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JP6755866B2 - Ｃｄ７３特異的結合分子及びその使用 - Google Patents

Ｃｄ７３特異的結合分子及びその使用 Download PDF

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Description

ＣＤ７３又はエクト−５’−ヌクレオチダーゼ（５’−ＮＴ）は幾つもの組織に遍在的に発現する。このタンパク質はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結を介して細胞膜にアンカリングし、細胞外酵素活性を有し、シグナル伝達において役割を果たす。ＣＤ７３の主な機能は、概して細胞非透過性である細胞外ヌクレオチド（例えば５’−ＡＭＰ）を、多くの細胞に容易に進入し得るその対応するヌクレオシド（例えばアデノシン）に変換することである。ＣＤ７３のＡＭＰ脱リン酸化によるアデノシン産生は多くの組織においてアデノシン受容体会合を調節することが示されており、アデノシンが細胞保護、細胞成長、血管新生及び免疫抑制において機能すると共に、腫瘍発生においても役割を果たすことが示唆される。
結腸直腸癌、膵癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、及び乳癌を含めた幾つかの種類の癌において、腫瘍細胞上のＣＤ７３発現が報告されている。ＣＤ７３の発現上昇はまた、腫瘍侵襲性、転移、及び患者生存期間の低下とも関連付けられている。ＣＤ７３は、アデノシンレベルの増加によって特徴付けられる免疫抑制環境を作り出し、それが癌の発生及び進行を促進する。特に、ＣＤ７３発現は、メラノーマ及び乳癌における前転移性表現型と関連付けられている。
免疫チェックポイント阻害薬は、癌療法として多大な可能性を有している。それにも関わらず、免疫チェックポイント阻害の臨床的有益性はそれほど得られていない。１つの可能性のある説明は、腫瘍が重なりのない免疫抑制機構を用いて免疫エスケープを促進するというものである。従って、腫瘍媒介性免疫抑制を低減するための改良された組成物及び方法が喫緊に必要とされている。
本発明は、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供する。一部の態様において、かかるＣＤ７３結合分子は、例えば、抗体又はその抗原結合断片である。詳細な実施形態において、本発明の抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）は、腫瘍媒介性免疫抑制の低減に有用である。従って、本発明はまた、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）と癌免疫サイクルの別の側面を標的化する他の薬剤（即ち抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体；抗ＣＴＬＡ４抗体、Ａ２ａＲアンタゴニスト、ＳＴＡＴ−３阻害薬）とを特徴とする治療的併用も提供し、かかる併用の使用方法は、腫瘍媒介性免疫抑制の低減に有用である。
一態様において、本発明は、ＣＤ７３エピトープに特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、結合分子は、ＣＤ７３０００２、ＣＤ７３０００３、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３００１０、ＣＤ７３００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、又はＣＤ７３００５８から選択される抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する抗体又はその抗原結合断片と同じＣＤ７３エピトープに特異的に結合する。
別の態様において、本発明は、ＣＤ７３に特異的に結合し、且つＣＤ７３０００２、ＣＤ７３０００３、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３００１０、ＣＤ７３００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、又はＣＤ７３００５８のＶＨ及びＶＬを含む抗体又はその抗原結合断片によるＣＤ７３結合を競合的に阻害する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＬを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＬは、アミノ酸配列：
［ＦＷ１］ＳＧＳＬＳＮＩＧＲＮＸ１ＶＮ［ＦＷ２］ＬＸ２ＮＸ３ＲＸ４Ｘ５［ＦＷ３］ＡＴＷＤＤＳＸ６Ｘ７ＧＷＸ８［ＦＷ４］
（式中、［ＦＷ１］、［ＦＷ２］、［ＦＷ３］及び［ＦＷ４］はＶＬフレームワーク領域を表し、ここで、Ｘ１はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、Ｘ２はアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ３はアミノ酸残基グルタミン（Ｑ）又はロイシン（Ｌ）を表し、
Ｘ４はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はプロリン（Ｐ）を表し、
Ｘ５はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ６はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はヒスチジン（Ｈ）を表し、
Ｘ７はアミノ酸残基リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）又はアスパラギン（Ｎ）を表し、及び
Ｘ８はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はスレオニン（Ｔ）を表す）を有する。本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、請求項６に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片であり、ＦＷ１は配列番号２５又は２６を含み、ＦＷ２は配列番号２７又は２８を含み、ＦＷ３は配列番号２９を含み、及びＦＷ４は配列番号３０を含む。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＨを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＨは、アミノ酸配列：
［ＦＷ５］ＳＹＡＸ９Ｓ［ＦＷ６］Ｘ１０ＩＸ１１ＧＳＸ１２ＧＸ１３ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［ＦＷ７］ＬＧＹＸ１４Ｘ１５Ｘ１６ＤＸ１７［ＦＷ８］
（式中、［ＦＷ５］、［ＦＷ６］、［ＦＷ７］及び［ＦＷ８］はＶＨフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ９はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ１０はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）を表し、
Ｘ１１はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１２はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はグリシン（Ｇ）を表し、
Ｘ１３はアミノ酸残基セリン（Ｓ）又はアルギニン（Ｒ）を表し、
Ｘ１４はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１５はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はスレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ１６はアミノ酸残基バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）を表し、及び
Ｘ１７はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）又はグルタミン酸（Ｅ）を表す）を有する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＬは、アミノ酸配列：
［ＦＷ１］ＳＧＳＬＳＮＩＧＲＮＸ１ＶＮ［ＦＷ２］ＬＸ２ＮＸ３ＲＸ４Ｘ５［ＦＷ３］ＡＴＷＤＤＳＸ６Ｘ７ＧＷＸ８［ＦＷ４］
（式中、［ＦＷ１］、［ＦＷ２］、［ＦＷ３］及び［ＦＷ４］はＶＬフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ１はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ２はアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ３はアミノ酸残基グルタミン（Ｑ）又はロイシン（Ｌ）を表し、
Ｘ４はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はプロリン（Ｐ）を表し、
Ｘ５はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ６はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はヒスチジン（Ｈ）を表し、
Ｘ７はアミノ酸残基リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）又はアスパラギン（Ｎ）を表し、及び
Ｘ８はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はスレオニン（Ｔ）を表す）を有し、ＶＨは、アミノ酸配列：
［ＦＷ５］ＳＹＡＸ９Ｓ［ＦＷ６］Ｘ１０ＩＸ１１ＧＳＸ１２ＧＸ１３ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［ＦＷ７］ＬＧＹＸ１４Ｘ１５Ｘ１６ＤＸ１７［ＦＷ８］
（式中、［ＦＷ５］、［ＦＷ６］、［ＦＷ７］及び［ＦＷ８］はＶＨフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ９はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ１０はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）を表し、
Ｘ１１はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１２はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はグリシン（Ｇ）を表し、
Ｘ１３はアミノ酸残基セリン（Ｓ）又はアルギニン（Ｒ）を表し、
Ｘ１４はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１５はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はスレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ１６はアミノ酸残基バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）を表し、及び
Ｘ１７はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）又はグルタミン酸（Ｅ）を表す）を有する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＬを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＬは、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１又は配列番号５２と同一であるか、又は４、３、２若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一であるＶＬ相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＬを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＬは、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、又は配列番号５６と同一であるか、又は４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一である相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＨを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＨは、配列番号３５又は配列番号３６と同一であるか、又は４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一である相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＨを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＨは、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、又は配列番号４０と同一であるか、又は４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一である相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＨを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＨは、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、又は配列番号４５と同一であるか、又は４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一である相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＬを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＬは、それぞれ、配列番号４６、４９及び５３；配列番号４７、４９、及び５３；配列番号４７、４９、及び５４；配列番号４６、５０、及び５４；配列番号４６、５１、及び５５；配列番号４８、５２、及び５４；配列番号４６、４９、及び５６；配列番号４７、４９、及び５６；配列番号４６、５０、及び５６；配列番号４６、５１、及び５６；又は配列番号４８、５２、及び５６と同一であるか、又はＶＬ−ＣＤＲの１つ以上における４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一であるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＨを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＨは、それぞれ、配列番号３５、３７及び４１；配列番号３６、３７、及び４２；配列番号３６、３８、及び４３；配列番号３６、３９、及び４４；配列番号３６、４０、及び４４；配列番号３５、３７、及び４５；配列番号３６、３７、及び４５；配列番号３６、３８、及び４５；配列番号３６、３９、及び４５；又は配列番号３６、４０、及び４５と同一であるか、又はＶＨ−ＣＤＲの１つ以上における４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一であるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、配列番号４６、４９、５３、３５、３７、及び４１；配列番号４７、４９、５３、３５、３７、及び４１；配列番号４７、４９、５４、３６、３７、及び４２；配列番号４６、５０、５４、３６、３８、及び４３；配列番号４６、５１、５５、３６、３９、及び４４；配列番号４８、５２、５４、３６、４０、及び４４；配列番号４６、４９、５６、３５、３７、及び４１；配列番号４６、４９、５３、３５、３７、及び４５；配列番号４７、４９、５６、３６、３７、及び４５；配列番号４６、５０、５６、３６、３８、及び４５；配列番号４６、５１、５６、３６、３９、及び４５；配列番号４８、５２、５６、３６、４０、及び４５；又は配列番号４６、４９、５６、３５、３７、及び４５と同一であるか、又は１つ以上のＣＤＲにおける４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一であるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＲＤ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有するＶＬ及びＶＨを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＬは、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約９０％〜約１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、ＶＨは、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３及び配列番号８４から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約９０％〜約１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明は、ＣＤ７３に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗体又は抗原結合断片は、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約９０％〜約１００％同一である配列を有するＶＬを有し、抗体又は抗原結合断片は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３及び配列番号８４から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約９０％〜約１００％同一である配列を有するＶＨを有する。
別の態様において、本発明は、配列番号５７から本質的になるＶＬと配列番号７１から本質的になるＶＨとを有する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様において、本発明は、配列番号６８から本質的になるＶＬと配列番号８２から本質的になるＶＨとを有する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様において、本発明は、配列番号５７からなるＶＬと配列番号７１からなるＶＨとを有する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様において、本発明は、配列番号６８からなるＶＬと配列番号８２からなるＶＨとを有する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明に係る単離抗体又はその抗原結合断片と担体とを含有する組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明に係る単離抗体又はその抗原結合断片をコードする配列を有する核酸を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明に係る核酸を含む組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明に係る核酸を含有するベクターを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明に係る核酸配列、組成物、又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、本発明に係る核酸配列、組成物、又はベクターを含有する細胞を培養するステップと、抗体又はその抗原結合断片を単離するステップとを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、標識された本発明に係る単離抗体又は抗原結合断片を含有する診断試薬を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明に係る単離抗体若しくはその抗原結合断片、組成物、又は診断試薬を含有するキットを提供する。
別の態様において、本発明は、ＣＤ７３を発現する細胞の成長を阻害する方法であって、細胞を本発明に係る抗体又はその抗原結合断片に接触させるステップを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、癌の治療を、それを必要としている対象において行う方法であって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片の治療有効量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、対象の癌を治療する方法であって、本発明に係る抗体又は抗原結合断片である第１の薬剤の治療有効量を、第１の薬剤以外の抗癌剤である第２の薬剤の治療有効量と併用して対象に投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、参照と比べてＣＤ７３の発現が増加した腫瘍を有すると同定された対象に抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片を投与するステップを含む治療方法を提供する。
別の態様において、本発明は、参照と比較してＣＤ７３の発現が増加した腫瘍を有すると同定された対象に、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、若しくは抗ＣＴＬＡ４、又はその抗原結合断片とを投与するステップを含む治療方法を提供する。
別の態様において、本発明は、参照と比較してＣＤ７３の発現が増加した腫瘍を有すると同定された対象に、ＭＥＤＩ９４４７若しくはＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１、又はその抗原結合断片と、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））若しくはニボルマブ（Ｏｐｄｉｖａ（登録商標））、又はその抗原結合断片とを投与するステップを含む治療方法を提供する。
別の態様において、本発明は、参照と比較してＣＤ７３の発現が増加した腫瘍を有すると同定された対象に、ＭＥＤＩ９４４７若しくはＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１、又はその抗原結合断片と、ＭＥＤＩ４７３６又はその抗原結合断片とを投与するステップを含む治療方法を提供する。
別の態様において、本発明は、参照と比較してＣＤ７３の発現が増加した腫瘍を有すると同定された対象に、ＭＥＤＩ９４４７若しくはＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１、又はその抗原結合断片と、トレメリムマブ又はその抗原結合断片とを投与するステップを含む治療方法を提供する。
別の態様において、本発明は、抗ＣＤ７３療法に応答性の癌を有する対象を同定する方法を提供し、この方法は、対象の腫瘍細胞又は血液細胞における参照と比べたＣＤ７３発現又は活性レベルの増加を検出して、前記癌を抗ＣＤ７３療法に応答性であると同定するステップを含む。
別の態様において、本発明は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法のうちの１つ以上と併用した抗ＣＤ７３療法に応答性の癌を有する対象を同定する方法を提供し、この方法は、対象の腫瘍細胞又は血液細胞における参照と比べたＣＤ７３発現又は活性レベルの増加を検出して、前記癌を、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法のうちの１つ以上と併用した抗ＣＤ７３療法に応答性であると同定するステップを含む。
別の態様において、本発明は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法に応答性の癌を有する対象を同定する方法を提供し、この方法は、対象の腫瘍細胞又は血液細胞における参照と比べたＣＤ７３発現又は活性レベルの低下を検出して、前記癌を、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法に応答性であると同定するステップを含む。
別の態様において、本発明は、対象の腫瘍成長を阻害する方法を提供し、この方法は、抗ＣＤ７３抗体、又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体のうちの１つ以上、又はその抗原結合断片とを、それを必要としている対象に投与するステップを含む。
別の態様において、本発明は、対象の抗腫瘍免疫応答を増加させる方法を提供し、この方法は、抗ＣＤ７３抗体、又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体のうちの１つ以上、又はその抗原結合断片とを、それを必要としている対象に投与するステップを含む。
別の態様において、本発明は、対象の腫瘍を治療する方法を提供し、この方法は、抗ＣＤ７３抗体、又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体のうちの１つ以上、又はその抗原結合断片とを、それを必要としている対象に投与するステップを含む。
別の態様において、本発明は、有効量の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＭＥＤＩ９４４７又はその抗原結合断片と、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＭＥＤＩ９４４７又はその抗原結合断片と、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖａ（登録商標））又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１又はその抗原結合断片と、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１又はその抗原結合断片と、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖａ（登録商標））又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＭＥＤＩ９４４７又はその抗原結合断片と、ＭＥＤＩ４７３６又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１又はその抗原結合断片と、ＭＥＤＩ４７３６又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＭＥＤＩ９４４７又はその抗原結合断片と、トレメリムマブ又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＭＥＤＩ９４４７又はその抗原結合断片と、イピリムマブ又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１又はその抗原結合断片と、トレメリムマブ又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１又はその抗原結合断片と、イピリムマブ又はその抗原結合断片とを含有する医薬製剤を提供する。
別の態様において、本発明は、抗腫瘍活性を増加させるためのキットであって、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片とを含むキットを提供する。
別の態様において、本発明は、抗腫瘍活性を増加させるためのキットであって、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片とを含むキットを提供する。
別の態様において、本発明は、抗腫瘍活性を増加させるためのキットであって、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合断片とを含むキットを提供する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＣＤ７３０００２のＶＬ及びＶＨは、それぞれ配列番号１及び２であるか又はそれを含み、及びＣＤ７３００１０のＶＬ及びＶＨは、それぞれ配列番号３及び４であるか又はそれを含む。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離結合分子又はその抗原結合断片は抗体又はその抗原結合断片を含む。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、結合分子は親和性成熟されている。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＦＷ５は配列番号３１であるか又はそれを含み、ＦＷ６は配列番号３２であるか又はそれを含み、ＦＷ７は配列番号３３であるか又はそれを含み、及びＦＷ８は配列番号３４であるか又はそれを含む。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＦＷ１は配列番号２５又は２６であるか又はそれを含み、ＦＷ２は配列番号２７又は２８であるか又はそれを含み、ＦＷ３は配列番号２９であるか又はそれを含み、ＦＷ４は配列番号３０であるか又はそれを含み、ＦＷ５は配列番号３１であるか又はそれを含み、ＦＷ６は配列番号３２であるか又はそれを含み、ＦＷ７は配列番号３３であるか又はそれを含み、及びＦＷ８は配列番号３４であるか又はそれを含む。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＶＬは、配列番号４６、配列番号４７、又は配列番号４８と同一であるか、又は４、３、２若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一であるＶＬ相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列を含む。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５７を有するＶＬと配列番号７１を有するＶＨとを有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６８を有するＶＬと配列番号８２を有するＶＨとを有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は重鎖定常領域又はその断片を含む。
様々な実施形態において、重鎖定常領域又はその断片は、例えばＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域又はＩｇＧ４定常領域を含めたＩｇＧ定常領域である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域から選択される軽鎖定常領域を含む。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＩｇＧ定常領域は野生型ＩｇＧ定常領域と比べて１個以上のアミノ酸置換を有し、この修飾ＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常領域を有するＩｇＧの半減期と比較して半減期が増加している。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＩｇＧ定常領域は、２５１〜２５７、２８５〜２９０、３０８〜３１４、３８５〜３８９、及び４２８〜４３６位（付番はＫａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスに従う）にアミノ酸残基の１個以上のアミノ酸置換を有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、少なくとも１つのＩｇＧ定常領域アミノ酸置換は、
（ａ）２５２位のアミノ酸の、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、又はスレオニン（Ｔ）による置換、
（ｂ）２５４位のアミノ酸の、スレオニン（Ｔ）による置換、
（ｃ）２５６位のアミノ酸の、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はスレオニン（Ｔ）による置換、
（ｄ）２５７位のアミノ酸の、ロイシン（Ｌ）による置換、
（ｅ）３０９位のアミノ酸の、プロリン（Ｐ）による置換、
（ｆ）３１１位のアミノ酸の、セリン（Ｓ）による置換、
（ｇ）４２８位のアミノ酸の、スレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はセリン（Ｓ）による置換、
（ｈ）４３３位のアミノ酸の、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、又はグルタミン（Ｑ）による置換、
（ｉ）４３４位のアミノ酸の、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はチロシンによる置換、及び
（ｊ）前記置換の２つ以上の組み合わせ
（付番はＫａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスに従う）から選択される。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ヒトＩｇＧ定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ定常領域と比べて２５２、２５４、及び２５６位にアミノ酸置換を有し、ここで、
（ａ）２５２位のアミノ酸がチロシン（Ｙ）によって置換され、
（ｂ）２５４位のアミノ酸がスレオニン（Ｔ）によって置換され、及び
（ｃ）２５６位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている
（付番はＫａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスに従う）。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態では、４３４位のアミノ酸が、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、及びセリン（Ｓ）から選択されるアミノ酸によって置換され、ここで付番はＫａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスに従う。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態では、４２８位のアミノ酸が、スレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びセリン（Ｓ）から選択されるアミノ酸によって置換され、ここで付番はＫａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスに従う。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態では、２５７位のアミノ酸がロイシン（Ｌ）によって置換され、且つＫａｂａｔ ４３４位のアミノ酸がチロシン（Ｙ）によって置換され、ここで付番はＫａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスに従う。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態では、Ｋａｂａｔ ４２８位のアミノ酸がロイシン（Ｌ）によって置換され、且つＫａｂａｔ ４３４位のアミノ酸がセリン（Ｓ）によって置換されている。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ヒトＩｇＧ定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ定常領域と比べて２５２、２５４、及び２５６位にアミノ酸置換を有し（付番はＫａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスに従う）、ここで、
（ａ）２５２位のアミノ酸がチロシン（Ｙ）によって置換され、
（ｂ）２５４位のアミノ酸がスレオニン（Ｔ）によって置換され、及び
（ｃ）２５６位のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、多重特異性抗体、又はその抗原結合断片である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、抗原結合断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、又はｓｃ（Ｆｖ）２である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、例えば抗癌剤を含めた少なくとも１つの異種薬剤にコンジュゲートされている。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、本発明に係る組成物は抗癌剤を更に含む。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導しない。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片はＣＤ７３のアンタゴニストである。
様々な実施形態において、単離抗体又はその抗原結合断片は、ＭＢ−ＭＤＡ−２３１、４Ｔ１、ＭＫ１、又は列挙される細胞の２つ以上の組み合わせから選択される細胞におけるＣＤ７３のアンタゴニストである。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＣＤ７３はヒトＣＤ７３である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、本抗体又は抗原結合断片がＣＤ７３に結合することにより、細胞増殖が低減され得る。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＣＤ７３に対する抗体又は抗原結合断片は、ヒトＣＤ７３、カニクイザルＣＤ７３、及びマウスＣＤ７３に結合することができる。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、癌は、結腸直腸癌、膵癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、及び乳癌から選択される。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、癌は、メラノーマ又は乳癌を含め、前転移性表現型を有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、対象はヒトである。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、第１の薬剤と第２の薬剤との併用は優れた抗腫瘍活性を有し、相加的又は相乗的であり得る。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、第２の薬剤は抗体又はその抗原結合断片である。
様々な実施形態において、第２の薬剤は、ＰＤ−１（プログラム死１タンパク質）、ＰＤ−Ｌ１（プログラム死１タンパク質リガンド１）、ＰＤ−Ｌ２（プログラム死１タンパク質リガンド２）、又はＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４タンパク質）に特異的に結合する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、第２の薬剤は、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）、又はその抗原結合断片を含めた、抗ＣＴＬＡ−４抗体又はその抗原結合断片である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、第２の薬剤は、例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖａ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８）、ＡＭＰ−２２４、又はその抗原結合断片を含めた、抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合断片である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、第２の薬剤は、例えば、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、又はその抗原結合断片を含めた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、ＭＥＤＩ９４４７、Ｐｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１、又はその抗原結合断片である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、対象は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法を受けているか、受けたことがあるか、又は受ける予定である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法は、それぞれ抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、若しくは抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。
様々な実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖａ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８）、ＡＭＰ−２２４、又はその抗原結合断片である。
様々な実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、又はその抗原結合断片である。
様々な実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ、トレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）、又はその抗原結合断片である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、腫瘍は、結腸癌、メラノーマ、乳癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びバーキットリンパ腫、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、又は膵癌である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＣＤ７３発現又は活性は、腫瘍試料、血液試料、又はリンパ試料において検出される。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＣＤ７３発現は、例えばリンパ系細胞又は骨髄系細胞サブセット（即ち、Ｂリンパ球、ＣＤ４＋，ＦｏｘＰ３＋リンパ球、又は骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）のうちの１つ以上）を含めた、腫瘍細胞又は末梢血細胞において検出される。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＣＤ７３発現は、フローサイトメトリー、免疫組織化学（ＩＨＣ）又は試料中のＣＤ７３酵素活性若しくは可溶性ＣＤ７３レベルによって検出される。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体、又はその抗原結合断片とは同時に投与される。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、本方法は腫瘍特異的免疫応答を誘導するか又は増加させる。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、本方法はＡＭＰ／ＣＤ７３／アデノシン経路の免疫抑制効果を低減する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、腫瘍はＣＤ７３過剰発現腫瘍である。
別の態様において、本発明は、抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供し、これは、Ｖａｌ１４４、Ｌｙｓ１８０、及びＡｓｎ１８５に対応する１つ以上のアミノ酸を有するＣＤ７３タンパク質のエピトープに特異的に結合する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離結合分子又は抗原結合は、Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、及びＡｓｎ１８７に対応する１つ以上のアミノ酸を更に含有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離結合分子又はその抗原結合断片は、Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、及びＡｓｎ１８７に対応するアミノ酸を含有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離結合分子又はその抗原結合断片は、Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、Ａｓｎ１８７、Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、及びＡｓｎ１８７に対応するアミノ酸を含有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離結合分子又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３タンパク質の以下の領域：Ｔｙｒ１３２〜Ｖａｌ１４４及び／又はＬｙｓ１８０〜Ａｓｎ１８７のうちの１つ以上におけるエピトープと結合する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離結合分子又はその抗原結合断片は、Ｔｙｒ１３２〜Ｖａｌ１４４及び／又はＬｙｓ１８０〜Ａｓｎ１８７のアミノ酸配列を含有するか、又はその中にある。
別の態様において、本発明は、ＣＤ７３タンパク質の表面上の、Ｖａｌ１４４、Ｌｙｓ１８０、及びＡｓｎ１８５に対応する１つ以上のアミノ酸を有する立体エピトープを提供し、このエピトープを含有するＣＤ７３タンパク質には、モノクローナル抗体ＭＥＤＩ９４４７又はその抗原結合断片、変異体、類似体又は誘導体が特異的に結合することができる。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、立体エピトープは、Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、及びＡｓｎ１８に対応する１つ以上のアミノ酸を更に含有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、立体エピトープは、Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、及びＡｓｎ１８７に対応するアミノ酸を含有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、立体エピトープは、Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、Ａｓｎ１８７、Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、及びＡｓｎ１８７に対応するアミノ酸を含有する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、立体エピトープは、ＣＤ７３タンパク質の以下の領域：Ｔｙｒ１３２〜Ｖａｌ１４４及び／又はＬｙｓ１８０〜Ａｓｎ１８７のうちの１つ以上におけるものである。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、立体エピトープは、Ｔｙｒ１３２〜Ｖａｌ１４４及び／又はＬｙｓ１８０〜Ａｓｎ１８７のアミノ酸配列を含有するか、又はその中にある。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＭＥＤＩ９４４７は、不活性状態若しくは触媒活性状態又は開いた状態若しくは閉じた状態のＣＤ７３タンパク質と結合する。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、ＣＤ７３タンパク質はヒトＣＤ７３である。
本明細書に説明される任意の態様の様々な実施形態において、単離結合分子又はその抗原結合断片、ＶＬ及びＶＨはＭＥＤ１９４４７のＶＬ及びＶＨである。
本発明によって定義される組成物及び物品は、以下に提供する例に関連して単離されたか、又はその他に製造された。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかであろう。
ＭＥＤＩ９４４７ ＶＨドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸翻訳を示し、ＣＤＲはＫａｂａｔ付番規則に基づき示している。 ＭＥＤＩ９４４７ ＶＬドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸翻訳を示し、ＣＤＲはＫａｂａｔ付番規則に基づき示している。 ＭＥＤＩ９４４７ ＶＨと最も近縁のヒトＶＨ及びＪＨ生殖系列配列とのアラインメントを示す。Ｋａｂａｔ付番規則に基づくＣＤＲを強調表示し、生殖系列配列と異なる残基に囲みを付す。 ＭＥＤＩ９４４７ ＶＬと最も近縁のヒトＶＬ及びＪＬ生殖系列配列とのアラインメントを示す。Ｋａｂａｔ付番規則に基づくＣＤＲを強調表示し、生殖系列配列と異なる残基に囲みを付す。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び４Ｔ１細胞への細胞毒性ＦａｂＺＡＰ試薬の抗体媒介性インターナリゼーションを示す２つのグラフを提供し、ここで、抗体はＭＥＤＩ９４４７及び対照抗体Ｒ３４７である。 図３Ａは抗ＣＤ７３抗体ＭＥＤＩ９４４７による５’エクトヌクレオチダーゼの阻害を示すグラフである。図３Ｂは抗ＣＤ７３抗体ＣＤ３７００１０によるＡＭＰ加水分解の阻害を示すグラフである。 ＭＥＤＩ９４４７がＣＴ２６同系腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を阻害したことを示すグラフである。マウスＣＴ２６腫瘍細胞を雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスの右側腹部に皮下移植した。腫瘍を３日間成長させて、ＭＥＤＩ９４４７又はアイソタイプ対照で週２回、２週間にわたって治療した。１６日目に腫瘍を回収してフローサイトメトリー分析にかけた。 ＭＥＤＩ９４４７が腫瘍浸潤性骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を阻害したことを示すグラフである。試験１６日目に、ＭＥＤＩ９４４７で治療したＣＴ２６腫瘍担持マウスを犠牲にし、腫瘍を回収した。腫瘍を単細胞に解離し、ＣＤ４５及びＭＤＳＣマーカーに関して染色し、フローサイトメトリーによって分析した。 腫瘍容積に対するＭＥＤＩ９４４７ ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ−１又は併用の効果を示す６つのスパイダープロットを含む。対照抗体としては、ｒＩｇＧ２ａ（これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）に特異的なラットＩｇＧ２ａ対照モノクローナルラット抗体である）、及びアイソタイプ対照マウスのＩｇＧ１が含まれる。試験４０日目までの各動物群の腫瘍容積を個々の動物についてプロットした。対照群には、４０日間の試験期間の終わりまで腫瘍がなかったマウスはいなかった。抗ＣＤ７３治療単独では、試験終了時に腫瘍がなかった動物は１０％であった。抗ＰＤ１治療単独も、試験終了時に腫瘍がなかった動物は１０％であった。顕著なことに、抗ＣＤ７３と抗ＰＤとの併用治療では、腫瘍がなかったマウスは６０％であった。対照群には、試験の終わりまで腫瘍がなかったマウスは一匹もいなかった。 生存に対するＭＥＤＩ９４４７ ｍＩｇＧ１、抗ＰＤ１又は併用の効果を示すグラフである。 ＭＥＤＩ９４４７と抗ＰＤ−１との併用が、一方の薬剤単独と比較したとき、結腸直腸癌腫瘍の腫瘍成長阻害を有意に増強した（＜０．０５）ことを示すグラフである。マウスに同系ＭＣ３８−ＯＶＡ結腸直腸癌細胞を皮下注射し、１０ｍｇ／ｋｇのＭＥＤＩ９４４７又は１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１抗体単独又は両方の抗体の併用で週２回治療した。腫瘍容積を週２回計測した。 腫瘍担持マウスから単離した腫瘍細胞上のＣＤ７３発現によって計測したとき、抗ＰＤ−１がＣＤ７３リッチな腫瘍微小環境を誘導したことを示すグラフである。マウス（ｎ＝４）に同系ＣＴ２６結腸直腸細胞を皮下注射し、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１又は無関係のアイソタイプ対照抗体で週２回治療した。初回治療の翌日、腫瘍を摘出し、細胞を解離し、フローサイトメトリーによって表面表現型に関して分析した。 腫瘍担持マウスから単離した骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上のＣＤ７３発現によって計測したとき、抗ＰＤ−１がＣＤ７３リッチな腫瘍微小環境を誘導したことを示すグラフである。マウス（ｎ＝４）に同系ＣＴ２６結腸直腸細胞を皮下注射し、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１又は無関係のアイソタイプ対照抗体で週２回治療した。初回治療の翌日、腫瘍を摘出し、腫瘍細胞を単離し、末梢全血細胞を回収し、フローサイトメトリーによって表面ＣＤ７３発現に関して分析した。 腫瘍担持マウスから単離したＣＤ４＋，ＦｏｘＰ３＋リンパ球上のＣＤ７３発現によって計測したとき、抗ＰＤ−１がＣＤ７３リッチな腫瘍微小環境を誘導したことを示すグラフである。マウス（ｎ＝４）に同系ＣＴ２６結腸直腸細胞を皮下注射し、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−１又は無関係のアイソタイプ対照抗体で週２回治療した。初回治療の３日後、腫瘍を摘出し、末梢全血細胞を回収し、フローサイトメトリーによって表面ＣＤ７３発現に関して分析した。 ＭＥＤＩ９４４７と抗ＰＤ−Ｌ１との併用が、一方の薬剤単独と比較したとき、メラノーマ腫瘍の腫瘍成長阻害を有意に増強した（＜０．０５）ことを示すグラフである。マウスに同系Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を皮下注射し、１０ｍｇ／ｋｇのＭＥＤＩ９４４７又は１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体単独又は両方の抗体の併用で週２回治療した。腫瘍容積を週２回計測した。 ＭＥＤＩ９４４７と抗ＰＤ−Ｌ１との併用が、一方の薬剤単独と比較したとき、リンパ腫腫瘍の腫瘍成長阻害（ｐ＜０．０１）を有意に増強したことを示すグラフである。マウスに同系ＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫細胞を皮下注射し、１０ｍｇ／ｋｇのＭＥＤＩ９４４７又は１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体単独又は両方の抗体の併用で週２回治療した。腫瘍容積を週２回計測した。 流入領域リンパ節Ｂリンパ球上のＣＤ７３の表面発現によって計測したとき、抗ＰＤ−Ｌ１がＣＤ７３リッチな腫瘍微小環境を誘導したことを示すグラフである。マウス（ｎ＝４）に同系ＣＴ２６結腸直腸細胞を皮下注射し、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１又は無関係のアイソタイプ対照抗体で週２回治療した。初回治療の翌日、流入領域リンパ節から細胞を単離し、フローサイトメトリーによって表面表現型に関して分析した。 腫瘍浸潤性ＣＤ４＋，ＦｏｘＰ３＋リンパ球上のＣＤ７３の表面発現によって計測したとき、抗ＰＤ−Ｌ１がＣＤ７３リッチな腫瘍微小環境を誘導したことを示すグラフである。マウス（ｎ＝４）に同系ＣＴ２６結腸直腸細胞を皮下注射し、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１又は無関係のアイソタイプ対照抗体で週２回治療した。初回治療の３日後、腫瘍を摘出し、細胞を解離し、フローサイトメトリーによって表面表現型に関して分析した。 ＭＥＤＩ９４４７単独又は抗ＰＤ−Ｌ１との併用により、腫瘍浸潤性リンパ系細胞上のＣＤ７３発現が低下したことを示すグラフである。結腸直腸ＣＴ２６同系腫瘍を担持するマウスを、３０ｍｇ／ｋｇ ＭＥＤＩ９４４７又は３０ｍｇ／ｋｇ 抗ＰＤ−Ｌ１のいずれか単独又はＭＥＤＩ９４４７と抗ＰＤ−Ｌ１との両方の併用で週２回（１２日目及び１６日目）治療した。１７日目、腫瘍を回収し、フローサイトメトリーによって表面ＣＤ７３発現に関して分析した。腫瘍上のＣＤ７３発現は、（Ａ）ＣＤ４＋ ＦｏｘＰ３＋ Ｔｒｅｇ及び（Ｂ）ＣＤ８＋ Ｔ細胞に浸潤する。 ＭＥＤＩ９４４７単独又は抗ＰＤ−Ｌ１との併用により、（Ａ）腫瘍細胞及び（Ｂ）末梢全血細胞のＣＤ７３活性が低下したことを示すグラフである。結腸直腸ＣＴ２６同系腫瘍を担持するマウスを、３０ｍｇ／ｋｇ ＭＥＤＩ９４４７又は３０ｍｇ／ｋｇ 抗ＰＤ−Ｌ１のいずれか単独又はＭＥＤＩ９４４７と抗ＰＤ−Ｌ１との両方の併用で週２回（１２日目及び１６日目）治療した。１７日目、腫瘍及び末梢全血細胞を回収し、Ｃｅｌｌ−Ｔｉｔｒｅ Ｇｌｏを使用することにより表面ＣＤ７３発現に関して酵素活性を分析した。 ＭＥＤＩ９４４７と、ＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＰＤ−１、及びＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体又は融合タンパク質とで処理した末梢血単核細胞のサイトカインプロファイルを表すグラフの組である。初代ヒト末梢血単核細胞をＭＥＤＩ９４４７及び／又は指示標的に特異的な抗体若しくは融合タンパク質と共に混合白血球反応で７２時間インキュベートした。デュプリケート上清中のサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）をＥＬＩＳＡによって定量化した。示されるデータは、抗ＣＤ７３抗体と４つの異なるパートナー薬剤との最適用量の組み合わせに相当する。Ｂｌｉｓｓ表面反応法（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．）によって決定するとき、抗ＰＤ−１と抗ＣＤ７３との併用は有意な（ｐ＜０．０５）相乗作用を示した。サイトカインプロファイルは、骨髄系列及びリンパ系列の両方が影響を受けたことを示している。５０組を超えるドナーペアを試験した。 ＭＥＤＩ９４４７と複合したＣＤ７３の水素重水素交換ＭＳ（ＨＤＸ−ＭＳ）分析の結果を表す。図１９Ａは、ＣＤ７３（Ｎ末端からＣ末端）のうち、ＭＥＤＩ９４４７との結合時に重水素取り込みの低下が起こる領域を示す水素重水素交換ヒートマップを表す。抗体結合ＣＤ７３と未結合ＣＤ７３との相対的交換を曝露時間の関数として、交換の低下を赤色、交換の増加を青色、及び変化無しを白色として表す。１３２〜１４３位及び１８２〜１８７位のＮ末端領域が最も高度な差次的交換を呈した。図８Ｂは、Ｎ末端ドメイン（黄色）の範囲内にあるＨＤＸによって同定された結合界面（シアン色）の位置を表すＣＤ７３単量体の結晶構造を示す。ＣＤ７３リンカー領域及びＣ末端ドメインは、それぞれオレンジ色及び青色で表される。 図１９Ａの続きである。 遊離状態と結合状態とを比べてＣＤ７３及びＭＥＤＩ９４４７のうち、差次的な水素交換が起こる領域を示す水素重水素交換ＭＳ（ＨＤＸ−ＭＳ）分析の結果を表す。図２０Ａは、１３２〜１４３領域を包含するペプチド内における重水素曝露時間の関数としての相対的重水素取り込み（ダルトン単位の質量変化）を表すプロットを示す。図２０Ｂは、１８２〜１８７領域を包含するペプチド内における重水素曝露時間の関数としての相対的重水素取り込み（ダルトン単位の質量変化）を表すプロットを示す。図２０Ａ及び図２０Ｂでは、ＣＤ７３単独の取り込みを四角で示し、ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂに結合したＣＤ７３の取り込みを赤色で示す。ペプチド配列、位置、及び質量をプロットボックス内に示す。水素交換の変化を示す配列を含み且つエピトープを形成すると予想し得る領域を絞り込むため、重複ペプチドの相対的質量変化を比較した。例えば、１７３〜１８６位にわたるペプチドは差次的な交換を示したが、１７３〜１８１にわたるペプチドに差はなかった。従って、１８２より上流の残基は差次的に標識されないことが推測された。図２０Ｃは、ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ重鎖のＤｙｎａｍＸ差分チャートを表す。図２０Ｄは、ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ軽鎖のＤｙｎａｍＸ差分チャートを表す。図２０Ｃ及び図２０Ｄについて、各データ点は、ＣＤ７３＋Ｆａｂ複合体（ｙ軸上の正の値）とＦａｂ単独（ｙ軸上の負の値）との重水素取り込みの差を示す。縦のバーは、曝露時間点にわたる取り込みの差の合計を表す。ＦａｂがＣＤ７３に結合したとき、相対的取り込みの低下を示すＣＤＲを指示する。図９Ｅは、ＣＤ７３単独（ｙ軸上の負の値）とＦａｂに結合したＣＤ７３（ｙ軸上の正の値）とのＤｙｎａｍＸ差分チャートを表す。領域Ｅ１（ａａ１３２〜１４３）及びＥ２（ａａ１８２〜１８７）を指示する。横軸は、Ｎ末端からＣ末端までの（左から右に）分析したペプチドに対応する。このチャートに、１．６ダルトン、統計学的に有意な変化の９８％信頼区間カットオフを示す点線をオーバーレイしている。 図２０Ａの続きである。 図２０Ａの続きである。 ＭＥＤＩ９４４７エピトープがＣＤ７３のＮ末端ドメイン内にあることを示すセンサーチップデータを表す。図２１Ａは、野生型ＣＤ７３タンパク質のセンサーチップデータを表すグラフである。野生型ＣＤ７３タンパク質をＨＴＧセンサーチップに固定化し、ＭＥＤＩ９４４７希釈物（５ｎＭ〜０．３ｎＭ）の結合を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって計測した。図２１Ｂは、Ｎ末端ドメインをスワッピングしたＣＤ７３タンパク質のセンサーチップデータを表すグラフである。Ｎ末端ドメインをスワッピングしたＣＤ７３タンパク質をＨＴＧセンサーチップに固定化し、ＭＥＤＩ９４４７希釈物（５ｎＭ〜０．３ｎＭ）の結合をＳＰＲによって計測した。Ｎ末端ドメインをスワッピングしたとき、ＭＥＤＩ９４４７はＣＤ７３に結合しなかった。図２１Ｃは、Ｎ末端及びＣ末端ドメインをスワッピングしたＣＤ７３タンパク質のセンサーチップデータを表すグラフである。Ｎ末端及びＣ末端ドメインをスワッピングしたＣＤ７３タンパク質をＨＴＧセンサーチップに固定化し、ＭＥＤＩ９４４７希釈物（５ｎＭ〜０．３ｎＭ）の結合をＳＰＲによって計測した。Ｎ末端及びＣ末端ドメインの両方をスワッピングしたとき、ＭＥＤＩ９４４７はＣＤ７３に結合しなかった。図２１Ｄは、リンカー領域をスワッピングしたＣＤ７３タンパク質のセンサーチップデータを表すグラフである。リンカー領域をスワッピングしたＣＤ７３タンパク質をＨＴＧセンサーチップに固定化し、ＭＥＤＩ９４４７希釈物（５ｎＭ〜０．３ｎＭ）の結合をＳＰＲによって計測した。リンカー領域のみのスワッピングは結合に影響を与えなかった。図２１Ｅは、Ｃ末端ドメインをスワッピングしたＣＤ７３タンパク質のセンサーチップデータを表すグラフである。Ｃ末端ドメインをスワッピングしたＣＤ７３タンパク質をＨＴＧセンサーチップに固定化し、ＭＥＤＩ９４４７希釈物（５ｎＭ〜０．３ｎＭ）の結合をＳＰＲによって計測した。Ｃ末端ドメインのみのスワッピングは結合に影響を与えなかった。図２１Ｆは、界面Ｅ１（ａａ１３２〜１４３）をスワッピングしたＣＤ７３タンパク質のセンサーチップデータを表すグラフである。界面Ｅ１（ａａ１３２〜１４３）をスワッピングしたＣＤ７３タンパク質をＨＴＧセンサーチップに固定化し、ＭＥＤＩ９４４７希釈物（５ｎＭ〜０．３ｎＭ）の結合をＳＰＲによって計測した。図２１Ｇは、界面Ｅ２（ａａ１８２〜１８７）をスワッピングしたＣＤ７３タンパク質のセンサーチップデータを表すグラフである。界面Ｅ２（ａａ１８２〜１８７）をスワッピングしたＣＤ７３タンパク質をＨＴＧセンサーチップに固定化し、ＭＥＤＩ９４４７希釈物（５ｎＭ〜０．３ｎＭ）の結合をＳＰＲによって計測した。図２１Ｈは、界面Ｅ１（ａａ１３２〜１４３）及び界面Ｅ２（ａａ１８２〜１８７）をスワッピングしたＣＤ７３タンパク質のセンサーチップデータを表すグラフである。界面Ｅ１（ａａ１３２〜１４３）及び界面Ｅ２（ａａ１８２〜１８７）をスワッピングしたＣＤ７３タンパク質をＨＴＧセンサーチップに固定化し、ＭＥＤＩ９４４７希釈物（５ｎＭ〜０．３ｎＭ）の結合をＳＰＲによって計測した。図２１Ｆ〜図２１Ｈについて、ＨＤＸ界面Ｅ１（ａａ１３２〜１４３）（図２１Ｆ）のスワッピングが結合に与えた影響は僅かであり、ＨＤＸ界面Ｅ２（ａａ１８２〜１８７）単独（図２１Ｇ）又はＥ１との組み合わせ（図２１Ｈ）のスワッピングと対照的であった。図２１Ａ〜図２１Ｈについて、センサーグラム及びオーバーレイフィットを対応する色で示す。各結合解析の反応速度計測値を表１６に提供する。 図２１Ａ−Ｄの続きである。 ヒト及びニワトリＣＤ７３タンパク質配列のアラインメントを表す。成熟タンパク質配列のみを示す。非保存残基をニワトリ配列に強調表示する。ノックアウト変異体を作成するためニワトリとヒトとの間でスワッピングした領域にアノテーションを付ける（例えばＤＳ１ａ、ＤＳ１ｂ等）。 図２２−１の続きである。 図２２−１の続きである。 図２２−１の続きである。 図２２−１の続きである。 ＣＤ７３変異体に対するＭＥＤＩ９４４７の結合を表す。図２３は、ＣＤ７３変異体に対するＭＥＤＩ９４４７の結合を示すデータの表である。青色で強調表示した変異体のＫＤはＷＴ又はＫＯ親コンストラクトから２倍超変化したものである。＊２：１異種リガンドフィットから得られた反応速度計測値。＊＊付番はニワトリ配列に対応する（ヒトでは１２９＝１３３、１４０＝１４４、及び１８１＝１８５）。 ＭＥＤＩ９４４７エピトープがＮ末端ドメインの頂端に位置することを表す。図１３Ａは、ＣＤ７３変異体のパネルに対するＭＥＤＩ９４４７結合の評価（図２２及び図２３を参照）により、相互作用部位を成す６つの位置が明らかになったことを示す。これらの３つの最も影響力の強い残基（囲みで強調表示）のうちの２つは、ＨＤＸ界面領域（青色で強調表示）の外側に位置する。それ程影響力が強くない３つの残基（ピンク色の囲み）はＨＤＸ界面内に位置する。図２４Ｂは、Ｎ１８５及びＶ１４４（Ｋ１８０は保存されている）をニワトリＮ末端及びＣ末端ドメイン配列を含むＣＤ７３コンストラクトにノックインすると、結合が野生型ＣＤ７３のＫＤの２０倍未満まで回復したことを示す表である（ＭＥＤＩ９４４７希釈物５ｎＭ〜０．３ｎＭ；図１０Ｂと比較のこと）。図２４Ｃは、ＣＤ７３のＮ末端ドメイン内に位置するエピトープ残基の詳細図を表す。結合に最も重要な残基を強調表示して示し、それ程影響力が強くない位置（Ｙ１３５、Ｋ１３６、及びＮ１８７）はピンク色とする。ＨＤＸ界面は青色でオーバーレイする。図２４Ｄは、エピトープがほぼ連続する結合表面を形成することを示す表面表現図を表す。図２４Ｅは、Ｎ末端ドメインの頂端外側表面にあるエピトープの位置を示すＣＤ７３の開いたコンホメーションの結晶構造を表す。図２４Ｆは、エピトープの位置が基質結合部位（球で表されるアデノシン）及び亜鉛イオン（灰色の球）配位部位（シアン色の側鎖）から離れていることを示す。いずれの結晶構造においても、ＣＤ７３ Ｎ末端ドメイン、リンカー領域、及びＣ末端ドメインは、それぞれ黄色、オレンジ色、及び青色で表す。 図２４Ａ−Ｂの続きである。 図２４Ａ−Ｂの続きである。 ＭＥＤＩ９４４７がＣＤ７３によるＡＭＰ加水分解の非競合阻害薬であることを示す。図２５Ａは、ＭＥＤＩ９４４７又はアイソタイプ対応対照ｍＡｂの存在下で計測したＣＤ７３によるＡＭＰリン酸加水分解の反応速度を表すグラフである。図２５Ｂは、ＭＥＤＩ９４４７が、基質濃度に関わらず加水分解を同等に阻害する点で非競合的阻害薬としての役割を果たすことを示すグラフである。対照的に、ＣＤ７３の既知の競合阻害薬であるＡＰＣＰでは、Ｋｍは増加するが、Ｖｍａｘは増加しない。図２５Ｃは、ＣＤ７３によるＡＭＰ加水分解の阻害に対するＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧ、Ｆａｂ、又は対照ＩｇＧの用量反応を表すグラフである。ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧは、ＣＤ７３二量体と１：１モル化学量論で最大阻害に達した（矢印）。ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧが過剰（＞１０ｎＭ）である高濃度では、阻害の喪失又は「フック効果」が観察された。ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ及び対照ＩｇＧはＣＤ７３を阻害しなかった。全ての実験は、本明細書に記載されるとおりのＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを用いて実施した（ＲＬＵ、相対発光単位）。 抗ＣＤ７３ ｍＡｂ（クローン００６９）の結合がＣＤ７３Ｎ末端及びＣ末端ドメイン残基に依存することを示す。図２６Ａは、ヒスチジンタグ付加ＣＤ７３のセンサーチップデータを示すグラフである。ヒスチジンタグ付加ＣＤ７３をＨＩＳ２バイオセンサーに固定化し、ｍＡｂ Ａによる結合をバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって計測した。ＷＴ ＣＤ７（青色のセンサーグラム）、Ｎ末端ドメインスワップノックアウトＣＤ７（ＫＯ＿１−２９１、緑色のセンサーグラム）及びＣ末端ドメインスワップノックアウトＣＤ７（ＫＯ＿３１１−５２３ シアン色のセンサーグラム）に対するｍＡｂ Ａの結合は、ｍＡｂ結合がＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの両方の残基の影響を受けることを示している。図２６Ｂ、Ｎ末端及びＣ末端ドメイン界面の近傍に位置する強調表示したｍＡｂ Ａ結合ホットスポット（ａａ１１４〜１３４及び１５３〜１７０）の位置を示す開いたＣＤ７３及び閉じたＣＤ７３の結晶構造（Ｎ末端ドメインは黄色、リンカーはオレンジ色、及びＣ末端ドメインは青色）。マッピングは図２６Ａ及び図２６Ｃの結合データに基づいた。図２６Ｃは、ＣＤ７３の種々のドメインスワップノックアウト変異体に対するｍＡｂ Ａの結合センサーグラムを示す。サブ領域ＤＳ２ｃ（ａａ１１４〜１３４）又はＤＳ３ａ（ａａ１５３〜１７０）のスワッピングは結合をノックアウトした。全ての結合解析は、本明細書に記載されるとおりＯｃｔｅｔ ＱＫ３８４機器で実施した。 図２６−１の続きである。 図２６−１の続きである。 ＭＥＤＩ９４４７がＣＤ７３のコンホメーション的に活性な構造への転移を阻害したことを示す。図２７Ａは、野生型ＣＤ７３バイオセンサーデータを示すグラフである。野生型ＣＤ７３をＨＩＳ２バイオセンサーに固定化し、ＭＥＤＩ９４４７（青色のセンサーグラム）及び抗ＣＤ７３ ｍＡｂ Ａ（茶色のセンサーグラム）の結合をＯｃｔｅｔ ＱＫ３８４でＢＬＩによって計測した。ＣＤ７３をＺｎ２＋及びＡＰＣＰとプレインキュベートしたとき、ＭＥＤＩ９４４７は結合を保持したが（黒色のセンサーグラム）、ｍＡｂ Ａの結合は消失した（オレンジ色のセンサーグラム）。図２７Ｂは、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰをＣＤ７３とプレインキュベートするとｍＡｂ Ａ結合（オレンジ色のセンサーグラム）の消失が生じたが、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰを加える前にＭＥＤＩ９４４７とプレインキュベートすると結合が回復した（紫色のセンサーグラム）ことを示すグラフである。ＣＤ７３単独及びＭＥＤＩ９４４７とプレインキュベートした（但しＺｎ２＋及びＡＰＣＰとはプレインキュベートしない）ＣＤ７３に対するｍＡｂ Ａの結合は、それぞれ青色及び茶色のセンサーグラムで示す。図２７Ｃは、ＣＤ７３がＺｎ２＋及びＡＰＣＰによって誘導される完全に閉じた活性のコンホメーションをとることをＭＥＤＩ９４４７がどのように妨げるかを表す提案されるモデルを示す。ＭＥＤＩ９９４７は、ｍＡｂ Ａに対する親和性が低い中間状態への転移を制限し得る。 図２７Ａ−Ｂの続きである。 以下で特に注記しない限り本明細書に記載されるとおりＢＬＩによって計測した種々の条件下でのＣＤ７３に対するＭＥＤＩ９４４７又はｍＡｂ Ａの結合を示す。図２８Ａは、ＨＩＳ２バイオセンサーに固定化したヒスチジンタグ付加野生型ＣＤ７３に対する抗ＣＤ７３ ｍＡｂ Ａの結合を表すグラフである。１００秒間ベースラインの後、捕捉されたＣＤ７３をＺｎ２＋、ＡＰＣＰ、及び／又はＥＤＴＡと共に９００秒間インキュベートし、次にバイオセンサーを３０ｎＭ ｍＡｂ Ａで６００秒間インキュベートして結合を計測した。ｍＡｂ ＡはＣＤ７３に結合したが（青色のセンサーグラム）、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰとプレインキュベートしたＣＤ７３には結合しなかった（紫色のセンサーグラム）。ｍＡｂ ＡはＡＰＣＰ及びＥＤＴＡ（緑色のセンサーグラム）又はＺｎ２＋、ＡＰＣＰ、及びＥＤＴＡ（金色のセンサーグラム）とプレインキュベートしたＣＤ７３に対する結合を維持した。ＥＤＴＡのキレート効果は、ＣＤ７３をＺｎ２＋及びＡＰＣＰとインキュベートしたときのｍＡｂ Ａ結合の消失に二価カチオンが必要であったことを示す。図２８Ｂは、ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ又は対照ＩｇＧが、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰとインキュベートしたＣＤ７３に対するｍＡｂ Ａの結合をレスキューしなかったことを示すグラフである。このアッセイは図２７Ｂのとおり実施した。ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ又はアイソタイプ対応対照ＩｇＧは、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰを加える前にＣＤ７３とプレインキュベートした。バイオセンサーに固定化したｍＡｂ Ａは、ＣＤ７３単独（青色のセンサーグラム）、ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ（明るい青色のセンサーグラム）又は対照ＩｇＧ（黒色のセンサーグラム）のいずれかとプレインキュベートしたＣＤ７３に結合したが、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰとインキュベートしたＣＤ７３（茶色のセンサーグラム）には結合せず、又はＺｎ２＋及びＡＰＣＰを加える前にＣＤ７３とプレインキュベートしたＦａｂ（金色のセンサーグラム）又は対照ＩｇＧ（紫色のセンサーグラム）のいずれにも結合しなかった。 抗ＣＤ７３ ｍＡｂ Ｂ結合がサブ領域ＤＳ２ｂ（ａａ９２〜１３４）又はＤＳ２ｃ（ａａ１１４〜１３４）の残基に依存することを示す。図２９Ａは、図３０Ａ〜図３０Ｃに対応するＳＥＣ−ＭＡＬＳデータを示す表である。ＣＤ７３とＭＥＤＩ９４４７又はｍＡｂ Ｂのいずれかとの各混合物について、形成された複合体の対応するＳＥＣ保持時間、Ｍｗ、及び多分散度を示す。図２９Ｂは、ＣＤ７３に対するｍＡｂ Ｂの結合ホットスポットの決定を表す。ＨＩＳ２バイオセンサー上に固定化したＣＤ７３変異体に対するｍＡｂ Ｂ結合を、本明細書の方法に係る図２６Ａ〜図２６ＣにおいてｍＡｂ Ａ（クローン００６９）について説明するとおりＢＬＩによって計測した。結合センサーグラムは、サブ領域ＤＳ２ｂ（ａａ９２〜１３４）又はＤＳ２ｃ（ａａ１１４〜１３４）のいずれのスワッピングも、ｍＡｂ Ｂによる結合をノックアウトしたことを示した。 図２９−１の続きである。 図２９−１の続きである。 図２９−１の続きである。 ＭＥＤＩ９４４７が可溶性ＣＤ７３分子間に二量体間架橋を形成することを示す。ＣＤ７３を様々な量のＭＥＤＩ９４４７又は抗ＣＤ７３ ｍＡｂ Ｂとインキュベートし、ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって分析した。ｘ軸にタンパク質保持時間及びｙ軸にＭＡＬＳによって決定されたモル質量をとったＳＥＣ ＵＶクロマトグラムを示す。図３０Ａは、１：１モル比で（緑色のトレース）、ＭＥＤＩ９４４７が約１．７（＾）及び約６．６（＋）メガダルトンのＣＤ７３と複合体を形成したことを示すクロマトグラムである。同等のサイズの複合体が、より低い比のＭＥＤＩ９４４７：ＣＤ７３（０．５：１青色、０．１：１マゼンタ色）で形成された。ＭＥＤＩ９４４７及びＣＤ７３単独は、それぞれ黒色及び赤色のＵＶトレースで表す。図３０Ｂは、ｍＡｂ Ｂ結合ホットスポット（紫色）及びＭＥＤＩ９４４７エピトープ（マゼンタ色及びピンク色）を示すＣＤ７３二量体の結晶構造の上面図である。ｍＡｂ Ｂは、開いたコンホメーションで二量体間の中心溝に近い部位に結合する。図３０Ｃは、ＣＤ７３がｍＡｂ Ｂに結合したとき、約２７０〜２９０ｋＤ（ピーク約７．２分）の単一の優勢な複合体が形成されたことを示すクロマトグラムである。示されるＵＶトレースは、１：１ｍＡｂ Ｂ：ＣＤ７３（赤色）、０．５：１（青色）、及び０．１：１（緑色）を表す。ｍＡｂ Ａ及びＣＤ７３単独は、それぞれマゼンタ色及び黒色である。 図３０−１の続きである。 表面結合型ＣＤ７３がＩｇＧ及びＦａｂフォーマットのＭＥＤＩ９４４７によって阻害されたことを表す。図３１Ａは、ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧ、Ｆａｂ又は対照抗体による固定化したＣＤ７３のＡＭＰ加水分解の阻害を表すグラフである。ＣＤ７３をＣ末端ヒスチジンタグを介してニッケル被覆マイクロタイタープレートに固定化し、本明細書に記載されるとおりのマラカイトグリーンアッセイを用いてＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧ、Ｆａｂ又は対照抗体によるＡＭＰ加水分解の阻害を計測した。ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧはＣＤ７３によるＡＭＰ加水分解を用量依存的に阻害したが、対照ＩｇＧは阻害しなかった。ＭＥＤＩ９４４７ ＦａｂもＣＤ７３活性を阻害したが、程度ははるかに低かった。図３１Ｂは、抗Ｆｄ抗体（ｘＦｄ、赤色）に結合したＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ（緑色）を含む複合体を表す。ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ（緑色）が抗Ｆｄ抗体（ｘＦｄ、赤色）の一方のアームに結合し、且つ他方のアームが非特異的なポリクローナルＦａｂ（ｐＦａｂ、オレンジ色）に結合したとき、阻害はＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧと同程度まで増加した（Ｆａｂ＋ｘＦｄ＋ｐＦａｂ対ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧ及びＭＥＤＩ９９４７ ＩｇＧ＋ｘＦｄ＋ｐＦａｂ）（図３１Ａを参照）。図３１Ｃは、ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧ、Ｆａｂ又は対照抗体によるＧＰＩアンカー型ＣＤ７３のＡＭＰ加水分解の阻害を表すグラフである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における内因的に発現したＣＤ７３の酵素活性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイによって計測した。固定化した組換えＣＤ７３と同様に、ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧはＦａｂと比べてより大きくＡＭＰ加水分解を阻害するが、抗Ｆｄ抗体と複合体を形成することによりＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂの有効サイズが増加すると、阻害が増強される。図３１Ｄは、ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧ、Ｆａｂ又は対照抗体による可溶性ＣＤ７３（ｓＣＤ７３）のＡＭＰ加水分解の阻害を表すグラフである。ｘＦｄ＋ＭＥＤＩ９４４７が可溶性ＣＤ７３を阻害し得るかどうかを試験するため、マラカイトグリーンアッセイを用いてＡＭＰ加水分解を計測した。ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂは、単独でも、或いは単一のｘＦｄアームと結合しても、可溶性ＣＤ７３活性を阻害しなかった。対照的に、ＭＥＤＩ９９４７ Ｆａｂが両方のｘＦｄアームと結合すると（ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ＋ｘＦｄ）、二価性が付与され、ＣＤ７３阻害がもたらされた。 図３１Ａ−Ｂの続きである。 ＭＥＤＩ９４４４７ ＩｇＧ及びＦａｂがＣＤ７３のＡＭＰ加水分解を阻害したことを示すグラフである。本明細書に記載されるとおり、漸増濃度の抗体の存在下でマラカイトグリーンアッセイを用いてＣＤ７３活性を計測した。ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧはＣＤ７３加水分解活性を用量依存的に阻害し、フック効果、即ち阻害の喪失は観察されなかった。ＭＥＤＩ９４４７ ＦａｂもＣＤ７３機能を阻害したが、最大阻害レベルは低かった。この実験は２回実施し、同等の結果が得られた。一方の実験のデータのみを示す。 ＭＥＤＩ９４４７によるＣＤ７３加水分解活性の阻害が二重の機構を介して起こることを示すモデルを表す。ＭＥＤＩ９４４７ＩｇＧ（緑色）は、二量体間架橋を形成して閉じた状態へのコンホメーション転移を妨げることにより、可溶性ＣＤ７３を阻害する。一価結合のＩｇＧ又はＦａｂは可溶性ＣＤ７３を阻害しない。ＣＤ７３が表面結合している場合、隣接するＣＤ７３二量体の架橋によるか、又は一価結合したＩｇＧ又はＦａｂ／ｘＦｄ（赤色）複合体からの立体的遮断によって阻害が起こり得る。
本発明は、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片を提供する。一部の態様において、かかる分子は、ＣＤ７３に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片である。関連するポリヌクレオチド、ベクター、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物も提供される。また、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体及び抗原結合断片の作製方法並びに使用方法、例えば、診断方法及び対象における癌の治療方法（直接療法、アジュバント療法としての、又は併用療法での）も提供される。本発明はまた、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子から得られる抗体−薬物コンジュゲートも提供する。更に、本発明は、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）と、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、ＭＥＤＩ４７３６）、抗ＣＴＬＡ４抗体などの、癌免疫サイクルの別の側面を標的化する薬剤の１つ以上とを特徴とする治療的併用；及び腫瘍媒介性免疫抑制を低減するためのかかる併用の使用方法を提供する。
本開示を更に容易に理解し得るように、初めに特定の用語を定義する。追加的な定義は詳細な説明全体を通じて示される。
Ｉ．定義
本発明を詳細に説明する前に、この発明が特定の組成物又は方法ステップに限定されず、それらは異なってもよいことが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。用語「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、並びに用語「１つ以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に使用することができる。
更に、「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの指定される特徴又は構成要素の各々の、他方を伴う又は伴わない具体的な開示と解釈されるべきである。従って、用語及び／又は」は、本明細書で「Ａ及び／又はＢ」などの語句で用いられるとき、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、用語「及び／又は」は、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で用いられるとき、以下の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓが、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。特に指示されない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載する。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって有され得る種々の態様の限定ではない。従って、この直後に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによって更に十全に定義される。
本明細書において態様が用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて記載される場合は常に、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／又は「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」の用語で記載される他の点では類似の態様も提供されることが理解される。
アミノ酸は、本明細書において、その一般に知られている三文字記号によるか、或いはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）が推奨する一文字記号により参照される。ヌクレオチドも同様に、その一般に認められている一文字コードによって参照される。
用語「ＣＤ７３ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、文献中では５’−ヌクレオチダーゼ（５’−ＮＴ）又はエクト−５’−ヌクレオチダーゼとも称される、ＮＴ５Ｅ遺伝子によってコードされるＣＤ７３（分化クラスター７３）タンパク質を指す。例えば、Ｍｉｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１（３）：５６３−９（１９９０）を参照のこと。ヒト型及びマウス型ＣＤ７３のそれぞれの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースで、それぞれ受託番号Ｐ２１５８９及びＱ６１５０３に基づき入手可能である。任意のＣＤ７３抗体エピトープを定義するにあたって、用いられるアミノ酸の付番は、シグナル配列残基を含まない成熟ＣＤ７３タンパク質のアミノ酸残基を表す。従って、例えば、アミノ酸Ｖａｌ１４４、Ｌｙｓ１８０、及びＡｓｎ１８５と結合する抗体は、シグナル配列の切断後の、即ち成熟タンパク質のアミノ酸のアミノ酸位置を参照する。
例示的ＣＤ７３ポリペプチドを以下に提供する。
＞ｓｐ｜Ｐ２１５８９｜５ＮＴＤ＿ヒト５’−ヌクレオチダーゼ ＯＳ＝ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ） ＧＮ＝ＮＴ５Ｅ ＰＥ＝１ ＳＶ＝１
Figure 0006755866
可溶性形態及び膜結合形態のＣＤ７３が同定されている。Ｋｌｅｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２（３）：１３７１−７（１９９０）を参照のこと。加えて、幾つかの異なるアイソザイムが同定されている。Ｒｏｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２（２５）：２２５７−６６（１９９８）を参照のこと。完全長ＣＤ７３タンパク質は５７４アミノ酸を含む。成熟ＣＤ７３タンパク質はシグナル配列（１〜２６位）及びプロペプチドのＣ末端領域（５５０〜５７４位）の除去後に産生される。加えて、ＣＤ７３のアイソフォーム２では選択的スプライシング後にアミノ酸４０４〜４５３が除去される。例えば、変異体Ｃ３５８Ｙ、変異体Ｔ３７６Ａ、及び変異体Ｍ３７９Ｔなど、天然変異体も知られている。Ｍｉｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：５６３−５６９（１９９０）；Ｏｔｓｕｋｉ ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ Ｒｅｓ．１２：１１７−１２６（２００５）；Ｍｕｎｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２５：８０５−８１１（２００３）；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １６７：３０７−３１２（１９９５）；Ｋｌｅｍｅｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７２：１３７１−１３７７（１９９０）；Ｋｎａｐｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０：２１６１−２１７３（２０１２）；又はＳｔ．Ｈｉｌａｉｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６４：４３２−４４２（２０１１）（これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
組織液中、特に血清中の患者のＣＤ７３レベルの変化につながる典型的な疾患は、組織外傷；心筋梗塞又は脳卒中、臓器移植又は他の外科手術によって生じる再灌流傷害；癌又は癌転移；又は前記外傷若しくは再灌流傷害によるか、又はアレルギー病態、自己免疫疾患、及び炎症性疾患を含めた慢性病態によって生じる炎症病態である。かかる慢性病態の例としては、関節炎、喘息などのアレルギー病態、炎症性腸疾患などの炎症病態又は皮膚の炎症病態、乾癬、パーキンソン病、アルツハイマー病、自己免疫疾患、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、クローン病、又は臓器移植に起因する拒絶反応を挙げることができる。特に、炎症性疾患の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、多臓器不全（ＭＯＦ）、虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）及び薬物有害反応（ＡＤＲＳ）が、組織液ＣＤ７３タンパク質の変化につながる。従って、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子は、例えば、癌（例えば、結腸癌、メラノーマ、乳癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びバーキットリンパ腫、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、及び膵癌）の治療又は診断に使用することができる。加えて、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子を使用した患者由来試料（例えば組織液）のＣＤ７３レベルの計測を用いることにより、上述の疾患の発生をモニタし、療法の有効性を評価し、特定の療法による治療に患者を選定し、又は医学的判断を下し、例えば、特定の治療を開始し、終了し、中断し、若しくは修正することができる。
用語「阻害する」、「遮断する」、「抑制する」、及びその文法上の変化形は、本明細書では同義的に使用され、活性の完全な遮断を含め、生物学的活性の任意の統計学的に有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、生物学的活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の減少を指し得る。従って、例えばＣＤ７３の酵素活性に対する効果を記載するために用語「阻害」又は「抑制」が用いられるとき、この用語は、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片がＣＤ７３の５’−ヌクレオチダーゼ活性（アデノシン一リン酸、ＡＭＰからアデノシンへの加水分解を異化（ｃａｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ）する）を、未処理（対照）細胞のＣＤ７３媒介性５’−ヌクレオチダーゼ活性と比べて統計学的に有意に減少させる能力を指す。ＣＤ７３を発現する細胞は天然に存在する細胞若しくは細胞株（例えば癌細胞）であってもよく、又はＣＤ７３をコードする核酸を宿主細胞に導入することによって組換え産生されてもよい。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、生体液中の可溶性形態のＣＤ７３の５’−ヌクレオチダーゼ活性を統計学的に有意に減少させることができる。一態様において、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３媒介性５’−ヌクレオチダーゼ活性を、例えば以下の実施例に記載する方法及び／又は当該技術分野において公知の方法によって決定するとき少なくとも１０％、少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は約１００％阻害する。
用語「ＣＤ７３活性を抑制する」は、本明細書で使用されるとき、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片が、ＣＤ７３を発現する細胞又はＣＤ７３を含有する試料におけるＣＤ７３依存性５’−ヌクレオチダーゼ活性を統計学的に有意に減少させる能力を指す。一部の態様において、ＣＤ７３活性の抑制は、細胞又は試料を本開示の抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片に接触させたとき、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片の非存在下（対照条件）で計測したＣＤ７３活性と比べて少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は約１００％の減少であり得る。
本明細書で同義的に使用されるとおりの用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、全抗体及びその任意の抗原結合断片若しくは単鎖を含む。
典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互に接続した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨ又はＶＨと省略する）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬ又はＶＬと省略する）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれるより保存された領域が間に入った、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順番：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４で並んだ３つのＣＤＲと４つのＦＷとを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、種々の免疫系細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。本開示の例示的抗体としては、抗ＣＤ７３抗体（オリジナル及び生殖細胞系列化されたもの）、親和性最適化クローン、ＡＤＣＣ欠損最適化抗体、コンジュゲート抗体（例えばＡＤＣ）、及び他の最適化抗体（例えば、血清半減期最適化抗体、例えばＹＴＥ突然変異、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２４（２００６）及び米国特許第７，０８３，７８４号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）を参照）が挙げられる。
用語「生殖細胞系列化」は、抗体の特定の位置にあるアミノ酸が生殖細胞系列のものに復帰突然変異することを意味する。
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介してタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又は前述の組み合わせなどの標的を認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、その抗体が所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片など）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、少なくとも２つのインタクトな抗体から作成された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。
抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと称されるその重鎖定常ドメインのアイデンティティに基づき、５つの主要な免疫グロブリンクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のいずれかのものであり得る。異なる免疫グロブリンクラスは異なる周知のサブユニット構造及び三次元配置を有する。抗体は、ネイキッドであってもよく、又は毒素、放射性同位体等の他の分子にコンジュゲートしてＡＤＣを形成してもよい。
「遮断」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、ＣＤ７３など、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害し、又は低下させるものである。特定の態様において、遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。望ましくは、生物学的活性は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％，少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は更には１００％低下する。
用語「ＣＤ７３抗体」、「ＣＤ７３に結合する抗体」又は「抗ＣＤ７３」は、その分子がＣＤ７３の標的化において治療剤又は診断試薬として有用となるように十分な親和性でＣＤ７３と結合する能力を有する抗体又はその抗原結合断片を指す。無関係の非ＣＤ７３タンパク質に対する抗ＣＤ７３抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（分析物として組換えＣＤ７３及びリガンドとして抗体を使用するか、又はその逆）、又は当該技術分野において公知の他の結合アッセイによって計測するときのＣＤ７３に対するこの抗体の結合の約１０％未満である。特定の態様において、ＣＤ７３に結合する抗体は、解離定数（ＫＤ）が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦１０ｐＭ、≦１ｐＭ、又は≦０．１ｐＭである。用語「抗ＣＤ７３」はまた、例えば、足場に組み込まれた、本明細書に開示される抗体のＣＤＲを含む分子も広く包含する。従って、語句「ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片」は、抗体及びその抗原結合断片を指すのみならず、例えば、本明細書に開示される抗体のＣＤＲを組み込む１つ以上の足場（フィブロネクチン又はテネイシン−３由来のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインなど）を含む分子も指し得る。例えば、米国特許出願公開第２０１５００９８９５５号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
一実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインが突然変異Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１を含み、可溶性ＣＤ７３及び細胞表面提示型ＣＤ７３と結合し、且つＣＤ７３酵素活性を阻害するようなＩｇＧ１−ＴＭフォーマットの抗体を指す。図１Ａ〜図１ＤはＭＥＤＩ９４４７ ＶＨ及びＶＬドメインのヌクレオチド及びアミノ酸配列を提供する。
「ＣＴＬＡ４ポリペプチド」とは、Ｔ細胞阻害活性を有する、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＬ０７４７３．１と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド又はその断片を意味する。ＡＡＬ０７４７３．１の配列を以下に提供する。
ＣＴＬＡ４ポリペプチド配列［ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）］
ｇｉ｜１５７７８５８６｜ｇｂ｜ＡＡＬ０７４７３．１｜ＡＦ４１４１２０＿１
Figure 0006755866
「ＣＴＬＡ４核酸分子」とは、ＣＴＬＡ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的ＣＴＬＡ４核酸分子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＬ０７４７３に提供される。
「抗ＣＴＬＡ４抗体」とは、ＣＴＬＡ４ポリペプチドと選択的に結合する抗体を意味する。例示的抗ＣＴＬＡ４抗体は、例えば米国特許第６，６８２，７３６号明細書；同第７，１０９，００３号明細書；同第７，１２３，２８１号明細書；同第７，４１１，０５７号明細書；同第７，８２４，６７９号明細書；同第８，１４３，３７９号明細書；同第７，８０７，７９７号明細書；及び同第８，４９１，８９５号明細書（同明細書中、トレメリムマブは１１．２．１である）（これらは本明細書において参照により援用される）に記載される。トレメリムマブは例示的抗ＣＴＬＡ４抗体である。トレメリムマブ配列は、以下の本明細書の配列表に提供される（配列番号１３０〜１３７）。
「ＰＤ−１ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００５００９と少なくとも約８５％のアミノ酸同一性を有し、且つＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２結合活性を有するポリペプチド又はその断片を意味する。ＮＰ＿００５００９の配列を以下に提供する。
ＰＤ−１ポリペプチド配列
ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００５００９
Figure 0006755866
「ＰＤ−１核酸分子」とは、ＰＤ−１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的ＰＤ−１核酸分子配列はＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００５０１８に提供される。
「抗ＰＤ−１抗体」とは、ＰＤ−１ポリペプチドと選択的に結合する抗体又はその抗原結合断片を意味する。例示的抗ＰＤ−１抗体としては、例えば、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＡ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８）、又はＡＭＰ−２２４が挙げられる。
「ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１２５４６３５と少なくとも約８５％、９５％又は１００％のアミノ酸同一性を有し、且つＰＤ−１及びＣＤ８０結合活性を有するポリペプチド又はその断片を意味する。ＮＰ＿００１２５４６３５の配列を以下に提供する。
ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド配列
ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１２５４６３５
Figure 0006755866
「ＰＤ−Ｌ１核酸分子」とは、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。例示的ＰＤ−Ｌ１核酸分子配列はＮＣＢＩ受託番号ＮＭ＿００１２６７７０６に提供される。
「抗ＰＤ−Ｌ１抗体」とは、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドと選択的に結合する抗体又はその抗原結合断片を意味する。例示的抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば米国特許出願公開第２０１３００３４５５９号明細書／米国特許第８７７９１０８号明細書及び米国特許出願公開第２０１４０３５６３５３号明細書（これらは本明細書において参照により援用される）に記載される。ＭＥＤＩ４７３６は例示的ＰＤ−Ｌ１抗体である。ＭＥＤＩ４７３６の配列は、以下の本明細書の配列表に提供される（配列番号１３８〜１４５）。
用語「抗原結合断片」は、インタクトな抗体の一部分を含む分子を指し、詳細には、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を含む分子を指す。当該技術分野において、抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片によって果たされ得ることは公知である。抗体断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体、及び抗体断片で形成される多重特異性抗体が挙げられる。
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基又はエピトープの高度に特異的な認識及び結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体と対照的である。
用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体の両方、並びに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体部分を含む融合タンパク質、及び抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。更に、「モノクローナル抗体」は、限定はされないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、及びトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の発現）によることを含めた、任意の方法で作製されたかかる抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト（例えばマウス）配列を含むように改変された非ヒト（例えばマウス）免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はハムスター）のＣＤＲの残基によってＣＤＲの残基が置き換えられているヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６）。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（ＦＷ）アミノ酸残基が、所望の特異性、及び／又は親和性、及び／又は能力を有する非ヒト種由来の抗体の対応する残基で置き換えられる。
ヒト化抗体は、抗体の特異性、親和性、及び／又は能力を洗練して最適化するため、Ｆｖフレームワーク領域にあるか、及び／又は置き換えられた非ヒト残基内にある更なる残基の置換によって更に修飾することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てを含有する少なくとも１つ、典型的には２つ又は３つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、一方、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部分も含み得る。ヒト化抗体の作成に用いられる方法の例が、米国特許第５，２２５，５３９号明細書又は同第５，６３９，６４１号明細書に記載される。
抗体の「可変領域」は、単独での、或いは組み合わせでの、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は、各々、３つのＣＤＲ領域によってつながった４つのＦＷ領域からなる。各鎖のＣＤＲはＦＷ領域によって近接して一体に保持されており、他方の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲの決定には少なくとも２つの技法がある：（１）異種間配列多様性に基づく手法（即ち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（５ｔｈ ｅｄ．，１９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））；及び（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８））。加えて、当該技術分野では、ＣＤＲの決定にこれらの２つの手法の組み合わせが用いられることもある。
Ｋａｂａｔ付番方式は、概して、可変ドメインの残基（およそ軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）を参照するときに用いられる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。
語句「Ｋａｂａｔにあるとおりのアミノ酸位置付番」、「Ｋａｂａｔ位置」、及びその文法上の変化形は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編成の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに用いられる付番方式を指す。この付番方式を用いると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＷ又はＣＤＲの短縮、又はそれへの挿入に対応するより少ない又は追加的なアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を含み、及び重鎖ＦＷ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。
Figure 0006755866
残基のＫａｂａｔ付番は、所与の抗体について、相同性領域において抗体の配列を「標準」Ｋａｂａｔ付番配列とアラインメントすることにより決定し得る。Ｃｈｏｔｈｉａは、その代わりに構造ループの位置を参照する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。Ｋａｂａｔ付番規則を用いて付番したときのＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で異なる（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームがＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を置くためである；３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終わり；３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終わり；３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ 構造ループとの妥協案に相当し、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられている。
ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）も、ＣＤＲを含めた免疫グロブリン可変領域の付番方式を提供する。例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５−７７（２００３）（これは本明細書において参照により援用される）を参照のこと。ＩＭＧＴ付番方式は、５，０００を超える配列のアラインメント、構造データ、及び超可変ループの特徴付けに基づいたもので、あらゆる種の可変領域及びＣＤＲ領域の容易な比較を可能にする。ＩＭＧＴ付番スキーマによれば、ＶＨ−ＣＤＲ１は２６〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５１〜５７位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ３は９３〜１０２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ１は２７〜３２位にあり、ＶＬ−ＣＤＲ２は５０〜５２位にあり、及びＶＬ−ＣＤＲ３は８９〜９７位にある。
ＥＵインデックス又はＥＵ付番方式は、配列決定された最初のヒトＩｇＧ（ＥＵ抗体）の連続付番に基づく。この規則の最も一般的な参考文献はＫａｂａｔ配列マニュアル（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）であるため、ＥＵインデックスは時にＫａｂａｔインデックスと同義として誤って使用される。ＥＵインデックスは挿入及び欠失を提供せず、従って場合によってはＩｇＧサブクラス及び種間でのＩｇＧ位置の比較が、特にヒンジ領域で不確かとなり得る。それにも関わらず、この規則は、多数のＦｃ構造機能研究においてＦｃ領域間の直接的な比較を可能にするのに十分となっている。従って、本明細書でＦｃ領域における置換及び挿入に用いる付番スキームは、ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスである。対照的に、本明細書で可変領域（ＶＨ及びＶＬ）に用いる付番スキームは、標準的なＫａｂａｔ付番である。
本明細書全体を通じて用いられるとおり、記載されるＶＨ ＣＤＲ配列は古典的Ｋａｂａｔ付番位置に対応し、即ち、Ｋａｂａｔ ＶＨ−ＣＤＲ１は３１〜３５位にあり、ＶＨ−ＣＤＲ２は５０〜６５位にあり、及びＶＨ−ＣＤＲ３は９５〜１０２位にある。ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３も古典的Ｋａｂａｔ付番位置、即ち、２４〜３４位、５０〜５６位及び８９〜９７位に対応する。
本明細書で使用されるとき、Ｆｃ領域は、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。従って、Ｆｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、及びＩｇＥ及びＩｇＭの最後３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインのＮ末端の可動性ヒンジを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧについては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃγ２及びＣγ３）並びにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。
Ｆｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むように定義される（ここで付番は、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に規定されるとおりのＥＵインデックスに従う）。Ｆｃとは、独立してこの領域を指し得るか、又は抗体、抗体断片、若しくはＦｃ融合タンパク質に関連してこの領域を指し得る。幾つもの異なるＦｃ位置に、限定はされないが、ＥＵインデックスによって付番するときの２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、及び３５８位を含め、多型が観察されており、従って提示される配列と先行技術の配列との間には少しの差異が存在し得る。
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体、又は当該技術分野において公知の任意の技法（例えば、培養下の細胞における組換え発現、又はトランスジェニック動物における発現）を用いて作製されるヒトによって産生される抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。従って、用語のヒト抗体はまた、本来はヒトによって産生される抗体（又はその改変された変異体若しくは誘導体）であるが、非ヒト系で発現する（例えば、化学合成によって作製されるか；微生物、哺乳動物、又は昆虫細胞で組換え発現するか；又は動物対象で発現する）抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体も包含する。従って、ヒト対象又はヒト細胞（例えば、組換え抗体又はその断片を発現するハイブリドーマ又は細胞株）から得られ、続いて動物、例えばマウスで発現する抗体は、ヒト抗体と見なされる。ヒト抗体のこの定義には、インタクトな又は完全長の抗体、その断片、及び／又は少なくとも１つのヒト重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体、例えば、マウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などが含まれる。
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の動物種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、及び／又は親和性、及び／又は能力を有する哺乳動物の１つの種（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域が、別の種（通常はヒト）に由来する抗体の配列と同種であり、その種における免疫応答の誘発が回避される。
用語「エピトープ」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に開示されるＣＤ７３抗体又はＣＤ７３結合分子との結合能を有する抗原タンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。抗体又は結合分子のうちのエピトープを認識する部分は、パラトープと呼ばれる。タンパク質抗原のエピトープは、その構造及びパラトープとの相互作用に基づき立体エピトープと線状エピトープとの２つに分類される。立体エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続なセクションで構成される。これらのエピトープは、抗原の三次元表面特徴及び形状又は三次構造に基づきパラトープと相互作用する。対照的に、線状エピトープは、その一次構造に基づきパラトープと相互作用する。線状エピトープは抗原の連続したアミノ酸配列によって形成される。
用語「抗体結合部位」は、相補的な抗体が特異的に結合する連続又は不連続な部位（即ち、エピトープ）を含む抗原（例えば、ＣＤ７３）内の領域を指す。従って、抗体結合部位は、抗原内に、エピトープを越えた、結合親和性及び／又は安定性などの特性を決定し得るか又は抗原酵素活性又は二量化などの特性に影響を与え得る追加的な範囲を含み得る。従って、２つの抗体が抗原内の同じエピトープに結合する場合であっても、抗体分子がエピトープ外のアミノ酸との個別的な分子間接触を確立する場合、かかる抗体は個別的な抗体結合部位に結合すると見なされる。
「結合親和性」は、概して、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。特に指示がない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、概して解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野において公知の一般的な方法によって計測することができる。低親和性抗体は、概して抗原に緩徐に結合し、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体は、概して抗原に速やかに結合し、結合したまま長く留まる傾向がある。結合親和性を計測する種々の方法が当該技術分野において公知であり、本開示の目的上、そのいずれを用いることもできる。
「効力」は、通常、特に指定されない限りｎＭ単位のＩＣ５０値として表現される。ＩＣ５０は、抗原結合分子の阻害濃度中央値である。機能アッセイでは、ＩＣ５０は、生物学的反応をその最大値の５０％低下させる濃度である。リガンド結合試験では、ＩＣ５０は、受容体結合を最大特異的結合レベルの５０％低下させる濃度である。ＩＣ５０は、当該技術分野において公知の任意の手段によって計算することができる。効力の改善は、例えば親抗体（例えば、生殖細胞系列化する前の親抗体又は親和性最適化する前の親抗体）と比べた計測によって決定し得る。
親抗体と比較したときの本開示の抗体又はポリペプチドの効力の改善倍数は、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１７０倍、又は少なくとも約１８０倍又はそれを超えることができる。
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌免疫グロブリンによってそれらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いてその標的細胞を細胞毒で死滅させることが可能になる細胞傷害の一形態を指す。標的細胞の表面に向かう特異的高親和性ＩｇＧ抗体は細胞傷害性細胞を「武装」し、かかる死滅に不可欠である。標的細胞の溶解は細胞外であって、直接的な細胞間接触が必要であり、補体は関与しない。抗体に加えて、抗原担持標的細胞に特異的に結合する能力を有するＦｃ領域を含む他のタンパク質、具体的にはＦｃ融合タンパク質は、細胞媒介性細胞傷害を達成可能であると考えられる。簡単にするため、Ｆｃ融合タンパク質の活性によって生じる細胞媒介性細胞傷害も本明細書ではＡＤＣＣ活性と称する。
「単離されている」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、天然には見られない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞又は組成物には、もはやそれらが天然に見られる形態ではなくなる程度まで精製されているものが含まれる。一部の態様において、単離されている抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、実質的に純粋である。
用語「対象」は、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含めた、特定の治療のレシピエントとなる任意の動物（例えば哺乳動物）を指す。典型的には、用語「対象」及び「患者」は、本明細書ではヒト対象を指して同義的に使用される。
用語「医薬組成物」は、活性成分（例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子）の生物学的活性が有効となるのを可能にするような形態の調製物であって、その組成物を投与しようとする対象にとって許容できない毒性がある追加的な構成成分を含有しない調製物を指す。かかる組成物は無菌であり得る。
本明細書に開示されるとおりの抗ＣＤ７３結合分子の「有効量」は、具体的に記載される目的の実行に十分な量である。「有効量」は、記載される目的に関して実験的に常法で決定することができる。
用語「治療有効量」は、対象又は哺乳動物の疾患又は障害を「治療」するのに有効な、本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子又は他の薬物の量を指す。
語句「標識」は、本明細書で使用されるとき、本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子に直接又は間接的に融合した（例えば遺伝子融合した）又はコンジュゲートした（例えば化学的にコンジュゲートした）、それにより「標識」抗ＣＤ７３結合分子を生じさせる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒することができる。
「誘導体化可能基」及び「誘導体化可能官能基」などの用語は同義的に使用され、反応することによって本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子（例えばＣＤ７３抗体）と別の物質との間での共有結合の形成を可能にする能力を有する官能基を指す。一部の態様において、かかる物質は、治療剤（例えば細胞毒）、検出可能標識、ポリマー（例えばＰＥＧ）等である。例示的誘導体化可能基としては、チオール、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、及びアミド、並びにこれらの修飾形態、例えば活性化形態又は保護形態などが挙げられる。
「治療する」又は「治療」又は「治療すること」又は「軽減する」又は「軽減すること」などの用語は、（１）診断された病的状態又は障害を治癒し、減速させ、その症状を和らげ、及び／又はその進行を止める治療手段と、（２）標的とする病的状態又は障害の発症を防ぎ及び／又は遅らせる予防又は防御手段との両方を指す。従って、治療を必要としている者には、既に障害を有する者；障害を起こし易い者；及び障害を予防すべき者が含まれる。特定の態様において、対象は、その患者が例えばある種の癌の完全寛解、部分寛解、又は一時的寛解を示す場合、本開示の方法による癌の「治療」に成功している。
用語「癌」、「腫瘍」、「癌性」、及び「悪性」は、典型的には調節されない細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物の生理的状態を指し、又はそれを記述する。癌の例としては、限定はされないが、癌腫、例えば、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫、及び白血病が挙げられる。かかる癌のより詳細な例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵癌、膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌及び肝細胞癌などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌（ホルモン媒介性乳癌を含む、例えば、Ｉｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９４：１０５７−１０６５を参照）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルムス腫瘍などの腎臓癌、基底細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、各種の頭頸部癌及びムチン性起源の癌、例えば、ムチン性卵巣癌、胆管癌（肝臓）及び腎乳頭癌が挙げられる。一部の態様において、用語の癌は、本明細書で使用されるとき、ＣＤ７３を発現する癌を具体的に指す。一部の具体的な態様において、用語の癌は、低レベルのＣＤ７３を発現する癌を指す。一部の態様において、用語の癌は、本明細書で使用されるとき、ＣＤ７３を発現する癌（例えば、結腸癌、乳癌、リンパ腫、非小細胞癌）を具体的に指す。
本明細書で同義的に使用されるとおりの「ポリヌクレオチド」、又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。前出の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含め、本明細書で言及されるあらゆるポリヌクレオチドに適用される。
用語「ベクター」は、宿主細胞に１つ以上の目的の遺伝子又は配列を送達し、一部の態様では発現させる能力を有する構築物を意味する。ベクターの例としては、限定はされないが、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及び特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞が挙げられる。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であってもよく、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、且つそれは非アミノ酸によって分断されていてもよい。これらの用語はまた、天然で又は介入によって修飾されている（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作又は修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションなど）アミノ酸ポリマーも包含する。また、この定義内には、例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）、並びに当該技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。本開示のポリペプチドは抗体に基づくため、特定の態様において、ポリペプチドは単鎖又は会合鎖として存在し得ることが理解される。
「組換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生されるポリペプチド又はタンパク質を指す。改変された宿主細胞で発現する組換え産生ポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術によって分離され、分画され、又は部分的若しくは実質的に精製されている天然又は組換えポリペプチドと同様に、単離されていると見なされる。本明細書に開示されるポリペプチドは、当該技術分野において公知の方法を用いて組換え産生されてもよい。或いは、本明細書に開示されるタンパク質及びペプチドは化学的に合成されてもよい。
用語「アミノ酸置換」は、親配列に存在するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置き換えることを指す。アミノ酸は、親配列において、例えば化学的ペプチド合成を用いるか、又は当該技術分野において公知の組換え方法で置換することができる。従って、「Ｘ位での置換」又は「Ｘ位での置換」と言うときは、Ｘ位に存在するアミノ酸を代替的なアミノ酸残基で置換することを指す。一部の態様において、置換パターンは、スキーマＡＸＹに従い記述することができ、ここでＡは、天然でＸ位に存在するアミノ酸に対応する一文字コードであり、Ｙは置換するアミノ酸残基である。他の態様において、置換パターンはスキーマＸＹに従い記述することができ、ここでＹは、天然でＸ位に存在するアミノ酸を置換するアミノ酸残基に対応する一文字コードである。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従って、ポリペプチドのアミノ酸が同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸に置き換えられる場合、この置換は保存的であると見なされる。別の態様では、一続きのアミノ酸を、側鎖ファミリーメンバーの順番及び／又は組成が異なる構造的には同様の一続きによって保存的に置き換えることができる。
非保存的置換は、（ｉ）電気陽性側鎖を有する残基（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＬｙｓ）が電気陰性残基（例えば、Ｇｌｕ又はＡｓｐ）に代えて、又はそれによって置換されているか、（ｉｉ）親水性残基（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）が疎水性残基（例えば、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ又はＶａｌ）に代えて、又はそれによって置換されているか、（ｉｉｉ）システイン又はプロリンが任意の他の残基に代えて、又はそれによって置換されているか、又は（ｉｖ）かさ高い疎水性又は芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ又はＴｒｐ）がより小さい側鎖を有するもの（例えば、Ａｌａ、Ｓｅｒ）又は側鎖を有しないもの（例えば、Ｇｌｙ）に代えて、又はそれによって置換されているものを含む。
当業者は他の置換を容易に特定することができる。例えば、アミノ酸アラニンについて、置換は、Ｄ−アラニン、グリシン、β−アラニン、Ｌ−システイン及びＤ−システインのいずれか１つから選ぶことができる。リジンについて、置換は、Ｄ−リジン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモアルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチン、又はＤ−オルニチンのいずれか１つであってもよい。概して、単離ポリペプチドの特性の変化を引き起こすと予想し得る機能的に重要な領域の置換は、（ｉ）極性残基、例えば、セリン又はスレオニンが疎水性残基、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、又はアラニンに代えて（又はそれによって）置換されるか；（ｉｉ）システイン残基が任意の他の残基に代えて（又はそれによって）置換されるか；（ｉｉｉ）電気陽性側鎖を有する残基、例えば、リジン、アルギニン又はヒスチジンが電気陰性側鎖を有する残基、例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸に代えて（又はそれによって）置換されるか；又は（ｉｖ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、かかる側鎖を有しないもの、例えばグリシンに代えて（又はそれによって）置換されるものである。前述の非保存的置換のうちの１つがタンパク質の機能特性を変化させ得る可能性はまた、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換の位置にも相関する。従って一部の非保存的置換は、生物学的特性に対する効果をほとんど又は全く有しない。
用語「アミノ酸挿入」は、親配列に存在する２つのアミノ酸残基の間に新規アミノ酸残基を導入することを指す。アミノ酸は、例えば、化学的ペプチド合成を用いるか、又は当該技術分野において公知の組換え方法で親配列に挿入することができる。従って本明細書で使用されるとき、語句「Ｘ位とＹ位との間への挿入」又は「Ｋａｂａｔ Ｘ位とＹ位との間への挿入」（ここでＸ及びＹはアミノ酸位置に対応する）は（例えば、２３９位と２４０位との間へのシステインアミノ酸挿入）、Ｘ位とＹ位との間へのアミノ酸の挿入を指し、また、核酸配列における、Ｘ位及びＹ位のアミノ酸をコードするコドン間への、あるアミノ酸をコードするコドンの挿入も指す。挿入パターンは、スキーマＡＸｉｎｓに従い記述することができ、ここでＡは、挿入されるアミノ酸に対応する一文字コードであり、及びＸは挿入の前の位置である。
２つのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の「パーセント配列同一性」という用語は、２つの配列の最適アラインメントのため導入しなければならない付加又は欠失（即ちギャップ）を考慮した、比較ウィンドウにわたって配列が共有される同一のマッチ位置の数を指す。マッチ位置は、標的配列と参照配列との両方で同一のヌクレオチド又はアミノ酸が提供される任意の位置である。ギャップはヌクレオチド又はアミノ酸ではないため、標的配列に提供されるギャップはカウントしない。同様に、カウントするのは標的配列のヌクレオチド又はアミノ酸であり、参照配列のヌクレオチド又はアミノ酸ではないため、参照配列に提供されるギャップもカウントしない。
配列同一性のパーセンテージは、両方の配列に同一のアミノ酸残基又は核酸塩基が存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を求め、そのマッチ位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを求めることにより計算される。２つの配列間の配列の比較及びパーセント配列同一性の決定は、オンライン使用及びダウンロードの両方について容易に利用可能なソフトウェアを用いて達成することができる。好適なソフトウェアプログラムは、様々な供給元から、タンパク質配列及びヌクレオチド配列の両方のアラインメントについて利用可能である。パーセント配列同一性を決定するための１つの好適なプログラムは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴウェブサイト（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能なＢＬＡＳＴプログラムスイートの一部であるｂｌ２ｓｅｑである。ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰのいずれかのアルゴリズムを使用して２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列の比較に用いられ、一方、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列の比較に用いられる。他の好適なプログラムは、例えば、ＥＭＢＯＳＳバイオインフォマティクスプログラムスイートの一部であって、且つ欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａからも入手可能なニードル（Ｎｅｅｄｌｅ）、ストレッチャー（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）、ウォーター（Ｗａｔｅｒ）、又はマッチャー（Ｍａｔｃｈｅｒ）である。
ポリヌクレオチド又はポリペプチド参照配列と整列する単一ポリヌクレオチド又はポリペプチド標的配列内の種々の領域は、各々が独自のパーセント配列同一性を有し得る。パーセント配列同一性の値は小数第２位で四捨五入されることが注記される。例えば、８０．１１、８０．１２、８０．１３、及び８０．１４は８０．１に切り捨てられ、一方、８０．１５、８０．１６、８０．１７、８０．１８、及び８０．１９は８０．２に切り上げられる。また、長さの値は常に整数であることも注記される。
特定の態様において、第１のアミノ酸配列の第２の配列アミノ酸に対するパーセンテージ同一性「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）（式中、Ｙは、第１及び第２の配列のアラインメント（目視検査によるか、又は特定の配列アラインメントプログラムによってアラインメントしたとき）において同一のマッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｚは、第２の配列の残基の総数である）として計算される。第１の配列の長さが第２の配列より長い場合、第１の配列の第２の配列に対するパーセント同一性は第２の配列の第１の配列に対するパーセント同一性より高くなる。
当業者は、パーセント配列同一性を計算するための配列アラインメントの生成が一次配列データによってのみ駆動される二値の配列間比較に限定されないことを理解するであろう。配列アラインメントは多重配列アラインメントから得ることができる。多重配列アラインメントの生成に好適な１つのプログラムは、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／から入手可能なＭＵＳＣＬＥである。或いは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、例えばＥＢＩから入手可能である。
また、配列データを構造データ（例えば、結晶学的タンパク質構造）、機能データ（例えば、突然変異の位置）、又は系統学的データなどの異種ソースのデータと統合することによって配列アラインメントを生成し得ることも理解されるであろう。異種データを統合して多重配列アラインメントを生成する好適なプログラムは、ｗｗｗ．ｔｃｏｆｆｅｅ．ｏｒｇで入手可能であるか、或いは例えばＥＢＩから入手可能なＴ−Ｃｏｆｆｅｅである。また、パーセント配列同一性の計算に用いる最終的なアラインメントは自動的に又は手動でキュレーションし得ることも理解されるであろう。
用語「コンセンサス配列」は、軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域に関して本明細書で使用されるとき、ＶＬ又はＶＨ鎖内のいずれのアミノ酸残基が抗原結合に害を及ぼすことなく修飾するのに適しているかに関する情報に基づき定義される複合の又は一般化されたＶＬ若しくはＶＨ配列を指す。従って、ＶＬ鎖又はＶＨ鎖の「コンセンサス配列」では、特定のアミノ酸位置が、その位置における複数の可能なアミノ酸残基のうちの１つによって占有される。例えば、特定の位置にアルギニン（Ｒ）又はセリン（Ｓ）が存在する場合、コンセンサス配列内のその特定の位置はアルギニン又はセリン（Ｒ又はＳ）のいずれかであり得る。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のコンセンサス配列は、例えば、インビトロ親和性成熟（例えば、縮重コーディングプライマーを使用して特定のＣＤＲ内のあらゆるアミノ酸位置をランダム化すること）か、抗体ＣＤＲ内のアミノ酸残基のスキャニング突然変異誘発（例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発）か、又は当該技術分野において公知の任意の他の方法と、続いて抗原に対する突然変異体の結合を評価することによる、突然変異したアミノ酸位置が抗原結合に影響を及ぼすかどうかの決定により定義することができる。一部の態様において、突然変異はＣＤＲ領域に導入される。他の態様において、突然変異はフレームワーク領域に導入される。他の一部の態様において、突然変異はＣＤＲ領域及びフレームワーク領域に導入される。
ＩＩ．ＣＤ７３結合分子
本開示は、ＣＤ７３結合分子、例えば、ＣＤ７３、例えばヒトＣＤ７３に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。ＣＤ７３の完全長アミノ酸（ａａ）及びヌクレオチド（ｎｔ）配列は当該技術分野において公知である（例えば、ヒトＣＤ７３についてＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２１５８９、又はマウスＣＤ７３についてＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ６１５０３を参照）。一部の態様において、抗ＣＤ７３結合分子はヒト抗体（例えば、クローン１０．３抗体、クローン２Ｃ５抗体、ＭＥＤＩ９４４７）である。特定の態様において、ＣＤ７３結合分子は抗体又はその抗原結合断片である。
一部の態様において、ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ又はｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、イントラボディ、ＩｇＧ ＣＨ２、ミニボディ、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、シングルドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、又はｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。一部の態様において、抗体はＩｇＧ型抗体、例えばＩｇＧ１型抗体である。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、重鎖定常領域又はその断片を含む。一部の具体的な態様において、重鎖定常領域はＩｇＧ定常領域である。ＩｇＧ定常領域は、κ定常領域及びλ定常領域からなる群から選択される軽鎖定常領域を含むことができる。
特定の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、親抗体、例えば、ＣＤ７３００１０抗体又はＣＤ７３０００２抗体と比較して修飾されている。一部の態様において、親抗体はＣＤ７３００１０である。他の態様において、親抗体はＣＤ７３０００２である。他の態様において、親抗体は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９である。修飾には、親抗体、例えばＣＤ７３００１０又はＣＤ７３０００２と比較したときのＣＤＲ領域及び／又はＦＷ領域の突然変異が含まれ得る。
語句「ＣＤ７３０００２抗体」は、配列番号１のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号２のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３０００４抗体」は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号１０３のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３０００８抗体」は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号１０７のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３００１０抗体」は、配列番号３のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号４のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３００１１抗体」は、配列番号５のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号６のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３００２１抗体」は、配列番号７のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号８のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３００４２抗体」は、配列番号９のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号１０のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３００４６抗体」は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号１２のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３００４７抗体」は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号１４のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３００６８抗体」は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号１０７のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
語句「ＣＤ７３００６９抗体」は、配列番号１１０のアミノ酸配列を含む２つのＶＬドメインと配列番号１０９のアミノ酸配列を含む２つのＶＨドメインとを含むＩｇＧ１を指す。
（ｉ）ＣＤ７３００１０由来抗ＣＤ７３抗体
特定の態様において、本開示の抗ＣＤ７３抗体は、限定はされないが：
１）コンセンサス配列ＳＧＳＬＳＮＩＧＲＮＸ１ＶＮ（式中、Ｘ１はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表す）を含む軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は
２）コンセンサス配列ＬＸ２ＮＸ３ＲＸ４Ｘ５（式中、Ｘ２はアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、Ｘ３はアミノ酸残基グルタミン（Ｑ）又はロイシン（Ｌ）を表し、Ｘ４はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はプロリン（Ｐ）を表し、及びＸ５はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表す）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
３）コンセンサス配列ＡＴＷＤＤＳＸ６Ｘ７ＧＷＸ８（式中、Ｘ６はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はヒスチジン（Ｈ）を表し、Ｘ７はアミノ酸残基リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）又はアスパラギン（Ｎ）を表し、及びＸ８はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はスレオニン（Ｔ）を表す）を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含めた、ＣＤ７３００１０抗体の軽鎖のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３に対する修飾を含む。
特定の態様において、本開示の抗ＣＤ７３抗体は、限定はされないが：
１）コンセンサス配列ＳＹＡＸ９Ｓ（式中、Ｘ９はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はチロシン（Ｙ）を表す）を含む重鎖ＣＤＲ１、及び／又は
２）コンセンサス配列Ｘ１０ＩＸ１１ＧＳＸ１２ＧＸ１３ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（式中、Ｘ１０はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）を表し、Ｘ１１はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はセリン（Ｓ）を表し、Ｘ１２はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はグリシン（Ｇ）を表し、及びＸ１３はアミノ酸残基セリン（Ｓ）又はアルギニン（Ｒ）を表す）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
３）コンセンサス配列ＬＧＹＸ１４Ｘ１５Ｘ１６ＤＸ１７（式中、Ｘ１４はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、Ｘ１５はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はスレオニン（Ｔ）を表し、Ｘ１６はアミノ酸残基バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）を表し、及びＸ１７はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）又はグルタミン酸（Ｅ）を表す）を含む重鎖ＣＤＲ３
を含めた、ＣＤ７３００１０抗体の重鎖のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３に対する修飾を含む。
一態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、コンセンサスアミノ酸配列：
［ＦＷ１］ＳＧＳＬＳＮＩＧＲＮＸ１ＶＮ［ＦＷ２］ＬＸ２ＮＸ３ＲＸ４Ｘ５［ＦＷ３］ＡＴＷＤＤＳＸ６Ｘ７ＧＷＸ８［ＦＷ４］
（式中、［ＦＷ１］、［ＦＷ２］、［ＦＷ３］及び［ＦＷ４］は、それぞれＶＬフレームワーク領域１（配列番号２５又は２６）、ＶＬフレームワーク領域２（配列番号２７又は２８）、ＶＬフレームワーク領域３（配列番号２９）及びＶＬフレームワーク領域４（配列番号３０）のアミノ酸残基を表し、ここで、
Ｘ１はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ２はアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ３はアミノ酸残基グルタミン（Ｑ）又はロイシン（Ｌ）を表し、
Ｘ４はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はプロリン（Ｐ）を表し、
Ｘ５はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ６はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はヒスチジン（Ｈ）を表し、
Ｘ７はアミノ酸残基リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）又はアスパラギン（Ｎ）を表し、及び
Ｘ８はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はスレオニン（Ｔ）を表す）を含むＶＬ領域を含む。
一態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、コンセンサスアミノ酸配列：
［ＦＷ５］ＳＹＡＸ９Ｓ［ＦＷ６］Ｘ１０ＩＸ１１ＧＳＸ１２ＧＸ１３ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［ＦＷ７］ＬＧＹＸ１４Ｘ１５Ｘ１６ＤＸ１７［ＦＷ８］
（式中、［ＦＷ５］、［ＦＷ６］、［ＦＷ７］及び［ＦＷ８］は、それぞれＶＨフレームワーク領域１（配列番号３１）、ＶＨフレームワーク領域２（配列番号３２）、ＶＨフレームワーク領域３（配列番号３３）及びＶＨフレームワーク領域４（配列番号３４）のアミノ酸残基を表し、ここで、
Ｘ９はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ１０はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）を表し、
Ｘ１１はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１２はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はグリシン（Ｇ）を表し、
Ｘ１３はアミノ酸残基セリン（Ｓ）又はアルギニン（Ｒ）を表し、
Ｘ１４はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１５はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はスレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ１６はアミノ酸残基バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）を表し
Ｘ１７はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）又はグルタミン酸（Ｅ）を表す）を含むＶＨ領域を含む。
一態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、コンセンサスアミノ酸配列：
［ＦＷ１］ＳＧＳＬＳＮＩＧＲＮＸ１ＶＮ［ＦＷ２］ＬＸ２ＮＸ３ＲＸ４Ｘ５［ＦＷ３］ＡＴＷＤＤＳＸ６Ｘ７ＧＷＸ８［ＦＷ４］
（式中、［ＦＷ１］、［ＦＷ２］、［ＦＷ３］及び［ＦＷ４］は、それぞれＶＬフレームワーク領域１（配列番号２５又は２６）、ＶＬフレームワーク領域２（配列番号２７又は２８）、ＶＬフレームワーク領域３（配列番号２９）及びＶＬフレームワーク領域４（配列番号３０）のアミノ酸残基を表し、ここで、
Ｘ１はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ２はアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ３はアミノ酸残基グルタミン（Ｑ）又はロイシン（Ｌ）を表し、
Ｘ４はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はプロリン（Ｐ）を表し、
Ｘ５はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ６はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はヒスチジン（Ｈ）を表し、
Ｘ７はアミノ酸残基リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）又はアスパラギン（Ｎ）を表し、及び
Ｘ８はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はスレオニン（Ｔ）を表す）を含むＶＬ領域を含み、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、コンセンサスアミノ酸配列：
［ＦＷ５］ＳＹＡＸ９Ｓ［ＦＷ６］Ｘ１０ＩＸ１１ＧＳＸ１２ＧＸ１３ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［ＦＷ７］ＬＧＹＸ１４Ｘ１５Ｘ１６ＤＸ１７［ＦＷ８］
（式中、［ＦＷ５］、［ＦＷ６］、［ＦＷ７］及び［ＦＷ８］は、それぞれＶＨフレームワーク領域１（配列番号３１）、ＶＨフレームワーク領域２（配列番号３２）、ＶＨフレームワーク領域３（配列番号３３）及びＶＨフレームワーク領域４（配列番号３４）のアミノ酸残基を表し、ここで、
Ｘ９はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ１０はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）を表し、
Ｘ１１はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１２はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はグリシン（Ｇ）を表し、
Ｘ１３はアミノ酸残基セリン（Ｓ）又はアルギニン（Ｒ）を表し、
Ｘ１４はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ１５はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はスレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ１６はアミノ酸残基バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）を表し
Ｘ１７はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）又はグルタミン酸（Ｅ）を表す）を含むＶＨ領域を更に含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４６、４７、及び４８からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４６、４７、及び４８からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４９、５０、５１及び５２からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５３、５４、５５、及び５６からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５３、５４、５５、及び５６からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５及び３６からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５及び３６からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３７、３８、３９、及び４０からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３７、３８、３９、及び４０からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４６、４７、及び４８からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４６、４７、及び４８からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号５３、５４、５５、及び５６からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号５３、５４、５５、及び５６からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３５及び３６からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３５及び３６からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３７、３８、３９、及び４０からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３７、３８、３９、及び４０からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４６、４７及び４８からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１と；配列番号４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２と；配列番号５３、５４、５５、及び５６からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４６、４７及び４８からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と；配列番号４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と；配列番号５３、５４、５５、及び５６からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５及び３６からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１と；配列番号３７、３８、３９、及び４０からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２と；配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３とを含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５及び３６からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号３７、３８、３９、及び４０からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４６、４７及び４８からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号５３、５４、５５、及び５６からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４６、４７及び４８からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と；１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号５３、５４、５５、及び５６からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３５及び３６からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１と；１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３７、３８、３９、及び４０からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３５及び３６からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３７、３８、３９、及び４０からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号４１、４２、４３、４４、及び４５からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３に対する修飾を含み、且つ重鎖及び／又は軽鎖のＦＷ１、及び／又はＦＷ２、及び／又はＦＷ３、及び／又はＦＷ４に対する修飾を更に含む。
一部の態様において、ＦＷ１は配列番号２５又は２６を含み、ＦＷ２は配列番号２７又は２８を含み、ＦＷ３は配列番号２９を含み、ＦＷ４は配列番号３０を含み、ＦＷ５は配列番号３１を含み、ＦＷ６は配列番号３２を含み、ＦＷ７は配列番号３３を含み、及びＦＷ８は配列番号３４を含む。
一部の態様において、ＦＷ１は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号２５又は２６を含み；ＦＷ２は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号２７又は２８を含み；ＦＷ３は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号２９を含み；ＦＷ４は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３０を含み；ＦＷ５は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３１を含み；ＦＷ６は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３２を含み；ＦＷ７は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３３を含み；及びＦＷ８は配列番号３４を含む。
特定の態様において、抗ＣＤ７３３抗体又はその抗原結合断片は、同一であるか、又は１つ以上のＣＤＲにおける１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を除いて同一であるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＲＤ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ及びＶＨを含み、ここでかかるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＲＤ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３は、それぞれ、
配列番号４６、４９、５３、３５、３７、及び４１、又は
配列番号４７、４９、５３、３５、３７及び４１、又は
配列番号４７、４９、５４、３６、３７及び４２、又は
配列番号４６、５０、５４、３６、３８及び４３、又は
配列番号４６、５１、５５、３６、３９及び４４、又は
配列番号４８、５２、５４、３６、４０及び４４、又は
配列番号４６、４９、５６、３５、３７及び４１、又は
配列番号４６、４９、５３、３５、３７及び４５、又は
配列番号４７、４９、５６、３６、３７及び４５、又は
配列番号４６、５０、５６、３６、３８及び４５、又は
配列番号４６、５１、５６、３６、３９及び４５、又は
配列番号４８、５２、５６、３６、４０及び４５、又は
配列番号４６、４９、５６、３５、３７及び４５である。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを含み、ＶＬは、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
他の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを含み、ＶＨは、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３及び配列番号８４からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
他の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、及び配列番号７０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一の配列を含むＶＬを含み、且つ配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３及び配列番号８４からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一の配列を含むＶＨを更に含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６８の配列を含むＶＬと配列番号８２の配列を含むＶＨとを含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号６８の配列からなるＶＬと配列番号８２の配列からなるＶＨとを含む。
「クローン１０．３抗体」（「７３ｃｏｍｂｏ３」又は「ＭＥＤＩ９４４７」とも称される）は、配列番号６８のＣＤ７３００１０由来軽鎖（ＶＬ）（それぞれ配列番号４６、５１及び５６の配列を有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む）を２つ、及び配列番号８２のＣＤ７３００１０由来重鎖（ＶＨ）（それぞれ配列番号３６、３９、及び４５の配列を有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む）を２つ含むＩｇＧ１である。
特定の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８２の１０．３重鎖ＶＨと配列番号６８の１０．３軽鎖ＶＬとを含む１０．３抗体と実質的に同じか又はそれより良好な親和性でＣＤ７３と結合する。
（ｉｉ）ＣＤ７３０００２由来抗ＣＤ７３抗体
特定の態様において、本開示の抗ＣＤ７３抗体は、限定はされないが：
１）配列ＳＧＤＫＶＧＤＫＹＡＳを含む軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は
２）コンセンサス配列ＥＤＸ１８ＫＸ１９Ｘ２０Ｓ（式中、Ｘ１８はアミノ酸残基セリン（Ｓ）又はスレオニン（Ｔ）を表し、Ｘ１９はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はチロシン（Ｙ）を表し、及びＸ２０はアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）又はロイシン（Ｌ）を表す）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
３）配列ＱＡＷＤＴＳＦＷＶを含む軽鎖ＣＤＲ３
を含めた、ＣＤ７３０００２抗体の軽鎖のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３に対する修飾を含む。
特定の態様において、本開示の抗ＣＤ７３抗体は、限定はされないが：
１）配列ＳＸ２１Ａ Ｘ２２Ｓ（式中、Ｘ２１はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）又はバリン（Ｖ）を表し、及びＸ２２はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はアルギニン（Ｒ）を表す）を含む重鎖ＣＤＲ１、及び／又は
２）配列ＡＩＳＧＳＧＧＳＸ２３ＹＹ Ｘ２４ＤＳＶＫＸ２５（式中、Ｘ２３はアミノ酸残基スレオニン（Ｔ）又はプロリン（Ｐ）を表し；Ｘ２４はアミノ酸残基アラニン（Ａ）又はＧ（グリシン）を表し；及びＸ２５はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はアルギニン（Ｒ）を表す）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
３）配列ＤＫＧＹＹＷＹＭを含む重鎖ＣＤＲ３
を含めた、ＣＤ７３０００２の重鎖のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３に対する修飾を含む。
一態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、コンセンサスアミノ酸配列：
［ＦＷ９］ＳＧＤＫＶＧＤＫＹＡＳ［ＦＷ１０］ＥＤＸ１８ＫＸ１９Ｘ２０Ｓ［ＦＷ１１］ＱＡＷＤＴＳＦＷＶ［ＦＷ１２］
（式中、［ＦＷ９］、［ＦＷ１０］、［ＦＷ１１］及び［ＦＷ１２］は、それぞれＶＬフレームワーク領域１（配列番号９０又は９１）、ＶＬフレームワーク領域２（配列番号９２）、ＶＬフレームワーク領域３（配列番号９３、９４又は１２２）及びＶＬフレームワーク領域４（配列番号３０）のアミノ酸残基を表し；ここで、Ｘ１８はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）又はロイシン（Ｌ）を表し；Ｘ１９はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はチロシン（Ｙ）を表し；及びＸ２０はアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）又はロイシン（Ｌ）を表す）を含むＶＬ領域を含む。
一態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、コンセンサスアミノ酸配列：
［ＦＷ１３］ＳＸ２１Ａ Ｘ２２Ｓ［ＦＷ１４］ＡＩＳＧＳＧＧＳＸ２３ＹＹ Ｘ２４ＤＳＶＫＸ２５［ＦＷ１５］ＤＫＧＹＹＷＹＭ［ＦＷ１６］
（式中、［ＦＷ１３］、［ＦＷ１４］、［ＦＷ１５］及び［ＦＷ１６］は、それぞれＶＨフレームワーク領域１（配列番号３１）、ＶＨフレームワーク領域２（配列番号３２）、ＶＨフレームワーク領域３（配列番号３３）及びＶＨフレームワーク領域４（配列番号８９）のアミノ酸残基を表し；ここで、Ｘ２１はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）又はバリン（Ｖ）を表し；Ｘ２２はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はアルギニン（Ｒ）を表し；Ｘ２３はアミノ酸残基スレオニン（Ｔ）又はプロリン（Ｐ）を表し；Ｘ２４はアミノ酸残基アラニン（Ａ）又はＧ（グリシン）を表し；及びＸ２５はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はアルギニン（Ｒ）を表す）を含むＶＨ領域を含む。
一態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、コンセンサスアミノ酸配列：
［ＦＷ９］ＳＧＤＫＶＧＤＫＹＡＳ［ＦＷ１０］ＥＤＸ１８ＫＸ１９Ｘ２０Ｓ［ＦＷ１１］ＱＡＷＤＴＳＦＷＶ［ＦＷ１２］
（式中、［ＦＷ９］、［ＦＷ１０］、［ＦＷ１１］及び［ＦＷ１２］は、それぞれＶＬフレームワーク領域１（配列番号９０又は９１）、ＶＬフレームワーク領域２（配列番号９２）、ＶＬフレームワーク領域３（配列番号９３、９４又は１２２）及びＶＬフレームワーク領域４（配列番号３０）のアミノ酸残基を表し；ここで、Ｘ１８はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）又はロイシン（Ｌ）を表し；Ｘ１９はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はチロシン（Ｙ）を表し；及びＸ２０はアミノ酸残基ヒスチジン（Ｈ）、プロリン（Ｐ）又はロイシン（Ｌ）を表す）を含むＶＬ領域を含み、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、コンセンサスアミノ酸配列：
［ＦＷ１３］ＳＸ２１Ａ Ｘ２２Ｓ［ＦＷ１４］ＡＩＳＧＳＧＧＳＸ２３ＹＹ Ｘ２４ＤＳＶＫＸ２５［ＦＷ１５］ＤＫＧＹＹＷＹＭ［ＦＷ１６］
（式中、［ＦＷ１３］、［ＦＷ１４］、［ＦＷ１５］及び［ＦＷ１６］は、それぞれＶＨフレームワーク領域１（配列番号３１）、ＶＨフレームワーク領域２（配列番号３２）、ＶＨフレームワーク領域３（配列番号３３）及びＶＨフレームワーク領域４（配列番号８９）のアミノ酸残基を表し；ここで、Ｘ２１はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）又はバリン（Ｖ）を表し；Ｘ２２はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はアルギニン（Ｒ）を表し；Ｘ２３はアミノ酸残基スレオニン（Ｔ）又はプロリン（Ｐ）を表し；Ｘ２４はアミノ酸残基アラニン（Ａ）又はＧ（グリシン）を表し；及びＸ２５はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はアルギニン（Ｒ）を表す）を含むＶＨ領域を更に含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９７からなる配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９７からなる配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９８、９９、１２７、１２８、及び１２９からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９８、９９、１２７、１２８及び１２９からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１００からなる配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１００からなる配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５、１２３及び１２４からなる群から選択される配列の配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５、１２３及び１２４からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３７、９５、１２５及び１２６からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３７、９５、１２５、及び１２６からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９６からなる配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９６からなる配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９７からなる配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９７からなる配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９８、９９、１２７、１２８、及び１２９からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９８、９９、１２７、１２８、及び１２９からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号１００からなる配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号１００からなる配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３５、１２３及び１２４からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３５、１２３及び１２４からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３７、９５、１２５及び１２６からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３７、９５、１２５及び１２６からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９６からなる配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９６からなる配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９７からなる配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１と；配列番号９８、９９、１２７、１２８、及び１２９からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２と；配列番号１００からなる配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９７からなる配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と；配列番号９８、９９、１２７、１２８、及び１２９からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と；配列番号１００からなる配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５、１２３、及び１２４からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１と；配列番号３７、９５、１２５、及び１２６からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２と；配列番号９６からなる配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３とを含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５、１２３、及び１２４からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号３７、９５、１２５、及び１２６からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号９６からなる配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９７からなる配列からなるＶＬ−ＣＤＲ１と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９８、９９、１２７、１２８、及び１２９からなる群から選択される配列からなるＶＬ−ＣＤＲ２と；１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号１００からなる配列からなるＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９７からなる配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９８、９９、１２７、１２８、及び１２９からなる群から選択される配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号１００からなる配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３５、１２３、及び１２４からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ１と；１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３７、９５、１２５、及び１２６からなる群から選択される配列からなるＶＨ−ＣＤＲ２と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９６からなる配列からなるＶＨ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３５、１２３、及び１２４からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３７、９５、１２５、及び１２６からなる群から選択される配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９６からなる配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３に対する修飾を含み、且つ重鎖及び／又は軽鎖のＦＷ１、及び／又はＦＷ２、及び／又はＦＷ３、及び／又はＦＷ４に対する修飾を更に含む。
一部の態様において、ＦＷ９は配列番号９０又は９１を含み、ＦＷ１０は配列番号９２を含み、ＦＷ１１は配列番号９３、９４、又は１２２を含み、ＦＷ１２は配列番号３０を含み、ＦＷ１３は配列番号３１を含み、ＦＷ１４は配列番号３２を含み、ＦＷ１５は配列番号３３を含み、及びＦＷ１６は配列番号８９を含む。
一部の態様において、ＦＷ９は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９０又は９１を含み、ＦＷ１０は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９２を含み、ＦＷ１１は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号９３、９４、又は１２２を含み、ＦＷ１２は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３０を含み、ＦＷ１３は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３１を含み、ＦＷ１４は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３２を含み、ＦＷ１５は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて配列番号３３を含み、及びＦＷ１６は配列番号８９を含む。
特定の態様において、抗ＣＤ７３３抗体又はその抗原結合断片は、同一であるか、又は１つ以上のＣＤＲにおける１、２、３、若しくは４個のアミノ酸置換を除いて同一であるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＲＤ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ及びＶＨを含み、ここでかかるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＲＤ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３は、それぞれ、
配列番号９７、９８、１００、３５、３７、及び９６、又は
配列番号９７、９９、１００、３５、９５及び９６、又は
配列番号９７、９８、１００、３５、３７、及び９６、又は
配列番号９７、９９、１００、１２３、３７、及び９６、又は
配列番号９７、９９、１００、１２４、３７、及び９６、又は
配列番号９７、９９、１００、３５、１２５、及び９６、又は
配列番号９７、９９、１００、３５、１２６、及び９６、又は
配列番号９７、９９、１００、３５、９５、及び９６、又は
配列番号９７、１２７、１００、３５、９５、及び９６、又は
配列番号９７、１２８、１００、３５、９５、及び９６、又は
配列番号９７、１２９、１００、３５、９５、及び９６、又は
配列番号９７、９９、１００、３５、９５、及び９６である。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを含み、ＶＬは、配列番号８６、８８、１１２、１１８、１１９、１２０、及び１２１からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
他の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを含み、ＶＨは、配列番号８５、８７、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、及び１１７からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
他の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８６、８８、１１２、１１８、１１９、１２０、及び１２１からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一の配列を含むＶＬを含み；且つ配列番号８５、８７、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、及び１１７からなる群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一の配列を含むＶＨを更に含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８８の配列を含むＶＬと；配列番号８７の配列を含むＶＨとを含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８７の配列からなるＶＬと、配列番号８７の配列からなるＶＨとを含む。
「クローン２Ｃ５抗体」は、配列番号８８のＣＤ７３０００２由来軽鎖（ＶＬ）（それぞれ配列番号９７、９９、及び１００の配列を有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む）を２つ、及び配列番号８７のＣＤ７３００００２由来重鎖（ＶＨ）（それぞれ配列番号３５、９５、及び９６の配列を有する３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む）を含むＩｇＧ１である。
特定の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８７の２Ｃ５重鎖ＶＨと配列番号８８の２Ｃ５軽鎖ＶＬとを含む２Ｃ５抗体と実質的に同じか又はそれより良好な親和性でＣＤ７３と結合する。
（ｉｉｉ）ＣＤ７３０００２又はＣＤ７３００１０以外の親抗体を有する抗ＣＤ７３抗体
他の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体又は抗原結合断片の親抗体は、ＣＤ７３０００４（即ち、配列番号１０４のＶＬと配列番号１０３のＶＨとを含む抗ＣＤ７３抗体）、ＣＤ７３０００８（即ち、配列番号１０６のＶＬと配列番号１０７のＶＨとを含む抗ＣＤ７３抗体）、ＣＤ７３０００１１（即ち、配列番号５のＶＬと配列番号６のＶＨとを含む抗ＣＤ７３抗体）、ＣＤ７３００２１（即ち、配列番号７のＶＬと配列番号８のＶＨとを含む抗ＣＤ７３抗体）、ＣＤ７３００４２（即ち、配列番号９のＶＬと配列番号１０のＶＨとを含む抗ＣＤ７３抗体）、ＣＤ７３００４６（即ち、配列番号１１のＶＬと配列番号１２のＶＨとを含む抗ＣＤ７３抗体）、ＣＤ７３００４７（即ち、配列番号１３のＶＬと配列番号１４のＶＨとを含む抗ＣＤ７３抗体）、ＣＤ７３００６８（即ち、配列番号１０８のＶＬと配列番号１０７のＶＨとを含む抗ＣＤ７３抗体）、又はＣＤ７３００６９（即ち、配列番号１１０のＶＬと配列番号１０９のＶＨとを含む抗ＣＤ７３抗体）である。親抗体に対する修飾には、親抗体、例えばＣＤ７３０００４と比較したときのＣＤＲ領域及び／又はＦＷ領域の突然変異が含まれ得る。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９の軽鎖のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３に対する修飾を含む。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９の重鎖のＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３に対する修飾を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ１を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ２を含む。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ３を含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ１と；ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ２と；ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ１と；ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ２と；ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ１と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ２と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ−ＣＤＲ３とを含む。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ１と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ２と；１、２、３又は４個のアミノ酸置換を除いて、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ−ＣＤＲ３とを含む。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来の重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３に対する修飾を含み、且つＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来の重鎖及び／又は軽鎖のＦＷ１、及び／又はＦＷ２、及び／又はＦＷ３、及び／又はＦＷ４に対する修飾を更に含む。
特定の態様において、抗ＣＤ７３３抗体又はその抗原結合断片は、同一であるか、又は１つ以上のＣＤＲにおける１、２、３、若しくは４個のアミノ酸置換を除いて同一であるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＲＤ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶＬ及びＶＨを含み、ここでかかるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＲＤ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来である。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを含み、ＶＬは、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ配列から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
他の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は抗体ＶＬ及び抗体ＶＨを含み、ＶＨは、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ配列から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一のアミノ酸配列を含む。
他の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＬ配列から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一の配列を含むＶＬを含み、且つＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９由来のＶＨ配列から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一の配列を含むＶＨを更に含む。
特定の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３０００１１、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９抗体と実質的に同じか又はそれより良好な親和性でＣＤ７３と結合する。
（ｉｖ）混合適合（ｍｉｘｅｄ ａｎｄ ｍａｔｃｈｅｄ）抗ＣＤ７３抗体
本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子（例えば、ＣＤ７３０００２、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、ＣＤ７３００１０、ＣＤ７３００１１、ＣＤ７３０２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、ＣＤ７３００４７、ＣＤ７３００６８、又はＣＤ７３００６９）のＶＨ及びＶＬ配列又はかかる配列の変異体（例えば、クローン１０ ＧＬ９、クローン１０ Ｐ３２Ｅ、クローン１０ Ｃ１、クローン１０ Ｃ２、クローン１０ Ｄ３、クローン１０ Ｇ１０、クローン１０ ＨＰＴ、クローン１０ ＧＲＶＥ、クローン１０ ｃｏｍｂｏ１、クローン１０ ｃｏｍｂｏ２、クローン１０ ｃｏｍｂｏ３、クローン１０ ｃｏｍｂｏ５、又はクローンｃｏｍｂｏ６）のＶＨ及びＶＬは、他の抗ＣＤ７３結合分子を作成するため「混合適合」することができる。
特定の態様において、１０．３抗体及び２Ｃ５抗体のＶＨ配列が混合適合される。別の態様において、１０．０３抗体及び２Ｃ５抗体のＶＬ配列を混合適合することができる。それに加えて又は代えて、本明細書に開示されるクローン１０（ＣＤ７３００１０）変異体のＶＬ及び／又はＶＨ配列を混合適合することができる。それに加えて又は代えて、本明細書に開示されるクローン２（ＣＤ７３０００２）変異体のＶＬ及び／又はＶＨ配列を混合適合することができる。それに加えて又は代えて、本明細書に開示されるクローン１０（ＣＤ７３００１０）及びクローン２（ＣＤ７３０００２）変異体のＶＬ及び／又はＶＨ配列を混合適合することができる。
一部の態様において、ＶＬ及び／又はＶＨの混合適合は、同じエピトープビンに分類される抗体に由来する配列間で行うことができる（実施例２を参照）。本明細書で使用されるとき、用語「エピトープビン」は、同じエピトープ又は重複エピトープに結合するか、或いは同じエピトープ又は重複エピトープとの結合に関して互いに競合する抗体又はその抗原結合断片のグループ化を指す。例えば、ＣＤ７３０００３、ＣＤ７３００１０、ＣＤ７３００２１、ＣＤ７３００４２、ＣＤ７３００４６、及びＣＤ７３００４７（これらの抗体は全てが「エピトープビンＢ」に属する）由来の配列を混合適合することができる。他の態様において、ＶＬ及び／又はＶＨの混合適合は、異なるエピトープビンに分類される抗ＣＤ７３抗体に由来する配列間で行うことができる。従って、「エピトープビンＢ」に属する抗体の配列を、「エピトープビンＡ」（ＣＤ７３０００２、ＣＤ７３０００４、ＣＤ７３０００８、及びＣＤ７３００１１）又は「エピトープビンＣ」（ＣＤ７３００６８及びＣＤ７３００６９）の抗ＣＤ７３抗体の配列と混合適合することができる。
（ｖ）突然変異抗ＣＤ７３抗体
特定の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、ヒトＦｃＲｎとの結合を改善し、且つ抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片の半減期を改善する突然変異を含む。一部の態様において、かかる突然変異は、ＩｇＧ１の定常ドメインに導入された、２５２位のメチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への突然変異、２５４位のセリン（Ｓ）からスレオニン（Ｔ）への突然変異、及び２５６位のスレオニン（Ｔ）からグルタミン酸（Ｅ）への突然変異（Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）にあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）である。米国特許第７，６５８，９２１号明細書（これは参照により本明細書に援用される）を参照のこと。「ＹＴＥ突然変異体」と称されるこの種の突然変異体ＩｇＧは、野生型バージョンの同じ抗体と比較したとき約４倍の半減期の増加を呈することが示されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２４（２００６））。一部の態様において、ＩｇＧ定常ドメインを含む抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、２５１〜２５７、２８５〜２９０、３０８〜３１４、３８５〜３８９、及び４２８〜４３６位（ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）のアミノ酸残基の１個以上のアミノ酸置換を含み、ここでかかる突然変異は抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片の血清半減期を増加させる。
一部の態様において、ＹＴＥ突然変異体は、ＩｇＧ定常ドメインの４３４位（ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）に、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、及びセリン（Ｓ）からなる群から選択されるアミノ酸による置換を更に含む。他の態様において、ＹＴＥ突然変異体は、ＩｇＧ定常ドメインの４３４位（ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）に、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、及びセリン（Ｓ）からなる群から選択されるアミノ酸による置換と、ＩｇＧ定常ドメインの４２８位（ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）に、スレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びセリン（Ｓ）からなる群から選択されるアミノ酸による置換とを更に含む。
更に他の態様において、ＹＴＥ突然変異体は、ＩｇＧ定常ドメインの４３４位（ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）に、チロシン（Ｙ）による置換と、ＩｇＧ定常ドメインの２５７位（ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）に、ロイシン（Ｌ）による置換とを更に含む。一部の態様において、ＹＴＥ突然変異体は、ＩｇＧ定常ドメインの４３４位（ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）に、セリン（Ｓ）による置換と、ＩｇＧ定常ドメインの４２８位（ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）に、ロイシン（Ｌ）による置換とを更に含む。
ある具体的な態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１定常ドメインの２５２位のメチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への突然変異、２５４位のセリン（Ｓ）からスレオニン（Ｔ）への突然変異、及び２５６位のスレオニン（Ｔ）からグルタミン酸（Ｅ）への突然変異（ＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）を含むＩｇＧ１定常ドメインを含む。
特定の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、
（ａ）２５２位のアミノ酸の、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、又はスレオニン（Ｔ）による置換、
（ｂ）２５４位のアミノ酸の、スレオニン（Ｔ）による置換、
（ｃ）２５６位のアミノ酸の、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、又はスレオニン（Ｔ）による置換、
（ｄ）２５７位のアミノ酸の、ロイシン（Ｌ）による置換、
（ｅ）３０９位のアミノ酸の、プロリン（Ｐ）による置換、
（ｆ）３１１位のアミノ酸の、セリン（Ｓ）による置換、
（ｇ）４２８位のアミノ酸の、スレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はセリン（Ｓ）による置換、
（ｈ）４３３位のアミノ酸の、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、又はグルタミン（Ｑ）による置換、
（ｉ）４３４位のアミノ酸の、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はチロシンによる置換、及び
（ｊ）前記置換の２つ以上の組み合わせ
（位置はＫａｂａｔにあるとおりのＥＵインデックスに従い付番する）からなる群から選択される少なくとも１つのＩｇＧ定常ドメインアミノ酸置換を含み、ここで修飾ＩｇＧは、野生型ＩｇＧ定常ドメインを有するＩｇＧの血清半減期と比較して血清半減期が増加している。
一部の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片のＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、上記のＶＨ及びＶＬ配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の類似性であり、且つ１、２、３、４、５個又はそれを超える保存的置換を含む。それぞれ、配列番号７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８７、１１１、１１３、１１４、１１５、１１６、又は１１７のＶＨ領域、及び／又は配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、８６、８８、１１２、１１８、１１９、１２０、又は１２１のＶＬ領域と高い（即ち、８０％以上の）配列類似性又は配列同一性を有するＶＨ及びＶＬ領域を有するＣＤ７３抗体は、配列番号５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、又は１２１をコードする核酸分子を突然変異誘発し（例えば、部位特異的又はＰＣＲ媒介性突然変異誘発）、続いて本明細書に記載される機能アッセイを用いて、コードされた改変抗体を保持機能に関して試験することによって得ることができる。
一部の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体のＦｃドメイン又は本明細書に開示される抗体のＣＤ７３結合断片を含む融合タンパク質のＦｃドメインは、例えばＡＤＣＣによる細胞傷害を低減するため、Ｆｃ受容体に対する結合性が低減されている。一部の態様において、抗体又はＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、例えばＡＤＣＣによる細胞傷害を増加させるため、Ｆｃ受容体に対する結合性が増加されている。一部の態様において、抗体又はＦｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｋａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスによって付番するとき２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２５１、２５２、２５４、２５５、２５６、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２７９、２８０、２８４、２９２、２９６、２９７、２９８、２９９、３０５、３１３、３１６、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３９、３４１、３４３、３７０、３７３、３７８、３９２、４１６、４１９、４２１、４４０、及び４４３からなる群から選択される１つ以上の位置に天然に存在しないＡＤＣＣ低減アミノ酸残基を含む。抗体のＡＤＣＣ活性を低減することが可能な多数の特異的突然変異が当該技術分野において公知であり、例えば、２３４Ｆ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｑ（又は２３５Ｙ）、２３９Ａ、３３２Ｑ、３３１Ｓ及びこれらの組み合わせが挙げられる。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書、同第５，６４８，２６０号明細書、同第７，５９７，８８９号明細書、同第８，９６１，９６７号明細書、同第７，３７１，８２６号明細書、同第７，７８５，７９１号明細書、同第７，７９０，８５８号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３７８６６３号明細書、同第２０１３００７１３９０号明細書、同第２０１１０２１２０８７号明細書、同第２０１５０１１８２２７号明細書、同第２００６０１９４２９０号明細書、同第２００６０１９４２９１号明細書、同第２００８０２７４１０５号明細書、同第２００８０２７４５０６号明細書、米国特許出願公開第２０１３００８９５４１号明細書、及び米国特許出願公開第２０１３０１０８６２３号明細書（これらは全体として参照により本明細書に援用される）に記載される突然変異を参照のこと。ＡＤＣＣエフェクター機能が低下した抗体にはまた、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものも含まれる（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号明細書を参照）。かかるＦｃ突然変異体にはまた、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するＦｃ突然変異体を含め、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上に置換を有するＦｃ突然変異体も含まれる（例えば、米国特許第７，３３２，５８１号明細書を参照）。任意選択で、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方を低減する突然変異が組み込まれてもよい。一部の態様では、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを低減し又は消失させる突然変異を含む本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片を使用して、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作成することができる。
一態様において、本開示は抗ＣＤ７３抗体を提供し、この抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３であり、Ｋａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスによって付番するとき２３４、２３５、及び３３１からなる群から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾を含む。更に別の具体的な態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３ Ｆｃ領域であり、天然に存在しないアミノ酸は、Ｋａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスによって付番するとき２３４Ｆ、２３５Ｅ、２３５Ｆ、２３５Ｑ（又は２３５Ｙ）、２３９Ａ、３３２Ｑ、３３１Ｓ、３３２Ｑからなる群から選択される。
別の態様において、本開示は抗ＣＤ７３抗体を提供し、この抗体はＩｇＧ４であり、Ｋａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスによって付番するとき２２８及び２３５からなる群から選択される１つ以上の位置に少なくとも１つの修飾を含む。更に別の具体的な態様において、Ｆｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、天然に存在しないアミノ酸は、Ｋａｂａｔに規定されるとおりのＥＵインデックスによって付番するとき２２８Ｐ、２３５Ｅ及び２３５Ｙからなる群から選択される。具体的な態様において、本開示は抗ＣＤ７３抗体を提供し、この抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３であり、位置（ｉ）２３４Ｆ、２３５Ｅ、及び３３１Ｓ；（ｉｉ）２３４Ｆ、２３５Ｆ、及び３３１Ｓ；（ｉｉｉ）２３４Ｆ、２３５Ｑ、及び３２２Ｑに修飾を含む。別の具体的な態様において、本開示は抗ＣＤ７３抗体を提供し、この抗体はＩｇＧ４であり、修飾２２８Ｐ及び２３５Ｅを含む。
ＩＩＩ．エピトープ競合ＣＤ７３結合分子
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される様々な抗ＣＤ７３抗体が結合するのと同じエピトープに結合するＣＤ７３結合分子、例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体と同じエピトープ、又はクローン２Ｃ５抗体と同じエピトープに結合する分子を提供する。
かかる抗体は、標準的なＣＤ７３結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリーアッセイ、表面プラズモン共鳴、又は溶液アッセイ）において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体、例えば、ＣＤ７３００１０抗体、ＣＤ７３０００２抗体、ＣＤ７３０００４抗体、及びその抗原結合断片と交差競合する（例えば、統計学的に有意な方法でその結合を競合的に阻害する）その能力に基づき同定することができる。
従って、一態様において、本開示は、ＣＤ７３との結合に関して別の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片、例えば、ＣＤ７３００１０抗体、ＣＤ７３０００２抗体、ＣＤ７３０００４抗体、その変異体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）、又はその抗原結合断片と競合する抗ＣＤ７３抗体及びその抗原結合断片、例えばヒトモノクローナル抗体を提供する。被験抗体が例えばＣＤ７３００１０抗体（又はクローン１０．３抗体又はその抗原結合断片）、又はＣＤ７３０００２抗体（又はクローン２Ｃ５抗体又はその抗原結合断片）の結合を阻害する能力は、その被験抗体がＣＤ７３との結合に関してその抗体と競合し得ることを実証する；かかる抗体は、非限定的な理論によれば、それが競合する抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片とＣＤ７３上の同じ又は関連する（例えば、構造的に類似しているか、又は空間的に近接した）エピトープに結合することができる。一態様において、例えば、ＣＤ７３００１０抗体（又はクローン１０．３抗体又はその抗原結合断片）、又はＣＤ７３０００２抗体（又はクローン２Ｃ５抗体又はその抗原結合断片）とＣＤ７３上の同じエピトープに結合する抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、ヒトモノクローナル抗体である。
本明細書に記載されるとおり、ＣＤ７３の酵素活性を直接阻害するモノクローナル抗体であるＭＥＤＩ９４４７の作用機構を解明するため、ＭＥＤＩ９４４７のエピトープを同定した。このエピトープは、基質結合及び活性部位残基から離れた領域であるＣＤ７３のＮ末端ドメインの頂端表面内にある。構造的及び機構的試験から、ＭＥＤＩ９４４７は、ＣＤ７３が触媒的に活性なコンホメーションをとるのを妨げる二重機構を介してＣＤ７３をアンタゴナイズすることが明らかになった。これらの結果は、腫瘍微小環境におけるアデノシンシグナル伝達の調節手段としての、ＣＤ７３の選択的で強力且つ非競合的な阻害の標的とし得る精密にマッピングされたエピトープの初めての報告を提供する。
本発明者らは、水素重水素交換（ＨＤＸ）質量分析法（ＭＳ）及び突然変異誘発戦略を用いてＭＥＤＩ９４４７のエピトープを確定し、大域的ＣＤ７３構造に対する抗体結合の潜在的効果を調べた。抗体は、ＡＭＰ加水分解の非競合的阻害を可能にするＣＤ７３のＮ末端ドメインにある部位に結合する。様々な態様において、エピトープは、Ｖ１４４、Ｋ１８０、及びＮ１８５に対応する１つ以上のＣＤ７３アミノ酸残基を含む。様々な態様において、エピトープは、ＣＤ７３のＹ１３５、Ｋ１３６、及びＮ１８７に対応する１つ以上のＣＤ７３アミノ酸残基を更に含む。顕著なことに、エピトープは、抗体結合がＣＤ７３の開いた配座異性体から触媒的に活性な閉じた配座異性体への変換を妨げるような位置にある。更に、本発明者らの試験は、ＭＥＤＩ９４４７がＣＤ７３との抗体相互作用の結合価によって媒介される二重阻害機構を用いてアンカー型ＣＤ７３と可溶性ＣＤ７３との両方を阻害し得ることを示している。
ＩＶ．抗ＣＤ７３抗体の機能的特性
抗原に対する抗体の親和性又はアビディティは、当該技術分野において周知の任意の好適な方法、例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、又は反応速度（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）を用いて実験的に決定することができる。直接結合アッセイ並びに競合的結合アッセイフォーマットは、容易に用いることができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，” Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；及び本明細書に記載される方法を参照のこと。特定の抗体抗原相互作用の親和性計測値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）で計測した場合に異なり得る。従って、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ又はＫｄ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の計測は、抗体及び抗原の標準化した溶液、及び当該技術分野において公知のとおりの及び本明細書に記載される緩衝液など、標準化した緩衝液で行われる。
また、当該技術分野において、表面プラズモン共鳴分析（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））を用いて計測した親和性が、反応物のうちのいずれの１つがチップに結合するかに応じて異なり得ることも公知である。この点で、親和性は、標的抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）をチップ上に固定化したフォーマット（「ＩｇＧダウン」フォーマットと称される）を用いるか、又は標的タンパク質（例えばＣＤ７３）をチップ上に固定化したフォーマット（例えば「ＣＤ７３ダウン」フォーマットと称される）を用いて計測することができる。
本開示の一態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、１０−６Ｍ未満、又は１０−７Ｍ未満、又は１０−８Ｍ未満、又は１０−９Ｍ未満、又は１０−１０Ｍ未満、又は１０−１１Ｍ未満、又は１０−１２Ｍ未満、又は１０−１３Ｍ未満の解離定数又はｋｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）でＣＤ７３及び／又はその抗原断片に特異的に結合する。
別の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、１×１０−３ｓ−１未満、又は２×１０−３ｓ−１未満のＫｏｆｆでＣＤ７３及び／又はその抗原断片に結合する。他の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、又は１０−１０ｓ−１未満のＫｏｆｆでＣＤ７３及びその抗原断片に結合する。
別の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、又は少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数又はｋｏｎ速度でＣＤ７３及び／又はその抗原断片に結合する。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーによって計測したとき少なくとも約６０ｐＭ、少なくとも約７０ｐＭ、少なくとも約８０ｐＭ、少なくとも約９０ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１１０ｐＭ、少なくとも約１２０ｐＭ、少なくとも約１３０ｐＭ、少なくとも約１４０ｐＭ、少なくとも約１５０ｐＭ、少なくとも約１６０ｐＭ、又は少なくとも約１７０ｐｍのＫＤでＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞の表面上のＣＤ７３に結合する。具体的な一態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン１０．３抗体であり、フローサイトメトリーによって計測したとき約１５０ｐＭのＫＤでＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞の表面上のＣＤ７３に結合する。別の具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン２Ｃ５抗体であり、フローサイトメトリーによって計測したとき約８０ｐＭのＫＤでＭＢ−ＭＤＡ−２３１細胞の表面上のＣＤ７３に結合する。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーによって計測したとき少なくとも約４０ｐＭ、少なくとも約５０ｐＭ、少なくとも約６０ｐＭ、少なくとも約７０ｐＭ、少なくとも約８０ｐＭ、少なくとも約９０ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１２０ｐＭ、又は少なくとも約１３０ｐＭのＫＤでマウス３Ｔ１細胞の表面上のＣＤ７３に結合する。具体的な一態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン１０．３抗体であり、フローサイトメトリーによって計測したとき約１１０ｐＭのＫＤでマウス３Ｔ１細胞の表面上のＣＤ７３に結合する。別の具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン２Ｃ５抗体であり、フローサイトメトリーによって計測したとき約５５ｐＭのＫＤでマウス３Ｔ１細胞の表面上のＣＤ７３に結合する。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、フローサイトメトリーによって計測したとき少なくとも約４０ｐＭ、少なくとも約５０ｐＭ、少なくとも約６０ｐＭ、少なくとも約７０ｐＭ、少なくとも約８０ｐＭ、少なくとも約９０ｐＭ、又は少なくとも約１００ｐＭのＫＤでカニクイザルＭＫ−１細胞の表面上のＣＤ７３に結合する。具体的な一態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン１０．３抗体であり、フローサイトメトリーによって計測したとき約８０ｐＭのＫＤでカニクイザルＭＫ−１細胞の表面上のＣＤ７３に結合する。別の具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン２Ｃ５抗体であり、フローサイトメトリーによって計測したとき約６０ｐＭのＫＤでカニクイザルＭＫ−１細胞の表面上のＣＤ７３に結合する。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴（ＰＲＯＴＥＯＮ（登録商標））によって計測したとき少なくとも約３ｐＭ、少なくとも約４ｐＭ、少なくとも約５ｐＭ、少なくとも約６ｐＭ、少なくとも約７ｐＭ、少なくとも約８ｐＭ、少なくとも約９ｐＭ、又は少なくとも約１０ｐＭのＫＤでヒトＣＤ７３に結合する。具体的な一態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン１０．３抗体であり、表面プラズモン共鳴（ＰＲＯＴＥＯＮ（登録商標））によって計測したとき約４ｐＭのＫＤでヒトＣＤ７３に結合する。別の具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン２Ｃ５抗体であり、表面プラズモン共鳴（ＰＲＯＴＥＯＮ（登録商標））によって計測したとき約９ｐＭのＫＤでヒトＣＤ７３に結合する。
一部の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴（ＰＲＯＴＥＯＮ（登録商標））によって計測したとき少なくとも約１ｐＭ、少なくとも約２ｐＭ、少なくとも約３ｐＭ、少なくとも約４ｐＭ、少なくとも約５ｐＭ、少なくとも約６ｐＭ、少なくとも約７ｐＭ、少なくとも約８ｐＭ、少なくとも約９ｐＭ、少なくとも約１０ｐＭ、少なくとも約１１ｐＭ、少なくとも約１２ｐＭ、少なくとも約１３ｐＭ、少なくとも約１４ｐＭ、少なくとも約１５ｐＭ、少なくとも約１６ｐＭ、少なくとも約１７ｐＭ、少なくとも約１８ｐＭ、少なくとも約１９ｐＭ、少なくとも約２０ｐＭ、少なくとも約２１ｐＭ、少なくとも約２２ｐＭ、少なくとも約２３ｐＭ、少なくとも約２４ｐＭ、又は少なくとも約２５ｐＭのＫＤでマウスＣＤ７３に結合する。具体的な一態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン１０．３抗体であり、表面プラズモン共鳴（ＰＲＯＴＥＯＮ（登録商標））によって計測したとき約１ｐＭのＫＤでマウスＣＤ７３に結合する。別の具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン２Ｃ５抗体であり、表面プラズモン共鳴（ＰＲＯＴＥＯＮ（登録商標））によって計測したとき約２２ｐＭのＫＤでマウスＣＤ７３に結合する。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴（ＰＲＯＴＥＯＮ（登録商標））によって計測したとき少なくとも約３ｐＭ、少なくとも約４ｐＭ、少なくとも約５ｐＭ、少なくとも約６ｐＭ、少なくとも約７ｐＭ、少なくとも約８ｐＭ、少なくとも約９ｐＭ、又は少なくとも約１０ｐＭのＫＤでカニクイザルＣＤ７３に結合する。具体的な一態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン１０．３抗体であり、ＳＰＲ（Ｐｒｏｔｅｏｎ）によって計測したとき約７ｐＭのＫＤでカニクイザルＣＤ７３に結合する。別の具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン２Ｃ５抗体であり、表面プラズモン共鳴（ＰＲＯＴＥＯＮ（登録商標））によって計測したとき約９ｐＭのＫＤでカニクイザルＣＤ７３に結合する。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、溶液結合によって計測したとき少なくとも約４０ｐＭ、少なくとも約５０ｐＭ、少なくとも約６０ｐＭ、少なくとも約７０ｐＭ、少なくとも約８０ｐＭ、少なくとも約９０ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、又は少なくとも約１１０ｐＭのＫＤでヒトＣＤ７３に結合する。具体的な一態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン１０．３抗体であり、溶液結合によって計測したとき約８０ｐＭのＫＤでヒトＣＤ７３に結合する。別の具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン２Ｃ５抗体であり、溶液結合によって計測したとき約８０ｐＭのＫＤでヒトＣＤ７３に結合する。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、溶液結合によって計測したとき少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約２００ｐＭ、少なくとも約３００ｐＭ、少なくとも約４００ｐＭ、少なくとも約５００ｐＭ、少なくとも約６００ｐＭ、少なくとも約７００ｐＭ、少なくとも約８００ｐＭ、少なくとも約９００ｐＭ、少なくとも約１０００ｐＭ、少なくとも約１１００ｐＭ、少なくとも約１２００ｐＭ、少なくとも約１３００ｐＭ、少なくとも約１４００ｐＭ、少なくとも約１５００ｐＭ、少なくとも約１６００ｐＭ、少なくとも約、又は少なくとも約１７００ｐＭのＫＤでマウスＣＤ７３に結合する。具体的な一態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン１０．３抗体であり、溶液結合によって計測したとき約１３０ｐＭのＫＤでマウスＣＤ７３に結合する。別の具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン２Ｃ５抗体であり、溶液結合によって計測したとき約１５００ｐＭのＫＤでマウスＣＤ７３に結合する。
一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、溶液結合によって計測したとき少なくとも約６０ｐＭ、少なくとも約７０ｐＭ、少なくとも約８０ｐＭ、少なくとも約９０ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１１０ｐＭ、又は少なくとも約１２０ｐＭのＫＤでカニクイザルＣＤ７３に結合する。具体的な一態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン１０．３抗体であり、溶液結合によって計測したとき約９０ｐＭのＫＤでカニクイザルＣＤ７３に結合する。別の具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体はクローン２Ｃ５抗体であり、溶液結合によって計測したとき約１００ｐＭのＫＤでカニクイザルＣＤ７３に結合する。詳細な態様において、ＭＥＤＩ９４４７は、約１×１０−１２、５×１０−１２、１０×１０−１２、１００×１０−１２、又は１５０×１０−１２のＫＤでＣＤ７３に結合する。
一部の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、Ｔ細胞分裂のＡＭＰ媒介抑制を軽減することができる。他の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、ＴｒｅｇによるＡＴＰ誘導性Ｔｅｆｆ抑制をレスキューすることができる。
一部の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、同系腫瘍成長を有意に阻害することができる。一態様において、腫瘍は、非小細胞肺癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、乳癌腫瘍、頭頸部癌腫瘍、膵癌腫瘍、結腸直腸癌腫瘍、メラノーマ腫瘍、リンパ腫腫瘍である。一態様において、腫瘍は、ＣＴ２６マウス同系ＣＲＣ腫瘍、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ腫瘍、ＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫腫瘍、又はＬＬ２（ルイス肺）腫瘍である。一部の態様において、ＣＤ７３結合分子、例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、腫瘍成長を有意に阻害することができ、ここで腫瘍は、抗ＰＤ−１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ２及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体による療法に不応性である。一部の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇのＰＤ１の濃度で投与したとき腫瘍成長を有意に阻害することができる。
一部の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、細胞との結合後にインターナライズされることができる。一部の態様において、ＣＤ７３結合分子は抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
Ｖ．抗ＣＤ７３抗体及び抗原結合断片の調製
モノクローナル抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）及びその抗原結合断片は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記載されるものなどのハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法の使用では、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物を上記に記載したとおり免疫し、免疫抗原に特異的に結合し得る抗体のリンパ球による産生を誘発する。リンパ球はまた、インビトロで免疫することもできる。免疫後、リンパ球を単離し、例えばポリエチレングリコールを使用して好適な骨髄腫細胞株と融合することによりハイブリドーマ細胞を形成し、次にそこから未融合のリンパ球及び骨髄腫細胞を選択によって除くことができる。次に、免疫沈降、免疫ブロット法によるか、又はインビトロ結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定するとき選択の抗原を特異的に対象とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準方法を用いたインビトロ培養か（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、或いは動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。次に、上記にポリクローナル抗体について説明されるとおり、モノクローナル抗体を培養培地又は腹水から精製することができる。
或いは、抗ＣＤ７３モノクローナル抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）及びその抗原結合断片はまた、例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載されるとおり組換えＤＮＡ方法を用いて作製することもできる。成熟Ｂ細胞又はハイブリドーマ細胞から、その抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによるなどして、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、従来の手順を用いてその配列を決定する。次に、重鎖及び軽鎖をコードする単離ポリヌクレオチドを好適な発現ベクターにクローニングし、本来免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にその発現ベクターをトランスフェクトすると、宿主細胞によってモノクローナル抗体が生成される。また、記載されるとおり、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリから、所望の種の組換え抗ＣＤ７３モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を単離することもできる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７）。
抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡ技術を用いた何らかの種々の方法で更に修飾することができ、それにより代替的な抗体を作成し得る。一部の態様では、例えばマウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインが、（１）例えばヒト抗体のそれらの領域に置換されてキメラ抗体が作成されるか、又は（２）非免疫グロブリンポリペプチドに置換されて融合抗体が作成され得る。一部の態様では、定常領域がトランケートされるか、又は除去されて、モノクローナル抗体の所望の抗体断片が作成される。可変領域の部位特異的又は高密度突然変異誘発を用いてモノクローナル抗体の特異性、親和性等を最適化することができる。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片はヒト抗体又はその抗原結合断片である。ヒト抗体は、当該技術分野において公知の様々な技法を用いて直接調製することができる。インビトロで免疫されるか、又は標的抗原に対する抗体を産生する免疫された個体から単離された固定化ヒトＢリンパ球を作成することができる（例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５；及び米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照）。
また、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９−３１４、Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：６１５７−６１６２、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１、及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１に記載されるとおり、抗ＣＤ７３ヒト抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片はファージライブラリから選択することもでき、ここで、そのファージライブラリはヒト抗体を発現する）。抗体ファージライブラリを作成及び使用する技術は、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、同第６，１７２，１９７号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明細書；同第６，５９３，０８１号明細書；同第６，３００，０６４号明細書；同第６，６５３，０６８号明細書；同第６，７０６，４８４号明細書；及び同第７，２６４，９６３号明細書；及びＲｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００７．１２．０１８（これらの各々は、全体として参照により援用される）にも記載されている。
親和性成熟戦略及びチェインシャッフリング戦略（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３、全体として参照により援用される）が当該技術分野において公知であり、高親和性ヒト抗体又はその抗原結合断片の作成に用いることができる。
一部の態様において、抗ＣＤ７３モノクローナル抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）はヒト化抗体であってもよい。非ヒト又はヒト抗体の改変、ヒト化又はリサーフェシング方法も用いることができ、当該技術分野において周知である。ヒト化抗体、リサーフェシング抗体、又は同様の改変抗体は、非ヒト、例えば、限定はされないが、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類又は他の哺乳動物である供給源由来の１つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称される残基によって置き換えられ、インポート残基は、典型的には既知のヒト配列の「インポート」可変、定常又は他のドメインから取られる。かかるインポートされた配列を用いて、免疫原性を低減し、又は結合性、親和性、ｏｎ速度、ｏｆｆ速度、アビディティ、特異性、半減期、若しくは当該技術分野において公知のとおりの任意の他の好適な特性を低減し、増強し、若しくは変更することができる。一般に、ＣＤ７３結合への影響としては、ＣＤＲ残基が直接的且つ最も実質的に関与する。従って、非ヒト又はヒトＣＤＲ配列の一部又は全てを維持する一方で、可変領域及び定常領域の非ヒト配列はヒト又は他のアミノ酸に置き換えることができる。
抗体はまた、任意選択で、ＣＤ７３抗原に対する高親和性及び他の有利な生物学的特性を保持しつつ改変されたヒト化抗体、リサーフェシング抗体、改変抗体又はヒト抗体であってもよい。この目標を達成するため、任意選択で、ヒト化（又はヒト）又は改変抗ＣＤ７３抗体及びリサーフェシング抗体を、親配列、改変配列、及びヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列及び様々な概念的ヒト化産物及び改変産物の分析プロセスによって調製することができる。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者は熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の推定上の三次元立体構造を図解及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の見込まれる役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがＣＤ７３などのその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、コンセンサス配列及びインポート配列からフレームワーク（ＦＷ）残基を選択して組み合わせることにより、標的抗原に対する親和性の増加など、所望の抗体特性を実現することができる。
抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片のヒト化、リサーフェシング又は改変は、限定はされないが、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８））、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３（１９９３）、米国特許第５，６３９，６４１号明細書、同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，９７６，８６２号明細書；同第５，８２４，５１４号明細書；同第５，８１７，４８３号明細書；同第５，８１４，４７６号明細書；同第５，７６３，１９２号明細書；同第５，７２３，３２３号明細書；同第５，７６６，８８６号明細書；同第５，７１４，３５２号明細書；同第５，９，５５，３５８号明細書；同第６，２０４，０２３号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；同第６，３３１，４３１号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第４，８１６，５６７号明細書；同第５，９６９，１０８号明細書；同第７，６３５，６６６号明細書；同第７，７２３，２７０号明細書；同第７，５５７，１８９号明細書；同第７，５３８，１９５号明細書；及び同第７，３４２，１１０号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願第９８／１６２８０号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願９１／０５９３９号明細書；ＰＣＴ／米国特許出願９４／０１２３４号明細書；ＰＣＴ／英国特許出願９２／０１７５５号明細書；国際公開第９０／１４４４３号パンフレット；国際公開第９０／１４４２４号パンフレット；国際公開第９０／１４４３０号パンフレット；及び欧州特許第２２９２４６号明細書（これらの各々は、そこに引用される文献を含め、全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるものなど、任意の公知の方法を用いて実施することができる。
抗ＣＤ７３ヒト化抗体及びその抗原結合断片はまた、免疫時に内因性免疫グロブリンを産生することなくヒト抗体の完全レパートリーを産生する能力を有するヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいても作製することができる。この手法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；及び同第５，６６１，０１６号明細書に記載されている。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体断片（例えば、クローン１０．３抗体由来又はクローン２Ｃ５抗体由来の断片）が提供される。抗体断片の作製については、様々な技法が公知である。従来、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解による消化によって得られている（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７；Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１）。特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体断片は組換えで作製される。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は、いずれも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は他の宿主細胞で発現させて、そこから分泌させることができ、このようにしてこれらの断片を大量に作製することが可能である。かかる抗ＣＤ７３抗体断片はまた、上記で考察した抗体ファージライブラリから単離することもできる。抗ＣＤ７３抗体断片はまた、米国特許第５，６４１，８７０号明細書に記載されるとおりの線状抗体であってもよい。抗体断片の他の作製技法、例えば化学合成が、当業者には明らかであろう。
本開示によれば、ＣＤ７３に特異的な一本鎖抗体の作製技法を適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照）。加えて、ＣＤ７３に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片、又はその誘導体、断片、類似体若しくは相同体の迅速且つ有効な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリの構築方法を適合させることができる（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）を参照）。抗体断片は、限定はされないが：（ａ）抗体分子のペプシン消化によって作製されるＦ（ａｂ’）２断片；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋の還元によって生成されるＦａｂ断片、（ｃ）抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片、及び（ｄ）Ｆｖ断片を含め、当該技術分野における技法によって作製することができる。
本明細書に開示される抗ＣＤ７３３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、その血清半減期が増加するように修飾することができる。これは、例えば、抗体又は抗体断片の適切な領域の突然変異によって抗体又は抗体断片にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことによるか、又は後に抗体又は抗体断片にいずれかの末端若しくは中央で（例えば、ＤＮＡ又はペプチド合成によって）融合するペプチドタグにそのエピトープを組み込むことによるか、又はＹＴＥ突然変異によって達成し得る。抗体又はその抗原結合断片の血清半減期を増加させる他の方法、例えば、ＰＥＧなどの異種分子とのコンジュゲーションが、当該技術分野において公知である。
ヘテロコンジュゲート抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）及びその抗原結合断片も本開示の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合的につながった抗体で構成される。かかる抗体は、例えば、免疫細胞を望ましくない細胞に標的化させることが提案されている（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号明細書を参照）。ヘテロコンジュゲート抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）及びその抗原結合断片は、架橋剤が関わる方法を含めた、合成タンパク質化学における公知の方法を用いてインビトロで調製し得ることが企図される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いるか、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築することができる。この目的に好適な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
特定の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子、例えば、抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、他の治療剤と組み合わせることができ（例えば併用療法で）、又は少なくとも１つの異種部分と融合（例えば、遺伝子融合、それにより融合タンパク質を形成する）又はコンジュゲート（例えば、化学的又は酵素的にコンジュゲート）することができる。従って、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子を他の治療剤又は毒素と融合又はコンジュゲートして、イムノコンジュゲート及び／又は融合タンパク質を形成することができる。本開示はまた、別の分子（例えば、ペプチド、薬物小分子、検出可能分子等）に（例えば化学的に又は組換えで）誘導体化又は連結されている本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子の少なくとも１つを含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）も提供する。一般に、抗ＣＤ７３抗体又はその一部分は、誘導体化又は標識によってそのＣＤ７３結合性が悪影響を受けることのないように誘導体化される。従って、本開示の抗ＣＤ７３抗体及び抗体部分は、本明細書に記載される抗ＣＤ７３結合分子のインタクトな形態及び修飾形態の両方を含むことが意図される。例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子又はそのＣｄ７３結合部分は、１つ以上の他の分子実体、例えば、細胞傷害剤、医薬品、検出剤、及び／又は抗ＣＤ７３結合分子と別の分子（ストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介し得るタンパク質若しくはペプチドに（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合などによって）機能的に連結させることができる。
ある種の誘導体化分子は、２つ以上の分子実体、例えば、本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子と治療剤（例えば、ツブリシンなどの細胞毒又はＭＥＤＩ １５０８）を架橋結合することによって作製し得る。好適な架橋剤としては、ヘテロ二官能性のもの、即ち、適切なスペーサーによって分離された２つの個別的な反応性の基を有するもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）；又はホモ二官能性のもの（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）が挙げられる。かかる架橋剤は、例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩから入手可能である。更なる二官能性カップリング剤としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬなど）、活性エステル類（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トリレン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）が挙げられる。
別種の誘導体化分子は、検出可能標識を導入することによって作製し得る。有用な検出剤としては、蛍光化合物（例えば、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニド蛍光体など）、検出に有用な酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなど）、二次レポーターによって認識されるエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）が挙げられる。一部の態様において、検出可能標識には少なくとも１つのスペーサーアームが付加され得る。スペーサーアームは、潜在的な立体障害を低減するように様々な長さであり得る。
本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子はまた、放射性標識アミノ酸で標識することもできる。放射性標識は、診断目的及び治療目的の両方に使用することができる。例えば、放射性標識を使用して、Ｘ線又はその他、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）などの診断技術によりＣＤ７３発現細胞を検出することができる。
更に、放射性標識は、望ましくない免疫応答を引き起こすものなど、ＣＤ７３発現細胞に対する毒素として治療的に使用することができる。ポリペプチドの標識の例としては、限定はされないが、以下の放射性同位体又は放射性核種：３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ及び１３１Ｉが挙げられる。一部の態様において、抗ＣＤ７３結合分子は、イメージング時に検出可能な常磁性、放射性、又は蛍光発生イオンで標識することができる。一部の態様において、常磁性イオンは、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）又はエルビウム（ＩＩＩ）である。他の態様において、放射性イオンは、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９、インジウム−１１１、レニウム−１８８、レニウム−１８６、銅−６７、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、アスタチン−２１１、及びガリウム−６７である。他の態様において、抗Ｃｄ７３結合分子は、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、及びビスマス（ＩＩＩ）などのＸ線造影剤で標識される。本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子はまた、化学基、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、メチル基、エチル基、又は炭水化物基で誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特性の向上、例えば血清半減期の増加又は組織結合性の増加に有用である。
用語「細胞傷害剤」は、本明細書で使用されるとき、広義に定義され、細胞の機能を阻害し又は妨げる物質及び／又は細胞の破壊（細胞死）を引き起こす物質、及び／又は抗新生物／抗増殖効果を発揮する物質を指す。例えば、細胞傷害剤は、新生物腫瘍細胞の発生、成熟、又は伝播を直接又は間接的に妨げることができる。この用語にはまた、単なる細胞傷害効果でなく、細胞増殖抑制効果のみを生じさせるような薬剤も含まれる。この用語には、以下に特定するとおりの化学療法剤、並びに他のＣＤ７３アンタゴニスト、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害薬、プロテインキナーゼＡ阻害薬、サイトカインファミリーメンバー、放射性同位元素、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素が含まれる。
用語「化学療法剤」は、天然又は合成の化学的化合物を含む用語「細胞傷害剤」の一部である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン化合物、スルホン酸アルキル及びアルキル化作用を有する他の化合物、例えば、ニトロソウレア類、シスプラチン及びダカルバジン；代謝拮抗薬、例えば、葉酸、プリン又はピリミジン拮抗薬；有糸分裂阻害薬、例えば、ビンカアルカロイド類及びポドフィロトキシンの誘導体；細胞傷害性抗生物質及びカンプトテシン誘導体が挙げられる。他の化学療法剤は、アミホスチン（ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））、ドキソルビシンリポ（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ゲフィチニブ（イレッサ（ＩＲＥＳＳＡ）（登録商標））、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンα、インターフェロンβ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、アロマターゼ阻害薬、及びこれらの組み合わせである。
本開示の目的上、修飾抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、抗体又はポリペプチドとＣＤ７３との会合を提供する任意のタイプの可変領域を含み得ることが理解されなければならない。この点で、可変領域は、所望の腫瘍関連抗原に対して体液性応答を開始して免疫グロブリンを生成するように誘導することのできる任意のタイプの哺乳動物を含み得るか、又はそれに由来し得る。従って、修飾抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカク等）又はルピナス起源のものであり得る。一部の態様では、修飾抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片の可変領域及び定常領域の両方がヒトである。他の態様では、適合抗体（通常非ヒト供給源に由来する）の可変領域が、分子の結合特性が向上し又は免疫原性が低下するように改変され又は特異的に調整される。この点で、可変領域はヒト化されるか、又は他に移入アミノ酸配列を含めることによって変更されてもよい。
特定の態様では、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片の重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインが、１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換、及び必要であれば、部分的フレームワーク領域置換及び配列変化によって変更される。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス又は更にはサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲが異なるクラスの抗体、特定の態様では異なる種の抗体に由来することが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すために、全てのＣＤＲをドナー可変領域の完全なＣＤＲに置き換える必要はない。むしろ、抗原結合部位の活性の維持に必要な残基を移しさえすれば十分である。米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書に記載される説明を所与とすれば、免疫原性が低下した機能性抗体を得ることは、ルーチンの実験を実施することによるか、或いは手探り試験によって、十分に当業者の能力の範囲内にある。
可変領域の変更にも関わらず、当業者は、修飾抗ＣＤ７３抗体（例えば、修飾クローン１０．３抗体又は修飾クローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片に、定常領域ドメインの１つ以上の少なくとも一部が欠失しているか、又は他に変更されている抗体（例えば、完全長抗体又はその免疫応答性断片）が含まれてもよく、天然の又は変更されていない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較したときに腫瘍局在の増加又は血清半減期の低下などの所望の生化学的特性がもたらされるようにし得ることを理解するであろう。一部の態様において、修飾抗体の定常領域はヒト定常領域を含み得る。本明細書に開示されるこの抗ＣＤ７３分子と適合性がある定常領域の修飾は、１つ以上のドメインにおける１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換を含む。即ち、本明細書に開示される修飾抗体は、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）のうちの１つ以上及び／又は軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に対する変更又は修飾を含み得る。一部の態様では、１つ以上のドメインが部分的又は完全に欠失している修飾定常領域が企図される。一部の態様において、修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が取り除かれたドメイン欠失コンストラクト又は変異体（ΔＣＨ２コンストラクト）を含み得る。一部の態様において、削除された定常領域ドメインは、典型的には欠けている定常領域によって付与される分子可動性の一部を提供する短いアミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）に置き換えられ得る。
その構成に加えて、当該技術分野では、定常領域が幾つかのエフェクター機能を媒介することが知られている。例えば、補体のＣ１成分が抗体に結合すると、補体系が活性化される。補体の活性化は細胞病原体のオプソニン化及び溶解に重要である。補体の活性化はまた炎症反応も刺激し、また、自己免疫性の過敏にも関与し得る。更に、抗体はＦｃ領域を介して細胞に結合し、ここでは抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）を含め、異なる抗体クラスに特異的なＦｃ受容体が幾つもある。抗体が細胞表面上のＦｃ受容体に結合すると、抗体被覆粒子の貪食及び破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、又はＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過及び免疫グロブリン産生の制御を含めた幾つもの重要且つ多様な生物学的反応が惹起される。
特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、変更されたエフェクター機能を提供し、従って投与される抗体又はその抗原結合断片の生物学的プロファイルが影響を受ける。例えば、定常領域ドメインを（点突然変異又は他の手段によって）欠失又は不活性化させると、循環中の修飾抗体のＦｃ受容体結合が低下し、それにより腫瘍局在が増加し得る。他の場合、定常領域を修飾すると、本開示と一致して、補体結合が調節され、従ってコンジュゲートした細胞毒の血清半減期及び非特異的な会合が低下し得る。定常領域の更に他の修飾を用いると、抗原特異性又は抗体可動性の増加による局在化の増進を可能にするジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を除去することができる。同様に、本開示における定常領域に対する修飾は、十分に当業者の範囲内にある周知の生化学的又は分子工学的技法を用いて容易に作製することができる。
特定の態様において、抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片である本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子は、１つ以上のエフェクター機能を有しない。例えば、一部の態様において、抗体又はその抗原結合断片は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有しない。特定の態様において、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片はＦｃ受容体及び／又は補体因子に結合しない。特定の態様において、抗体又はその抗原結合断片はエフェクター機能を有しない。
特定の態様において、抗ＣＤ７３修飾抗体又はその抗原結合断片は、それぞれの修飾抗体又はその断片のＣＨ３ドメインがヒンジ領域に直接融合するように改変し得ることが注記されるであろう。他のコンストラクトでは、ヒンジ領域と修飾ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとの間にペプチドスペーサーを提供することが望ましい場合もある。例えば、適合性コンストラクトを発現させることができ、ここではＣＨ２ドメインが欠失しており、且つ残りのＣＨ３ドメイン（修飾又は非修飾）が５〜２０アミノ酸のスペーサーでヒンジ領域に結合している。かかるスペーサーを加えると、例えば、定常ドメインの調節エレメントが空いて利用可能なままであること、又はヒンジ領域が可動なままであることが確実になり得る。しかしながら、ある場合には、アミノ酸スペーサーが免疫原性で、且つコンストラクトに対する望ましくない免疫応答を誘導することが判明し得ることに留意しなければならない。従って、特定の態様では、修飾抗体の所望の生化学的品質を維持するため、コンストラクトに加えられる任意のスペーサーは比較的免疫原性が低いか、又は更には完全に省かれてもよい。
定常領域ドメイン全体の欠失に加えて、本開示の抗ＣＤ７３抗体及びその抗原結合断片は、数個の、又は更には単一のアミノ酸の部分的欠失又は置換によって提供され得ることが理解されるであろう。例えば、ＣＨ２ドメインの選択範囲における単一アミノ酸の突然変異が、Ｆｃ結合を実質的に低下させて、それにより腫瘍局在を増加させるには十分であり得る。同様に、調節しようとするエフェクター機能（例えば、補体Ｃ１Ｑ結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部を単純に欠失させることが望ましい場合もある。定常領域のかかる部分欠失により、その定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能はインタクトなまま残しておきながら、抗体又はその抗原結合断片の選択された特性（例えば、血清半減期）を向上させることができる。更に、上記で示唆したとおり、開示される抗ＣＤ７３抗体及びその抗原結合断片の定常領域は、得られるコンストラクトのプロファイルを強化する１つ以上のアミノ酸の突然変異又は置換によって修飾することができる。この点で、修飾抗体又はその抗原結合断片の構成及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位によって提供される活性（例えば、Ｆｃ結合）を破壊することが可能である。特定の態様は、エフェクター機能の低下若しくは増加などの望ましい特性を増強し、又はより多くの細胞毒又は炭水化物結合を提供するため、定常領域に対する１つ以上のアミノ酸の付加を含み得る。かかる態様では、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合もある。
本開示はまた、本明細書に示されるキメラ、ヒト化及びヒト抗ＣＤ７３抗体、又はその抗原結合断片と実質的に相同な変異体及び均等物も提供する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、即ち１つ以上のアミノ酸の、同様のアミノ酸による置換を含み得る。例えば、保存的置換は、アミノ酸を同じ一般クラス内の別のアミノ酸で置換すること、例えば、ある酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で置換すること、ある塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で置換すること、又はある中性アミノ酸を別の中性アミノ酸によって置換することを指す。保存的アミノ酸置換によって意味されるものは、当該技術分野において周知である。
抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片は、通常はそのタンパク質の一部でない追加的な化学的部分を含むように更に修飾することができる。それらの誘導体化部分は、タンパク質の溶解度、生物学的半減期又は吸収を向上させることができる。これらの部分はまた、タンパク質の任意の望ましい副作用などを低減し又は消失させることもできる。それらの部分についての概要は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２０００）を参照することができる。
ＶＩ．ＣＤ７３結合分子をコードするポリヌクレオチド
特定の態様において、本開示は、ＣＤ７３に特異的に結合するポリペプチド又はその抗原結合断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含する。例えば、本開示は、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）をコードするか、又はかかる抗体の抗原結合断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本開示のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であっても、又はＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが含まれ；且つ二本鎖又は一本鎖であってもよく、及び一本鎖の場合、コード鎖又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは単離されている。特定の態様において、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。特定の態様において、ポリヌクレオチドは、例えば宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を助けるポリヌクレオチド（例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同じリーディングフレーム内で融合した成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、成熟形態のポリペプチドを形成するため宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有することができる。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質＋追加的な５’アミノ酸残基であるＣＤ７３結合プロタンパク質もコードすることができる。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、例えばコードされたポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じリーディングフレーム内で融合した成熟ＣＤ７３結合ポリペプチド、例えば抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片のコード配列を含む。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合にｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであってもよく、それによりマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製が提供され、又はマーカー配列は、哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）を使用するときは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグであってもよい。
本開示はまた、例えば、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）のＣＤ７３結合断片、類似体、及び誘導体をコードする記載のポリヌクレオチドの変異体も提供する。
ポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、又は両方に変更を含み得る。一部の態様において、ポリヌクレオチド変異体は、サイレント置換、付加、又は欠失を生じるものの、コードされるポリペプチドの特性又は活性は変えない変更を含む。一部の態様において、ヌクレオチド変異体は、遺伝子コードの縮重に起因するサイレント置換によって作製される。ポリヌクレオチド変異体は、種々の理由で、例えば、特定の宿主用にコドン発現を最適化するため（ヒトｍＲＮＡのコドンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌宿主が選好するものに変化させるため）作製され得る。本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。
一部の態様において、ＣＤ７３結合分子、例えば抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成機を使用した化学合成によって構築することができる。かかるオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列、及び目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において有利なコドンの選択に基づき設計することができる。標準方法を適用して、目的の単離ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を使用して逆翻訳遺伝子を構築することができる。更に、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部分をコードする幾つかの小さいオリゴヌクレオチドを合成し、次にライゲートすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には相補的アセンブリのための５’又は３’オーバーハングを含有する。
アセンブル後（合成、部位特異的突然変異誘発又は別の方法による）、目的とする特定の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現ベクターに挿入され、所望の宿主におけるそのタンパク質の発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結される。適切なアセンブリは、ヌクレオチドシーケンシング、制限マッピング、及び好適な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。当該技術分野において周知のとおり、宿主におけるトランスフェクトした遺伝子の高い発現レベルを達成するためには、その遺伝子を、選択の発現宿主で機能する転写及び翻訳発現制御配列に作動可能に連結しなければならない。
特定の態様では、組換え発現ベクターを使用して、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡを増幅し、発現させる。組換え発現ベクターは、哺乳類、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子に由来する好適な転写又は翻訳調節エレメントに作動可能に連結された、抗ＣＤ７３抗体及び／又はその抗原結合断片のポリペプチド鎖をコードする合成又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する複製可能なＤＮＡコンストラクトである。
転写単位は、概して、以下に更に詳細に記載するとおり、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する１つ又は複数の遺伝エレメント、例えば転写プロモーター又はエンハンサーと、（２）ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される構造又はコード配列と、（３）適切な転写及び翻訳開始及び終結配列との集合を含む。かかる調節エレメントは、転写を制御するためオペレーター配列を含み得る。一般に複製起点によって付与される宿主における複製能、及び形質転換体の認識を促進する選択遺伝子が、更に組み込まれ得る。ＤＮＡ領域は、それらが機能上互いに関係しているとき、作動可能に連結している。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーターは、それが配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を可能にするような位置にある場合、コード配列に作動可能に連結している。酵母発現系での使用が意図される構造エレメントは、宿主細胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。或いは、組換えタンパク質がリーダー配列又は輸送配列なしに発現する場合、それはＮ末端メチオニン残基を含み得る。この残基は、任意選択で、後に発現した組換えタンパク質から切断されて、最終産物を提供し得る。
発現制御配列及び発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存することになる。幅広い種類の発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、ｐＣＲ １、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体を含めた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミドなどの公知の細菌プラスミド、Ｍ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージなどのより広い宿主域のプラスミドが挙げられる。
ＣＤ７３結合分子、例えば抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片の発現に好適な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母、昆虫又は高等真核生物細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌が含まれる。高等真核生物細胞には、以下に記載するとおりの哺乳類起源の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も用いることができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳類細胞宿主での使用に適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）（この関連する開示は本明細書によって参照により援用される）によって記載されている。抗体作製を含めたタンパク質作製方法に関する更なる情報については、例えば、米国特許出願公開第２００８／０１８７９５４号明細書、米国特許第６，４１３，７４６号明細書、同第６，６６０，５０１号明細書、及び同第７，９３２，０８７号明細書（これらの各々は本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。
種々の哺乳類又は昆虫細胞培養系も、組換えＣＤ７３結合分子、例えば抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片の発現に有利に用いることができる。哺乳類細胞における組換えタンパク質の発現を実施してもよく、なぜならかかるタンパク質は概して正しく折り畳まれ、適切に修飾され、且つ完全に機能性であるためである。
好適な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＨＥＫ−２９３及びＨＥＫ−２９３Ｔ、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ ２３：１７５，１９８１）によって記載されるサル腎細胞のＣＯＳ−７株、及び他の細胞株、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳類発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させる遺伝子に連結した好適なプロモーター及びエンハンサー、及び他の５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば、必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与・受容部位、及び転写終結配列などを含み得る。昆虫細胞における異種タンパク質産生用のバキュロウイルス系が、Ｌｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）によってレビューされている。
形質転換宿主によって産生されるＣＤ７３結合分子、例えば抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、任意の好適な方法によって精製することができる。かかる標準方法には、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心、溶解度差、又は任意の他の標準的なタンパク質精製技法によるものが含まれる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティータグをタンパク質に付加すると、適切なアフィニティーカラムに通過させることによる容易な精製が可能となり得る。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴及びＸ線結晶学などの技法を用いて物理的に特徴付けることもできる。
例えば、組換えタンパク質を培養培地中に分泌する系からの上清を、初めに市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばＡｍｉｃｏｎ（登録商標）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）限外ろ過ユニットを使用して濃縮し得る。この濃縮ステップの後、濃縮物を好適な精製マトリックスに適用し得る。或いは、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製において一般的に用いられる他のタイプであってもよい。或いは、陽イオン交換ステップが用いられてもよい。好適な陽イオン交換体としては、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが挙げられる。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１つ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）ステップを用いて、ＣＤ７３結合分子（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を更に精製することができる。均一な組換えタンパク質を提供するため、前述の精製ステップの一部又は全てを様々に組み合わせて用いることもできる。
細菌培養で産生された組換えＣＤ７３結合タンパク質、例えば抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、例えば、細胞ペレットからの初期抽出と、続く１つ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。最終精製ステップには、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。組換えタンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル処理、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含めた、任意の好都合な方法によって破壊することができる。
抗体及び他のタンパク質を精製するための当該技術分野において公知の方法としてはまた、例えば、米国特許出願公開第２００８／０３１２４２５号明細書、同第２００８／０１７７０４８号明細書、及び同第２００９／０１８７００５号明細書（これらの各々は、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるものも挙げられる。
特定の態様では、ＣＤ７３結合分子は、抗体でないポリペプチドである。タンパク質標的に高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを同定及び作製する種々の方法が当該技術分野において公知である。例えば、Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．．１８：２９５−３０４（２００７）、Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５：１４−２７（２００６）、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：６５３−６５８（２００６）、Ｎｙｇｒｅｎ，ＦＥＢＳ Ｊ．，２７５：２６６８−７６（２００８）、及びＳｋｅｒｒａ，ＦＥＢＳ Ｊ．，２７５：２６７７−８３（２００８）（これらの各々は、全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。特定の態様では、ファージディスプレイ技術を用いてＣＤ７３結合ポリペプチドを同定／作製することができる。特定の態様では、ポリペプチドは、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン（例えば、テネイシン−３ Ｆｎ ＩＩＩドメインなどのフィブロネクチンドメイン）、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、及びチオレドキシンからなる群から選択されるタイプのタンパク質スキャフォールドを含む。
ＶＩ．治療用抗ＣＤ７３抗体を用いた治療方法
本開示は、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、例えばその抗原結合断片、変異体、及び誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を使用することにより、ＣＤ７３発現又はＣＤ７３発現細胞に関連する疾患、例えば癌を有する患者を治療することに関する方法を提供する。一部の具体的な態様において、かかる癌は、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵癌、腎癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、肺・結腸癌（ｌｕｎｇｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、及びリンパ腫である。
「ＣＤ７３発現細胞」とは、ＣＤ７３を発現する細胞を意味する。ＣＤ７３は、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカリングを介する膜結合型であってもよく、また可溶性タンパク質として存在してもよい。細胞及び他の好適な試料中のＣＤ７３発現を検出する方法は当該技術分野において周知されており、限定はされないが、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。
以下の考察では、本開示のＣＤ７３結合分子（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）による様々な疾患及び障害の診断方法及び治療を参照するが、本明細書に記載される方法はまた、任意の他の抗ＣＤ７３抗体、及び本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体の所望の特性を保持している、例えば、ＣＤ７３に特異的に結合してその５’−ヌクレオチダーゼ活性を中和する能力を有するこれらの抗ＣＤ７３抗体の抗原結合断片、変異体、及び誘導体（例えば、融合タンパク質又はコンジュゲート）にも適用可能である。一部の態様において、ＣＤ７３結合分子は、ヒトＡＤＣＣを媒介しないヒト又はヒト化抗体であるか、又はＡＤＣＣを媒介しないように改変された抗ＣＤ７３抗体である。
一部の態様において、ＣＤ７３結合分子は、ＣＤ７３００１０抗体又はその抗原結合断片、クローン１０．３抗体又はその抗原結合断片、ＣＤ７３０００２抗体又はその抗原結合断片、クローン２Ｃ５抗体又はその抗原結合断片、又はＣＤ７３００４抗体又はその抗原結合断片である。他の態様において、ＣＤ７３結合分子はクローン１０．３突然変異抗体である。一部の態様において、ＣＤ７３結合分子はクローン１０．３モノクローナル抗体である。一部の態様において、ＣＤ７３結合分子は、血清半減期が延長するように改変されたクローン１０．３モノクローナル抗体である。他の態様において、ＣＤ７３結合分子はクローン１０．３ ＹＴＥ突然変異抗体である。他の態様において、ＣＤ７３結合分子はクローン２Ｃ５突然変異抗体である。一部の態様において、ＣＤ７３結合分子はクローン２Ｃ５モノクローナル抗体である。一部の態様において、ＣＤ７３結合分子は、血清半減期が延長するように改変されたクローン２Ｃ５モノクローナル抗体である。他の態様において、ＣＤ７３結合分子はクローン２Ｃ５ ＹＴＥ突然変異抗体である。
一態様において、治療は、対象又は患者への本開示の抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の適用又は投与、又は対象又は患者由来の単離組織又は細胞株への抗ＣＤ７３結合分子の適用又は投与を含み、ここで対象又は患者は、疾患、疾患の症状、又は疾患に対する素因を有する。別の態様において、治療はまた、疾患、疾患の症状、又は疾患に対する素因を有する対象又は患者に対する本開示の抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体を含む医薬組成物の適用又は投与、又は対象又は患者由来の単離組織又は細胞株に対する抗ＣＤ７３結合分子を含む医薬組成物の適用又は投与を含むことも意図される。
本開示の抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体は、様々な癌の治療に有用である。一態様において、本開示は、医薬として使用するための、詳細には、癌（例えば、結腸癌、メラノーマ、乳癌、リンパ腫、又は非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びバーキットリンパ腫、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、及び膵癌）の治療又は予防において使用するための抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体を提供する。一部の態様において、癌は前転移性表現型を示す。一部の態様において、前転移性表現型を示す癌は、メラノーマ又は乳癌である。一部の態様において、癌は転移性癌である。一部の態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子は、適応抗腫瘍活性を惹起し、及び／又は転移を阻害することができる。一部の詳細な態様において、本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子は乳癌における転移を阻害することができる。
本開示の方法では、本明細書の他の部分で定義するとおりの少なくとも１つの抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体を使用して、癌に対する好ましい治療応答が促進される。癌治療に対する「好ましい治療応答」という用語は、これらの抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の活性に関連した疾患の改善、及び／又は疾患に関連する症状の改善を指す。従って、例えば、疾患の改善は、完全寛解として特徴付けることができる。「完全寛解」は、任意の過去の試験結果を標準化して臨床的に検出可能な疾患がないことが意図される。或いは、疾患の改善は、部分寛解として分類することができる。「好ましい治療応答」は、本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子の投与によって得られる癌の進行及び／又は持続時間の低減又は阻害、癌の重症度の低減又は改善、及び／又はその１つ以上の症状の改善を包含する。
具体的な態様において、かかる用語は、本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子の投与後の１、２又は３つ又はそれを超える結果を指す：（１）癌細胞集団の安定化、減少又は消失；（２）癌成長の安定化又は減少；（３）癌の形成障害；（４）原発性、局所的及び／又は転移性癌の根絶、除去、又は制御；（５）死亡率の低下；（６）無病、無再発、無進行、及び／又は全生存期間又は比率の増加；（７）奏効率、応答の持続性、又は応答性又は寛解期の患者の数の増加；（８）入院率の低下、（９）入院期間の低下、（１０）癌のサイズが保たれ、増加しないか、又はその増加が１０％未満、好ましくは５％未満、好ましくは４％未満、好ましくは２％未満である、及び（１２）寛解期の患者の数の増加。
臨床応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、フローサイトメトリー又は蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、組織学、肉眼的病理学、及び血液化学、例えば、限定はされないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、クロマトグラフィーなどによって検出可能な変化など、スクリーニング技術を用いて評価することができる。これらの好ましい治療応答に加えて、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体による療法を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善において有益な効果を得ることができる。
本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体は、任意の既知の癌療法、例えば、癌、例えば、結腸癌、メラノーマ、乳癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びバーキットリンパ腫、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、及び膵癌）の治療に有用であることが分かっているか又はそれに対して使用されてきた若しくは現在使用中である任意の薬剤又は薬剤の組み合わせと併用することができる。医薬品併用製剤又は投与レジメンの第２の薬剤又は薬剤の組み合わせは、好ましくは本開示の抗体又はポリペプチドに対して互いに悪影響を与え合うことのないように補完的な活性を有する。
抗癌剤には、癌性増殖などの悪性病変の治療に使用される薬物が含まれる。薬物療法は、単独で、又は手術若しくは放射線療法などの他の治療と併用して使用することができる。癌治療では、病変のある臓器の性質に応じて幾つかの薬物クラスが用いられ得る。例えば、乳癌は一般にエストロゲンによって刺激され、性ホルモンを不活性化する薬物で治療することができる。同様に、前立腺癌は男性ホルモンのアンドロゲンを不活性化する薬物で治療することができる。本開示の特定の方法で使用される抗癌剤としては、特に、抗体（例えば、ＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体、ＥＧＦＲに結合する抗体、Ｈｅｒ２に結合する抗体、又はｃＭＥＴに結合する抗体）、ＩＧＦ１Ｒを標的化する小分子、ＥＧＦＲを標的化する小分子、Ｈｅｒ２を標的化する小分子、代謝拮抗薬、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管標的化薬剤、キナーゼ阻害薬、タンパク質合成阻害薬、免疫療法剤、ホルモン療法、グルココルチコイド、アロマターゼ阻害薬、ｍＴＯＲ阻害薬、化学療法剤、プロテインキナーゼＢ阻害薬、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害薬、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害薬、ＲＬｒ９、ＣＤ２８９、酵素阻害薬、抗ＴＲＡＩＬ、ＭＥＫ阻害薬等が挙げられる。
具体的な態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子、例えば、抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片は、例えば、ＰＤ−１（プログラム死１タンパク質）、その２つのリガンドＰＤ−Ｌ１（プログラム死リガンド１）及び／又はＰＤ−Ｌ２、又はＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４タンパク質）を標的化する抗体又は抗体断片と併用して投与することができる。例えば、Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０７：１５４７−１５５２（２０１０）；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０（６）：（２０１０）；Ａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９：５６２６（２０１３）（これらは全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。一部の態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体はイピリムマブ又はその抗原結合断片である。他の態様において、抗ＣＴＬＡ−４抗体はトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）又はその抗原結合断片である。一部の態様において、抗ＰＤ−１抗体はペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、旧ランブロリズマブ、別名ＭＫ−３４７５）又はその抗原結合断片である。一部の態様において、抗ＰＤ−１抗体はニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＯＰＤＩＶＡ（登録商標））又はその抗原結合断片である。一部の態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＢＭＳ−９３６５５９又はその抗原結合断片である。他の態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＰＤＬ３２８０Ａである。他の態様において、抗ＰＤ−１抗体はＡＭＰ−２２４（抗ＰＤ−１ Ｆｃ融合タンパク質）又はその抗原結合断片である。様々な態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ４７３６又はその抗原結合断片である。
一部の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−１抗体と併用して投与することができる。様々な実施形態において、抗ＣＤ７３抗体は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、又は約２０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。一部の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体と併用して投与することができ、ここで抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１１ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ、約１３ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、約１７ｍｇ／ｋｇ、約１８ｍｇ／ｋｇ、約１９ｍｇ／ｋｇ、又は約２０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与される。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体と抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４とは約１：１、１：２、１：３又は１：４の比で投与される。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体と抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体とは約１：２の比で投与される。具体的な態様において、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）の濃度は約１０ｍｇ／ｋｇであり、抗ＰＤ−１抗体の濃度は約２０ｍｇ／ｋｇである。一部の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、抗ＰＤ−１抗体と併用して投与することができる。一部の態様において、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体と併用した本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子（例えば、ＭＥＤＩ９４４７、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を含む併用治療の投与は、未治療の対象又は単剤療法（例えば、抗ＣＤ７３抗体を伴わない抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体）で治療した対象と比較して生存を約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％増加させることができる。一部の態様において、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体と併用した本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を含む併用治療の投与は、未治療の対象又は単剤療法（例えば、抗ＣＤ７３抗体を伴わない抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体）で治療した対象と比較して生存を約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、又は約１０倍増加させる。
併用療法が、別の治療剤（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体）の投与と併用した抗ＣＤ７３結合分子の投与を含む場合、本明細書に開示される方法は、別個の製剤又は単一の医薬製剤、及びいずれかの順序の連続投与を用いた共投与を包含する。一部の態様において、本明細書に記載される抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は他の薬物と併用して投与され、ここで抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体と治療剤とは、いずれかの順序で逐次的に投与するか、又は同時に（即ち、同時に又は同じタイムフレーム内で）投与することができる。
併用療法は「相乗作用」を提供することができ、「相乗的」である、即ち、活性成分を併せて使用したときに達成される効果が、それらの化合物を個別に使用して得られる効果の総和より高いことが判明し得る。相乗効果は、活性成分が（１）共製剤化されて投与されるか、又は組み合わせた単位投薬量製剤で同時に送達されるとき；（２）別個の製剤として交互に又は並行して送達されるとき；又は（３）他の何らかのレジメンによるとき、達成され得る。交互投与療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が例えば別個のシリンジでの異なる注射によって逐次的に投与又は送達されるときに達成され得る。一般に、交互投与療法に際して、各活性成分の有効な投薬量は逐次的に、即ち連続的に投与され、一方併用療法では、２つ以上の活性成分の有効な投薬量は一緒に投与される。
他の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、チロシンキナーゼ阻害薬と併用して投与することができる。他の何らかの具体的な態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子は、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２／ｎｅｕに関連するチロシンキナーゼ活性の阻害薬、例えばラパチニブと併用して投与することができる。一部の態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子は、抗有糸分裂剤と併用して投与することができる。一部の具体的な態様において、本明細書に開示されるＣＤ７３結合分子は、紡錘体微小管集合を安定化させる薬剤、例えばパクリタキセル又はドセタキセルと併用して投与することができる。更なる態様は、臨床試験手順の一部としての組織中タンパク質レベルの診断的モニタリングに対する抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）の使用であり、それにより例えば、所与の治療レジメンの有効性が決定される。例えば、抗体を検出可能物質とカップリングすることにより、検出を促進し得る。
検出可能物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ；及び好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが挙げられる。
ＶＩＩＩ．抗ＣＤ７３抗体治療的併用及び共療法
本開示は、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、例えばその抗原結合断片、変異体、及び誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を含む治療的併用を用いて、癌（結腸癌、メラノーマ、乳癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、及び膵癌を含む）を有する患者を治療することに関する方法を提供する。
以下の考察では、本開示のＣＤ７３結合分子（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を特徴とする治療的併用を参照するが、本明細書に記載される方法はまた、任意の他の抗ＣＤ７３抗体、及び本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体の所望の特性を保持している、例えば、ＣＤ７３に特異的に結合してその５’−ヌクレオチダーゼ活性を中和する能力を有するこれらの抗ＣＤ７３抗体の抗原結合断片、変異体、及び誘導体（例えば、融合タンパク質又はコンジュゲート）にも適用可能である。一部の態様において、ＣＤ７３結合分子は、ヒトＡＤＣＣを媒介しないヒト又はヒト化抗体であるか、又はＡＤＣＣを媒介しないように改変された抗ＣＤ７３抗体である。
抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体、又はその抗原結合断片と併用した抗ＣＤ７３抗体、又はその抗原結合断片など、本発明の併用を用いた固形腫瘍患者の治療は、相加効果又は相乗効果をもたらし得る。本明細書で使用されるとき、用語「相乗的」とは、単剤療法の相加効果より有効性が高い療法の併用（例えば、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）と抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体との併用を指す。
療法の併用（例えば、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）と抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体との併用の相乗効果により、固形腫瘍患者に対して治療剤の１つ以上のより低い投薬量及び／又は前記治療剤のより少ない投与頻度を用いることが可能になる。治療剤のより低い投薬量を利用すること及び／又は前記療法をより少ない頻度で投与することが可能であるため、固形腫瘍の治療における前記療法の有効性は低下することなく、対象に対する前記療法の投与に伴う毒性が低下する。加えて、相乗効果によって、固形腫瘍の管理、治療、又は改善における治療剤の有効性が高まり得る。治療剤の併用の相乗効果は、いずれかの単剤療法の使用に伴う有害な又は望ましくない副作用を回避又は低減し得る。
共療法では、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体、又はその抗原結合断片との組み合わせは、任意選択で同じ医薬組成物に含めることができ、又は別個の医薬組成物に含めてもよい。この後者の例では、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体、又はその抗原結合断片を含む医薬組成物の投与の前、それと同時、又はその後の投与に好適である。場合によっては、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体とは別個の組成物で重なる時間に投与される。
抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４抗体、又はその抗原結合断片とは、患者になおも利益を提供しつつ、１回のみ又は低頻度で投与することができる。更なる態様において、患者は追加的なフォローオン用量を投与される。フォローオン用量は、患者の年齢、体重、臨床的評価、腫瘍量、及び／又は主治医の判断を含めた他の要因に応じて様々な時間間隔で投与され得る。
本明細書に提供される方法は、腫瘍成長を低減し、又は遅延させることができる。一部の態様において、この低下又は遅延は統計学的に有意であり得る。腫瘍成長の低下は、ベースライン時の患者の腫瘍の成長との比較、予想腫瘍成長に対する比較、大規模患者集団に基づく予想腫瘍成長に対する比較、又は対照集団の腫瘍成長に対する比較によって計測し得る。他の実施形態において、本発明の方法は生存を増加させる。
ＩＸ．抗ＰＤ−Ｌ１抗体
ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合してその活性（例えば、ＰＤ−１及び／又はＣＤ８０との結合）を阻害する抗体は、腫瘍の治療に有用である。ＰＤ−Ｌ１としても知られるＢ７−Ｈ１は、約５３ｋＤａサイズのＩ型膜貫通タンパク質である。ヒトでは、Ｂ７−Ｈ１は幾つもの免疫細胞型、例えば活性化及びアネルギー／枯渇Ｔ細胞、ナイーブ及び活性化Ｂ細胞、並びに骨髄樹状細胞（ＤＣ）、単球及びマスト細胞で発現する。Ｂ７−Ｈ１はまた、膵島、肝クッパー細胞、血管内皮及び特定の上皮、例えば気道上皮及び腎尿細管上皮を含めた非免疫細胞でも発現し、その発現は炎症エピソードの間に増強される。Ｂ７−Ｈ１発現はまた、限定はされないが、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、腎細胞癌を含めた腎癌、胃癌、膀胱癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、及び膵癌、並びにメラノーマを含め、幾つもの腫瘍に高いレベルで見られる。
Ｂ７−Ｈ１は、２つの代替的なリガンドに結合することが知られており、その１つ目、ＰＤ−１は、当初は活性化誘導性アポトーシスを起こすＴ細胞株で同定された５０〜５５ｋＤａのＩ型膜貫通受容体である。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び単球、並びに他の免疫系細胞に発現し、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）及び関連するＢ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）の両方に結合する。２つ目はＢ７ファミリーメンバーＢ７−１であり、これは活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球及び抗原提示細胞に発現する。
ＰＤ−１／Ｂ７−Ｈ１軸を介したシグナル伝達は、Ｔ細胞応答を負に調節することによって免疫系内で重要な必須の機能を果たすと考えられている。腫瘍細胞上のＢ７−Ｈ１発現は、腫瘍が免疫系による検出及び排除を回避するのを助けると考えられている。この点で、Ｂ７−Ｈ１は、腫瘍浸潤性Ｔリンパ球の枯渇及びアネルギーの駆動、腫瘍微小環境への免疫抑制性サイトカインの分泌の刺激、抑制性調節性Ｔ細胞機能の刺激、及び腫瘍細胞特異的細胞傷害性Ｔ細胞による溶解からのＢ７−Ｈ１発現腫瘍細胞の保護を含め、幾つかの代替的な機構を通じて機能する。
ＭＥＤＩ４７３６は、Ｂ７−Ｈ１に選択的な、且つＰＤ−１及びＣＤ８０受容体に対するＢ７−Ｈ１の結合を遮断する例示的抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ＭＥＤＩ４７３６は、インビトロでヒトＴ細胞活性化のＢ７−Ｈ１媒介抑制を軽減することができ、異種移植モデルでＴ細胞依存性機構を介して腫瘍成長を阻害する。使用し得る他の薬剤としては、ＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−１を阻害する薬剤（ＡＢなど）が挙げられる。
本明細書に提供される方法で使用されるＭＥＤＩ４７３６（又はその断片）に関する情報は、米国特許出願公開第２０１３００３４５５９号明細書／米国特許第８７７９１０８号明細書及び米国特許出願公開第２０１４０３５６３５３号明細書（これらの各々の開示は全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。ＭＥＤＩ４７３６の結晶化可能断片（Ｆｃ）ドメインは、ＩｇＧ１重鎖の定常ドメインに、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の媒介に関与する補体成分Ｃ１ｑ及びＦｃγ受容体との結合を低下させる三重突然変異を含む。
本明細書に提供される方法で使用されるＭＥＤＩ４７３６及びその抗原結合断片は、重鎖及び軽鎖又は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。ある具体的な態様において、本明細書に提供される方法で使用されるＭＥＤＩ４７３６又はその抗原結合断片は、配列番号１３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号１３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域とを含む。ある具体的な態様において、本明細書に提供される方法で使用されるＭＥＤＩ４７３６又はその抗原結合断片は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、ここで重鎖可変領域は配列番号１３２〜１３４のＫａｂａｔ定義によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み、且つ軽鎖可変領域は、配列番号１３５〜１３７のＫａｂａｔ定義によるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。当業者であれば、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ａｂｍ定義又は当業者に公知の他のＣＤＲ定義を容易に特定することができるであろう。ある具体的な態様において、本明細書に提供される方法で使用されるＭＥＤＩ４７３６又はその抗原結合断片は、米国特許出願公開第２０１３００３４５５９号明細書／米国特許第８７７９１０８号明細書及び米国特許出願公開第２０１４０３５６３５３号明細書（これらの各々の開示は全体として参照により本明細書に援用される）に開示されるとおりの２．１４Ｈ９ＯＰＴ抗体の可変重鎖及び可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
Ｘ．抗ＣＴＬＡ４抗体
従って、一実施形態において、本発明の治療的併用はＣＴＬＡ４遮断抗体（例えばトレメリムマブ）及び／又はＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を低下させる抗体を含む。これまでに大きな注目を集めている２つのＴ細胞調節経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２）及びプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、別名Ｂ７Ｈ−１又はＣＤ２７４）を介してシグナルを伝達する。
ＣＴＬＡ４は活性化Ｔ細胞上に発現し、ＣＤ２８媒介性Ｔ細胞活性化後にＴ細胞応答を抑える共阻害薬としての役割を果たす。ＣＴＬＡ４は、ＴＣＲ会合後のナイーブ及びメモリーＴ細胞の初期活性化の振幅を調節し、抗腫瘍免疫及び自己免疫の両方に影響を及ぼす中心的阻害経路の一部であると考えられている。ＣＴＬＡ４は主にＴ細胞上に発現し、そのリガンドＣＤ８０（Ｂ７１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）の発現は概して抗原提示細胞、Ｔ細胞、及び他の免疫媒介細胞に限定されている。ＣＴＬＡ４シグナル伝達経路を遮断するアンタゴニスト抗ＣＴＬＡ４抗体は、Ｔ細胞活性化を増強することが報告されている。１つのかかる抗体、イピリムマブは、２０１１年にＦＤＡによって転移性メラノーマの治療用に承認された。もう１つの抗ＣＴＬＡ４抗体、トレメリムマブは、第ＩＩＩ相試験で進行性メラノーマの治療が調査されたが、その時点では標準治療（テモゾロミド又はダカルバジン）と比較して患者の全生存に有意な増加はなかった。
本明細書に提供される方法で使用されるトレメリムマブ（又はその抗原結合断片）に関する情報は、米国特許第６，６８２，７３６号明細書（この中では１１．２．１と称される）（この開示は全体として参照により本明細書に援用される）を参照することができる。トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６、ＣＰ−６７５、ＣＰ−６７５２０６、及びチシリムマブとしても知られる）は、ＣＴＬＡ４に高度に選択的な、且つＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）に対するＣＴＬＡ４の結合を遮断するヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である。トレメリムマブはインビトロで免疫活性化をもたらすことが示されており、トレメリムマブで治療された一部の患者は腫瘍退縮を示している。
本明細書に提供される方法で使用されるトレメリムマブは、重鎖及び軽鎖又は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。ある具体的な態様において、本明細書に提供される方法で使用されるトレメリムマブ又はその抗原結合断片は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む。ある具体的な態様において、本明細書に提供される方法で使用されるトレメリムマブ又はその抗原結合断片は、本明細書に特定される重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。当業者であれば、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、Ａｂｍ定義又は当業者に公知の他のＣＤＲ定義を容易に特定することができるであろう。ある具体的な態様において、本明細書に提供される方法で使用されるトレメリムマブ又はその抗原結合断片は、米国特許第６，６８２，７３６号明細書（全体として参照により本明細書に援用される）に開示されるとおりの１１．２．１抗体の可変重鎖及び可変軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
ＸＩ．ＶＩＩ．医薬組成物及び投与方法
抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を調製し、それを必要としている対象に投与する方法は当業者に周知であり、又は当業者によって容易に決定される。抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によるか又は局所であり得る。本明細書で使用されるとおりの用語の非経口には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、又は腟内投与が含まれる。しかしながら、本明細書の教示と適合する他の方法では、本開示の抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体を有害細胞集団の部位に直接送達して、それにより治療剤に対する罹患組織の曝露を増加させることができる。
本明細書で考察するとおり、本開示の抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、ある種の癌など、ＣＤ７３発現細胞が媒介する疾患のインビボ治療に薬学的に有効な量で投与することができる。
抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体、又はその抗原結合断片と併用した抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を含む治療的併用を調製し、それを必要としている対象に投与する方法は当業者に周知であり、又は当業者によって容易に決定される。これらの併用の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入によるか又は局所であり得る。本明細書で使用されるとおりの用語の非経口には、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、又は腟内投与が含まれる。しかしながら、本明細書の教示と適合する他の方法では、本開示の併用を有害細胞集団の部位に直接送達して、それにより治療剤に対する罹患組織の曝露を増加させることができる。本明細書で考察するとおり、抗ＣＤ７３抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）と抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、及び／又は抗ＣＴＬＡ４抗体との併用は、ある種の癌など、ＣＤ７３発現細胞が媒介する疾患のインビボ治療に薬学的に有効な量で投与することができる。
本開示で使用される医薬組成物は、例えば、水、イオン交換体、タンパク質、緩衝物質、及び塩を含め、薬学的に許容可能な担体を含み得る。保存剤及び他の添加剤も存在し得る。担体は溶媒又は分散媒であってもよい。本明細書に開示される治療法における使用に好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）１６ｔｈ ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
いずれの場合にも、本発明の治療的併用、所要量の活性化合物を（例えば、抗ＣＤ７３抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体、例えばクローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体を、単独で、又は他の活性薬剤との併用で）適切な溶媒中に配合し、続いて滅菌ろ過することにより、滅菌注射用溶液を調製することができる。更に、このような調製物を包装し、キットの形態で販売することができる。かかる製品は、関連する組成物が、疾患又は障害に罹患しているか又はそれに罹り易い対象の治療に有用であることを示すラベル又は添付文書を有し得る。
非経口製剤は単回ボーラス投与、注入又は負荷ボーラス投与であってもよく、その後に維持投与が続く。これらの組成物は、特定の一定の間隔又は変動的な間隔で、例えば、１日１回、又は「必要に応じて」投与され得る。
本組成物は、単回投与、複数回投与として、又は注入における定められた期間にわたって投与され得る。投薬量レジメンも最適な所望の反応（例えば、治療的又は予防的反応）が得られるように調整され得る。
ＣＤ７３発現細胞が媒介する疾患、例えば、結腸癌、メラノーマ、乳癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びバーキットリンパ腫、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、及び膵癌を含め、ある種の癌などの治療に対する本開示の組成物の治療有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトか、それとも動物か、投与されている他の薬物療法、及び処置が予防的か、それとも治療的かを含め、多くの異なる要因に応じて変わる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含めた非ヒト哺乳動物も治療し得る。治療投薬量は、当業者に公知のルーチンの方法を用いて、安全性及び有効性が最適となるように滴定することができる。
本発明の少なくとも１つの抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又は治療的併用の投与量は、本開示の開示を所与とすれば、当業者によって過度の実験を行うことなく容易に決定される。投与方法、及び本発明の少なくとも１つの抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、その抗原結合断片、変異体又は誘導体、又は治療的併用のそれぞれの量に影響を及ぼす要因としては、限定はされないが、疾患の重症度、病歴、並びに治療を受ける個体の年齢、身長、体重、健康、及び理学的状態が挙げられる。同様に、本発明の抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、又はその断片、変異体、若しくは誘導体、又は治療的併用の投与量は、投与方法、及び対象がこの薬剤の単回投与を受けるか、それとも複数回投与を受けるかに依存することになる。
本開示はまた、例えば、結腸癌、メラノーマ、乳癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びバーキットリンパ腫、卵巣癌、乳癌、頭頸部癌、及び膵癌を含めた、ある種の癌の治療用医薬の製造における、本発明の抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）、又は治療的併用の使用も提供する。
本開示はまた、ある種の癌を治療するための対象の治療用医薬の製造における、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）の使用も提供する。特定の態様において、この医薬は、少なくとも１つの他の療法で前治療されている対象において使用される。
「前治療された」又は「前治療」とは、対象が抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を含む医薬を投与される前に、１つ以上の他の療法を受けている（例えば、少なくとも１つの他の抗癌療法で治療されている）ことが意図される。対象が先行する１つ又は複数の療法による前治療に対するレスポンダーであった必要はない。従って、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体を含む医薬を投与される対象は、先行の療法、又は前治療が複数の療法を含んだ場合に先行の療法のうちの１つ以上による前治療に応答した可能性もあり、又は応答しなかった可能性もある。
本開示はまた、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）と少なくとも１つの他の療法との共投与も提供する。抗ＣＤ７３抗体と少なくとも１つの他の療法とは、単一の組成物で一緒に共投与することができ、又は別個の組成物で同時に若しくは重なり合う時間に一緒に共投与することができる。一部の態様において、抗ＣＤ７３抗体は、例えば、ＰＤ−１（プログラム死１タンパク質）を標的化する抗体と共投与することができる。本開示はまた、癌を治療するための対象の治療用医薬の製造における、抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗体、又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）の使用も提供し、ここで抗ＣＤ７３結合分子は、対象が少なくとも１つの他の療法で治療される前に投与される。
ＶＩＩＩ．診断
本開示は、特定の種類の癌など、ＣＤ７３発現細胞が媒介する疾患の診断において有用な診断方法を更に提供し、これは、個体からの組織若しくは他の細胞又は体液中のＣＤ７３タンパク質の発現レベルを計測すること、及び計測した発現レベルを正常組織又は体液中の標準ＣＤ７３発現レベルと比較することを含み、ここで標準と比較した発現レベルの増加が、障害の指標となる。
本明細書に開示される抗ＣＤ７３抗体並びにその抗原結合断片、変異体、及び誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いた生物学的試料中のＣＤ７３タンパク質レベルのアッセイに使用することができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照）。ＣＤ７３タンパク質発現の検出に有用な他の抗体ベースの方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、又はウエスタンブロッティングなどのイムノアッセイが挙げられる。好適なアッセイは、本明細書の他の部分に更に詳細に記載される。
「ＣＤ７３ポリペプチドの発現レベルをアッセイする」とは、第１の生物学的試料中のＣＤ７３ポリペプチドのレベルを直接（例えば、絶対タンパク質レベルを決定又は推定することによる）、或いは相対的に（例えば、第２の生物学的試料中の疾患関連ポリペプチドレベルと比較することによる）、定性的又は定量的に計測又は推定することが意図される。第１の生物学的試料中のＣＤ７３ポリペプチド発現レベルを計測又は推定して標準ＣＤ７３ポリペプチドレベルと比較することができ、この標準は、障害を有しない個体から得た第２の生物学的試料から取られるか、又は障害を有しない個体集団のレベルを平均することにより決定される。当該技術分野では理解されるであろうとおり、一度「標準」ＣＤ７３ポリペプチドレベルが分かれば、それを比較の標準として繰り返し使用することができる。
「生物学的試料」とは、潜在的にＣＤ７３を発現する個体、細胞株、組織培養物、又は他の細胞供給源から得られる任意の生物学的試料が意図される。哺乳動物から組織生検及び体液を得る方法は、当該技術分野において周知である。
ＩＸ．ＣＤ７３結合分子を含むキット
本開示はまた、本明細書に記載される方法の実施に使用し得る、本明細書に記載されるＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片、本明細書に開示される分子の変異体、又は誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）のうちの少なくとも１つを含むキットも提供する。特定の態様において、キットは、１つ以上の容器に少なくとも１つの精製抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片を含む。一部の態様において、キットは、全ての対照、アッセイの実施についての指図、並びに結果の分析及び発表に必要な任意のソフトウェアを含め、検出アッセイの実施に必要及び／又は十分な全ての構成要素を含む。当業者は、開示されるＣＤ７３結合分子、例えば、本開示の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）を、当該技術分野において周知の確立されたキットフォーマットの１つに容易に組み込み得ることを容易に認識するであろう。
Ｘ．イムノアッセイ
本明細書に開示される抗ＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片、本明細書に開示される分子の変異体、又は誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、当該技術分野において公知の任意の方法によって免疫特異的結合に関してアッセイすることができる。使用することのできるイムノアッセイとしては、限定はされないが、いくつか例を挙げれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの技法を用いる競合及び非競合アッセイシステムが挙げられる。かかるアッセイは常法であり、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ） Ｖｏｌ．１（参照により全体として本明細書に援用される）を参照）。
ＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片、及びそれらの変異体又は誘導体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）は、免疫蛍光法、免疫電子顕微鏡法又は非免疫学的アッセイのように、ＣＤ７３又はその保存された変異体若しくはペプチド断片のインサイチュー検出に組織学的に用いることができる。インサイチュー検出は、患者から組織標本を採取し、且つ好ましくは標識ＣＤ７３結合分子（例えば、及び抗体又は断片）を生物学的試料の上に重ねることによって適用して、標識ＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片、その変異体、又は誘導体をその標本に適用することによって達成し得る。かかる手順を用いることにより、ＣＤ７３、又は保存された変異体若しくはペプチド断片の存在のみならず、被験組織におけるその分布も決定することが可能である。本開示を用いることにより、当業者は、かかるインサイチュー検出を実現するため、多種多様な組織学的方法の任意のもの（染色手順など）を変更し得ることを容易に理解するであろう。
ＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片、その変異体、又は誘導体の所与のロットの結合活性は、周知の方法により決定することができる。当業者は、ルーチンの実験を用いて各決定に有効且つ最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
単離ＣＤ７３結合分子、例えば、抗ＣＤ７３抗体（例えば、クローン１０．３抗体又はクローン２Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片、その変異体、又は改変／突然変異誘導体の結合特性の決定に好適な方法及び試薬は、当該技術分野において公知であり、及び／又は市販されている。かかる反応速度論的分析用に設計された機器及びソフトウェアは市販されている（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＫｉｎＥｘａソフトウェア、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。
本開示の実施には、特に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術が用いられ、それらは当該技術分野の技術の範囲内にある。かかる技法は、文献に十全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照のこと。
抗体工学の一般原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に記載される。タンパク質工学の一般原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に記載される。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に記載される。加えて、当該技術分野において公知の、具体的には記載されない免疫学の標準方法が、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）及びＭｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ）にあるとおり、一般に用いられる。
免疫学の一般原理について記載する標準的な参考文献としては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ＆Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ２００３）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。
上記に引用する参考文献の全て、並びに本明細書に引用する全ての参考文献は、全体として参照により本明細書に援用される。
以下の例は、限定としてではなく、例示として提供される。
本開示の態様は、以下の非限定的な例を参照することによって更に定義され得る。これらの例は、本開示の特定の抗体の調製及び本開示の抗体の使用方法を詳細に記載するものである。当業者には、本開示の範囲から逸脱することなく材料及び方法の両方に対して多くの変更を行い得ることが明らかであろう。
エクト−５’−ヌクレオチダーゼ（ＮＴ５Ｅ）としても知られるＣＤ７３（分化クラスター７３）は、腫瘍細胞並びに正常な間質細胞、例えば内皮細胞及びある種の白血球に見られる膜貫通受容体である。ＣＤ７３はアデノシン一リン酸からアデノシン及び有機リン酸に触媒する。アデノシン受容体の細胞外部分の結合により、サイクリックＡＭＰを通じてシグナルが送られ、Ｔ細胞受容体活性化が阻害される（Ｌｉｎｄｅｎ ａｎｄ Ｃｅｋｉｃ，２０１２によってレビューされている）。ＣＤ７３は、調節性Ｂ及びＴリンパ球の阻害機能の媒介（Ｓａｚｅ ｅｔ ａｌ，２０１３）、並びに内皮完全性の維持（Ｊａｌｋａｎｅｎ ａｎｄ Ｓａｌｍｉ，２００８によってレビューされている）において役割を果たすと考えられている。
正常な生物学におけるその役割に加えて、ＣＤ７３及びアデノシンは腫瘍生物学に影響を与える。腫瘍微小環境中の細胞外アデノシンの存在は、免疫抑制性の「ハロー」として記載されている（Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ，２０１３）。アデノシンのこの役割と一致して、アデノシン受容体が欠損したノックアウトマウスは、正常マウスと比べてより容易に腫瘍を拒絶することが示されている（Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ，２００６）。腫瘍中の細胞外アデノシンの主な供給源はＣＤ７３であると考えられている（Ａｕｇｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ，２０１３）。この仮説並びにＡ２Ａ欠損マウスを用いた研究と一致して、ＣＤ７３が欠損したノックアウトマウスでは抗腫瘍免疫が増加しており（Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ，２０１１）、正常マウスと比較したとき発癌の低下を示す（Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ，２０１２）。具体的には、細胞外アデノシンは、特に調節性Ｔ細胞及び骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の両方の免疫抑制効果を媒介すると考えられている（Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ，２０１３によってレビューされている）。小分子又は抗体によるＣＤ７３の分子阻害が腫瘍形成、成長、及び転移を阻害し得ることを示す他の研究（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１４によってレビューされている）を併せて考えると、腫瘍がＣＤ７３を使用してアデノシンを生成し、それにより抗腫瘍免疫を抑制することが仮定される。従って、ＣＤ７３に選択的に結合してそのエクトヌクレオチダーゼ活性を阻害する抗ＣＤ７３抗体は、抗腫瘍免疫応答の増強に有用である可能性が高い。
実施例１：抗ＣＤ７３抗体の単離及び同定
ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリをビオチン化ＣＤ７３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）でパニングして、ヒト、カニクイザル、及びマウスＣＤ７３に結合する抗体を単離した。リード抗体、ＣＤ７３００１０は、ヒト、マウス、及びカニクイザルＣＤ７３発現細胞に特異的に結合すること（フローサイトメトリーによる）、及び組換え可溶性ＣＤ７３ ＥＣＤ並びに細胞上に提示された天然ＣＤ７３の活性を阻害することが示された。ヒトＣＤ７３に対するＣＤ７３００１０の結合親和性を増強するためＣＤ７３００１０の親和性成熟を開始した。
親和性最適化の前に、親和性を損なうことなくＣＤ７３００１０のできるだけ多くのフレームワーク残基を最も近縁のヒト生殖系列配列（ＩＭＧＴレパートリーに基づく）に復帰させることを試みた。これは、ヒトにおける最終的な抗体薬の潜在的な免疫原性を最小限に抑えるため行った。ＶＬドメインの全てのフレームワーク残基及びＶＨドメインの１つを除いた全てのフレームワーク残基を、ヒト生殖細胞系列ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＬＪ３、ＩＧＨＶ３−２３、及びＩＧＨＪ２のアミノ配列に一致するように復帰させることができた。ＣＤ７３００１０のＶＨドメインの９４位（Ｋａｂａｔ付番；Ｋａｂａｔ，１９９１）にあるリジンは、親和性の損失なしに復帰させることができなかった。
生殖細胞系列化したＣＤ７３００１０抗体の親和性及び効力を、ＣＤＲ変異体のライブラリを作成し且つそれらの変異体をＣＤ７３との結合性の向上に関して試験することによって最適化した。親和性の向上が最良であった幾つかの突然変異を組み合わせて、候補薬物ＭＥＤＩ９４４７を作成した。ＭＥＤＩ９４４７のヌクレオチド及び推定アミノ酸配列を図１Ａ〜図１Ｄに示す。
本質的にＬｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＥＤＳ ２２：１５９−６８（２００９）に以前記載されたとおり哺乳類細胞からインハウスで作製したビオチン化ヒト及びマウスＣＤ７３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する一連の反復的な交互選択サイクルで、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリからＣＤ７３特異的ｓｃＦｖ抗体を単離した。選択アウトプットのラウンド２及び３からのＳｃＦｖ遺伝子を、バッチで細菌性ｓｃＦｖ−Ｆｃ又はＦａｂ発現ベクターに変換した。可溶性ｓｃＦｖ−Ｆｃ又はＦａｂを有する細菌培養上清を、ヒト、マウス、及びカニクイザルＣＤ７３ ＥＣＤとのそれらの結合性に関してＥＬＩＳＡ又は均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によってスクリーニングした。交差反応性を示す上位のヒットを選択し、ＤＮＡシーケンシングに供し、全免疫グロブリンＧ１三重突然変異体抗体フォーマット（「ＩｇＧ−ＴＭ」、突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓを組み込むＩｇＧ１ Ｆｃ配列）に変換した。ＩｇＧ１ ＴＭ抗体を哺乳類細胞で発現させて、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、結合及び機能アッセイでのそれらの特性に基づきランク付けした。
実施例２：抗ＣＤ７３抗体のエピトープビニング
抗ＣＤ７３抗体がヒトＣＤ７３ ＥＣＤとの結合に関して互いに競合する能力を、本質的に記載されるとおり（Ａｂｄｉｃｈｅ ＹＮ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３８６：１７２−８０（２００９）、Ｏｃｔｅｔ機器で評価した。ＣＤ７３ ＥＣＤタンパク質及び第１の抗ＣＤ７３抗体をプレインキュベートし、ストレプトアビジンセンサに捕捉されたビオチン化第２抗ＣＤ７３抗体に添加した。第１の抗ＣＤ７３抗体がＣＤ７３ ＥＣＤと第２の抗ＣＤ７３抗体との結合を遮断した場合、両方の抗体を同じ又は重複するエピトープビンに入れた。両方の抗体がＣＤ７３ ＥＣＤに同時に結合し得た場合、それらを重複しないエピトープビンに入れた。抗ＣＤ７３抗体のペアワイズ試験から、それらが３つの重複しないエピトープビンに属することが実証された（表２）。
Figure 0006755866
実施例３：ＣＤ７３に対する抗ＣＤ７３抗体の結合
抗ＣＤ７３抗体の結合親和性及び特異性を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及びフローサイトメトリーによって決定した。
ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器を使用して、ヒト、マウス、及びカニクイザルＣＤ７３ ＥＣＤに対するＭＥＤＩ９４４７の結合を特徴付けた。抗ヒトＦｃ抗体を使用してＭＥＤＩ９４４７の親和性捕捉を行った。ＣＤ７３ ＥＣＤは移動相にあった。ＭＥＤＩ９４４７に対するＣＤ７３の会合及び解離はラングミュアの１：１モデルで正確に記述することができた。表３に示す結果は、これらの３つの種のＣＤ７３ ＥＣＤに対するＭＥＤＩ９４４７の親和性が同程度であり、低ピコモル範囲にあることを実証している。
Figure 0006755866
ヒト、マウス、及びカニクイザル細胞株上に発現した天然ＣＤ７３に対するＭＥＤＩ９４４７の結合をフローサイトメトリーによって特徴付けた。細胞を様々な濃度のＭＥＤＩ９４４７とインキュベートし、フルオロフォア標識抗ヒトＦｃ抗体で抗体結合をモニタした。ＭＥＤＩ９４４７濃度の関数としての蛍光強度中央値のプロットをワンサイト結合等温線モデルを使用して非線形フィッティングして、平衡解離定数を計算した。フローサイトメトリーによる分析から、ヒト、マウス、及びカニクイザルＣＤ７３に対するＭＥＤＩ９４４７の同程度の親和性での結合が確認され（表４）、但しＫＤ値はＳＰＲによって決定されるＫＤ値よりも１３〜１２６倍高く、これは恐らくは、組換えＣＤ７３と天然ＣＤ７３との間のコンホメーションの違いによるものと思われる。
Figure 0006755866
ヒトＣＤ７３に対するＭＥＤＩ９４４７の特異性をフローサイトメトリーによって決定するため、細胞株を作成した。胸水に由来するヒト乳癌細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にヒトＣＤ７３低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をトランスフェクトしてＣＤ７３の細胞表面発現をノックダウンした。バーキットリンパ腫細胞に由来するＴ細胞株であるジャーカット細胞に、ヒトＣＤ７３ ｍＲＮＡを発現するプラスミドをトランスフェクトして、ＣＤ７３の細胞表面発現をノックインした。ジャーカット細胞は内因性ＣＤ７３をほとんど発現しない。
高ＣＤ７３発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）と低発現細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＣＤ７３−ｓｈＲＮＡ）とに結合するＭＥＤＩ９４４７の比により、ヒトＣＤ７３に対するＭＥＤＩ９４４７の特異性を決定した。ヒトＣＤ７３に対するＭＥＤＩ９４４７の特異性はまた、高ＣＤ７３発現細胞株（ジャーカット−ＣＤ７３ノックイン）と低発現細胞株ジャーカットとの比によっても決定した。
マウスＣＤ７３（ｍＣＤ７３）に対するＭＥＤＩ９４４７の特異性をフローサイトメトリーにより、マウス細胞株４Ｔ１（高ｍＣＤ７３発現）をノックダウン細胞株（４Ｔ１ ｍＣＤ７３−ｓｈＲＮＡ）と比較して決定した。加えて、マウスＣＤ７３ノックインを有するジャーカット細胞に対するＭＥＤＩ９４４７の特異性を野生型ジャーカット細胞（マウスＣＤ７３なし）と比較した。
Figure 0006755866
実施例４：抗ＣＤ７３抗体ＭＥＤＩ９４４７によるＣＤ７３のインターナリゼーション
ＣＤ７３の抗体媒介性インターナリゼーション又はシェディングをフローサイトメトリーによって評価した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を成長培地中１００ｎＭ ＭＥＤＩ９４４７又は陰性対照抗体Ｒ３４７の存在下で３７℃で０〜４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、氷冷ＰＢＳに再懸濁した。１０ｎＭ ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識検出抗体を添加することにより、細胞表面上のＣＤ７３の存在を検出した。細胞を１５分間インキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。検出抗体は、ＭＥＤＩ９４４７エピトープと異なるＣＤ７３のエピトープに結合し、両方の抗体とも、妨げなしにＣＤ７３に同時に結合する。ＣＤ７３の細胞表面発現は、ＭＥＤＩ９４４７と共に４時間インキュベートした後その元の値の７３％に降下したことから、ＣＤ７３の２７％はＭＥＤＩ９４４７結合時にインターナライズされるか、又はシェディングされるかのいずれかであったことが示唆される（エラー！参照元が見つかりません。）。
Figure 0006755866
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳癌）及び４Ｔ１（マウス乳癌）へのＭＥＤＩ９４４７のインターナリゼーションを、ＦａｂＺＡＰアッセイ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）として商業的に販売されているヒト抗体インターナリゼーションキットを使用して評価した。ＭＥＤＩ９４４７又は陰性対照抗体Ｒ３４７の段階希釈物を４０ｎＭ ＦａｂＺＡＰ試薬（細胞毒性タンパク質サポリンにコンジュゲートしたポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体のＦａｂ断片）とプレインキュベートし、次に細胞株に添加した。培養下で３日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）として商業的に販売されている発光細胞生存度アッセイを用いて細胞増殖を計測した。このアッセイを用いてＥＣ５０値及び最大毒性を計算した。ＦａｂＺＡＰ試薬は、そのままでは細胞にインターナライズすることができない。これは被験抗体（例えば、ＭＥＤＩ９４４７）に結合し、被験抗体のインターナリゼーション時に限り細胞毒性となる。ＭＥＤＩ９４４７はＦａｂＺＡＰのインターナリゼーションを生じさせ、細胞増殖を用量依存的に阻害した。
Figure 0006755866
被験抗体及びＦａｂＺＡＰ試薬の段階希釈物で処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及び４Ｔ１細胞の細胞増殖をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイによって計測した（図２）。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイにおける陰性対照抗体Ｒ３４７からのシグナルをＭＥＤＩ９４４７のシグナルからサブトラクトし、非線形回帰分析を使用して用量反応曲線をフィッティングすることによりＥＣ５０値及び最大毒性を計算した。
実施例５：抗ＣＤ７３抗体ＭＥＤＩ９４４７による５’エクトヌクレオチダーゼ活性の阻害
この試験では、ヒト非小細胞癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３２２を使用してＣＤ７３の触媒によるＡＭＰ加水分解を計測するインビトロアッセイでＭＥＤＩ９４４７の機能活性を決定した。ＭＥＤＩ９４４７の製剤は、そのストック溶液を無血清ＲＰＭＩ培地に１μＭの終濃度となるように希釈することによって調製した。Ｒ３４７の製剤は、そのストック溶液をＲＰＭＩに１μＭの終濃度となるように希釈することによって調製した。
ＮＣＩ−Ｈ３２２細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去し、無血清ＲＰＭＩ培地を補充した。ＶｉＣｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｃｏｕｌｔｅｒ）細胞計数器を使用して細胞懸濁液をカウントした。９６ウェルプレートに細胞を１ウェルにつき１００μＬ当たり１０，０００細胞の細胞密度でプレーティングした。５０μＬの４倍濃縮ＡＭＰ（２００μＭ）を添加した。次にプレートを３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。プレートを遠心し、５０μＬの培養上清をウェル間で９６ウェル不透明丸底プレートに移した。次に２×ＡＴＰを添加した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従い添加した。５’エクトヌクレオチダーゼの細胞酵素阻害をマルチラベルリーダー、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎワークステーションで計測した。試料はＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。
ＭＥＤＩ９４４７は、ヒトインビトロ系でアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の脱リン酸化を特異的に阻害した。表面発現ＣＤ７３の細胞ベースのアッセイでは、アデノシン一リン酸からアデノシンへの変換がＭＥＤＩ９４４７によって用量依存的に減少したが、無関係のアイソタイプ対照抗体によっては減少しなかった（図３）。図３に示す結果は、９６ウェル非組織培養処理プレート（Ｆａｌｃｏｎ ３７８８）に１００μＬの添加剤不含ＲＰＭＩ培地中ウェル当たり１０，０００細胞でプレーティングしたＣＤ７３発現ＮＳＣＬＣ細胞を使用して得られた。抗体はＡＭＰ（２００μＭの終濃度）と共にデュプリケートで添加し、プレートは３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次にプレートを１５００ｒｐｍで３分間遠心した。新鮮な９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３６０５）に上清を回収し、ＡＴＰを１００μＭの終濃度となるように添加した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１：１で添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎルミネセンスプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用してＡＴＰレベルを計測することにより細胞ＣＤ７３酵素ＡＭＰホスホリラーゼ活性を決定した。ＡＴＰ及びＡＭＰのみを含有する緩衝液を陰性対照として使用した。アッセイを繰り返した。図３に示す結果は、他のヒト癌細胞株を使用した２つの同様の実験の代表的なものである。
これらの結果は、ＭＥＤＩ９４４７が癌細胞によるアデノシンの産生を阻害したことを示している。アデノシンは、腫瘍微小環境内で腫瘍の免疫抑制効果を媒介すると考えられている。
実施例６：ＭＥＤＩ９４４７による腫瘍浸潤性骨髄系由来サプレッサー細胞の減少
０．１ｍＬのＰＢＳ中に懸濁した５×１０５細胞を４〜６週齢雌マウスの右側腹部に皮下（ＳＣ）注射することにより、マウス結腸癌に由来するＣＴ２６細胞を樹立した。マウスをＭＥＤＩ９４４７又は対照抗体で治療した。
この試験では、各群１０匹のマウスを使用した。動物を群に無作為に割り付けた。群１の動物は治療せず、群２にはアイソタイプ対照を投与した。群３にはＭＥＤＩ９４４７を投与した。被験物質は、３日目に開始して週２回、腹腔内投与した。１６日目、各群５匹の動物を剖検し、腫瘍を摘出した。
群番号及び用量レベルを表８に提供する。
Figure 0006755866
腫瘍はノギスで１、７、９、１２、１４、及び１６日目に計測し、腫瘍容積は以下のとおり計算した：
（１）（腫瘍容積長さ（ｍｍ）×（腫瘍容積幅）２（ｍｍ））／２。
ＭＥＤＩ９４４７の抗癌効果は、以下のとおり計算したパーセント腫瘍成長阻害率として表した：
（２）（ＭＥＤＩ９４４７の平均腫瘍容積／Ｒ３４７−ＴＭの平均腫瘍容積）×１００。
フローサイトメトリー用の腫瘍を摘出した。試験１６日目にＣＴ２６腫瘍担持マウスから腫瘍を解剖した。腫瘍を細片に切断し、コラゲナーゼで消化させた。３０分間インキュベートした後、消化された試料を７０ミクロンフィルタに通過させた。解離した細胞を４℃で１０００ｒｐｍで５分間ペレット化し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）緩衝液に再懸濁した。Ｖｉ−Ｃｅｌｌでデフォルト設定を用いて細胞をカウントした。ウェル当たり１×１０６細胞をプレーティングした。細胞を抗ＣＤ４５（全ての白血球を検出するため）、抗ＧＲ１（ＭＤＳＣを検出するため）及び抗Ｌｙ６ｇ（顆粒球系ＭＤＳＣ）で染色した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでデータを収集した。存在する場合、ＭＤＳＣ分析から得られた有意なｐ値を図４に記述統計値（即ち、平均値及び標準偏差）の隣に提供する。
ＭＥＤＩ９４４７はマウスＣＴ２６同系Ｂａｌｂ／Ｃ腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を阻害した（図４）。
ＭＥＤＩ９４４７はマウスＣＴ２６同系Ｂａｌｂ／Ｃ腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤性ＭＤＳＣの割合を低下させた（図５）。
ＭＥＤＩ９４４７はＣＴ２６マウス同系腫瘍の成長を阻害した。加えて、ＭＥＤＩ９４４７による治療後、同系ＣＴ２６結腸癌腫瘍の骨髄系由来サプレッサー細胞が減少した。腫瘍内ＭＤＳＣは腫瘍微小環境に対して免疫抑制効果を有し、腫瘍成長の増強を可能にする。ＭＥＤＩ９４４７による治療後に腫瘍内ＭＤＳＣの減少が観察されたことは、ＭＥＤＩ９４４７による治療が腫瘍免疫抑制を低減する機構を実証している。
実施例７：ＭＥＤＩ９４４７ ｍＩｇＧ１と抗ＰＤ−１抗体との併用は腫瘍成長を低減し、生存を増加させる
ＨＢＳＳ中に懸濁した０．１ｍｌの５×１０６個のＣＴ２６細胞／ｍｌを８〜１０週齢の動物の右側腹部に皮下（ＳＣ）注射することにより、同系腫瘍を樹立した。腫瘍をノギスで計測し、以下の式を用いて腫瘍容積（ＴＶ）を計算した：
（１）ＴＶ＝（Ｌ×Ｗ２）／２
（式中、Ｌは腫瘍長さ（ミリメートル単位）であり、Ｗは腫瘍幅（ミリメートル単位）である）。
マウスを体重に基づく群に無作為化した。動物の取り替えはなかった。この試験では６０匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。
動物を６群に無作為に割り付けた。動物にはＭＥＤＩ９４４７（ｍＩｇＧ１）を投与した。被験物質は３日目に開始して週２回、腹腔内（ＩＰ）注射によって投与した。群番号及び用量レベルを表９に提供する。
Figure 0006755866
（ａ）インビボ腫瘍阻害試験の結果
ＣＴ２６マウス結腸癌を同系Ｂａｌｂ／ｃマウスに移植し、抗ＣＤ７３（ＭＥＤＩ９４４７ ｍＩｇＧ１）、抗ＰＤ１又は併用で治療した。併用治療は抗ＣＤ７３単独と比較したとき腫瘍成長を有意に阻害した（ｐ＝０．０１５、ＡＮＯＶＡ）。試験４０日目までの各動物群の腫瘍容積を個々の動物についてプロットした。対照群には、４０日間の試験期間の終わりまで腫瘍がなかったマウスはいなかった。抗ＣＤ７３治療単独では、試験終了時に腫瘍がなかった動物は１０％であった。抗ＰＤ１治療単独も、試験終了時に腫瘍がなかった動物は１０％であった。顕著なことに、抗ＣＤ７３と抗ＰＤとの併用治療では、腫瘍がなかったマウスは６０％であった。対照群には、試験の終わりまで腫瘍がなかったマウスは一匹もいなかった。抗ＣＤ７３（ＭＥＤＩ９４４７ ｍＩｇＧ１）、抗ＰＤ１又は抗ＣＤ７３と抗ＰＤ１との併用で治療したマウスのＣＴ２６腫瘍を計測した。マウスは試験４０日目まで計測し、腫瘍が２０００ｍｍ３に達したところで人道的に犠牲死させた。抗ＣＤ７３と抗ＰＤ１との併用治療は、抗ＣＤ７３又は抗ＰＤ１治療単独と比較したとき、一緒になって統計学的に有意な生存の増加をもたらした（それぞれｐ値＝０．００５及びｐ＝０．０３８、ログランク検定）（図７）。生存期間中央値は、この併用についての４０日目における「未定」と比較して２５日及び３３日（それぞれ抗ＣＤ７３及び抗ＰＤ１）から増加した（表１０）。
Figure 0006755866
要約すれば、抗ＣＤ７３抗体、ＭＥＤＩ９４４７ ｍＩｇＧ１は、マウス同系ＣＴ２６結腸癌モデルにおいて抗ＰＤ−１抗体と比較したとき抗腫瘍活性の増強を示した。加えて、抗ＣＤ７３と抗ＰＤとの併用治療では、腫瘍がなかったマウスは６０％であった。抗ＣＤ７３と抗ＰＤ１との併用治療はまた、抗ＣＤ７３又は抗ＰＤ１単独治療と比較したとき、一緒になって統計学的に有意な生存の増加ももたらした。
実施例８：腫瘍細胞（図９）、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）及び腫瘍浸潤性ＣＤ４＋，ＦｏｘＰ３＋リンパ球（図１５）のＣＤ７３発現によって計測したとき、抗ＰＤ−１はＣＤ７３リッチな腫瘍微小環境を誘導した。
同系Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ細胞又は同系ＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫細胞を皮下（ＳＣ）注射することにより、同系腫瘍を樹立した。マウスをＭＥＤＩ９４４７（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、又はＭＥＤＩ９４４７（１０ｍｇ／ｋｇ）と抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）との併用で週２回治療した。腫瘍容積を週２回計測した。ＭＥＤＩ９４４７と抗ＰＤ−Ｌ１との併用での投与は、メラノーマ腫瘍（図１２）及びリンパ腫瘍（図１３）における腫瘍成長阻害を有意に増強した。
抗ＰＤ−Ｌ１が腫瘍微小環境に及ぼす効果を理解するため、リンパ球上のＣＤ７３発現を調べた。マウス（ｎ＝４）に同系ＣＴ２６結腸直腸細胞を皮下注射し、１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１又は無関係のアイソタイプ対照抗体で週２回治療した。初回治療の翌日、流入領域リンパ節から細胞を単離し、フローサイトメトリーによって表面表現型に関して分析した。初回治療の３日後、腫瘍を摘出し、細胞を解離し、フローサイトメトリーによって表面表現型に関して分析した。流入領域リンパ節Ｂリンパ球（図１４）及び腫瘍浸潤性ＣＤ４＋，ＦｏｘＰ３＋リンパ球（図１５）のＣＤ７３表面発現によって計測したとき、抗ＰＤ−Ｌ１はＣＤ７３リッチな腫瘍微小環境を誘導した。
結腸直腸ＣＴ２６同系腫瘍を担持するマウスを、ＭＥＤＩ９４４７（３０ｍｇ／ｋｇ）又は抗ＰＤ−Ｌ１（３０ｍｇ／ｋｇ）又はＭＥＤＩ９４４７（３０ｍｇ／ｋｇ）と抗ＰＤ−Ｌ１（３０ｍｇ／ｋｇ）との併用で週２回治療した。１６日目、腫瘍及び末梢全血細胞を回収し、フローサイトメトリー及び酵素活性によって表面ＣＤ７３発現に関して分析した。ＭＥＤＩ９４４７単独又は抗ＰＤ−Ｌ１との併用により、末梢全血細胞（図１６）、腫瘍浸潤性ＣＤ４＋，ＦｏｘＰ３＋リンパ球（図１７）及び腫瘍浸潤性ＣＤ８＋リンパ球（図１８）のＣＤ７３発現が低下した。ＭＥＤＩ９４４７単独又は抗ＰＤ−Ｌ１との併用により、腫瘍細胞のＣＤ７３発現も低下した（図１９）。
ＭＥＤＩ９４４７とＣＴＬＡ４、ＯＸ４０、ＰＤ−１、及びＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体又は融合タンパク質とを混合白血球反応で初代ヒト末梢血単核細胞と共に７２時間インキュベートした。デュプリケートの上清中の指示サイトカインをＥＬＩＳＡによって定量化した。示されるデータは、抗ＣＤ７３抗体と４つの異なるパートナー薬剤との最適用量の併用を表す。抗ＰＤ−１と抗ＣＤ７３との併用は、Ｂｌｉｓｓ表面反応法（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．）によって決定するとき有意な（ｐ＜０．０５）相乗作用を示した（図２０）。サイトカインプロファイルは、骨髄系列及びリンパ系列の両方が影響を受けたことを示している。５０組を超えるドナーペアを試験した。
要約すれば、抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、末梢中に検出可能な、且つ抗ＣＤ７３抗体、ＭＥＤＩ９４４７ ｍＩｇＧ１による治療によって可逆的なＣＤ７３リッチ腫瘍微小環境を作り出した。具体的には、マウスＣＴ２６腫瘍において、これらの腫瘍を担持するマウスを抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体で治療したとき、ＣＤ７３細胞表面発現及び酵素活性のレベルが劇的に増加した。更に、抗ＣＤ７３抗体ＭＥＤＩ９４４７単独又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との併用で治療することにより、発現及び活性レベルは低下した。これらの変化は腫瘍並びに循環末梢全血細胞の両方で観察された。従って、ＣＤ７３発現及び活性は、抗ＰＤＬ１治療及び抗ＣＤ７３治療の両方の薬力学的マーカーとして、又は無調節なＣＤ７３発現及び活性によって腫瘍が「エスケープ」した、抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１で治療される患者のセグメンテーションのための予測的バイオマーカーとしての役割を果たし得る。重要なことには、抗ＣＤ７３抗体、ＭＥＤＩ９４４７は、抗ＰＤ１又は抗ＰＤ−Ｌ１、ＭＥＤＩ ４７３６との併用で抗腫瘍活性の増強を示した。
まとめると、これらの結果は、抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体が「ＣＤ７３リッチな」腫瘍微小環境を誘導することを様々な計測によって裏付けると共に、ＭＥＤＩ９４４７とＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸を標的化する療法とを併用することの強力な理論的根拠を提供する。
実施例９：抗ＣＤ７３００１０抗体及び抗体変異体
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ＣＤ７３０００２について、最も近縁の生殖系列遺伝子は、ＶＨドメインについてＩＧＨＶ３−２３及びＩＧＨＪ３、並びにＶＬドメインについてＩＧＬＶ３−１及びＩＧＬＪ３であった。ＣＤＲ領域外の４つの非生殖細胞系列残基を同定した：ＶＨのＲ９４、及びＶＬのＴ２０、Ｒ５７、Ｌ８１及びＦ８７（Ｋａｂａｔ付番）（表１１）。ＣＤ７３０００２ ＩｇＧ１−ＴＭ発現ベクターのヌクレオチドを標準的な分子生物学的技術によって復帰突然変異させて、従って得られた発現ベクターはこれらの位置で生殖細胞系列アミノ酸をコードした（ＶＨのＫ９４、及びＶＬのＳ２０、Ｇ５７、Ｍ８１、及びＹ８７）。このＣＤ７３０００２ ＩｇＧ１−ＴＭタンパク質変異体を発現させて、精製し、組換えヒト及びマウスＣＤ７３との結合に関してフローサイトメトリーによって試験した。ＶＬの４つ全ての非生殖細胞系列アミノ酸は、結合を損なうことなくそれらの生殖細胞系列残基に変えることができた。しかしながら、ＶＨのＲ９４は結合に重要であり、それをＫに変えると結合が損なわれる。変異体ＣＤ７３０００２ ＳＧＭＹ（生殖細胞系列化されていないＶ、完全に生殖細胞系列化されたＶＬ）を親和性最適化抗体変異体の作成の鋳型として使用した。
実施例１０：抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３００１０ＧＬ９の親和性最適化
単一のアミノ酸突然変異を有する変異ＣＤＲ配列を含むＦａｂライブラリをスクリーニングすることにより、ＣＤ７３００１０ＧＬ９ ＩｇＧ１−ＴＭを最適化した。６つのＣＤＲ内の６１個の位置の各々を、個々に１９個のアミノ酸（システインを除く全ての天然アミノ酸）にランダム化し、理論上１１５９個のユニークなクローンの多様性（各位置につき１９個のアミノ酸×６１個の位置）を有するライブラリを作成した。このライブラリの４２２４個のクローンから細菌Ｆａｂ断片を作製し、ヒト及びマウスＣＤ７３タンパク質との結合に関して捕捉ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした（アッセイ２）。親ＣＤ７３００１０ ＧＬ９ ＩｇＧ１−ＴＭと比較して結合シグナルが増加した１８０個のクローンを選択し、ＶＨ又はＶＬドメインの突然変異をＤＮＡシーケンシングによって同定した。細菌上清中のＦａｂ濃度を標準化し、ヒト及びマウスＣＤ７３タンパク質に対する標準化した上清の結合をダイレクトＥＬＩＳＡによって判定した（アッセイ１）。表１２には、選択された有益な単一アミノ酸置換及び組換えＣＤ７３タンパク質との結合に対するそれらの効果を掲載する。
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抗ＣＤ７３抗体の親和性を更に向上させるため、親ＣＤ７３００１０ ＧＬ９と比較したとき結合が向上した幾つかの単一アミノ酸変化を組み合わせてコンビナトリアルＦａｂライブラリを作成した（アッセイ４）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてこのコンビナトリアルライブラリの４２２４個のクローンのＦａｂ断片を作製し、ヒト及びマウスＣＤ７３タンパク質との結合に関して捕捉ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。各スクリーニングアッセイからの上位２０個のクローンを更なる特徴付けに選択した。上清中のＦａｂ濃度を標準化し、標準化した上清の段階希釈物をヒト及びマウスＣＤ７３との結合に関して捕捉ＥＬＩＳＡ及びダイレクトＥＬＩＳＡによって試験した。クローンＣ１、Ｃ２、Ｄ３及びＧ１０は、ヒト及びマウスＣＤ７３に対する強力な結合を示し、更なる特徴付けに選択した。
ＣＤ７３００１０ ＧＬ９の抗原結合も親和性ベースのファージ選択を用いて最適化した。リードＣＤ７３００１０ ＧＬ９配列に由来する大規模ｓｃＦｖライブラリを、記載されるとおりの標準的な分子生物学的技術を用いた可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域３（ＣＤＲ３）又は可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ３のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって作成した（Ｆｉｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＪＭＢ ４１１，７９１−８０７（２０１１））。これらのライブラリを、ビオチン化ヒト及びマウスＣＤ７３細胞外ドメインタンパク質による一連の反復的な交互選択サイクルでパニングした。選択アウトプットのラウンド３からのＳｃＦｖ遺伝子を細菌ＩｇＧ発現ベクターにバッチ変換した。可溶性ＩｇＧを含有する細菌培養上清を、ヒト及びマウスＣＤ７３とのそれらの結合に関してスクリーニングした。親ＣＤ７３００１０ ＧＬ９と比較してＣＤ７３との結合が有意に向上したＩｇＧ変異体をＤＮＡシーケンシングに供した。２つの変異体、ＧＲＶＥ及びＨＰＴを、更なる特徴付けに選択した。
更なる親和性の向上を生じさせるため、コンビナトリアルＦａｂライブラリ及び親和性ベースのファージ選択から同定された有益な突然変異を組み合わせて、変異体７３ｃｏｍｂｏ１〜７３ｃｏｍｂｏ６を作成した。
実施例１１：抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３０００２ＳＧＭＹの親和性最適化
ＣＤ７３００１０ＧＬ９について記載したとおり、単一アミノ酸突然変異を有する変異ＣＤＲ配列を含むＦａｂライブラリをスクリーニングすることによってＣＤ７３０００２ＳＧＭＹ ＩｇＧ１−ＴＭを最適化した。組換えＣＤ７３に対する結合シグナルの増加をもたらしたＶＨドメインの５つのアミノ酸突然変異及びＶＬドメインの４つのアミノ酸突然変異が同定された。表１３には、有益な単一アミノ酸置換及び組換えＣＤ７３との結合に対するそれらの効果を掲載する。
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抗ＣＤ７３抗体ＣＤ７３０００２ＳＧＭＹの親和性を更に向上させるため、ＶＨドメインに１つの有益なアミノ酸変化を有し、且つＶＬドメインに１つの有益なアミノ酸変化を有するＩｇＧ変異体を調製した。２９３Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって抗体変異体を調製し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との結合に関してフローサイトメトリーによってスクリーニングした。クローン２Ｃ５は親ＣＤ７３０００２ＳＧＭＹよりも３倍低いＥＣ５０値を有した。
実施例１２：最適化抗ＣＤ７３抗体の親和性
ヒト、マウス、及びカニクイザルＣＤ７３に対する最適化抗ＣＤ７３抗体（ＩｇＧ１−ＴＭフォーマット）の親和性をフローサイトメトリー及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定した（表１４）。最適化抗体は、これらの３つの種由来の細胞性及び組換えＣＤ７３に対してｐＭ親和性を有した。
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実施例１３：抗ＣＤ７３抗体のインターナリゼーション
細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及び４Ｔ１への抗ＣＤ７３抗体のインターナリゼーションをＦａｂＺＡＰアッセイ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いて評価した。抗ＣＤ７３抗体及びＦａｂＺＡＰ試薬の存在下で細胞株をインキュベートした。３日後、細胞増殖を計測してＥＣ５０値及び最大毒性を計算した（表１５）。ＦＡＣＳデータは、親和性最適化抗体のインターナリゼーション率が低いことを示している。
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別の実験において、抗ＣＤ７３抗体／サポリンコンジュゲートがＣＤ７３陽性細胞株に及ぼす細胞毒性効果を分析することにより、細胞株への抗体のインターナリゼーションを評価した（表１５）。Ｓ−ＨｙＮｉｃ及び４ＦＢケミストリー（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を用いて抗ＣＤ７３抗体をサポリン毒素に直接コンジュゲートし、細胞成長を５０％阻害するために必要な抗体／サポリンコンジュゲート濃度を決定した。
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実施例１４：抗ヒトＣＤ７３抗体、Ｐｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１は、インビトロでＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞増殖のＡＭＰ媒介性抑制を濃度依存的に阻害した。
抗ＣＤ７３抗体（Ｐｈｅｎ０２０３）がインビトロでＡＭＰ媒介性Ｔ細胞抑制を軽減する能力を決定する試験を行った。このインビトロ試験では、抗ヒトＣＤ７３抗体（Ｐｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１）がＣＤ７３によるアデノシン一リン酸からアデノシン及び有機リン酸への触媒作用及び続くＴ細胞機能への影響を阻害する能力を調べた。Ｐｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１は、インビトロでＣＤ７３の細胞性の及び生化学的な酵素活性を阻害する能力を含め、ＭＥＤＩ９４４７と同様の機能特性を有する）。
Ｐｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１抗体は、重鎖定常領域に改変を有しないヒトＩｇＧ１ ｍＡｂである。ＭＥＤＩ９４４７と同様に、この抗体も、ヒトＣＤ７３に選択的に結合して、ヒトＣＤ７３のエクトヌクレオチダーゼ活性による免疫抑制性アデノシンの産生を阻害する。しかしながら、Ｐｈｅｎ０２０３はマウスＣＤ７３に対する交差反応性を欠いている。
ＡＭＰ媒介性Ｔ細胞抑制に関するアッセイでは、白血球コーン（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｏｎｅ）の内容物からＣＤ２５＋細胞が枯渇した初代ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞を単離し、エフェクター細胞として使用した；各コーンは別々に処理した。簡潔に言えば、白血球コーンの内容物をＰＢＳに希釈し、次にＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ Ｇｉｌｅｓ、ＵＫ）に層状に重ね、ブレーキをオフにして４００×ｇで４０分間遠心した。次に界面から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、２００×ｇで１０分間遠心することによりＰＢＳで洗浄した。上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ中に懸濁した。生細胞を決定し、次に３５０×ｇで５分間ペレット化して、５×１０７／ｍＬの濃度でＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）に懸濁した。ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エンリッチメントキット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）及びＲｏｂｏＳｅｐ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、Ｇｒｅｎｏｂｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用したネガティブ選択により、ＰＢＭＣからＣＤ４＋ Ｔ細胞を単離した。精製したＣＤ４＋ Ｔ細胞をペレット化し、１．５×１０７／ｍＬでＲｏｂｏｓｅｐ緩衝液中に再懸濁した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＣＤ２５（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ細胞キットの一構成要素；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を１．５×１０７細胞当たり２００μＬで添加し、連続的に混合しながら４℃で２５分間インキュベートした。次に細胞をＤｙｎａＭａｇ−１５磁石（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）内に１分間置き、ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクター細胞を含有する上清を新しいチューブに移した。
ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥ細胞増殖キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を使用して、単離したエフェクター細胞を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で３７℃で１５分のインキュベーション時間としてＣＦＳＥプローブ（３μＭ）によって標識した。細胞を温Ｘ−Ｖｉｖｏ １５培地で２回洗浄し、同じ培地中に５×１０５細胞／ｍＬで懸濁した。１×１０６細胞当たり２５μＬの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８被覆マイクロビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）及び６０ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２を添加することにより、標識したエフェクター細胞を３７℃で１時間活性化させた。その後、活性化したＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞（１００μＬ中約５０，０００）を滅菌丸底９６ウェルプレートのウェルに添加した。Ｘ−Ｖｉｖｏ １５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）中に以下の試薬の段階希釈を実施した：被験物質Ｐｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１及びＲ３４７対照抗体。
プレート内の細胞に５０μＬの希釈試薬を添加し、続いて４００μＭ又は８００μＭのＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を含有する５０μＬのＸ−Ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）を添加した。以下の対照ウェルも含まれた：活性化ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞、ＡＭＰ無し（活性化対照）；ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞、ＡＭＰ有り、但し被験／対照物質無し（未処理対照）；及び活性化していない（静止対照）ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞、ＡＭＰ無し。このアッセイの細胞を１００×ｇで２分間遠心することにより穏やかにペレット化し、３７℃、５％ＣＯ２の加湿組織培養インキュベーターに７２時間入れた。
７２時間のインキュベーション後、３８０ｇで４分間遠心することにより細胞をペレット化し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＵＫ）で１回洗浄し、最後に、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）でのフローサイトメトリー分析のため、３．７％のホルムアルデヒドを含有する１００μＬのＰＢＳ中に懸濁した。ＡＭＰウェルのない静止ＣＦＳＥ＋ ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を使用して、細胞分裂を起こした細胞（分裂細胞）を同定した。
ＣＤ７３は、一部のＣＤ４＋ Ｔ細胞上に発現することが分かった。細胞外ＡＭＰの存在下では、ＣＤ７３＋ Ｔ細胞は、ＣＤ７３によるＡＭＰからアデノシンへの代謝と、それに続くアデノシン受容体の活性化及び次のＴ細胞機能の調節に関わるパラクリン／オートクリン経路を可能にする潜在的能力を有する。このＣＤ７３／アデノシン経路を、ＴＣＲシグナル伝達及びｒｈＩＬ−２によって活性化した精製ＣＤ４＋ＣＤ２５−初代ヒトＴ細胞を使用してインビトロでモデル化した。１００又は２００μＭの細胞外ＡＭＰの存在下でＴ細胞増殖は抑制された。
抗ヒトＣＤ７３抗体のＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１は、インビトロでＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞増殖のＡＭＰ媒介性抑制を濃度依存的に阻害する能力を有した。このデータは、ＡＭＰ／ＣＤ７３／アデノシン経路の免疫抑制効果を標的化する抗ＣＤ７３抗体手法の科学的論拠を提供する。
実施例１５：ＭＥＤＩ９４４７エピトープ及びパラトープマッピング
ＭＥＤＩ９４４７とＣＤ７３との結合界面を同定するため、ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ及び組換え可溶性ＣＤ７３（ｓＣＤ７３）を単独或いは複合体で用いて水素重水素交換ＭＳ（ＨＤＸ−ＭＳ）分析を実施した（図１９Ａ、図１９Ｂ、及び図２０Ａ〜図２０Ｅ）。近年、水素重水素交換ＭＳ（ＨＤＸ−ＭＳ）は、タンパク質間相互作用部位のマッピング並びにタンパク質構造及びコンホメーションダイナミクスの特徴付けに強力なツールであることが判明している。タンパク質領域の標識が溶媒露出度によって媒介される方法で差次的であることを利用して、ＨＤＸ−ＭＳを用いた抗体エピトープのマッピングが成功を収めている。遊離ＣＤ７３と複合体化したＣＤ７３との間の水素交換の反応速度を比較することにより、Ｆａｂに結合したとき低い重水素取り込みを呈するｓＣＤ７３のＮ末端ドメイン内に位置する２つの領域（アミノ酸（ａａ）１３２〜１４３及び１８２〜１８７）が明らかになった（図１９Ａ、図２０Ａ及び図２０Ｂ）。領域１３２〜１４３（ＨＤＸ＿Ｅ１）は、最も短い曝露時間点においてのみ、取り込みの有意な変化を示した。より長い曝露時間では、交換の違いはなかった。特定の理論に拘束されるものではないが、これは、この部位が溶媒から部分的にのみ保護されていることを示している。対照的に、領域１８２〜１８７（ＨＤＸ＿Ｅ２）における差次的な重水素取り込みの程度は曝露時間と共に増加した。特定の理論に拘束されるものではないが、これは、溶媒露出度を低下させる高親和性タンパク質間相互作用と一致する（図１９Ａ）。Ｆａｂの分析により、ＣＤ７３と複合したとき、重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１及び３、並びに軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２が最も大きい交換の低下を呈したことが示されたことから、これらの領域がパラトープの主要な構成要素であることが示唆される（図２０Ｃ及び図２０Ｄ）。ＣＤ７３ ａａ１３２〜１４３（ＨＤＸ＿Ｅ１）及び１８２〜１８７（ＨＤＸ＿Ｅ２）は配列スペース上不連続であるが、これらはＣＤ７３の折り畳まれた構造上にマッピングしたとき隣接する（図１９Ｂ）。ＣＤ７３内の他の領域に水素交換の差が観察された。しかしながら、質量変化の大部分は、既知の基質結合及び活性部位残基を含むペプチドのものを含め、統計学的に有意でなかった（図１９Ａ及び図２０Ｅ）。
ＨＤＸはポリペプチド骨格溶媒曝露のコンテクスト依存的な変化に関して報告するため、水素交換についてエピトープ−パラトープ界面内の骨格マスキングによるものと、抗体結合によって間接的又はアロステリックに誘導される立体構造変化によるものとの違いを区別する検証が必要である。ＨＤＸ＿Ｅ１及びＨＤＸ＿Ｅ２がＭＥＤＩ９４４７エピトープを構成するかどうかを決定するため、ドメインスワッピングしたキメラＣＤ７３突然変異体に対する抗体結合を評価した（図２１Ａ〜図２１Ｈ及び表１６）。
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ドメインスワッピングは、目的の抗体に結合しない標的タンパク質（即ち、ヒトＣＤ７３）の相同体を使用してキメラを作成し、それらの残基がエピトープを構成することを明らかにする技術である。欠失の導入とは対照的に、相同体間での配列の交換では、タンパク質構造が大域的に破壊されたり、又はタンパク質発現が妨害されたりする可能性が最小限となる。ガルス・ガルス（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）（ニワトリ）ＣＤ７３は成熟ヒトＣＤ７３と約６５％の配列同一性を共有する（図２２）。ヒトＣＤ７３ Ｎ末端ドメイン（ＫＯ＿１〜２９１）又はＮ末端及びＣ末端の両方のドメイン（ＫＯ＿１〜２９１＋３１１〜５２３）を対応するニワトリ配列に置き換えることによってノックアウトしたとき、スワッピングしたキメラのＭＥＤＩ９４４７に対する結合は失われた（図２１Ａ〜図２１Ｈ及び表１６）。Ｃ末端ドメイン（ａａ３１１〜５２３）又はαヘリックスリンカー領域（ａａ２９２〜３１０）のみをノックアウトしたが、野生型（ＷＴ）タンパク質と比較して結合は影響を受けなかった（図２１Ａ、図２１Ｄ、図２１Ｅ及び表１６）。これらの結果は、ＣＤ７３のＮ末端ドメイン内のエピトープ位置と一致する。次に、各ＨＤＸ界面領域を個別に、及び組み合わせで、ノックアウトした。ＫＯ＿ＨＤＸ＿Ｅ１とのＭＥＤＩ９４４７の結合はＷＴ ＣＤ７３と同程度であったが、会合速度ｋａの僅かな低下があった（図２１Ｆ及び表１６）。対照的に、ＫＯ＿ＨＤＸ＿Ｅ２に対する結合親和性は、より速い解離によって促進されて、ＷＴ ＣＤ７３と比べて有意に弱まった（図２１Ｆ及び表１６）。両方の領域をノックアウトすると（ＫＯ＿ＨＤＸ＿Ｅ１＋Ｅ２）、領域Ｅ２単独と比較して結合は少し低下したに過ぎなかった（図２１Ｇ及び表１６）。これらの知見は、領域１８２〜１８７、及びより少ない程度に１３２〜１４３が抗体結合に重要な残基を含むものの、ＨＤＸで同定された界面の外側にある更なる残基がエピトープを構成することを示している。
ＭＥＤＩ９４４７エピトープを完全に定義付けるため、ヒトＣＤ７３のＮ末端ドメインの約７０ａａストレッチを対応するニワトリ配列に置き換えて、配列をスワッピングしたキメラのパネルを作成した（図２２、図２３Ａ及び図２３Ｂ）。領域２（ＤＳ２）又は３（ＤＳ３）のいずれか単独をノックアウトすると結合が減少し、両方の領域を共にスワッピングすると（ＤＳ２＿３）、結合がノックアウトされた（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。領域４（ＤＳ４）又は領域１の一部分（ＤＳ１ａ）（全領域をスワッピングすると発現が妨げられた）をノックアウトしたが、結合は影響を受けなかった（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。約２０〜３０ａａがスワッピングされた領域を含むキメラによる結合解析から、サブ領域ＤＳ２ｄ（ａａ１３５〜１５２）及びＤＳ３ｂ（ａａ１７１〜１８８）が、ＭＥＤＩ９４４７結合に影響を及ぼす残基を含むことが明らかになった（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。サブ領域２ｄの一部分（ＤＳ２ｄｍｏｄ）を領域３ｂとスワッピングしたとき（ＤＳ２ｄｍｏｄ＿３ｂ）、結合は失われた（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。特に、これらの２つのサブ領域は、ＨＤＸ研究によって同定された界面を包含する（図２２）。両方のＨＤＸ領域を共にスワッピングしても結合の消失はなかったという観察から、結合を媒介する更なる残基がサブ領域２ｄ及び３ｂ内にあり、しかしＨＤＸによって同定された部位内にはないことが示される。これらの更なるエピトープ残基をマッピングするため、単一の点突然変異か、又は点突然変異の組み合わせかのいずれか及び領域スワップを含むＣＤ７３キメラのパネルに対する抗体結合を評価した。ニワトリＣＤ７３とヒトＣＤ７３との間で保存されているＨＤＸ界面内の及びそれに空間的に近接した残基に関して、アラニン突然変異誘発も実施した（図２２、図２３Ａ及び図２３Ｂ）。これらの分析から、Ｖ１４４、Ｋ１８０、及びＮ１８５が主要なエピトープ残基であり、Ｎ１８５が最も重要であることが明らかになった（図２３Ａ、図２３Ｂ、及び図２４）。Ｎ１８５Ｇ突然変異をＫ１８０Ａ又はＶ１４４Ｋのいずれかと組み合わせると結合が消失し、一方、Ｋ１８０及びＶ１４４を共に突然変異させると結合の低下が生じた（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。Ｋ１８０に加え、３つの他の保存残基、Ｙ１３５、Ｋ１３６、及びＮ１８７が結合に影響したことが分かったが、程度は低かった（図２３Ａ、図２３Ｂ、及び図２４Ａ）。これらの後者３つの残基の影響を、ドメインスワッピングしたＫＯバックグラウンドのコンテクストでそれらをアラニンに突然変異させることによって明らかにした；唯一の点突然変異として、それらが親和性に与える影響は最小限であるか、又は全くなかった（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。エピトープの重要な構成要素としてのＶ１４４、Ｋ１８０、及びＮ１８５を検証するため、ニワトリＣＤ７３をＶ１４４及びＮ１８５に置き換えた（Ｋ１８０は保存されている）。これらの３つの残基の存在により、ＭＥＤＩ９９４７によるｎＭ以下の親和性での結合性が付与された（ＫＤ＝７９ｐＭ）（図２３Ａ、図２３Ｂ、及び図２４Ｂ）。特定の理論に拘束されるものではないが、これは、ＣＤ７３に対するＭＥＤＩ９４４７の結合が主にこれらの３つのアミノ酸位置によって媒介されることを示している。特に、ＨＤＸ分析によって結合界面の概略的な位置が同定されたが、これらの３つの重要なエピトープ残基のうちの２つは、水素交換の変化を呈するペプチド内に含まれなかったものである（図２０Ａ及び図２０Ｂ）。
同定されたエピトープをＣＤ７３の構造に重ね合わせると、結合部位がＣＤ７３の開いたコンホメーションの頂端、外側面に位置することが示される（図２４Ｃ〜図２４Ｅ）。Ｎ１８５は、Ｋ１８０を含むヘリックスＧから外側に延びるループ領域のＮ末端ドメイン頂端の近傍に位置する（図２４Ｃ）。βストランド６に位置し、且つＫ１８０に隣接して、Ｙ１３５及びＫ１３６がある。Ｖ１４４は、Ｎ１８７と緊密に接触して、βストランド７内に位置する（図２４Ｃ）。集合的には、これらの残基の側鎖は、ほぼ連続する結合表面を形成する（図２４Ｄ）。ＣＤ７３単量体の開いた構造で見ると、エピトープが対向する面の両方にあり、且つ基質結合部位から空間的に離れていることは明らかである（図２４Ｆ）。加えて、この結合部位は、Ｚｎ２＋補因子との相互作用をコーディネートするものを含め、いかなる活性部位残基も包含しない（図２４Ｆ）。特定の理論に拘束されるものではないが、エピトープの位置に基づくと、ＭＥＤＩ９４４７はＡＭＰ結合に関して競合せず、代わりに潜在的なアロステリック機構によってＣＤ７３酵素活性を阻害することが予想された。
実施例１４：ＭＥＤＩ９４４７はＣＤ７３酵素活性を阻害した
ＭＥＤＩ９４４７の阻害様式を特徴付けるため、初めにＭＥＤＩ９４４７又はＣＤ７３の非加水分解性阻害薬、ＡＰＣＰのいずれかの存在下でｓＣＤ７３のＡＭＰ加水分解の反応速度を調べた。ＭＥＤＩ９４４７は、基質濃度に関わらず、Ｖｍａｘの低下（４．５９±０．２６対１．２１±０．０３）から明らかであったとおり、ｓＣＤ７３を非競合的に阻害した（図２５Ａ）。対照的に、ＡＰＣＰでは、ミカエリス定数Ｋｍが増加し（７５．８５±３．３６対２６．０３±３．８７）、しかしＶｍａｘ（３．３５±０．０４対３．５０±０．１１）は低下せず、ＡＰＣＰがＣＤ７３の競合阻害薬であるというこれまでの知見と整合的であった（図２５Ｂ）。これらの結果は、ＭＥＤＩ９４４７がｓＣＤ７３のＡＭＰ加水分解能力を遮断したことを示している。加えて、これらの結果は、ＭＥＤＩ９４４７がＡＭＰ基質の結合を遮断しないことを示しており、これはエピトープの位置と一致する。
次に、ＩｇＧ又はＦａｂのいずれかのフォーマットの漸増濃度のＭＥＤＩ９４４７の関数として、ｓＣＤ７３の阻害を試験した。ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧはｓＣＤ７３活性を用量反応的に阻害し、約１：１のモル比のＩｇＧとｓＣＤ７３二量体とで最大阻害に達した（図２５Ｃ）。しかしながら、ＩｇＧがｓＣＤ７３に対して化学量論的に過剰であった場合、阻害の喪失が観察された（図２５Ｃ）。このいわゆる「フック効果」は、他のイムノアッセイで観察されており、標的抗原上の結合部位の制限に関して競合する同じＩｇＧ分子上のＦａｂアームによって駆動される一価抗体結合によって生じ得る。この観察と一致して、ＦａｂフォーマットのＭＥＤＩ９４４７はｓＣＤ７３活性を阻害しなかった（図２５Ｃ）。これらの結果を合わせると、ｓＣＤ７３機能の阻害にＭＥＤＩ９４４７の二価相互作用が必要であることが示唆される。
実施例１５：ＭＥＤＩ９４４７はＣＤ７３の閉じた状態へのコンホメーション転移を防ぐ
前出のＣＤ７３の構造研究から、ＣＤ７３の酵素活性に「開いた」コンホメーションと「閉じた」コンホメーションとの間での転移が必要であることが明らかになった。開いた状態では、酵素は不活性であり、一方、閉じた状態では活性部位が形成されて、基質の加水分解が可能となる。ヒトＣＤ７３の結晶構造を決定することにより、開いた配座異性体と閉じた配座異性体との間の転移には、Ｎ末端ドメインがＣ末端ドメインに対する位置を変えて活性部位を形成することができるように、αヘリックスリンカー領域の広範な屈曲及び回転が必要であることが示された。２つのＣＤ７３Ｎ末端ドメイン上のＭＥＤＩ９４４７の各Ｆａｂアームの会合が、ＣＤ７３が不活性な開いた状態から触媒活性のある閉じた状態へと転移することを制限する架橋を形成し得たものと仮定された。ＭＥＤＩ９４４７がＣＤ７３コンホメーション転移を阻害するかどうかを試験するため、ＣＤ７３コンホメーションのレポーターとして開発された抗体、ｍＡｂ Ａを利用した。ｍＡｂ Ａの結合界面のマッピングから、それがＣＤ７３のＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの両方と相互作用することが示された（図２６Ａ〜図２６Ｃ）。結合領域の位置を考えると、エピトープがＣＤ７３の開いた配座異性体に存在し得るが、閉じた配座異性体では分断されると仮定された（図２６Ｂ）。これを試験するため、開いた基質遊離型のｓＣＤ７３及び閉じたｓＣＤ７３に対するｍＡｂ Ａの結合を計測した（図２７Ａ〜図２７Ｃ）。閉じたコンホメーションを誘導するため、ｓＣＤ７３をＺｎ２＋及びＡＰＣＰと共にプレインキュベートした；この補因子及び非加水分解性基質は、先にヒトＣＤ７３の閉じた配座異性体の結晶構造の作成に使用されたものである。結合解析から、ｍＡｂ Ａは開いたｓＣＤ７３に結合するが、ＣＤ７３をＺｎ２＋及びＡＰＣＰとプレインキュベートしたとき結合は消失することが示された（図２７Ａ）。特定の理論に拘束されるものではないが、この知見は、ｍＡｂ Ａエピトープが開いた構造のＣＤ７３にのみ存在することと一致する。対照的に、ＭＥＤＩ９４４７結合はＣＤ７３の状態に感受性を有しなかったことから、ＭＥＤＩ９４４７が基質遊離型ＣＤ７３又は結合型ＣＤ７３のいずれにも結合し得ることが示唆される（図２７Ａ）。ｍＡｂ Ａによる結合の喪失は、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰの両方に依存した（図２８Ａ）。ｍＡｂ Ａの結合がＣＤ７３のコンホメーション状態を報告することが確立されたため、次に、ＭＥＤＩ９４４７がＺｎ２＋／ＡＰＣＰの誘導によるＣＤ７３の構造転移に及ぼす効果を試験した。ｍＡｂ Ａは、ＭＥＤＩ９４４７とプレインキュベートしたｓＣＤ７３に結合したことから、これらの２つの抗体が個別的なエピトープに結合することが示唆される（図２７Ｂ）。重要なことには、続いてｓＣＤ７３−ＭＥＤＩ９４４７複合体をＺｎ２＋及びＡＰＣＰとインキュベートしたとき、ｍＡｂ Ａによる結合が維持された（図２７Ｂ）。対照的に、対照ＩｇＧ及びＦａｂフォーマットのＭＥＤＩ９４４７は、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰの添加前にｓＣＤ７３と予め複合体化したとき、ｍＡｂ Ａ結合を回復しなかった（図２８Ｂ）。これらの結果は、二価ＭＥＤＩ９４４７の結合がｓＣＤ７３の開いた状態から完全に閉じた加水分解的に活性なコンホメーションへの転移を防ぐという仮説を裏付ける。ＭＥＤＩ９４４７が結合したときｍＡｂ Ａ結合が部分的にのみ維持されるという観察は、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰによってＣＤ７３が誘導されて、レポーター抗体により低い親和性で結合する触媒的に不活性な中間体をとり得ることを示している（図２７Ｃ）。
実施例１６：ｓＣＤ７３及びＭＥＤＩ９４４７は二量体間架橋複合体を形成した
観察されたＭＥＤＩ９４４７の阻害活性は、Ｎ末端ドメインを介するか、単一のＣＤ７３分子の二量体間架橋、又は別個のＣＤ７３分子の二量体間架橋を介して起こり得た。これらのシナリオを区別するため、溶液中に形成された複合体のサイズを特徴付けた。未結合のＭＥＤＩ９４４７及びＣＤ７３の質量計測値（それぞれ１４５及び１２５キロダルトン（ｋＤ））に基づけば、抗体とＣＤ７３との二量体間架橋１：１複合体の予想サイズは約２７０ｋＤとなる（図２９Ａ）。ＭＥＤＩ９４４７とｓＣＤ７３とが１：１モル比で結合したとき、２つの複合体が形成された。優勢な種は約１．７４メガダルトンの重量平均モル質量（Ｍｗ）を有し、存在量が少ない種は約０．６６ｋＤのＭｗを有した（図３０Ａ）。最も大きい複合体のＭｗは、７個のＣＤ７３二量体及び６個のＩｇＧを含有するオリゴマーと一致する（７×１２５ｋＤ＋６×１５０ｋＤ＝１．７４５メガダルトン）。ＭＥＤＩ９４４７が限られている場合（０．５：１、０．１：１）、同程度のＭｗの複合体が形成されるが、しかし各々の種の存在量の相対的違いはそれほど顕著でない（図３０Ａ）。ＭＥＤＩ９４４７との複合体を、別の抗ＣＤ７３抗体、ｍＡｂ Ｂと形成されたものと比較した。ドメインスワッピングしたＣＤ７３キメラのパネルに対するｍＡｂ Ｂの結合解析から、ｍＡｂ Ｂが、ＣＤ７３のＮ末端ドメイン内の領域に結合することが示され、この領域は、ＭＥＤＩ９４４７とは対照的に、ＣＤ７３単量体間に形成される溝に近接している（図２９Ｂ及び図１９Ｂ）。この内部に位置する表面での結合が、ｍＡｂ ＢのＦａｂアームによるＣＤ７３二量体間の架橋を妨げ得ることが仮定される。実際、ＳＥＣ−ＭＡＬＳでは、ｍＡｂ Ｂが、１：１相互作用について予想されるものに近いＭｗである約２７０〜２９５ｋＤの複合体を形成することが示された（図３０Ｃ）。まとめると、これらの知見は、ＭＥＤＩ９４４７が複数のｓＣＤ７３二量体間に二量体間架橋を形成すること、及びこれらのオリゴマーの生成がエピトープによって付与されることを示している。
実施例１７：ＭＥＤＩ９４４７はアンカー型ＣＤ７３を一価相互作用によって阻害した
ＣＤ７３はインビボで細胞表面からシェディングされ、その可溶性形態で酵素活性を保持するが、天然ＣＤ７３の大部分はＧＰＩアンカー型フォーマットで存在する。このこと、及び前出の研究が可溶性形態のＣＤ７３で行われたことを踏まえて、固定化された状態のＣＤ７３によるＭＥＤＩ９４４７活性を特徴付ける必要があった。組換えＣＤ７３をニッケル被覆マイクロタイタープレート上にＣ末端６ヒスチジンタグで捕捉して、細胞表面上のＧＰＩアンカー型ＣＤ７３のものに類似した方法で空間的に配向した固定化したＣＤ７３の酵素活性のアッセイを可能にした。本発明者らのこれまでの結果と同様に、ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧはＡＭＰ加水分解を用量依存的に阻害した（図３１Ａ）。しかしながら、抗体がＣＤ７３二量体に対してモル過剰であった場合、阻害の喪失、即ちフック効果は観察されなかった（図３１Ａ及び図３２）。予想外にも、ＭＥＤＩ９４４７ ＦａｂもＣＤ７３活性を阻害し、しかしＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧと比較して最大阻害は低かった（図３１Ａ及び図３２）。これらの結果は、可溶性ＣＤ７３と異なり、アンカー型ＣＤ７３が一価抗体相互作用によって阻害され得ることを示している。ＩｇＧとＦａｂとの間の阻害の差から、抗体分子のサイズが効力を左右し得ることが示唆された。これを調べるため、ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂを抗Ｆｄ抗体（ｘＦｄ）と、ｘＦｄ抗体の一方のＦａｂアームがＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂに結合し、且つ他方のアームが非特異的なポリクローナルＦａｂ（ｐＦａｂ）に結合するような条件下でプレインキュベートした（図３１Ｂ）。この複合体の形成により、ＣＤ７３の一価を維持しつつＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂのサイズが有効に増加した。このｘＦｄ結合Ｆａｂは、ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧと同程度にＣＤ７３活性を阻害した（図３１Ａ）。この観察を検証するため、ヒト上皮乳癌細胞株ＭＢＡ−ＭＤ−２３１で、内因的に発現するＣＤ７３の抗体阻害を計測した。固定化した組換えＣＤ７３と同様に、ＧＰＩアンカー型ＣＤ７３はＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧによってロバストに阻害され、ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂによって中程度に阻害され、及びＦａｂをｘＦｄ抗体に予め結合すると、最大阻害がＩｇＧと同等のレベルまで増加した（図３１Ｃ）。最後に、ｘＦｄ抗体の一方又は両方のアームのいずれかに結合したＭＥＤＩ９４４７ ＦａｂによるｓＣＤ７３の阻害を試験した。表面結合型ＣＤ７３と異なり、ｓＣＤ７３は、単一のｘＦｄアームに結合したＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂによって阻害されなかった（図３１Ｄ）。しかしながら、ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂを両方のｘＦｄアームに結合することによって二価性を付与すると、ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧと同程度のｓＣＤ７３阻害がもたらされた（図３１Ｂ及び図３１Ｄ）。これらの知見は、表面アンカー型ＣＤ７３が一価抗体結合によって阻害され得ること、及び効力が抗体のサイズによって媒介されることを示している。これは、二価相互作用を介してのみＭＥＤＩ９４４７によって阻害されるｓＣＤ７３と直接的な対照をなす。
実施例１８：ＭＥＤＩ９４４７は、二重の非競合的作用機構によってＣＤ７３コンホメーション変化及びＡＭＰ加水分解を阻害する
本明細書に記載するとおり、ＣＤ７３の酵素活性を阻害する治療的モノクローナル抗体のエピトープ及び作用機構を決定した。この試験の結果から、２つの個別的な機構を介して阻害を可能にしたＣＤ７３ Ｎ末端ドメイン内の結合部位が明らかになった。重要なことには、この特徴は、可溶性ＣＤ７３及び細胞表面アンカー型ＣＤ７３の両方を非競合的に遮断する能力をＭＥＤＩ９４４７に付与する。
ＨＤＸ−ＭＳを用いて、ＣＤ７３とＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂとの間の結合界面を同定した。ペプシン消化で得られたペプチドが比較的大きかったため、この交換分析によって同定された相互作用部位は比較的広く、２つの非連続ペプチドにわたる合計１８アミノ酸に及んだ。ドメインスワッピング及び突然変異誘発実験から、これらの残基の一部のみが抗体結合に影響を有したこと、及び最も影響力のある３つのアミノ酸のうちの２つ（Ｖ１４４及びＫ１８０）が、差次的な水素交換を呈しなかったペプチド内に含まれたことが示された。この矛盾の１つの説明は、抗体ＣＤＲ残基との接触に起因してＶ１４４及びＫ１８０側鎖が塞がれ得る一方で、重水素との交換を起こす関連するポリペプチド骨格アミド水素原子は比較的溶媒に露出していることがあり得るというものである。ＨＤＸ−ＭＳの結果はまた、ａａ１３２〜１４３で構成される領域が最も短い曝露時間点においてのみ交換反応速度の有意な変化を呈したことも示した。特定の理論に拘束されるものではないが、これにより、この領域における結合が比較的弱いことが示された。実際、この領域内の結合に影響を及ぼすことが分かった２つの残基（Ｙ１３５及びＫ１３６）は、ＭＥＤＩ９９４７親和性に対して僅かな効果しか有しなかった（図２３Ａ及び図２３Ｂ）。対照的に、最も有意な差次的交換があった領域、ａａ１８２〜１８７は、結合に最も重要な残基（Ｎ１８５）を含んだ。共結晶構造がないため、ＭＥＤＩ９４４７との相互作用因子として考慮に入れなかった何らかの残基が実にパラトープとの接触を形成する可能性は正式には排除できない。しかしながら、広範な突然変異体結合解析は、これらの可能性のある残基による結合の熱力学への寄与が最小限であろうことを示している。重鎖ＣＤＲ３が抗原接触部位の形成において重要であるとおり、このＣＤＲが最大の差次的交換を呈した。ＨＤＸ結果はまた、抗原結合に軽鎖、特にＣＤＲ１及び２が重要であることも示した（図２０Ｃ及び図２０Ｄ）。まとめると、これらの結果は、エピトープマッピングにおけるＨＤＸ−ＭＳの有用性並びに突然変異誘発などの直交的な技法によって予想結合界面を検証することの重要性の両方を浮き彫りにする。
ＣＤ７３基質結合及び活性部位残基から離れたＮ末端ドメイン内の位置にエピトープがあることは、ＭＥＤＩ９４４７が非競合的阻害様式を備えることを示す結果と一致する。エピトープ単独のフットプリントに基づくと、抗体が古典的なアロステリック阻害薬としての役割を果たし、加水分解活性を妨げる方法で活性部位残基を歪めるＣＤ７３における大きい範囲にわたるコンホメーション変化を誘導すると仮定し得る。しかしながら、ＨＤＸ−ＭＳデータからは、この形態のアロステリック効果を裏付けるであろう結合界面の外側にある領域のＣＤ７３構造の有意な変化は明らかにならなかった。或いは、このエピトープは、触媒活性に必要なＮ末端ドメイン内のループ、βストランド、又はαヘリックスの動きがＭＥＤＩ９４４７の結合によって制限されることを示唆している可能性がある。これに反して、ＣＤ７３の開いた構造と閉じた構造との間には、Ｎ末端ドメイン内の二次又は三次構造の違いはほとんど乃至全く報告されなかった。確かに起こる局所的なドメイン間コンホメーション変化は、リンカー及びＣ末端ドメインに限られている。
構造変化の誘導に代わるものとして、必要なコンホメーション変化を制限し得る抗体架橋又はＣＤ７３二量体の架橋結合を可能にするのに良好な位置にエピトープがあることが考えられた。この架橋の概念は、可溶性形態のＣＤ７３の阻害にＩｇＧが必要であったこと、及びＭＥＤＩ９４４７が複数のＣＤ７３二量体を含有する複合体を形成することを示すデータによって裏付けられる。この後者の結果は、二量体間架橋を形成しなかったｍＡｂ Ｂと対照的であり、この架橋結合活性の付与におけるＭＥＤＩ９４４７エピトープの重要性が浮き彫りになった。合理的には、２つのＣＤ７３ Ｎ末端ドメインが同じＩｇＧのＦａｂドメインによって結合する場合、酵素がその閉じた活性構造をとるために必要なＮ末端ドメイン及びリンカー領域の動きがそれによって物理的に制限され得る。ＣＤ７３状態のコンホメーションプローブとしての役割を果たすｍＡｂ Ａの使用によって、ＭＥＤＩ９４４７が結合すると、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰによって誘導されるとおりの、ＣＤ７３が完全に閉じた配座異性体をとることが阻害されることが実証された。ＭＥＤＩ９４４７をＣＤ７３と予め複合体化したときのレポーターｍＡｂ Ａによる結合の中間レベルは、Ｚｎ２＋及びＡＰＣＰによってある程度のコンホメーション転移がなおも誘導されることを示している。ｍＡｂ Ａ結合の減少は、そのエピトープがこの中間状態で部分的に歪められるが、結合を生じさせるにはなおも十分であることを反映したものであり得る。ヒンジ領域の高度な可動性を考えると、ＭＥＤＩ９４４７がＣＤ７３二量体を架橋している場合であっても、基質結合に起因してなおも幾らかのＣＤ７３構造変化があり得ることは意外ではない。特定の理論に拘束されるものではないが、結合したＩｇＧが完全に固定されたコンホメーションでＣＤ７３を捕捉することは想定し難い。
この研究の意外な結果は、ＭＥＤＩ９４４７が、二価相互作用による架橋に加え、一価の結合機構で表面結合したときにもＣＤ７３を阻害し得る点である。当初は混乱させるものであったが、アンカー型ＣＤ７３活性の第２の立体的に媒介される遮断機構は、本明細書に記載される観察と一致している。触媒的に活性なＧＰＩアンカー型ＣＤ７３の形成には、Ｎ末端ドメインが細胞表面に近接した位置まで下方に回転する必要がある。天然ＣＤ７３二量体は約１３０ｋＤａである。ＩｇＧ又はＦａｂのサイズ（それぞれ約１５０ｋＤ及び約５０ｋＤ）と比較して、Ｎ末端ドメインに結合した抗体が、ＣＤ７３の閉じたコンホメーションをとるための完全な回転を立体的に遮断し得るとすることは妥当である。この機構は２つの観察によって裏付けられる。第１に、ＦａｂがＩｇＧと比較して低い最大阻害を呈することは、サイズ依存的な立体効果と整合する。Ｆａｂ親和性はなおもｎＭ以下（ＫＤ＝３２７ｐＭ、データは示さず）であるため、ＦａｂとＩｇＧとの相違が結合の違いに起因する可能性は低い。更に、ｘＦｄ抗体とのコンジュゲーションによるＦａｂの有効サイズの増加によって付与される高い効力も、価数又はアビディティでなく、サイズに依存する立体機構を強力に裏付ける。この阻害様式を裏付ける第２の観察は、ＣＤ７３が表面結合したときにフック効果、即ち阻害の喪失が、ＭＥＤＩ９４４７ ＩｇＧによっては観察されなかったことである。恐らくこれは、この抗体がアンカー型ＣＤ７３によるＡＭＰ加水分解を二価又は一価相互作用のいずれによっても遮断し得ることが理由である（図３３）。対照的に、ＣＤ７３が可溶性であるとき、一価結合型ＩｇＧ又はＦａｂがＮ末端ドメインの回転を立体的に遮断するために必要な固相が存在しないため、フック効果が観察される。
従って、ＭＥＤＩ９４４７が、そのエピトープに一体に連結する二重の阻害機構によって可溶性ＣＤ７３及びＧＰＩアンカー型ＣＤ７３の機能をアンタゴナイズするモデルが提案される（図３３）。本明細書に記載される試験は、ＭＥＤＩ９４４７がインビボで可溶性ＣＤ７３及び結合型ＣＤ７３の両方を遮断し得ることを示すが、ＧＰＩアンカー型ＣＤ７３の阻害が一方の機構によるのか、それとも両方の機構によるのかは不明である。恐らくは、細胞表面上のＣＤ７３の密度、配向、及び二量体間距離によって優勢な阻害様式が左右される。ほとんどの癌細胞がＣＤ７３を過剰発現する（これにより二量体が近接する可能性が増加し得る）ことを所与とすれば、ＭＥＤＩ９４４７は二価及び一価相互作用の両方で会合することが予想される。正常な非腫瘍組織では、ＣＤ７３発現は比較的低い面密度であり、ＭＥＤＩ９４４７は主に立体的遮断様式でＡＭＰ加水分解を阻害し得る。
機構的観点からは、ＣＤ７３の遮断は、既に承認済みの薬物があるＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４などの比較し得る標的のものとは異なる免疫腫瘍学的戦略である。治療的見地からは、ＭＥＤＩ９４４７の活性は有利である。ＭＥＤＩ９４４７はＣＤ７３を非競合的に阻害し、従って、活性部位の遮断によって内因性ヌクレオチド結合と競合する必要がない。これにより、構造的に保存されている活性部位を有する他のヌクレオチド／ヌクレオシド結合タンパク質に対する潜在的な交差反応性が回避される。更に、ＭＥＤＩ９４４７は、一価会合又は二価会合のいずれかによって可溶性ＣＤ７３及び膜結合型ＣＤ７３の両方を阻害することができる。これらの特徴は両方ともに、インビボ有効性に寄与するものと思われる。この治療的ｍＡｂは、単独、及び補完的な免疫調節経路を標的化する既存の化学療法剤との併用の両方で、癌の治療に潜在的免疫調節能力を有する。
上記に記載する結果は、以下の材料及び方法を使用して実施した。
アッセイ１：ダイレクトＥＬＩＳＡ
３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートを約１．５ｎｇ／ウェルの組換えＣＤ７３タンパク質でコーティングし、１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳでブロックし、抗体試料と室温で９０分間インキュベートした。これに続いて、ヤギ抗Ｉｇλ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートと室温で３０分間インキュベートした。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質でＨＲＰ活性を検出し、１Ｍ ＨＣｌで反応を停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
アッセイ２：捕捉ＥＬＩＳＡ
３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートを約３ｎｇ／ウェルのヒツジ抗ヒトＦｄ抗体でコーティングし（Ｆａｂフォーマットの抗体をスクリーニングするため）、１％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳでブロックし、試料と室温で９０分間インキュベートした。次にビオチン化ＣＤ７３タンパク質を室温で１時間添加した。これに続いて、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートと室温で３０分間インキュベートした。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質でＨＲＰ活性を検出し、１Ｍ ＨＣｌで反応を停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
約５０ｎｇ／ウェルのビオチン化組換えＣＤ７３を使用して、単一アミノ酸突然変異を有するクローンをスクリーニングした。コンビナトリアルライブラリからのクローンのスクリーニングには、１０ｎｇ／ウェルのビオチン化組換えＣＤ７３を使用した。
アッセイ３：フローサイトメトリー結合アッセイ
フローサイトメトリー実験は全て４℃で行い、試薬はＰＢＳ／１％ＦＢＳ緩衝液中に調製した。１０，０００細胞を５０ｕＬ容積中の被験抗体と４時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｕＬヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲートにおいて１５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ｄａｐｉを補足した緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメーターで分析した。Ｄａｐｉ強染色によって同定される死細胞は分析から除外した。ＫＤ値の決定には、被験抗体濃度の関数としての蛍光強度中央値のプロットを、ワンサイト結合等温線モデルを使用して非線形フィッティングした。
アッセイ４：単一のアミノ酸変化を有する抗体ライブラリの作成
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ多重部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びプライマーを使用して、ＣＤ７３００１０又はＣＤ７３０００２のＣＤＲコドンの部位特異的突然変異誘発を実施した。野生型コドンをコドンＮＮＳに置き換えたプライマーで各コドンを突然変異誘発した。突然変異誘発したＶＨ及びＶＬ遺伝子を細菌発現用のＦａｂベクターにクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）を抗体ライブラリで形質転換し、個々のコロニーをピッキングし、Ｍａｇｉｃ Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において室温で２４時間培養して細菌Ｆａｂ断片を作製した。細菌上清を調製し、それを使用してＥＬＩＳＡ結合アッセイで抗体ライブラリをスクリーニングした。
アッセイ５：コンビナトリアルなアミノ酸変化を有する抗体ライブラリの作成
ＣＤ７３００１０ＧＬ９ ＶＨ及びＶＬ遺伝子を細菌Ｆａｂ発現用のベクターにクローニングした。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ多重部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）又はオーバーラップＰＣＲのいずれか及び縮重プライマーを使用して、ＣＤ７３００１０ＧＬ９のＣＤＲコドンの部位特異的突然変異誘発を実施した。縮重プライマーは、同じ位置に選択のアミノ酸変化並びに親アミノ酸をコードするように設計した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）をＦａｂライブラリで形質転換し、個々のコロニーをＭａｇｉｃ Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において室温で２４時間培養して細菌Ｆａｂ断片を作製した。細菌上清を使用して、ＥＬＩＳＡ結合アッセイで抗体ライブラリをスクリーニングした。
アッセイ６：ＦａｂＺＡＰアッセイ
９６ウェルプレートにおいてＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中で１，０００細胞／ウェルを培養した。５ｎＭで開始した抗ＣＤ７３抗体の段階希釈物をＦａｂＺＡＰ試薬（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）と混合し、細胞に加えた。３７℃で３日間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて細胞増殖を計測した。
以下のアッセイ（アッセイ７〜１１）は、以下のＣＤ７３及び抗体試薬を使用して実施した。
組換え成熟ヒトＣＤ７３（アミノ酸位置１〜５２６）をコードする哺乳類発現ベクタープラスミドを構築した（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）。可溶性の分泌型ＣＤ７３の発現を実現するため、ＧＰＩアンカーシグナルペプチドを除去し、Ｃ末端６ｘ−ヒスチジンタグに置き換えた。ＣＤ７３配列の付番はシグナルペプチドのない成熟タンパク質に基づく（ヒトＮＴ５Ｅ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００２５１７．１）。コドン最適化ニワトリＣＤ７３ ＤＮＡ配列（ニワトリＮＴ５Ｅ、ＮＣＢＩ参照配列ＸＰ＿００４９４０４５３．１）をコードする合成ＤＮＡ ｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ，Ｉｎｃ．）を使用して、組換えヒト／ニワトリキメラドメインスワッピング「ノックアウト」（ＫＯ）突然変異体をコードするプラスミドを作成した。ヒトＣＤ７３タンパク質配列とのアラインメントに基づけば、ニワトリＮ末端ドメインを含むコンストラクトのアミノ酸コード位置１位は、予想シグナルペプチドを含む未成熟ニワトリＣＤ７３の２０位に対応する。完全長ＫＯ ＤＮＡコンストラクトをｇＢｌｏｃｋｓのシングルオーバーラップ伸長ＰＣＲ及びヒトＣＤ７３のＰＣＲアンプリコンによって作製した。全てのコンストラクトがＣ末端６ｘヒスチジンタグを含んだ。Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ多重部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した部位特異的突然変異誘発によって、ヒト及びキメラコンストラクトに単一及び複数の点突然変異を作製した。ＣＤ７３コンストラクトは全て、懸濁ＨＥＫ２９３細胞で発現させた。ヒスチジンタグ付加野生型ヒトＣＤ７３（ＧＰＩアンカーシグナル配列を欠いている）が、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＳｃｉｅｎｃｅｓグループによってＨｉｓＴｒａｐニッケルアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製された。タンパク質は溶液中で二量体であることが確認され、モル質量は約１２５ｋＤａであった（図１８Ａ及び図１８Ｂを参照）。突然変異ＣＤ７３コンストラクトは全て、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して懸濁ＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクトすることにより発現させた。細胞は２４ウェルディープウェルブロック内の無血清２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で成長させ、トランスフェクトした。トランスフェクションの６日後に粗細胞上清を回収し、０．４５μｍフィルタでろ過して細胞残屑を除去してから使用した。Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＨＩＳ２バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対するヒスチジンタグ付加タンパク質の結合を計測することにより、ＣＤ７３変異体の上清濃度を決定した。濃度は、Ｏｃｔｅｔデータ分析ソフトウェアを使用して、既知の濃度の精製組換え６ｘ−ヒスチジンタグ付加ヒトＣＤ７３の希釈物から作成した標準曲線と結合シグナルを比較することにより計算した。ＭＥＤＩ９４４７（ヒトＩｇＧ１及びマウスＩｇＧ１フォーマット）、ｍＡｂ Ａ（ヒトＩｇＧ１）、及びｍＡｂ Ｂ（ヒトＩｇＧ１）及びＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ（ヒトＩｇＧ１）の発現及び精製は、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎグループによって行われた。ＩｇＧは哺乳類細胞で発現させて、プロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂの作成には、１０ｍｇのＩｇＧを固定化したパパイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３７℃で５時間消化し、ＨｉＴｒａｐ Ｑカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦａｂを精製した。
アッセイ７：ＨＤＸ−ＭＳ分析
組換えヒトＣＤ７３及びＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ試料を２ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。ＣＤ７３＋Ｆａｂ複合体を、１：１の濃度比でプレインキュベートすることにより形成した。ＨＤＸ実験全体は、Ｌｅａｐ自動ロボットを備えたＷａｔｅｒｓ ＨＤＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。簡潔に言えば、１．２５μＬのタンパク質試料を２０℃でＨ２Ｏ又はＤ２Ｏ緩衝液（１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．０）のいずれかによって２０倍希釈した。種々のインキュベーション時間（非重水素化実験については０秒又は重水素化実験については０．５、１、５、１０、３０、６０、及び１２０分）の後、４．０Ｍ グアニジンＨＣｌ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、５００ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐＨ２．４の等容積の氷冷溶液を添加することにより、標識した試料をクエンチした。その直後に、２０℃でＰｏｒｏｓｚｙｍｅ固定化ペプシンカートリッジ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して試料を消化した。消化断片を回収し、ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８ ＶａｎＧｕａｒｄプレカラム（２．１×５ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用して脱塩し、０℃でＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ、１．０×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）に溶出した。カラムで分離されたペプチドをＳＹＮＡＰＴ Ｇ２質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）によって分析した。データ解析のため、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してペプチドを同定し、各標識時間からの各消化ペプチドの重水素取り込みレベルを、ＤｙｎａｍＸ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して計算した。各タンパク質につき４つの非重水素化実験及び３つの完全なＨＤＸ実験を実施した。以前の記載どおり実験の不確かさ及び９８％信頼区間を用いて有意差の値（±１．６ダルトン）を計算し、但し、個々の標準偏差の平均値の代わりに、標準偏差のプールした分散を使用した。ＣＤ７３＋Ｆａｂ複合体とＣＤ７３との間の相対取り込み率をＤｙｎａｍＸソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ）によって求め、構造をモデル化するためＰｙＭＯＬ（Ｓｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ，Ｉｎｃ．）にエクスポートした。ＰｙＭｏｌ並びに開いた及び閉じたＣＤ７３コンホメーションの既報告の結晶構造（それぞれＰＤＢ参照番号４Ｈ２Ｆ及び４Ｈ２Ｉ）を使用して、ヒトＣＤ７３の全ての構造図を作成した。
アッセイ８：ＳＰＲ及びＢＬＩ結合解析
野生型及び突然変異ＣＤ７３タンパク質に対するＭＥＤＩ９４４７の結合を、ＰｒｏｔｅＯｎ機器（ＢｉｏＲａｄ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって計測した。ＣＤ７３粗細胞上清タンパク質試料を、ＰＢＳ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４（ＢｉｏＲａｄ）中３μｇ／ｍｌに希釈し、１０ｍＭ ＮｉＳＯ４、１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０（ＢｉｏＲａｄ）で予め活性化したＨＴＧトリス−ＮＴＡセンサーチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に約４００ＲＵとなるように固定化した。非トランスフェクト細胞からの等しく希釈した粗細胞上清試料を参照チャネル対照として含めた。５ｎＭ〜０．３１ｎＭの範囲の、ＰＢＳ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４中に調製したＭＥＤＩ９４４７の２倍希釈物を流すことにより、センサーグラムを記録した。場合によっては、ＭＥＤＩ９４４７との結合が弱かったＣＤ７３変異体について、抗体希釈は２０ｎＭ〜１．２５ｎＭの範囲であった。３分の会合相及び２０分の解離相として１００μＬ／分の流量で抗体結合を計測した。各ランの間に、３００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５（ＢｉｏＲａｄ）を３０μＬ／分の流量で８００秒間注入してセンサーチップ表面を再生させた。結合反応速度はＰｒｏｔｅＯｎデータ分析ソフトウェアを使用して分析した。二重参照を行い、且つ特に注記しない限り、データのフィッティングには１：１ラングミュア結合モデルを利用した。アミノ酸領域１７１〜１８８内に突然変異を含む一部のＣＤ７３変異体は１：１モデルに対する適合性が低い（即ち、Ｃｈｉ２値＞Ｒｍａｘの１０％）。注記される場合、これらの変異体は異種抗原（２：１）モデルでフィッティングした。ＭＥＤＩ９４４７は親和性が高く（約４ｐＭ）、且つＰｒｏｔｅＯｎの感度は限られているため、ＣＤ７３変異体に対するＭＥＤＩ９４４７結合を比較する際には、２倍を超える反応速度計測値の変化のみを有意味なものと見なした。アッセイフォーマット（固定化した抗原）及びＣＤ７３の二量体状態に起因して、アビディティ効果によりＫＤ値が誇張され得る。しかしながら、これが種々のＣＤ７３変異体に対するＭＥＤＩ９４４７結合のランク付けに影響することはないものと予想される。
抗ＣＤ７３抗体ｍＡｂ Ａ及びｍＡｂ Ｂの結合のホットスポットのマッピングを、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４機器を使用したＢＬＩによって実施した。タンパク質は全て、１×Ｋｉｎｅｔｉｃｓ緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に調製した。粗細胞上清からの、Ｃ末端にヒスチジンタグを付加したＣＤ７３変異体を６μｇ／ｍｌに希釈し、０．８ｎｍの結合反応閾値となるようにＨＩＳ２バイオセンサーに固定化した。３００秒のベースラインステップの後、センサーを３０ｎＭの抗体に浸漬した。会合時間及び解離時間は６００秒であった。データ分析時のバックグラウンド結合サブトラクションのため、非トランスフェクト細胞上清参照対照を含めた。ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用してデータを処理し、グラフを作成した。
アッセイ９：ＣＤ７３酵素活性アッセイ
ＣＤ７３触媒によるＡＭＰからアデノシン及び無機リン酸塩への加水分解を、無機リン酸塩の定量化（マラカイトグリーンアッセイ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＡＭＰによって阻害されるルシフェリンのＡＴＰ依存性酸化の計測（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイ；Ｐｒｏｍｅｇａ）のいずれかによって分析した。データグラフ及び酵素反応速度計測値（ミカエリス・メンテンの非線形回帰）はＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して作成した。実験はデュプリケート又はトリプリケートのいずれかで実施した。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを用いた可溶性組換えＣＤ７３の計測については、４００ｐＭの組換えＣＤ７３及び種々の濃度の抗ＣＤ７３抗体をアッセイ緩衝液（２５ｍＭトリス ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中３７℃で１時間インキュベートし、その後、等容積の２００μＭ ＡＭＰ／６００μＭ ＡＴＰ（アッセイ緩衝液中）を添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを製造者の指示に従い使用して、試料中のＡＭＰ濃度を決定した。
マラカイトグリーンアッセイを用いた可溶性組換えＣＤ７３の計測については、１ｎＭの組換えＣＤ７３及び１ｎＭ抗体又は４０μＭアデノシン５’−（α，β−メチレン）二リン酸（ＡＰＣＰ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかをアッセイ緩衝液（２５ｍＭトリス ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中室温で１時間インキュベートした。アッセイ緩衝液中の等容積の４００μＭ ＡＭＰ（抗ＣＤ７３抗体について）又は３ｍＭ ＡＭＰ（ＡＰＣＰについて）を添加し、試料を室温で１５分間インキュベートした。マラカイトグリーンアッセイを製造者の指示に従い使用して、無機リン酸塩の濃度を決定した。
固定化組換えＣＤ７３の計測については、１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡを補足したアッセイ緩衝液（２５ｍＭトリス ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中１００ｎｇ／ｍＬの５０μＬ ＣＤ７３をニッケル被覆プレート（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に固定化した。未結合のＣＤ７３を洗浄して取り除き、５０μＬの抗ＣＤ７３抗体（アッセイ緩衝液中）を添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを再び洗浄し、１００μＬの５００μＭ ＡＭＰ（アッセイ緩衝液中）を添加して、試料を室温で１５分間インキュベートした。マラカイトグリーンアッセイを製造者の指示に従い使用して、無機リン酸塩の濃度を決定した。固定化ＣＤ７３及び可溶性ＣＤ７３の両方による一部の実験では、抗ＣＤ７３抗体（ＩｇＧ及びＦａｂ）は、１０倍モル過剰のポリクローナルヒトＦａｂ断片（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及び１００倍モル過剰のヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｄ）（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に少なくとも２時間プレインキュベートした後にＣＤ７３に添加した。
培養細胞における内因性ＣＤ７３活性の計測については、９６ウェルプレート内のＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にウェル当たり２０，０００個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をプレーティングした。一晩インキュベートした後、ウェルを無血清ＲＰＭＩで３回洗浄し、５０μＬの抗体（無血清ＲＰＭＩ中）を添加した。３７℃で３０分間インキュベートした後、各ウェルに２５μＬの１．２ｍＭ ＡＭＰ（無血清ＲＰＭＩ中）を添加した。プレートを３７℃で３時間インキュベートした。２５μＬの細胞上清と２５μＬの１００ｍＭ ＡＴＰとを混合し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏアッセイを製造者の指示に従い使用して、試料中のＡＭＰ濃度を決定した。
アッセイ１０：ＣＤ７３コンホメーション転移のｍＡｂ Ａレポーターアッセイ
精製組換えヒトＣＤ７３に対するＭＥＤＩ９４４７及びｍＡｂ Ａの結合をＯｃｔｅｔ ＱＫ３８４機器で実施した。ｍＡｂ Ａ及びＭＥＤＩ９４４７の結合を比較するため、ＣＤ７３をＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋０．５％ウシ血清アルブミン（ＰＢＳＢ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中６μｇ／ｍＬに希釈し、１．０ｎｍの結合シグナル閾値となるようにＨＩＳ２バイオセンサーにロードした。次にバイオセンサーをＰＢＳＢ単独又はＰＢＳＢと１０μＭ ＺｎＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＡＰＣＰ、及び／又は２ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかに移し、１５分間インキュベートした。次に、バイオセンサーをＰＢＳＢ中３０ｎＭに希釈したＭＥＤＩ９４４７又はｍＡｂ Ａを含有するＰＢＳＢに移し、抗体の会合を１０分間計測した。
ＭＥＤＩ９４４７がＺｎＣｌ２及びＡＰＣＰの存在下でＣＤ７３コンホメーション転移に及ぼす効果を調べるため、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１０μｇ／ｍＬに希釈したｍＡｂ Ａを抗ヒトＦｃ ＡＨＣバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ／Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に固定化した。４００秒間の固定化ステップの後、バイオセンサーをＰＢＳ、ｐＨ７．４中５０μｇ／ｍＬの非特異的ポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で１０分間ブロックした。４分間のベースラインステップの後、ＰＢＳ単独、又は１０μＭ ＺｎＣｌ２及び／又は０．５ｍＭ ＡＰＣＰを含有するＰＢＳ中２５０ｎＭ（二量体の分子量基準）に希釈したＣＤ７３が入ったウェルにおいてバイオセンサーを６００秒間インキュベートすることにより、ｍＡｂ Ａ結合を計測した。ＣＤ７３に結合したＭＥＤＩ９４４７を含む試料については、ＰＢＳ中２５０ｎＭに希釈したマウスＩｇＧ１バージョンのＭＥＤＩ９４４７（抗ヒトＦｃバイオセンサーとの結合を回避するために使用した）をＣＤ７３と共に室温で１５分間プレインキュベートし、その後、ＺｎＣｌ２及びＡＰＣＰと共にインキュベートした。ＭＥＤＩ９４４７ Ｆａｂ及びマウスアイソタイプ対応対照ＩｇＧ１（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅで作成された）は５００ｎＭで試験した。全てのアッセイステップの振盪速度は１０００ｒｐｍであった。結合解析及びデータグラフはＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用して作成した。
アッセイ１１：ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析
ＣＤ７３及びＭＥＤＩ９４４７又はｍＡｂ Ｂで形成された複合体を分析する実験については、９００ピコモルのＣＤ７３を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に希釈した９００、４５０、９０、又は０ピコモルの抗体とインキュベートした。９００ピコモルの抗体のみの別個の試料も調製した。試料を室温で３０分間インキュベートし、次に１００μＬの各試料を、ＨＰ １１００ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）でＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＷｘＬ ５μｍ、７．８８ｍｍ×３０ｃｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＬＬＣ）を使用して、１ｍＬ／分の流量で２０分間分離した。試料ランニング緩衝液は０．１Ｍ ＮａＰｉ、０．１Ｍ ＮａＳＯ４、ｐＨ６．８であった。ＨＰＬＣ分離後、全ての試料をＤａｗｎ Ｈｅｌｅｏｓ ＩＩ ＭＡＬＳ検出器及びＯｐｔｉｌａｂ Ｔ−ｒＥｘ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ）を使用して分析した。データはＡｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ）を使用して分析した。
具体的な態様の前出の説明は、本発明の一般的性質を十分に完全に明らかにするものであり、従って第三者が、当該技術分野の範囲内の知識を適用することにより、本発明の一般的概念から逸脱することなく、過度の実験を行うことなしにかかる具体的な態様を容易に改良し及び／又はそれを様々な適用に適合させることができる。従って、かかる適合形態及び改良形態は、本明細書に提供される教示及び指針に基づけば、開示される態様の均等物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書における用語法又は表現法は、限定ではなく、説明を目的とするものであり、従って本明細書の用語法又は表現法は当業者によって教示及び指針を踏まえて解釈されるべきであることが理解されなければならない。本発明の様々な態様を以下に示す。
１．抗体ＶLを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片であって、前記ＶLが、アミノ酸配列：
［ＦＷ1］ＳＧＳＬＳＮＩＧＲＮＸ1ＶＮ［ＦＷ2］ＬＸ2ＮＸ3ＲＸ4Ｘ5［ＦＷ3］ＡＴＷＤＤＳＸ6Ｘ7ＧＷＸ8［ＦＷ4］
（式中、［ＦＷ1］、［ＦＷ2］、［ＦＷ3］及び［ＦＷ4］はＶLフレームワーク領域を表し、ここで、Ｘ1はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、Ｘ2はアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ3はアミノ酸残基グルタミン（Ｑ）又はロイシン（Ｌ）を表し、
Ｘ4はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はプロリン（Ｐ）を表し、
Ｘ5はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ6はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はヒスチジン（Ｈ）を表し、
Ｘ7はアミノ酸残基リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）又はアスパラギン（Ｎ）を表し、及び
Ｘ8はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はスレオニン（Ｔ）を表す）を含む、単離結合分子又はその抗原結合断片。
２．ＦＷ1が配列番号２５又は２６を含み、ＦＷ2が配列番号２７又は２８を含み、ＦＷ3が配列番号２９を含み、及びＦＷ4が配列番号３０を含む、上記１に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
３．抗体ＶＨを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片であって、前記ＶHが、アミノ酸配列：
［ＦＷ5］ＳＹＡＸ9Ｓ［ＦＷ6］Ｘ10ＩＸ11ＧＳＸ12ＧＸ13ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［ＦＷ7］ＬＧＹＸ14Ｘ15Ｘ16ＤＸ17［ＦＷ8］
（式中、［ＦＷ5］、［ＦＷ6］、［ＦＷ7］及び［ＦＷ8］はＶＨフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ9はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ10はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）を表し、
Ｘ11はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ12はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はグリシン（Ｇ）を表し、
Ｘ13はアミノ酸残基セリン（Ｓ）又はアルギニン（Ｒ）を表し、
Ｘ14はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ15はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はスレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ16はアミノ酸残基バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）を表し、及び
Ｘ17はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）又はグルタミン酸（Ｅ）を表す）を含む、単離結合分子又はその抗原結合断片。
４．ＦＷ5が配列番号３１を含み、ＦＷ6が配列番号３２を含み、ＦＷ7が配列番号３３を含み、及びＦＷ8が配列番号３４を含む、上記３に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
５．抗体ＶL及び抗体ＶHを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片であって、前記ＶLが、アミノ酸配列：
［ＦＷ1］ＳＧＳＬＳＮＩＧＲＮＸ1ＶＮ［ＦＷ2］ＬＸ2ＮＸ3ＲＸ4Ｘ5［ＦＷ3］ＡＴＷＤＤＳＸ6Ｘ7ＧＷＸ8［ＦＷ4］
（式中、［ＦＷ1］、［ＦＷ2］、［ＦＷ3］及び［ＦＷ4］はＶLフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ1はアミノ酸残基プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ2はアミノ酸残基アスパラギン（Ｎ）又はアスパラギン酸（Ｄ）を表し、
Ｘ3はアミノ酸残基グルタミン（Ｑ）又はロイシン（Ｌ）を表し、
Ｘ4はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はプロリン（Ｐ）を表し、
Ｘ5はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ6はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はヒスチジン（Ｈ）を表し、
Ｘ7はアミノ酸残基リジン（Ｋ）、プロリン（Ｐ）、イソロイシン（Ｉ）又はアスパラギン（Ｎ）を表し、及び
Ｘ8はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はスレオニン（Ｔ）を表す）を含み、前記ＶHが、アミノ酸配列：
［ＦＷ5］ＳＹＡＸ9Ｓ［ＦＷ6］Ｘ10ＩＸ11ＧＳＸ12ＧＸ13ＴＹＹＡＤＳＶＫＧ［ＦＷ7］ＬＧＹＸ14Ｘ15Ｘ16ＤＸ17［ＦＷ8］
（式中、［ＦＷ5］、［ＦＷ6］、［ＦＷ7］及び［ＦＷ8］はＶＨフレームワーク領域を表し、ここで、
Ｘ9はアミノ酸残基メチオニン（Ｍ）又はチロシン（Ｙ）を表し、
Ｘ10はアミノ酸残基ロイシン（Ｌ）又はアラニン（Ａ）を表し、
Ｘ11はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ12はアミノ酸残基トリプトファン（Ｗ）又はグリシン（Ｇ）を表し、
Ｘ13はアミノ酸残基セリン（Ｓ）又はアルギニン（Ｒ）を表し、
Ｘ14はアミノ酸残基グリシン（Ｇ）又はセリン（Ｓ）を表し、
Ｘ15はアミノ酸残基アルギニン（Ｒ）又はスレオニン（Ｔ）を表し、
Ｘ16はアミノ酸残基バリン（Ｖ）又はイソロイシン（Ｉ）を表し、及び
Ｘ17はアミノ酸残基チロシン（Ｙ）、リジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、ロイシン（Ｌ）又はグルタミン酸（Ｅ）を表す）を含む、単離結合分子又はその抗原結合断片。
６．ＦＷ1が配列番号２５又は２６を含み、ＦＷ2が配列番号２７又は２８を含み、ＦＷ3が配列番号２９を含み、ＦＷ4が配列番号３０を含み、ＦＷ5が配列番号３１を含み、ＦＷ6が配列番号３２を含み、ＦＷ7が配列番号３３を含み、及びＦＷ8が配列番号３４を含む、上記５に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
７．抗体又はその抗原結合断片を含む、上記１〜６のいずれかに記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
８．抗体ＶLを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片であって、前記ＶLが、それぞれ、配列番号４６、４９及び５３；配列番号４７、４９、及び５３；配列番号４７、４９、及び５４；配列番号４６、５０、及び５４；配列番号４６、５１、及び５５；配列番号４８、５２、及び５４；配列番号４６、４９、及び５６；配列番号４７、４９、及び５６；配列番号４６、５０、及び５６；配列番号４６、５１、及び５６；又は配列番号４８、５２、及び５６と同一であるか、又はＶＬ−ＣＤＲの１つ以上における４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一であるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、単離結合分子又はその抗原結合断片。
９．抗体ＶHを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片であって、前記ＶHが、それぞれ、配列番号３５、３７及び４１；配列番号３６、３７、及び４２；配列番号３６、３８、及び４３；配列番号３６、３９、及び４４；配列番号３６、４０、及び４４；配列番号３５、３７、及び４５；配列番号３６、３７、及び４５；配列番号３６、３８、及び４５；配列番号３６、３９、及び４５；又は配列番号３６、４０、及び４５と同一であるか、又はＶＨ−ＣＤＲの１つ以上における４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一であるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、単離結合分子又はその抗原結合断片。
１０．抗体又はその抗原結合断片を含む、上記８又は９に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
１１．配列番号４６、４９、５３、３５、３７、及び４１；配列番号４７、４９、５３、３５、３７、及び４１；配列番号４７、４９、５４、３６、３７、及び４２；配列番号４６、５０、５４、３６、３８、及び４３；配列番号４６、５１、５５、３６、３９、及び４４；配列番号４８、５２、５４、３６、４０、及び４４；配列番号４６、４９、５６、３５、３７、及び４１；配列番号４６、４９、５３、３５、３７、及び４５；配列番号４７、４９、５６、３６、３７、及び４５；配列番号４６、５０、５６、３６、３８、及び４５；配列番号４６、５１、５６、３６、３９、及び４５；配列番号４８、５２、５６、３６、４０、及び４５；又は配列番号４６、４９、５６、３５、３７、及び４５と同一であるか、又は１つ以上のＣＤＲにおける４、３、２、若しくは１個のアミノ酸置換を除いてそれと同一であるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＲＤ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むＶL及びＶHを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片。
１２．抗体又はその抗原結合断片を含む、上記１１に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
１３．配列番号６８を含むＶLと配列番号８２を含むＶHとを含む、単離抗体又はその抗原結合断片。
１４．配列番号６８から本質的になるＶLと配列番号８２から本質的になるＶHとを含む、単離抗体又はその抗原結合断片。
１５．配列番号６８からなるＶLと配列番号８２からなるＶHとを含む、単離抗体又はその抗原結合断片。
１６．重鎖定常領域又はその断片を含む、上記７に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
１７．重鎖定常領域又はその断片を含む、上記１０に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
１８．重鎖定常領域又はその断片を含む、上記１１〜１５のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
１９．上記７又は１０〜１８のいずれかに記載の単離抗体又はその抗原結合断片をコードする配列を含む核酸。
２０．上記１９に記載の核酸配列を含む宿主細胞。
２１．上記７又は１０〜１８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、（ａ）上記２０に記載の細胞を培養するステップと、（ｂ）前記抗体又はその抗原結合断片を単離するステップとを含む方法。
２２．ＣＤ７３のアンタゴニストである、上記７に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
２３．ＣＤ７３のアンタゴニストである、上記１０に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
２４．ＣＤ７３のアンタゴニストである、上記１１〜１５のいずれかに記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
２５．前記ＣＤ７３がヒトＣＤ７３である、上記２２に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
２６．前記ＣＤ７３がヒトＣＤ７３である、上記２３に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
２７．前記ＣＤ７３がヒトＣＤ７３である、上記２４に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
２８．癌の治療用医薬の製造における、上記７〜２７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
２９．前記癌が、結腸直腸癌、膵癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、及び乳癌からなる群から選択される、上記２８に記載の使用。
３０．参照と比べてＣＤ７３の発現が増加した腫瘍を有すると同定された対象を治療するための医薬の製造における、抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片の使用。
３１．前記抗ＣＤ７３抗体がＭＥＤＩ９４４７又はＰｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１である、上記３０に記載の使用。
３２．前記対象が、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法を受けているか、受けたことがあるか、又は受ける予定である、上記３０又は３１に記載の使用。
３３．前記抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法が、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、若しくは抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む、上記３２に記載の使用。
３４．前記抗ＰＤ−１抗体が、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ランブロリズマブ、ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＡ（登録商標）、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８）、ＡＭＰ−２２４、又はその抗原結合断片である、上記３３に記載の使用。
３５．前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９、若しくはＭＰＤＬ３２８０Ａ又はその抗原結合断片である、上記３３に記載の方法。
３６．前記抗ＣＴＬＡ−４抗体が、イピリムマブ、トレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）、又はその抗原結合断片である、上記３３に記載の方法。
３７．有効量の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片とを含む医薬製剤。
３８．前記抗ＣＤ７３抗体が、ＭＥＤＩ９４４７、Ｐｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１、又はその抗原結合断片である、上記３７に記載の医薬製剤。
３９．前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＭＥＤＩ４７３６、ＢＭＳ−９３６５５９、若しくはＭＰＤＬ３２８０Ａ、又はその抗原結合断片である、上記３７又は３８に記載の医薬製剤。
４０．有効量の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合断片とを含む医薬製剤。
４１．前記抗ＣＤ７３抗体が、ＭＥＤＩ９４４７、Ｐｈｅｎ０２０３ ｈＩｇＧ１、又はその抗原結合断片である、上記４０に記載の医薬製剤。
４２．前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、イピリムマブ若しくはトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）、又はその抗原結合断片である、上記４０又は４１に記載の医薬製剤。
４３．抗体ＶL及び抗体ＶHを有する、ＣＤ７３に特異的に結合する単離結合分子又はその抗原結合断片であって、Ｖａｌ１４４、Ｌｙｓ１８０、及びＡｓｎ１８５に対応する１つ以上のアミノ酸を含むＣＤ７３タンパク質のエピトープに特異的に結合する、単離結合分子又はその抗原結合断片。
４４．Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、及びＡｓｎ１８７に対応する１つ以上のアミノ酸を更に含む、上記４３に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
４５．Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、及びＡｓｎ１８７に対応する前記アミノ酸を含む、上記４３又は４４に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
４６．Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、Ａｓｎ１８５、Ｔｙｒ１３５、Ｌｙｓ１３６、及びＡｓｎ１８７に対応する前記アミノ酸を含む、上記４３又は４４に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
４７．ＣＤ７３タンパク質の以下の領域：Ｔｙｒ１３２〜Ｖａｌ１４４及び／又はＬｙｓ１８０〜Ａｓｎ１８７のうちの１つ以上におけるエピトープと結合する、上記４３又は４４に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
４８．Ｔｙｒ１３２〜Ｖａｌ１４４及び／又はＬｙｓ１８０〜Ａｓｎ１８７におけるアミノ酸配列を含む、上記４３又は４４に記載の単離結合分子又はその抗原結合断片。
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Claims (19)

  1. 抗体ＶL及び抗体ＶHを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＶLが、配列番号６８を含むアミノ酸配列を含み、前記ＶHが、配列番号８２を含むアミノ酸配列を含む、単離抗体又はその抗原結合断片。
  2. ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、ＶＬ−ＣＤＲ３、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３を含むＶL及びＶHを含む、ＣＤ７３に特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、ＶＬ−ＣＤＲ１が配列番号４６を含み、ＶＬ−ＣＤＲ２が配列番号５１を含み、ＶＬ−ＣＤＲ３が配列番号５６を含み、ＶＨ−ＣＤＲ１が配列番号３６を含み、ＶＨ−ＣＤＲ２が配列番号３９を含み、ＶＨ−ＣＤＲ３が配列番号４５を含む、単離抗体又はその抗原結合断片。
  3. 重鎖定常領域又はその断片を含む、請求項１又は２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  4. ＣＤ７３のアンタゴニストである、請求項１又は２に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  5. 前記ＣＤ７３がヒトＣＤ７３である、請求項４に記載の単離抗体又はその抗原結合断片。
  6. 有効量の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片とを含む医薬製剤であって、前記抗ＣＤ７３抗体が、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片である、医薬製剤。
  7. 有効量の抗ＣＤ７３抗体又はその抗原結合断片と、抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合断片とを含む医薬製剤であって、前記抗ＣＤ７３抗体が、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片である、医薬製剤。
  8. ＣＤ７３に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む、それを必要としている対象におけるＣＤ７３関連癌を治療するための医薬組成物であって、前記抗体又はその抗原結合断片は重鎖ＶＨドメイン及び軽鎖ＶＬドメインを含み、重鎖及び軽鎖ドメインが、
    （ａ）配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、
    （ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、
    （ｃ）配列番号４５のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、
    （ｅ）配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び
    （ｆ）配列番号５６のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３
    を含む、医薬組成物。
  9. 抗体ＶLドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、抗体ＶHドメインが、配列番号８２のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 前記癌が、結腸直腸癌、膵癌、膀胱癌、白血病、リンパ腫、神経膠腫、膠芽腫、メラノーマ、卵巣癌、甲状腺癌、食道癌、前立腺癌、及び乳癌からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
  11. 請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片である第１の薬剤と、第１の薬剤以外の抗癌剤である第２の薬剤とを含む、対象におけるＣＤ７３関連癌を治療するための医薬組成物。
  12. 請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片である第１の薬剤を含む、第１の薬剤以外の抗癌剤である第２の薬剤との併用で、対象におけるＣＤ７３関連癌を治療するための医薬組成物。
  13. 第１の薬剤以外の抗癌剤である第２の薬剤を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片である第１の薬剤との併用で、対象におけるＣＤ７３関連癌を治療するための医薬組成物。
  14. 第１の薬剤と第２の薬剤との組み合わせが、相加的又は相乗的に有効である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  15. 前記第２の薬剤が、ＰＤ−１（プログラム死１タンパク質）、ＰＤ−Ｌ１（プログラム死１タンパク質リガンド１）、ＰＤ−Ｌ２（プログラム死１タンパク質リガンド２）、又はＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４タンパク質）に特異的に結合する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  16. 前記第２の薬剤が、抗ＣＴＬＡ−４抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  17. 前記第２の薬剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  18. 前記対象が、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法を受けているか、受けたことがあるか、又は受ける予定である、請求項８〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  19. 前記抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、又は抗ＣＴＬＡ４療法が、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、若しくは抗ＣＴＬＡ４抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
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