染的药物浓度。

表2是.多肽对T-20抗性毒株的抑制活性。

表2

本发明通过一次性尾静脉注射HIV融合抑制剂T20和IBP-CP24后，分别在2，4，6h和1，3，6，8，10，14d不同时间点取血，通过双抗夹心ELISA实验检测IBP-CP24在恒河猴体内的半衰期约为46h(如图4所示)，约是第一个被FDA批准上市的HIV融合抑制剂T20(t_1/2＝4)的11倍。

基于HIV-1与靶细胞融合的关键是六螺旋(6HB)的形成，而N36和C34多肽在体外可以模拟gp41六螺旋束的结构有关研究基础，本发明中，通过圆二色谱测定多肽与N36混合后的二级结构及其解链温度，CP24及IBP-CP24与N36混合后，结果显示，混合物为螺旋结构(如图5A所示)，其结果符合六螺旋核心结构的CD光谱，而其Tm值分别约为78℃和85℃(如图5B和图5C所示)，而IBP 与N36混合后，其混合物为无规则卷曲结构(如图5A所示)；继而，本发明通过建立的ELISA系统检测IgG-Fc结合肽IBP对六螺旋形成的影响，结果显示，结合肽IBP不与C34或N36竞争来影响六螺旋的形成，而HIV融合抑制剂CP24和IBP-CP24可以和C34竞争来影响六螺旋的形成(如图5D所示)；同时，本发明在所建立的HIV-1包膜蛋白Env介导的cell-cell融合抑制系统上，检测结合肽IBP对病毒入侵靶细胞过程的影响，结果显示IBP并不影响病毒对靶细胞的入侵，而HIV融合抑制剂CP24及IBP-CP24均显示能阻止病毒对靶细胞的入侵，其IC50分别约为23nM和19nM(如图5E所示)；实验结果表明，CP24及IBP-CP24可以与N36相互结合，形成六螺旋结构，因而推测这些多肽可以和HIV病毒CHR相结合，从而干扰病毒与细胞膜之间的融合，阻断病毒感染；同时表明HIV融合抑制剂CP24的抗病毒作用机制不受结合肽IBP的影响。

本发明进一步通过CCK8试剂盒在MT-2和M7细胞上检测上述结合肽IBP、HIV融合抑制剂CP24及IBP-CP24对细胞存活率的影响，结果显示，IBP、CP24及IBP-CP24在MT-2和M7细胞上的存活率均在90％以上(如图6A和6B所示)，结果表明了结合肽IBP及HIV融合抑制剂CP24和IBP-CP24均为低毒性。

进一步本发明提供了一种药物组合或疫苗，其包所述的多肽，或者所述的核酸分子，或者所述的任何一个表达载体。

本发明提供了一种可用于治疗艾滋病的、长效HIV融合抑制剂，该多肽可用于制备长效化抗艾滋病病毒的药物；本发明的长效HIV融合抑制剂的抗病毒活性及抗病毒作用机制不受结合肽IBP的影响，其在恒河猴体内的半衰期约是第一个临床上应用的HIV融合抑制剂T20的11倍，并且其对细胞低毒性。因此，本发明所述的HIV融合抑制剂有望发展成为新一代的长效HIV融合抑制剂，同时本发明为延长蛋白和多肽药物在体内的半衰期提供了一种新的策略，并为加快长效多肽小分子药物的研发提供了新的理论依据。

附图说明

图1.HIV-1gp41重要功能区及T20、C34、CP24、CP24-IBP、CP24-G3-IBP和 IBP-CP24多肽序列。

图2.长效HIV-1融合抑制剂IBP-CP24与恒河猴IgG结合的结果。

图3.多肽对活病毒的抑制实验结果，其中，A.多肽对HIV-1_IIIB活病毒抑制试验，B.多肽对HIV-1_Bal活病毒抑制试验。

图4.IBP-CP24在恒河猴体内的药代动力学检测，其中显示了通过ELISA实验检测在不同时间点体内药物残留量，如图其半衰期约为46h

图5.多肽的抗病毒作用机制，其中，A.混合多肽二级结构，B.N36+CP24的Tm值，C.N36+IBP-CP24的Tm值，D.6HB抑制实验结果，E.HIV-1Env介导的cell-cell融合实验结果

图6.多肽细胞毒性的检测，其中，A是MT-2细胞，B是M7细胞。

具体实施方式

实施例1

1.通过ELISA检测长效多肽与猴IgG结合的能力

本实验中，参考文献：Du L,Kou Z,Ma C,Tao X,Wang L,Zhao G,Chen Y,Yu F,Tseng CT,Zhou Y,Jiang S.A truncated receptor-binding domain of MERS-CoV spikeprotein potently inhibits MERS-CoV infectionand induces strong neutralizingant ibody responses:implication for developing therapeutics andvaccines.PLoSOne.2013 Dec 4；8(12):e81587.

(1)用PH为9.6的0.05M NaHCO₃包被缓冲溶液分别包被相应多肽，将多肽稀释到5μg/ml，加入到96孔板里，每孔50μl，4℃过夜；

(2)每孔加入2％牛奶150μl，37℃孵育2h，洗板三次；

(3)稀释恒河猴IgG的浓度为100μg/ml，然后倍比稀释，37℃孵育1h，洗板三次；

(4)每孔加入50μl用PBS稀释至1：3000的兔抗猴IgG-Fc-HRP，37度孵育1h，洗板五次；

(5)每孔加入50μl TMB显色液，显色3-10min，每孔加入50μl 1M H₂SO₄终止反应，然后用Ultra386(Tecan)检测OD₄₅₀的吸光度。

2.HIV-1实验室适应株、抗性株及原代病毒株的病毒抑制实验(参考文献Wang Q,Bi W,Zhu X,Li H,Qi Q,Yu F,Lu L,Jiang S.Nonneutralizing Antibodies Induced bythe HIV-1 gp41 NHR Domain Gain Neutralizing Activity in the Presence of theHIV Fusion Inhibitor Enfuvirtide:a Potential Therapeutic Vaccine Strategy.JVirol.2015 Jul；89(13):6960-4.或Xu W.,Wang Q.,Yu F.,Lu L.,Jiang S.SynergisticEffect Resulting From Combinations of a Bifunctional HIV-1 Antagonist WithAntiretroviral Drugs.J Acquir Immune Defic Syndr.2014 Sep 1；67(1):1-6.或Tong,P.,Lu,Z.,Chen,X.,Wang,Q.,Yu,F.,Zou,P.,Yu,X.,Li,Y.,Lu,L.,Chen,Y.H.,Jiang,S.Anengineered HIV-1gp41 trimeric coiled coil with increased stability and anti-HIV-1 activity:implication for developing anti-HIV microbicides.J AntimicrobChemother.2013,68(11):2533-44.)

(1)药物梯度稀释，在96孔板中加入不含血清的164050μl，将以起始浓度为2μM的相应多肽加入96孔板第一行中，以4倍梯度进行稀释。同时设定阳性对照和阴性对照；

(2)将-80℃解冻的病毒株充分混匀，按照100倍TCID50值(即50％组织感染剂量加入孔中)，每孔50μl，37℃5％CO2培养箱放置30min；

(3)将MT-2或M7细胞1000rpm离心3min后，用新鲜的生长培养基悬浮，吹打混匀，细胞计数将MT-2或M7细胞调整到1x10⁵个/ml浓度，每孔加入100μl细胞。37℃5％CO₂培养过夜；

(4)次日每孔吸取150μl的培养基，补入150μl新鲜的1640+10％FBS培养基，继续培养4天或7天，MT-2细胞感染后的第五天吸取50μl的细胞上清到96孔板中，加入：5％TritonX-100-PBS裂解细胞，4℃过夜；M7细胞感染后的第五天吸取100μl/孔的培养基，补入100μl新鲜的1640+10％FBS培养基。感染后第八天，吸取50μl的细胞上清到96孔板中，加入：5％Triton X-100-PBS裂解细胞，4℃过夜；

(5)ELISA检测细胞上清中的P24含量，使用包被缓冲液包被半区ELISA板(人HIV-IgG 5μg/ml)，4℃过夜。PBST洗板3次，浸泡3min。2％milk PBS封闭ELISA板，37℃2h。PBST洗板3次，浸泡3min。加入5μl裂解后细胞培养上清，混匀后，37℃1h。PBST洗板3次，浸泡3min。加入1.5μl/ml 183鼠源单克隆抗体，37℃1h。PBST洗板3次，浸泡3min。加入兔抗鼠HRP (1:3000稀释)，37℃1h。PBST洗板5次，浸泡3min。TMB显色，Ultra386(Tecan)检测OD₄₅₀的吸光度值。

3.恒河猴药物代谢动力学实验(参考文献：Xie D,Yao C,Wang L,Min W,Xu J,Xiao J,Huang M,Chen B,Liu B,Li X,Jiang H.An albumin-conjugated peptideexhibits potent anti-HIV activity and long in viv o half-life.AntimicrobAgents Chemother.2010 Jan；54(1):191-6.)

(1)静脉注射前，采取血清作为阴性对照；

(2)实验分为两组，IBP-CP24和T20两个多肽药物各一组，其中，IBP-CP24组三只恒河猴，T20组两只恒河猴；

(3)恒河猴静脉注射IBP-CP24和T20，均为15mg/kg，注射一次；

(1)静脉注射后，2h，4h，6h，1d，3d，6d，8d，10d，和14d取血；

(2)样本室温放置2h后，分离血清，冻于-80度冰箱。

4.ELISA检测血清中药物浓度(参考文献：Xie D,Yao C,Wang L,Min W,Xu J,XiaoJ,Huang M,Chen B,Liu B,Li X,Jiang H.An albumin-conjugated peptide exhibitspotent anti-HIV activity and long in viv o half-life.Antimicrob AgentsChemother.2010 Jan；54(1):191-6.或Zhu X,Zhu Y,Ye S2,Wang Q,Xu W,Su S,Sun Z,YuF,Liu Q,Wang C,Zhang T,Zhang Z,Zhang X,Xu J,Du L,Liu K,Lu L,Zhang R,JiangS.Improved Pharmacological and Structural Properties of HIV Fusion InhibitorAP3 over Enfuvirtide:Highlighting Advantages of Artificial PeptideStrategy.Sci Rep.2015 Aug 19；5:13028.)

(1)用PH为9.6的0.05M NaHCO3包被缓冲溶液包被1μg/ml兔抗T20(IBP-CP24)抗体，50μl每孔，4度过夜；

(2)每孔加入2％牛奶150μl，37℃孵育2h，洗板三次；

(3)加入1：10稀释的血清样本，37℃孵育1h，洗板三次；

(4)每孔加入50μl鼠抗T20(IBP-CP24)抗体(1：1000稀释)，37℃孵育1h，洗板三次；

(5)加入用PBS稀释至1：3000兔抗鼠HRP，50μl每孔，37度孵育1h，洗板 五次；

(3)每孔加入50μl TMB显色液，显色3-10min后，每孔加入50μl 1M H2SO4终止反应，然后用Ultra386(Tecan)检测OD450的吸光度。

5.六螺旋竞争实验(参考文献：Lu L,Pan C,Li Y,Lu H,He W,Jiang S.Abivalent recombinant protein inactivates HIV-1 by targeting the gp41 prehairpin fusion intermediateinduced by CD4 D1D2 domains.Retrovirology.2012 Dec7；9:104.)

(1)用pH8.8的0.1MTris-HCI缓冲液将兔抗gp41多抗(兔抗NY-364)稀释到2μg/ml，加入96孔酶标板里，每孔50μl，4度过夜；

(2)每孔加入1％的脱脂奶粉(用pH7.2的PBS溶解)150μl，37度孵育60分钟，洗板三次；

(3)将相应浓度的待检化合物和对照化合物各30μl分别与1μM的N3630μl在37度孵育30分钟。然后各孔分别加入60μl的0.5μM C34，37度孵育30min。

(4)将上一步孵育好的混合液50μL移入已包被和封闭好的相应孔中，37度孵育60分钟，洗板三次；

(5)每孔加入50μl用PBS稀释至1μg/ml的单克隆抗体NC-1，37度孵育60分钟，洗板三次；

(6)每孔加入50μl用PBS稀释至1:3000的辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，37度孵育60分钟，洗板三次；

(7)每孔加入3，3’，5，5’一四甲基联苯胺(TMB)液50μl，显色3-10分钟。在观察到空白对照孔即将显色时，每孔加入终止液1M H2SO4氏50μl。

6.圆二色谱测定多肽二级结构及多肽复合物的解链温度(参考文献：Zhu X,ZhuY,Ye S2,Wang Q,Xu W,Su S,Sun Z,Yu F,Liu Q,Wang C,Zhang T,Zhang Z,Zhang X,XuJ,Du L,Liu K,Lu L,Zhang R,Jiang S.Improved Pharmacological and StructuralProperties of HIV Fusion Inhibitor AP3 over Enfuvirtide:HighlightingAdvantages of Artificial Peptide Strategy.Sci Rep.2015 Aug 19；5:13028.或Tong,P.,Lu,Z.,Chen,X.,Wang,Q.,Yu,F.,Zou,P.,Yu,X.,Li,Y.,Lu,L.,Chen,Y.H.,Jiang,S.Anengineered HIV-1gp41 trimeric coiled coil with increased stability and anti-HIV-1 activity:implication for developing anti-HIV microbicides.J AntimicrobChemother.2013,68(11):2533-44.)

(1)样品准备：用PBS(pH7.2)将游离多肽或多肽混合物稀释到终浓度为10μM，37℃孵育30min；

(2)上样：用酒精和去离子水彻底清洗比色皿，将空白PBS(pH7.2)注入比色皿内，然后将反应好的混合物注入比色皿内，将比色皿放入机器卡槽内；

(3)参数设置：检测温度4度，带宽5.0nm，解析度0.1nm，光径0.1cm，反应时间4.0s，扫描速度50nm/min。在222nm以5℃/min的温度梯度(4℃-98℃)变化检测多肽的热变形。

7.HIV-1细胞融合抑制实验(参考文献Wang Q,Bi W,Zhu X,Li H,Qi Q,Yu F,LuL,Jiang S.Nonneutralizing Antibodies Induced by the HIV-1 gp41 NHR DomainGain Neutralizing Activity in the Presence of the HIV Fusion InhibitorEnfuvirtide:a Potential Therapeutic Vaccine Strategy.J Virol.2015 Jul；89(13):6960-4.或Zhu X,Zhu Y,Ye S2,Wang Q,Xu W,Su S,Sun Z,Yu F,Liu Q,Wang C,Zhang T,Zhang Z,Zhang X,Xu J,Du L,Liu K,Lu L,Zhang R,Jiang S.Improved Pharmacologicaland Structural Properties of HIV Fusion Inhibitor AP3 over Enfuvirtide:Highlighting Advantages of Artificial Peptide Strategy.Sci Rep.2015 Aug 19；5:13028.)

(1)每毫升H9/HIV-1IIIB(2×10⁵/ml)与2.5μl 1mM Calcein-AM在37度孵育半小时后，用PBS洗3次；

(2)在96孔板中每孔分别加入50μl T20(500nM)、CP24(500nM)以及IBP-CP24(500nM)后，每孔加入50μl经上述处理过的H9/HIV-1IIIB细胞在37度孵育半小时；

(3)然后每孔加入100μlMT-2(1×10⁶/ml)在37度孵育2小时后在荧光显微镜下观察细胞融合情况。

8.IBP，IBP-CP24多肽细胞毒性的检测(参考文献：Tong,P.,Lu,Z.,Chen,X.,Wang,Q.,Yu,F.,Zou,P.,Yu,X.,Li,Y.,Lu,L.,Chen,Y.H.,Jiang,S.An engineered HIV-1gp41trimeric coiled coil with increased stability and anti-HIV-1 activity:implication for developing anti-HIV microbicides.J Antimicrob Chemother.2013,68(11):2533-44.或Li W1,Yu F,Wang Q,Qi Q,Su S,Xie L,Lu L,Jiang S. Co-deliveryof HIV-1 entry inhibitor and NNRTI shuttled by nanoparticles:cocktailtherapeutic strategy for antiviral therapy.AIDS.2015 Nov 20.或Zou Y,Bao J,PanX,Lu Y,Liao S,Wang X,Wang G,Lin D.NKP30-B7-H6 Interaction AggravatesHepatocyte Damage through Up-Regulation of Interleukin-32Expression inHepatitis B Virus-Related Acute-On-Chronic Liver Failure.PLoS One.2015 Aug 4；10(8):e0134568.)

(1)将多肽药物(起始浓度5μM)在96孔板细胞培养板中进行一系列梯度稀释后，使每孔多肽药物最终体积为50μl；

(2)将4×10⁴/ml,100μl/孔的MT-2细胞(M7细胞)加入到96孔板细胞培养板中，放置细胞培养箱37℃5％CO₂培养过夜；

(3)第二天换液，继续放置细胞培养箱37℃5％CO₂培养3天；

(4)3天后，每孔加入5μl CCK8、25μl PBS,放置细胞培养箱培养4h；

(5)酶标仪测定OD₄₅₀nm的吸光度。

上述试验结果显示，本发明的长效HIV融合抑制剂的抗病毒活性及抗病毒作用机制不受结合肽IBP的影响，其在恒河猴体内的半衰期约是第一个临床上应用的HIV融合抑制剂T20的11倍，并且其对细胞低毒性。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 一种长效HIV融合抑制剂

<130> 16

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MTWEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS

<400> 1

Met Thr Trp Glu Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys

1 5 10 15

Ile Glu Glu Leu Ile Lys Lys Ser

20

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DCAWHLGELVWCT

<400> 2

Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr

1 5 10

<210> 3

<211> 37

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DCAWHLGELVWCTMTWEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS

<400> 3

Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr Met Thr Trp

1 5 10 15

Glu Glu Trp Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Ile Glu Glu

20 25 30

Leu Ile Lys Lys Ser

35

Claims (6)

1.一种长效HIV 融合抑制剂，其特征在于，所述的长效HIV 融合抑制由靶

向HIV-1 跨膜蛋白gp41 的融合抑制剂CP24 以及与人类免疫球蛋白Fc 可逆性结

合的小分子IgG-Fc 结合肽IBP 两部分组成长效HIV 融合抑制IBP-CP24；

所述的靶向HIV-1 跨膜蛋白gp41 的融合抑制剂CP24 由24 个氨基酸组成，

其氨基酸序列为N-MTWEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS-C；

所述的能与人类免疫球蛋白Fc 结合的IgG-Fc 结合肽由13 个氨基酸组成，其

氨基酸序列为N-DCAWHLGELVWCT-C；

所述的长效HIV 融合抑制剂IBP-CP24 由37 个氨基酸组成，其氨基酸序列为

N-DCAWHLGELVWCTMTWEEWDKKIEEYTKKIEELIKKS-C，其中，N-表示N 端方向，

C-表示C 端方向。

2.权利要求1 所述的长效HIV 融合抑制剂在用于制备治疗艾滋病的药物中的用途。

3.如权利要求2 所述的用途，其特征在于，其中所述的IBP 能与人类免疫球蛋白Fc 的CH2 和CH3 区域特异性结合。

4.一个核酸分子，其编码权利要求1 的多肽，所述的多肽是由靶向HIV-1跨膜蛋白gp41的融合抑制剂CP24及与人类免疫球蛋白Fc可逆性结合的IgG-Fc结合肽IBP两部分组成的长效HIV-1融合抑制剂IBP-CP24。

5.一个表达载体，其包含权利要求4 的核酸分子。

6.一种药物组合物，其包含权利要求1的由靶向HIV-1跨膜蛋白gp41的融合抑制剂CP24及与人类免疫球蛋白Fc可逆性结合的IgG-Fc结合肽IBP两部分组成的长效HIV-1融合抑制剂IBP-CP24；或者权利要求4的核酸分子；或者权利要求5的表达载体。

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