JP6917662B2 - 腸内細菌叢改善組成物 - Google Patents

Description

本発明は、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の増殖による腸内細菌叢の改善作用を有するグネチンＣ及び／又はその配糖体を有効成分として含有する腸内細菌叢改善組成物に関する。

人の腸内には膨大な数の微生物が腸内細菌叢を形成しており、近年その細菌叢の系統組成変化が疾患と関係していることが明らかになってきている。腸内細菌叢は健康と疾患に深く関与し、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、大腸癌などの消化管疾患、生活習慣病、自己免疫疾患、自閉症などにも関連性が言われ、加齢による腸内細菌叢の変化は宿主の健康に影響与えているとも言われている（非特許文献１）。

また、肝細胞内に脂肪が沈着して脂肪肝となり、そこに炎症を惹起、繊維化が進行して肝疾患（非アルコール性脂肪肝疾患や非アルコール性脂肪肝炎など）が起こるという説があり、この説では、脂肪肝の原因として、腸内ミクロビオータが関与すると考えられている（非特許文献２）。さらに、デオキシコール酸産生妨害又は腸内細菌減少は、肥満マウスにおける肝細胞癌進展を効果的に予防することも報告されており（非特許文献３）、腸内細菌によって産生される二次胆汁酸のリトコール酸が大腸癌発生に関与していることも知られている（非特許文献４）。男性の糖尿病発症リスクの高い人では脂肪組織の抗炎症作用およびインスリン抵抗性作用を有するアッカーマンシアが腸内細菌叢における比率が低かったとの報告がある（非特許文献５）。免疫チェックポイント阻害剤に無反応であった癌患者の便微生物叢移植後にアッカーマンシアの経口補給は阻害剤の効能を取り戻したことが報告されている（非特許文献６）。さらに潰瘍性大腸炎ではアッカーマンシアなどの腸内細菌が減少していることが報告されている（非特許文献７）。特許文献１には植物由来の５量体以上のプロアントシアニジン類がアッカーマンシア属細菌の増殖を促進することについて開示されている。

グネチンＣ及びその配糖体は、メリンジョ種子の内乳に含まれている低分子化合物であり、含水アルコールなどで抽出して得られるメリンジョエキスの主要な成分であることが開示されている（特許文献２および非特許文献８）。しかし、グネチンＣ及びその配糖体がアッカーマンシアの増殖による腸内細菌叢の改善作用を有することは知られていなかった。

特開２０１８−８９１１号公報 国際公開第２００６／０３０７７１号公報

日老医誌、５３、３１８（２０１６） モダンメディア、６０、１２、３５６−３６８（２０１４） Ｓ．Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４９９，９７（２０１３） Ｖ．Ｋｏｚｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２１，９９９（２０００） Ａ．Ｅｖｅｒａｎｄ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１０，２２（２０１３） Ｂ．Ｒｏｕｌｙ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５９，３５６（２０１８） Ｌ．Ｂａｊｅｒ，ｅｔ ａｌ． Ｗｏｒｌｄ Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２３，４５４８（２０１７） Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．５７、２５４４（２００９）

本発明は、食品として使用されている安全な植物であるメリンジョ種子から得られる成分を利用することにより、腸内細菌叢を改善する組成物を提供することを課題とする。
また、本発明の更なる課題は、腸内細菌叢の改善に起因する疾患の予防及び／又は改善剤、免疫チェックポイント阻害薬の効果向上剤、及び胆汁酸代謝機能調節剤を提供することを課題とする。

本発明者らは，上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果，グネチンＣ及びその配糖体を有効成分とする組成物を摂取したマウスは、腸内細菌叢中のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ、以下、単にアッカーマンシアという）の増殖作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、前記課題を解決する本発明は、グネチンＣ及び／又はその配糖体を有効成分とする腸内細菌叢改善剤である。
本発明の腸内細菌叢改善剤は、腸内細菌叢中のアッカーマンシアの増殖を促進し、あるいは腸内細菌叢中のアッカーマンシアの存在率を高めることができる。

本発明の好ましい形態では、前記配糖体が、グネモノシドＡ、グネモノシドＣ、及びグネモノシドＤから選択される１種又は２種以上である。
これらの配糖体は、腸管内でグネチンＣに加水分解され、グネチンＣを直接摂取した場合と同様の効果が得られる。

本発明の好ましい形態では、前記腸内細菌叢改善組成物が、メリンジョエキスである。

本発明の好ましい形態では、前記腸内細菌叢改善組成物が、腸内細菌叢中のアッカーマンシアの存在比率を高める作用を有する。

また、前記課題を解決する本発明は、前記腸内細菌叢改善組成物を含む、肝機能疾患の予防剤及び／又は改善剤である。
前記腸内細菌叢改善組成物は、肝臓への脂肪沈着を抑制し、胆汁酸の代謝を調節することで、肝機能疾患を予防、又は改善する作用を有する。

本発明の好ましい形態では、前記肝機能疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、及び／又は肝臓癌である。
前記腸内細菌叢改善組成物は、肝臓への脂肪沈着を抑制し、癌の要因となる二次胆汁酸のデオキシコール酸、及びリトコール酸の量を減少させることで、肝臓癌を予防、又は改善する作用を有する。

また、前記課題を解決する本発明は、前記腸内細菌叢改善組成物を含む、大腸癌の予防剤及び／又は改善剤である。
前記腸内細菌叢改善組成物は、癌の要因となる二次胆汁酸のデオキシコール酸、及びリトコール酸の量を減少させることで、大腸癌を予防、又は改善する作用を有する。

また、前記課題を解決する本発明は、前記腸内細菌叢改善組成物を含む、免疫チェックポイント阻害薬の効果向上剤である。
前記腸内細菌叢改善組成物は、アッカーマンシアの増殖を促進し、あるいは存在比率を高めることで、免疫チェックポイント阻害薬の効果を高める作用を有する。

また、前記課題を解決する本発明は、前記腸内細菌叢改善組成物を含む、炎症性腸疾患治療剤である。
前記腸内細菌叢改善組成物は、脂肪の沈着を抑制し、当該脂肪に惹起される炎症を間接的に抑制することができる。

また、前記課題を解決する本発明は、前記腸内細菌叢改善組成物を含む、胆汁酸代謝調節剤である。
前記腸内細菌叢改善組成物は、胆汁酸代謝を調節する作用を有する。

また、前記課題を解決する本発明は、前記腸内細菌叢改善組成物を含む、飲食品。
前記腸内細菌改善組成物は、食用として安全なメリンジョエキスに含まれる成分である、グネチンＣ及び／又はその配糖体を有効成分として含むものであり、飲食品として摂取することに適している。

本発明の腸内細菌叢改善組成物は、インドネシアで食品としてよく食されていて安全であるメリンジョを使用し、そのエキス並びに、メリンジョの含有成分であるグネチンＣ及びその配糖体は腸内細菌叢中のアッカーマンシアの増殖を促進する作用を有する。
この作用により腸内細菌叢の改善作用による非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）や非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝機能疾患、肝臓癌、大腸癌などの予防及び治療のみならず、免疫チェックポイント阻害薬の効果向上による癌治療や胆汁酸代謝調節による生活習慣病の改善に使用することができる。また、このような作用を有するグネチンＣ及びその配糖体を含有する組成物及び飲食品を摂取又は服用して肝疾患、炎症性腸疾患、癌及び生活習慣病の予防或いは治療に有用である。

試験例３における高脂肪食を摂取したマウス、および試験食を摂取したマウスの肝組織の顕微鏡写真である。

本発明の腸内細菌叢改善組成物における、腸内細菌叢の改善とは、腸内細菌叢中のアッカーマンシ・ムシニフィラアの存在率を増大させることを意味する。アッカーマンシアは、ウエルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）門アッカーマンシア属のグラム陰性、偏性嫌気性、非運動性、非芽胞形成性の細菌である。炭素と窒素源としてムチンを利用して動物種の消化器管にコロニーを形成することができ、抗炎症作用を示す。

本発明の腸内細菌叢改善組成物は、有効成分としてグネチンＣ及び／又はその配糖体を用いる。
グネチンＣは下記式（１）で表される化合物である。グネチンＣの配糖体としては、グネモノシドＣ、グネモノシドＤ、及びグネモノシドＡが存在する。
グネモノシドＣは、下記式（１）におけるフラン環に置換したヒドロキシフェニル基の水酸基がグルコシル基で置換された化合物であり、グネモノシドＤはヒドロキシスチリル基の水酸基がグルコシル基で置換された化合物であり、グネモノシドＡはヒドロキシフェニル基とヒドロキシスチリル基の両水酸基が、グルコシル基で置換された化合物である。

グネチンＣ及び／又はその配糖体は、メリンジョ種子内乳の主要成分である。したがって、メリンジョを抽出して、メリンジョエキスを得た後、当該エキスを分離精製することで、グネチンＣ及びその配糖体を得ることができる。例えば、特許文献２記載の方法で抽出してメリンジョエキスを得ることができる。そのエキスをオクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）カラム及びシリカゲルカラムを用いた非特許文献６記載の方法、並びにポリスチレン樹脂カラムを用いた分離精製により、グネチンＣ及びその配糖体をそれぞれ得ることができる。

具体的には、メリンジョの果皮、種皮、薄皮、胚乳から選択される１種／又は２種以上を抽出原料とすることで、メリンジョエキスを得ることができる。
抽剤としては、水、及び／又は有機溶剤を用いることができ、水と極性有機溶剤との混合溶剤である水系抽剤を用いることが好ましい。

有機溶媒としては、１）メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどのアルコール類（ジオール、トリオールを含む。）、２）ジエチルエーテル、セロソルブ、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類(環状エーテルを含む。）、３)酢酸メチル、酢酸エチル、セロソルブアセテートなどのエステル類、４）アセトンなどのケトン類、酢酸、氷酢酸、プロピオン酸などの常温で液体の有機酸、５）エチレンジアミン、ピリジン、モノメタノールアミン等のアミン類、６）へキサン、シクロへキサン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン、キシレン等の炭化水素類(脂肪族、脂環式、芳香族を含む。）、７)塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、１，２−ジクロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭素を挙げることができる。

水系抽剤に使用する極性有機溶媒は、上記のうちで、水と自由に混和可能なメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどの低級アルコール類、ジエチルエーテルなどのエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、酢酸、氷酢酸、プロピオン酸などの常温で液体の有機酸を好適に使用できる。これらのうち、本発明の腸内細菌叢改善組成物が経口剤である場合には、許容残留濃度の高いもの（例えば、エタノール）を用いることで、後精製が不要となり望ましい。

本発明の腸内細菌叢改善組成物は、アッカーマンシアの増殖を促進することに起因して、肝機能疾患、炎症性腸疾患、癌や生活習慣病などの予防及び／又は治療のために服用及び摂食できる予防剤、治療剤として用いることができる。
本発明の腸内細菌叢組成物は、特定保健用食品、機能性表示食品、健康食品及び飲食品等の形態で使用することができる。

本発明の腸内細菌叢改善組成物は、服用及び飲用を容易にするために配合剤を加えて一般的方法によりペースト状物、固形状物及び粉末状物とし、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などの製剤および飲料、チョコレート、穀粉製品、乳製品などの飲食品に加工することができる。配合剤としては、加工形態により適宜、乳化剤、デキストリン、澱粉、糖類などの賦形剤、増粘・ゲル化剤、崩壊剤、滑沢剤、油脂、高級アルコールなどが使用することができる。飲食品にあっては一般的食品原料として使用されているものを適宜配合することができる。

本発明の組成物をアッカーマンシアの増殖を促進させるために経口剤として用いる場合の服用（投与、飲用）量は、服用の目的や服用者の状況（性別、年齢、体重、肥満度、総合的健康度合いなど）により異なるが、通常、1日の服用量として、グネチンＣとしての重量換算で、１０〜１０００ｍｇ／ヒト／日の範囲で服用することができる。また、動物にあっても同様に適用することができる。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

製造例１（メリンジョエキス粉末）
特許文献１の方法に準じ、メリンジョ種子内乳を含水エタノールに室温浸漬し、ろ過して抽出液を減圧濃縮して得たメリンジョエキスを水に溶かし、デキストリンを添加溶解した後、凍結乾燥して製造したメリンジョエキス粉末（ホソダＳＨＣ製ＬｏｔＯＭＰ−５１７０６１）を試験例で使用した。本粉末をＨＰＬＣ分析したところ、グネモノシドＡ、グネモノシドＤおよびグネチンＣをそれぞれ１９．９％、４．３％、２．３％含有していた。

製造例２（グネモノシドＡおよびグネチンＣの分離精製）
特許文献１の方法に準じ、メリンジョ種子内乳２ｋｇを６０％エタノール６Ｌに室温で２日浸漬した後、ろ過して抽出液を減圧濃縮してペースト状のメリンジョエキス３３０ｇを得た。本メリンジョエキス１５０ｇを水に溶解させて、ＯＤＳカラムに付し、含水メタノールにより溶出分離し、非特許文献６の方法に準じて分離精製して非晶性粉末のグネモノシドＡを９ｇおよび非晶性粉末のグネチンＣを１１ｇ得た。当該グネチンＣをシリカゲルカラムに付し、塩化メチレン及びエタノールの混合液により溶出精製して、非晶性粉末のグネチンＣを１０ｇ得た。

（試験例１）
マウス１８匹を、普通食（リサーチダイエット製Ｄ１２４５０Ｂ）を摂取させる普通食群６匹、高脂肪食（リサーチダイエット製Ｄ１２４９２）を摂取させる高脂肪食群６匹、および高脂肪食に製造例１で製造したメリンジョエキス粉末を０．５％含有させた試験食を摂取させる試験食群６匹にそれぞれ分類した。それぞれ食事を５ｇ／匹／日で８週間連続自由摂取させた後、糞採取し、凍結乾燥して保管した。

凍結乾燥糞を粉砕後、１０ｍｇの糞に１％ＳＤＳ及びフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液を加えて撹拌した後、遠心分離を行った。上清にフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて混合し、さらに遠心分離行った。
次いで、上清に３Ｍ酢酸ナトリウム液及び冷エタノールを加えて混合して−８０℃で静置後、遠心分離し、エタノールを除去した。
次いで、沈降物に７０％エタノールを加えて混和し、遠心分離して上層を除去した後、乾燥した。
乾燥物にＥＤＴＡ含有トリス緩衝液（ｐＨ８）０．１ｍＬを加えて撹拌し、遠心分離後、上清の２０μＬを−３０℃に保存し、残液にＲＮａｓｅＡを加えて３７℃で一夜インキュベートした。
インキュベート後の液に純水を加えて２００μＬに調整し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液２００μＬを加えて撹拌後、遠心分離した。
次いで、上清に３Ｍ酢酸ナトリウム液（ｐＨ５．２）２０μＬを加えて混合し、次いで冷エタノール４００μＬを加えて混合し、氷冷後、遠心分離して上清を分離した。沈降物に７０％エタノール５００μＬを加えて混和し、冷却遠心分離して上層を除去した。同操作を再度行った後、乾燥させた。
乾燥物にＥＤＴＡ含有トリス緩衝液（ｐＨ８）５０μＬを加えて撹拌し、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いてＤＮＡ濃度を測定し、濃度をＥＤＴＡ含有トリス緩衝液（ｐＨ８）で希釈して１０ｎｇ／μＬとした。
希釈液１μＬ、に対してＦ Ｐｒｉｍｅｒ （２７ Ｆｍｏｄ： １０ μＭ）１．２５μＬ、Ｒ Ｐｒｉｍｅｒ （３３８Ｒ： １０ μＭ）１．２５μＬ、２× Ｇｆｌｅｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ２５μＬ、Ｔｋｓ Ｇｆｌｅｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μＬ、及び純水２０．５μＬを混合して試料液とした。
試料液を９８℃から５５℃次いで６８℃のサイクルを２０回行ってＰＣＲ反応を行った後、４℃で保存した。各試料液５μＬと６×Ｌｏａｄｉｎｇ緩衝液１μＬの混液の２％寒天ゲル（ＥＤＴＡ含有トリス緩衝液）電気泳動（マーカー：∫Ｘ１７４／ＨａｅＩＩＩｄｉｇｅｓｔ）の後、細菌分析を行い、その結果から腸内細菌叢解析を行った。
結果を表１に示す。なお、表中の数字は、各群のマウス（６匹）の平均値である。

腸内細菌叢解析を行ったところ、普通食群ではフィルミクテス門の細菌が５７．４％、バクテロイデス門の細菌が２７．８％、およびプロテオバクテリア門の細菌が８．９％存在していた。
高脂肪食群ではフィルミクテス門の細菌が４２．８％、バクテロイデス門の細菌が３８．８％およびプロテオバクテリア門の細菌が１２．４％存在していた。
一方、試験食群では、前記普通食群、および高脂肪食群では存在が確認できなかった、ウエルコミクロビウム門の細菌が４１．８％存在し、フィルミクテス門の細菌が１．８％、バクテロイデス門の細菌が３６．５％、プロテオバクテリア門の細菌が１８．６％存在していた。試験食群において確認された、ウエルコミクロビウム門の菌種は、アッカーマンシア菌であり、存在率は４１．８％であった。

この結果から、本発明の腸内細菌叢改善組成物は、アッカーマンシアの増殖を促進し、あるいは腸内細菌叢中のアッカーマンシアの存在率を高める作用を有することがわかった。

（試験例２）
試験例１のマウス１８匹を解剖して、肝臓の重量を測定した。
結果を表２に示す。

測定の結果、高脂肪食群の肝臓の重量は、普通食群の肝臓の重量と比して２．１倍であった。
一方、試験食群の肝臓の重量は、普通食群の肝臓の重量と比して１．３倍であった。
この結果は、メリンジョエキス粉末を含む高脂肪食を摂取した試験食群は、高脂肪食群と比して、肝臓の脂肪蓄積が半分以下に抑えられたことを示している。また、この結果から、腸内細菌叢中のアッカーマンシアが増殖し、あるいは腸内細菌叢中のアッカーマンシアの存在率が高められたことで、肝臓の脂肪の蓄積が抑制されたと推定される（非特許文献２参照）。

（試験例３）
試験例１のマウス１８匹を解剖して、肝臓中の胆汁酸分析、及び糞中の胆汁酸分析を次のように行った。
内部標準の重水素化胆汁酸の入ったインキュベート用チューブに各マウスの肝臓試料をそれぞれ２０ｍｇ入れ、８．９Ｍ水酸化カリウム液１０μＬ及び滅菌純水９０μＬを加えて混合後、８０℃で２０分間インキュベートし、０．５Ｍりん酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．３）２ｍＬを加えて混合してから遠心分離して試料液とした。各試料液をＬＣＭＳ分析（液体クロマトグラフィー質量分析）することにより各胆汁酸の量を求めた。結果を表３に示す。
また、各糞試料２０ｍｇの入ったチューブに８．９Ｍ水酸化カリウム液５０μＬ及び滅菌純水４５０μＬを加えて混合し、８０℃で２０分間インキュベート後、遠心分離して上清を分取した。各上清１０μＬを内部標準の重水素化胆汁酸の入ったインキュベート用チューブにそれぞれ加えて試料液とし、ＬＣＭＳ分析を行って各胆汁酸の量を求めた。結果を表４に示す。

分析の結果、普通食群に対する高脂肪食群のコール酸、タウロコール酸およびタウロ−β−ミュリコール酸の含有量は、それぞれ０．８倍、０．９倍および２倍であった。
一方で、普通食群に対する試験食群のコール酸、タウロコール酸、およびタウロ−β−ミュリコール酸の含有量は１０倍、１．６倍および１６倍であり、何れの胆汁酸も含有量が大きく増加した。
以上の結果は、本発明の腸内細菌叢改善組成物は、腸内細菌叢を変化させることにより、胆汁酸の含有量が高められ、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）や非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝機能疾患を抑制する作用を有することを示している。

糞中の胆汁酸を分析した結果、普通食群に対する高脂肪食群のコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、β−ミュリコール酸およびタウロβ−ミュリコール酸の含有量は、２．２倍、１６．５倍、２２．０倍、２．７倍および２．０倍であった。
一方で、普通食群に対する試験食群のコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、β−ミュリコール酸およびタウロβ−ミュリコール酸の含有量は、２７．３倍、０．８倍、０倍（試験食群において、リトコール酸は確認できなかった）、８．７倍および１６．４倍であった。
これらのことから、高脂肪食群では、脱酸素化された発癌性のデオキシコール酸およびリトコール酸の割合が大きく上昇したのに対し、試験食群では前記腸内細菌叢の変化により、コール酸、β−ミュ−リコール酸およびタウロβ−ミュリコール酸の含有量が大きく増加し、発癌性のデオキシコール酸およびリトコール酸の含有量が著しく減少していることがわかる。この結果から、本発明の腸内細菌叢改善組成物は、腸内細菌叢を変化させることにより、大腸癌などの発癌を抑制する作用を有することを示唆している。

（試験例４）
マウス２１匹を普通食群７匹、高脂肪食群７匹および高脂肪食に製造例２で分離精製したグネチンＣを０．５％含有させた試験食群７匹に分類し、それぞれ食事を５ｇ／匹／日で１４週間連続自由摂取させ、経週的に体重計測した。結果を表５に示す。

普通食群及び試験食群の体重は、経週的にゆっくりと増加し、１４週後の体重は、それぞれ開始時の１．４２倍及び１．４３倍であった。
一方で、高脂肪食群の体重は、経週的に大きく増加していき、１４週間後の体重は開始時の２．２４倍であった。
この結果は、本発明の腸内細菌改善組成物が、脂肪蓄積を抑制する作用を有することを示している。

（試験例５）
試験例４のマウス２１匹を解剖して、肝臓重量、肝臓トリグリセリドの含有量および内臓脂肪重量を測定した。
肝臓及び腸管膜をクロロホルム／メタノール混合液に加えてホモジナイザーで破砕後、遠心分離して上清を分取した。これらの上清から減圧下で溶媒を留去して得た残留物に２−プロパノールを加えて溶解し、酵素分析キットのデタミナーＬ ＴＧＩＩ（協和メデックス）で肝臓トリグリセリド量を測定し、コレステロールＥテストワコー（和光純薬）で総コレステロール量を測定した。結果を表６に示す。

普通食群に対する高脂肪食群の肝臓重量、肝臓トリグリセリドの含有量、および内臓脂肪重量は、それぞれ１．５倍、６．５倍および３．５倍であった。
一方で、普通食群に対する試験食群の肝臓重量、肝臓トリグリセリドの含有量、および内臓脂肪重量は０．９倍、０．６倍および０．９倍であった。
高脂肪食群に対する試験食群の肝臓重量、肝臓トリグリセリドの含有量、および内臓脂肪重量は、それぞれ約１／２、１／１０および１/４であった。
高脂肪食群では、肝臓重量、肝臓トリグリセリドの含有量および内蔵脂肪重量が大きく増加したのに対して、試験食群では、いずれのパラメーターも普通食群よりも低かった。
この結果から、本発明の腸内細菌叢改善組成物は、肝臓および内臓の脂肪蓄積を抑制する作用を有することを示している。

（試験例６）
マウス２１匹を普通食群７匹、高コレステロール食群７匹および高コレステロール食に製造例２で分離精製したグネチンＣを０．１％含有させた試験食群７匹に分類し、それぞれ食事を５ｇ／匹／日で２１週間連続自由摂取させた後、採血を行い、血漿中の総コレステロール量、遊離コレステロール量及びトリグリセリドを生化学分析機で測定した。また、血漿中の肝機能指標であるＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の量は、Ａｓｓａｙ ＫｉｔＦｕｎａｋｏｓｈｉ Ｋ７５２−１００を使用して測定した。
具体的には、マウスに３％ウシ胎児血清含有リン酸緩衝生理食塩水を注入し、腹部から注射針付きシリンジを使用して血液を採取した。採取液を冷却遠心分離（１０００ｒｐｍ、４℃、５ｍｉｎ）し、上清を除去してマクロファージを得た。このマクロファージから、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｋ.Ｋ.)を用いてｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(ＴａＫａＲａ)を用いてｔｏｔａｌＲＮＡから合成した。個々のｃＤＮＡ(ＭＣＰ−１、Ｃｏｌ３α１、Ｃｄ１１ｃ)を、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥｘＴａＩＩ（ＴａＫａＲａ）、ＰＩＫＯ Ｒｅａｌ（Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ.Ｋ）を用いて、定量ＲＴ−ＰＣＲ測定した。
採血後、マウスを解剖し、肝重量の測定を行い、肝臓の顕微鏡観察を行った（図１）。なお、肝臓の繊維化を確認するため、肝臓にマッソントリックローム染色を行った（繊維化：染色部分）。また、脂肪球を明確に確認するために、肝臓にヘマトキシリンエオジン染色を行った（脂肪球：非染色部分）。結果を表７に示す。

普通食群に対する高コレステロール食群の肝臓重量、総コレステロール量、遊離コレステロール量、トリグリセリドおよびＡＬＴの量は、それぞれ１．５倍、１．５倍、１．６倍、０．６倍及び８．２倍、であった。
一方で普通食群に対する試験食群の肝臓重量、総コレステロール量、遊離コレステロール量、及びＡＬＴの量はそれぞれ０．９倍、１．３倍、１．１倍、０．３倍及び４．６倍であった。
高コレステロール食群では、血中コレステロール量に大きく増加したのに対し、試験食群では、血中コレステロール量の増加が抑制され、普通食群の値に近くなった。
また、高脂肪食群では、ＡＬＴが著しく上昇したのに対し、試験食群では、ＡＬＴの量が高脂肪食群に対し約１／２であった。
この結果から、本発明の腸内細菌叢改善組成物は、肝機能を改善する作用、又は肝機能の悪化を予防する作用を有することを示している。

普通食群に対する高コレステロール食群のＭＣＰ−１量、Ｃｏｌ３α１量、及びＣｄ１１ｃ量は、それぞれ６．５倍、７．８倍及び６．８倍であった。高コレステロール食群のマウスは、何れのマーカーも著しく上昇しており、肝障害が進展して非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）を呈していた。
一方、普通食群に対する試験食群のＭＣＰ−１量、Ｃｏｌ３α１量、及びＣｄ１１ｃ量は、それぞれ４．１倍、３．０倍、及び３．３倍であった。
この結果から、本発明の腸内細菌改善組成物は、高コレステロール食と併せて摂取した場合でも、肝機能の悪化を抑制できることを示している。

高コレステロール食群、及び試験食群の肝組織を顕微鏡観察したところ、高コレステロール食群の肝臓には、繊維化および大きな中性脂肪滴が確認されたのに対し、試験食群では、繊維化が見られず、中性脂肪滴も小さかった（図１）。
また、普通食群に対する高コレステロール食群の肝重量は、２．８倍であったのに対し、普通食群に対しる試験食群の肝重量は１．８７倍であった。この結果から、本発明の腸内細菌叢改善組成物は、高コレステロール食による重量増が抑制する作用を有していることがわかった。

以上の結果からグネチンＣを有効成分として含む本発明の腸内細菌叢改善組成物は、高脂肪・高コレステロ食摂取による肝臓および内蔵への脂肪蓄積による重量増、肝機能低下、肝臓の炎症、肝線維化などによる非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝臓癌に対して、腸内細菌叢を改善することで、その進行抑制および改善効果を有することが示された。
また、試験例３において、試験食群では、腸内細菌叢改善作用によりデオキシコール酸の量、及びリトコール酸の量が著しく低下したことが確認された。ここで、核内受容体中の胆汁酸をリガンドとするファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）は、コレステロール代謝および脂質代謝に関与していることが知られている。したがって、本発明の腸内細菌叢改善組成物は、デオキシコール酸、及びリトコール酸の量を減少させることにより、コレステロール代謝、及び脂質代謝が低下し、セラミド合成低下による線維化抑制を伴って肝臓内中性脂肪蓄積が減少する作用を有すると推察される。

（試験例７）
高脂肪食に実施例２で分離精製したグネモノシドＡを０．５％含有させた試験食をマウス７匹に５ｇ／匹／日を１４週間連続自由摂取させた後に糞を１０ｍｇ採取した。この糞及び試験例４で採取した糞１０ｍｇをそれぞれ採取し、それぞれメタノール（アセトニトリル水溶液）に加え、超音波処理して懸濁させた後、ろ過した。ろ液をヘキサン洗浄後、ＯＤＳカートリッジを通し、流出液２０μＬをＨＰＬＣ装置に注入した。

試験例４で採取した糞における、ＨＰＬＣクロマトグラムでは、グネチンＣとそのモノグルクロン酸抱合体のピークが認められた。
一方で、試験例７で採取した糞における、ＨＰＬＣクロマトグラムでは、グネモノシドＡ、Ｃ及びＤのピークは認められず、グネチンＣとモノグルクロン酸抱合体のピークが認められた。

この結果は、グネモノシドＡは、腸管内で加水分解されてグネチンＣに変化していることを示している。
したがって、本発明の腸内細菌叢改善組成物は、有効成分としてグネモノシドＡ、グネモノシドＣ及びグネモノシドＤを含む場合であっても、これらの成分は腸管内でグネチンＣに加水分解されるため、グネチンＣを有効成分として含む場合と同様に、腸内細菌叢改善効果を有することがわかった。

製造例３（錠剤の製造）
製造例１で製造したメリンジョエキス粉末１部、ショ糖脂肪酸エステル０．５部、乳糖０．５部及び結晶セルロース０．２部を混合した後、打錠機で打錠して直径８ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤（グネモノシドＡ：１５ｍｇ、グネモノシドＤ：４．４ｍｇ、グネチンＣ：３．２ｍｇ）を製造した。

製造例４（軟カプセル剤の製造）
実施例２で製造したグネチンＣ粉末１部、グリセリン脂肪酸エステル１部、大豆レシチン０．２部及びコーン油１．８部を十分に混合した後、ゼラチンカプセルに充填して軟カプセル（内容物２００ｍｇ、グネチンＣ：５０ｍｇ）を製造した。

製造例５（クッキーの製造）
実施例２で製造したグネモノシドＡ１部、薄力粉２．５部、全卵１部、バター２部、上白糖１．５部、バター１．５部、脱脂粉乳０．３部、ベーキングパウダー０．０２部及び水０．８部を混練り後、オーブンで焼いてクッキー（グネモノシドＡ：１６％）を製造した。

インドネシアでよく食されているメリンジョ種子内乳を原料とするメリンジョエキスは安全であり、その主要成分であるグネチンＣ及び／又はその配糖体はアッカーマンシアの存在率を高める作用を有しているので、腸内細菌叢を改善して非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）や非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）などの肝機能疾患、肝臓癌、大腸癌、炎症性腸疾患などの予防及び治療だけでなく免疫チェックポイント阻害薬の効果向上による癌治療や胆汁酸代謝調節による生活習慣病の改善に役立ち有用である。したがって、このような作用を有する主成分のグネチンＣ及び／又はその配糖体を有効成分として含有する本発明の腸内細菌叢改善組成物は、服用及び飲食用を容易にするために配合剤を加えて固形状物及び粉末状物とし、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤などの製剤及び飲食品に容易に加工することができるので、患者の病状改善に貢献できる。

Claims (7)

1. グネチンＣ及び／又はその配糖体を有効成分として含有してなることを特徴とする、腸内細菌叢中のアッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）の存在比率向上用組成物。
2. 前記配糖体がグネモノシドＡ、グネモノシドＣ及びグネモノシドＤから選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物がメリンジョエキスであることを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
4. 請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物を含むことを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎、及び／又は肝臓癌の予防剤及び／又は改善剤。
5. 請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物を含むことを特徴とする、免疫チェックポイント阻害薬の効果向上剤。
6. 請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物を含むことを特徴とする、炎症性腸疾患治療剤。
7. 前記組成物が飲食品であることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
   

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