[go: up one dir, main page]

JP6678108B2 - Ｌｇ１２−系統群プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 - Google Patents

Ｌｇ１２−系統群プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6678108B2
JP6678108B2 JP2016542111A JP2016542111A JP6678108B2 JP 6678108 B2 JP6678108 B2 JP 6678108B2 JP 2016542111 A JP2016542111 A JP 2016542111A JP 2016542111 A JP2016542111 A JP 2016542111A JP 6678108 B2 JP6678108 B2 JP 6678108B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cleaning
family
composition
bacillus
protease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2016542111A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2016537011A (ja
JP2016537011A5 (ja
Inventor
ベイブ、リリア・エム
エステル、デービッド・エー
グーデゲブール、フリッツ
ボット、リチャード・アール
コルクマン、マーク
ムルダー、ハーム
シュミット、ブライアン・エフ
オーガスティン、キャサリン
アトウォル、ムンループ
マルケス、デイビッド
Original Assignee
ダニスコ・ユーエス・インク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ダニスコ・ユーエス・インク filed Critical ダニスコ・ユーエス・インク
Publication of JP2016537011A publication Critical patent/JP2016537011A/ja
Publication of JP2016537011A5 publication Critical patent/JP2016537011A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6678108B2 publication Critical patent/JP6678108B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38681—Chemically modified or immobilised enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C14—SKINS; HIDES; PELTS; LEATHER
    • C14C—CHEMICAL TREATMENT OF HIDES, SKINS OR LEATHER, e.g. TANNING, IMPREGNATING, FINISHING; APPARATUS THEREFOR; COMPOSITIONS FOR TANNING
    • C14C1/00—Chemical treatment prior to tanning
    • C14C1/06—Facilitating unhairing, e.g. by painting, by liming
    • C14C1/065—Enzymatic unhairing
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
    • D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
    • D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C9/00—After-treatment of cellulose pulp, e.g. of wood pulp, or cotton linters ; Treatment of dilute or dewatered pulp or process improvement taking place after obtaining the raw cellulosic material and not provided for elsewhere
    • D21C9/10—Bleaching ; Apparatus therefor
    • D21C9/1063—Bleaching ; Apparatus therefor with compounds not otherwise provided for, e.g. activated gases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年９月１２日出願の米国仮特許出願番号第６１／８７７，０８７号に基づく優先権にかかる利益を主張するものであって、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
セリンプロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合を切断する酵素群である。セリンプロテアーゼは、活性部位に求核性セリン残基を含有する。スブチリシンはセリンプロテアーゼの大規模なファミリーであり、工業用酵素の分野で古くから知られているものの、特定の条件及び用途に好適な組み換えプロテアーゼがなおも必要とされている。
本開示は、特に、ＬＧ１２−系統群のプロテアーゼ酵素変異体を含むＬＧ１２−系統群のプロテアーゼ酵素、ＬＧ１２−系統群のプロテアーゼ酵素をコードする核酸、並びにその製造及び使用に関係する組成物及び方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＧ１２−系統群の親酵素に対するアミノ酸の改変を含む、ＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体又はそれらの活性断片であって、改変は、ＬＧ１２−系統群の酵素変異体の生産的位置におけるものである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＧ１２−系統群の親酵素に対するアミノ酸の改変を含むＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素又はその活性断片であって、改変は、ＬＧ１２−系統群の酵素変異体の生産的位置におけるものであり、生産的位置において試験される改変のうち少なくとも５０％の改変は、次の基準ａ）〜ｃ）のうちの少なくとも１つを満たす：ａ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．９以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもＰＩが１．０以上である生産的位置：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；ｂ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．８以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもＰＩが１．２以上である生産的位置：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；ｃ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．５以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもＰＩが１．５以上である生産的位置：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；ここで、生産的位置は、２７、４０、４３、７８、９８、１３０、１３１、１５８、１６６、１８２、２３７、２３９、２４２、２４５、及び２５１からなる群から選択され、ＬＧ１２−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すバチルス種（Bacillus sp.）ＬＧ１２ｓｐｒＣスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される。
いくつかの実施形態では、改変は、残基２７（Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｍ）、４０（Ａ、Ｉ、Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｙ）、４３（Ｎ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｅ）、７８（Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｗ）、９８（Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｎ、Ｗ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）、１３０（Ｓ、Ｉ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｆ、Ｖ、Ｙ）、１３１（Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｅ）、１５８（Ｓ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｋ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、Ｖ）、１６６（Ｇ、Ｋ、Ｗ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）、１８２（Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｐ、Ｗ、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｄ、Ｅ）、２３７（Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｑ）、２３９（Ｐ、Ｙ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｖ）、２４２（Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｖ、Ｗ、Ａ、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｓ）、２４５（Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、Ｄ、Ｓ、Ｙ）、及び２５１（Ｋ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ）、からなる群から選択される（ここで、ＬＧ１２−系統群の変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される）。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＧ１２−系統群の親酵素変異体に対するアミノ酸の改変を含むＬＧ１２−系統群の酵素変異体、又はその活性断片であって、改変はＬＧ１２−系統群の酵素変異体の生産的位置で生じ、生産的位置で試験された改変のうち少なくとも３０％但し５０％未満はａ、ｂ及びｃ（上記参照）に挙げた評価基準のうち少なくとも１つを満たしており、そして生産的位置は、２、９、１５、３８、４５、４８、５２、５９、６２、７５、９７、９９、１０３、１１７、１１８、１１９、１２３、１２９、１３３、１４５、１４８、１４９、１５６、１５９、１６１、１８１、２０９、２３６、２４０、２４８、２５６、２６７、２７１、及び２７５からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、改変は、残基２（Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ｙ）、９（Ｐ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ）、１５（Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｙ、Ａ）、３８（Ｎ、Ｈ、Ｙ、Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｓ）、４５（Ｋ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ａ）、４８（Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ）、５２（Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｆ）、５９（Ｑ、Ｆ、Ｍ、Ｈ、Ｎ、Ｗ、Ｔ、Ｉ、Ｖ）、６２（Ｎ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｗ）、７５（Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、Ｇ）、９７（Ｓ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ａ、Ｉ）、９９（Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｖ）、１０３（Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｙ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｄ）、１１７（Ｎ、Ｍ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）、１１８（Ｇ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｑ、Ｓ）、１１９（Ｍ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）、１２３（Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｑ）、１２９（Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｒ、Ｙ、Ｋ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｄ）、１３３（Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｉ）、１４５（Ｒ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｙ、Ｎ）、１４８（Ｖ、Ｄ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、Ｓ）、１４９（Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｑ）、１５６（Ｓ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｄ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｍ、Ｋ、Ｎ）、１５９（Ｓ、Ｃ、Ｆ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｑ）、１６１（Ｎ、Ｆ、Ｋ、Ｗ、Ｍ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｙ）、１８１（Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｎ）、２０９（Ｔ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙ）、２３６（Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｓ）、２４０（Ｓ、Ｈ、Ｑ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｍ）、２４８（Ｅ、Ｑ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｔ、Ｗ、Ｄ、Ｃ、Ｈ、Ｍ、Ｙ）、２５６（Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｐ、Ｒ）、２６７（Ｖ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）、２７１（Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｗ、Ｙ）、及び２７５（Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｈ、Ｗ、Ｅ、Ｎ、Ｒ）、からなる群から選択され、ここで、ＬＧ１２−系統群の変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＧ１２系統群の親酵素に対するアミノ酸の改変を含むＬＧ１２−系統群の酵素変異体又はそれらの活性断片であって、改変はＬＧ１２−系統群の酵素変異体の生産的位置におけるものであり、生産的位置で試験された改変のうち少なくとも１５％但し３０％未満はａ、ｂ、及びｃ（上記参照）に挙げた評価基準のうち少なくとも１つを満たしており、そして生産的位置は、１、３、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、４４、５０、５３、５５、５７、５８、６１、６７、７２、７６、７７、７９、８０、８５、８６、８７、８９、９０、９１、９３、９６、１００、１０１、１０２、１０６、１０７、１０８、１１３、１１６、１２１、１２４、１２６、１２７、１３６、１３７、１４０、１４４、１４７、１５０、１５２、１５３、１６０、１６２、１７０、１７２、１７３、１８３、１８５、１８７、１８８、１９４、２１３、２１６、２１７、２１８、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３５、２４１、２４３、２４４、２４６、２５２、２５５、２６５、及び２７２からなる群から選択され、ここで、ＬＧ１２−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すバチルス種（Bacillus sp.）ＬＧ１２ｓｐｒＣスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される。
いくつかの実施形態では、改変は、残基１（Ａ、Ｌ、Ｈ、Ｋ、Ｇ、Ｒ）、３（Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｖ）、１８（Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｒ、Ｔ）、１９（Ａ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｗ）、２０（Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｎ）、２２（Ｔ、Ｄ、Ｓ、Ｅ）、２４（Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｒ、Ｖ）、２４（Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｒ、Ｖ）、２６（Ｖ、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｓ）、２８（Ｖ、Ｎ、Ｓ、Ｅ、Ｔ）、３０（Ｉ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｖ）、３１（Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｔ）、４４（Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｆ）、５０（Ｆ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｋ、Ｑ、Ｙ）、５３（Ｇ、Ｙ、Ｈ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｅ）、５５（Ｐ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｒ）、５７（Ａ、Ｇ、Ｗ、Ｐ）、５８（Ｌ、Ｆ、Ｄ、Ｋ）、５８（Ｌ、Ｆ、Ｄ、Ｋ）、６７（Ａ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｐ）、７２（Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ）、７６（Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｄ）、７７（Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ）、７９（Ｔ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｋ、Ｑ、Ｉ、Ｌ）、８０（Ｇ、Ｃ、Ｐ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｙ）、８５（Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ）、８６（Ｙ、Ａ、Ｐ、Ｆ）、８７（Ｎ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｓ）、８９（Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｆ）、９０（Ｌ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｐ）、９１（Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、Ｖ、Ｗ）、９３（Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ）、９６（Ｌ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｉ、Ｅ、Ｈ）、１００（Ｇ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｅ）、１０１（Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｒ）、１０２（Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｙ）、１０６（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ）、１０７（Ｉ、Ｈ、Ｑ、Ｖ、Ｔ）、１０８（Ａ、Ｓ、Ｉ、Ｃ）、１１３（Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ）、１１６（Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｍ）、１２１（Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｉ）、１２４（Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ａ）、１２６（Ｌ、Ｈ、Ｗ、Ｉ、Ｑ、Ｇ、Ｋ）、１２７（Ｇ、Ｅ、Ｈ、Ｎ）、１３６（Ｑ、Ｌ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、Ｒ、Ｄ）、１３７（Ｑ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、Ｅ）、１４０（Ｎ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ｑ）、１４４（Ｎ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）、１４７（Ｉ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、Ａ、Ｈ、Ｍ）、１５０（Ｉ、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｖ）、１５２（Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｖ）、１５３（Ａ、Ｍ、Ｇ、Ｓ）、１６０（Ｇ、Ｎ、Ｈ、Ｍ）、１６２（Ｒ、Ｋ、Ｍ、Ｖ）、１７０（Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｌ）、１７２（Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｔ、Ｇ、Ｈ）、１７３（Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｄ）、１８３（Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ）、１８５（Ｔ、Ｃ、Ｗ、Ｑ、Ｒ、Ｍ）、１８７（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｈ、Ｐ、Ｖ、Ｗ）、１８８（Ｓ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、Ｙ）、１９４（Ｓ、Ｍ、Ｔ、Ｆ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｄ）、２１３（Ｎ、Ｖ、Ｗ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、Ｋ、Ｑ）、２１６（Ｓ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｔ、Ａ）、２１７（Ｆ、Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｅ、Ｒ）、２１８（Ｎ、Ｃ、Ｈ、Ｄ）、２２２（Ｍ、Ｃ、Ａ、Ｈ、Ｌ、Ｑ）、２２５（Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｖ）、２２８（Ａ、Ｃ、Ｒ、Ｓ）、２３１（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ）、２３４（Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｖ）、２３５（Ｋ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、２４１（Ｍ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｗ）、２４３（Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ）、２４４（Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ）、２４６（Ｉ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｔ）、２５２（Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｆ、Ｅ）、２５２（Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｆ、Ｅ）、２６５（Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｓ）、及び２７２（Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｋ）、からなる群から選択され、ここで、ＬＧ１２−系統群の変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＧ１２−系統群の親酵素に対するアミノ酸の改変を含むＬＧ１２−系統群の酵素変異体又はそれらの活性断片であって、改変はＬＧ１２−系統群の酵素変異体の生産的位置におけるものであり、生産的位置で試験された改変のうち少なくとも１つ但し１５％未満はａ、ｂ、及びｃ（上記参照）に挙げた評価基準のうち少なくとも１つを満たしており、そして生産的位置は、４、７、８、１２、１４、１６、１７、２９、３３、４２、４６、５１、５６、６５、６９、７３、８１、８３、８４、８８、９４、１０４、１０９、１１１、１１４、１２０、１２２、１２５、１２８、１３２、１３８、１４１、１４３、１４６、１５１、１６３、１６５、１６７、１７５、１７６、１９５、２０３、２０４、２０５、２０６、２１１、２１２、２１５、２２０、２２４、２２７、２３０、２３２、２３８、２５０、２６０、２６２、２６８、２７３、及び２７４からなる群から選択され、ここで、ＬＧ１２−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すバチルス種（Bacillus sp.）ＬＧ１２ｓｐｒＣスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番される。
いくつかの実施形態では、改変は、残基４（Ｖ、Ｃ）、７（Ｇ、Ｎ）、８（Ｉ、Ｌ）、１２（Ｋ、Ｇ、Ｒ）、１４（Ｄ、Ｌ）、１６（Ａ、Ｇ、Ｖ）、１７（Ｈ、Ａ）、２９（Ａ、Ｔ、Ｓ）、３３（Ｔ、Ｄ）、４２（Ｌ、Ｄ）、４６（Ｇ、Ｎ）、５１（Ｖ、Ｉ）、５６（Ｎ、Ｅ）、６５（Ｇ、Ｔ、Ｖ）、６９（Ａ、Ｇ、Ｔ）、７３（Ａ、Ｇ）、８１（Ｖ、Ｈ、Ｍ）、８３（Ｇ、Ｓ）、８４（Ｖ、Ａ）、８８（Ａ、Ｃ、Ｇ）、９４（Ｋ、Ｇ）、１０４（Ｌ、Ｙ、Ｖ）、１０９（Ｑ、Ｋ）、１１１（Ｉ、Ｖ）、１１４（Ｓ、Ｔ、Ｇ）、１２０（Ｎ、Ｈ、Ｅ）、１２２（Ｉ、Ｍ）、１２５（Ｓ、Ｇ）、１２８（Ｇ、Ｅ、Ｎ）、１３２（Ｓ、Ａ）、１３８（Ａ、Ｅ、Ｓ）、１４１（Ｎ、Ｇ）、１４３（Ｙ、Ｄ、Ｅ）、１４６（Ｇ、Ｎ、Ｒ）、１５１（Ａ、Ｈ）、１６３（Ｎ、Ｓ、Ｄ）、１６５（Ｍ、Ｉ、Ｖ）、１６７（Ｙ、Ｇ）、１６７（Ｙ、Ｇ）、１６７（Ｙ、Ｇ）、１９５（Ｅ、Ｑ）、２０３（Ｖ、Ｃ）、２０４（Ｎ、Ｅ）、２０５（Ｉ、Ｖ）、２０６（Ｌ、Ｙ）、２１１（Ｇ、Ｃ）、２１１（Ｇ、Ｃ）、２１５（Ａ、Ｄ、Ｅ）、２２０（Ｔ、Ａ、Ｇ）、２２４（Ａ、Ｓ）、２２４（Ａ、Ｓ）、２３０（Ａ、Ｓ）、２３２（Ａ、Ｓ）、２３８（Ｙ、Ｗ、Ｆ）、２５０（Ｌ、Ｉ、Ｍ）、２６０（Ｐ、Ｙ）、２６０（Ｐ、Ｙ）、２６８（Ｉ、Ｆ）、２７３（Ａ、Ｓ）、及び２７３（Ａ、Ｓ）、からなる群から選択され、ここで、ＬＧ１２−系統群の変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の通りの変異体を少なくとも１種含む組成物である。いくつかの実施形態では、本発明は、先に挙げたようなクリーニング組成物を用いたクリーニング方法である。
ＬＧ１２ｓｐｒＣの野生型及び変異体プロテアーゼを発現させるためのプラスミドマップｐＨＹＴ−ＬＧ１２を提供する。 プラスミドｐＨＹＴ−ＬＧ１２にコードされるＬＧ１２ｓｐｒＣタンパク質前駆体の配列を提供する。 Ｂｈｏｎ０３３２１を発現させるためのプラスミドマップｐＨＹＴ−Ｂｈｏｎ０３３２１を提供する。 洗剤ＯＭＯ ＨＤＬ中でのＬＧ１２相同体のクリーニング性能を提供する。 洗剤ＯＭＯ ＨＤＤ中でのＬＧ１２相同体のクリーニング性能を提供する。 洗剤ＧＳＭ−Ｂ（ｐＨ９）中でのＬＧ１２相同体のクリーニング性能を提供する。 洗剤ＧＳＭ−Ｂ（ｐＨ１０．５）中でのＬＧ１２相同体のクリーニング性能を提供する。 枝分岐に示す、ｓｐｒＣに対するＬＧ１２−系統群の相同体を含む、ＬＧ１２ｓｐｒＣに対し６０％超の配列同一性を有する数多くのスブチリシンの系統樹を提供する。 様々なＬＧ１２−系統群プロテアーゼ：バチルス種（Bac sp）ＬＧ１２ＳｐｒＣ、ＤＳＭ＿９７１１、ＤＳＭ＿９７１２、ＤＳＭ＿６９５１、Ｂｈｏｎ０３３２１、バチルス種（Bac sp）ＢＡＤ１１９８８、バチルス種（Bac sp）ＷＰ＿０１０１９２４０３、バチルス種（Bac sp）ＬＧ１２ＳｐｒＤ、バチルス種（Bac sp）ＷＰ＿０１０１９２４０５、バチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８に加え、スブチリシンバチルス・レンタス（B lentus）Ｐ２９６００のアライメントを提供する。 様々なＬＧ１２−系統群プロテアーゼ：バチルス種（Bac sp）ＬＧ１２ＳｐｒＣ、ＤＳＭ＿９７１１、ＤＳＭ＿９７１２、ＤＳＭ＿６９５１、Ｂｈｏｎ０３３２１、バチルス種（Bac sp）ＢＡＤ１１９８８、バチルス種（Bac sp）ＷＰ＿０１０１９２４０３、バチルス種（Bac sp）ＬＧ１２ＳｐｒＤ、バチルス種（Bac sp）ＷＰ＿０１０１９２４０５、バチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８に加え、スブチリシンバチルス・レンタス（B lentus）Ｐ２９６００のアライメントを提供する。 有用な洗剤プロテアーゼと、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ、及びその他の知られる、ＬＧ１２ｓｐｒＣと配列同一性の近いスブチリシンとの、構造ベースのアライメントを提供する。下線を付した領域は、ＬＧ１２−系統群のメンバーに共通するモチーフ配列を示す。 有用な洗剤プロテアーゼと、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ、及びその他の知られる、ＬＧ１２ｓｐｒＣと配列同一性の近いスブチリシンとの、構造ベースのアライメントを提供する。下線を付した領域は、ＬＧ１２−系統群のメンバーに共通するモチーフ配列を示す。 ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼの構造についての相同モデル領域を、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のスブチリシンの構造に基づき提供する。図中、Ｔｙｒ８６、Ａｓｎ８７、Ｔｈｒ２２及びＨｉｓ１７側鎖をスティック表示する。 画像の塩基上に基質結合部位及び活性三残基部位を有するＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼの相同モデルを提供する。図中、Ｔｈｒ１０３及びＬｅｕ１０４の側鎖をスティック表示する。
本発明は、新規セリンプロテアーゼ酵素、具体的には、ＬＧ１２−系統群セリンプロテアーゼ酵素及び変異体、並びに特に洗剤組成物に有用な酵素を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、親セリンプロテアーゼ酵素と比較して、置換などの１つ以上の改変を有する、セリンプロテアーゼ酵素変異体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＧ１２−系統群のセリンプロテアーゼの、新規セリンプロテアーゼ酵素を提供する。上記のそれぞれにおいて、本発明のセリンプロテアーゼ酵素は、汚れの除去、穀物エタノールの製造、動物の飼料、食品加工助剤及び消助剤、皮革加工、及びパーソナルケアなどのいくつかの工業で有用であり得る。このような有用性は、クリーニング性能、化学薬品の存在下での酵素の安定性、及び／又は酵素の熱安定性を向上させることにより酵素に改良をなし、酵素の有効性を向上させることで達成され得る。本発明は、ＬＧ１２ｓｐｒＣセリンプロテアーゼ酵素変異体が挙げられるが、これに限定されない、セリンプロテアーゼ酵素変異体であって、様々なクリーニング用途に特にうまく適合しかつ有用なセリンプロテアーゼ酵素変異体を提供する。本発明は、本明細書に記載の新規セリンプロテアーゼ酵素及び／又はセリンプロテアーゼ酵素変異体（例えば、Ｇ１２ ｓｐｒＣ変異体）のうち少なくとも１種を含む組成物を含む。このような組成物のうちいくつかのものは、洗剤組成物を含む。本発明は、バチルス種（Bacillus species）変異体セリンプロテアーゼ酵素を含む様々な種、及びかかるＬＧ１２−系統群セリンプロテアーゼ変異体を１種以上含む組成物を提供する。本発明のセリンプロテアーゼ酵素変異体は、洗剤組成物に有用な他の酵素と組み合わせることが可能である。本発明は、本発明の新規セリンプロテアーゼ酵素及び／又はセリンプロテアーゼ酵素変異体を使用する方法も提供する。
本発明は、親セリンプロテアーゼ酵素からの１つ以上の改変を有するセリンプロテアーゼ酵素の酵素変異体を包含する。酵素変異体は、洗浄性能、洗剤組成物中の酵素の安定性及び酵素の熱安定性に関し最小性能指数を有し、更に、これらの特性のうち少なくとも１つが親セリンプロテアーゼ酵素よりも改善されていることにより、洗剤組成物に有用であり得る。
更に、本発明は、洗剤組成物に有用であり得るセリンプロテアーゼ酵素の１つ以上のアミノ酸位置に、置換などの改変を付与するものであり、好ましい改変の結果として、洗浄性能、洗剤組成物中での酵素の安定性及び酵素の熱安定性に関し最小性能指数を得るとともに、これらの特性のうち少なくとも１種を親セリンプロテアーゼ酵素よりも改善する。これらの改変は、本発明の好適な改変と考えられる。これらアミノ酸の位置は、親セリンプロテアーゼ酵素に対する改変を組み合わせるのに有用な位置であると考えられる。有用な位置であることが判明しているセリンプロテアーゼ酵素のアミノ酸位置は、洗剤組成物での使用に適した複数の改変を有することを更に特徴とすることができる。それぞれの位置では、好適な改変の見込まれる数が多いほど、特定の位置の生産性が高いことを意味する。
更に、本発明は、本発明の新規セリンプロテアーゼ酵素及び／又はセリンプロテアーゼ酵素変異体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、これらの新規セリンプロテアーゼ酵素及び／又はセリンプロテアーゼ酵素変異体のうちの少なくとも１種を含む、クリーニング組成物を提供する。
これら本発明の特定の特徴は、明確にするために個別の実施形態に照らして上記及び以降で説明するが、一つの実施形態において組み合わせて提供され得ると認識されるべきである。反対に、手短に説明するためにただ一つの実施形態に照らして説明された本発明の様々な特徴もまた、別個に又は任意のサブコンビネーションで提供され得る。
用語の定義
特に指定しない限り、本発明の実施は、当該技術分野内の分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えＤＮＡにおいて通常使用される従来技術を伴う。このような技術は当業者に既知のものであり、当業者に広く知られている数多くの文献及び参考文献に記載されている。本明細書の上述の及び以降に記載されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。多くの専門用語辞典が当業者に既知である。本明細書に記載されているものと類似した又は等価な任意の方法及び材料が本発明の実施に使用されるが、本明細書には一部の好適な方法及び材料を記載する。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。同様に、本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で明示されない限り、対象物が複数個ある場合も含まれる。数範囲は、範囲を定義する数を包含する。特に断りのない限り、核酸（の塩基配列）は５’側から３’側へ向かって左から右に表示され、そしてアミノ酸配列はアミノ基からカルボキシ基へ向かって左から右に表示される。本発明は、記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に制限されるものではなく、これらは当業者により使用される文脈に応じて変動し得ると理解されるべきである。
本発明の実施は、特に断りのない限り、タンパク質精製、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術及びタンパク質配列決定の従来技術を採用し、これらはすべて、当該技術分野内のものである。
加えて、本明細書で提供される見出しは本発明の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。それでもなお、本発明に対する理解を容易にする目的で、数多くの用語を以下に定義する。
本明細書全体を通じて記載されているあらゆる最大数値限度には、それよりも小さいあらゆる数値限度が、あたかもこうしたより小さい数値限度が本明細書に明確に記載されているかのように包含されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるあらゆる最小数の限定は、それよりも大きいあらゆる数値の限定を、あたかもこうしたより大きい数値の限定が本明細書に明確に記載されているかのように包含する。本明細書の全体を通じて与えられるあらゆる数値範囲は、このような広い数値範囲に含まれるより狭いあらゆる数値範囲が、あたかもこうしたより狭い数値範囲がすべて本明細書に明確に記載されているかのように包含される。
本明細書で使用するとき、用語「プロテアーゼ」及び「プロテイナーゼ」は、他のタンパク質を分解する能力を有する酵素タンパク質を指す。プロテアーゼは、タンパク質を形成するペプチド鎖又はポリペプチド鎖中のアミノ酸を連結するペプチド結合を加水分解することにより、タンパク質の異化を開始する、「タンパク質分解」の実行能を有する。タンパク質消化酵素としてのプロテアーゼのこの活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。タンパク質分解活性の測定には、数多くの周知の手法が存在する（例えば、Ｋａｌｉｓｚ，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」Ｉｎ：Ｆｉｅｃｈｔｅｒ（ｅｄ．），Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８８）を参照されたい）。例えば、タンパク質分解活性は、各プロテアーゼが市販の基質を加水分解する能力を解析する比較アッセイにより確認することができる。プロテアーゼ活性又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質としては、限定するものではないが、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９８０１）、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９８７９）、ウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ Ｅ−１６２５）、及びウシケラチン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ９０２１１１）が挙げられる。これらの基質を利用する比色アッセイは当業界では広く知られている（例えば、いずれも参照により本明細書に援用される、国際公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，３７６，４５０号を参照されたい）。ｐＮＡアッセイ（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：３１６〜３２０［１９７９］を参照されたい）も、勾配溶出時に回収される分画中の活性な酵素濃度の測定に有用である。ｐＮＡアッセイは、酵素が、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）などの可溶性の合成ペプチド基質を加水分解したときの、ｐ−ニトロアニリンの放出速度を測定するものである。加水分解反応によりＣ−末端のアミノ酸（フェニルアラニン）とｐ−ＮＡとの間に切断が生じることで、黄色の呈色が生じる。４１０ｎｍに設定した分光光度計でこの呈色が測定され、この呈色は活性酵素の濃度に比例する。色の変化を測定することにより、反応速度を算出可能である。加えて、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度測定を使用して、総タンパク質濃度を測定することができる。参照標準を使用するとき、活性酵素／総タンパク質比によって酵素純度が与えられる。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド変異体」は、親又は参照ポリペプチド（限定するものではないが野生型ポリペプチドが挙げられる）のアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）属」としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）」属のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B.brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、バチルス・ハロデュランス（B. halodurans）、バチルス・プミルス（B. pumilus）、バチルス・ギブソニイ（B. gibsonii）、バチルス・シュードファームス（B.pseudofirmus）、バチルス・レヘンシス（B. lehensis）、バチルス・メガテリウム（巨大菌、B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サークランス（B.circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類学上の再編成を絶えず受けているものと認識される。したがって、属には、これまでに再分類された種、限定するものではないが、現在では「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されているバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）などの生物を包含するものと意図される。酸素存在下での、耐久性の高い内生胞子の形成は、バチルス（Bacillus）属を定義する特性であると考慮されるものの、この特性は、現在、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アムピバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びバルジバチルス（Virgibacillus)と命名されている属にも当てはまる。
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書ではほぼ同じ意味で使用され、ヌクレオチドモノマーが鎖状に共有結合している任意の長さのポリマーを指す。デオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、及びリボヌクレオチドポリマーであるＲＮＡ（リボ核酸）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチド又は核酸の例である。ポリヌクレオチド又は核酸としては、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基、若しくは他の天然の、化学的に改変された、生化学的に改変された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが挙げられる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、発現配列標識（ＥＳＴ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマー。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチド、ウラシル、他の糖、並びにフルオロリボース及びチオエートなどの結合基、並びに分岐ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により割り込まれる。
本明細書で使用するとき、用語「変異」は、開始アミノ酸又は核酸配列に生じた変化を指す。この用語には、置換、挿入及び欠失が包含されることを意図する。
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、核酸又はポリヌクレオチドを、標的細胞又は組織に、導入又は移行するために使用される核酸構築物又はポリヌクレオチド構築物を指す。ベクターは、典型的には、外来ＤＮＡを他の細胞又は組織に導入する際に使用される。概してベクターは、導入遺伝子であるＤＮＡ配列と、ベクターの「骨格」として機能するより長いポリヌクレオチド配列と、からなる。典型的には、ベクターは、挿入された導入遺伝子などの遺伝子情報を、標的細胞又は組織で挿入断片が単離、複製、又は発現されるよう、標的細胞又は組織に移動させるよう機能する。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテリオファージ、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、コスミド、発現ベクター、シャトルベクター、カセット、及びこれに類するものなどが挙げられる。典型的には、ベクターは複製開始点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーを備えている。ベクターを標的細胞に挿入するプロセスは、一般に形質移入と呼ばれる。ウイルスベクターによる細胞の形質移入は、一般に形質導入と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本発明には、ＤＮＡ配列を好適なホストで発現させるよう機能し得る好適な配列（例えば、分泌型のシグナルペプチド配列など）に制御可能なように連結される、変異型プロテアーゼ（例えば、前駆型又は成熟型プロテアーゼ変異体）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターが包含される。
本明細書で使用するとき、用語「発現カセット」、「発現プラスミド」又は「発現ベクター」は、対象とする核酸（例えば、外来核酸又は導入遺伝子）を標的細胞で発現させるにあたり組み換え的に又は合成的に生成される核酸構築物又はベクターを指す。典型的には、対象とする核酸は、対象とするタンパク質を発現する。発現ベクター又は発現カセットは、典型的には外来核酸の発現を駆動又は促進するプロモーターヌクレオチド配列を含む。また、典型的には発現ベクター又はカセットは、標的細胞で特定の核酸の転写を可能にする任意の他の指定された核酸エレメントを包含する。組み換え型発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことができる。いくつかの発現ベクターは、宿主細胞に異種性のＤＮＡ断片を組み込み、発現させすることができる。多くの原核及び真核細胞発現ベクターが、市販されている。適切な発現ベクターは、当業者の知識の範囲内で選択される。発現ベクターに組み込まれた核酸配列からタンパク質を発現させるのに適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内のものである。
ＤＮＡ構築物は、標的細胞又は組織に導入することのできる、人工的に構築された核酸断片である。一般的には、ＤＮＡ構築物は、対象とするタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる、ベクターにサブクローニングされたＤＮＡの挿入断片を含む。ベクターは、バクテリア中での増殖に関係するバクテリア由来の耐性遺伝子、並びに対象とするタンパク質を微生物で発現させるためのプロモーターを含有し得る。ＤＮＡはＰＣＲによりインビトロで生成されるか、あるいは当業者に既知である任意の他の好適な技術により生成される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物は対象とする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、制御要素（例えば、プロモーターなど）のような追加の要素に、機能的に連結される。ＤＮＡ構築物は、更に選択マーカーを含んでもよく、及びホメオボックスに隣接する組み込み配列を更に含んでもよい。構築物は、他の相同性ではない配列を末端に組み込んで含んでもよい（例えば、スタッファー配列（stuffer sequences）又は隣接配列）。いくつかの実施形態では、配列の両末端は、ＤＮＡ構築物が閉環を形成するように閉じている。当業者に周知である技術を用いてＤＮＡ構築物に組み込まれる、対象とする核酸配列は、野生型、変異型、又は修飾型核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物は、宿主細胞染色体と相同である核酸配列を１種以上含む。他の実施形態においては、ＤＮＡ構築物は、非相同的なヌクレオチド配列を１種以上含む。ＤＮＡ構築物がインビトロで構築されたならば、例えば、１）異種配列の、宿主細胞の望ましい標的配列への挿入；及び／又は２）宿主細胞の染色体領域に対する変異誘発（すなわち、内在性配列を異種配列により置き換える）；３）標的遺伝子の欠失；及び／又は４）複製プラスミドの宿主への導入、に使用できる。「ＤＮＡ構築物」は、本明細書において「発現カセット」とほぼ同じ意味で使用される。
本明細書で使用するとき、「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することのできる染色体外ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは二本鎖（ｄｓ）であり、環状であってもよく、典型的にはクローニングベクターとして使用される。
本明細書で、核酸配列を細胞に導入する文脈において使用するとき、用語「導入」は、核酸配列を細胞に移入するのに好適な任意の方法を指す。導入の際のこのような方法としては、プロトプラスト融合、遺伝子導入、形質転換、電気穿孔、複合、及び形質導入（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ Ｈａｒｄｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，ｐｐ．５７〜７２［１９８９］を参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。
形質転換は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）の取り込み、ゲノムへの組み込み、及び発現により生じる、細胞の遺伝的変化を指す。
本明細書で使用するとき、核酸は、別の核酸配列と機能的に関連を持つよう配置された場合に、別の核酸配列と「機能的に連結」される。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響を与える場合、プロモーター又はエンハンサーは、ヌクレオチドコード配列に機能的に連結される。リボソーム結合部位は、コード配列の翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に機能的に連結され得る。通常、「機能的に連結された」ＤＮＡ配列は隣接している。但し、エンハンサーが隣接する必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合には、従来の実践に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーが用いられ得る。
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を指し、コード領域の前及び後に続く領域、並びに個々のコード配列（エキソン）の間に存在する介在配列（イントロン）を包含する。
本明細書で使用するとき、「組み換え」が細胞に関し使用される場合、典型的には、非相同な核酸配列の導入により細胞が改質されていることを、あるいはそのように改質された細胞からその細胞が誘導されていることを意味する。例えば、組み換え細胞は、未改変（非組み換え型）の細胞において同一の形で見られない遺伝子を含み得るか、又は組み換え細胞は、改変されて細胞に再導入されている未改変の遺伝子（未改変の細胞で見られる）を含み得る。組み換え細胞は、細胞から核酸を除去せずに改変されている細胞にとって内因性の核酸を含み得るが、このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、及び当業者に既知の関連技術によって生じる改変が挙げられる。組み換えＤＮＡ技術には、インビトロで組み換えＤＮＡを産生する技術、及び組み換えＤＮＡが発現され得る又は増加し得る細胞に組み換えＤＮＡを移入して、それによって組み換えポリペプチドが産生される技術が挙げられる。ポリヌクレオチド又は核酸の「組み換え（Recombination）」、「組換する（recombining）」及び「組み換えられた（recombined）」は、概して、２つ以上の核酸若しくはポリヌクレオチド鎖若しくは断片をアセンブル又は結合させて新しいポリヌクレオチド又は核酸を生成することを指す。組み換えポリヌクレオチド又は核酸は、しばしばキメラと呼ばれる。人工的なもの又は設計されたものである場合、あるいは人工的な又は設計されたタンパク質又は核酸から誘導される場合、核酸又はポリペプチドは「組み換え体」である。
本明細書で使用するとき、核酸又は遺伝子の「増幅」といった用語は、増幅させた核酸又は遺伝子が、ゲノム中に最初に存在していたコピー数よりもより大きいコピー数で存在するように、特異的ＤＮＡ配列を不釣り合いに複製させるプロセスを指す。いくつかの実施形態では、薬剤（例えば、阻害可能な酵素の阻害剤）の存在下で増殖させることによる細胞選別の結果、薬剤の存在下での増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする内因性遺伝子が増幅されるか、又はこの核酸若しくは遺伝子産物又はこれら両方をコードする外因性の（すなわち、導入）配列が増幅されることになる。
「増幅」は鋳型特異性を伴う核酸複製の特殊例である。これは非特異的な鋳型複製（すなわち、鋳型依存的であるが、特定の鋳型に依存しない複製）と対比をなす。ここで、鋳型特異性は、複製の忠実度（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列が合成される度合い）及びヌクレオチド（リボ又はデオキシリボヌクレオチド）の特異性とは区別される。鋳型特異性は、しばしば「標的」特異性に関して記載される。標的配列は、他の核酸から選別されることが求められるという意味での「標的」である。増幅技術は主にこの選別のために設計されている。
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」は、精製された制限酵素消化物として天然に存在するか、又は合成により生成されるかによらず、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件（すなわち、ヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導物質の存在下で、かつ好適な温度及びｐＨ）下に置かれた場合に、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド残基のポリマー）を指す。好ましくは、プライマーは増幅効率を最大にするために一本鎖であるが、あるいは、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーを最初に処理してその鎖を分離した後、伸長産物を調製するために使用する。いくつかの実施形態では、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導物質の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー供給源、及び使用方法などの様々な因子に応じ異なる。
本明細書で使用するとき、用語「プローブ」は、精製された制限酵素消化物として天然に存在するか、又は合成、組み換え、若しくはＰＣＲ増幅により生成されるかによらず、典型的に対象とする他のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。プローブは一本鎖又は二本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、及び単離に有用である。本発明で使用される任意のプローブは、限定するものではないが酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、並びに酵素を用いる組織化学アッセイ）、蛍光、放射活性、及び発光システムなどの任意の検出システムで検出され得るように、任意の「リポーター分子」により標識されると想到される。本発明は、任意の特定の検出系又は標識に制限されることを意図しない。
本明細書で使用するとき、用語「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に関し使用する場合、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーが結合する核酸領域を指す。したがって、「標的」は他の核酸配列から選別されることが求められる。ヌクレオチド「セグメント」は、標的核酸配列内の核酸領域である。
本明細書で使用するとき、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，９６５，１８８号（これらは参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を指し、クローニング又は精製せずにゲノムＤＮＡ混合物中の標的配列セグメントの濃度を増加させる方法を包含する。標的配列のこの増幅プロセスは当業者に周知である。
本明細書で使用するとき、用語「増幅試薬」は、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素を除く、増幅に必要とされる試薬を指す（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液など）。典型的に、増幅試薬は他の反応成分と共に配置され、反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に入れられる。
本明細書で使用するとき、用語「制限エンドヌクレアーゼ」又は「制限酵素」は、制限部位として知られる特異的ヌクレオチド配列又はその近傍で二本鎖又は一本鎖ＤＮＡを切断することのできる酵素（例えば、細菌酵素）を指す。制限部位を含むヌクレオチド配列は、所定の制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素により認識及び開裂され、しばしばＤＮＡ断片の挿入部位になる。制限部位は、発現ベクター又はＤＮＡ構築物中に工学操作することができる。
「相同的組み換え」は、同一の若しくはほとんど同一のヌクレオチド配列部位での２つのＤＮＡ分子又は染色体対の間で生じるＤＮＡ断片の交換を指す。いくつかの実施形態では、染色体への組み込みは相同的組み換えである。
核酸又はポリヌクレオチドは、未改変の状態にせよ又は当業者に既知の手法により工学操作された場合にせよ、転写及び／又は翻訳されてポリペプチド又はそれらの断片を産生できるのであれば、ポリペプチドを「コードする」と言われる。このような核酸のアンチセンス鎖も、同様に、配列をコードすると言われる。
当該技術分野において既知であるように、ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ配列を転写してＲＮＡ配列を生産することができるが、逆転写酵素によりＲＮＡ配列を逆転写してＤＮＡ配列を生産することもできる。
「宿主株」又は「宿主細胞」は、対象とするＤＮＡ配列を含む発現ベクターにとって好適な宿主を指す。対象とするＤＮＡ配列は、対象とするタンパク質を宿主株又は宿主細胞で発現することができる。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列からなる。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書ではほぼ同じ意味で使用される。ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従い定義されるアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を、本開示全体を通して使用する。一文字のＸは、２０種のアミノ酸のうちのいずれかを指す。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重により１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。変異は、親アミノ酸の１文字表記、続いて３桁又は２桁の数字による位置番号、次に変異アミノ酸の１文字表記により記載される。例えば、８７位でのグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）への変異は、「Ｇ０８７Ｓ」又は「Ｇ８７Ｓ」と表される。複数の変異は、「−」を変異の間に挿入することで示される。８７位及び９０位での変異は、「Ｇ０８７Ｓ−Ａ０９０Ｙ」若しくは「Ｇ８７Ｓ−Ａ９０Ｙ」、又は「Ｇ８７Ｓ＋Ａ９０Ｙ」若しくは「Ｇ０８７Ｓ＋Ａ０９０Ｙ」のいずれかとして表される。欠失については、一文字コード「Ｚ」を使用する。親配列に対する挿入については、一文字コード「Ｚ」を位置番号の左側に記載する。欠失については、一文字コード「Ｚ」を位置番号の右側に記載する。挿入については、位置番号は、挿入されるアミノ酸の前の位置番号にアミノ酸毎に０．０１を加えた番号である。例えば、位置８７と８８の間に三つのアミノ酸、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びチロシン（Ｙ）を挿入することは、「Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ」と表される。したがって、上記のすべての変異に加え第１００番目の位置に欠失が存在する場合には、「Ｇ０８７Ｓ−Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ−Ａ０９０Ｙ−Ａ１００Ｚ」となる。改変について記載するとき、位置の後に続く括弧内に記載のアミノ酸は置換一覧を意味し、すなわち、その位置において、掲載の任意のアミノ酸により置換がなされる。例えば、６（Ｌ，Ｉ）とは、６位がロイシン又はイソロイシンで置換され得ることを意味する。
「プロ配列」又は「プロペプチド配列」は、シグナルペプチド配列と成熟プロテアーゼ配列の間に存在し、適切な折りたたみ及びプロテアーゼの分泌に必要とされるアミノ酸配列を指す。プロ配列又はプロペプチド配列の開裂により、成熟型活性プロテアーゼを生じる。プロ配列は内因性のものであってよく、又は生じ得る配列は、別のスブチリシンなどの関連性が高いタンパク質のものである。
用語「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、成熟型又は前駆体型タンパク質の分泌又は直接輸送に関与し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、典型的に、前駆体型又は成熟型タンパク質配列のＮ端末に位置する。シグナル配列は内因性又は外来性であり得る。シグナル配列は通常、成熟型タンパク質には存在しない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質の輸送後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質から開裂される。
用語「ハイブリッド型シグナル配列（hybrid signal sequence）」は、発現させる遺伝子に関するシグナル配列と融合させた発現宿主から配列の一部が得られる、シグナル配列を指す。いくつかの実施形態では、合成配列が用いられる。
用語「成熟」型タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとは、シグナルペプチド配列及びプロペプチド配列を持たないタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的形態を指す。
用語「前駆体」型タンパク質又はペプチドとは、タンパク質のアミノ末端又はカルボニル末端に機能的に連結されたプロ配列を有する成熟型タンパク質を指す。前駆体型タンパク質又はペプチドは、プロ配列のアミノ末端に、機能的に連結された「シグナル」配列を有する場合もある。前駆体は、翻訳後活性に関与する追加のポリヌクレオチド（例えば、前駆体からこのポリヌクレオチドが切断されると、成熟型のタンパク質又はペプチドが得られる）を有する場合もある。
アミノ酸配列又は核酸配列に関する用語「野生型」は、そのアミノ酸配列又は核酸配列が未改変の又は天然に生じる配列であることを示す。本明細書で使用するとき、用語「天然に生じた」は、自然に見出される（すなわち、組み換え法により操作を受けていない）任意のものを指す（例えば、タンパク質、アミノ酸、又は核酸配列）。
本明細書で使用するとき、用語「天然に生じたものではない」は、自然界では見られない任意のものを指す（例えば、研究室で製造される組み換えポリヌクレオチド又はポリペプチド）。
本明細書でアミノ酸残基の位置に関して使用するとき、「対応する（「corresponding to」又は「corresponds to」又は「corresponds」）」とは、タンパク質若しくはペプチド中の列挙された位置にあるアミノ酸残基、又はタンパク質若しくはペプチド中の列挙された残基と類似、相同、若しくは等価であるアミノ酸残基を指す。本明細書で使用するとき、「対応する領域」とは、概して、関連するタンパク質又は参照タンパク質における類似の位置を指す。
用語「に由来する」及び「から得られる」とは、当該生物株により産生されるあるいは産生され得るタンパク質だけでなく、このような株から単離されるＤＮＡ配列によってコードされ、このようなＤＮＡ配列を含有している宿主生物で産生されるプロテアーゼも指す。更にこれらの用語は、合成ＤＮＡ配列及び／又はｃＤＮＡにより生じるのＤＮＡ配列によりコードされかつ当該タンパク質を識別する特徴を有するプロテアーゼを指す。例えば、「バチルス（Bacillus）由来のプロテアーゼ」は、バチルス（Bacillus）により天然に産生されるタンパク質分解活性を有する酵素、並びバチルス（Bacillus）源により産生されるものなどのセリンプロテアーゼを指すが、遺伝子工学技術の利用により、セリンプロテアーゼをコードしている核酸で形質転換させたバチルス株（Bacillus）又はバチルス（Bacillus）以外の生物で産生されたものは含まれない。
２つのポリペプチド配列についての文脈において、用語「同一」は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの１つを用いて測定する際に、最大限一致するようにアライメントさせたときに同じである２つの配列中の残基を指す。
本明細書で使用するとき、用語「相同な遺伝子」は、互いに対応し、かつ互いに同一であるか又は非常に類似している、異なるが通常は近縁種からの一対の遺伝子を指す。この用語は、種分化（すなわち、新種の発生）により分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、並びに遺伝子複製により分離されている遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
本明細書で使用するとき、「相同性」は、配列類似性又は同一性を指し、同一性が好ましい。相同性は当業界で既知の標準法を利用して求めることができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［１９７０］；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ソフトウェアパッケージに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのソフトウェアプログラム；及びＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５［１９８４］を参照されたい）。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブペアワイズアラインメント法を用いて、関連する配列群から複数の配列のアラインメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを作成するのに使用されるクラスタリング関連性を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント法を単純化したものを使用する（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０［１９８７］を参照されたい）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載されたものと類似のものである（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３頁［１９８９年］を参照されたい）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ重みづけ（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップ伸長重みづけ（default gap length weight）及び重みつき末端ギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。
参照配列と対象とする試験配列との配列同一率は、当業者により容易に判定することができる。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列により共有される同一率は、配列をアライメントし、当該技術分野において既知の方法により同一性を判定することによって分子間での配列情報を直接比較することにより、判定される。配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０（１９９０）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントを行ったときに一致するか又はある程度ポジティブであると評価された（positive-valued）閾値スコアＴを満たすかのいずれかである問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を同定する。これらの最初にヒットした隣接ワードは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための開始点として働く。ワードのヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り比較されている２つの配列の各々に沿って両方向に拡張される。ワードのヒットの拡張は、次の場合に止まる：累積アラインメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ減少する、累積スコアがゼロ以下になる、又は、いずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、感度及びアライメントの速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、語長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５［１９９２］を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両菌株の比較を用いる。
次いで、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、類似する２つの配列間の統計解析を実行する（例えば、上掲Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌを参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は、最小和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然により生じ得る確率の指標を提供する。例えば、試験核酸をセリンプロテアーゼの核酸と比較した際の最小合計類似度が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は本発明のセリンプロテアーゼ核酸と類似していると考えられる。セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている試験核酸は、最小合計類似度の比較結果が約０．５未満、及びより好ましくは約０．２未満である場合に、特定のセリンプロテアーゼ核酸と類似していると考えられる。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列についての文脈において、「同一率（percent identical or percent identity）」は、２つ以上の配列を最も一致するように比較及びアライメントし、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視確認により判定したときに、２つ以上の配列が、同一であるか、あるいは核酸残基又はアミノ酸残基と、表記される割合で同一であることを指すものである。参照（すなわち、クエリー）アミノ酸配列に対する、対象とするアミノ酸配列の、「配列同一率」又は「同一率（％）」又は「配列同一率（％）」又は「アミノ酸配列同一率」は、対象とするアミノ酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたってクエリーアミノ酸配列に対して表記される割合（すなわち、アミノ酸とアミノ酸を並べたときの同一度）だけ同一であることを意味する。したがって、２つのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つのアミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち８０％が同一であることを意味する。
参照核酸配列（すなわち、クエリー）に対する、対象とする核酸配列の、「配列同一率」又は「同一率（％）」又は「配列同一率（％）」又は「核酸配列同一率（％）」は、対象とする核酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたってクエリー配列に対して表記される割合（すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドを並べたときの同一度）だけ同一であることを意味する。したがって、２つの核酸配列に対するヌクレオチド配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つの核酸配列中のヌクレオチド残基のうち８０％が同一であることを意味する。
参照タンパク質配列（すなわち、クエリー）に対する、対象とするタンパク質配列の、「配列同一率」又は「同一率（％）」又は「配列同一率（％）」又は「タンパク質配列同一率（％）」は、対象とするタンパク質配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたってクエリー配列に対して表記される割合だけ同一（すなわち、ポリペプリド配列の残基と残基を並べたときに）であることを意味する。したがって、２つのタンパク質配列に対するポリペプチド配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つのタンパク質配列中の残基のうち８０％が同一であることを意味する。
いくつかの実施形態では、クエリー配列に対する対象とする配列の「配列同一性又は配列同一性（％）」、又は「同一性（％）」は、２つの配列を最適にアライメントし、比較長さにわたって、２つの最適にアライメントした配列を比較することで、算出することができる。最適なアライメントにおいて両方の配列の残基が一致している位置の数は、一致する位置の数を求めて一致する位置の数を比較長さ（特に断りのない限り、クエリー配列の長さである）のうちの位置の合計数で除することで決定される。得られる数に１００を乗じることで、クエリー配列に対する対象とする配列の配列同一率を算出する。
「最適アライメント」又は「最適アライメントを行った」は、最高の同一性パーセントスコアを与える２つ（以上）の配列のアライメントを指す。例えば、２つのタンパク質配列の最適なアライメントは、各配列中の同一のアミノ酸残基が最多数アライメントされるように、配列を手作業でアライメントさせることで、あるいはソフトウェアプログラム又は本明細書に記載の若しくは当該技術分野において既知の手順を用いることで、達成することができる。２つの核酸配列の最適アライメントは、各配列中の同一のヌクレオチド残基の最大数が共にアライメントされるよう手作業で配列のアライメントを行うことにより、あるいは、本明細書に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。
いくつかの実施形態では、２つのポリペプチド配列は、配列対に関し可能性のある最も高い類似性スコアが得られるように、定義されたアミノ酸置換行列、ギャップ開始ペナルティ（ギャップオープンペナルティとも呼ばれる）、及びギャップ伸長ペナルティなどの定義されたパラメーターを用いてアライメントされたときに、「最適にアライメントされた」と見なされる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（上掲のＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆを参照されたい）は、多くの場合、ポリペプチド配列アライメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）でデフォルトのスコア置換行列として使用される。ギャップ存在ペナルティはアライメントされた配列の１つにアミノ酸ギャップが１つ導入された際に課せられ、ギャップ伸張ペナルティはギャップ中の各残基位置に対して課される。用いられる代表的なアライメントは以下のものである：ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列、ギャップ存在ペナルティ＝１１、及びギャップ伸張ペナルティ＝１。アライメントスコアは、可能性のある最も高い類似性スコアが得られるように、アライメントが開始及び終了する各配列のアミノ酸位置により（例えば、アライメントウィンドウ）、並びに場合によっては可能な限り最高の類似性スコアを達成するように一方若しくは両方の配列の中に１つ若しくは複数のギャップを挿入することにより、決定される。
２つ以上の配列間の最適なアライメントは、目視確認により手作業で、又はコンピュータ（限定するものではないが、例えば、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラム、及び核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムなど）を用いて、決定することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）参照；ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトも参照）。
対象とするポリペプチドは、対象とするポリペプチドが、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる場合、参照ポリペプチドと「実質的に類似するもの」であるものとして参照される。２つのこのようなポリペプチド間の同一性（％）は、最適にアライメントした２つのポリペプチド配列を目視確認することで手作業により、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することにより、決定することができる。２つのポリペプチドが実質的に同一であることの指標の１つは、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応するというものである。典型的に、保存的アミノ酸置換が異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのペプチドが、保存的アミノ酸置換のみが異なる、又は１つ以上の保存的アミノ酸置換のみが異なる場合、ポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同一である。
対象とする核酸は、対象とする核酸が、参照核酸のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる場合、参照核酸と「実質的に類似するもの」であるものとして参照される。２つのこのような核酸間の同一性（％）は、最適にアラインメントされた２つの核酸配列を目視確認することで手作業により、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することにより、決定することができる。２つの核酸配列が実質的に同一であることの指標の１つは、ストリンジェント（例えば、中程度〜高ストリンジェンシーの範囲）な条件下で、２つの核酸分子が互いにハイブリダイズするというものである。
核酸又はポリヌクレオチドは、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から部分的又は完全に分離されているときに「単離され」ている。同様に、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から部分的又は完全に分離されているときに「単離され」ている。モルベースで、単離された種は組成物中の他の種よりも豊富である。例えば、単離された種は、存在するすべての高分子種のうちの少なくとも約５０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％（モルベースで）を構成し得る。好ましくは、対象とする分子種は、本質的に均質になるよう精製される（すなわち、従来の検出法では、組成に夾雑物が検出されない）。純度及び均一度は、タンパク質又は核酸サンプルをアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動後に染色により可視化するなどの、当業者に周知である数多くの手法を用い測定することができる。必要に応じて、高解像度の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は同様の手法を用いて材料を精製することができる。
核酸又はポリペプチドに使用される場合、用語「精製された」は、概して、当業者に周知の解析技術により決定したときに、核酸又はポリペプチドが他の成分を本質的に含まないことを意味する（例えば、精製されているポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液、及び／又は密度勾配遠心分離にかけた培養液中で、別個のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルで本質的に１本のバンドのみが生じる核酸又はポリペプチドは、「精製されている」。精製されている核酸又はポリペプチドは、少なくとも純度約５０％のものであり、通常、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、又は約９９．８％以上（例えば、モル重量による純度）のものである。これに関連し、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチド又はポリヌクレオチドのような本発明の分子１つ以上について組成物を濃縮する方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に増加している場合、組成物はその分子について濃縮されている。本発明の、実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする実質的に純粋な変異型プロテアーゼ又はポリヌクレオチド）は、典型的には、特定の組成物中で、すべての高分子種の少なくとも約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８、約９９％、又は約９９．５％以上（モルベースで）を構成する。
これに関連し、本発明は、１つ以上の本発明の分子、例えば１つ以上の本発明のポリペプチド（例えば、１つ以上の本発明の変異型プロテアーゼ）又は１つ以上の本発明の核酸（例えば、１つ以上の本発明の変異型プロテアーゼをコードする１つ以上の核酸）について組成物を濃縮する方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に増加している場合、組成物はその分子について濃縮されている。実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチドは、典型的には、特定の組成物中で、すべての高分子種の少なくとも約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８、約９９％、又は約９９．５％以上（モルベースで）を構成する。
本明細書で使用するとき、用語「コンビナトリアル変異導入」又は「コンビナトリアル」とは、参照核酸配列の核酸変異体のライブラリを作成する方法を指す。これらのライブラリでは、変異体は既定の変異の組から選択された１つ以上の変異を含有している。この方法は、既定の変異の組のメンバーではないランダム変異を導入する手段も提供する。このような方法のうちのいくつかのものは、米国特許第６，５８２，９１４号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。このようなコンビナトリアル変異導入法のうちいくつかのものには、市販のキット（例えば、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ融合／伸長ＰＣＲ）で具体化される方法が挙げられ、及び／又は包含される。
本明細書で使用するとき、変異体プロテアーゼに関連して使用される「改善された特性を有する」とは、対応する参照プロテアーゼ（例えば、野生型又は天然に生じるプロテアーゼ）と比較した場合に、変異型プロテアーゼの洗浄性能若しくはクリーニング性能が改善又は増強されていること、及び／又は場合により洗浄若しくはクリーニング性能は保持されたまま安定性が改善又は増強されている変異体プロテアーゼを意味する。変異体プロテアーゼの特性の改善には、洗浄若しくはクリーニング性能の改善及び／又は安定性の改善が含まれ得る。いくつかの実施形態では、本発明は、次の特性のうち１つ以上を呈する本発明の変異型プロテアーゼを提供する：参照プロテアーゼ（例えば、野生型ＬＧ１２などの、野生型プロテアーゼ）と比較した場合に、手洗いの洗浄性能の改善、食器手洗い性能若しくは手動食器洗浄性能の改善、自動食器洗浄性能の改善、洗濯性能の改善、及び／又は安定性の改善。
本明細書で使用するとき、用語「機能性アッセイ」は、タンパク質活性の指標を提供するアッセイを指す。いくつかの実施形態では、この用語は、タンパク質を、通常の性能で機能し得るかに関して解析するアッセイ系を指す。例えば、酵素の場合、機能的アッセイは、反応を触媒する酵素の有効性を決定することを包含する。
本明細書で使用するとき、用語「標的特性」は、開始遺伝子から変化させることになる特性を指す。本発明は、任意の特定の標的特性に制限されないと意図される。しかしながら、いくつかの実施形態では、標的特性は遺伝子産物の安定性（例えば、変性、タンパク質分解又は他の分解要因に対する抵抗性）である一方、他の実施形態では、生産宿主による生産レベルが変化する。
本明細書で使用するとき、核酸に関する文脈における用語「特性」又はそれらの文法的に等価な表現は、選別又は検出が可能な核酸の任意の特性若しくは属性を指す。これらの特性としては、限定するものではないが、ポリペプチドに対する結合に影響する特性、特定の核酸を含む細胞に与えられる特性、遺伝子の転写に影響を与える特性（例えば、プロモーター強度、プロモーター認識、プロモーター制御、エンハンサー機能）、ＲＮＡのプロセシングに影響を与える特性（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡコンフォメーション、及び転写後修飾）、翻訳に影響を与える特性（例えば、ｍＲＮＡのレベル、調節、リボソームタンパク質に対する結合、翻訳後修飾）が挙げられる。例えば、核酸における、転写因子、ポリメラーゼ、制御因子などの結合部位を変化させることで、所望の特性を生じる、又は望ましくない特性を同定することができる。
本明細書で使用するとき、（タンパク質を含む）ポリペプチドに関する文脈における用語「特性」又はそれらの文法的に等価な表現は、選別又は検出が可能なポリペプチドの任意の特徴又は属性を指す。これらの特性としては、限定するものではないが、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、酵素活性、熱安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク質分解に対する抵抗性、ＫＭ、ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／ｋＭ比、タンパク質フォールディング、免疫応答の誘導、リガンドに対する結合能、受容体に対する結合能、分泌され得るか否か、細胞の表面に提示され得るか否か、オリゴマー形成能、シグナル伝達能、細胞増殖の刺激能、細胞増殖の阻害能、アポトーシス誘導能、リン酸化又はグリコシル化により改変され得るか否か、及び／又は疾患の治療能などが挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「スクリーニング」は、当該技術分野で通常使用される意味を有する。スクリーニングプロセスの一例では、変異核酸、又はこの核酸によってコードされるポリペプチド変異体が提供されて、変異核酸又はポリペプチド変異体の特性がそれぞれ評価又は決定される。変異核酸又はポリペプチド変異体について決定された特性を、それぞれ、対応する核酸前駆体（親核酸）の特性又は対応する親ポリペプチドの特性と比較することもできる。
特性が変化した核酸又はタンパク質を得る際のスクリーニング手順は、変異核酸の生成により、その改変が促進されるものと意図される開始材料の特性によって異なることは当業者には明白である。したがって、本発明はスクリーニングされる任意の特定の特性に制限されるものではなく、また、以下の特性に関する記載は例証のみを掲載していることを、当業者は認識するであろう。任意の特定の特性に関するスクリーニング方法は、一般的に当該技術分野で記載されているものである。例えば、ある方法は、変異の前後の結合、ｐＨ、特異性などを測定することができ、それらの変化が変更の指標である。好ましくは、スクリーニングは、同時にスクリーニングされる多数の試料を含むハイスループット方式で実施されるものであって、例えば、限定するものではないが、チップ、ファージディスプレイ、並びに複数の基質及び／又は指示薬を利用するアッセイが挙げられる。
本明細書で使用するとき、いくつかの実施形態では、スクリーニングプロセスは、対象とする変異体を、変異体集団から濃縮する選別工程を一工程以上包含する。これらの実施形態の例としては、宿主生物に増殖優位性を与える変異体の選別、並びにファージディスプレイ法又は任意の他のディスプレイ法が挙げられるが、これらの方法では、変異体の結合特性又は触媒特性に基づき、変異体を変異体集団から捕捉することができる。いくつかの実施形態では、変異体ライブラリをストレス（例えば、熱、変性など）に曝露して、続いて変性を受けていない（intact）変異体を、スクリーニングにより同定するか、又は選別により濃縮する。この用語は、選別に関する任意の好適な手段を包含することを意図するものである。実際のところ、本発明は、任意の特定のスクリーニング方法に制限されることを意図しない。
用語「改変核酸配列」及び「改変遺伝子」は、本明細書において天然に生じる（すなわち、野生型の）核酸配列に欠失、挿入又は中断を含む核酸配列を指す際に互換的に使用される。いくつかの実施形態では、改変された核酸配列の発現産物は、切断型タンパク質である（例えば、改変が配列の欠失又は中断である場合）。いくつかの実施形態では、切断型タンパク質は生物活性を保持している。代替的な実施形態では、改変された核酸配列の発現産物は、伸長型タンパク質である（例えば、改変が核酸配列への挿入を含む場合）。いくつかの実施形態では、核酸配列にヌクレオチドを挿入することで切断型タンパク質が得られる（例えば、挿入により終止コドンが形成される場合）。したがって、挿入によって、切断型タンパク質又は伸長型タンパク質のいずれかが発現産物として生じ得る。
「変異体」核酸配列は、典型的には、変異体核酸配列の発現産物が、野生型タンパク質と比較してアミノ酸配列が変化しているタンパク質であるよう、宿主細胞の野生型配列に存在する少なくとも１つのコドンに変化を有する核酸配列を指す。発現産物は、変化した機能的能力（例えば、酵素活性の増強）を有し得る。
本明細書で使用するとき、語句「基質特異性の変化」は、酵素の基質特異性に生じる変化を指す。いくつかの実施形態では、基質特異性の変化は、酵素の変異、又は反応条件の変化により生じる、特定の基質に関するｋｃａｔ及び／又はＫｍの変化として定義される。酵素の基質特異性は、その酵素が示す触媒効率を異なる基質と比較することで決定される。概して、対象とする基質のｋｃａｔ／Ｋｍ比がより大きい変異体酵素を生産することが所望されることから、これらの決定は、変異体酵素の効率を評価する際に特に有用である。しかしながら、本発明は、いかなる特定の基質組成物又は基質特異性にも制限されないと意図される。
本明細書で使用するとき、「表面特性」は、静電荷、並びにタンパク質の表面が示す疎水性及び親水性などの特性に関して使用される。
本明細書で使用するとき、用語「実効電荷」は、分子中に存在するすべての電荷の合計として定義される。親タンパク質分子の「実効電荷を変化」させることで、親分子とは異なる実効電荷を有する変異体が得られる（すなわち、変異体は親分子と同じではない実効電荷を有する）。例えば、中性アミノ酸を負電荷を持つアミノ酸に置き換えるか、又は正電荷を持つアミノ酸を中性アミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が−１になる。正電荷を持つアミノ酸を負電荷を持つアミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が−２になる。中性のアミノ酸を正電荷を持つアミノ酸に置き換えるか、又は負電荷を持つアミノ酸を中性のアミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が＋１になる。負電荷を持つアミノ酸を正電荷を持つアミノ酸に置き換えることで、親分子と比較して実効電荷が＋２になる。親タンパク質の実効電荷は、電荷を持つアミノ酸の欠失及び／又は挿入によっても変化し得る。
用語「熱的に安定な」及び「熱安定性の」及び「熱安定性」は、変更された温度に曝露されているがタンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は本発明の他のプロセスの際に一般的に適用される条件下で、所定の時間にわたって特定の温度に曝露された後でも、明記された量の酵素活性を保持するプロテアーゼを意味する。「変更された温度」は、温度の上昇又は低下を包含する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、変化した温度に、例えば少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分などの所定の時間にわたって曝露した後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質分解活性を保持する。
酸化安定性、キレート剤安定性、熱安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼに関する文脈において、用語「安定性の強化」は、他のプロテアーゼ（例えば、ＬＧ１２プロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した場合に、時間が経過しても保持されるタンパク質分解活性が高いことを意味する。
酸化安定性、キレート安定性、熱安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼに関する文脈において、用語「安定性の低下」は、他のプロテアーゼ（例えば、ＬＧ１２プロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した場合に、時間が経過するにつれて保持されるタンパク質分解活性が低下することを意味する。
用語「クリーニング活性」は、タンパク質分解、加水分解、クリーニング、汚れ／シミ除去、又は本発明の他のプロセスの際に一般的に適用される条件下で、プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼにより得られるクリーニング性能を指す。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の、１種以上の様々な酵素反応性の染み（例えば、食品、草類、血液、インク、牛乳、油、及び／又は卵タンパク質に由来する染み）のクリーニングについての、様々なアッセイを使用して決定することもできる。プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の染みを標準的な洗浄条件に晒す工程、及び染みが除去される程度を、様々なクロマトグラフィー、分光光度法、又はその他の定量法を用いて評価する工程によって決定され得る。代表的なクリーニングアッセイ及び方法は、当該技術分野で既知であり、限定するものではないが、国際公開第９９／３４０１１号、及び米国特許第６，６０５，４５８号に記載のもの（これらの特許文献の両方共が参照により本明細書に援用される）、並びに以下に提供される実施例に包含されるクリーニングアッセイ及び方法が挙げられる。
プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼの「クリーニング有効量」という表現は、特定のクリーニング組成物中で、所望のレベルの酵素活性を達成するプロテアーゼの量を指す。このような有効量は、当業者によって容易に確認され、使用される特定のプロテアーゼ、クリーニング用途、クリーニング組成物の具体的な組成、及び必要とされる組成物が液体又は乾燥形態（例えば、粒状、錠剤、棒状）のいずれであるのか、などの多くの要因に基づくものである。プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼについての用語「汚れ除去指数」（ＳＲＩ）は、ある量の酵素又は酵素活性により達成される汚れ除去の度合いを指す。
用語「クリーニング助剤」は、クリーニング組成物に包含される、本発明の変異体プロテアーゼ以外の任意の液体、固体、又はガス状の材料を指す。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上のクリーニング助剤を包含する。各クリーニング助剤は、典型的には、クリーニング組成物の特定のタイプ及び形態（例えば、液体、粒状、粉末、棒状、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、フォーム、又はその他の組成）に応じて選択される。好ましくは、各クリーニング助剤は、組成物に使用されるプロテアーゼ酵素と適合性である。
クリーニング活性の文脈における表現「性能の強化」は、標準的な洗浄サイクル及び／又は複数回の洗浄サイクル後に通常の評価により決定されたときに、卵、牛乳、草類、インク、油、及び／又は血液などの特定の酵素反応性の染みに対する酵素によるクリーニング活性が増加又はより大きいことを指す。
クリーニング活性の文脈における表現「性能の低下」は、標準的な洗浄サイクル後に通常の評価により決定されたときに、卵、牛乳、草類又は血液などの特定の酵素反応性の染みに対する酵素によるクリーニング活性が低下又はより低いことを指す。
クリーニング性能は、標準的な洗浄サイクル条件後に通常の分光光度法又は分析技法により決定されたときに、草類、血液、インク、油、及び／又は牛乳などの酵素反応性の染みに関する様々なクリーニングアッセイにおいて、本発明のプロテアーゼ変異体を参照プロテアーゼと比較することで決定することができる。
本明細書で使用するとき、用語「消費者製品」は、布地ケア製品及びホームケア製品を意味する。本明細書で使用するとき、用語「布地ケア製品及びホームケア製品」又は「布地ケア及び家庭用ケア製品」は、販売される形態で使用又は消費されることが一般的に意図され、かつ布地、硬質表面及び任意の他の表面を処理するための製品、非生物表面のケア及びクリーニングの全般に関するクリーニング系、並びに布地コンディショナー製品及び布地のケア及び維持のために特に設計されたその他の製品、エアケア製品（例えば、エアフレッシュナー及び香り送達系など）、カーケア、ペットケア、家畜ケア、パーソナルケア、ジュエリーケア、食器洗浄、布地コンディショニング（例えば、柔軟化及び／又はフレッシュニングなど）、洗濯洗剤、洗濯及びすすぎ添加剤及び／又はケア剤、前処理クリーニング組成物、硬質表面クリーニング及び／又は処理剤（例えば、床及び便器クリーナー、ガラスクリーナー及び／又は処理剤、タイルクリーナー及び／又は処理剤、セラミッククリーナー及び／又は処理剤など）、並びに消費者若しくは業務用の他のクリーニング剤を包含する。いくつかの実施形態では、布地ケア製品及びホームケア製品は、創傷部及び／又は皮膚への使用に好適である。「布地ケア製品及びホームケア製品」としては、消費者製品及び業務用製品が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「非布地用ケア製品及びホームケア製品」は、他の組成物に添加することで布地ケア製品及びホームケア製品となり得る最終製品を生成する組成物を指す。
本明細書で使用するとき、用語「業務用クリーニング組成物」は、限定するものではないが、学校、病院、工場、商店、企業、建造物、飲食店、総合オフィスビル、加工及び／又は製造プラント、動物病院、畜産場、大牧場などの施設での使用に好適な製品を指す。
本明細書で使用するとき、用語「クリーニング及び／又は処理組成物」は、特に断りのない限り、物品のクリーニング及び／又は処理に好適な組成物などが挙げられる、布地ケア及びホームケア製品に属する組成物である。このような製品としては、限定するものではないが、次のような布地処理用の製品、硬質面処理用の製品、並びに布地ケア及びホームケアの領域の任意の他の表面処理用の製品が挙げられる：エアフレッシュナー及び香り送達系などの空気ケア、カーケア、食器洗浄、布地コンディショニング（例えば、柔軟化及び／又はフレッシュニングなど）、洗濯洗浄、洗濯及びすすぎ添加剤及び／又はケア剤、硬質表面クリーナー及び／又は処理剤（例えば、床及び便器クリーナーなど）、粒状又は粉末形態の万能又は「強力」洗浄剤（特にクリーニング用洗剤）、液体、ゲル、又はペースト形態の万能洗浄剤（特にいわゆる強力液体型万能洗浄剤）、おしゃれ着用液体洗剤、食器手洗い用洗剤又はライトデューティ食器洗浄剤（特に高起泡型のもの）、食器洗浄機用食器洗浄剤（家庭用及び業務用の、様々な錠剤型、粒状、液体及びすすぎ補助型洗浄剤）：車又はカーペット洗浄剤、便器クリーナーを含む風呂場クリーナー、並びにクリーニング補助剤（漂白添加剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型、あるいは乾燥機用シートなどの、基材添加製品（substrate-laden product））。
実際には、本明細書で使用するとき、本発明の「クリーニング組成物」又は「クリーニング配合物」は、クリーニングされる物体、物品又は表面から化合物（例えば望ましくない化合物）を除去又は排除するのに有用な本発明の任意の組成物を指し、クリーニングされる物体、物品又は表面としては、これらに限定するものではないが、例えば、布地、布地物品、食器類、食卓用食器類、ガラス製品類、コンタクトレンズ、その他の固体基材、毛髪（シャンプー）（ヒト又は動物の毛髪を包含する）、皮膚（石鹸及び／又はクリーム）、歯（マウスウォッシュ、歯磨き粉）、物品又は対象物の表面（例えば、テーブルの硬質表面、テーブルトップ、壁、家具、床、天井、皿以外の物品、食卓用食器以外の物品などの硬質表面）、フィルター、薄膜（例えば、限外濾過膜を含むがこれに限定されない濾過膜）等が挙げられる。上記の用語は、組成物に使用されるプロテアーゼ及びその他の酵素とその組成物が適合する限り、所望の特定の種類のクリーニング組成物及び所望の特定の形態の製品（例えば、液体、ゲル、粒状、スプレー、又はその他の構成）のために選択されるいかなる材料及び／又は添加化合物も包含する。クリーニング組成物材料の具体的な選別は、クリーニングされる表面、物体、物品、又は布地を考慮することにより、及び使用時のクリーニング条件に所望される組成物の形態を考慮することにより、容易に行われる。
クリーニング組成物及びクリーニング配合物は、任意の対象物、物品、及び／又は表面をクリーニング、漂白、消毒、及び／又は殺菌するのに好適な任意の組成物を含む。このような組成物及び配合物としては、限定するものではないが、液体及び／又は固体組成物、例えば、クリーニング又は洗剤組成物（例えば、液体、錠剤、ゲル、棒状、粒状、及び／又は固体洗濯クリーニング又は洗剤組成物、並びにおしゃれ着用洗剤組成物など）；硬質表面クリーニング組成物及び配合物（例えば、ガラス、木材、セラミック及び金属製のカウンター甲板及び窓用のもの）；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；布地フレッシュナー；布地柔軟剤；及び繊維製品、洗濯洗浄性能増進用クリーニング又は洗剤組成物、洗濯用添加型クリーニング組成物、及び洗濯物のシミ抜き前処理用クリーニング組成物；食器手洗い用又は食器手動洗浄用組成物（例えば、食器「手洗い」用又は食器「手動」洗浄用の洗剤）及び自動食器洗浄機用組成物（例えば、「自動食器洗浄機用の洗剤」）を包含する食器洗浄用組成物などが挙げられる。
本明細書で使用するとき、クリーニング組成物又はクリーニング配合物としては、特に断りのない限り、粒状又は粉末状万能又は強力洗浄剤、特に、クリーニング洗剤；液状、粒状、ゲル状、固形、錠剤型又はペースト状万能洗浄剤、特にいわゆる強力液体（ＨＤＬ）洗剤又は強力粉末洗剤（ＨＤＤ）型；おしゃれ着用液体洗剤；高起泡型のものを含む食器手洗い又は食器手動洗浄剤；食器手洗い又は食器手動洗浄、食器自動洗浄、あるいは家事用及び業務用の様々な錠剤、粉末、固形、粒状、液状、ゲル状及びすすぎ助剤型の食器類若しくは食卓用食器類洗浄剤；抗菌性手洗い用液体クリーニング及び殺菌剤、固形石鹸、マウスウォッシュ、義歯クリーナー、車洗浄剤、カーペット洗浄剤、風呂場クリーナーなどの液体クリーニング及び殺菌剤；人間及び他の動物の毛髪用シャンプー及び／又は毛髪用リンス；シャワージェル及びバブルバス、並びに金属製品クリーナー；加えて、漂白添加剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型などのクリーニング補助剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、粒状組成物は「コンパクト」形態であり；いくつかの実施形態では、液体組成物は「濃縮」形態である。
本明細書で使用するとき、「布地クリーニング組成物」としては、洗濯用添加組成物などの手洗い用及び洗濯機用洗剤組成物、並びに染みの付いた布地（例えば、衣類、リネン類、及び他の繊維材料）の浸け置き及び／又は前処理に使用するのに好適な組成物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「非布地用クリーニング組成物」としては、限定するものではないが、例えば、食器手洗い用若しくは手動食器洗浄用又は自動食器洗浄用洗剤組成物、口腔クリーニング組成物、義歯クリーニング組成物、及びパーソナルクレンジング組成物などの、非繊維製品（すなわち、非布地）表面用のクリーニング組成物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「布地及び／又は硬質表面用のクリーニング及び／又は処理組成物」は、特に断りのない限り、粒状又は粉末状の万能又は「強力」洗浄剤、特にクリーニング用洗剤、液体、ゲル、又はペースト状の万能洗浄剤、特にいわゆる強力液体洗浄剤、おしゃれ着用液体洗剤、食器手洗い用洗浄剤又はライトデューティ食器洗浄剤（特に高起泡型のもの）、家庭用及び業務用の各種の錠剤型、粒状、液体、及びすすぎ補助型を含む食器洗浄機用洗剤、液体洗浄剤及び殺菌剤、車又はカーペット洗浄剤、便器クリーナーを含む浴室クリーナー、液体、固体、及び／又は乾燥機用シート形態であり得る柔軟化及び／又はフレッシュニングを含む布地コンディショニング製品、並びに漂白剤添加型及び「染み抜きスティック」又は前処理型そして乾燥機用シート（dryer added sheet）などの基材添加製品（substrate-laden product）のようなクリーニング補助剤を包含する、クリーニング及び処理組成物に属する組成物である。適用可能であるこのような製品のすべては、標準形態又は濃縮形態であってよく、又は特定の態様では、このような製品は、更には非水性となり得る程度まで高濃縮された形態であってもよい。
本明細書で使用するとき、用語「洗剤組成物」又は「洗剤配合物」は、特定の布地及び／又は非布地製の物体又は物品などの、汚れた又は泥の付いた物体を洗浄するために洗浄媒質中で使用することが意図される組成物に関して使用される。本発明のこのような組成物は、任意の特定の洗剤組成物又は配合物に限定されない。実際に、いくつかの実施形態では、本発明の洗剤は、少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体に加え、界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー（例えば、ビルダー塩など）、漂白剤、漂白活性化剤、ブルーイング剤、蛍光染料、ケーキング防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化物質、及び／又は可溶化剤を１種以上含有する。場合によっては、ビルダー塩はケイ酸塩とリン酸塩の混合物であり、好ましくはケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）をリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりも多く含む。例えば、限定するものではないが、クリーニング組成物又は洗剤組成物などの、本発明のいくつかの組成物は、リン酸塩（例えば、リン酸塩又はリン酸塩ビルダー）を含まない。
本明細書で使用するとき、用語「漂白」は、物質の増白（すなわち、ホワイトニング）及び／若しくはクリーニングを行うために充分な時間及び／又は適切なｐＨ及び／又は温度条件下での物質（例えば、布地、洗濯物、パルプなど）又は表面の処理を指す。漂白に好適な化学物質の例としては、例えば、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書で使用するとき、プロテアーゼ（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体）の「洗浄性能」は、組成物にプロテアーゼ変異体を加えていない洗剤と比較して、追加のクリーニング性能を洗剤に付与するプロテアーゼ変異体の洗浄への貢献を指す。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。いくつかの試験系では、洗剤組成物、泡濃度、水硬度、洗浄機構、時間、ｐＨ、及び／又は温度などの他の関連する要因を、特定のマーケットセグメントにおける家事用途に典型的な条件（例えば、食器手洗い又は食器手動洗浄、自動食器洗浄、食器クリーニング、食卓用食器類クリーニング、及び布地クリーニングなど）を模倣するように調節することができる。
本明細書において、用語「関連する洗浄条件」は、食器手洗い、自動食器洗浄、又は洗濯洗剤のマーケットセグメントに含まれる家事で実際に使用される条件であって、具体的には、洗浄温度、時間、洗浄機構、泡濃度（sud concentration）、洗剤のタイプ及び水硬度などの条件を意味する。
用語「洗浄性能の改善」は、関連する洗浄条件下で、染み除去において、より良好な仕上がり結果が得られること、又は対応する野生型若しくは開始親プロテアーゼと比較して同様の仕上がり結果を得るにあたり必要とされるプロテアーゼ変異体が重量ベースでより少量ですむことを表すのに使用される。
本明細書で使用するとき、用語、「消毒」は、汚染物質を表面から除去すること、並びに、物品の表面上の微生物の阻害又は死滅を指す。本発明は、任意の特定の表面、物品、又は除去される汚染物若しくは微生物に限定されないと意図される。
本明細書では、「コンパクト」形態のクリーニング組成物は、密度により表され、組成の点で言えば無機塩充填剤の量によって表される。無機塩充填剤は、粉末形態の洗剤組成物の通常の成分である。通常の洗剤組成物では、塩充填剤は、相当量で、典型的には組成物全体の約１７〜約３５重量％で存在する。対照的に、コンパクト組成物では、塩充填剤は、組成物全体の約１５重量％以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、塩充填剤は、組成物の約１０重量％以下、より好ましくは約５％重量以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、無機塩充填剤は、硫酸アルカリ塩及びアルカリ土類金属塩、並びアルカリ塩化物及びアルカリ土類金属塩化物から選択される。いくつかの実施形態では、塩充填剤は硫酸ナトリウムである。
所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置は、本明細書では典型的には、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣのアミノ酸配列の対応するアミノ酸残基の位置に割り振られた番号を用いて付番される。すなわち、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣアミノ酸配列は、参照配列として提供される。本明細書に記載される変異型プロテアーゼのアミノ酸配列などの、所与のアミノ酸配列を、本明細書に記載されるようなアライメントアルゴリズムを使用してＬＧ１２ｓｐｒＣ配列（配列番号３）とアライメントすることができ、及びＬＧ１２ｓｐｒＣ配列中の対応するアミノ酸残基を参照することで、ＬＧ１２ｓｐｒＣ配列中のアミノ酸残基アライメントした（好ましくは部分的にアライメントさせた）所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基を都合よく番号付けすることができる。
概して、本明細書で使用する命名法、並びに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、及びタンパク質化学的な実験手順の多くは周知のものであり、当業者により一般的に採用される。組み換え核酸の製造及び操作法、核酸合成法、細胞培養法、及びトランスジーンの組み込み法（例えば、トランスフェクション、電気穿孔法）は当業者に既知のものであり、様々な一般的な文献に記載されている。オリゴヌクレオチドの合成工程及び精製工程は、典型的には本明細書に従って実施される。概して技術及び手順は、当業者に周知の従来法、並びに本明細書を通して提供される様々な一般参考文献に従って実施される。それらの手順は当業者に周知のものであると考えられ、読み手には便宜のため提供される。
本発明のＬＧ１２−系統群酵素
本明細書で使用するとき、ＬＧ１２−系統群の酵素には、酵素、ポリポリペプチド又はタンパク質、あるいはその活性断片が包含される。本酵素には、実施例、図９Ａ、図９Ｂ、図１０Ａ、図１０Ｂに示すアライメント、及び／又は図８の系統樹に記載の通りのＬＧ１２−系統群のメンバーが包含される。ＬＧ１２−系統群のメンバーは、ＬＧ１２ｓｐｒＣと相同性の近いスブチリシン分子を選択し、これらの配列と他のスブチリシンとの構造ベースのアライメントを生成し、すべてのＬＧ１２−系統群の酵素について保存されていた固有の配列領域を特定することにより特定される。いくつかの実施形態では、ＬＧ１２酵素の系統群は、スブチリシンプロテアーゼを含む、親、野生型、及び／又は変異体配列は、次のアミノ酸モチーフ：Ｓｅｒ２２１、Ｈｉｓ６４、及びＡｓｐ３２を含む触媒三残基；位置５５〜５８のＰｒｏ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｌｅｕモチーフ；Ｔｈｒ１０３−Ｌｅｕ１０４モチーフ；Ｔｙｒ８６−Ａｓｎ／Ａｓｐ８７モチーフ；Ａｌａ１６−Ｈｉｓ１７モチーフ；Ｖａｌ２１−Ｔｈｒ２２モチーフ、及び／又は位置２６７から始まるＣ末端モチーフ：Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｖａｌ／Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｘ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎのうち１つ以上を含み、ここでＸは任意のアミノ酸を表し、残基番号はＬＧ１２ｓｐｒＣ（配列番号３）に対応するものである。ＬＧ１２野生型酵素の系統群の配列であれば、本発明のスブチリシン酵素変異体を生成するための親配列として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＬＧ１２酵素の系統群のスブチリシンプロテアーゼは、上記の通りのシグネチャモチーフのうちいずれか１つ以上を有し得る。ＬＧ１２−系統群のメンバーは、近隣結合法を利用して作製した系統樹において同じ分岐点でクラスター化されることが確認されている（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．ａｎｄ Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）ＭｏｌＢｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５を参照されたい）。ＬＧ１２−系統群の配列同一性は、ＬＧ１２ｓｐｒＣ配列（配列番号３）に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である酵素を包含する。ＬＧ１２−系統群のメンバーは：ＬＧ１２ｓｐｒＣ（配列番号３，ＡＡＣ４３５８０．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）（配列番号７，ＷＰ＿０１０１９２４０３．１，旧称ＺＰ＿０７７０７６５７．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＬＤ１，ＳＢ（ＢＡＤ２１１２８．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（２）（ＷＰ＿１０１９２４０５．１，旧称ＺＰ＿０７７０７６５８．１）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ ８７１９，Ｂｈｏｎ０３３２１（配列番号１０）、ＬＧ１２ｓｐｒＤ（ＡＡＣ４３５８１．１）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１１（配列番号１３）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１２（配列番号１６）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿６９５１（配列番号１９）、及びバチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８（配列番号２０）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＧ１２−系統群の新規酵素及び変異体を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ＬＧ１２−系統群の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、配列番号３のＬＧ１２ｓｐｒＣ配列（配列番号３、ＡＡＣ４３５８０．１）に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂｈｏｎ０３３２１の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、配列番号１０のバチルス種（Bacillus sp.）ＤＳＭ ８７１９スブチリシン酵素Ｂｈｏｎ０３３２１配列に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）（配列番号７，ＷＰ＿０１０１９２４０３．１，旧称ＺＰ＿０７７０７６５７．１）の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、配列番号７のバチルス種（Bacillus sp.）Ｍ３−１３配列に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、バチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、バチルス種（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＬＤ１、ＳＢ（ＢＡＤ２１１２８．１）に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、バチルス種（Bac sp）ＷＰ＿０１０１９２４０５．の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、ババチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（２）（ＷＰ＿１０１９２４０５．１、旧称ＺＰ＿０７７０７６５８．１）に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、バチルス種（Bac sp）ＬＧ１２ＳｐｒＤ ＡＡＣ４３５８１の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、バチルス種（Bac sp）ＬＧ１２ｓｐｒＤ（ＡＡＣ４３５８１．１）に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＳＭ＿９７１１（配列番号１３）の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、ＤＳＭ＿９７１１（配列番号１３）に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＳＭ＿９７１２（配列番号１６）の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、ＤＳＭ＿９７１２（配列番号１６）に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＤＳＭ＿６９５１（配列番号１９）の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、ＤＳＭ＿６９５１（配列番号１９）に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、バチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８（配列番号２０）の新規酵素及び／又は酵素変異体を含み、変異体は、バチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８（配列番号２０）に対し少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する。
ＬＧ１２−系統群の酵素の生産的位置
本発明は、ＬＧ１２−系統群の酵素、例えば、ＬＧ１２ｓｐｒＣセリンプロテアーゼのアミノ酸位置であって、望ましく改変することで、クリーニング性能、洗剤組成物中での酵素の安定性、及び酵素の熱安定性について最低限の性能指数が得られ、かつこれらの特性のうちの少なくとも１つが、上記の例における配列番号３のＬＧ１２ｓｐｒＣなどのＬＧ１２−系統群の親酵素から改良される、アミノ酸位置を提供する。これらの改変は、本発明の好適な改変と考えられる。
用語「熱的安定性」及び「熱安定性」は、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、クリーニングプロセス、又は本明細書において開示される他のプロセスの際に一般に使用される条件下で一定の時間にわたって特定の温度に曝された後に（例えば、変化した温度に曝されている間に）、所定量の酵素活性を維持する本発明のＬＧ１２−系統群セリンプロテアーゼを指す。変化した温度には、温度の上昇又は低下が含まれる。いくつかの実施形態では、ＬＧ１２−系統群プロテアーゼは、変化した温度に、例えば少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分などの所定の時間にわたって曝露した後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のプロテアーゼ活性を保持する。
本明細書で使用するとき、特性が改良されたＬＧ１２−系統群プロテアーゼ酵素としては、対応するＬＧ１２−系統群の親酵素（例えば、野生型又は天然に生じるＬＧ１２−系統群の酵素）と比較してその洗浄性能若しくはクリーニング性能が改良又は増強された、並びに／又は任意選択で洗浄若しくはクリーニング性能が保持されつつ安定性が改良又は増強された、ＬＧ１２−系統群プロテアーゼ酵素変異体が挙げられる。ＬＧ１２−系統群酵素変異体の特性の改善には、洗浄若しくはクリーニング性能の改善及び／又は安定性の改善が含まれ得る。いくつかの実施形態では、本発明は、次の特性、すなわち、参照となるＬＧ１２−系統群の親酵素（例えば、配列番号３の成熟配列を有する野生型ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼなどの、野生型ＬＧ１２ｓｐｒＣ酵素）と比較して、手洗い性能の改良、食器手洗い性能又は手動食器洗浄性能の改良、自動食器洗浄性能の改良、洗濯性能の改良、並びに／又は安定性の改良のうち１つ以上を示す本発明のＬＧ１２−系統群の酵素変異体を提供する。
生産的位置は、改善された特徴を示すコンビナトリアル変異体を製造するのに最も有用な分子内位置として記載され、この位置では、少なくとも１種の組み合わせ可能な変異が生じ得る。組み合わせ可能な変異は、コンビナトリアルな変異体を作製するのに使用することのできる、これらの分子内の置換として記載され得る。組み合わせ可能な変異は、この分子の所望の特性のうち少なくとも１種を改善するが、発現、活性、又は安定性のいずれかを有意に低下させないものである。
組み合わせ可能な変異は、この分子の所望の特性のうち少なくとも１種を改善するが、発現、活性、又は安定性のいずれかを有意に低下させないものである。例えば、ＬＧ１２−系統群プロテアーゼにおいて組み合わせ可能な変異は、実施例１に記載のアッセイ：Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡプロテアーゼアッセイ（活性）、ＥＭＰＡ−１１６アッセイ（活性）、ＰＡＳ−３８見本布地小片アッセイ（活性）、洗剤安定性及び熱安定性アッセイ、並びにタンパク質の定量（発現）、により得られる性能指数（ＰＩ）の値を利用して決定することができる。
組み合わせ可能な変異に加え、ＬＧ１２−系統群プロテアーゼの第２の変異グループ、すなわち組み合わせ可能な活性を有する変異のグループがある。組み合わせ可能な活性を有する変異は、この分子の活性特性のうち少なくとも１つを改善し、１．５以上の性能指数を備えるが、発現又は安定性のＰＩ値を０．５未満に低下させないものである。この組み合わせ可能な活性を有する変異を利用することで、分子の他の既知の望ましい特性（例えば、発現又は安定性）を有意に低下させることなく所望の特性を達成できるように、分子を改変することができる。
ＬＧ１２−系統群のプロテアーゼ酵素の、有用な位置であることが判明しているアミノ酸位置には、洗剤組成物で使用するのに好適な様々な改変をなすことができる。改変としては、特定の位置での挿入、欠失又は置換を挙げることができる。一実施形態では、改変は置換である。各々の位置において、生じ得る好適な改変の数が多ければ、その位置での生産性スコアが高くなる。例えば、アミノ酸位置は、好適な改変として生産的な位置において試験される改変のうち、少なくとも５０％、３０％又は１５％の改変を有することができ、この改変は次の好適な基準ａ）〜ｃ）のうちの少なくとも１つを満たす：
ａ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．９以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもＰＩが１．０以上である生産的位置：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；
ｂ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．８以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもＰＩが１．２以上である生産的位置：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；
ｃ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．５以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれについてもＰＩが１．５以上である生産的位置：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ。
好適な改変として試験した改変のうち少なくとも５０％を有する、本発明のＬＧ１２−系統群の酵素の位置は、位置２７、４０、４３、７８、９８、１３０、１３１、１５８、１６６、１８２、２３７、２３９、２４２、２４５、及び２５１を含み、ここで、ＬＧ１２−系統群の変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。好適な改変には、残基２７（Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｍ）、４０（Ａ、Ｉ、Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｖ、Ｙ）、４３（Ｎ、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｅ）、７８（Ｔ、Ｃ、Ｓ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｗ）、９８（Ａ、Ｙ、Ｖ、Ｄ、Ｆ、Ｋ、Ｎ、Ｗ、Ｈ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）、１３０（Ｓ、Ｉ、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｗ、Ｅ、Ｆ、Ｖ、Ｙ）、１３１（Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｅ）、１５８（Ｓ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｋ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｔ、Ｖ）、１６６（Ｇ、Ｋ、Ｗ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）、１８２（Ｓ、Ｃ、Ｑ、Ｐ、Ｗ、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｒ、Ｙ、Ｄ、Ｅ）、２３７（Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｔ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｑ）、２３９（Ｐ、Ｙ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｖ）、２４２（Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｖ、Ｗ、Ａ、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｓ）、２４５（Ｑ、Ｃ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、Ｄ、Ｓ、Ｙ）、及び２５１（Ｋ、Ｃ、Ｇ、Ｈ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｌ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ）を含み、ここで、ＬＧ１２変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。
好適な改変として試験した改変のうちの少なくとも３０％但し５０％未満を有する、本発明のＬＧ１２−系統群の酵素の位置は、位置２、９、１５、３８、４５、４８、５２、５９、６２、７５、９７、９９、１０３、１１７、１１８、１１９、１２３、１２９、１３３、１４５、１４８、１４９、１５６、１５９、１６１、１８１、２０９、２３６、２４０、２４８、２５６、２６７、２７１、及び２７５を含み、ここで、ＬＧ１２変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。好適な改変には、残基２（Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ｙ）、９（Ｐ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ）、１５（Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｙ、Ａ）、３８（Ｎ、Ｈ、Ｙ、Ａ、Ｑ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｓ）、４５（Ｋ、Ｌ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ａ）、４８（Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ）、５２（Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｖ、Ｄ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｆ）、５９（Ｑ、Ｆ、Ｍ、Ｈ、Ｎ、Ｗ、Ｔ、Ｉ、Ｖ）、６２（Ｎ、Ｅ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｐ、Ｗ）、７５（Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｆ、Ｑ、Ｒ、Ｗ、Ｇ）、９７（Ｓ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ａ、Ｉ）、９９（Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｖ）、１０３（Ｔ、Ｅ、Ａ、Ｙ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｒ、Ｓ、Ｄ）、１１７（Ｎ、Ｍ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）、１１８（Ｇ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｑ、Ｓ）、１１９（Ｍ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）、１２３（Ｎ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｑ）、１２９（Ｓ、Ｅ、Ｉ、Ｒ、Ｙ、Ｋ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｄ）、１３３（Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ｄ、Ｉ）、１４５（Ｒ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｗ、Ｙ、Ｎ）、１４８（Ｖ、Ｄ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｎ、Ｇ、Ｓ）、１４９（Ｖ、Ａ、Ｐ、Ｓ、Ｅ、Ｇ、Ｌ、Ｎ、Ｑ）、１５６（Ｓ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、Ｄ、Ｈ、Ｑ、Ａ、Ｍ、Ｋ、Ｎ）、１５９（Ｓ、Ｃ、Ｆ、Ｔ、Ｍ、Ｎ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｑ）、１６１（Ｎ、Ｆ、Ｋ、Ｗ、Ｍ、Ｓ、Ｄ、Ｅ、Ｒ、Ｙ）、１８１（Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ａ、Ｈ、Ｋ、Ｎ）、２０９（Ｔ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、Ｗ、Ｙ）、２３６（Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｓ）、２４０（Ｓ、Ｈ、Ｑ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｍ）、２４８（Ｅ、Ｑ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｔ、Ｗ、Ｄ、Ｃ、Ｈ、Ｍ、Ｙ）、２５６（Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｗ、Ｅ、Ｐ、Ｒ）、２６７（Ｖ、Ｈ、Ｎ、Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）、２７１（Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ｍ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｗ、Ｙ）、及び２７５（Ｑ、Ｌ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｈ、Ｗ、Ｅ、Ｎ、Ｒ）を含み、ここで、ＬＧ１２変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。
好適な改変として試験した改変のうちの少なくとも１５％但し３０％未満を有する、本発明のＬＧ１２−系統群の酵素の位置は、位置１、３、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、４４、５０、５３、５５、５７、５８、６１、６７、７２、７６、７７、７９、８０、８５、８６、８７、８９、９０、９１、９３、９６、１００、１０１、１０２、１０６、１０７、１０８、１１３、１１６、１２１、１２４、１２６、１２７、１３６、１３７、１４０、１４４、１４７、１５０、１５２、１５３、１６０、１６２、１７０、１７２、１７３、１８３、１８５、１８７、１８８、１９４、２１３、２１６、２１７、２１８、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３５、２４１、２４３、２４４、２４６、２５２、２５５、２６５、及び２７２を含み、ここで、ＬＧ１２変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。好適な改変には、残基１（Ａ、Ｌ、Ｈ、Ｋ、Ｇ、Ｒ）、３（Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｅ、Ｙ、Ｉ、Ｖ）、１８（Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｒ、Ｔ）、１９（Ａ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｗ）、２０（Ｇ、Ｈ、Ｑ、Ｅ、Ｎ）、２２（Ｔ、Ｄ、Ｓ、Ｅ）、２４（Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｒ、Ｖ）、２４（Ｓ、Ｇ、Ｆ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｒ、Ｖ）、２６（Ｖ、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｓ）、２８（Ｖ、Ｎ、Ｓ、Ｅ、Ｔ）、３０（Ｉ、Ｔ、Ａ、Ｅ、Ｖ）、３１（Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｔ）、４４（Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｆ）、５０（Ｆ、Ｒ、Ｓ、Ａ、Ｋ、Ｑ、Ｙ）、５３（Ｇ、Ｙ、Ｈ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｅ）、５５（Ｐ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｒ）、５７（Ａ、Ｇ、Ｗ、Ｐ）、５８（Ｌ、Ｆ、Ｄ、Ｋ）、５８（Ｌ、Ｆ、Ｄ、Ｋ）、６７（Ａ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｐ）、７２（Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ）、７６（Ｎ、Ｆ、Ｐ、Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｙ、Ｄ）、７７（Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ）、７９（Ｔ、Ｅ、Ｍ、Ａ、Ｋ、Ｑ、Ｉ、Ｌ）、８０（Ｇ、Ｃ、Ｐ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｙ）、８５（Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｓ）、８６（Ｙ、Ａ、Ｐ、Ｆ）、８７（Ｎ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、Ｌ、Ｓ）、８９（Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｆ）、９０（Ｌ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｐ）、９１（Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、Ｖ、Ｗ）、９３（Ｖ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ）、９６（Ｌ、Ｇ、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｉ、Ｅ、Ｈ）、１００（Ｇ、Ｆ、Ｋ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｅ）、１０１（Ｓ、Ｍ、Ａ、Ｔ、Ｖ、Ｒ）、１０２（Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｙ）、１０６（Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｅ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ）、１０７（Ｉ、Ｈ、Ｑ、Ｖ、Ｔ）、１０８（Ａ、Ｓ、Ｉ、Ｃ）、１１３（Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｈ）、１１６（Ｓ、Ｅ、Ｆ、Ｍ）、１２１（Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｉ）、１２４（Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｙ、Ａ）、１２６（Ｌ、Ｈ、Ｗ、Ｉ、Ｑ、Ｇ、Ｋ）、１２７（Ｇ、Ｅ、Ｈ、Ｎ）、１３６（Ｑ、Ｌ、Ｈ、Ｗ、Ｆ、Ｒ、Ｄ）、１３７（Ｑ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｈ、Ｔ、Ｅ）、１４０（Ｎ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ｑ）、１４４（Ｎ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｍ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）、１４７（Ｉ、Ｒ、Ｋ、Ｓ、Ａ、Ｈ、Ｍ）、１５０（Ｉ、Ａ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｔ、Ｖ）、１５２（Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｖ）、１５３（Ａ、Ｍ、Ｇ、Ｓ）、１６０（Ｇ、Ｎ、Ｈ、Ｍ）、１６２（Ｒ、Ｋ、Ｍ、Ｖ）、１７０（Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｌ）、１７２（Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｔ、Ｇ、Ｈ）、１７３（Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｄ）、１８３（Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｅ）、１８５（Ｔ、Ｃ、Ｗ、Ｑ、Ｒ、Ｍ）、１８７（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｄ、Ｈ、Ｐ、Ｖ、Ｗ）、１８８（Ｓ、Ｃ、Ｌ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、Ｙ）、１９４（Ｓ、Ｍ、Ｔ、Ｆ、Ｋ、Ｐ、Ｒ、Ｄ）、２１３（Ｎ、Ｖ、Ｗ、Ｇ、Ｍ、Ｒ、Ｋ、Ｑ）、２１６（Ｓ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｔ、Ａ）、２１７（Ｆ、Ｃ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｅ、Ｒ）、２１８（Ｎ、Ｃ、Ｈ、Ｄ）、２２２（Ｍ、Ｃ、Ａ、Ｈ、Ｌ、Ｑ）、２２５（Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｖ）、２２８（Ａ、Ｃ、Ｒ、Ｓ）、２３１（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｓ）、２３４（Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｖ）、２３５（Ｋ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、２４１（Ｍ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｌ、Ｑ、Ｓ、Ｗ）、２４３（Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｇ）、２４４（Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｙ）、２４６（Ｉ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｔ）、２５２（Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｆ、Ｅ）、２５２（Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｆ、Ｅ）、２６５（Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｓ）、及び２７２（Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｋ）を含み、ここで、ＬＧ１２変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。上記変異のそれぞれに関し、最初に掲載した置換はｓｐｒＣ（配列番号３）のもとのアミノ酸を表す。本発明のいくつかの実施形態では、変異体は、ｓｐｒＣのＬＧ１２−系統群の変異体であり、変異は、上掲のもののうち、最初に掲載される置換以外の、いずれかのものである。
好適な改変として試験した少なくとも１つの改変、但し改変の１５％未満を有する、本発明のＬＧ１２−系統群の酵素の位置は、位置４、７、８、１２、１４、１６、１７、２９、３３、４２、４６、５１、５６、６５、６９、７３、８１、８３、８４、８８、９４、１０４、１０９、１１１、１１４、１２０、１２２、１２５、１２８、１３２、１３８、１４１、１４３、１４６、１５１、１６３、１６５、１６７、１７５、１７６、１９５、２０３、２０４、２０５、２０６、２１１、２１２、２１５、２２０、２２４、２２７、２３０、２３２、２３８、２５０、２６０、２６２、２６８、２７３、及び２７４を含み、ここで、ＬＧ１２変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。好適な改変には、残基４（Ｖ、Ｃ）、７（Ｇ、Ｎ）、８（Ｉ、Ｌ）、１２（Ｋ、Ｇ、Ｒ）、１４（Ｄ、Ｌ）、１６（Ａ、Ｇ、Ｖ）、１７（Ｈ、Ａ）、２９（Ａ、Ｔ、Ｓ）、３３（Ｔ、Ｄ）、４２（Ｌ、Ｄ）、４６（Ｇ、Ｎ）、５１（Ｖ、Ｉ）、５６（Ｎ、Ｅ）、６５（Ｇ、Ｔ、Ｖ）、６９（Ａ、Ｇ、Ｔ）、７３（Ａ、Ｇ）、８１（Ｖ、Ｈ、Ｍ）、８３（Ｇ、Ｓ）、８４（Ｖ、Ａ）、８８（Ａ、Ｃ、Ｇ）、９４（Ｋ、Ｇ）、１０４（Ｌ、Ｙ、Ｖ）、１０９（Ｑ、Ｋ）、１１１（Ｉ、Ｖ）、１１４（Ｓ、Ｔ、Ｇ）、１２０（Ｎ、Ｈ、Ｅ）、１２２（Ｉ、Ｍ）、１２５（Ｓ、Ｇ）、１２８（Ｇ、Ｅ、Ｎ）、１３２（Ｓ、Ａ）、１３８（Ａ、Ｅ、Ｓ）、１４１（Ｎ、Ｇ）、１４３（Ｙ、Ｄ、Ｅ）、１４６（Ｇ、Ｎ、Ｒ）、１５１（Ａ、Ｈ）、１６３（Ｎ、Ｓ、Ｄ）、１６５（Ｍ、Ｉ、Ｖ）、１６７（Ｙ、Ｇ）、１６７（Ｙ、Ｇ）、１６７（Ｙ、Ｇ）、１９５（Ｅ、Ｑ）、２０３（Ｖ、Ｃ）、２０４（Ｎ、Ｅ）、２０５（Ｉ、Ｖ）、２０６（Ｌ、Ｙ）、２１１（Ｇ、Ｃ）、２１１（Ｇ、Ｃ）、２１５（Ａ、Ｄ、Ｅ）、２２０（Ｔ、Ａ、Ｇ）、２２４（Ａ、Ｓ）、２２４（Ａ、Ｓ）、２３０（Ａ、Ｓ）、２３２（Ａ、Ｓ）、２３８（Ｙ、Ｗ、Ｆ）、２５０（Ｌ、Ｉ、Ｍ）、２６０（Ｐ、Ｙ）、２６０（Ｐ、Ｙ）、２６８（Ｉ、Ｆ）、２７３（Ａ、Ｓ）、及び２７３（Ａ、Ｓ）を含み、ここで、ＬＧ１２変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＬＧ１２−系統群酵素は、親と比較して有益な変異を有し、この効果は、下表に掲載する通りの、次の：Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｕｌｔｒａ ＨＤＤ（ｐＨ１０．６）又はＯＭＯ Ｃｏｌｏｒ ＨＤＤ（ｐＨ１０．６）において、ＨＤＤ ＰＩ値が１．０１以上である；ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ（ｐＨ８．２）において、ＨＤＬ（ｐＨ８）ＰＩ値が１．０１以上である；Ｂｌｕｅ Ｍｏｏｎ ｐＨ６．５において、ＨＤＬ（ｐＨ６）ＰＩ値が１．０１以上である；洗剤及び緩衝剤、５１℃のＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ（ｐＨ８．２）又は５２℃のＬＡＳ−ＥＤＴＡ緩衝剤において、洗濯安定性のＰＩ値が１．０１以上である；洗剤、ＧＳＭ−Ｂ、ＧＳＭ−Ｂ ｐＨ９、ＧＳＭ−Ｃ、Ｓｕｎ Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ、又はＦｉｎｉｓｈ Ｑｕａｎｔｕｍ ｔａｂｌｅｔにおいて、ＡＤＷ ＰＩ値が１．０１以上である；洗剤及び緩衝剤、６８．５℃のＧＳＭ−Ｂ、６２℃のＧＳＭ−Ｃ、５１℃のＴｒｉｓ ＥＤＴＡ緩衝液、７２．５℃のＴｒｉｓ−カルシウム緩衝液において、ＡＤＷ安定性のＰＩ値が１．０１以上である；のうちのいずれか１つ以上であり得る。それぞれに分類する基準には、効果の１つ以上について、ＰＩが１．０１を超え、かつ発現についてＰＩが０．７５を超えるというものが含まれる。
本発明のいくつかの実施形態では、洗濯安定性に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ０２９Ｔ、Ｉ０３０Ａ、Ｉ０３０Ｖ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｒ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｖ、Ａ０４０Ｗ、Ａ０４０Ｙ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｇ、Ｔ１０３Ｋ、Ｔ１０３Ｒ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｒ、Ｎ１８３Ｅ、Ｖ０９３Ｔ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｄ、Ｌ１２６Ｇ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｑ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２５Ｇ、Ｓ１２９Ａ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１２９Ｋ、Ｓ１２９Ｑ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｆ、Ｓ１３０Ｈ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、Ｓ１３０Ｗ、Ｓ１３０Ｙ、Ｇ１３１Ｄ、Ｇ１３１Ｅ、Ｇ１３１Ｒ、Ｑ１３７Ｅ、Ｓ０９９Ｋ、Ｇ１０２Ｅ、Ｇ１０２Ｆ、Ｇ１０２Ｙ、Ｉ１０７Ｈ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｖ１２１Ｇ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ａ２２４Ｐ、Ａ２２４Ｓ、Ｋ０１５Ｖ、Ｐ２２５Ｇ、Ｔ１８５Ｑ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３６Ｒ、Ｑ１３６Ｗ、Ｎ１６３Ｄ、Ｅ２４８Ｃ、Ｅ２４８Ｄ、Ａ０１９Ｍ、Ｔ０２２Ｄ、Ｔ０２２Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｌ０９０Ｐ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｇ１００Ｆ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｎ、Ｖ１４８Ｓ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｉ２４６Ｎ、Ｎ２４３Ｇ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｆ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｅ、Ｑ２７５Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｙ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｋ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｓ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｙ０９１Ｈ、Ｙ０９１Ｎ、Ｍ２４１Ｑ、Ｍ２４１Ｓ、Ｍ２４１Ｗ、Ｖ２４４Ｙ、Ｎ２５２Ｅ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｒ、Ｆ０５０Ｙ、Ｖ０５１Ｉ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｓ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｌ０７５Ｇ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ１６６Ｙ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｑ、Ｇ０５３Ｒ、Ｙ１４３Ｄ、Ｙ１４３Ｅ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｈ、Ｓ１８１Ｎ、Ｓ１８１Ｑ、Ｇ１５４Ｆ、Ｇ１５４Ｈ、Ｇ１５４Ｉ、Ｇ１５４Ｋ、Ｇ１５４Ｔ、Ｓ１９４Ｋ、Ｓ１９４Ｐ、Ｓ１９４Ｒ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｙ１７１Ｇ、Ｙ１７１Ｑ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｋ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｔ２５５Ｄ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｗ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｍ、Ｔ１３３Ｎ、Ｔ１３３Ｖ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｎ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｓ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ１５２Ｐ、Ａ１５２Ｖ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｄ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｍ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｗ、Ｆ２１７Ｒ、Ｔ２２０Ｇ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｇ１２８Ｎ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｔ２０９Ｙ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｓ２４０Ｐ、Ｓ２４０Ｑ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｌ０９６Ｅ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｌ０９６Ｒ、Ｌ０９６Ｙ、Ｓ１１６Ｅ、Ｖ０８１Ｍ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｋ２３５Ｆ、Ｋ２３５Ｇ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｒ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ｍ２２２Ａ、Ｍ２２２Ｈ、及びＭ２２２Ｑからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬ（ｐＨ６）での洗濯性能に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ｉ０３０Ａ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｙ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｎ、Ｎ１８３Ｅ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｍ１２４Ｓ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｖ１２１Ｇ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ａ２２４Ｓ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｔ０２２Ｄ、Ｔ０２２Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｌ０９０Ｐ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｉ２４６Ｎ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｆ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｅ、Ｑ２７５Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｑ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｙ０９１Ｈ、Ｍ２４１Ｓ、Ｍ２４１Ｗ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｑ、Ｔ０７９Ｌ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｙ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｙ１４３Ｄ、Ｙ１４３Ｅ、Ｓ１８１Ｈ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｔ２５５Ｄ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｎ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｄ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｍ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｌ０９６Ｅ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、及びＶ２６７Ｓからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＬ（ｐＨ８）での洗濯性能に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ０２９Ｇ、Ａ０２９Ｔ、Ｔ０３３Ｎ、Ｔ０３３Ｖ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ｇ０６５Ａ、Ａ０６９Ｇ、Ｋ０９４Ａ、Ｋ０９４Ｄ、Ｋ０９４Ｅ、Ｋ０９４Ｈ、Ｋ０９４Ｌ、Ｋ０９４Ｍ、Ｋ０９４Ｎ、Ｋ０９４Ｓ、Ｋ０９４Ｔ、Ｖ０９５Ａ、Ｖ０９５Ｓ、Ｇ１１０Ｓ、Ｉ１１１Ｍ、Ｙ０８６Ｄ、Ｙ０８６Ｅ、Ｙ０８６Ｉ、Ｙ０８６Ｐ、Ｙ０８６Ｓ、Ｙ０８６Ｔ、Ｓ１０１Ａ、Ｔ１０３Ａ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｎ、Ｌ１０４Ｉ、Ｌ１０４Ｔ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｇ、Ｓ０５２Ｈ、Ｓ０５２Ｌ、Ｌ０５８Ｖ、Ｎ１８３Ｅ、Ｇ０８３Ａ、Ｖ０８４Ｅ、Ｖ０９３Ｉ、Ｌ０３１Ａ、Ｌ０３１Ｅ、Ｌ０３１Ｎ、Ｌ０３１Ｑ、Ｇ０３４Ａ、Ｇ０３４Ｅ、Ａ０３７Ｄ、Ａ０３７Ｅ、Ａ０３７Ｆ、Ａ０３７Ｈ、Ａ０３７Ｌ、Ａ０３７Ｍ、Ａ０３７Ｎ、Ａ０３７Ｑ、Ａ０３７Ｔ、Ａ０３７Ｗ、Ｖ０６８Ｄ、Ｖ０６８Ｑ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｑ、Ｍ１１９Ａ、Ｍ１１９Ｆ、Ｍ１１９Ｈ、Ｍ１１９Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｎ１２３Ａ、Ｎ１２３Ｄ、Ｎ１２３Ｅ、Ｎ１２３Ｇ、Ｎ１２３Ｈ、Ｎ１２３Ｉ、Ｎ１２３Ｑ、Ａ１８７Ｄ、Ａ１８７Ｈ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ０６２Ｋ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｐ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｐ、Ｑ１３７Ｅ、Ｎ１４４Ｍ、Ｓ０９７Ｇ、Ｓ０９７Ｈ、Ｓ０９７Ｉ、Ｓ０９７Ｌ、Ｓ０９７Ｍ、Ｓ０９７Ｙ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｐ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｈ、Ａ００１Ｌ、Ｔ００３Ｅ、Ｖ００４Ｅ、Ｄ０１４Ｅ、Ｅ１９７Ｄ、Ｌ２０６Ｙ、Ｉ０１１Ａ、Ｉ０１１Ｓ、Ｉ０１１Ｔ、Ａ０１３Ｓ、Ｋ０１５Ｈ、Ｋ０１５Ｍ、Ｋ０１５Ｎ、Ｋ０１５Ｐ、Ｋ０１５Ｑ、Ｋ０１５Ｓ、Ｋ０１５Ｔ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０１５Ｙ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｐ００５Ｄ、Ｐ００５Ｔ、Ｋ０２７Ｄ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｇ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｎ、Ｋ０２７Ｑ、Ｋ０２７Ｔ、Ｋ０２７Ｙ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｓ０４９Ａ、Ｓ０４９Ｄ、Ｓ０４９Ｅ、Ｓ０４９Ｇ、Ｓ０４９Ｈ、Ｓ０４９Ｉ、Ｓ０４９Ｋ、Ｓ０４９Ｎ、Ｓ０４９Ｑ、Ｓ０４９Ｔ、Ｓ０４９Ｖ、Ｓ０４９Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｎ１６３Ｅ、Ｇ２１１Ｄ、Ｇ２１１Ｑ、Ｇ２１１Ｔ、Ｗ００６Ａ、Ｗ００６Ｄ、Ｗ００６Ｈ、Ｗ００６Ｌ、Ｗ００６Ｍ、Ｗ００６Ｎ、Ｗ００６Ｐ、Ｗ００６Ｑ、Ｗ００６Ｓ、Ａ０１９Ｋ、Ａ０１９Ｗ、Ｔ０２２Ｇ、Ｔ０２２Ｌ、Ｇ０６１Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ１５８Ｈ、Ｓ１５８Ｑ、Ｌ０９０Ｅ、Ｌ０９０Ｇ、Ｌ０９０Ｎ、Ｌ０９０Ｑ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ａ、Ｖ１４８Ｄ、Ｖ１４８Ｅ、Ｖ１４８Ｆ、Ｖ１４８Ｇ、Ｖ１４８Ｌ、Ｖ１４８Ｑ、Ｔ１６４Ｄ、Ｔ１６４Ｅ、Ｎ１８４Ａ、Ｎ１８４Ｈ、Ｆ１８９Ａ、Ｆ１８９Ｄ、Ｆ１８９Ｅ、Ｆ１８９Ｉ、Ｆ１８９Ｌ、Ｆ１８９Ｓ、Ｆ１８９Ｖ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｐ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｉ２４６Ａ、Ｉ２４６Ｃ、Ｌ２７４Ｄ、Ｌ２７４Ｅ、Ｌ２７４Ｇ、Ｎ２４３Ｄ、Ｈ０１７Ｉ、Ｖ０２１Ｄ、Ｌ２５７Ｃ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｉ、Ｓ０２４Ｇ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｌ、Ｑ２７５Ｔ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｌ、Ｅ０５４Ｆ、Ｅ０５４Ｇ、Ｅ０５４Ｈ、Ｅ０５４Ｉ、Ｅ０５４Ｌ、Ｅ０５４Ｍ、Ｅ０５４Ｎ、Ｅ０５４Ｐ、Ｅ０５４Ｒ、Ｅ０５４Ｔ、Ｅ０５４Ｖ、Ｅ０５４Ｗ、Ａ０７３Ｉ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｆ、Ｎ０８７Ｈ、Ｎ０８７Ｐ、Ｎ０８７Ｑ、Ｎ０８７Ｓ、Ａ０８８Ｄ、Ａ０８８Ｇ、Ａ０８８Ｎ、Ａ０８８Ｐ、Ａ０８８Ｑ、Ｄ０８９Ｆ、Ｄ０８９Ｋ、Ｄ０８９Ｌ、Ｙ０９１Ｔ、Ｙ０９１Ｖ、Ｙ０９１Ｗ、Ｇ０２０Ｅ、Ｇ０２０Ｈ、Ｇ０２０Ｌ、Ｇ０２０Ｖ、Ｇ０２０Ｙ、Ｇ０４６Ｅ、Ｇ０４６Ｌ、Ｇ０４６Ｍ、Ｎ２５２Ｅ、Ｎ２５２Ｆ、Ｎ２５２Ｉ、Ｎ２５２Ｌ、Ｎ２５２Ｑ、Ｎ２５２Ｓ、Ｆ２６１Ｙ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｖ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｓ２７２Ｖ、Ｎ０５６Ａ、Ｎ０５６Ｅ、Ｎ０５６Ｈ、Ｎ０５６Ｉ、Ｎ０５６Ｌ、Ｎ０５６Ｍ、Ｎ０５６Ｑ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０５６Ｖ、Ａ０７４Ｇ、Ｎ０７７Ｄ、Ｎ０７７Ｇ、Ｎ０７７Ｐ、Ｔ２０８Ａ、Ａ２３１Ｆ、Ａ２３１Ｌ、Ａ０１８Ｆ、Ａ０１８Ｋ、Ａ０１８Ｌ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１８Ｐ、Ａ０１８Ｑ、Ａ０１８Ｓ、Ａ０１８Ｔ、Ａ０１８Ｖ、Ａ０１８Ｗ、Ａ０１８Ｙ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｈ、Ｎ０３８Ｉ、Ｎ０３８Ｋ、Ｎ０３８Ｐ、Ｎ０３８Ｑ、Ｎ０３８Ｔ、Ｎ０３８Ｙ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｅ２７１Ａ、Ｅ２７１Ｄ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｍ、Ｅ２７１Ｗ、Ｆ０５０Ｉ、Ｆ０５０Ｓ、Ｆ０５０Ｙ、Ｖ０５１Ｄ、Ｖ０５１Ｅ、Ｖ０５１Ｆ、Ｖ０５１Ｇ、Ｖ０５１Ｋ、Ｖ０５１Ｌ、Ｖ０５１Ｍ、Ｖ０５１Ｎ、Ｖ０５１Ｐ、Ｖ０５１Ｑ、Ｖ０５１Ｒ、Ｖ０５１Ｔ、Ｖ０５１Ｗ、Ｖ０５１Ｙ、Ａ０５７Ｃ、Ａ０５７Ｄ、Ａ０５７Ｅ、Ａ０５７Ｉ、Ａ０５７Ｋ、Ａ０５７Ｌ、Ａ０５７Ｍ、Ａ０５７Ｎ、Ａ０５７Ｑ、Ａ０５７Ｒ、Ａ０５７Ｓ、Ａ０５７Ｔ、Ａ０５７Ｖ、Ａ０５７Ｙ、Ｌ０７５Ａ、Ｌ０７５Ｄ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｎ、Ｌ０７５Ｑ、Ｌ０７５Ｓ、Ｌ０７５Ｔ、Ｌ０７５Ｖ、Ｌ０７５Ｗ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｉ１７５Ａ、Ｉ１７５Ｆ、Ｉ１７５Ｑ、Ｉ１７５Ｓ、Ｉ１７５Ｔ、Ｉ１７５Ｖ、Ｇ０５３Ａ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｉ、Ｇ０５３Ｌ、Ｇ０５３Ｐ、Ｐ０５５Ａ、Ｐ０５５Ｇ、Ｐ０５５Ｍ、Ｐ０５５Ｗ、Ｐ０５５Ｙ、Ｓ１９４Ｇ、Ａ２３２Ｈ、Ａ２３２Ｉ、Ａ２３２Ｎ、Ａ２３２Ｑ、Ａ２３２Ｓ、Ａ２３２Ｔ、Ｉ２３４Ｍ、Ｉ２３４Ｎ、Ｉ２３４Ｓ、Ｉ２３４Ｔ、Ｉ２３４Ｖ、Ｉ２３４Ｗ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｄ、Ｋ２３７Ｆ、Ｋ２３７Ｌ、Ｋ２３７Ｍ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｔ、Ｋ２３７Ｖ、Ｋ２３７Ｗ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ａ２１５Ｍ、Ｖ２０３Ａ、Ｖ２０３Ｄ、Ｖ２０３Ｅ、Ｖ２０３Ｇ、Ｖ２０３Ｉ、Ｖ２０３Ｌ、Ｌ２３３Ｇ、Ｌ２３３Ｈ、Ｌ２３３Ｎ、Ｌ２３３Ｔ、Ｌ２５０Ｉ、Ｋ０１２Ｄ、Ｋ０１２Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０１２Ｈ、Ｋ０１２Ｌ、Ｋ０１２Ｍ、Ｋ０１２Ｔ、Ｋ０１２Ｙ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｄ、Ｖ０７２Ｅ、Ｖ０７２Ｆ、Ｖ０７２Ｇ、Ｖ０７２Ｉ、Ｖ０７２Ｔ、Ｙ１６７Ｄ、Ｙ１６７Ｅ、Ｙ１６７Ｆ、Ｙ１６７Ｐ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１７２Ｎ、Ｙ２３８Ａ、Ｙ２３８Ｃ、Ｙ２３８Ｅ、Ｙ２３８Ｆ、Ｙ２３８Ｇ、Ｙ２３８Ｓ、Ｙ２３８Ｗ、Ｔ２５５Ｌ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｉ０３５Ａ、Ｉ０３５Ｆ、Ｉ０３５Ｇ、Ｉ０３５Ｌ、Ｉ０３５Ｍ、Ｉ０３５Ｔ、Ｖ２２７Ｆ、Ｖ２２７Ｓ、Ｖ２２７Ｙ、Ｆ２６２Ｅ、Ｆ２６２Ｉ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｔ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｎ１６１Ｆ、Ｎ１６１Ｓ、Ｎ１６１Ｗ、Ｎ１６１Ｙ、Ｒ１７０Ｉ、Ｒ１７０Ｌ、Ｒ１７０Ｍ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｎ、Ｇ１４６Ｑ、Ｄ０６０Ｅ、Ｄ０６０Ｎ、Ｄ０６０Ｓ、Ｗ１１３Ｆ、Ａ１３８Ｅ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４０Ｇ、Ｖ１４９Ｄ、Ｖ１４９Ｆ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｉ１５０Ａ、Ｎ２１２Ｉ、Ｎ２１２Ｌ、Ｎ２１２Ｑ、Ｎ２１２Ｗ、Ｓ２１６Ｄ、Ａ２２８Ｇ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｌ、Ｐ２３９Ｎ、Ｑ００２Ｅ、Ｑ００２Ｓ、Ｆ２１７Ｄ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｔ、Ｈ２２６Ｄ、Ｈ２２６Ｅ、Ｈ２２６Ｌ、Ｈ２２６Ｑ、Ｈ２２６Ｔ、Ａ２３０Ｆ、Ａ２３０Ｈ、Ａ２３０Ｉ、Ａ２３０Ｍ、Ａ２３０Ｑ、Ｑ０５９Ｉ、Ａ０１６Ｈ、Ａ０１６Ｗ、Ｐ２１０Ｄ、Ｐ２１０Ｅ、Ｐ２１０Ｗ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｇ０６３Ｄ、Ｇ０６３Ｅ、Ｇ０６３Ｌ、Ｇ０６３Ｍ、Ｇ０６３Ｎ、Ｇ０６３Ｓ、Ｇ０６３Ｔ、Ｇ０６３Ｖ、Ａ０９８Ｆ、Ａ０９８Ｓ、Ｉ１２２Ｌ、Ｖ１９８Ａ、Ｖ１９８Ｃ、Ｖ１９８Ｆ、Ｖ１９８Ｔ、Ｔ２０９Ｍ、Ｔ２０９Ｑ、Ｔ２０９Ｖ、Ｎ２１３Ｄ、Ｎ２１３Ｅ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｆ、Ａ２３６Ｌ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｐ、Ｔ２４２Ｅ、Ｔ２４２Ｑ、Ｐ２６０Ｃ、Ｇ２５８Ｄ、Ｎ１４１Ｇ、Ｓ１７３Ｄ、Ｙ２１４Ｍ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｔ、Ｈ０１０Ｌ、Ｌ０９６Ｅ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｓ１１６Ｅ、Ｓ１１６Ｆ、Ｇ０２５Ａ、Ｇ０２５Ｆ、Ｖ０８１Ｐ、Ｈ０３９Ｇ、Ｈ０３９Ｔ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｖ２６７Ｌ、Ｖ２６７Ｎ、Ａ１５１Ｈ、Ｇ１６０Ｆ、Ｇ１６０Ｈ、Ｇ１６０Ｍ、Ｇ１６０Ｖ、Ｍ２２２Ｌ、及びＭ２２２Ｙからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、ＨＤＤでの洗濯性能に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ０２９Ｇ、Ａ０２９Ｓ、Ａ０２９Ｔ、Ｉ０３０Ｓ、Ｉ０３０Ｖ、Ｉ０３０Ｙ、Ｔ０３３Ｎ、Ｔ０３３Ｖ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｇ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｐ、Ａ０４０Ｙ、Ｇ０６５Ａ、Ｔ０６６Ｓ、Ｈ０６７Ａ、Ｈ０６７Ｅ、Ｈ０６７Ｆ、Ｈ０６７Ｇ、Ｈ０６７Ｋ、Ｈ０６７Ｌ、Ｈ０６７Ｍ、Ｈ０６７Ｎ、Ｈ０６７Ｐ、Ｈ０６７Ｑ、Ｈ０６７Ｓ、Ｈ０６７Ｔ、Ｈ０６７Ｖ、Ｈ０６７Ｙ、Ａ０６９Ｇ、Ｋ０９４Ａ、Ｋ０９４Ｄ、Ｋ０９４Ｅ、Ｋ０９４Ｈ、Ｋ０９４Ｌ、Ｋ０９４Ｍ、Ｋ０９４Ｎ、Ｋ０９４Ｓ、Ｋ０９４Ｔ、Ｖ０９５Ａ、Ｖ０９５Ｓ、Ｖ０９５Ｔ、Ｇ１１０Ｓ、Ｉ１１１Ｍ、Ｉ１１１Ｖ、Ｙ０８６Ｄ、Ｙ０８６Ｅ、Ｙ０８６Ｉ、Ｙ０８６Ｋ、Ｙ０８６Ｍ、Ｙ０８６Ｐ、Ｙ０８６Ｑ、Ｙ０８６Ｔ、Ｙ０８６Ｗ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０１Ｔ、Ｓ１０１Ｖ、Ｔ１０３Ａ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｇ、Ｔ１０３Ｌ、Ｔ１０３Ｎ、Ｔ１０３Ｓ、Ｔ１０３Ｙ、Ｌ１０４Ｉ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｇ、Ｓ０５２Ｈ、Ｓ０５２Ｌ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｑ、Ｓ０５２Ｔ、Ｓ０５２Ｖ、Ｌ０５８Ａ、Ｌ０５８Ｄ、Ｌ０５８Ｈ、Ｌ０５８Ｉ、Ｌ０５８Ｒ、Ｌ０５８Ｔ、Ｌ０５８Ｖ、Ｎ１８３Ｅ、Ｎ１８３Ｉ、Ｎ１８３Ｍ、Ｎ１８３Ｐ、Ｎ１８３Ｙ、Ｇ０８３Ａ、Ｇ０８３Ｓ、Ｖ０８４Ｌ、Ｖ０８４Ｓ、Ｖ０８４Ｔ、Ａ０８５Ｉ、Ａ０８５Ｓ、Ｖ０９３Ｇ、Ｖ０９３Ｉ、Ｖ０９３Ｍ、Ｖ０９３Ｔ、Ｌ０３１Ａ、Ｌ０３１Ｅ、Ｌ０３１Ｎ、Ｌ０３１Ｑ、Ｌ０３１Ｔ、Ｇ０３４Ａ、Ｇ０３４Ｅ、Ａ０３７Ｄ、Ａ０３７Ｅ、Ａ０３７Ｆ、Ａ０３７Ｈ、Ａ０３７Ｌ、Ａ０３７Ｍ、Ａ０３７Ｎ、Ａ０３７Ｑ、Ａ０３７Ｒ、Ａ０３７Ｓ、Ａ０３７Ｔ、Ａ０３７Ｗ、Ｖ０６８Ｄ、Ｖ０６８Ｉ、Ｖ０６８Ｍ、Ｖ０６８Ｑ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｎ１１７Ｋ、Ｎ１１７Ｍ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｎ１１７Ｙ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｇ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｑ、Ｍ１１９Ａ、Ｍ１１９Ｆ、Ｍ１１９Ｈ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１１９Ｑ、Ｍ１１９Ｓ、Ｍ１１９Ｔ、Ｎ１２３Ａ、Ｎ１２３Ｄ、Ｎ１２３Ｅ、Ｎ１２３Ｇ、Ｎ１２３Ｈ、Ｎ１２３Ｉ、Ｎ１２３Ｑ、Ａ１８７Ｄ、Ａ１８７Ｆ、Ａ１８７Ｇ、Ａ１８７Ｈ、Ａ１８７Ｎ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｗ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ０６２Ｋ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｐ、Ｎ０６２Ｗ、Ｓ１２９Ａ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１２９Ｇ、Ｓ１２９Ｑ、Ｓ１２９Ｔ、Ｓ１２９Ｙ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｐ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｇ１３１Ｄ、Ｇ１３１Ｐ、Ｇ１３１Ｑ、Ｇ１３１Ｓ、Ｓ１３２Ａ、Ｑ１３７Ｅ、Ｑ１３７Ｈ、Ｑ１３７Ｉ、Ｑ１３７Ｔ、Ｎ１４４Ｈ、Ｎ１４４Ｖ、Ｎ１４４Ｙ、Ａ１５３Ｓ、Ｓ０９７Ｇ、Ｓ０９７Ｈ、Ｓ０９７Ｉ、Ｓ０９７Ｋ、Ｓ０９７Ｌ、Ｓ０９７Ｍ、Ｓ０９７Ｎ、Ｓ０９７Ｙ、Ｓ０９９Ｉ、Ｓ０９９Ｌ、Ｓ０９９Ｖ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０Ｐ、Ｎ１２０Ｔ、Ｖ１２１Ａ、Ｖ１２１Ｆ、Ｖ１２１Ｇ、Ｖ１２１Ｓ、Ｖ１７７Ｉ、Ｖ１７７Ｔ、Ａ１７９Ｇ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｆ、Ｓ１８２Ｌ、Ｓ１８２Ｍ、Ｓ１８２Ｎ、Ｓ１８２Ｗ、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｌ、Ａ００１Ｒ、Ｔ００３Ｅ、Ｔ００３Ｈ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ｔ００３Ｙ、Ｖ００４Ｅ、Ｖ００４Ｆ、Ｖ００４Ｇ、Ｖ００４Ｈ、Ｖ００４Ｐ、Ｖ００４Ｓ、Ｖ００４Ｙ、Ｄ０１４Ｅ、Ｄ０１４Ｆ、Ｄ０１４Ｇ、Ｄ０１４Ｈ、Ｄ０１４Ｔ、Ｄ０１４Ｙ、Ｅ１９７Ｄ、Ｉ２０５Ａ、Ｉ２０５Ｃ、Ｉ２０５Ｍ、Ｉ２０５Ｎ、Ｌ２０６Ｆ、Ｌ２０６Ｋ、Ｌ２０６Ｍ、Ｌ２０６Ｎ、Ｌ２０６Ｒ、Ｌ２０６Ｓ、Ｌ２０６Ｖ、Ｌ２０６Ｗ、Ｌ２０６Ｙ、Ａ２２４Ｓ、Ｉ０１１Ａ、Ｉ０１１Ｍ、Ｉ０１１Ｔ、Ｉ０１１Ｖ、Ａ０１３Ｓ、Ｋ０１５Ｈ、Ｋ０１５Ｍ、Ｋ０１５Ｎ、Ｋ０１５Ｐ、Ｋ０１５Ｑ、Ｋ０１５Ｓ、Ｋ０１５Ｔ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０１５Ｙ、Ａ０９２Ｖ、Ｔ１８５Ｆ、Ｔ１８５Ｇ、Ｔ１８５Ｈ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｐ００５Ｄ、Ｐ００５Ｉ、Ｐ００５Ｍ、Ｐ００５Ｓ、Ｐ００５Ｔ、Ｐ００５Ｖ、Ｇ００７Ｙ、Ｋ０２７Ｄ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｇ、Ｋ０２７Ｈ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｎ、Ｋ０２７Ｐ、Ｋ０２７Ｑ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｋ０２７Ｙ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｇ、Ｎ０４３Ｈ、Ｎ０４３Ｉ、Ｎ０４３Ｋ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｍ、Ｎ０４３Ｑ、Ｎ０４３Ｓ、Ｎ０４３Ｖ、Ｎ０４３Ｗ、Ｓ０４９Ａ、Ｓ０４９Ｄ、Ｓ０４９Ｅ、Ｓ０４９Ｇ、Ｓ０４９Ｈ、Ｓ０４９Ｉ、Ｓ０４９Ｋ、Ｓ０４９Ｎ、Ｓ０４９Ｑ、Ｓ０４９Ｒ、Ｓ０４９Ｔ、Ｓ０４９Ｖ、Ｓ０４９Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｑ１３６Ｇ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３６Ｌ、Ｑ１３６Ｎ、Ｑ１３６Ｖ、Ｎ１６３Ｄ、Ｎ１６３Ｅ、Ｎ２０４Ｌ、Ｇ２１１Ｈ、Ｇ２１１Ｋ、Ｇ２１１Ｑ、Ｇ２１１Ｔ、Ｅ２４８Ａ、Ｅ２４８Ｈ、Ｉ００８Ａ、Ｉ００８Ｇ、Ｉ００８Ｈ、Ｉ００８Ｎ、Ｉ００８Ｐ、Ｉ００８Ｔ、Ｉ００８Ｖ、Ｉ００８Ｙ、Ｖ０２８Ｅ、Ｖ０２８Ｆ、Ｖ０２８Ｈ、Ｖ０２８Ｉ、Ｖ０２８Ｌ、Ｖ０２８Ｍ、Ｖ０２８Ｎ、Ｖ０２８Ｑ、Ｖ０２８Ｓ、Ｖ０２８Ｔ、Ｌ０４２Ｉ、Ｌ０４２Ｍ、Ｌ０４２Ｎ、Ｌ０４２Ｑ、Ｌ０４２Ｔ、Ｌ０４２Ｖ、Ｗ００６Ａ、Ｗ００６Ｄ、Ｗ００６Ｈ、Ｗ００６Ｋ、Ｗ００６Ｌ、Ｗ００６Ｍ、Ｗ００６Ｎ、Ｗ００６Ｐ、Ｗ００６Ｑ、Ｗ００６Ｓ、Ｗ００６Ｙ、Ａ０１９Ｆ、Ａ０１９Ｋ、Ａ０１９Ｌ、Ａ０１９Ｍ、Ａ０１９Ｒ、Ａ０１９Ｗ、Ａ０１９Ｙ、Ｔ０２２Ｅ、Ｔ０２２Ｇ、Ｔ０２２Ｉ、Ｔ０２２Ｌ、Ｔ０２２Ｍ、Ｔ０２２Ｑ、Ｔ０２２Ｒ、Ｔ０２２Ｓ、Ｔ０２２Ｖ、Ｔ０２２Ｗ、Ｖ０２６Ｅ、Ｖ０２６Ｆ、Ｖ０２６Ｈ、Ｖ０２６Ｌ、Ｖ０２６Ｎ、Ｖ０２６Ｑ、Ｖ０２６Ｒ、Ｖ０２６Ｓ、Ｇ０６１Ａ、Ｇ０６１Ｅ、Ｇ０６１Ｉ、Ｇ０６１Ｍ、Ｇ０６１Ｐ、Ｇ０６１Ｓ、Ｇ０６１Ｔ、Ｇ０６１Ｙ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ１５８Ｇ、Ｓ１５８Ｈ、Ｓ１５８Ｍ、Ｓ１５８Ｎ、Ｓ１５８Ｑ、Ｓ１５８Ｔ、Ｓ１５８Ｖ、Ｌ０９０Ｅ、Ｌ０９０Ｆ、Ｌ０９０Ｇ、Ｌ０９０Ｎ、Ｌ０９０Ｐ、Ｌ０９０Ｑ、Ｌ０９０Ｒ、Ｌ０９０Ｙ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｄ、Ｖ１４８Ｅ、Ｖ１４８Ｇ、Ｖ１４８Ｌ、Ｖ１４８Ｍ、Ｖ１４８Ｑ、Ｖ１４８Ｓ、Ｎ１８４Ａ、Ｎ１８４Ｓ、Ｆ１８９Ａ、Ｆ１８９Ｄ、Ｆ１８９Ｅ、Ｆ１８９Ｇ、Ｆ１８９Ｈ、Ｆ１８９Ｉ、Ｆ１８９Ｋ、Ｆ１８９Ｌ、Ｆ１８９Ｍ、Ｆ１８９Ｎ、Ｆ１８９Ｐ、Ｆ１８９Ｑ、Ｆ１８９Ｓ、Ｆ１８９Ｔ、Ｆ１８９Ｖ、Ｐ２０１Ｌ、Ｐ２０１Ｓ、Ｐ２０１Ｔ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｆ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｐ、Ｑ２４５Ｒ、Ｑ２４５Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｗ、Ｑ２４５Ｙ、Ｉ２４６Ａ、Ｉ２４６Ｆ、Ｉ２４６Ｍ、Ｉ２４６Ｖ、Ｌ２７４Ｆ、Ｌ２７４Ｍ、Ｌ２７４Ｙ、Ｎ２４３Ｄ、Ｎ２４３Ｋ、Ｎ２４３Ｌ、Ｎ２４３Ｐ、Ｎ２４３Ｒ、Ｔ２５３Ｆ、Ｔ２５３Ｇ、Ｔ２５３Ｋ、Ｔ２５３Ｎ、Ａ２５４Ｇ、Ａ２５４Ｔ、Ｈ０１７Ｉ、Ｈ０１７Ｌ、Ｈ０１７Ｐ、Ｈ０１７Ｓ、Ｈ０１７Ｔ、Ｈ０１７Ｖ、Ｖ０２１Ｄ、Ｖ０２１Ｆ、Ｖ０２１Ｇ、Ｖ０２１Ｈ、Ｖ０２１Ｋ、Ｖ０２１Ｍ、Ｖ０２１Ｒ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｃ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｈ、Ｌ２５７Ｉ、Ｌ２５７Ｍ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｑ、Ｌ２５７Ｖ、Ｖ２７０Ｉ、Ｖ２７０Ｌ、Ｖ２７０Ｍ、Ｖ２７０Ｑ、Ｖ２７０Ｔ、Ｖ２７０Ｗ、Ｖ２７０Ｙ、Ｓ０２４Ｇ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｉ、Ｓ０２４Ｐ、Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｋ、Ｑ２７５Ｌ、Ｑ２７５Ｎ、Ｑ２７５Ｒ、Ｑ２７５Ｗ、Ｑ２７５Ｙ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｉ、Ａ０４８Ｋ、Ａ０４８Ｌ、Ａ０４８Ｎ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｗ、Ｅ０５４Ｄ、Ｅ０５４Ｆ、Ｅ０５４Ｇ、Ｅ０５４Ｈ、Ｅ０５４Ｉ、Ｅ０５４Ｋ、Ｅ０５４Ｌ、Ｅ０５４Ｍ、Ｅ０５４Ｎ、Ｅ０５４Ｐ、Ｅ０５４Ｒ、Ｅ０５４Ｓ、Ｅ０５４Ｔ、Ｅ０５４Ｖ、Ｅ０５４Ｗ、Ａ０７３Ｇ、Ａ０７３Ｉ、Ａ０７３Ｋ、Ａ０７３Ｌ、Ａ０７３Ｔ、Ａ０７３Ｖ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｉ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｒ、Ｔ０７８Ｖ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｆ、Ｎ０８７Ｈ、Ｎ０８７Ｐ、Ｎ０８７Ｑ、Ｎ０８７Ｓ、Ａ０８８Ｄ、Ａ０８８Ｇ、Ａ０８８Ｎ、Ａ０８８Ｐ、Ａ０８８Ｑ、Ｄ０８９Ｆ、Ｄ０８９Ｋ、Ｄ０８９Ｌ、Ｄ０８９Ｒ、Ｄ０８９Ｔ、Ｄ０８９Ｗ、Ｙ０９１Ｈ、Ｙ０９１Ｉ、Ｙ０９１Ｍ、Ｙ０９１Ｎ、Ｙ０９１Ｖ、Ｙ０９１Ｗ、Ｇ０２０Ｅ、Ｇ０２０Ｈ、Ｇ０２０Ｌ、Ｇ０２０Ｎ、Ｇ０２０Ｑ、Ｇ０２０Ｔ、Ｇ０２０Ｖ、Ｇ０２０Ｙ、Ｍ２４１Ｈ、Ｍ２４１Ｉ、Ｍ２４１Ｑ、Ｍ２４１Ｓ、Ｖ２４４Ｌ、Ｖ２４４Ｑ、Ｎ２５２Ｆ、Ｎ２５２Ｉ、Ｎ２５２Ｌ、Ｎ２５２Ｑ、Ｎ２５２Ｒ、Ｎ２５２Ｓ、Ｆ２６１Ｙ、Ｋ２６５Ｓ、Ｋ２６５Ｖ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｈ、Ｓ２７２Ｋ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｎ、Ｓ２７２Ｐ、Ｓ２７２Ｑ、Ｓ２７２Ｔ、Ｓ２７２Ｖ、Ｎ０５６Ａ、Ｎ０５６Ｅ、Ｎ０５６Ｉ、Ｎ０５６Ｌ、Ｎ０５６Ｍ、Ｎ０５６Ｐ、Ｎ０５６Ｑ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０５６Ｖ、Ａ０７４Ｇ、Ａ０７４Ｓ、Ｎ０７７Ｇ、Ｌ１３５Ｉ、Ｌ１９６Ｍ、Ｔ２０８Ａ、Ｔ２０８Ｉ、Ｔ２０８Ｌ、Ｔ２０８Ｎ、Ｔ２０８Ｖ、Ａ２３１Ｇ、Ａ２３１Ｌ、Ａ２３１Ｓ、Ａ２３１Ｙ、Ｒ２４９Ｋ、Ｒ２４９Ｗ、Ａ０１８Ｆ、Ａ０１８Ｋ、Ａ０１８Ｌ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１８Ｓ、Ａ０１８Ｔ、Ａ０１８Ｗ、Ａ０１８Ｙ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｉ、Ｎ０３８Ｋ、Ｎ０３８Ｐ、Ｎ０３８Ｔ、Ｎ０３８Ｙ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｅ２７１Ａ、Ｅ２７１Ｄ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｌ、Ｅ２７１Ｍ、Ｅ２７１Ｑ、Ｅ２７１Ｗ、Ｅ２７１Ｙ、Ｆ０５０Ａ、Ｆ０５０Ｉ、Ｆ０５０Ｋ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｓ、Ｆ０５０Ｗ、Ｆ０５０Ｙ、Ｖ０５１Ａ、Ｖ０５１Ｄ、Ｖ０５１Ｅ、Ｖ０５１Ｆ、Ｖ０５１Ｇ、Ｖ０５１Ｈ、Ｖ０５１Ｉ、Ｖ０５１Ｋ、Ｖ０５１Ｌ、Ｖ０５１Ｍ、Ｖ０５１Ｎ、Ｖ０５１Ｐ、Ｖ０５１Ｑ、Ｖ０５１Ｒ、Ｖ０５１Ｔ、Ｖ０５１Ｗ、Ｖ０５１Ｙ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｅ、Ｎ０７６Ｉ、Ｎ０７６Ｋ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｒ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７６Ｔ、Ｎ０７６Ｙ、Ｔ０７９Ｋ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ａ０５７Ｃ、Ａ０５７Ｄ、Ａ０５７Ｅ、Ａ０５７Ｉ、Ａ０５７Ｋ、Ａ０５７Ｌ、Ａ０５７Ｍ、Ａ０５７Ｎ、Ａ０５７Ｐ、Ａ０５７Ｑ、Ａ０５７Ｒ、Ａ０５７Ｓ、Ａ０５７Ｔ、Ａ０５７Ｖ、Ａ０５７Ｙ、Ｌ０７５Ａ、Ｌ０７５Ｄ、Ｌ０７５Ｅ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｈ、Ｌ０７５Ｉ、Ｌ０７５Ｋ、Ｌ０７５Ｎ、Ｌ０７５Ｑ、Ｌ０７５Ｒ、Ｌ０７５Ｓ、Ｌ０７５Ｔ、Ｌ０７５Ｖ、Ｌ０７５Ｗ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｙ、Ｉ１７５Ａ、Ｉ１７５Ｆ、Ｉ１７５Ｑ、Ｉ１７５Ｓ、Ｉ１７５Ｔ、Ｉ１７５Ｖ、Ｇ０５３Ａ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｉ、Ｇ０５３Ｌ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｐ、Ｇ０５３Ｑ、Ｐ０５５Ａ、Ｐ０５５Ｇ、Ｐ０５５Ｋ、Ｐ０５５Ｍ、Ｐ０５５Ｎ、Ｐ０５５Ｒ、Ｐ０５５Ｓ、Ｐ０５５Ｗ、Ｐ０５５Ｙ、Ｙ１４３Ｅ、Ｙ１４３Ｌ、Ｙ１４３Ｍ、Ｙ１４３Ｎ、Ｙ１４３Ｑ、Ｙ１４３Ｔ、Ｙ１４３Ｖ、Ｓ１８１Ａ、Ｔ０７１Ａ、Ｔ０７１Ｇ、Ｔ０７１Ｍ、Ｔ０７１Ｎ、Ｔ０７１Ｐ、Ｔ０７１Ｓ、Ｔ０７１Ｖ、Ｓ１９４Ｇ、Ｓ１９４Ｉ、Ｓ１９４Ｍ、Ｓ１９４Ｖ、Ａ２３２Ｈ、Ａ２３２Ｉ、Ａ２３２Ｌ、Ａ２３２Ｍ、Ａ２３２Ｎ、Ａ２３２Ｑ、Ａ２３２Ｓ、Ａ２３２Ｔ、Ｉ２３４Ａ、Ｉ２３４Ｆ、Ｉ２３４Ｍ、Ｉ２３４Ｎ、Ｉ２３４Ｑ、Ｉ２３４Ｓ、Ｉ２３４Ｖ、Ｉ２３４Ｗ、Ｉ２３４Ｙ、Ｋ２３７Ｆ、Ｋ２３７Ｇ、Ｋ２３７Ｉ、Ｋ２３７Ｌ、Ｋ２３７Ｍ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｑ、Ｋ２３７Ｒ、Ｋ２３７Ｓ、Ｋ２３７Ｔ、Ｋ２３７Ｖ、Ｋ２３７Ｗ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ａ２１５Ｆ、Ａ２１５Ｇ、Ａ２１５Ｈ、Ａ２１５Ｋ、Ａ２１５Ｌ、Ａ２１５Ｍ、Ａ２１５Ｎ、Ａ２１５Ｙ、Ａ１６
９Ｓ、Ｖ２０３Ａ、Ｖ２０３Ｄ、Ｖ２０３Ｅ、Ｖ２０３Ｇ、Ｖ２０３Ｌ、Ｖ２０３Ｔ、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３３Ｄ、Ｌ２３３Ｇ、Ｌ２３３Ｈ、Ｌ２３３Ｍ、Ｌ２３３Ｔ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５０Ｔ、Ｋ０１２Ｄ、Ｋ０１２Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０１２Ｈ、Ｋ０１２Ｌ、Ｋ０１２Ｍ、Ｋ０１２Ｒ、Ｋ０１２Ｔ、Ｋ０１２Ｙ、Ｄ０３６Ａ、Ｄ０３６Ｅ、Ｄ０３６Ｗ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｄ、Ｖ０７２Ｅ、Ｖ０７２Ｆ、Ｖ０７２Ｋ、Ｖ０７２Ｐ、Ｖ０７２Ｑ、Ｖ０７２Ｔ、Ｙ１６７Ａ、Ｙ１６７Ｄ、Ｙ１６７Ｅ、Ｙ１６７Ｆ、Ｖ１８０Ａ、Ｖ１８０Ｎ、Ｖ１８０Ｓ、Ｖ１８０Ｔ、Ｇ０８０Ｆ、Ｇ０８０Ｍ、Ｇ０８０Ｙ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｉ、Ｓ１５６Ｌ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｓ１５６Ｖ、Ｓ１７２Ｈ、Ｓ１７２Ｉ、Ｓ１７２Ｌ、Ｓ１７２Ｍ、Ｓ１７２Ｎ、Ｓ１７２Ｔ、Ｓ１７２Ｖ、Ｓ１７２Ｙ、Ｓ１８８Ｇ、Ｓ１８８Ｈ、Ｓ１８８Ｔ、Ｓ１８８Ｙ、Ｙ２３８Ａ、Ｙ２３８Ｃ、Ｙ２３８Ｄ、Ｙ２３８Ｆ、Ｙ２３８Ｇ、Ｙ２３８Ｉ、Ｙ２３８Ｋ、Ｙ２３８Ｌ、Ｙ２３８Ｍ、Ｙ２３８Ｑ、Ｙ２３８Ｔ、Ｙ２３８Ｖ、Ｙ２３８Ｗ、Ｔ２５５Ａ、Ｔ２５５Ｄ、Ｔ２５５Ｆ、Ｔ２５５Ｇ、Ｔ２５５Ｈ、Ｔ２５５Ｉ、Ｔ２５５Ｋ、Ｔ２５５Ｌ、Ｔ２５５Ｍ、Ｔ２５５Ｎ、Ｔ２５５Ｑ、Ｔ２５５Ｓ、Ｔ２５５Ｗ、Ｔ２５５Ｙ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｋ、Ｎ２５６Ｌ、Ｎ２５６Ｍ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｑ、Ｎ２５６Ｒ、Ｎ２５６Ｖ、Ｎ２５６Ｗ、Ｉ０３５Ａ、Ｉ０３５Ｆ、Ｉ０３５Ｇ、Ｉ０３５Ｌ、Ｉ０３５Ｍ、Ｉ０３５Ｔ、Ｖ２２７Ｆ、Ｖ２２７Ｓ、Ｖ２２７Ｔ、Ｖ２２７Ｙ、Ｆ２６２Ｅ、Ｆ２６２Ｓ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｉ、Ｇ１０６Ｎ、Ｇ１０６Ｓ、Ｔ１３３Ａ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｍ、Ｔ１３３Ｎ、Ｔ１３３Ｑ、Ｔ１３３Ｖ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｎ１６１Ｆ、Ｎ１６１Ｍ、Ｎ１６１Ｑ、Ｎ１６１Ｗ、Ｎ１６１Ｙ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｌ、Ｒ１７０Ｍ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ａ１０８Ｌ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｈ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｒ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１１８Ｙ、Ｇ１４６Ｑ、Ｇ１４６Ｒ、Ｄ０６０Ａ、Ｄ０６０Ｅ、Ｄ０６０Ｆ、Ｄ０６０Ｈ、Ｄ０６０Ｋ、Ｄ０６０Ｌ、Ｄ０６０Ｍ、Ｄ０６０Ｎ、Ｄ０６０Ｐ、Ｄ０６０Ｑ、Ｄ０６０Ｓ、Ｄ０６０Ｔ、Ｄ０６０Ｖ、Ｄ０６０Ｙ、Ｗ１１３Ｆ、Ｗ１１３Ｈ、Ｗ１１３Ｙ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４０Ｆ、Ｎ１４０Ｇ、Ｎ１４０Ｉ、Ｎ１４０Ｌ、Ｎ１４０Ｍ、Ｎ１４０Ｑ、Ｎ１４０Ｔ、Ｎ１４０Ｖ、Ｎ１４０Ｗ、Ｎ１４０Ｙ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｄ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｆ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｈ、Ｖ１４９Ｉ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｐ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｖ１４９Ｔ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｍ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ｎ２１２Ｆ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１２Ｌ、Ｎ２１２Ｐ、Ｎ２１２Ｗ、Ｓ２１６Ａ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｉ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｖ、Ｐ２３９Ｗ、Ｑ００２Ｅ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ００２Ｗ、Ｑ００２Ｙ、Ｓ２０７Ｔ、Ｓ２０７Ｖ、Ｆ２１７Ｄ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｈ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｒ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｈ２２６Ｄ、Ｈ２２６Ｅ、Ｈ２２６Ｆ、Ｈ２２６Ｇ、Ｈ２２６Ｌ、Ｈ２２６Ｑ、Ｈ２２６Ｔ、Ａ２３０Ｄ、Ａ２３０Ｆ、Ａ２３０Ｈ、Ａ２３０Ｍ、Ａ２３０Ｑ、Ａ２３０Ｙ、Ｑ０５９Ｉ、Ｑ０５９Ｎ、Ａ０１６Ｅ、Ａ０１６Ｇ、Ａ０１６Ｈ、Ａ０１６Ｉ、Ａ０１６Ｋ、Ａ０１６Ｌ、Ａ０１６Ｑ、Ａ０１６Ｔ、Ａ０１６Ｗ、Ｇ０２３Ａ、Ａ２００Ｓ、Ｐ２１０Ｄ、Ｐ２１０Ｅ、Ｐ２１０Ｆ、Ｐ２１０Ｉ、Ｐ２１０Ｌ、Ｐ２１０Ｑ、Ｐ２１０Ｓ、Ｐ２１０Ｔ、Ｐ２１０Ｖ、Ｐ２１０Ｗ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｓ１５９Ｔ、Ｇ０６３Ａ、Ｇ０６３Ｄ、Ｇ０６３Ｅ、Ｇ０６３Ｆ、Ｇ０６３Ｈ、Ｇ０６３Ｌ、Ｇ０６３Ｍ、Ｇ０６３Ｎ、Ｇ０６３Ｐ、Ｇ０６３Ｒ、Ｇ０６３Ｓ、Ｇ０６３Ｔ、Ｇ０６３Ｖ、Ｇ０６３Ｗ、Ｇ０６３Ｙ、Ａ０９８Ｈ、Ａ０９８Ｌ、Ａ０９８Ｍ、Ａ０９８Ｐ、Ａ０９８Ｑ、Ａ０９８Ｓ、Ａ０９８Ｔ、Ａ０９８Ｖ、Ｑ１０９Ｋ、Ｉ１２２Ｌ、Ｉ１２２Ｍ、Ｇ１２８Ｎ、Ｖ１９８Ａ、Ｖ１９８Ｃ、Ｖ１９８Ｆ、Ｔ２０９Ｅ、Ｔ２０９Ｍ、Ｔ２０９Ｑ、Ｔ２０９Ｒ、Ｔ２０９Ｓ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｎ２１３Ａ、Ｎ２１３Ｄ、Ｎ２１３Ｅ、Ｎ２１３Ｆ、Ｎ２１３Ｇ、Ｎ２１３Ｍ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｆ、Ａ２３６Ｇ、Ａ２３６Ｌ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｖ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｉ、Ｓ２４０Ｍ、Ｓ２４０Ｐ、Ｓ２４０Ｑ、Ｓ２４０Ｖ、Ｓ２４０Ｗ、Ｔ２４２Ａ、Ｔ２４２Ｅ、Ｔ２４２Ｇ、Ｔ２４２Ｈ、Ｔ２４２Ｉ、Ｔ２４２Ｋ、Ｔ２４２Ｌ、Ｔ２４２Ｐ、Ｔ２４２Ｑ、Ｔ２４２Ｓ、Ｔ２４２Ｖ、Ｔ２４２Ｙ、Ｐ２６０Ｃ、Ｐ２６０Ｉ、Ｐ２６０Ｌ、Ｐ２６０Ｍ、Ｐ２６０Ｎ、Ｐ２６０Ｓ、Ｐ２６０Ｖ、Ｇ２５８Ｄ、Ｙ２６３Ｔ、Ｙ２６３Ｗ、Ｎ１４１Ｇ、Ｎ１４１Ｔ、Ｓ１７３Ａ、Ｓ１７３Ｄ、Ｓ１７３Ｎ、Ｓ１７３Ｔ、Ｙ２１４Ｆ、Ｙ２１４Ｇ、Ｙ２１４Ｉ、Ｙ２１４Ｍ、Ｙ２１４Ｎ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｈ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｒ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｈ０１０Ａ、Ｈ０１０Ｌ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｓ１１６Ｆ、Ｓ１１６Ｍ、Ｇ０２５Ａ、Ｖ０４４Ａ、Ｖ０４４Ｉ、Ｖ０８１Ｇ、Ｖ０８１Ｌ、Ｖ０８１Ｍ、Ｖ０８１Ｐ、Ｖ０８１Ｙ、Ｎ２６９Ｋ、Ｎ２６９Ｔ、Ｎ２６９Ｖ、Ｈ０３９Ｇ、Ｈ０３９Ｓ、Ｈ０３９Ｔ、Ｋ２３５Ａ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｖ２６７Ａ、Ｖ２６７Ｅ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｇ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｋ、Ｖ２６７Ｌ、Ｖ２６７Ｎ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ａ１５１Ｈ、Ａ１５１Ｉ、Ａ１５１Ｑ、Ａ１５１Ｓ、Ａ１５１Ｔ、Ｇ１６０Ｆ、Ｇ１６０Ｈ、Ｇ１６０Ｍ、Ｇ１６０Ｖ、Ｍ２２２Ｅ、Ｍ２２２Ｈ、Ｍ２２２Ｌ、及びＭ２２２Ｙからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、洗濯安定性及びＨＤＬ（ｐＨ６）での洗濯性能に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ｉ０３０Ａ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｙ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｎ、Ｎ１８３Ｅ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｍ１２４Ｓ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｖ１２１Ｇ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ａ２２４Ｓ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｔ０２２Ｄ、Ｔ０２２Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｌ０９０Ｐ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｉ２４６Ｎ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｆ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｅ、Ｑ２７５Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｑ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｙ０９１Ｈ、Ｍ２４１Ｓ、Ｍ２４１Ｗ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｑ、Ｔ０７９Ｌ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｙ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｙ１４３Ｄ、Ｙ１４３Ｅ、Ｓ１８１Ｈ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｔ２５５Ｄ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｎ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｄ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｍ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｌ０９６Ｅ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｖ２６７Ｓ、及びＭ２２２Ｑからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、洗濯安定性及びＨＤＬ（ｐＨ８）での洗濯性能に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ０２９Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｎ１８３Ｅ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｑ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｋ０１５Ｖ、Ｔ１８５Ｑ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｗ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｎ２５２Ｅ、Ｋ２６５Ｄ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｙ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｎ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｎ、Ａ１３８Ｅ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｉ１５０Ａ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｎ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｖ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ｓ２４０Ｐ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｔ、Ｌ０９６Ｅ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｓ１１６Ｅ、Ｋ２３５Ｄ、及びＫ２３５Ｅからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、洗濯安定性及びＨＤＤでの洗濯性能に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ０２９Ｔ、Ｉ０３０Ｖ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｙ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｇ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｎ、Ｎ１８３Ｅ、Ｖ０９３Ｔ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｇ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｑ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ａ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１２９Ｑ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｇ１３１Ｄ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｖ１２１Ｇ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ａ２２４Ｓ、Ｋ０１５Ｖ、Ｔ１８５Ｑ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｑ１３６Ｈ、Ｎ１６３Ｄ、Ａ０１９Ｍ、Ｔ０２２Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｓ１５８Ｄ、Ｌ０９０Ｐ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｓ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｔ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｑ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｙ０９１Ｈ、Ｙ０９１Ｎ、Ｍ２４１Ｑ、Ｍ２４１Ｓ、Ｋ２６５Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｙ、Ｖ０５１Ｉ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｓ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｌ０７５Ｇ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｙ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｑ、Ｙ１４３Ｅ、Ｓ１８１Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｔ２５５Ｄ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｗ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｍ、Ｔ１３３Ｎ、Ｔ１３３Ｖ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｗ、Ｆ２１７Ｒ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｇ１２８Ｎ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ｓ２４０Ｐ、Ｓ２４０Ｑ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｖ０８１Ｍ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、及びＭ２２２Ｈからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、洗濯安定性並びにＨＤＬ（ｐＨ８）及びＨＤＤでの洗濯に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ０２９Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｎ１８３Ｅ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｑ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｋ０１５Ｖ、Ｔ１８５Ｑ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｔ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｗ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｙ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｎ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ａ１３８Ｅ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｉ１５０Ａ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｖ、Ａ２３６Ｃ、Ｓ２４０Ｐ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｔ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｋ２３５Ｄ、及びＫ２３５Ｅからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、洗濯安定性、並びにＨＤＤでの洗濯及びＨＤＬ（ｐＨ６）での洗濯及びＨＤＬ（ｐＨ８）での洗濯に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ０４０Ｅ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｎ１８３Ｅ、Ｍ１２４Ｓ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｗ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｎ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ａ１３８Ｅ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｉ１５０Ａ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｔ、Ｋ２３５Ｄ、及びＫ２３５Ｅからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、ＡＤＷ安定性に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｒ、Ｑ００２Ｆ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｒ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ００２Ｗ、Ｔ００３Ｇ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ｔ００３Ｙ、Ｇ００７Ｎ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｈ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｒ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１９Ｍ、Ｔ０２２Ｅ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｇ０２５Ａ、Ｇ０２５Ｈ、Ｖ０２６Ｎ、Ｋ０２７Ｐ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ａ０２９Ｓ、Ｉ０３０Ｖ、Ｔ０３３Ｅ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｑ、Ｎ０３８Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｒ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｖ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｈ、Ｎ０４３Ｋ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｍ、Ｎ０４３Ｓ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｎ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｗ、Ｆ０５０Ａ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｒ、Ｆ０５０Ｓ、Ｖ０５１Ｉ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｑ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｑ、Ｐ０５５Ｎ、Ａ０５７Ｐ、Ｑ０５９Ｉ、Ｈ０６７Ａ、Ｈ０６７Ｇ、Ｈ０６７Ｐ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ａ０７３Ｇ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｒ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７７Ｔ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｋ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｒ、Ｔ０７８Ｓ、Ｔ０７８Ｖ、Ｔ０７９Ｋ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｇ０８０Ｍ、Ｖ０８１Ｍ、Ｙ０８６Ｐ、Ｎ０８７Ｈ、Ｄ０８９Ｆ、Ｌ０９０Ｐ、Ｙ０９１Ｉ、Ｙ０９１Ｍ、Ｙ０９１Ｖ、Ｌ０９６Ｅ、Ｌ０９６Ｎ、Ｓ０９７Ｎ、Ａ０９８Ｎ、Ａ０９８Ｑ、Ａ０９８Ｓ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０１Ｔ、Ｇ１０２Ｆ、Ｇ１０２Ｙ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｇ、Ｔ１０３Ｓ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｎ、Ｇ１０６Ｔ、Ｉ１０７Ｑ、Ｉ１０７Ｖ、Ｗ１１３Ｈ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｓ１１６Ｅ、Ｓ１１６Ｆ、Ｓ１１６Ｍ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｈ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｒ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１１８Ｙ、Ｍ１１９Ｑ、Ｖ１２１Ａ、Ｖ１２１Ｇ、Ｌ１２６Ｇ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｇ１２８Ｎ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｈ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、Ｇ１３１Ｈ、Ｔ１３３Ａ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｖ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３７Ｅ、Ｑ１３７Ｔ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４４Ｈ、Ｎ１４４Ｙ、Ｒ１４５Ｗ、Ｇ１４６Ｎ、Ｇ１４６Ｒ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｐ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ１５１Ｈ、Ａ１５２Ｐ、Ａ１５２Ｖ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｋ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｓ１５８Ｖ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｎ１６１Ｍ、Ｎ１６１Ｒ、Ｍ１６５Ｖ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ１６６Ｙ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｈ、Ｓ１８１Ｎ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｍ、Ｓ１８２Ｒ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ｒ、Ａ１８７Ｗ、Ｓ１８８Ｈ、Ｓ１９４Ｐ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｔ２０９Ｙ、Ｎ２１３Ｋ、Ｓ２１６Ｆ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ｆ２１７Ｒ、Ｍ２２２Ｌ、Ａ２２４Ｓ、Ａ２２８Ｓ、Ｉ２３４Ｖ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｋ２３７Ａ、Ｙ２３８Ｆ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｍ、Ｓ２４０Ｐ、Ｍ２４１Ｗ、Ｔ２４２Ｓ、Ｎ２４３Ｇ、Ｖ２４４Ｆ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｉ２４６Ｎ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５０Ｍ、Ｋ２５１Ｒ、Ｎ２５２Ｅ、Ｔ２５５Ｉ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｋ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｑ、Ｎ２５６Ｒ、Ｎ２５６Ｗ、Ｋ２６５Ｓ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｋ、Ｖ２６７Ｎ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ｅ２７１Ｗ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｋ、Ｓ２７２Ｎ、Ｓ２７２Ｑ、及びＱ２７５Ｅからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、ＡＤＷ性能に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｈ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｒ、Ｑ００２Ｆ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｒ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ００２Ｗ、Ｑ００２Ｙ、Ｔ００３Ｅ、Ｔ００３Ｇ、Ｔ００３Ｈ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ｔ００３Ｙ、Ｇ００７Ｎ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｈ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｒ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０１２Ｒ、Ｋ０１５Ｈ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０１５Ｙ、Ａ０１８Ｆ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１８Ｑ、Ａ０１８Ｒ、Ａ０１８Ｔ、Ａ０１９Ｋ、Ａ０１９Ｌ、Ａ０１９Ｍ、Ａ０１９Ｒ、Ａ０１９Ｗ、Ｇ０２０Ｎ、Ｔ０２２Ｄ、Ｔ０２２Ｅ、Ｔ０２２Ｓ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｉ、Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｇ０２５Ａ、Ｖ０２６Ｎ、Ｖ０２６Ｓ、Ｋ０２７Ｄ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｇ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｐ、Ｋ０２７Ｑ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｖ０２８Ｅ、Ｖ０２８Ｔ、Ａ０２９Ｓ、Ａ０２９Ｔ、Ｉ０３０Ａ、Ｉ０３０Ｅ、Ｉ０３０Ｖ、Ｌ０３１Ｑ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｑ、Ｎ０３８Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｒ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｖ、Ａ０４０Ｗ、Ａ０４０Ｙ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｇ、Ｎ０４３Ｈ、Ｎ０４３Ｉ、Ｎ０４３Ｋ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｍ、Ｎ０４３Ｑ、Ｎ０４３Ｓ、Ｎ０４３Ｗ、Ｎ０４３Ｙ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｆ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｇ０４６Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｋ、Ａ０４８Ｎ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｗ、Ｆ０５０Ａ、Ｆ０５０Ｋ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｒ、Ｆ０５０Ｓ、Ｆ０５０Ｙ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｈ、Ｓ０５２Ｌ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｑ、Ｓ０５２Ｒ、Ｓ０５２Ｔ、Ｓ０５２Ｖ、Ｇ０５３Ａ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｑ、Ｇ０５３Ｒ、Ｐ０５５Ｋ、Ｐ０５５Ｎ、Ｐ０５５Ｒ、Ａ０５７Ｐ、Ｌ０５８Ｄ、Ｑ０５９Ｉ、Ｇ０６１Ｅ、Ｇ０６１Ｍ、Ｇ０６１Ｙ、Ｎ０６２Ｋ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｐ、Ｎ０６２Ｗ、Ｈ０６７Ａ、Ｈ０６７Ｇ、Ａ０６９Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ａ０７３Ｇ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｑ、Ｌ０７５Ｒ、Ｌ０７５Ｗ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７６Ｙ、Ｎ０７７Ｔ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｉ、Ｔ０７８Ｋ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｒ、Ｔ０７８Ｓ、Ｔ０７８Ｖ、Ｔ０７９Ｋ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｇ０８０Ｍ、Ｇ０８０Ｙ、Ｖ０８１Ｍ、Ｇ０８３Ｓ、Ａ０８５Ｓ、Ｙ０８６Ｐ、Ｎ０８７Ｈ、Ｎ０８７Ｓ、Ｄ０８９Ｆ、Ｌ０９０Ｅ、Ｌ０９０Ｎ、Ｌ０９０Ｐ、Ｙ０９１Ｈ、Ｙ０９１Ｉ、Ｙ０９１Ｍ、Ｙ０９１Ｎ、Ｙ０９１Ｔ、Ｙ０９１Ｖ、Ｙ０９１Ｗ、Ｖ０９３Ｔ、Ｌ０９６Ｉ、Ｌ０９６Ｎ、Ｓ０９７Ｇ、Ｓ０９７Ｈ、Ｓ０９７Ｉ、Ｓ０９７Ｌ、Ｓ０９７Ｍ、Ｓ０９７Ｎ、Ａ０９８Ｆ、Ａ０９８Ｈ、Ａ０９８Ｋ、Ａ０９８Ｍ、Ａ０９８Ｎ、Ａ０９８Ｑ、Ａ０９８Ｓ、Ａ０９８Ｔ、Ｓ０９９Ｉ、Ｓ０９９Ｋ、Ｓ０９９Ｌ、Ｓ０９９Ｖ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０１Ｔ、Ｓ１０１Ｖ、Ｇ１０２Ｅ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｈ、Ｔ１０３Ｋ、Ｔ１０３Ｎ、Ｔ１０３Ｒ、Ｔ１０３Ｓ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｎ、Ｇ１０６Ｓ、Ｇ１０６Ｔ、Ｇ１０６Ｖ、Ｉ１０７Ｑ、Ｉ１０７Ｔ、Ｉ１０７Ｖ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｑ１０９Ｋ、Ｉ１１１Ｖ、Ｗ１１３Ｆ、Ｗ１１３Ｈ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｓ１１６Ｅ、Ｓ１１６Ｆ、Ｓ１１６Ｍ、Ｎ１１７Ｇ、Ｎ１１７Ｋ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｎ１１７Ｙ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｈ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｒ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１１８Ｙ、Ｍ１１９Ａ、Ｍ１１９Ｆ、Ｍ１１９Ｈ、Ｍ１１９Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１１９Ｑ、Ｍ１１９Ｓ、Ｍ１１９Ｔ、Ｎ１２０Ｅ、Ｖ１２１Ａ、Ｎ１２３Ａ、Ｎ１２３Ｄ、Ｎ１２３Ｅ、Ｎ１２３Ｇ、Ｎ１２３Ｈ、Ｎ１２３Ｑ、Ｇ１２８Ｎ、Ｓ１２９Ａ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１２９Ｇ、Ｓ１２９Ｈ、Ｓ１２９Ｑ、Ｓ１２９Ｔ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｆ、Ｓ１３０Ｈ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、Ｇ１３１Ａ、Ｇ１３１Ｄ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｐ、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｓ、Ｓ１３２Ａ、Ｔ１３３Ａ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｍ、Ｔ１３３Ｎ、Ｔ１３３Ｑ、Ｔ１３３Ｖ、Ｑ１３６Ｄ、Ｑ１３６Ｆ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３６Ｒ、Ｑ１３６Ｗ、Ｑ１３７Ｅ、Ｑ１３７Ｈ、Ｑ１３７Ｔ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４０Ｑ、Ｎ１４０Ｙ、Ｎ１４１Ｔ、Ｙ１４３Ｅ、Ｎ１４４Ｈ、Ｎ１４４Ｍ、Ｎ１４４Ｖ、Ｎ１４４Ｗ、Ｎ１４４Ｙ、Ｒ１４５Ｗ、Ｇ１４６Ｎ、Ｇ１４６Ｒ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｇ、Ｖ１４８Ｓ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｐ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｓ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ１５１Ｈ、Ａ１５２Ｖ、Ａ１５３Ｇ、Ａ１５３Ｓ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｋ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ１５８Ｍ、Ｓ１５８Ｔ、Ｓ１５８Ｖ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｋ、Ｓ１５９Ｍ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｓ１５９Ｙ、Ｇ１６０Ｆ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｎ１６１Ｋ、Ｎ１６１Ｍ、Ｎ１６１Ｒ、Ｎ１６１Ｓ、Ｎ１６３Ｄ、Ｍ１６５Ｖ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ１６６Ｙ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｌ、Ｓ１７２Ｈ、Ｉ１７５Ｑ、Ｉ１７５Ｓ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｈ、Ｓ１８１Ｋ、Ｓ１８１Ｎ、Ｓ１８１Ｑ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｈ、Ｓ１８２Ｉ、Ｓ１８２Ｍ、Ｓ１８２Ｒ、Ｓ１８２Ｙ、Ｎ１８３Ｅ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ｒ、Ａ１８７Ｄ、Ａ１８７Ｇ、Ａ１８７Ｈ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｑ、Ａ１８７Ｖ、Ａ１８７Ｗ、Ｓ１８８Ｈ、Ｓ１８８Ｙ、Ｓ１９４Ｆ、Ｓ１９４Ｋ、Ｓ１９４Ｐ、Ｓ１９４Ｒ、Ｌ２０６Ｙ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｔ２０９Ｙ、Ｎ２１３Ｋ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｓ２１６Ａ、Ｓ２１６Ｆ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ｆ２１７Ｒ、Ｍ２２２Ｌ、Ａ２２４Ｓ、Ａ２２８Ｓ、Ｉ２３４Ｖ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｆ、Ａ２３６Ｇ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｇ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｑ、Ｋ２３７Ｒ、Ｙ２３８Ｆ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｄ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｉ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｌ、Ｐ２３９Ｍ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｖ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｉ、Ｓ２４０Ｍ、Ｓ２４０Ｐ、Ｓ２４０Ｑ、Ｓ２４０Ｖ、Ｓ２４０Ｗ、Ｍ２４１Ｉ、Ｍ２４１Ｑ、Ｍ２４１Ｓ、Ｍ２４１Ｗ、Ｔ２４２Ａ、Ｔ２４２Ｅ、Ｔ２４２Ｉ、Ｔ２４２Ｋ、Ｔ２４２Ｐ、Ｔ２４２Ｑ、Ｔ２４２Ｓ、Ｔ２４２Ｖ、Ｎ２４３Ｇ、Ｖ２４４Ｆ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｆ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｗ、Ｑ２４５Ｙ、Ｉ２４６Ａ、Ｉ２４６Ｎ、Ｉ２４６Ｖ、Ｅ２４８Ｄ、Ｅ２４８Ｈ、Ｅ２４８Ｋ、Ｅ２４８Ｍ、Ｅ２４８Ｙ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５０Ｍ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｒ、Ｎ２５２Ｅ、Ｎ２５２Ｆ、Ｔ２５５Ｄ、Ｔ２５５Ｉ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｋ、Ｎ２５６Ｍ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｑ、Ｎ２５６Ｒ、Ｎ２５６Ｗ、Ｆ２６２Ｅ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｓ、Ｖ２６７Ａ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｋ、Ｖ２６７Ｎ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ｅ２７１Ａ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｈ、Ｅ２７１Ｋ、Ｅ２７１Ｗ、Ｅ２７１Ｙ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｋ、Ｓ２７２Ｎ、Ｓ２７２Ｑ、Ｑ２７５Ｅ、Ｑ２７５Ｇ、Ｑ２７５Ｎ、及びＱ２７５Ｒからなる群から選択される置換を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、ＡＤＷ安定性及びＡＤＷ性能に効果的な変異を有する本発明のＬＧ１２−系統群の酵素は、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｒ、Ｑ００２Ｆ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｒ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ００２Ｗ、Ｔ００３Ｇ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ｔ００３Ｙ、Ｇ００７Ｎ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｈ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｒ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１９Ｍ、Ｔ０２２Ｅ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｇ０２５Ａ、Ｖ０２６Ｎ、Ｋ０２７Ｐ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ａ０２９Ｓ、Ｉ０３０Ｖ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｑ、Ｎ０３８Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｒ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｖ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｈ、Ｎ０４３Ｋ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｍ、Ｎ０４３Ｓ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｎ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｗ、Ｆ０５０Ａ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｒ、Ｆ０５０Ｓ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｑ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｑ、Ｐ０５５Ｎ、Ａ０５７Ｐ、Ｑ０５９Ｉ、Ｈ０６７Ａ、Ｈ０６７Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ａ０７３Ｇ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｒ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７７Ｔ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｋ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｒ、Ｔ０７８Ｓ、Ｔ０７８Ｖ、Ｔ０７９Ｋ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｇ０８０Ｍ、Ｖ０８１Ｍ、Ｙ０８６Ｐ、Ｎ０８７Ｈ、Ｄ０８９Ｆ、Ｌ０９０Ｐ、Ｙ０９１Ｉ、Ｙ０９１Ｍ、Ｙ０９１Ｖ、Ｌ０９６Ｎ、Ｓ０９７Ｎ、Ａ０９８Ｎ、Ａ０９８Ｑ、Ａ０９８Ｓ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０１Ｔ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｓ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｎ、Ｇ１０６Ｔ、Ｉ１０７Ｑ、Ｉ１０７Ｖ、Ｗ１１３Ｈ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｓ１１６Ｅ、Ｓ１１６Ｆ、Ｓ１１６Ｍ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｈ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｒ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１１８Ｙ、Ｍ１１９Ｑ、Ｖ１２１Ａ、Ｇ１２８Ｎ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｈ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、Ｇ１３１Ｈ、Ｔ１３３Ａ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｖ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３７Ｅ、Ｑ１３７Ｔ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４４Ｈ、Ｎ１４４Ｙ、Ｒ１４５Ｗ、Ｇ１４６Ｎ、Ｇ１４６Ｒ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｐ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ１５１Ｈ、Ａ１５２Ｖ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｋ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５８Ｖ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｎ１６１Ｍ、Ｎ１６１Ｒ、Ｍ１６５Ｖ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ１６６Ｙ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｈ、Ｓ１８１Ｎ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｍ、Ｓ１８２Ｒ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ｒ、Ａ１８７Ｗ、Ｓ１８８Ｈ、Ｓ１９４Ｐ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｔ２０９Ｙ、Ｎ２１３Ｋ、Ｓ２１６Ｆ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ｆ２１７Ｒ、Ｍ２２２Ｌ、Ａ２２４Ｓ、Ａ２２８Ｓ、Ｉ２３４Ｖ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｋ２３７Ａ、Ｙ２３８Ｆ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｍ、Ｓ２４０Ｐ、Ｍ２４１Ｗ、Ｔ２４２Ｓ、Ｎ２４３Ｇ、Ｖ２４４Ｆ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｉ２４６Ｎ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５０Ｍ、Ｋ２５１Ｒ、Ｎ２５２Ｅ、Ｔ２５５Ｉ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｋ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｑ、Ｎ２５６Ｒ、Ｎ２５６Ｗ、Ｋ２６５Ｓ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｋ、Ｖ２６７Ｎ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ｅ２７１Ｗ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｋ、Ｓ２７２Ｎ、Ｓ２７２Ｑ、及びＱ２７５Ｅからなる群から選択される置換を含む。
本発明のポリペプチド
本発明は、総じて「本発明のポリペプチド」として参照することのできる新規ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドには、単離されたＬＧ１２−系統群酵素ポリペプチド、ＬＧ１２−系統群酵素ポリペプチドの組換体、実質的に純粋なＬＧ１２−系統群酵素ポリペプチド、又は非天然に生じかつ新規に発見されたＬＧ１２−系統群酵素ポリペプチドを含み、例えば、酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性）を有するＬＧ１２ｓｐｒＣ酵素変異体ポリペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、クリーニング用途に有用であり、クリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、物品の表面）をクリーニングする方法に有用なクリーニング組成物中に組み込まれ得る。
いくつかの実施形態では、ＬＧ１２−系統群の酵素変異体は、バチルス（Bacillus）属由来のＬＧ１２−系統群の親酵素の変異体であり得る。互いに高い同一性を有しかつ配列番号３で示されるＬＧ１２由来のＬＧ１２ｓｐｒＣ成熟酵素とも高い同一性を有する、様々なＬＧ１２−系統群の酵素が、バチルス属（Bacillus）で発見されている。例えば、実施例４の表５及び６、実施例１１の図４及び図８、実施例１２の図９、及び実施例１３の図１０を参照されたい。他の実施形態では、本発明のＬＧ１２−系統群の酵素変異体は、表５又は６に掲載されるいずれかの属に由来するＬＧ１２−系統群の親酵素の変異体であってよく、あるいはバチルス（Bacillus）属、ゲオバチルス（Geobacillus）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、エクシグオバクテリウム（Exiguobacterium）属、ブレビバチルス（Brevibacillus）属、パエニバチルス（Paenibacillus）属、ヘルペトシフォン（Herpetosiphon）属、オセアノバチルス（Oceanobacillus）属、Ｓシュワネラ（hewanella）属、クロストリジウム（Clostridium）属、ブドウ球菌（Staphylococcus）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、スチグマテラ（Stigmatella）属、ミクソコッカス（Myxococcus）属、ビブリオ（Vibrio）属、メタノサルシナ（Methanosarcina）属、クリセオバクテリウム（Chryseobacterium）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、クリベラ（Kribbella）属、ジャニバクター（Janibacter）属、ノカルジオイデス（Nocardioides）属、ザンタモナス（Xanthamonas）属、ミクロモノスポラ（Micromonospora）属、バークホルデリア（Burkholderia）属、デハロコッコイデス（Dehalococcoides）属、クロセイバクター（Croceibacter）属、コルジア（Kordia）属、マイクロシーラ（Microscilla）属、サーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）属、クロロフレクサス（Chloroflexus）属、リステリア（Listeria）属、プレシオシスチス（Plesiocystis）属、ハリスコメノバクター（Haliscomenobacter）属、サイトファーガ（Cytophaga）属、ハヘラ（Hahella）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、ブラキバクテリウム（Brachybacterium）属、クラビバクター（Clavibacter）属、マイクロバクテリウム（Microbacterium）属、イントラスポランギウム（Intrasporangium）属、フランキア（Frankia）属、メイオテルムス（Meiothermus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、トウゴマ（Ricinus）属、カテヌリスポラ（Catenulispora）属、アナベナ（Anabaena）属、ノストック（Nostoc）属、ハロモナス（Halomonas）属、クロモハロバクター（Chromohalobacter）属、ボルデテラ（Bordetella）属、バリオボラックス（Variovorax）属、ディケヤー（Dickeya）属、ペクトバクテリウム（Pectobacterium）属、シトロバクター（Citrobacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、サルモネラ（Salmonella）属、エルウィニア（Erwinia）属、パントエア（Pantoea）属、ラーネラ（Rahnella）属、セラチア（Serratia）属、ゲオデルマトフィルス（Geodermatophilus）属、ゲンマタ（Gemmata）属、ゼノラブダス（Xenorhabdus）属、フォロラブダス（Photorhabdus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、ネオサルトリア（Neosartorya）属、ピレノフォラ（Pyrenophora）属、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属、ネクトリア（Nectria）属、ジベレラ（Gibberella）属、メタリジウム（Metarhizium）属、ワドリア（Waddlia）属、シアノセイス（Cyanothece）属、セルロファーガ（Cellulphaga）属、プロピデンシア（Providencia）属、ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、ムシラジニバクター（Mucilaginibacter）属、セラチア（Serratia）属、ソランジウム（Sorangium）属、ストレプトスポランジウム（Streptosporangium）属、レニバクテリウム（Renibacterium）属、アエロモナス（Aeromonas）属、レイネケア（Reinekea）属、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属、モリテラ（Moritella）属、ハリアンギウム（Haliangium）属、カンギエラ（Kangiella）属、マリノモナス（Marinomonas）属、ビブリオナレス（Vibrionales）属、リストネラ（Listonella）属、サリニビブリオ（Salinivibrio）属、フォトバクテリウム（Photobacterium）属、アルテロモナダーレス（Alteromonadales）属、レジオネラ（Legionella）属、テレディニバクター（Teredinibacter）属、レイネケア（Reinekea）属、ヒドロゲニビルガ（Hydrogenivirga）属、及びシュードアルテロモナス（Pseudoalteromonas）からなる群から選択される属であってよい。様々な実施形態では、ＬＧ１２−系統群の酵素変異体は、表５又は６に記載のいずれかの種に由来するＬＧ１２−系統群の親酵素の変異体であってよい。
いくつかの実施形態では、ＬＧ１２−系統群の酵素変異体は、表５又は６に記載のＬＧ１２−系統群の酵素、例えば、配列番号３のＬＧ１２ ｓｐｒＣプロテアーゼ、又は次の：ＬＧ１２ ｓｐｒＣ（配列番号３、ＡＡＣ４３５８０．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）（配列番号７、ＷＰ＿０１０１９２４０３．１，旧称ＺＰ＿０７７０７６５７．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＬＤ１、ＳＢ（ＢＡＤ２１１２８．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（２）（ＷＰ＿１０１９２４０５．１，旧称ＺＰ＿０７７０７６５８．１）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ ８７１９、Ｂｈｏｎ０３３２１（配列番号１０）、ＬＧ１２ｓｐｒＤ（ＡＡＣ４３５８１．１）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１１（配列番号１３）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１２（配列番号１６）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿６９５１（配列番号１９）、及びバチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８（配列番号２０）のうちのいずれかのものに対し、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％の同一性を有する変異体であり得る。
ＬＧ１２−系統群酵素、例えば、ＬＧ１２からクローン化したＬＧ１２ｓｐｒＣに関連する組成物及び方法が記載される。当該組成物及び方法は、クローニング及び発現されたＬＧ１２が、洗剤組成物の存在下でタンパク質分解活性を有するという観察に一部基づいたものである。ＬＧ１２はまた、洗剤組成物中で優れた安定性を示す。こうしたＬＧ１２の特徴により、ＬＧ１２は、洗剤組成物に含まれている界面活性剤及び他の成分の存在下で酵素がタンパク質を加水分解可能である、様々なクリーニング用途で使用するのに、よく適している。
一態様では、本発明の組成物及び方法は、ＬＧ１２−系統群の変異体ポリペプチドを提供する。ＬＧ１２−系統群の親ポリペプチドはＬＧ１２から単離された。ＬＧ１２−系統群の成熟ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。同様のほぼ同一のＬＧ１２−系統群のポリペプチドが、例えば株又はＬＧ１２単離株において天然に生じ得る。これらの及び他のＬＧ１２−系統群の組み換えポリペプチドが、本発明の組成物及び方法に包含される。
いくつかの実施形態では、本発明は、プロテアーゼ活性を有する、単離されたＬＧ１２−系統群酵素変異体、ＬＧ１２−系統群酵素変異体の組換体、実質的に純粋なＬＧ１２−系統群酵素変異体、又は非天然に生じるＬＧ１２−系統群酵素変異体を含み、ポリペプチドは、本明細書で提供される通りのＬＧ１２−系統群の親酵素、例えば、配列番号３のＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ、又は次の：ＬＧ１２ｓｐｒＣ（配列番号３、ＡＡＣ４３５８０．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）（配列番号７、ＷＰ＿０１０１９２４０３．１，旧称ＺＰ＿０７７０７６５７．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＬＤ１、ＳＢ（ＢＡＤ２１１２８．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（２）（ＷＰ＿１０１９２４０５．１，旧称ＺＰ＿０７７０７６５８．１）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ ８７１９、Ｂｈｏｎ０３３２１（配列番号１０）、ＬＧ１２ｓｐｒＤ（ＡＡＣ４３５８１．１）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１１（配列番号１３）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１２（配列番号１６）、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿６９５１（配列番号１９）、及びバチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８（配列番号２０）のいずれかに対し、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、例示のＬＧ１２−系統群ポリペプチドに対しある程度のアミノ酸配列相同性を有する変異体であり、例えば、配列番号３又は４のアミノ酸配列に対し、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％配列相同性を有する。相同性は、例えば本明細書に記載する、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用した、アミノ酸配列アラインメントにより決定することができる。
同様にして、プロテアーゼ活性を有するＬＧ１２−系統群の酵素変異体をコードしている配列を含む、単離されたＬＧ１２−系統群の酵素変異体、ＬＧ１２−系統群の酵素変異体の組換体、実質的に純粋なＬＧ１２−系統群の酵素変異体、又は非天然に生じるＬＧ１２−系統群の酵素変異体が提供され、このＬＧ１２−系統群の酵素変異体（例えば、ＬＧ１２変異体）は、配列番号３、７、１０、１３、１６、１９、又は２０のアミノ酸配列とは、５０個以下、４０個以下、３０個以下、３５個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含み、ここで、ＬＧ１２変異体のアミノ酸位置は、ＬＧ１２系統群の酵素変異体のアミノ酸配列をＬＧ１２ｓｐｒＣのアミノ酸配列とアラインメントさせることにより評価された通りに、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣのアミノ酸配列に対応させたアミノ酸位置の番号付けにより付番される。
上記の通り、本発明のＬＧ１２−系統群の酵素変異体ポリペプチドは、酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を有し、したがって、食器類、食卓用食器類、布地、及び硬質表面を有する物品（例えば、テーブル、テーブルの天板、壁、家具、床、天井などの硬質表面）をクリーニングするための方法が挙げられるがこれらに限定されないクリーニング用途に有用である。本発明のＬＧ１２−系統群の酵素変異体ポリペプチドを１種以上含むクリーニング組成物の例を以下に記載する。本発明のＬＧ１２−系統群の酵素変異体ポリペプチドの酵素活性（例えば、ＬＧ１２−系統群酵素活性）は、当業者に周知の手順を用いて、容易に決定することができる。以下に記載の実施例では、酵素活性、クリーニング性能、洗剤安定性及び／又は熱安定性の評価方法について説明する。染み（例えば、脂質による染み）の除去時、硬質表面のクリーニング時、又は洗濯物、食器類若しくは食卓用食器類のクリーニング時の本発明のＬＧ１２−系統群酵素変異体の性能は、当業者に周知の手順を用いて、及び／又は以降の実施例に記載の手順を用いて、容易に決定され得る。
本発明のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は保存的若しくは非保存的のいずれかの置換などといった様々な変化を受けることができ、このような変化としては、この変化によってポリペプチドの酵素活性が実質的に変更されないものが包含される。同様に、本発明の核酸には、様々な変更を施すこともでき、それらの変更には、例えば、特定のコドンが、サイレント変異（例えば、コードされるアミノ酸が核酸変異により変化しない場合では、ヌクレオチド配列中の変異によってアミノ酸配列中にサイレント変異が生じる）若しくは非サイレント変異を生じさせる同一の又は異なるアミノ酸をコードするような、１つ以上のコドンにおける１つ以上の核酸の１つ以上の置換、配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の欠失、配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の付加若しくは挿入、及び／又は配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の開裂若しくは切断、などが挙げられる。核酸配列における多くのこのような変化は、結果として得られたコードされたＬＧ１２−系統群酵素変異体の酵素活性を、元の核酸配列によりコードされたＬＧ１２−系統群酵素変異体の酵素活性と比較して実質的に変化させなくてもよい。同様に、本発明の核酸は、発現系（例えば、細菌の発現系）で最適な発現をもたらすが、必要に応じてなおも同じアミノ酸をコードするコドンを１つ以上包含するように改変され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、所望の酵素活性（例えば、ＬＧ１２−系統群酵素活性又はクリーニング性能活性）を有するＬＧ１２−系統群酵素変異体ポリペプチドを含むポリペプチド種を提供し、ポリペプチドは本明細書に記載されるアミノ酸置換を有する配列からなり、かつ保存的及び非保存的置換などのような更なるアミノ酸置換も１箇所以上に含み、ポリペプチドは、所望の酵素活性（例えば、ＬＧ１２−系統群酵素変異体のクリーニング活性又は性能に反映される通り、ＬＧ１２−系統群酵素活性又はタンパク質分解活性）を示し、維持し、又は概ね維持する。本発明に従うアミノ酸置換には、限定するものではないが、１つ以上の非保存的置換及び／又は１つ以上の保存的アミノ酸置換が包含され得る。保存的アミノ酸残基置換は、典型的には、アミノ酸残基の１機能分類に含まれるアミノ酸を、同一の機能分類に属する残基（同一のアミノ酸残基は、機能的に相同であると見なされるか又は機能的相同性パーセントの算出において保存されている）と交換することを含む。保存的アミノ酸置換は、典型的には、アミノ酸配列中のアミノ酸を機能的に類似するアミノ酸により置換することを含む。例えば、アラニン、グリシン、セリン、及びトレオニンは機能的に類似するものであり、このため互いに保存的アミノ酸置換を提供し得る。アスパラギン酸及びグルタミン酸は、互いに保存的置換を提供し得る。アスパラギン及びグルタミンは、互いに保存的置換を提供し得る。アルギニン、リシン、及びヒスチジンは、互いに保存的置換を提供し得る。イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリンは、互いに保存的置換を提供し得る。フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンは、互いに保存的置換を提供し得る。
他の保存的アミノ酸置換基も想定され得る。例えば、アミノ酸は、類似する機能又は化学的構造又は組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、硫黄の含有）をもとにグループ化することができる。例えば、脂肪族のグループには、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）が含まれ得る。互いに保存的な置換であるものと考えられるその他のアミノ酸を包含するグループには、芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；非極性電荷残基、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、及びプロリン（Ｐ）；親水性非荷電残基：セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、及びグルタミン（Ｑ）が挙げられる。アミノ酸のその他の分類も当業者に周知であり、様々な一般的な文献に記載されている。上記の置換基と共に、本明細書においてポリペプチド配列を列挙することで、保存的に置換されたすべてのポリペプチド配列の明白な一覧を提供する。
上記のアミノ酸残基分類には、より保存的な置換が存在し、これらも同様に又は別法として好適であり得る。より保存的である保存的置換基としては：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
本発明の保存的に置換された変異体のポリペプチド配列（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体）は、ポリペプチド配列中のアミノ酸のうち、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、又は６％未満の僅かな割合で、あるいはポリペプチド配列中のアミノ酸のうち５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満、すなわち１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、又は１個未満の僅かな割合で、同類の保存的置換基のアミノ酸から保存的に選択されたアミノ酸による置換を含有する。
本明細書内の他の箇所で更に詳細に記載されるように、及び本明細書で提供される実施例に記載されるように、本発明のポリペプチドは、既知のセリンプロテアーゼを包含する既知のプロテアーゼと同程度のクリーニング能力を有し得る。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体は、１つ以上の変異を含み、ＬＧ１２ｓｐｒＣ（配列番号３）と比較して−５、−４、−３、−２、−１、０、１、２、３、４、又は５の総実効電荷を有する。
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質分解活性を有する、単離されたプロテアーゼ変異体、プロテアーゼ変異体の組換体、実質的に純粋なプロテアーゼ変異体、又は非天然に生じるプロテアーゼ変異体（例えば、ＬＧ１２変異体）を提供し、このプロテアーゼ変異体は、配列番号３、７、１０、１３、１６、１９、又は２０に示すアミノ酸配列とは、５０個以下、４５個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列をＬＧ１２ｓｐｒＣのアミノ酸配列とアラインメントさせることにより評価された通りに、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣのアミノ酸配列に対応させたアミノ酸位置の番号付けにより付番される。
本発明の核酸
本発明は、単離された、天然に由来するものではない、又は組み換え型の核酸（本明細書では「ポリヌクレオチド」とも呼ばれる）を提供し、これは集合的に本発明のポリペプチドをコードする「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。以下に記載のすべてのものを含む本発明の核酸は、典型的に、対象とするポリペプチドをコードする配列又はそれらの断片を含むプラスミド発現ベクターの発現を介した本発明のポリペプチドの組み換えによる産生（例えば発現）に有用である。上述のように、ポリペプチドには、例えば、酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を有する、ＬＧ１２−系統群の変異体ポリペプチドなどの変異型プロテアーゼのポリペプチドが包含され、プロテアーゼ変異体ポリペプチドは、クリーニング用途、及びクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、物品の表面）をクリーニングするためのクリーニング組成物に有用である。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の表題「本発明のポリペプチド」と付けられた節及び本明細書の他の場所に記載される、任意のポリペプチド（任意の融合タンパク質などが包含される）をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は天然に由来するものではない核酸を提供する。本発明は、上記及び本明細書の他の箇所に記載の、本発明の任意のポリペプチドの２つ以上の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は天然に由来するものではない核酸も提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、プロテアーゼ活性を有する、単離されたＬＧ１２−系統群酵素、ＬＧ１２−系統群酵素の組換体、実質的に純粋なＬＧ１２−系統群酵素、又は非天然に生じかつ新規に発見されたＬＧ１２−系統群酵素をコードするポリヌクレオチドを包含するものであり、このポリペプチドは、本明細書で提供されるＬＧ１２−系統群の親酵素に対し少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、例示のＬＧ１２−系統群ポリペプチドに対しある程度のアミノ酸配列相同性を有する変異体であり、例えば、配列番号３又は４のアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％配列相同性を有する。相同性は、例えば本明細書記載する、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用した、アミノ酸配列アラインメントにより評価することができる。
同様に、タンパク質分解活性を有するプロテアーゼ変異体をコードしているポリヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然に生じる核酸も提供され、上記プロテアーゼ変異体（例えば、ＬＧ１２ｓｐｒＣ変異体）は：３、７、１０、１３、１６、１９、又は２０のアミノ酸配列とは、５０個以下、４０個以下、３０個以下、３５個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含み、ここで、ＬＧ１２系統群の酵素変異体のアミノ酸位置は、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列をＬＧ１２ｓｐｒＣのアミノ酸配列とアラインメントさせることにより評価された通りに、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣのアミノ酸配列に対応させたアミノ酸位置の番号付けにより付番される。
本発明は、バチルス属（Bacillus）ＬＧ１２のＬＧ１２−系統群の変異体をコードしている核酸を提供するものであり、このＬＧ１２変異体は、タンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ本明細書全体を通じて列挙されているようなアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含む（ここで、ＬＧ１２変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣのアミノ酸配列と対応させて付番される）。
本発明の核酸は、任意の好適な合成技術、操作技術、及び／又は単離技術、又はこれらの組み合わせを用いて作製できる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の固相合成法などの標準的な核酸合成技術を用いて製造することもできる。このような技術では、典型的には５０個まで又はそれ以上のヌクレオチド塩基の断片を合成して、次いで連結することで（例えば、酵素的若しくは化学的連結方法、又はポリメラーゼによる組み換え方法）、本質的に任意の所望の連続的な核酸配列が形成される。本発明の核酸の合成は、古典的なホスホラミダイト法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９〜６９［１９８１］を参照されたい）を利用する化学的合成法；又はＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．により記載の、典型的に自動化合成法において実施されるものなどの方法（Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１〜８０５［１９８４］を参照されたい）などが挙げられるがこれらに限定されない、当業界で既知の任意の好適な方法によっても促進できる（あるいは達成できる）。本発明の核酸は、自動ＤＮＡ合成装置を使用しても作製できる。カスタマイズした核酸を、各種供給業者（例えば、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．及びＤＮＡ２．０）に発注することができる。核酸合成に関係するその他の技術及び関連する原理は、当業界で既知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３［１９８４］；及びＩｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６［１９８４］を参照されたい）。
上記のように、核酸の改変に有用な、ＤＮＡの組み換え技術は、当該技術分野において周知である。例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写、及びｃＤＮＡの生産、並びにポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）などの技法が知られており、当業者により容易に使用される。本発明のヌクレオチドは、本発明のプロテアーゼ変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズすることのできる又は前記ポリヌクレオチドをＰＣＲにより増幅することのできるオリゴヌクレオチドプローブを１つ以上用い、ｃＤＮＡライブラリ（例えば、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で一般的に使用される変異導入技術を用いて生成されたｃＤＮＡライブラリ）をスクリーニングすることでも得ることができる。ｃＤＮＡクローンのスクリーニング及び単離手順、並びにＰＣＲによる増幅手順は当業者に周知のものであり、当業者に既知の標準的な参考文献に記載されている。本発明の核酸のいくつかは、天然由来のポリヌクレオチド主鎖（例えば、酵素又は親プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド主鎖）を、例えば既知の変異導入法（例えば、部位特異的変異導入法、部位飽和変異導入法、及びインビトロ組み換え）によって変化させることによって得ることができる。
本発明の改変プロテアーゼ変異体の製造方法
本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている本発明の改変されたポリヌクレオチドを生成するのに好適であるものとして様々な方法が既知であり、例えば、部位飽和変異導入（site-saturation mutagenesis）、系統的変異導入、挿入変異導入、欠失変異導入、ランダム変異導入、部位特異的変異導入、オリゴヌクレオチド合成法及びライゲーションによる合成遺伝子の構築、並びに定向進化、更にはその他の各種リコンビナトリアルなアプローチが挙げられるがこれらに限定されない。改変されたポリヌクレオチド及びタンパク質（例えば、プロテアーゼ変異体）の作製方法としては、ＤＮＡシャッフリング法、ＩＴＣＨＹ（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，７：２１３９〜４４［１９９９］）、ＳＣＲＡＣＨＹ（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．９８：１１２４８〜５３［２００１］を参照されたい）、ＳＨＩＰＲＥＣ（Ｓｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９：４５６〜６０［２００１］を参照されたい）、及びＮＲＲ（Ｂｉｔｔｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０：１０２４〜９［２００１］；Ｂｉｔｔｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１０１：７０１１〜６［２００４］を参照されたい）などの遺伝子の非相同組み換えによる方法、並びにオリゴヌクレオチドを利用してランダムな及び標的とする変異、欠失及び／又は挿入を挿入する方法（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０：１２５１〜５［２００２］；Ｃｏｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０：１２４６〜５０［２００２］；Ｚｈａ ｅｔ ａｌ．，４：３４〜９［２００３］；Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１４９：３９０３〜１３［１９９２］を参照されたい）が挙げられる。
本発明のプロテアーゼ変異体を製造するためのベクター、細胞、及び方法
本発明は、本明細書に記載の少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の本発明の変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド）を含む単離若しくは組み換え型のベクター、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離若しくは組み換え型の発現ベクター又は発現カセット、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離された、実質的に純粋な、又は組み換えＤＮＡ構築物、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチドを含む単離又は組み換え型細胞、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含む細胞培養物、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む細胞培養物、並びにこのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、ＤＮＡ構築物、細胞、細胞培養物、又はこれらの任意の組み合わせ若しくは混合物を１種以上含む組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１種の核酸又はポリヌクレオチドを含む本発明のベクター（例えば、発現ベクター又はＤＮＡ構築物）を少なくとも１つ含む組み換え細胞を提供する。このような組み換え細胞のいくつかのものは、このような少なくとも１つのベクターにより形質転換又はトランスフェクトされる。このような細胞は、典型的には宿主細胞と呼ばれる。このような細胞のうち幾種類かは、バチルス種（Bacillus sp.）細胞、例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）細胞が挙げられるがこれらに限定されない細菌細胞を含む。本発明は、本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含む組み換え細胞（例えば、組み換え宿主細胞）も提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする本発明のポリヌクレオチド配列が、効率的な遺伝子発現に必要とされる１つ又は追加の核酸セグメント（例えば、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする本発明のポリヌクレオチドに機能的に連結されるプロモーター）に機能的に連結される、発現ベクター又は発現カセットである。ベクターには、転写ターミネーター、及び／又は抗菌剤含有培地での増殖により、プラスミド感染宿主細胞の持続的な培養維持を可能にする、抗生物質耐性遺伝子などの選択遺伝子が包含され得る。
発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導され得るか、又は代替的な実施形態では、これらの両方の要素を含有する。ベクターの例としては、ｐＸＸ、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３（Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ［ｅｄｓ．］，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ［１９９０］を参照されたい；バチルス・スブチリス（B. subtilis）に好適な複製プラスミドとしては、第９２頁に掲載のものが挙げられる）；同様にして、Ｐｅｒｅｇｏ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｉｎ Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，［ｅｄｓ．］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．［１９９３］，ｐｐ．６１５〜６２４も参照されたい）が挙げられるがこれらに限定されない。
対象とするタンパク質（例えば、プロテアーゼ変異体）を細胞において発現及び生産する際、改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１コピー及び好ましくは複数コピー含む発現ベクターを少なくとも１つ用い、プロテアーゼの発現に好適な条件下で細胞を形質転換する。本発明のいくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体（並びにベクターに含まれる他の配列）をコードするポリヌクレオチド配列は宿主細胞のゲノムに組み込まれ、一方、他の実施形態では、プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターは自律性の染色体外因子として細胞内に留まる。本発明は、染色体外の核酸エレメント、並びに宿主細胞のゲノムに組み込まれる移入ヌクレオチド配列の両方を提供する。本明細書に記載のベクターは、本発明のプロテアーゼ変異体の生産に有用である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド構築物は、プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを細菌染色体に組み込み、そして場合により増幅することのできる組み込みベクターに存在する。組み込み部位の例は、当業者に周知である。いくつかの実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドの転写は、選択された前駆体プロテアーゼのための野生型プロモーターであるプロモーターによりもたらされる。他のいくつかの実施形態では、プロモーターは、前駆体プロテアーゼとは異種であるものの、宿主細胞中で機能するものである。具体的には、細菌宿主細胞で使用するのに好適なプロモーターの例としては、限定するものではないが、例えば、ＡｐｒＥ、ａｍｙＥ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ｐＳＰＡＣ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａＩＩプロモーター；並びにバチルス・ステアロサーモフィルスのマルトース生成型アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンス（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子、バチルス・スブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・クラウシイのアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミルスのキシロシダーゼ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシスのｃｒｙＩＩＩＡ、及びバチルス・リケニフォルミスのα−アミラーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる。追加のプロモーターとしては、限定するものではないが、Ａ４プロモーター、並びにファージλＰＲ又はＰＬプロモーター、及び大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが挙げられる。
本発明のプロテアーゼ変異体は、細菌及び糸状菌などの任意の好適な微生物宿主細胞において産生させることができる。
例えば、いくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体は真菌及び／又は細菌由来の宿主細胞で生産される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バチルス種（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）、エシェリキア種（Escherichia sp.）、又はアスペルギルス種（Aspergillus sp.）である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体は、バチルス種（Bacillus sp.）の宿主細胞により生産される。本発明のプロテアーゼ変異体の産生への使用が見出されるバチルス種（Bacillus sp.）宿主細胞の例としては、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（B. alkalophilus）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・プミリス（B. pumilis）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、及びバチルス・メガテリウム（B. megaterium）、並びにバチルス（Bacillus）属に属するその他の生物が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、バチルス・スブチリス（B. subtilis）宿主細胞は、プロテアーゼ変異体の産生に使用される。米国特許第５，２６４，３６６号及び同第４，７６０，０２５号（再発行特許第３４，６０６号）は、本発明のプロテアーゼ変異体の生産に使用することができる様々なバチルス属の宿主株を記述しているが、他の好適な株も使用することができる。
本発明のプロテアーゼ変異体の生産に使用することができるいくつかの工業用の細菌種としては、非組み換え型（すなわち、野生型）のバチルス種（Bacillus sp.）株、並びに天然由来の株の変異体及び／又は組み換え株が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主株は組み換え株であり、宿主には、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている。いくつかの実施形態では、宿主株はバチルス・スブチリス（B. subtilis）宿主株であり、特に組み換え型バチルス・スブチリス（B. subtilis）宿主株である。数多くのバチルス・スブチリス（B. subtilis）株が既知であり、限定するものではないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ ３９，０８７）、ＡＴＣＣ ２１３３２、ＡＴＣＣ ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ １１０、及びＰＥＰ ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７３：２１５〜２２８頁［１９７３年］、また同様に、米国特許第４，４５０，２３５号及び同第４，３０２，５４４号、並びに欧州特許第０１３４０４８号を参照されたい。これら各公報は参照によりその全文が組み込まれる）。発現宿主細胞としてのバチルス・スブチリス（B. subtilis）の使用は当業者に周知である（例えば、Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９：８１〜８７頁［１９８２年］；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６〜８０４頁［１９８６年］；並びにＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６９：３９〜４７頁［１９８８年］を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、バチルス属の宿主細胞は、次の遺伝子：ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ及びｄｅｇＱのうちの少なくとも１つの遺伝子において変異又は欠失を含むバチルス種の宿主細胞である。好ましい変異はｄｅｇＵ遺伝子におけるものであり、より好ましくは変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２におけるものである（例えば、Ｍｓａｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：８２４〜８３４［１９９０］；及びＯｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：５６２〜５６７［１９９７］を参照されたい）。変異ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）を有するバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）は、好適な宿主株の１つである。いくつかの実施形態では、バチルス（Bacillus）宿主は、ｓｃｏＣ４（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：７３２９〜７３４０［２００１］を参照されたい）；ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：１４０７〜１４１５［１９９９］を参照されたい）；及び／又はｏｐｐＡ又はｏｐｐオペロンのその他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１７３〜１８５［１９９１］を参照されたい）中に変異又は欠失を含む。実際に、ｏｐｐＡの遺伝子の変異と同じ表現型を生じるｏｐｐオペロンにおけるいかなる変異も、本発明の、変更の生じたバチルス（Bacillus）株についてのいくつかの実施形態において有用であろうと想到される。いくつかの実施形態では、これらの変異は単独で生じるが、他の実施形態では複数の変異が組み合わさって存在する。いくつかの実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体の産生に使用することができる、変更の生じたバチルス（Bacillus）属の宿主細胞株は、上記の遺伝子のうちの１つ以上に予め変異を包含しているバチルス属（Bacillus）の宿主株である。加えて、内因性プロテアーゼ遺伝子に関する変異（複数可）及び／又は欠失を含むバチルス種（Bacillus sp.）宿主細胞も有用である。いくつかの実施形態では、バチルス（Bacillus）属の宿主細胞は、ａｐｒＥ遺伝子及びｎｐｒＥ遺伝子の欠失を含む。他の実施形態では、バチルス種（Bacillus sp.）宿主細胞は、５つのプロテアーゼ遺伝子に欠失を含むのに対し、他の実施形態では、バチルス種（Bacillus sp.）宿主細胞は９つのプロテアーゼ遺伝子に欠失を含む（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号を参照されたい）。
宿主細胞は、当該技術分野において既知の任意の好適な手段を用いて、本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体をコードする少なくとも１つの核酸により形質転換される。核酸がベクターに組み込まれるか、又はプラスミドＤＮＡの非存在下で用いられるかによらず、核酸は、典型的には微生物に導入され、いくつかの実施形態では、好ましくは大腸菌細胞又はコンピテントバチルス細胞に導入される。プラスミドＤＮＡ構築物又はベクターを利用して、核酸（例えば、ＤＮＡ）をバチルス属の細胞又は大腸菌細胞に導入する方法、及びこのようなプラスミドＤＮＡ構築物又はベクターをそのような細胞に形質転換する方法は周知である。いくつかの実施形態では、プラスミドは、次に大腸菌（E. coli）細胞から単離され、バチルス（Bacillus）属の細胞に形質転換される。しかしながら、大腸菌（E. coli）などの介在微生物を用いることは必須ではなく、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物又はベクターは直接バチルス（Bacillus）属の宿主に導入される。
当業者であれば、本発明の核酸配列をバチルス（Bacillus）細胞に導入するのに好適な方法を認識されるであろう（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ Ｈａｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．［ｅｄｓ．］，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．［１９８９］，ｐｐ．５７〜７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：７１８〜７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：１９２５〜１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１〜１３５［１９８６］；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７［１９８５］；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１〜１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：２６１〜２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３〜２１７［１９８１］；及びＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３［１９８４］を参照されたい）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合（congression）を包含する形質転換、形質導入、及びプロトプラスト融合などの方法は周知であり、本発明でも好適に使用される。本発明のプロテアーゼ変異体をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物又はベクターを宿主細胞に導入するために、形質転換法が使用される。バチルス（Bacillus）属の細胞を形質転換させるのに当該技術分野で知られる方法としては、部分的に相同性の常在性プラスミドを保有しているコンピテントセルにドナープラスミドを取り込ませることを包含するプラスミドマーカーレスキュー形質転換法が挙げられる（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５〜５７１［１９７９］；Ｈａｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５〜１９１［１９９０］；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１０７７〜１０８７［１９８３］；及び Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１２０５〜１２１１［１９８７］を参照されたい）。この方法では、組み込まれるドナープラスミドは、染色体の形質転換を模倣するプロセスにおいて、常在性の「ヘルパー」プラスミドの相同領域と組み換えられる。
一般的に使用される方法に加えて、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物又はベクターにより直接的に形質転換される（すなわち、宿主細胞への導入前に、ＤＮＡ構築物又はベクターを増幅又はさもなくば処理する中間細胞は利用しない）。本発明のＤＮＡ構築物又はベクターの宿主細胞への導入法には、核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を、プラスミド又はベクターに挿入せずに宿主細胞に導入するために当該技術分野において知られる、物理的及び化学的方法が包含される。このような方法としては、限定するものではないが、塩化カルシウム沈殿、電気穿孔、ネイキッドＤＮＡ、及びリポソームなどが挙げられる。更なる実施形態では、ＤＮＡ構築物又はベクターは、プラスミドに挿入されることなく、プラスミドと共に同時形質転換される。更なる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野で知られる方法により、変更を加えたバチルス（Bacillus）株から欠失させる（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１〜４１８［１９８４］；及びＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２４７：２５５〜２６４［２０００］を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本発明の形質転換細胞は、一般的な栄養培地で培養される。温度及びｐＨなどの好適な具体的な培養条件は当業者に既知であり、科学文献に詳しく記載されている。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は本発明の少なくとも１種の核酸を含む培養物（例えば、細胞培養物）を提供する。同様に、本発明の核酸、ベクター、又はＤＮＡ構築物を少なくとも１つ含む組成物も提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列によって形質転換された宿主細胞を、本発明のプロテアーゼの発現を可能にする条件下で、好適な栄養培地で培養した後、得られたプロテアーゼを培養物から回収する。細胞培養に使用する培地には、宿主細胞を増殖させるのに好適な、適切な添加剤を含有している最少培地又は複合培地などといった任意の一般的な培地を含む。好適な培地は、販売元から入手することができ、又は公開されている処方に従って調製することもできる（例えば、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログを参照されたい）。いくつかの実施形態では、細胞により産生されたプロテアーゼは、例えば、遠心沈降又は濾過による培養液からの宿主細胞の分離、塩（例えば、硫酸アンモニウム）による上清又は濾液中のタンパク質様成分の沈殿、クロマトグラフィー精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティーなど）などが挙げられるがこれらに限定されない従来法により培地から回収される。プロテアーゼ変異体を回収又は精製するための任意の好適な方法が、本発明において有用である。
いくつかの実施形態では、組み換え宿主細胞により生産されたプロテアーゼ変異体は、培養培地に分泌される。精製を促進するドメインをコードする核酸配列を使用して、可溶性タンパク質の精製を容易にすることもできる。プロテアーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター又はＤＮＡ構築物は、プロテアーゼ変異体の精製を促進する精製促進ドメインをコードしている核酸配列を更に含む（例えば、Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４４１〜５３［１９９３］）。このような精製促進ドメインとしては、例えば、固定した金属による精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド（Ｐｏｒａｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３〜２８１［１９９２］を参照されたい）、固定した免疫グロブリンによる精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系に利用されるドメイン［例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から入手可能なプロテインＡドメイン］が挙げられるがこれらに限定されない。精製ドメインと非相同的なタンパク質との間に、凝固因子ＸＡ又はエンテロキナーゼなどの開裂可能なリンカー配列［例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能な配列］を含めることも、精製を容易にするのに有用である。
本発明のプロテアーゼ変異体などの酵素の酵素活性を検出及び測定するためのアッセイは周知である。プロテアーゼ（例えば、本発明の変異型プロテアーゼ）の活性を検出及び測定するための様々なアッセイも当業者には知られる。特に、当業者に周知であるように、２８０ｎｍでの吸光度として又はフォーリン法を用いる比色法により測定した、カゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイを、プロテアーゼの活性を測定するのに利用できる。他の例示的なアッセイは、発色性基質の可溶化を伴う（例えば、Ｗａｒｄ，「Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」 ｉｎ Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，［１９８３］，ｐｐ．２５１〜３１７を参照されたい）。他の例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当該技術分野で知られる数多くのその他の参照文献により好適な方法が提供される（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：７９１１〜７９２５［１９８３］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：１１９〜１２９［１９９４］；及びＨｓｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：２２１〜２２７［１９９９］を参照されたい）。
宿主細胞での成熟プロテアーゼ（例えば、本発明の成熟型のプロテアーゼ変異体）の産生レベルを評価するために、様々な方法を利用することができる。このような方法としては、限定するものではないが、例えば、プロテアーゼに特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを利用する方法が挙げられる。例示的な方法としては、限定するものではないが、例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらの及びその他のアッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１［１９８３］を参照されたい）。
他のいくつかの実施形態では、本発明は、本発明の成熟型のプロテアーゼ変異体を製造又は生産する方法を提供する。成熟型プロテアーゼ変異体は、シグナルペプチド配列又はプロペプチド配列を含有しない。この方法のいくつかのものは、例えば、バチルス種（Bacillus sp.）細胞（例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）細胞）などの、組み換え型細菌宿主細胞において、本発明のプロテアーゼ変異体を製造又は産生させる工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のプロテアーゼ変異体の生産方法を提供し、この方法は、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする核酸を含む組み換え発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を、プロテアーゼ変異体の生産を誘導する条件下で培養する工程を含む。このような方法のいくつかのものは、更に、培養物からプロテアーゼ変異体を回収する工程を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を産生する方法を提供し、方法は、（ａ）本発明のプロテアーゼ変異体をコードしている核酸を含む組み換え発現ベクターを細胞群［例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）細胞などの細菌細胞］に導入することと；（ｂ）この細胞を、発現ベクターによりコードされているプロテアーゼ変異体の産生を実施する条件下で、培養培地で培養することと、を含む。いくつかのこのような方法は、（ｃ）細胞又は培養培地からプロテアーゼ変異体を単離することを更に含む。
クリーニング組成物
特に断りのない限り、本明細書に提供される成分又は組成物のレベルはすべて、成分又は組成物の活性レベルに関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は除外される。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。百分率（％）及び比率はすべて、特に断りのない限り、重量で計算している。すべての百分率（％）及び比率は、特に断りのない限り、総組成物に対し計算している。例示された洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ特に断りのない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表記される。
本明細書で示されるように、いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、更に、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ剥離ポリマー、移染剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、充填塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナー、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、収縮防止剤、防皺剤、殺菌剤、防カビ剤、色スペックル、銀製品ケア剤、変色防止剤及び／又は防食剤、アルカリ度供給源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、及びｐＨ調整剤などの補助材料を含む（例えば、参照によりその全容が本明細書に援用される、米国特許６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号を参照されたい）。具体的なクリーニング組成物材料の実施形態を以下に詳細に例示する。クリーニング助剤が、クリーニング組成物中で本発明のプロテアーゼ変異体と適合性でない実施形態では、２つの成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤及びプロテアーゼを分離させたまま（すなわち、互いに接触させない）にするという好ましい手法が利用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離など）。
本発明のクリーニング組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面クリーニング用途、食器洗浄用途、並びに義歯、歯、毛髪、及び皮膚などの美容的化粧用途に好都合に使用される。加えて、低温の溶液中での有効性が増大しているという固有の利点により、本発明の酵素は洗濯用途に理想的なものである。更に本発明の酵素は、粒状及び液体組成物での使用が見出される。
本発明のプロテアーゼ変異体は、クリーニング添加剤においても有用である。いくつかの実施形態では、低温溶液を用いるクリーニング用途での使用が見出される。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の酵素を少なくとも１種含むクリーニング添加剤を提供し、当該クリーニング添加剤は、更に漂白効果が所望される場合に、洗浄プロセスに含めるために理想的に適している。このような場合の例としては、限定するものではないが、例えば、低温溶液を用いるクリーニング用途が挙げられる。いくつかの実施形態では、添加剤は最も単純な形態の１種以上のプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、添加剤は、クリーニングプロセスに添加される剤形にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、添加剤は、過酸化物供給源が用いられかつ漂白効果の増加が所望されるクリーニングプロセスに添加される剤形にパッケージングされる。限定するものではないが、例えば、丸剤、錠剤、ゲルキャップ、又は予め計量された粉末若しくは液体などの他の一回用量単位が挙げられる、任意の好適な一回用量単位が、本発明において有用である。いくつかの実施形態では、このような組成物を増量するために充填剤又はキャリア材料を含める。好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、様々な硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩並びにタルク、及びクレイなどが挙げられる。液体組成物に好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、水、又はポリオール及びジオールなどの低分子量の一級及び二級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、限定するものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、このような材料を約５％〜約９０％含有する。酸性充填剤はｐＨを低下させるために有用である。あるいは、いくつかの実施形態では、クリーニング添加剤として、以下により詳細に記載されるような補助成分が挙げられる。
本発明のクリーニング組成物及びクリーニング添加剤は、本明細書で提供される少なくとも１種のプロテアーゼ変異体の有効量を単独で、あるいは他のプロテアーゼ及び／又は追加の酵素と組み合わせて必要とする。必要とされる酵素レベルは、本発明のプロテアーゼ変異体を１種以上加えることにより達成される。典型的には、本発明のクリーニング組成物は、少なくとも約０．０００１重量％、約０．０００１〜約１０重量％、約０．００１〜約１重量％、又は更には約０．０１〜約０．１重量％の、少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を含む。
本明細書のクリーニング組成物は、典型的には、水性クリーニング操作で使用した場合に、洗浄水のｐＨが約５．０〜約１１．５又は更には約７．５〜約１０．５となるように配合される。液体製剤は、典型的には、約３．０〜約９．０又は更には約３〜約５の原液のｐＨを有するよう配合される。粒状洗濯製品は、典型的にはｐＨが約９〜約１１になるよう配合される。推奨される使用レベルでｐＨを調節する技術としては、緩衝剤、アルカリ、酸などの使用が挙げられ、これらは当業者には周知のものである。
好適な「低ｐＨのクリーニング組成物」は、典型的には、原液のｐＨが約３〜約５のものであり、典型的には、このようなｐＨ環境で加水分解される界面活性剤を含まない。このような界面活性剤としては、エチレンオキシド部分を少なくとも１つ又は更にはエチレンオキシド約１〜約１６モルを含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が挙げられる。このようなクリーニング組成物は、典型的には、原液のｐＨが約３〜約５であるクリーニング組成物を提供するのに十分な量のｐＨ調整剤、例えば、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸などを含む。このような組成物は、典型的には、酸に安定な酵素を少なくとも１種含む。いくつかの実施形態では、組成物は液体であるが、他の実施形態では、組成物は固体である。このような液体組成物のｐＨは、典型的には原液のｐＨとして測定される。このような固形組成物のｐＨは、上記組成物の１０％固体溶液として測定され、ここで、その溶媒は蒸留水である。これらの実施形態では、特に断りのない限り、ｐＨの測定はすべて２０℃で行われる。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ変異体が粒状組成物又は液体組成物に使用される場合、保存時にプロテアーゼ変異体を粒状組成物の他の成分から保護するために、変異型プロテアーゼはカプセル封入粒子の形態であることが望ましい。加えて、カプセル封入は、クリーニングプロセスでプロテアーゼ変異体の利用能を制御する手段でもある。いくつかの実施形態では、カプセル封入は、プロテアーゼ変異体及び／又は追加の酵素の性能を向上させる。この観点から、本発明のプロテアーゼ変異体は、当該技術分野において既知の任意の好適なカプセル材によりカプセル封入される。いくつかの実施形態では、カプセル材は、典型的には、本発明のプロテアーゼ変異体に関する触媒の少なくとも一部を封入する。典型的には、カプセル材は、水溶性及び／又は水分散性である。いくつかの実施形態では、カプセル材は、０℃以上のガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。ガラス転移温度は、ＰＣＴ国際特許出願公開第９７／１１１５１号により詳細に記載されている。カプセル材は、典型的には、炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。カプセル材が炭水化物である場合、典型的には、単糖、オリゴ糖、多糖、及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの典型的な実施形態では、カプセル材はデンプンである（例えば、欧州特許第０ ９２２ ４９９号；米国特許第４，９７７，２５２号、同第５，３５４，５５９号、及び同第５，９３５，８２６号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、カプセル材は、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル及びこれらの混合物などのプラスチックから製造されるマイクロスフェアであり、有用な市販のマイクロスフェアとしては、限定するものではないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）、並びにＰＭ ６５４５、ＰＭ ６５５０、ＰＭ ７２２０、ＰＭ ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ Ｃｏｒｐ．，Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ）として供給されるものが挙げられる。
本明細書に記載のように、本発明のプロテアーゼ変異体は、限定するものではないが、洗濯用洗剤及び食器用洗剤などのクリーニング産業において特に有用である。これらの用途では、酵素を様々な環境ストレス下に置く。本発明のプロテアーゼ変異体は、様々な条件下で安定であることから、現在使用されている多数の酵素よりも有利である。
実際に、多様な洗剤の配合、多様な洗浄水の容量、多様な洗浄水の温度、及び多様な洗浄時間の長さを含む各種洗浄条件が存在し、洗浄に関与するプロテアーゼはこれらの条件に晒される。加えて、異なる地域で使用される洗剤配合物では、洗浄水中に、関連する成分が異なる濃度で存在する。例えば、欧州の洗剤は一般的には４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に有するが、日本の洗剤は一般的には６６７ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水に有する。北アメリカ、特に合衆国では、一般的には約９７５ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に有する。
低濃度洗剤系には、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤が包含される。日本の洗剤は、洗浄水中におよそ６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に低濃度洗剤系とみなされる。
中間濃度の洗剤には、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤が包含される。北アメリカの洗剤は、洗浄水中におよそ９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に中間濃度の洗剤系であるとみなされる。ブラジルでは、典型的に洗浄水中におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。
高濃度洗剤系には、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分が洗浄水中に存在している洗剤が包含される。欧州の洗剤は、洗浄水中におよそ４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に高濃度洗剤系であるとみなされる。
ラテンアメリカの洗剤は、概して高起泡性のリン酸塩ビルダー洗剤であり、洗浄水中に１５００〜６０００ｐｐｍの範囲の洗剤成分が存在していることから、ラテンアメリカで使用されている洗剤の範囲は、中間濃度及び高濃度洗剤の両方に包含される。上記のように、ブラジルでは、洗浄水中に典型的におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。しかしながら、例えば、他のラテンアメリカの国々に限定されないが、高起泡性のリン酸ビルダー洗剤が使用されている他の地域では、洗浄水中に、洗剤成分が最大で約６０００ｐｐｍ存在している高濃度洗剤系が使用されている場合がある。
前述の内容を考慮すると、世界中の典型的な洗浄液中の洗剤組成物の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「低濃度洗剤地域」）、例えば、日本の約６６７ｐｐｍのものから、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤組成物（「中間濃度の洗剤地域」）、例えば、米国の約９７５ｐｐｍ及びブラジルの約１５００ｐｐｍのもの、そして約２０００ｐｐｍ超の洗剤組成物（「高濃度洗剤地域」）、例えば、欧州の約４５００ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍのもの、及び高起泡性リン酸ビルダーの地域では約６０００ｐｐｍのものまで様々であることが明白である。
典型的な洗浄液の濃度は経験的に決定される。例えば、米国では、典型的な洗濯機の洗浄液容量は約６４．４Ｌである。したがって、洗浄溶液中に約９７５ｐｐｍの洗剤濃度を得るためには、６４．４Ｌの洗浄液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を添加しなくてはならない。この量は、消費者が、洗剤に付属された計量カップを用いて洗浄水に量り入れる典型的な量である。
更なる例として、異なる地域では異なる洗浄温度が使用される。日本で使用されている洗浄水の温度は、一般的に、欧州で使用される温度よりも低い。例えば、北アメリカ及び日本の洗浄水の温度は、典型的には約１０〜約３０℃（例えば、約２０℃）であるが、欧州の洗浄水の温度は、典型的には約３０〜約６０℃（例えば、約４０℃）である。しかしながら、エネルギーの節約の観点から、多くの消費者は冷水洗浄の使用に切り替えている。加えて、いくつかの更なる地域では、典型的に洗濯だけでなく食器洗浄用途にも冷水が使用されている。いくつかの実施形態では、本発明の「冷水洗浄」では、約１０℃〜約４０℃、又は約２０℃〜約３０℃、又は約１５℃〜約２５℃、並びに約１５℃〜約３５℃の範囲内のすべてのその他の組み合わせ、並びに１０℃〜４０℃のすべての範囲の洗浄温度に好適な「冷水用洗剤」を用いる。
更なる例として、異なる地域では、典型的には異なる硬度の水が用いられている。水硬度は、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を合わせて１ガロンあたりのグレインを単位とする。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）量の測定値である。米国ではほとんどの水は硬水であるが、硬度の程度は様々である。中硬水（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬水（１２１〜１８１ｐｐｍ）は、６０〜１８１ｐｐｍ（ｐｐｍをグレイン／ＵＳガロン単位に変換する場合、ｐｐｍ数を１７．１で除したものがグレイン／ガロンに相当する）の鉱物を含有する。
Figure 0006678108
欧州の水硬度は、一般的には約０．１５０（１０．５）（例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の合計が約０．１５０〜約０．２９（１０．５〜約２０．０））グラム／リットル（括弧内はグレイン／ガロン単位）を上回る（例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の合計が約０．２１グラム／リットル（１５グレイン／ガロン））。北アメリカの水硬度は、一般的には日本の水硬度よりも高いものの、欧州の水硬度より低い。例えば、北アメリカの水硬度は、約０．２〜約０．６グラム（３〜約１０グレイン）、約０．２〜約０．５グラム又は約０．４グラム（３〜約８グレイン又は約６グレイン）であり得る。日本の水硬度は、一般的には北アメリカの水硬度よりも低く、通常Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の合計が約０．３（４）未満、例えば約０．０４グラム／リットル（３グレイン／ガロン）である。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は少なくとも１組の洗浄条件（例えば、水温、水の硬度、及び／又は洗剤濃度）において驚くべき洗浄性能を示すプロテアーゼ変異体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体の洗浄性能は、他のＬＧ１２プロテアーゼの洗浄性能と同程度である。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に提供されるプロテアーゼ変異体は、強化された酸化安定性、強化された熱安定性、様々な条件下での強化されたクリーニング性能、及び／又は強化されたキレート剤中の安定性を示す。加えて、本発明のプロテアーゼ変異体は、単独でも又はビルダー及び安定化剤との組み合わせとしても、洗剤を含まないクリーニング組成物において有用である。
本発明のいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％のレベルで本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体と、組成物の重量をもとに、クリーニング助剤を含む残部（例えば、約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％）と、を含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき、約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％のレベルの少なくとも１種のプロテアーゼ変異体と、クリーニング助剤を含むクリーニング組成物の残部（例えば、約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％）と、を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、クリーニング性能及び／又は布地ケア及び／又は食器洗浄効果を提供する追加の洗剤用酵素を１種以上含む。好適な酵素の例としては、限定するものではないが、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、あるいはこれらの任意の組み合わせ又はこれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び／又はセルラーゼなどの一般的に適用可能な酵素をアミラーゼと共に含む酵素混合物（すなわち、「カクテル」）が使用される。
本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体に加えて、任意の他の好適なプロテアーゼが本発明の組成物において有用である。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、微生物由来のプロテアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ性の微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。アルカリ性プロテアーゼの例としては、スブチリシン、特にバチルス（Bacillus）属由来のスブチリシンが挙げられる（例えば、スブチリシン、レンタス、アミロリケファシエンス、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、スブチリシン３０９、スブチリシン１４７、及びスブチリシン１６８）。追加の例としては、参照によりその全容が本明細書に援用される、米国再発行特許第３４，６０６号、同第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８号が挙げられる。追加のプロテアーゼ例としては、例えば、限定するものではないが、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）、及びＰＣＴ国際特許出願公開第８９／０６２７０号に記載のフサリウムプロテアーゼが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明に使用できる市販のプロテアーゼ酵素としては、限定するものではないが、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）及びＢＬＡＰ（商標）変異体（Ｈｅｎｋｅｌ Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ａｕｆ Ａｋｔｉｅｎ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、並びにＫＡＰ（バチルス・アルカロフィルススブチリシン；花王株式会社、日本国東京）が挙げられる。様々なプロテアーゼが、国際公開ＷＯ９５／２３２２１号、国際公開第９２／２１７６０号、米国特許出願公開２００８／００９０７４７号、及び米国特許第５，８０１，０３９号、同第５，３４０，７３５号、同第５，５００，３６４号、同第５，８５５，６２５号、米国再発行特許第３４，６０６号、米国特許第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６、及び同第６，４８２，６２８号、並びに様々なその他の特許文献に記載されている。いくつかの更なる実施形態では、本発明において有用であるセリンプロテアーゼとしては、限定するものではないが、ＰＣＴ国際特許出願公開第０７／０４４９９３号に記載の中性のセリンプロテアーゼが挙げられる。
加えて、任意の好適なリパーゼが本発明において有用である。好適なリパーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体は本発明に包含される。有用なリパーゼの例としては、ヒュミコラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ（例えば、欧州特許第２５８ ０６８号、及び同第３０５ ２１６号を参照されたい）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ（例えば、欧州特許第２３８ ０２３号を参照されたい）、カンジダ（Candida）リパーゼ、例えば、カンジダ・アンタークティカ（C. antarctica）リパーゼ［例えば、カンジダ・アンタークティカ（C. antarctica）リパーゼＡ又はＢ；例えば、欧州特許第２１４ ７６１号を参照されたい］、シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、例えば、シュードモナス・アルカリジェネス（P. alcaligenes）及びシュードモナス・シュードアルカリジェネス（P. pseudoalcaligenes）リパーゼ（例えば、欧州特許第２１８ ２７２号を参照されたい）、シュードモナス・セパキア（P. cepacia）リパーゼ（例えば、欧州特許第３３１ ３７６号を参照されたい）、シュードモナス・ストゥッチェリ（P. stutzeri）リパーゼ（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号を参照されたい）、シュードモナス・フルオレッセンス（P. fluorescens）リパーゼ、バチルス（Bacillus）リパーゼ（例えば、バチルス・スブチリス（B. subtilis）リパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３〜２６０［１９９３］）；バチルス・ステアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）リパーゼ［例えば、日本国特許第６４／７４４９９２号を参照されたい］；並びにバチルス・プミルス（B.pumilus）リパーゼ［例えば、国際公開第ＷＯ ９１／１６４２２号を参照されたい］）が挙げられる。
更に、本発明のいくつかの実施形態には、ペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camembertii）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０３：６１〜６７［１９９１］を参照されたい）、ゲオトリクム・カンジドウム（Geotricum candidum）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３〜３８８［１９８９］を参照されたい）、及び様々なリゾプス（Rhizopus）リパーゼ、例えば、リゾプス・デレマー（R. delemar）リパーゼ（Ｈａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０９：１１７〜１１３［１９９１］を参照されたい）、リゾプス・ニベウス（R. niveus）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６〜７１９［１９９２］）、及びリゾプス・オリゼ（R. oryzae）リパーゼが挙げられるがこれらに限定されない数多くのクローン化されたリパーゼの使用が見出される。
クチナーゼなどの他の種類の脂肪分解酵素も本発明のいくつかの実施形態での使用が見出されており、限定するものではないが、例えば、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）由来のクチナーゼ（国際公開第８８／０９３６７号を参照されたい）、及びフザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼ（国際公開第９０／０９４４６号を参照されたい）が挙げられる。
その他の好適なリパーゼとしては、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；及びＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「アマノ」（天野エンザイム，日本）などの市販のリパーゼが挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のリパーゼのレベルのリパーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にリパーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％リパーゼのレベルで含む。
本発明のいくつかの実施形態では、任意の好適なアミラーゼが、本発明において有用である。いくつかの実施形態では、アルカリ性溶液に使用するのに好適である任意のアミラーゼ（例えば、α及び／又はβ）も有用である。好適なアミラーゼとしては、限定するものではないが、細菌由来のもの又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本発明において有用なアミラーゼとしては、限定するものではないが、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）から得られるα−アミラーゼが挙げられる（例えば、英国特許第１，２９６，８３９号を参照されたい）。本発明において有用な市販のアミラーゼとしては、限定するものではないが、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のアミラーゼのレベルのアミラーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。同様に、本発明の一部の他の実施例では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にアミラーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％アミラーゼのレベルで含む。
いくつかの更なる実施形態では、任意の好適なセルラーゼが、本発明のクリーニング組成物において有用である。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼが挙げられる（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照されたい）。特に好適なセルラーゼは、色ケア効果を有するセルラーゼである（例えば、欧州特許第０４９５２５７号を参照されたい）。本発明において有用である市販のセルラーゼとしては、限定するものではないが、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、Ｎ−末端部分が欠失している成熟野生型セルラーゼ又はセルラーゼ変異体の部分又は断片として組み込まれる（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％のレベルの追加のセルラーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にセルラーゼを、組成物の重量に基づいて約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％のレベルで含む。
洗剤組成物で使用するのに好適な任意のマンナナーゼも同様に本発明において有用である。好適なマンナナーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本発明において使用が見出される様々なマンナナーゼが知られている（例えば、参照によりその全容が本明細書に援用される米国特許第６，５６６，１１４号、同第６，６０２，８４２号、及び同第６，４４０，９９１号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％のレベルの追加のマンナナーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％レベルでマンナナーゼを含む。
いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼは過酸化水素又は過酸化水素供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩又は過硫酸塩）と組み合わせて本発明の組成物に使用される。いくつかの代替的な実施形態では、オキシダーゼは酸素と組み合わせて使用される。いずれのタイプの酵素も「溶液を漂白する」（すなわち、布地を一緒に洗浄液で洗浄する場合に、繊維製品の染料が、その染料で染色されている布から他の布へと色移りするのを予防する）ために、好ましくは増感剤と共に使用される（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第９４／１２６２１号及び同第９５／０１４２６号を参照されたい）。好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、限定するものではないが、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼのレベルのペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼのレベルで含む。
いくつかの実施形態では、有用である追加の酵素としては、限定するものではないがペルヒドロラーゼが挙げられる（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第０５／０５６７８２号を参照されたい）。加えて、いくつかの実施形態では、上述の酵素の混合物、特に、１種以上の追加のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なくとも１種のセルラーゼなどの酵素の混合物が、本明細書に包含される。実際に、これらの酵素の多様な混合物が本発明において有用であることは想到される。変異型プロテアーゼ及び１種以上の追加の酵素のレベルは、いずれも独立して約１０％までの範囲で変化し、クリーニング組成物の残部はクリーニング助剤からなることも想到される。具体的なクリーニング助剤の選別は、クリーニングされる表面、物品、又は布地、並びに使用時（例えば、洗剤を用いた洗浄中）のクリーニング条件に所望される組成物の形態を考慮することで容易になされる。
好適なクリーニング助剤の例としては、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化系、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ剥離ポリマー、移染剤、移染防止剤、触媒材料、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成された過酸、ポリマー型分散剤、泥汚れ除去剤、構造弾性化剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、フィラー塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナー、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤、溶媒、色素、加水分解性界面活性剤、保存料、抗酸化剤、収縮防止剤、防皺剤、殺菌剤、防カビ剤、色スペックル、銀製品ケア剤、変色防止剤及び／又は防食剤、アルカリ供給源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、色素、及びｐＨ調整剤が挙げられる（例えば、参照により本明細書にその全容が援用される、米国特許第６，６１０，６４２号；同第６，６０５，４５８号；同第５，７０５，４６４号；同第５，７１０，１１５号；同第５，６９８，５０４号；同第５，６９５，６７９号；同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号を参照されたい）。具体的なクリーニング組成物材料の実施形態を以下に詳細に例示する。クリーニング助剤が、クリーニング組成物中で本発明のプロテアーゼ変異体と適合性でない実施形態では、２つの成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤及びプロテアーゼを分離させたまま（すなわち、互いに接触させない）にするという好ましい手法が利用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離など）。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１種以上のプロテアーゼ変異体の有効量は、タンパク質性の染みを除去する必要のある各種表面をクリーニングするのに有用な組成物中に含まれる。このようなクリーニング組成物としては、硬質表面、布地、及び皿のクリーニングなどの用途向けのクリーニング組成物が挙げられる。実際に、いくつかの実施形態では、本発明は布地クリーニング組成物を提供するが、他の実施形態では、本発明は非布地用クリーニング組成物を提供する。特に、本発明は、口腔ケア組成物（歯磨剤、歯磨き粉、マウスウォッシュなど、並びに義歯洗浄用組成物を包含する）、皮膚クリーニング組成物及び毛髪クリーニング組成物などのパーソナルケアに好適なクリーニング組成物も提供する。本発明は、任意の形態（すなわち、液体、粒状、棒状、半固形、ゲル、乳濁液、錠剤、カプセル剤など）の洗剤組成物を包含することを意図する。
例として、本発明のプロテアーゼ変異体が有用である数種類のクリーニング組成物について、以降に更に詳細に説明する。本発明のクリーニング組成物が、洗濯機を用いる洗浄方法で使用するのに好適な組成物として配合されるいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、少なくとも１種のビルダー化合物と、並びに好ましくは、有機高分子化合物、漂白剤、追加の酵素、抑泡剤、分散剤、石鹸カス分散剤、汚れ懸濁剤及び再付着防止剤、及び防食剤から選択される１種以上のクリーニング助剤と、を含有する。いくつかの実施形態では、洗濯用組成物は柔軟剤も含有する（すなわち、追加のクリーニング助剤として）。本発明の組成物は、固形又は液体形態の洗剤添加剤としても有用である。このような添加剤は、従来の洗剤組成物の性能を補う及び／又は強化することが意図されるものであり、クリーニングプロセスの任意の段階で添加できる。いくつかの実施形態では、２０℃で測定した場合、本発明の洗濯洗剤組成物の密度は約４００〜約１２００ｇ／リットルの範囲であり、一方で他の実施形態では約５００〜約９５０ｇ／リットルの範囲である。
食器手洗い方式で使用する組成物として配合される実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、好ましくは有機高分子化合物、起泡剤、第２族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、及び追加の酵素から選択される少なくとも１種の追加のクリーニング助剤と、を含有する。
いくつかの実施形態では、米国特許第６，６０５，４５８号に提供されるものなどの様々なクリーニング組成物と、本発明のプロテアーゼ変異体とを組み合わせての使用が見出される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含有する組成物は、コンパクトな粒状布地クリーニング組成物である一方、他の実施形態では、組成物は、着色された布地を洗濯するのに有用な粒状布地洗浄組成物であり、他の実施形態では、組成物は、洗浄能を通して柔軟効果を提供する粒状布地クリーニング組成物であり、更なる実施形態では、組成物は、強力液体布地クリーニング組成物である。いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に記載のものなどの布地クリーニング組成物である。更に、本発明のプロテアーゼ変異体は、欧州又は日本の洗浄条件（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号を参照されたい）下で特に有用である顆粒状洗濯洗剤組成物への使用が見出される。
いくつかの代替的な実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む硬質表面クリーニング組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，３７６，４５０号、及び同第６，３７６，４５０号に記載の硬質表面クリーニング組成物である。
更に他の実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む食器洗浄用組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に記載のものなどの硬質表面クリーニング組成物である。更に他のいくつかの実施形態では、本発明は、本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含む食器洗浄用組成物を提供する。いくつかの更なる実施形態では、少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体を含む組成物は、米国特許第６，３７６，４５０号、及び同第６，３７６，４５０号に記載のものなどの口腔ケア組成物を含む。前述の米国特許第６，３７６，４５０号、同第６，６０５，４５８号、同第６，６０５，４５８号、及び同第６，６１０，６４２号に含有される化合物及びクリーニング助剤についての処方及び記載には、本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体の使用が見出される。
本発明のクリーニング組成物は、製造者により選択される任意のプロセスにより、任意の好適な形態に処方され、かつ調製され、非限定的な例は、参照によりその全容が本明細書に援用される米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、及び同第５，４８６，３０３号が挙げられる。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される場合、かかる組成物のｐＨは、モノエタノールアミン又は酸性材料（例えば、ＨＣｌ）などの追加の材料により調整される。
本発明の目的には必須でないが、以下に例示される助剤の非限定的な一覧は、本発明のクリーニング組成物での使用に好適である。いくつかの実施形態では、これらの助剤は、例えば、クリーニング性能を補助又は強化させるために、クリーニングされる基材を処理するために、あるいは香料、着色剤、又は染料などの場合にはクリーニング組成物の美観を改善するために組み込まれる。これらの助剤が本発明のプロテアーゼ変異体に添加されることは理解されたい。このような追加成分の正確な性質及びその添加レベルは、組成物の物理的形態、及び組成物が使用されるクリーニング操作の性質によって決まる。好適な補助剤としては、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、付着助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定化剤、触媒材料、漂白活性化剤、漂白増進剤、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成された過酸、高分子分散剤、泥汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、構造弾性化剤、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤及び／又は色素が挙げられる。以下の開示に加え、このような他の補助剤の好適な例及び使用レベルは、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号、及び同第６，３２６，３４８号に記載されており、これら公報は参照により組み込まれる。上述の補助成分は、本発明のクリーニング組成物の残部を構成し得る。
いくつかの実施形態では、本発明に従うクリーニング組成物は、少なくとも１種の界面活性剤及び／又は界面活性剤系を含み、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物から選択される。いくつかの低ｐＨクリーニング組成物の実施形態（例えば、原液のｐＨが約３〜約５の組成物の場合）では、界面活性剤がこのような組成物の酸性成分により加水分解される恐れがあると考えられることから、典型的には当該組成物はエトキシル化アルキル硫酸塩を含まない。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、クリーニング組成物の重量に基づいて、約０．１重量％〜約６０重量％のレベルで存在する一方、代替的な実施形態では約１重量％〜約５０重量％のレベルで、あるいは更に他の実施形態では約５重量％〜約４０重量％のレベルで存在する。
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の洗剤ビルダー又はビルダー系を含む。少なくとも１種のビルダーを組み込むいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、クリーニング組成物の重量に基づいて、少なくとも約１重量％、約３重量％〜約６０重量％、又は更には約５重量％〜約４０重量％のビルダーを含む。ビルダーとしては、限定するものではないが、例えば、ポリリン酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びアルカノールアンモニウム塩、ケイ酸アルカリ金属塩、炭酸のアルカリ土類金属塩及びアルカリ金属塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボン酸塩化合物、エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、ポリ酢酸の様々なアルカリ金属塩、アンモニウム塩及び置換アンモニウム塩（例えば、エチレンジアミン四酢酸及びニトリロ三酢酸）、並びにメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びこれらの可溶性塩などのポリカルボン酸類が挙げられる。実際に、本発明の様々な実施形態では任意の好適なビルダーが有用であることが想到される。
いくつかの実施形態では、ビルダーは硬度をもたらす水溶性のイオン錯体（例えば、金属イオン封鎖ビルダー）、例えば、クエン酸塩及びポリリン酸塩など（例えば、トリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、並びにトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物など）を形成する。当該技術分野において知られるものなどの（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号参照）、任意の好適なビルダーが、本発明において有用であることが想到される。
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は少なくとも１種のキレート剤を含有する。好適なキレート剤としては、銅、鉄及び／又はマンガンキレート剤及びこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。少なくとも１種のキレート剤を使用する実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、対象とするクリーニング組成物の重量に基づいて、約０．１重量％〜約１５重量％又は更には約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含む。
いくつかの更なる実施形態では、本明細書で提供されるクリーニング組成物は、少なくとも１種の付着助剤を含有する。好適な付着助剤としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸塩、ポリテレフタル酸などの汚れ剥離ポリマー、カオリナイトなどのクレイ、モンモリロナイト、アタパルジャイト（atapulgite）、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物が挙げられる。
本明細書に記載されるように、再付着防止剤は、本発明の一部の実施形態において有用である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は有用である。例えば、自動食器洗浄機の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、表面改質の目的で、特にシーチングのために、フィルミングとスポッティングを防止するため、及び光沢を改善するために有用である。これらの非イオンの界面活性剤は、また、汚れの再付着の防止にも有用である。いくつかの実施形態では、再付着防止剤は、当該技術分野において既知の非イオン性界面活性剤である（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の移染防止剤を包含する。好適なポリマー移染防止剤としては、これらに限定されるものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、及びポリビニルイミダゾール、又はこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１種の移染防止剤が使用される実施形態では、本発明のクリーニング組成物において、クリーニング組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、又は更には約０．１重量％〜約３重量％を構成する。
いくつかの実施形態では、ケイ酸塩が本発明の組成物に含まれる。このようないくつかの実施形態では、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶質フィロケイ酸塩）は有用である。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は約１％〜約２０％のレベルで存在する。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は組成物の約５重量％〜約１５重量％のレベルで存在する。
いくつかの更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は分散剤も含有する。好適な水溶性有機材料には、ホモポリマー型若しくはコポリマー型の酸又はそれらの塩が挙げられるが、これらに限定されず、このうち、ポリカルボン酸は、炭素原子２個以内の程度で互いに離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
いくつかの更なる実施形態では、クリーニング組成物に使用される酵素は任意の好適な技術により安定化されている。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンの水溶性供給源を存在させて、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを酵素に供給することで安定化する。いくつかの実施形態では、酵素安定化剤としては、オリゴ糖類、多糖類、及び二価の無機金属塩、例えばアルカリ土類金属塩（カルシウム塩など）が挙げられる。酵素安定化に関する様々な技術が本発明において有用であると想到される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中に、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオンの水溶性供給源、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ）イオン）の水溶性供給源を存在させて当該イオンを酵素に供給することで安定化される。塩化物及び硫酸塩もまた、本発明のいくつかの実施形態において有用である。好適なオリゴ糖類及び多糖類（例えば、デキストリン）の例は、当該技術分野において既知である（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第０７／１４５９６４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、例えば、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸）及び／又はトリペプチドアルデヒドなどの可逆的プロテアーゼ阻害剤もまた、所望により更に安定性を改善させるために有用である。
いくつかの実施形態では、漂白剤、漂白活性化剤及び／又は漂白触媒が、本発明の組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、無機及び／又は有機漂白化合物を含む。無機漂白剤としては、限定するものではないが、ペルハイドレート塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩はアルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩が、更なる保護はされずに結晶質の固体として含まれるが、他のいくつかの実施形態では、この塩はコーティングされる。当該技術分野において知られる任意の好適な塩が、本発明において有用である（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、漂白活性化剤を本発明の組成物に使用する。漂白活性化剤は、典型的には、６０℃以下の温度にてクリーニング過程で漂白作用を増強させる有機過酸前駆体である。本明細書に用いるのに好適な漂白活性化剤としては、過加水分解条件下で好ましくは約１〜約１０個の炭素原子、特に約２〜約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸及び／又は任意に置換された過安息香酸を生じる化合物が挙げられる。更なる漂白活性化剤も当該技術分野において知られており、本発明において有用である（例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号を参照されたい）。
加えて、いくつかの実施形態において及び本明細書に更に記載されるように、本発明のクリーニング組成物は、少なくとも１種の漂白触媒を更に含む。いくつかの実施形態では、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、並びにコバルト錯体、銅錯体、マンガン錯体、及び鉄錯体も有用である。その他の漂白触媒も本発明において有用である（例えば、米国特許第４，２４６，６１２号、同第５，２２７，０８４号、及び同第４，８１０，４１０号；ＰＣＴ国際特許出願公開第９９／０６５２１号；及び欧州特許第２ １００ ９４９号を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は１種以上の触媒性金属錯体を含有する。いくつかの実施形態では、金属系漂白触媒は有用である。いくつかの実施形態では、金属系漂白触媒には、所定の漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンカチオン）、漂白触媒活性をわずかしか有さない又は全く有さない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン）、及び触媒型及び補助金属カチオンに関して所定の安定性定数を有する金属イオン封鎖剤、具体的には、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）及びこれらの水溶性塩を含む触媒系が含まれる（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はマンガン化合物により触媒される。このような化合物及び使用レベルは当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号を参照されたい）。追加の実施形態では、コバルト漂白触媒は、本発明のクリーニング組成物において有用である。様々なコバルト漂白触媒が当該技術分野において知られており（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び同第５，５９５，９６７号を参照されたい）、知られている手順により容易に調製される。
いくつかの更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、マクロ多環式剛性配位子（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含有する。実際問題として、制限を目的とするものではないが、いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物及びクリーニング方法は、水性洗浄媒質中に少なくとも１ｐｐｈｍの次数で活性ＭＲＬ種を供給するように調整され、及びいくつかの実施形態では約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、より好ましくは約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、及び最も好ましくは約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬが洗浄液中に供給される。
いくつかの実施形態では、本発明の遷移金属漂白触媒の遷移金属としては、限定するものではないが、例えば、マンガン、鉄及びクロムが挙げられる。同様に、ＭＲＬとしては、限定するものではないが、例えば、特定の架橋型超剛性配位子（例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ（６．６．２）ヘキサデカン）が挙げられる。好適な遷移金属ＭＲＬは、知られている手順により容易に調製される（例えば、ＰＣＴ国際特許出願公開第２０００／３２６０１号及び米国特許第６，２２５，４６４号を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、金属製品ケア剤を含有する。金属製品ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、及び非鉄金属（例えば、銀及び銅）を包含する金属の、変色、腐食、及び／又は酸化の予防及び／又は軽減に有用である。好適な金属製品ケア剤としては、欧州特許第２ １００ ９４９号、ＰＣＴ国際特許出願公開第９４／２６８６０号、及び同第９４／２６８５９号に記載のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、金属製品ケア剤は亜鉛塩である。いくつかの更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の金属製品ケア剤を約０．１重量％〜約５重量％含む。
いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、ＬＧ１２プロテアーゼ変異体を有する高密度液体（ＨＤＬ）組成物である。ＨＤＬ液体洗濯洗剤には、アニオン性洗剤界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、スルホン酸アルキル、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）；及び任意選択的に非イオン界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキルアルコキシル化アルコール、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシル化アルコール及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートからなる群から選択される）を含む、洗剤界面活性剤を含ませることができ（１０％〜４０％）、任意選択的に、アニオン性洗剤界面活性剤（親水性指数（ＨＩｃ）が６．０〜９のもの）の非イオン性洗剤界面活性剤に対する重量比は１：１である。
組成物には、任意選択的に、両親媒性アルコキシル化グリースクリーニングポリマーからなる界面活性増強ポリマー（surfactancy boosting polymer）（分岐親水性及び疎水性を備える分岐部分を有するアルコキシル化ポリマーからなる群から選択され、例えば、アルコキシル化ポリアルキレンイミンを０．０５重量％〜１０重量％）、及び／又はランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン酸、飽和ポリアルコール、例えば、グリセロール、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性主鎖と、Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖（複数可）とを含む）を含ませることができる。
組成物には、追加ポリマー、例えば汚れ剥離ポリマー（アニオン性末端保護ポリエステル、例えば、ＳＲＰ１、ランダム又はブロック構成で、単糖類、ジカルボン酸、ポリオール及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１種のモノマー単位を含むポリマー、ランダム又はブロック構成のエチレンテレフタレート系ポリマー及びそれらのコポリマーであって、例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ ＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００及びＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ ＳＬを含む）、再付着防止ポリマー（分子量５００〜１００，０００Ｄａの範囲の、アクリル酸、マイレン酸（若しくはマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸、及びこれらの任意の混合物から選択される少なくとも１種のモノマーを含むポリマー、ビニルピロリドンホモポリマー、並びに／又はポリエチレングリコールなどのカルボキシレートポリマーを０．１重量％〜１０重量％含む）、セルロースポリマー（アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロースであって、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、及びこれらの混合物などから選択されるものを含む）、並びに高分子カルボキシレート（マレイン酸／アクリル酸ランダムコポリマー又はポリアクリル酸ホモポリマーなど）などを含めることもできる。
組成物は、飽和又は不飽和脂肪酸、好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）、及び付着補助剤を含んでもよく、付着補助剤の例としては、多糖類、好ましくはセルロース系ポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤＭＡＣ）、及びＤＡＤＭＡＣと、ビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、ハロゲン化イミダゾリニウム、及びそれらの混合物との、ランダム又はブロック構成のコポリマー、カチオン性グアーガム、カチオン性セルロース（例えば、カチオン性ヒドロキシエチル（hydoxyethyl）セルロースなど）、カチオン性デンプン、カチオン性ポリアシルアミド、並びにそれらの混合物が挙げられる。
組成物には、更に、移染防止剤を含ませることもでき、移染防止剤としては、例えば、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール、並びに／又はこれらの混合物、キレート剤（例えば、エチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）が挙げられる）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸及びその任意の塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
組成物は、更に、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ，リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの任意の混合物から選択される酵素（約０．０１重量％活性酵素〜０．０３重量％活性酵素）を含ませることもできる。組成物は、酵素安定化剤（例としては、プロピレングリコール若しくはグリセロールなどのポリオール類、糖若しくは糖アルコール、乳酸、可逆的プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸、若しくは芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体、又は４−ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体が挙げられる）を含んでもよい。
組成物には、シリコーン又は脂肪酸系抑泡剤、色相染料、カルシウム及びマグネシウムカチオン、視覚的シグナル成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）、及び／又は構造剤／増粘剤（０．０１重量％〜５重量％、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微小結晶セルロース、セルロース系材料、微小繊維セルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、及びこれらの混合物からなる群から選択される）を更に含ませることもできる。
好適な洗浄界面活性剤には、カチオン性洗浄界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）、双極性及び／又は両性洗浄界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインからなる群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、並びにこれらの混合物も含まれる。
組成物は任意の液体形態であってよく、例えば、液体又はジェル形態、あるいはこれらの組み合わせであってよい。組成物は、任意の単回用量形態であってよく、例えば、パウチであってもよい。
いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、ＬＧ１２プロテアーゼ変異体を有する高密度粉末（ＨＤＤ）組成物である。ＨＤＤ粉末洗濯洗剤は、洗浄用界面活性剤、例えば、アニオン性洗浄用界面活性剤（例えば、直鎖状又は分岐鎖状又はランダム鎖状の、置換又は非置換のアルキル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はそれらの混合物からなる群から選択される）、非イオン性洗浄用界面活性剤（例えば、直鎖状又は分岐鎖状又はランダム鎖状の、置換又は非置換のＣ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレート、及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートからなる群から選択される）、カチオン性洗浄用界面活性剤（例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及びそれらの混合物からなる群から選択される）、双性イオン性及び／又は両性洗浄用界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインからなる群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びそれらの混合物など；ビルダー、例えば、リン酸塩を含まないビルダー（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲の、ゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰ及びゼオライトＭＡＰなどのゼオライトビルダー）、リン酸塩ビルダー（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲の、トリポリリン酸ナトリウムを包含する）、１５重量％未満の範囲のクエン酸、クエン酸塩、及びニトリロ三酢酸又はその塩、ケイ酸塩（０重量％〜１０重量％未満の範囲のケイ酸ナトリウム若しくはケイ酸カリウム又はメタケイ酸ナトリウム、あるいは層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））、炭酸塩（０重量％〜１０重量％未満の範囲の、炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウム）；並びに漂白剤（すなわち、フォトブリーチであって、例としては、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料、及びそれらの混合物が含まれる）、疎水性若しくは親水性の漂白活性剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシ安息香酸若しくはその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、及びノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）、ニトリル四級アンモニウム塩、並びにこれらの混合物を含む）、過酸化水素、過酸化水素供給源（無機ペルハイドレート塩、例えば、過ホウ酸、過炭酸、過硫酸、過リン酸又は過ケイ酸のナトリウム塩一水和物又は四水和物を含む）、予形成された親水性及び／又は疎水性の過酸（過カルボン酸及びその塩、過炭酸及びその塩、ペルイミド酸及びその塩、ペルオキシ一硫酸及びその塩からなる群から選択される）、並びにこれらの混合物及び／又は漂白触媒（例えば、イミニウムカチオン及びポリイオンを含むイミン漂白増進剤など、イミニウム双性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾールジオキシド、ペルフルオロイミン、環状糖ケトン及びこれらの混合物、並びに金属含有漂白触媒（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンカチオンと、亜鉛又はアルミニウムなどの補助金属カチオン）が挙げられる）、並びにエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）及びそれらの水溶性塩などの金属イオン封鎖剤を含ませることができる。
組成物は、更に、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される酵素を含めることもできる。
組成物には、香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料アコード、色相剤（hueing agent）、追加のポリマー（布地保全剤（fabric integrity）及びカチオン性ポリマー）、染料固定剤、布地柔軟剤、増白剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、布地付着助剤（fabric deposition aid）、及び／又はシクロデキストリンなどの追加の洗剤原料を更に含ませることができる。
いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、ＬＧ１２プロテアーゼ変異体を有する自動食器洗い機用（ＡＤＷ）洗剤組成物である。ＡＤＷ洗剤組成物は、０〜１０重量％の量で存在する２種以上の非イオン性界面活性剤であって、エトキシル化非イオン性界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシキャップされたポリ（オキシアルキル化）アルコール、又はアミンオキシド界面活性剤から選択されるもの；５〜６０％の範囲のビルダーであって、リン酸塩ビルダー（一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩又はオリゴマー化ポリリン酸塩、好ましくはトリポリリン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ））又はリン酸を含まないビルダー［アミノ酸系化合物、例えばＭＧＤＡ（メチルグリシン二酢酸）及びその塩並びにそれらの誘導体、ＧＬＤＡ（グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸）及びその塩並びにそれらの誘導体、ＩＤＳ（イミノ二コハク酸）及びその塩並びにそれらの誘導体、カルボキシメチルイヌリン及びその塩及びそれらの誘導体並びにこれらの混合物、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニン二酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）及びその塩を含む］のうちいずれかを含むビルダー；約０．５重量％〜約５０重量％の範囲の、ポリカルボン酸のホモポリマー及びコポリマー並びにそれらの部分中和した又は完全中和した塩、カルボン酸モノマー及びポリカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸並びにそれらの塩；約０．１重量％〜約５０重量％の範囲の、スルホン化／カルボキシル化ポリマー（製品に寸法安定性を付与するためのもの）；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の、乾燥補助剤（ポリエステルから選択され、特にアニオン性ポリエステルであって、場合により、重縮合を促す３〜６個の官能基、具体的には酸、アルコール又はエステル官能基を有する更なるモノマーを併せ持つもの、ポリカーボネート−、ポリウレタン−及び／若しくはポリ尿素−ポリオルガノシロキサン化合物又はその反応性環状炭酸エステル及び尿素型の前駆体化合物）；約１重量％〜約２０重量％の範囲のケイ酸塩（ケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム、例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム及び結晶質フィロケイ酸塩など）；無機漂白剤（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩及び過ケイ酸塩などのペルハイドレート塩）及び有機漂白剤（例えば、過酸化ジアシル及びテトラアシル、特に、ジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸（diperoxytetradecanedioc acid）、及びジペルオキシヘキサデカン二酸（diperoxyhexadecanedioc acid）などの有機ペルオキシ酸）；漂白活性剤（即ち、約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の有機過酸前駆物質）；漂白触媒（マンガン−トリアザシクロノナン及び関連する錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＦｅビスピリジルアミン及び関連する錯体、並びにペンタミン酢酸コバルト（ＩＩＩ）及び関連する錯体から選択されるもの）；約０．１重量％〜５重量％の範囲の金属製品ケア剤（ベンゾトリアゾール（benzatriazole）、金属塩及び錯体、及び／又はケイ酸塩）；自動食器洗浄用洗剤組成物１グラム当たり活性酵素約０．０１〜５．０ｍｇの範囲の酵素（プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロラーゼ、アリールエステラーゼ、及びそれらの任意の混合物などから選択されるもの）；並びに酵素安定化剤成分（オリゴ糖、多糖類、及び二価の無機金属塩から選択されるもの）を含ませることができる。
本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを有益に含有する代表的な洗剤処方としては、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３０６３４６０号、第７８〜１５２頁に見られるものが挙げられ、特に、第９４〜１５２頁に見られるものが挙げられる。セリンプロテアーゼは、通常、酵素タンパク質のレベルが、組成物の０．００００１重量％〜１０重量％になるよう、洗剤組成物に組み込まれる。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、組成物の０．０００１重量％超、０．００１重量％超、０．０１重量％超又は０．１重量％超のセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、組成物の１重量％未満、０．１重量％未満、０．０１重量％未満、又は０．００１重量％未満のセリンプロテアーゼを含む。
本発明のクリーニング組成物は、製造者により選択される任意のプロセスにより、任意の好適な形態に処方され、かつ調製され、非限定的な例は、参照によりその全容が本明細書に援用される米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、及び同第５，４８６，３０３号が挙げられる。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される他のいくつかの実施形態では、このような組成物のｐＨは、ＨＣｌなどの酸性材料を添加することで調整される。
本明細書で開示されるクリーニング組成物は、部位のクリーニングにおいて有用である（例えば、表面、物品、食器類又は布地）。典型的には、このような部位の少なくとも一部を、原液又は洗浄液で希釈した本発明のクリーニング組成物と接触させ、そしてその後、場合により、その部位を洗浄及び／又はすすぎ洗いする。本発明の目的に関し、「洗浄」には、擦ること及び機械的撹拌が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、典型的には溶液中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は、典型的には、約５℃〜約９０℃の範囲であり、部位が布地を含む場合、水と布地との質量比は、典型的には、約１：１〜約３０：１である。
クリーニング組成物の製造及び使用方法
本発明のクリーニング組成物は、任意の好適な形態に組成配合されて、配合者により選択された任意の好適なプロセスにより調製される（例えば、米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、同第５，４８６，３０３号、同第４，５１５，７０５号、同第４，５３７，７０６号、同第４，５１５，７０７号、同第４，５５０，８６２号、同第４，５６１，９９８号、同第４，５９７，８９８号、同第４，９６８，４５１号、同第５，５６５，１４５号、同第５，９２９，０２２号、同第６，２９４，５１４号及び同第６，３７６，４４５号を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、錠剤、カプセル、分包剤、パウチ、及び多区画パウチなどの一回用量形状で提供される。いくつかの実施形態では、一回用量形式は、多区画パウチ（又は他の一回用量形式）内の成分を制御放出するよう設計される。好適な一回用量形式及び放出制御形式が、当業界で知られている（例えば、一回用量形式及び放出制御形式ヘの使用に好適な材料については、欧州特許第２ １００ ９４９号、国際公開第０２／１０２９５５号、米国特許出願公開第４，７６５，９１６号及び同第４，９７２，０１７号、並びに国際公開第０４／１１１１７８号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、一回用量形状は、水溶性フィルムで包装された錠剤又は水溶性パウチとして提供される。様々な一回用量形式が欧州特許第２ １００ ９４７号に提示されており、当該技術分野においても既知である。
使用方法
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、表面（例えば、食器類））、洗濯物、硬質表面、コンタクトレンズなどのクリーニングにおける使用が見出される。いくつかの実施形態では、表面の少なくとも一部を、原液又は洗浄液で希釈した本発明のクリーニング組成物の少なくとも一実施形態と接触させ、そしてその後、場合により、表面を洗浄及び／又はすすぎ洗いする。本発明の目的に関し、「洗浄」には、擦ること及び機械的洗浄が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、溶液中約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水であるいくつかの実施形態では、水温は、典型的には約５℃〜約９０℃の範囲である。
本発明は、クリーニングの必要がある物品又は表面（例えば、硬質表面）をクリーニング又は洗浄する方法を提供し、こうした方法としては、これらに限定するものではないが、食器類、食卓用食器類、布地物品、洗濯物物品、パーソナルケア物品等のクリーニング又は洗浄方法、及び硬質若しくは軟質表面（例えば、物品の硬質表面）のクリーニング又は洗浄方法が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明は、クリーニングする必要のある物品、対象物、又は表面をクリーニングするための方法を提供し、方法は、物品又は表面（又はクリーニングされることが所望される物品又は表面の一部）を本発明の少なくとも１種のＬＧ１２プロテアーゼ変異体又は本発明の組成物と、物品、対象物若しくは表面を所望される程度まで洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又はそうするのに好適な及び／又は有効な条件下で接触させることを含む。このような方法のいくつかのものは、物品、物体、又は表面を水ですすぐ工程を更に含む。このような方法のいくつかのものでは、クリーニング組成物は食器洗剤組成物であり、クリーニングされる物品又は物体は食器類又は食卓用食器類である。本明細書で使用するとき、「食器類」は、食品を給仕する際又は食べる際に一般的に使用される物品である。食器類は、これらに限定するものではないが、例えば深皿、平皿、カップ、椀等のようなものであり得る。本明細書で使用するとき、「食卓用食器類」はより広義の用語であり、これらに限定するものではないが、例として深皿、金属食器、ナイフ、フォーク、スプーン、箸、ガラス食器、水差し、ソース入れ、飲用容器、給仕用具等が挙げられる。「食卓用食器類」は食品を給仕する又は食べるための上記又は類似物品のいかなるものも包含することを意図する。このような方法の一部では、クリーニング組成物は、自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品又は物体は、食器又は食卓用食器類である。このような方法のいくつかのものでは、クリーニング組成物は、洗濯洗剤組成物（例えば、粉末洗濯洗剤組成物又は液体洗濯洗剤組成物）であり、クリーニングされる物品は布地物品である。その他のいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は洗濯物前処理用組成物である。
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれ所望によりクリーニング又は洗浄が必要な布地物品をクリーニング又は洗浄する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、布地又は洗濯物洗浄組成物を包含する、プロテアーゼ変異体を含む組成物、及びクリーニングが必要な布地物品又は洗濯物物品を準備する工程と、この布地物品又は洗濯物物品（又はクリーニングが望ましい物品の一部）を、組成物に、布地又は洗濯物物品を望ましい程度までクリーニング又は洗浄するのに十分な又は有効な条件下で接触させる工程と、を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、所望によりクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、硬質表面）をクリーニング又は洗浄するための方法を提供し、方法は、クリーニング又は洗浄される物品又は表面を準備する工程、並びに物品又は表面（又はクリーニング又は洗浄することが所望される物品又は表面の一部）を、本発明の少なくとも１種のＬＧ１２変異体又はこのようなＬＧ１２変異体を少なくとも１種含有する本発明の組成物に、所望される程度まで物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又はそうするのに十分又は有効な条件下で接触させる工程を含む。このような組成物としては、これらに限定するものではないが、例えば、本発明のクリーニング組成物又は洗剤組成物（例えば、食器手洗い用洗剤組成物、食器手洗い用クリーニング組成物、洗濯洗剤又は布地洗剤又は洗濯物若しくは布地クリーニング組成物、液体洗濯洗剤、液体洗濯物クリーニング組成物、粉末洗濯洗剤組成物、粉末洗濯物クリーニング組成物、自動食器洗浄用洗剤組成物、洗濯用補助クリーニング又は洗剤組成物、洗濯物クリーニング添加剤、及び洗濯物シミ抜き前処理用組成物（laundry pre-spotter composition）等）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本方法は、特に追加のクリーニング又は洗浄が望ましい場合に、１回以上繰り返される。例えば、場合によっては、本方法は任意で、その物品又は表面を望ましい程度までクリーニング又は洗浄するのに十分な又は有効な時間にわたって、物品又は表面を少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は組成物に接触させ続ける工程を更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、物品又は表面を水及び／又は別の液体ですすぎ洗いする工程を更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、物品又は表面を少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体又は本発明の組成物と再度接触させる工程と、その物品又は表面を望ましい程度までクリーニング又は洗浄するのに十分な又は有効な時間にわたって、物品又は表面を少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は組成物に接触させ続ける工程と、を更に含む。いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、食器洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器又は食卓用食器類である。本方法のいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器又は食卓用食器類である。本方法のいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は洗濯洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は布地物品である。
本発明はまた、自動食器洗浄機で食卓用食器類又は食器類をクリーニングする方法を提供し、この方法は、自動食器洗浄機を準備する工程、食卓用食器類又は食器類をクリーニングするのに十分な量の、本発明のＬＧ１２変異体を少なくとも１種含有している自動食器洗浄機用組成物又は本発明の組成物を自動食器洗浄機内に（例えば、組成物を適切な又は食器洗浄機内に装備された洗剤区画若しくはディスペンサーに入れることにより）入れる工程と、自動食器洗浄機内に食器類又は食卓用食器類を入れる工程と、食卓用食器類又は食器類がクリーニングされるよう自動食器洗浄機を操作する工程（例えば、製造元による取り扱い説明書に従って）と、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の任意の自動食器洗浄機用組成物を包含し、組成物は、限定するものではないが本明細書で提供されるＬＧ１２変異体を少なくとも１種含む。自動食器洗浄用組成物の使用量は、製造元による取り扱い説明書又は提案に従って容易に決定することができ、本明細書に記載のものを含めて、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含むいかなる形態の自動食器洗浄用組成物（例えば、液体、粉末、固体、ゲル、錠剤等）も使用できる。
本発明は、所望によりクリーニングする必要のある表面、物品又は対象物をクリーニングするための方法も提供し、本方法は、所望される程度まで物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又はそうするのに十分な若しくは有効な条件下で、物品又は表面（又はクリーニングすることが所望される物品又は表面の部分）を、原液若しくは洗浄溶液に希釈した本発明の少なくとも１種のＬＧ１２変異体又は本発明のクリーニング組成物と接触させる工程を含む。必要に応じて、その後、表面、物品、又は対象物を（任意に）洗浄し及び／又はすすいでもよい。本発明の目的に関し、「洗浄」には、例えば擦ること及び機械的撹拌が包含されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、溶液（例えば水溶液）中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水であるとき、水温は、典型的には約５℃〜約９０℃の範囲である。
本発明は、洗濯物又は布地物品を洗濯機でクリーニングする方法も提供し、方法は、洗濯機を準備する工程と、洗濯物又は布地物品をクリーニングするのに十分な量の、本発明のＬＧ１２変異体を少なくとも１種含む洗濯洗剤組成物を（例えば、組成物を洗濯機内の適切な又は備え付けの洗剤区画又はディスペンサーに入れることにより）洗濯機内に入れる工程と、洗濯機内に洗濯物又は布地物品を入れる工程と、及び洗濯物又は布地物品がクリーニングされるように洗濯機を（例えば、製造元の取扱説明書に従って）操作する工程と、を包含する。本発明の方法は、限定するものではないが、本明細書で提供される少なくとも１種の任意のＬＧ１２変異体を含む、本明細書に記載の任意の洗濯物洗浄用洗剤組成物を包含する。洗濯洗剤組成物の使用量は、製造元の取扱説明書又は提案に従って容易に決定することができ、本明細書に記載のものを含めて、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含むいかなる形態の洗濯洗剤組成物（例えば、固体、粉末、液体、錠剤、ゲル等）も使用できる。
動物飼料に使用するための本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチド
本発明の更なる態様では、本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは、ＬＧ−１２系統群のプロテアーゼ及びそれらの変異体を含む動物飼料組成物、動物飼料添加剤、及び／又はペットフードの成分として使用することができる。更に、本発明は、１種類以上の動物飼料材料、及び／又は動物飼料添加物成分、及び／又はペットフード材料に、ＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドを混合することを含む、このような動物飼料組成物、動物飼料添加組成物、及び／又はペットフードの調製方法に関する。更に、本発明は、動物飼料組成物、及び／又は動物飼料添加組成物、及び／又はペットフードの調製における、ＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドの使用に関する。
用語「動物」は、すべての非反芻及び反芻動物を含む。特定の実施形態では、動物は、馬及び単胃動物などの非反芻動物である。単胃動物の例としては、豚及び家畜豚（子豚、育成豚、雌豚など）、鶏（七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏など）、魚（鮭、鱒、テラピア、ナマズ、及び鯉など）、及び甲殻類（海老及び車海老など）が挙げられるがこれらに限定されない。更なる実施形態では、動物は反芻動物であり、畜牛、幼若牛、ヤギ、羊、キリン、バイソン、ヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、リャマ、レイヨウ、エダツノレイヨウ、及びニルガイが挙げられるがこれらに限定されない。
この文脈において、用語「ペットフード」は、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、高級ラット、モルモット、飼育用鳥類（カナリア、インコ、及びオウムなど）、飼育用爬虫類（亀、とかげ、及びヘビなど）、並びに飼育用水生生物（熱帯魚、及び蛙など）であるがこれらに限定されない家庭内飼育用動物のための飼料を意味するものと理解されることが意図される。
用語「動物飼料組成物」、「飼料原料」及び「飼葉」は、互換的に使用され、かつａ）シリアル類、例えば、小粒（例えば、小麦、大麦、ライ麦、オーツ麦、及びこれらの組み合わせ）及び／又はトウモロコシ若しくはソルガムなどの大粒；ｂ）シリアル、例えば、トウモロコシグルテンミール、醸造乾燥粒可溶化物（Distillers Dried Grain Solubles）（ＤＤＧＳ）（特にコーンベースの醸造乾燥粒可溶化物（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、ホイートミドリングス、小麦ショート、米ふすま、もみ殻、オーツ殻、パーム核、及びシトラスパルプからの生成物；ｃ）大豆、ひまわり、落花生、ハウチワマメ、えんどう、そら豆、綿、キャノーラ、魚肉、乾燥結晶タンパク質、肉骨粉、じゃがいもタンパク質、乳清、コプラ，胡麻などの資源から得られたタンパク質；ｄ）植物及び動物資源から得られる油脂；ｅ）ミネラル及びビタミンからなる群から選択される１種以上の試料成分を含ませることができる。
布地の湯通しに使用するための本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチド
本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドを用いて布地を処理する（例えば、布地を湯通しする）組成物及び方法も想到される。布地の処理方法は当該技術分野においてよく知られている（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号を参照されたい）。例えば、布地の感触及び外観は、その布地を溶液中のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼと接触させる工程を含む方法により改善することができる。布地は、圧力下で溶液により処理され得る。
本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼは、織物の製織の間に若しくはその後に、又は糊抜き段階、若しくは１つ以上の追加の布地加工工程の間に、適用することができる。織物の製織の間、織り糸は相当な機械的な歪に曝される。機械式織機での製織前、縦糸は、引張り強度を向上させ、かつ断裂を防止するために、しばしば糊付けデンプン又はデンプン誘導体により被覆される。本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼは、これらの糊付け用デンプン又はデンプン誘導体を取り除くために、製織の間又はその後に適用することができる。製織後にＬＧ−１２系統群のプロテアーゼを使用して、均一かつ耐洗浄効果を確保すべく布地を更に加工する前に、糊付けコーティングを取り除くことができる。
本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼは、単体で使用して、又は他の糊抜き用化学試薬、及び／若しくは糊抜き用酵素と共に、（例えば、水性組成物中の）洗剤添加剤として使用して、綿含有布地などの布地の糊抜きを行ってよい。また、アミラーゼは、インディゴ染色デニム布地及び衣類のストーンウォッシュ加工したような見た目を作り出すための組成物及び方法において使用することもできる。衣服の製造に際し、布地を裁断し、衣服又は衣類に縫製し、その後仕上げることができる。特にデニムジーンズの製造に関し、異なる酵素による仕上げ方法が開発されている。デニム衣類の仕上げは、通常、酵素による湯通し工程により開始され、この間、衣類はタンパク質分解酵素による作用を受け、布地には柔軟性がもたらされ、木綿は以降の酵素による仕上げ工程による作用を受けやすくなる。ＬＧ−１２系統群のプロテアーゼは、デニム衣類の仕上げ方法（例えば、「バイオストーン加工」）、酵素による糊抜き方法及び、布地への柔らかさの付与方法、並びに／又は仕上げ加工にて使用することができる。
製紙用パルプの漂白に使用するための本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチド
本明細書に記載のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは、酵素により補助される製紙パルプ漂白への更なる使用が見出されており、例えば、化学パルプ、セミケミカルパルプ、クラフトパルプ、機械パルプ又は亜硫酸塩法によリ調製されたパルプなどの漂白への更なる使用が見出されている。おおまかに言えば、製紙パルプの漂白に好適な条件下で製紙パルプを本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドとインキュベートする。
いくつかの実施形態では、パルプは無塩素漂白パルプのうち酸素、オゾン、ペルオキシド又はペルオキシ酸漂白されたものである。いくつかの実施形態では、ＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは、改変又はパルプ連続製造法により製造され、低リグニン含量を示すパルプの、酵素による漂白補助に使用される。その他のいくつかの実施形態では、ＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは単独で利用され、又は好ましくはキシラナーゼ及び／又はエンドグルカナーゼ及び／又はα−ガラクトシダーゼ及び／又はセロビオヒドロラーゼ酵素と組み合わせて利用される。
タンパク質分解に使用するための本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチド
本明細書に記載のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは、羽毛、皮膚、毛髪、皮革、及び等価物などの動物由来のタンパク質の酵素による除去及びそれらの分解又は廃棄への使用が更に見出される。いくつかの例では、本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドを含む溶液中に動物の死骸を浸漬することで、従来の熱湯消毒水への浸漬又は抜羽プロセスと比較して皮膚を損傷から保護するよう機能させることができる。一実施形態では、羽毛には、羽毛の消化又は分解の開始に好適な条件下で、本発明の単離したメタロプロテアーゼポリペプチドを噴霧することができる。いくつかの実施形態では、本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼは、上記の通りに酸化剤と組み合わせて使用することができる。
いくつかの実施形態では、原羽毛の油脂の除去は本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドを使用することにより補助される。いくつかの実施形態では、ＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは、羽毛のクリーニング並びに繊維の消毒及び部分的脱水のために組成物に使用される。いくつかの他の実施形態では、ＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは、約０．５％（体積／体積）の界面活性剤を添加して又は添加せずに、９５％エタノール又はその他の極性有機溶媒と組み合わせて利用される。
尚更なる実施形態では、本開示のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは、羽毛由来のタンパク質の回収への使用が見出される。いくつかの実施形態では、回収したタンパク質を、続いて動物又は魚用の飼料に使用することができる。
組織創傷清拭に使用するための本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチド
本明細書に記載のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは、酵素による組織の創傷清拭の補助への使用が更に見出されている。これには、例えば、創傷から、死組織又は損傷組織を除去して治癒を補助することが包含される。
組織培養に使用するための本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチド
本明細書に記載のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドには、組織培養への使用が更に見出される。特に、本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼは、細胞の回収プロセス中などに、細胞培養壁に接着している細胞を懸濁又は再懸濁するのに使用できる。本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼは、培養細胞とディッシュとのタンパク質結合部を切断して、細胞を溶液に懸濁させるのに使用できる。
本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドの食品への応用
本明細書に記載のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドには、食品添加物、消化助剤、又は食品加工助剤としての使用も更に見出される。
皮革加工に使用するための本発明のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチド
本明細書に記載のＬＧ−１２系統群のプロテアーゼポリペプチドは、動物の皮からの毛髪の除去、浸漬、脱脂、又はベーチングによるものなどの、レザーの製造中の非構造タンパク質の分解を包含する、皮革加工への使用が更に見出される。
実験
（実施例１）
アッセイ
以下のアッセイは、以下に記載の実施例に使用した標準アッセイ法である。場合により、特定のプロトコルは、これらの標準アッセイにあてはまらないこともある。この場合、以下のこれらの標準アッセイプロトコルから外れた部分については、実施例中で規定する。
性能指数
酵素の性能指数（ＰＩ）は、同一のタンパク質濃度にて、変異体（測定値）の性能を親酵素（理論値又は測定値）の性能と比較する。親酵素の理論濃度は、親酵素の標準曲線をラングミュア式に当てはめ抽出したパラメーターを利用して算出可能である。１を超える性能指数（ＰＩ）（ＰＩ＞１）は、変異により、親（例えば、配列番号３のＬＧ１２ｓｐｒＣ成熟タンパク質）と比較して性能が向上していることを示し、一方、ＰＩが１の場合（ＰＩ＝１）は、変異体の性能が親と同じであることを示し、ＰＩが１未満である場合（ＰＩ＜１）は、変異体の性能が親よりも劣ることを示す。
タンパク質定量アッセイ
９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）で増殖させた培養物の上清を使用し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を用いタンパク質を定量して、タンパク質の発現レベルを求めた。Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ １２５ ＳＥＣ（Ｗａｔｅｒｓ）分子ふるいカラムを装備したＡｇｉｌｅｎｔ １２００又は１２６０ ＨＰＬＣを使用した。２５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有させた２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用い、カラムからサンプルを溶出させた。２２０ｎｍで吸光度を測定し、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりピークを積分した。精製した野生型タンパク質（ＬＧ１２−系統群のスブチリシン親酵素、配列番号３のｓｐｒＣ）の標準曲線をもとにサンプルのタンパク質濃度を求めた。
プロテアーゼ活性
発色基質Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡの加水分解を測定することにより、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ及びそれらの変異体のプロテアーゼ活性を試験した。次の試薬溶液：使用した試薬溶液は、以下のものであった：０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有している１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．６）（トリス希釈緩衝液）、１０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有している１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．６）（トリス／Ｃａ緩衝液）、並びに１６０ｍＭのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ／ＤＭＳＯ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ保存溶液）（Ｓｉｇｍａ：Ｓ−７３８８）。基質の希釈溶液を調製するために、１ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液を１００ｍＬのＴｒｉｓ／Ｃａ緩衝液に加え、ウェルをよく混合した。１ｍｇ／ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈液を入れたＭＴＰプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ７８１１０１）に酵素サンプルを加え、室温で、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを動態モードで使用して、４０５ｎｍで３分間活性をアッセイした。プロテアーゼ活性は、ｍＯＤ／ｍｉｎ−１で表した。
安定性アッセイのためのサンプル調製の概要
高温下でのインキュベート後に残存している活性を測定し、様々なストレス条件下（下表１に記載の通りの緩衝液および洗剤）での適性について変異体を試験した。高温は、残存活性が約３０％になるよう設定した。希釈した酵素サンプルをストレッサーに混合し、ストレスを加えていないプロテアーゼ活性を測定した。ストレッサーに加えた希釈サンプルを高温でインキュベートし、インキュベート後に、ストレスを加えたプロテアーゼの活性を測定した。
安定性アッセイ条件は下表に掲載する通りのものであり、洗剤は、安定性アッセイに使用する前に不活性化させた。
Figure 0006678108
非ストレス条件に関しては、酵素の活性はＡＡＰＦで直ちにアッセイした（上記を参照のこと）。ストレス条件に関しては、ＰＣＲプレートをシールし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ３８４サーモサイクラーにより５分間高温でインキュベートした後、活性についてアッセイした。
上記の通り、合成基質ＡＡＰＦの加水分解により、ストレス時及び非ストレス時活性を測定した。非ストレス時の活性に対するストレス時の活性の比をとり、１００を乗じて、残存活性（％）を算出した。変異型の残存活性を野生型のもので除算して、適性ＰＩを得た。
洗濯及び自動食器洗浄洗剤におけるクリーニング性能
洗濯物ベースの用途については、ＢＭＩ（綿に血液／牛乳／インクを染みこませたもの）布見本小片（ＥＭＰＡ−１１６）で、及び食器ベースの用途については、卵黄（ポリアクリル布に卵黄を染みこませ、エージングし、カーボンブラック染料で着色したもの）布見本小片（ＰＡＳ−３８）で、変異体のクリーニング性能を野生型ＬＧ１２ｓｐｒＣと比較して試験した。
布見本小片を（ＭＴＰに合うよう）予め切り出し、すすぎ洗いし、プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）に入れたものを、Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ（Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により準備した。布見本小片のプレートに洗剤を充填した後、酵素を添加した。市販の洗剤を熱により失活させて酵素を排除し、表２に記載の通りに添加した。更に、ＧＳＭ−Ｂ及びＧＳＭ−Ｃ ＡＤＷ洗剤の組成を表２．１に示す。
酵素を失活させる際の洗剤処理は以下の通りのものとした。各ＡＤＷ洗剤の錠剤を７００ｍＬ ２１ＧＨ水に溶解させ、溶液を６５℃で３０〜４５分間処理して酵素活性を失活させた。失活させた酵素溶液を、アッセイで使用する前に２１ＧＨ水で１０倍希釈した。
ＨＤＬ洗濯洗剤を９５℃の水浴で１６時間加熱し、失活させた。失活後、ＡＡＰＦ基質を利用してプロテアーゼ活性をアッセイし、完全に失活していることを確認した。最終的なクリーニングアッセイで使用するものの１０倍濃度の溶液を用意し、９５℃で１６時間加熱してＨＤＤ洗濯洗剤を失活させた。失活させた後、ＡＡＰＦ基質を用いプロテアーゼ活性をアッセイした。ＨＤＤ及びＨＤＬ洗剤の両方を１６時間加熱した後、プロテアーゼ活性は示されなかった。ＡＤＷの錠剤と、洗濯用ＨＤＤの１０倍濃度の溶液を調製した。洗濯用ＨＤＬは未希釈のまま扱った。溶液を高温下でインキュベートし、酵素活性を失活させた。失活後、ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質を用いプロテアーゼ活性をアッセイした。
Figure 0006678108
 ＊これらの洗剤のうちｐＨを設定したものについては値を掲載し、ｐＨを設定していないものについてはＮＤと掲載する。
洗剤の供給元：Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｕｌｔｒａ（Ｓｕｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＯＭＯ Ｃｏｌｏｒ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）及びＢｌｕｅ Ｍｏｎｎ（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｂｌｕｅ Ｍｏｏｎ）は、近場のスーパーマーケットで２０１２年に購入した。Ｆｉｎｉｓｈ Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ）、Ｆｉｎｉｓｈ Ｑｕａｎｔｕｍ（Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ）、及びＳＵＮ Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）洗剤の錠剤は、２０１２年１２月に近場のスーパーマーケットで購入した。
Figure 0006678108
洗剤を充填した布見本小片プレートに、洗濯アッセイの最終用量２００μＬに達するよう酵素のアリコートを加え、酵素の最終濃度５〜０．５ｐｐｍを得た。ＨＤＬ又はＨＤＤ処方による洗濯クリーニングアッセイを２５℃で１５〜２０分間実施し、一方、自動食器洗浄（ＡＤＷ）アッセイは４０℃で３０分間実施した。
インキュベート後、１００μＬの上清を新しいＭＴＰ（Ｃｏｓｔａｒ ９０１７）に移しＥＭＰＡ−１１６布見本小片については６００ｎｍ、又はＰＡＳ−３８布見本小片については４０５ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用い吸光度を読み取った。各サンプルの値からブランク対照（酵素不含有）の値を減算することで吸光度を得た。所与の変異体の吸光度を、同濃度であると推定される野生型の吸光度で除算することにより各アッセイ条件について、クリーニングＰＩを得た。ラングミュア式による親酵素の標準曲線に代入して野生型の濃度を求めた。
（実施例２）
バチルス種（Bacillus sp）ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼの部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）の作製
バチルス・スブチリス（B. subtilis）ａｐｒＥプロモーター、ハイブリッドａｐｒＥ−ＢＰＮ’のシグナルペプチド、ハイブリッドＢＰＮ’−ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのプロペプチド、成熟ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ及びＢＰＮ’ターミネーターから構成される発現カセットを使用して、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼをバチルス・スブチリス（B. subtilis）で産生させた。このカセットを、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＨＹＴ複製シャトルベクターにクローニングした。ＢｓｔＥＩＩ及びＥｃｏＲＩ認識部位を使用して、テトラサイクリン耐性遺伝子の後ろに転写終結部位を付加し、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）からｐＨＹＴベクターを誘導した（配列番号２１、転写終結配列、ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＧＣＴＣＧＧＴＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＧＡＡＴＴＣ）。ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ認識部位にクローニングされているリンカーを利用して、ｐＨＹ３００ＰＬＫのＨｉｎｄＩＩＩ認識部位も除去した（配列番号２２、新しいリンカー配列、ＧＧＡＴＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴ）。
ＬＧ１２ｓｐｒＣ遺伝子（ｐＨＹＴ−ＬＧ１２）を含有しているｐＨＹＴベクターのマップを図１に示す。プラスミドｐＨＹＴ−ＬＧ１２ｓｐｒＣによりＴｏｐ１０大腸菌（E. coli）コンピテントセルに形質転換し、形質転換した細胞を、５０ｐｐｍカルベニシリンを添加したＬＧ寒天プレートに播種した。３７℃で一晩インキュベート後、５０ｐｐｍカルベニシリンを添加した５ｍＬルリアブロスで培養物を準備し、振盪させながら３７℃で一晩生育させた。１日後、培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。確認のため、操作した領域にわたってプラスミドＤＮＡの配列決定を行い、次に、正しい配列を有するプラスミドを使用してバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）細胞を形質転換した。形質転換した細胞を、１０ｐｐｍテトラサイクリンを添加し、１．６％スキムミルクを含有させたＬＢ寒天プレートに播種した。
ＬＧ１２ｓｐｒＣ成熟型セリンプロテアーゼ［Ｂ．Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ １９９５，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６１：４４９０〜４４９３］の２７５部位のそれぞれについて部位ライブラリを作製した。
変異体は、ＬＧ１２ｓｐｒＣ変異体配列をコードしている発現プラスミドを含有する、形質転換したバチルス・スブチリス（B. subtilis）細胞から構成された。変異体を９６ウェルプレートに整列させ、１ウェルに付き１変異体を配置した。ＬＧ１２ｓｐｒＣ置換変異体を含有するＢ・スブチリス（B. subtilis）形質転換体を、１２．５ｐｐｍテトラサイクリンを添加したトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）を入れた９６ウェルプレートで一晩生育させ、この予備培養物から１０μＬを、２５ｐｐｍテトラサイクリンを添加した３４０μＬの培養培地（下記）を入れた角型ウェルのＭＴＰ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）に添加した。３２℃、湿度８０％で、３００ｒｐｍの定速回転で混合させながら、このプレートを２日間インキュベートした。２５００ｒｐｍで１０分間遠心沈降させて細胞を回収し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ真空システムを利用してＭｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンフィルタープレートにより濾過した。培養上清をアッセイに使用した。培養培地は、主要な窒素源として尿素を富化させ、主要な炭素源としてグルコースを富化させ、ロバストな細胞増殖のため１％ソイトンを添加したＭＯＰｓ緩衝剤系の半合成培地とした。図２には、プラスミドｐＨＹＴ−ＬＧ１２にコードされるＬＧ１２ｓｐｒＣタンパク質前駆体の配列を提示する。シグナルペプチド（シグナルペプチド：ＡｐｒＥの７番目のアミノ酸（Ｔｒｐ）をＢＰＮ’の８番目のアミノ酸（Ｉｌｅ）と融合させたもの）には下線を付し（バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来の配列は小文字で示し、プロペプチド：ＢＰＮ’の９番目のアミノ酸（Ｌｙｓ）をＬＧ１２の１３番目のアミノ酸（Ｔｙｒ）に融合させたもの、のバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）由来の配列はイタリック体で示し、ＬＧ１２配列は通常のテキストで示す）、プロペプチド配列にはハイライトし、成熟ＬＧ１２配列はボールド体で示す。
ＬＧ１２ｓｐｒＣ遺伝子をコードする翻訳領域、及びＮ末端シグナル、及びｐＨＹＴ−ＬＧ１２プラスミドでの発現に使用されるプロペプチド領域のヌクレオチド配列を以下に示す。
配列番号１には、プラスミドｐＨＹＴ−ＬＧ１２にコードされる通り、ＬＧ１２ｓｐｒＣタンパク質の前駆体をコードするヌクレオチド配列を示す。
Figure 0006678108
配列番号２には、成熟ＬＧ１２ｓｐｒＣタンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す（８２５ヌクレオチド）。
ＧＣＴＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＣＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＡＣＧＴＡＡＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＣＧＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＧＴＴＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＡＴＧＣＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＣＴＴＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＡＣＧＴＴＡＡＧＴＧＧＴＡＴＴＧＣＴＣＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＧＴＧＧＴＣＧＡＴＣＴＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＧＴＧＴＡＡＴＡＡＴＧＣＴＴＡＴＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＣＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＡＴＣＧＧＡＡＴＡＣＧＡＴＧＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＡＧＣＴＣＴＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＴＡＧＴＡＧＣＡＡＴＡＡＴＡＣＴＣＧＴＧＣＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＡＣＡＴＴＴＴＧＡＧＣＡＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＣＧＡＡＡＴＡＣＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＧＧＴＧＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＴＡＣＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＡＧ
配列番号３には、成熟ＬＧ１２ｓｐｒＣタンパク質のアミノ酸配列を示す（２７５アミノ酸）。
ＡＱＴＶＰＷＧＩＰＨＩＫＡＤＫＡＨＡＡＧＶＴＧＳＧＶＫＶＡＩＬＤＴＧＩＤＡＮＨＡＤＬＮＶＫＧＧＡＳＦＶＳＧＥＰＮＡＬＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＴＴＧＶＬＧＶＡＹＮＡＤＬＹＡＶＫＶＬＳＡＳＧＳＧＴＬＳＧＩＡＱＧＩＥＷＳＩＳＮＧＭＮＶＩＮＭＳＬＧＧＳＳＧＳＴＡＬＱＱＡＣＮＮＡＹＮＲＧＩＶＶＩＡＡＡＧＮＳＧＳＳＧＮＲＮＴＭＧＹＰＡＲＹＳＳＶＩＡＶＧＡＶＳＳＮＮＴＲＡＳＦＳＳＶＧＳＥＬＥＶＭＡＰＧＶＮＩＬＳＴＴＰＧＮＮＹＡＳＦＮＧＴＳＭＡＡＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＫＡＫＹＰＳＭＴＮＶＱＩＲＥＲＬＫＮＴＡＴＮＬＧＤＰＦＦＹＧＫＧＶＩＮＶＥＳＡＬＱ
配列番号４には、完全長のＬＧ１２ｓｐｒＣタンパク質のアミノ酸配列を示す（シグナル配列には下線を引き、プロペプチドはイタリック体で示し、３残基付加ＡＧＫはボールド体で示し、成熟ＬＧ１２配列は通常のフォントで示す）。
Figure 0006678108
（実施例３）
生産的位置及び組み合わせ可能な変異
生産的位置は、改善された特徴を示すコンビナトリアル変異体を製造するのに最も有用な分子内位置として記載され、この位置では、少なくとも１種の組み合わせ可能な変異が生じ得る。組み合わせ可能な変異は、コンビナトリアルな変異体を作製するのに使用することのできる、これらの分子内の置換として記載され得る。組み合わせ可能な変異は、この分子の所望の特性のうち少なくとも１種を改善するが、発現、活性、又は安定性のいずれかを有意に低下させないものである。
組み合わせ可能な変異は、この分子の所望の特性のうち少なくとも１種を改善するが、発現、活性、又は安定性のいずれかを有意に低下させないものである。実施例１及び以下に記載のアッセイから得られる性能指数（ＰＩ）の値を利用し、ＬＧ１２ ｓｐｒＣにおいて組み合わせ可能な変異を決定した。
タンパク質の定量（発現）を実施例１に示す。
プロテアーゼ活性（ＡＡＰＦアッセイ）を実施例１に示す。
次の洗剤におけるクリーニング活性：Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｕｌｔｒａ ＨＤＤ（ｐＨ１０．６）、ＯＭＯ Ｃｏｌｏｒ ＨＤＤ（ｐＨ１０．６）、ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ（ｐＨ８．２）、Ｂｌｕｅ Ｍｏｏｎ ＨＤＬ（ｐＨ６．５）、ＧＳＭ−Ｂ、ＧＳＭ−Ｂ（ｐＨ９）、ＧＳＭ−Ｃ、Ｓｕｎ Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ、Ｆｉｎｉｓｈ Ｑｕａｎｔｕｍ ｔａｂｌｅｔ。
次の洗剤及び緩衝液における安定性アッセイ：ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ［ｐＨ８．２、５１℃］、ＧＳＭ−Ｂ［６８．５℃］、ＧＳＭ−Ｃ［６２℃］、ＬＡＳ−ＥＤＴＡ緩衝液［５２℃］、Ｔｒｉｓ ＥＤＴＡ緩衝液［５１℃］、Ｔｒｉｓ−カルシウム緩衝液［７２．５℃］。
組み合わせ可能な変異は、以降の基準に従って分類する：
発現、プロテアーゼ活性、１つ以上のクリーニング活性アッセイでの活性、並びに１つ以上の安定性アッセイについて、変異体の最小性能指数（ＰＩ）が、親ＬＧ１２ｓｐｒＣのものと比較して、０．９以上であり、更には、これらの試験のうちのいずれか１つについて、ＰＩが１．０以上である（Ａ群）。
発現、プロテアーゼ活性、１つ以上のクリーニング活性アッセイでの活性、並びに１つ以上の安定性アッセイについて、変異体の最小性能指数（ＰＩ）が、親ＬＧ１２ｓｐｒＣのものと比較して、０．８以上であり、更には、これらの試験のうちのいずれか１つについて、ＰＩが１．２以上である（Ｂ群）。
発現、プロテアーゼ活性、１つ以上のクリーニング活性アッセイでの活性、並びに１つ以上の安定性アッセイについて、変異体の最小性能指数（ＰＩ）が、親ＬＧ１２ｓｐｒＣのものと比較して、０．５以上であり、更には、これらの試験のうちのいずれか１つについて、ＰＩが１．５以上である（Ｃ群）。
組み合わせ可能な変異について、特性を表３に要約する。
Figure 0006678108
第Ａ、Ｂ及びＣ群には、更に、複数の置換に関する寛容度が異なるアミノ酸位置が含まれている。生産的位置を同定するために、各位置で許容される置換の程度を測定して、各位置に生産性スコアを割り当てた。生産性スコアは、以降の基準を利用して、各位置の置換のうち、第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまるものの割合により割り当てた。
生産的位置は、複数の置換に対してある程度の寛容度を示し、なおかつ以降に示す通りの組み合わせ可能性に関する基準の組を満たす位置と定義される。
生産的位置の生産性スコアを決定するための基準は次の通りである。
所定の位置での置換の１５％未満が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、生産性スコア「１」が割り当てられる。
所定の位置での置換の１５％以上３０％未満が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、生産性スコア「２」が割り当てられる。
所定の位置での置換の３０％以上５０％未満が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、生産性スコア「３」が割り当てられる。
所定の位置での置換の５０％以上が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、生産性スコア「４」が割り当てられる。
生産性スコアが「１」の位置を以下に掲載する：
４、７、８、１２、１４、１６、１７、２９、３３、４２、４６、５１、５６、６５、６９、７３、８１、８３、８４、８８、９４、１０４、１０９、１１１、１１４、１２０、１２２、１２５、１２８、１３２、１３８、１４１、１４３、１４６、１５１、１６３、１６５、１６７、１７５、１７６、１９５、２０３、２０４、２０５、２０６、２１１、２１２、２１５、２２０、２２４、２２７、２３０、２３２、２３８、２５０、２６０、２６２、２６８、２７３、及び２７４。
生産性スコアが「２」の位置を以下に掲載する：
１、３、１８、１９、２０、２２、２４、２５、２６、２８、３０、３１、４４、５０、５３、５５、５７、５８、６１、６７、７２、７６、７７、７９、８０、８５、８６、８７、８９、９０、９１、９３、９６、１００、１０１、１０２、１０６、１０７、１０８、１１３、１１６、１２１、１２４、１２６、１２７、１３６、１３７、１４０、１４４、１４７、１５０、１５２、１５３、１６０、１６２、１７０、１７２、１７３、１８３、１８５、１８７、１８８、１９４、２１３、２１６、２１７、２１８、２２２、２２５、２２８、２３１、２３４、２３５、２４１、２４３、２４４、２４６、２５２、２５５、２６５、及び２７２。
生産性スコアが「３」の位置を以下に掲載する：
２、９、１５、３８、４５、４８、５２、５９、６２、７５、９７、９９、１０３、１１７、１１８、１１９、１２３、１２９、１３３、１４５、１４８、１４９、１５６、１５９、１６１、１８１、２０９、２３６、２４０、２４８、２５６、２６７、２７１、及び２７５。
生産性スコアが「４」の位置を以下に掲載する：
２７、４０、４３、７８、９８、１３０、１３１、１５８、１６６、１８２、２３７、２３９、２４２、２４５、及び２５１。
実施例１に記載のアッセイから得られる性能指数（ＰＩ）の値を利用し、ＬＧ１２ｓｐｒＣにおいて組み合わせ可能な変異を決定した。次の洗剤［Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｕｌｔｒａ ＨＤＤ（ｐＨ１０．６）、ＯＭＯ Ｃｏｌｏｒ ＨＤＤ（ｐＨ１０．６）、ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ（ｐＨ８．２）、Ｂｌｕｅ Ｍｏｏｎ ＨＤＬ（ｐＨ６．５）、ＧＳＭ−Ｂ、ＧＳＭ−Ｂ（ｐＨ９）、ＧＳＭ−Ｃ、Ｓｕｎ Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ、及びＦｉｎｉｓｈ Ｑｕａｎｔｕｍ ｔａｂｌｅｔ］におけるタンパク質の定量（発現）、ＡＡＰＦ活性、クリーニング活性、並びに次の洗剤及び緩衝液［ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ洗剤（ｐＨ８．２）、ＧＳＭ−Ｂ洗剤、ＧＳＭ−Ｃ洗剤、ＬＡＳ−ＥＤＴＡ緩衝液、Ｔｒｉｓ ＥＤＴＡ緩衝液、及びＴｒｉｓ−カルシウム緩衝液（７２．５℃）］における安定性アッセイ。
組み合わせ可能な変異を、実施例４に記載の基準に照らして第Ａ、Ｂ又はＣ群に割り当てた。これらの置換に、更に、置換が出現する群（第Ａ、Ｂ、Ｃ群）に基づいて適性スコアを割り当てるが、適性スコアは大きいほど、コンビナトリアル変異体を製造する際の使用に一層適した置換を表す。適性スコアを表４に規定する。上記基準に該当する、ＬＧ１２ ｓｐｒＣの各置換の適性スコアを表４に報告する。
Figure 0006678108
Figure 0006678108
Figure 0006678108
Figure 0006678108
Figure 0006678108
ＬＧ１２−系統群のスブチリシン変異体の特定のクリーニング用途についての有効性評価
以下の通りの異なるアッセイ条件下での性能に基づき、ＳＥＬ変異体を更に様々に分類した。この解析に関し、ＨＰＬＣ ＰＩ値が０．７５未満のＳＥＬ変異体は除外した。更に、各解析に関し、対応するＣＶ値が０未満又は１００超である場合にはＰＩ値を考慮しなかった。
各性能分類について最良の変位を得るため、ＨＰＬＣ（タンパク質の相対的な発現）のＰＩ値に加え、次の測定結果も考慮に入れた：
１）Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｕｌｔｒａ ＨＤＤ（ｐＨ１０．６）、又はＯＭＯ Ｃｏｌｏｒ ＨＤＤ（ｐＨ１０．６）において、ＨＤＤのＰＩ値が１．０１以上である。
２）ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ（ｐＨ８．２）において、ＨＤＬ（ｐＨ８）のＰＩ値が１．０１以上である。
３）Ｂｌｕｅ Ｍｏｏｎ（ｐＨ６．５）において、ＨＤＬ（ｐＨ６）のＰＩ値が１．０１以上である。
４）洗濯洗剤及び緩衝液、５１℃のＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ ＨＤＬ（ｐＨ８．２）又は５２℃のＬＡＳ−ＥＤＴＡ緩衝液において、洗濯安定性のＰＩ値が１．０１以上である。
５）洗剤、ＧＳＭ−Ｂ、ＧＳＭ−Ｂ（ｐＨ９）、ＧＳＭ−Ｃ、Ｓｕｎ Ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ、又はＦｉｎｉｓｈ Ｑｕａｎｔｕｍ ｔａｂｌｅｔにおいて、ＡＤＷのＰＩ値が１．０１以上である。
６）洗剤及び緩衝液、６８．５℃のＧＳＭ−Ｂ、６２℃のＧＳＭ−Ｃ、５１℃のＴｒｉｓ ＥＤＴＡ緩衝液、７２．５℃のＴｒｉｓ−カルシウム緩衝液において、ＡＤＷ安定性のＰＩ値が１．０１以上である。
各分類の基準：表７に掲載する通りの個別分類に関しＰＩ＞１．０１であり、かつ発現のＰＩ＞０．７５である。
洗濯安定性において最も有効な変異一覧
Ａ０２９Ｔ、Ｉ０３０Ａ、Ｉ０３０Ｖ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｒ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｖ、Ａ０４０Ｗ、Ａ０４０Ｙ、Ｓ１０１Ｒ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｇ、Ｔ１０３Ｋ、Ｔ１０３Ｒ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｒ、Ｎ１８３Ｅ、Ｖ０９３Ｔ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｄ、Ｌ１２６Ｇ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｌ１２６Ｑ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２５Ｇ、Ｓ１２９Ａ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１２９Ｋ、Ｓ１２９Ｑ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｆ、Ｓ１３０Ｈ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、Ｓ１３０Ｗ、Ｓ１３０Ｙ、Ｇ１３１Ｄ、Ｇ１３１Ｅ、Ｇ１３１Ｒ、Ｑ１３７Ｅ、Ｓ０９９Ｋ、Ｇ１０２Ｅ、Ｇ１０２Ｆ、Ｇ１０２Ｙ、Ｉ１０７Ｈ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｖ１２１Ｇ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ａ２２４Ｐ、Ａ２２４Ｓ、Ｋ０１５Ｖ、Ｐ２２５Ｇ、Ｔ１８５Ｑ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３６Ｒ、Ｑ１３６Ｗ、Ｎ１６３Ｄ、Ｅ２４８Ｃ、Ｅ２４８Ｄ、Ａ０１９Ｍ、Ｔ０２２Ｄ、Ｔ０２２Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｌ０９０Ｐ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｇ１００Ｆ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｎ、Ｖ１４８Ｓ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｉ２４６Ｎ、Ｎ２４３Ｇ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｆ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｅ、Ｑ２７５Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｙ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｋ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｓ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｙ０９１Ｈ、Ｙ０９１Ｎ、Ｍ２４１Ｑ、Ｍ２４１Ｓ、Ｍ２４１Ｗ、Ｖ２４４Ｙ、Ｎ２５２Ｅ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｒ、Ｆ０５０Ｙ、Ｖ０５１Ｉ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｓ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｌ０７５Ｇ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ１６６Ｙ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｑ、Ｇ０５３Ｒ、Ｙ１４３Ｄ、Ｙ１４３Ｅ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｈ、Ｓ１８１Ｎ、Ｓ１８１Ｑ、Ｇ１５４Ｆ、Ｇ１５４Ｈ、Ｇ１５４Ｉ、Ｇ１５４Ｋ、Ｇ１５４Ｔ、Ｓ１９４Ｋ、Ｓ１９４Ｐ、Ｓ１９４Ｒ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｙ１７１Ｇ、Ｙ１７１Ｑ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｋ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｔ２５５Ｄ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｗ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｍ、Ｔ１３３Ｎ、Ｔ１３３Ｖ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｎ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｓ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ１５２Ｐ、Ａ１５２Ｖ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｄ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｍ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｗ、Ｆ２１７Ｒ、Ｔ２２０Ｇ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｇ１２８Ｎ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｔ２０９Ｙ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｓ２４０Ｐ、Ｓ２４０Ｑ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｌ０９６Ｅ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｌ０９６Ｒ、Ｌ０９６Ｙ、Ｓ１１６Ｅ、Ｖ０８１Ｍ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｋ２３５Ｆ、Ｋ２３５Ｇ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｒ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ｍ２２２Ａ、Ｍ２２２Ｈ、及びＭ２２２Ｑ
ＨＤＬ（ｐＨ６）性能において最も有効な変異一覧
Ｉ０３０Ａ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｙ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｎ、Ｎ１８３Ｅ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｍ１２４Ｓ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｖ１２１Ｇ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ａ２２４Ｓ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｔ０２２Ｄ、Ｔ０２２Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｌ０９０Ｐ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｉ２４６Ｎ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｆ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｅ、Ｑ２７５Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｑ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｙ０９１Ｈ、Ｍ２４１Ｓ、Ｍ２４１Ｗ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｑ、Ｔ０７９Ｌ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｙ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｙ１４３Ｄ、Ｙ１４３Ｅ、Ｓ１８１Ｈ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｔ２５５Ｄ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｎ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｄ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｍ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｌ０９６Ｅ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、及びＶ２６７Ｓ
ＨＤＬ（ｐＨ８）性能において最も有効な変異一覧
Ａ０２９Ｇ、Ａ０２９Ｔ、Ｔ０３３Ｎ、Ｔ０３３Ｖ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ｇ０６５Ａ、Ａ０６９Ｇ、Ｋ０９４Ａ、Ｋ０９４Ｄ、Ｋ０９４Ｅ、Ｋ０９４Ｈ、Ｋ０９４Ｌ、Ｋ０９４Ｍ、Ｋ０９４Ｎ、Ｋ０９４Ｓ、Ｋ０９４Ｔ、Ｖ０９５Ａ、Ｖ０９５Ｓ、Ｇ１１０Ｓ、Ｉ１１１Ｍ、Ｙ０８６Ｄ、Ｙ０８６Ｅ、Ｙ０８６Ｉ、Ｙ０８６Ｐ、Ｙ０８６Ｓ、Ｙ０８６Ｔ、Ｓ１０１Ａ、Ｔ１０３Ａ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｎ、Ｌ１０４Ｉ、Ｌ１０４Ｔ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｇ、Ｓ０５２Ｈ、Ｓ０５２Ｌ、Ｌ０５８Ｖ、Ｎ１８３Ｅ、Ｇ０８３Ａ、Ｖ０８４Ｅ、Ｖ０９３Ｉ、Ｌ０３１Ａ、Ｌ０３１Ｅ、Ｌ０３１Ｎ、Ｌ０３１Ｑ、Ｇ０３４Ａ、Ｇ０３４Ｅ、Ａ０３７Ｄ、Ａ０３７Ｅ、Ａ０３７Ｆ、Ａ０３７Ｈ、Ａ０３７Ｌ、Ａ０３７Ｍ、Ａ０３７Ｎ、Ａ０３７Ｑ、Ａ０３７Ｔ、Ａ０３７Ｗ、Ｖ０６８Ｄ、Ｖ０６８Ｑ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｑ、Ｍ１１９Ａ、Ｍ１１９Ｆ、Ｍ１１９Ｈ、Ｍ１１９Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｎ１２３Ａ、Ｎ１２３Ｄ、Ｎ１２３Ｅ、Ｎ１２３Ｇ、Ｎ１２３Ｈ、Ｎ１２３Ｉ、Ｎ１２３Ｑ、Ａ１８７Ｄ、Ａ１８７Ｈ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ０６２Ｋ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｐ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｐ、Ｑ１３７Ｅ、Ｎ１４４Ｍ、Ｓ０９７Ｇ、Ｓ０９７Ｈ、Ｓ０９７Ｉ、Ｓ０９７Ｌ、Ｓ０９７Ｍ、Ｓ０９７Ｙ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｐ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｈ、Ａ００１Ｌ、Ｔ００３Ｅ、Ｖ００４Ｅ、Ｄ０１４Ｅ、Ｅ１９７Ｄ、Ｌ２０６Ｙ、Ｉ０１１Ａ、Ｉ０１１Ｓ、Ｉ０１１Ｔ、Ａ０１３Ｓ、Ｋ０１５Ｈ、Ｋ０１５Ｍ、Ｋ０１５Ｎ、Ｋ０１５Ｐ、Ｋ０１５Ｑ、Ｋ０１５Ｓ、Ｋ０１５Ｔ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０１５Ｙ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｐ００５Ｄ、Ｐ００５Ｔ、Ｋ０２７Ｄ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｇ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｎ、Ｋ０２７Ｑ、Ｋ０２７Ｔ、Ｋ０２７Ｙ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｓ０４９Ａ、Ｓ０４９Ｄ、Ｓ０４９Ｅ、Ｓ０４９Ｇ、Ｓ０４９Ｈ、Ｓ０４９Ｉ、Ｓ０４９Ｋ、Ｓ０４９Ｎ、Ｓ０４９Ｑ、Ｓ０４９Ｔ、Ｓ０４９Ｖ、Ｓ０４９Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｎ１６３Ｅ、Ｇ２１１Ｄ、Ｇ２１１Ｑ、Ｇ２１１Ｔ、Ｗ００６Ａ、Ｗ００６Ｄ、Ｗ００６Ｈ、Ｗ００６Ｌ、Ｗ００６Ｍ、Ｗ００６Ｎ、Ｗ００６Ｐ、Ｗ００６Ｑ、Ｗ００６Ｓ、Ａ０１９Ｋ、Ａ０１９Ｗ、Ｔ０２２Ｇ、Ｔ０２２Ｌ、Ｇ０６１Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ１５８Ｈ、Ｓ１５８Ｑ、Ｌ０９０Ｅ、Ｌ０９０Ｇ、Ｌ０９０Ｎ、Ｌ０９０Ｑ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ａ、Ｖ１４８Ｄ、Ｖ１４８Ｅ、Ｖ１４８Ｆ、Ｖ１４８Ｇ、Ｖ１４８Ｌ、Ｖ１４８Ｑ、Ｔ１６４Ｄ、Ｔ１６４Ｅ、Ｎ１８４Ａ、Ｎ１８４Ｈ、Ｆ１８９Ａ、Ｆ１８９Ｄ、Ｆ１８９Ｅ、Ｆ１８９Ｉ、Ｆ１８９Ｌ、Ｆ１８９Ｓ、Ｆ１８９Ｖ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｐ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｉ２４６Ａ、Ｉ２４６Ｃ、Ｌ２７４Ｄ、Ｌ２７４Ｅ、Ｌ２７４Ｇ、Ｎ２４３Ｄ、Ｈ０１７Ｉ、Ｖ０２１Ｄ、Ｌ２５７Ｃ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｉ、Ｓ０２４Ｇ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｌ、Ｑ２７５Ｔ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｌ、Ｅ０５４Ｆ、Ｅ０５４Ｇ、Ｅ０５４Ｈ、Ｅ０５４Ｉ、Ｅ０５４Ｌ、Ｅ０５４Ｍ、Ｅ０５４Ｎ、Ｅ０５４Ｐ、Ｅ０５４Ｒ、Ｅ０５４Ｔ、Ｅ０５４Ｖ、Ｅ０５４Ｗ、Ａ０７３Ｉ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｆ、Ｎ０８７Ｈ、Ｎ０８７Ｐ、Ｎ０８７Ｑ、Ｎ０８７Ｓ、Ａ０８８Ｄ、Ａ０８８Ｇ、Ａ０８８Ｎ、Ａ０８８Ｐ、Ａ０８８Ｑ、Ｄ０８９Ｆ、Ｄ０８９Ｋ、Ｄ０８９Ｌ、Ｙ０９１Ｔ、Ｙ０９１Ｖ、Ｙ０９１Ｗ、Ｇ０２０Ｅ、Ｇ０２０Ｈ、Ｇ０２０Ｌ、Ｇ０２０Ｖ、Ｇ０２０Ｙ、Ｇ０４６Ｅ、Ｇ０４６Ｌ、Ｇ０４６Ｍ、Ｎ２５２Ｅ、Ｎ２５２Ｆ、Ｎ２５２Ｉ、Ｎ２５２Ｌ、Ｎ２５２Ｑ、Ｎ２５２Ｓ、Ｆ２６１Ｙ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｖ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｓ２７２Ｖ、Ｎ０５６Ａ、Ｎ０５６Ｅ、Ｎ０５６Ｈ、Ｎ０５６Ｉ、Ｎ０５６Ｌ、Ｎ０５６Ｍ、Ｎ０５６Ｑ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０５６Ｖ、Ａ０７４Ｇ、Ｎ０７７Ｄ、Ｎ０７７Ｇ、Ｎ０７７Ｐ、Ｔ２０８Ａ、Ａ２３１Ｆ、Ａ２３１Ｌ、Ａ０１８Ｆ、Ａ０１８Ｋ、Ａ０１８Ｌ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１８Ｐ、Ａ０１８Ｑ、Ａ０１８Ｓ、Ａ０１８Ｔ、Ａ０１８Ｖ、Ａ０１８Ｗ、Ａ０１８Ｙ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｈ、Ｎ０３８Ｉ、Ｎ０３８Ｋ、Ｎ０３８Ｐ、Ｎ０３８Ｑ、Ｎ０３８Ｔ、Ｎ０３８Ｙ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｅ２７１Ａ、Ｅ２７１Ｄ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｍ、Ｅ２７１Ｗ、Ｆ０５０Ｉ、Ｆ０５０Ｓ、Ｆ０５０Ｙ、Ｖ０５１Ｄ、Ｖ０５１Ｅ、Ｖ０５１Ｆ、Ｖ０５１Ｇ、Ｖ０５１Ｋ、Ｖ０５１Ｌ、Ｖ０５１Ｍ、Ｖ０５１Ｎ、Ｖ０５１Ｐ、Ｖ０５１Ｑ、Ｖ０５１Ｒ、Ｖ０５１Ｔ、Ｖ０５１Ｗ、Ｖ０５１Ｙ、Ａ０５７Ｃ、Ａ０５７Ｄ、Ａ０５７Ｅ、Ａ０５７Ｉ、Ａ０５７Ｋ、Ａ０５７Ｌ、Ａ０５７Ｍ、Ａ０５７Ｎ、Ａ０５７Ｑ、Ａ０５７Ｒ、Ａ０５７Ｓ、Ａ０５７Ｔ、Ａ０５７Ｖ、Ａ０５７Ｙ、Ｌ０７５Ａ、Ｌ０７５Ｄ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｎ、Ｌ０７５Ｑ、Ｌ０７５Ｓ、Ｌ０７５Ｔ、Ｌ０７５Ｖ、Ｌ０７５Ｗ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｉ１７５Ａ、Ｉ１７５Ｆ、Ｉ１７５Ｑ、Ｉ１７５Ｓ、Ｉ１７５Ｔ、Ｉ１７５Ｖ、Ｇ０５３Ａ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｉ、Ｇ０５３Ｌ、Ｇ０５３Ｐ、Ｐ０５５Ａ、Ｐ０５５Ｇ、Ｐ０５５Ｍ、Ｐ０５５Ｗ、Ｐ０５５Ｙ、Ｓ１９４Ｇ、Ａ２３２Ｈ、Ａ２３２Ｉ、Ａ２３２Ｎ、Ａ２３２Ｑ、Ａ２３２Ｓ、Ａ２３２Ｔ、Ｉ２３４Ｍ、Ｉ２３４Ｎ、Ｉ２３４Ｓ、Ｉ２３４Ｔ、Ｉ２３４Ｖ、Ｉ２３４Ｗ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｄ、Ｋ２３７Ｆ、Ｋ２３７Ｌ、Ｋ２３７Ｍ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｔ、Ｋ２３７Ｖ、Ｋ２３７Ｗ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ａ２１５Ｍ、Ｖ２０３Ａ、Ｖ２０３Ｄ、Ｖ２０３Ｅ、Ｖ２０３Ｇ、Ｖ２０３Ｉ、Ｖ２０３Ｌ、Ｌ２３３Ｇ、Ｌ２３３Ｈ、Ｌ２３３Ｎ、Ｌ２３３Ｔ、Ｌ２５０Ｉ、Ｋ０１２Ｄ、Ｋ０１２Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０１２Ｈ、Ｋ０１２Ｌ、Ｋ０１２Ｍ、Ｋ０１２Ｔ、Ｋ０１２Ｙ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｄ、Ｖ０７２Ｅ、Ｖ０７２Ｆ、Ｖ０７２Ｇ、Ｖ０７２Ｉ、Ｖ０７２Ｔ、Ｙ１６７Ｄ、Ｙ１６７Ｅ、Ｙ１６７Ｆ、Ｙ１６７Ｐ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１７２Ｎ、Ｙ２３８Ａ、Ｙ２３８Ｃ、Ｙ２３８Ｅ、Ｙ２３８Ｆ、Ｙ２３８Ｇ、Ｙ２３８Ｓ、Ｙ２３８Ｗ、Ｔ２５５Ｌ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｉ０３５Ａ、Ｉ０３５Ｆ、Ｉ０３５Ｇ、Ｉ０３５Ｌ、Ｉ０３５Ｍ、Ｉ０３５Ｔ、Ｖ２２７Ｆ、Ｖ２２７Ｓ、Ｖ２２７Ｙ、Ｆ２６２Ｅ、Ｆ２６２Ｉ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｔ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｎ１６１Ｆ、Ｎ１６１Ｓ、Ｎ１６１Ｗ、Ｎ１６１Ｙ、Ｒ１７０Ｉ、Ｒ１７０Ｌ、Ｒ１７０Ｍ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｈ、Ｇ１４６Ｎ、Ｇ１４６Ｑ、Ｄ０６０Ｅ、Ｄ０６０Ｎ、Ｄ０６０Ｓ、Ｗ１１３Ｆ、Ａ１３８Ｅ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４０Ｇ、Ｖ１４９Ｄ、Ｖ１４９Ｆ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｉ１５０Ａ、Ｎ２１２Ｉ、Ｎ２１２Ｌ、Ｎ２１２Ｑ、Ｎ２１２Ｗ、Ｓ２１６Ｄ、Ａ２２８Ｇ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｌ、Ｐ２３９Ｎ、Ｑ００２Ｅ、Ｑ００２Ｓ、Ｆ２１７Ｄ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｔ、Ｈ２２６Ｄ、Ｈ２２６Ｅ、Ｈ２２６Ｌ、Ｈ２２６Ｑ、Ｈ２２６Ｔ、Ａ２３０Ｆ、Ａ２３０Ｈ、Ａ２３０Ｉ、Ａ２３０Ｍ、Ａ２３０Ｑ、Ｑ０５９Ｉ、Ａ０１６Ｈ、Ａ０１６Ｗ、Ｐ２１０Ｄ、Ｐ２１０Ｅ、Ｐ２１０Ｗ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｇ０６３Ｄ、Ｇ０６３Ｅ、Ｇ０６３Ｌ、Ｇ０６３Ｍ、Ｇ０６３Ｎ、Ｇ０６３Ｓ、Ｇ０６３Ｔ、Ｇ０６３Ｖ、Ａ０９８Ｆ、Ａ０９８Ｓ、Ｉ１２２Ｌ、Ｖ１９８Ａ、Ｖ１９８Ｃ、Ｖ１９８Ｆ、Ｖ１９８Ｔ、Ｔ２０９Ｍ、Ｔ２０９Ｑ、Ｔ２０９Ｖ、Ｎ２１３Ｄ、Ｎ２１３Ｅ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｆ、Ａ２３６Ｌ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｐ、Ｔ２４２Ｅ、Ｔ２４２Ｑ、Ｐ２６０Ｃ、Ｇ２５８Ｄ、Ｎ１４１Ｇ、Ｓ１７３Ｄ、Ｙ２１４Ｍ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｔ、Ｈ０１０Ｌ、Ｌ０９６Ｅ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｓ１１６Ｅ、Ｓ１１６Ｆ、Ｇ０２５Ａ、Ｇ０２５Ｆ、Ｖ０８１Ｐ、Ｈ０３９Ｇ、Ｈ０３９Ｔ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｖ２６７Ｌ、Ｖ２６７Ｎ、Ａ１５１Ｈ、Ｇ１６０Ｆ、Ｇ１６０Ｈ、Ｇ１６０Ｍ、Ｇ１６０Ｖ、Ｍ２２２Ｌ、及びＭ２２２Ｙ
ＨＤＤ性能において最も有効な変異一覧
Ａ０２９Ｇ、Ａ０２９Ｓ、Ａ０２９Ｔ、Ｉ０３０Ｓ、Ｉ０３０Ｖ、Ｉ０３０Ｙ、Ｔ０３３Ｎ、Ｔ０３３Ｖ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｇ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｐ、Ａ０４０Ｙ、Ｇ０６５Ａ、Ｔ０６６Ｓ、Ｈ０６７Ａ、Ｈ０６７Ｅ、Ｈ０６７Ｆ、Ｈ０６７Ｇ、Ｈ０６７Ｋ、Ｈ０６７Ｌ、Ｈ０６７Ｍ、Ｈ０６７Ｎ、Ｈ０６７Ｐ、Ｈ０６７Ｑ、Ｈ０６７Ｓ、Ｈ０６７Ｔ、Ｈ０６７Ｖ、Ｈ０６７Ｙ、Ａ０６９Ｇ、Ｋ０９４Ａ、Ｋ０９４Ｄ、Ｋ０９４Ｅ、Ｋ０９４Ｈ、Ｋ０９４Ｌ、Ｋ０９４Ｍ、Ｋ０９４Ｎ、Ｋ０９４Ｓ、Ｋ０９４Ｔ、Ｖ０９５Ａ、Ｖ０９５Ｓ、Ｖ０９５Ｔ、Ｇ１１０Ｓ、Ｉ１１１Ｍ、Ｉ１１１Ｖ、Ｙ０８６Ｄ、Ｙ０８６Ｅ、Ｙ０８６Ｉ、Ｙ０８６Ｋ、Ｙ０８６Ｍ、Ｙ０８６Ｐ、Ｙ０８６Ｑ、Ｙ０８６Ｔ、Ｙ０８６Ｗ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０１Ｔ、Ｓ１０１Ｖ、Ｔ１０３Ａ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｇ、Ｔ１０３Ｌ、Ｔ１０３Ｎ、Ｔ１０３Ｓ、Ｔ１０３Ｙ、Ｌ１０４Ｉ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｇ、Ｓ０５２Ｈ、Ｓ０５２Ｌ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｑ、Ｓ０５２Ｔ、Ｓ０５２Ｖ、Ｌ０５８Ａ、Ｌ０５８Ｄ、Ｌ０５８Ｈ、Ｌ０５８Ｉ、Ｌ０５８Ｒ、Ｌ０５８Ｔ、Ｌ０５８Ｖ、Ｎ１８３Ｅ、Ｎ１８３Ｉ、Ｎ１８３Ｍ、Ｎ１８３Ｐ、Ｎ１８３Ｙ、Ｇ０８３Ａ、Ｇ０８３Ｓ、Ｖ０８４Ｌ、Ｖ０８４Ｓ、Ｖ０８４Ｔ、Ａ０８５Ｉ、Ａ０８５Ｓ、Ｖ０９３Ｇ、Ｖ０９３Ｉ、Ｖ０９３Ｍ、Ｖ０９３Ｔ、Ｌ０３１Ａ、Ｌ０３１Ｅ、Ｌ０３１Ｎ、Ｌ０３１Ｑ、Ｌ０３１Ｔ、Ｇ０３４Ａ、Ｇ０３４Ｅ、Ａ０３７Ｄ、Ａ０３７Ｅ、Ａ０３７Ｆ、Ａ０３７Ｈ、Ａ０３７Ｌ、Ａ０３７Ｍ、Ａ０３７Ｎ、Ａ０３７Ｑ、Ａ０３７Ｒ、Ａ０３７Ｓ、Ａ０３７Ｔ、Ａ０３７Ｗ、Ｖ０６８Ｄ、Ｖ０６８Ｉ、Ｖ０６８Ｍ、Ｖ０６８Ｑ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｎ１１７Ｋ、Ｎ１１７Ｍ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｎ１１７Ｙ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｇ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｑ、Ｍ１１９Ａ、Ｍ１１９Ｆ、Ｍ１１９Ｈ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１１９Ｑ、Ｍ１１９Ｓ、Ｍ１１９Ｔ、Ｎ１２３Ａ、Ｎ１２３Ｄ、Ｎ１２３Ｅ、Ｎ１２３Ｇ、Ｎ１２３Ｈ、Ｎ１２３Ｉ、Ｎ１２３Ｑ、Ａ１８７Ｄ、Ａ１８７Ｆ、Ａ１８７Ｇ、Ａ１８７Ｈ、Ａ１８７Ｎ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｗ、Ｎ０６２Ａ、Ｎ０６２Ｋ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｐ、Ｎ０６２Ｗ、Ｓ１２９Ａ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１２９Ｇ、Ｓ１２９Ｑ、Ｓ１２９Ｔ、Ｓ１２９Ｙ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｐ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｇ１３１Ｄ、Ｇ１３１Ｐ、Ｇ１３１Ｑ、Ｇ１３１Ｓ、Ｓ１３２Ａ、Ｑ１３７Ｅ、Ｑ１３７Ｈ、Ｑ１３７Ｉ、Ｑ１３７Ｔ、Ｎ１４４Ｈ、Ｎ１４４Ｖ、Ｎ１４４Ｙ、Ａ１５３Ｓ、Ｓ０９７Ｇ、Ｓ０９７Ｈ、Ｓ０９７Ｉ、Ｓ０９７Ｋ、Ｓ０９７Ｌ、Ｓ０９７Ｍ、Ｓ０９７Ｎ、Ｓ０９７Ｙ、Ｓ０９９Ｉ、Ｓ０９９Ｌ、Ｓ０９９Ｖ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０Ｐ、Ｎ１２０Ｔ、Ｖ１２１Ａ、Ｖ１２１Ｆ、Ｖ１２１Ｇ、Ｖ１２１Ｓ、Ｖ１７７Ｉ、Ｖ１７７Ｔ、Ａ１７９Ｇ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｆ、Ｓ１８２Ｌ、Ｓ１８２Ｍ、Ｓ１８２Ｎ、Ｓ１８２Ｗ、Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｌ、Ａ００１Ｒ、Ｔ００３Ｅ、Ｔ００３Ｈ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ｔ００３Ｙ、Ｖ００４Ｅ、Ｖ００４Ｆ、Ｖ００４Ｇ、Ｖ００４Ｈ、Ｖ００４Ｐ、Ｖ００４Ｓ、Ｖ００４Ｙ、Ｄ０１４Ｅ、Ｄ０１４Ｆ、Ｄ０１４Ｇ、Ｄ０１４Ｈ、Ｄ０１４Ｔ、Ｄ０１４Ｙ、Ｅ１９７Ｄ、Ｉ２０５Ａ、Ｉ２０５Ｃ、Ｉ２０５Ｍ、Ｉ２０５Ｎ、Ｌ２０６Ｆ、Ｌ２０６Ｋ、Ｌ２０６Ｍ、Ｌ２０６Ｎ、Ｌ２０６Ｒ、Ｌ２０６Ｓ、Ｌ２０６Ｖ、Ｌ２０６Ｗ、Ｌ２０６Ｙ、Ａ２２４Ｓ、Ｉ０１１Ａ、Ｉ０１１Ｍ、Ｉ０１１Ｔ、Ｉ０１１Ｖ、Ａ０１３Ｓ、Ｋ０１５Ｈ、Ｋ０１５Ｍ、Ｋ０１５Ｎ、Ｋ０１５Ｐ、Ｋ０１５Ｑ、Ｋ０１５Ｓ、Ｋ０１５Ｔ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０１５Ｙ、Ａ０９２Ｖ、Ｔ１８５Ｆ、Ｔ１８５Ｇ、Ｔ１８５Ｈ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｐ００５Ｄ、Ｐ００５Ｉ、Ｐ００５Ｍ、Ｐ００５Ｓ、Ｐ００５Ｔ、Ｐ００５Ｖ、Ｇ００７Ｙ、Ｋ０２７Ｄ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｇ、Ｋ０２７Ｈ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｎ、Ｋ０２７Ｐ、Ｋ０２７Ｑ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｋ０２７Ｙ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｇ、Ｎ０４３Ｈ、Ｎ０４３Ｉ、Ｎ０４３Ｋ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｍ、Ｎ０４３Ｑ、Ｎ０４３Ｓ、Ｎ０４３Ｖ、Ｎ０４３Ｗ、Ｓ０４９Ａ、Ｓ０４９Ｄ、Ｓ０４９Ｅ、Ｓ０４９Ｇ、Ｓ０４９Ｈ、Ｓ０４９Ｉ、Ｓ０４９Ｋ、Ｓ０４９Ｎ、Ｓ０４９Ｑ、Ｓ０４９Ｒ、Ｓ０４９Ｔ、Ｓ０４９Ｖ、Ｓ０４９Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｑ１３６Ｇ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３６Ｌ、Ｑ１３６Ｎ、Ｑ１３６Ｖ、Ｎ１６３Ｄ、Ｎ１６３Ｅ、Ｎ２０４Ｌ、Ｇ２１１Ｈ、Ｇ２１１Ｋ、Ｇ２１１Ｑ、Ｇ２１１Ｔ、Ｅ２４８Ａ、Ｅ２４８Ｈ、Ｉ００８Ａ、Ｉ００８Ｇ、Ｉ００８Ｈ、Ｉ００８Ｎ、Ｉ００８Ｐ、Ｉ００８Ｔ、Ｉ００８Ｖ、Ｉ００８Ｙ、Ｖ０２８Ｅ、Ｖ０２８Ｆ、Ｖ０２８Ｈ、Ｖ０２８Ｉ、Ｖ０２８Ｌ、Ｖ０２８Ｍ、Ｖ０２８Ｎ、Ｖ０２８Ｑ、Ｖ０２８Ｓ、Ｖ０２８Ｔ、Ｌ０４２Ｉ、Ｌ０４２Ｍ、Ｌ０４２Ｎ、Ｌ０４２Ｑ、Ｌ０４２Ｔ、Ｌ０４２Ｖ、Ｗ００６Ａ、Ｗ００６Ｄ、Ｗ００６Ｈ、Ｗ００６Ｋ、Ｗ００６Ｌ、Ｗ００６Ｍ、Ｗ００６Ｎ、Ｗ００６Ｐ、Ｗ００６Ｑ、Ｗ００６Ｓ、Ｗ００６Ｙ、Ａ０１９Ｆ、Ａ０１９Ｋ、Ａ０１９Ｌ、Ａ０１９Ｍ、Ａ０１９Ｒ、Ａ０１９Ｗ、Ａ０１９Ｙ、Ｔ０２２Ｅ、Ｔ０２２Ｇ、Ｔ０２２Ｉ、Ｔ０２２Ｌ、Ｔ０２２Ｍ、Ｔ０２２Ｑ、Ｔ０２２Ｒ、Ｔ０２２Ｓ、Ｔ０２２Ｖ、Ｔ０２２Ｗ、Ｖ０２６Ｅ、Ｖ０２６Ｆ、Ｖ０２６Ｈ、Ｖ０２６Ｌ、Ｖ０２６Ｎ、Ｖ０２６Ｑ、Ｖ０２６Ｒ、Ｖ０２６Ｓ、Ｇ０６１Ａ、Ｇ０６１Ｅ、Ｇ０６１Ｉ、Ｇ０６１Ｍ、Ｇ０６１Ｐ、Ｇ０６１Ｓ、Ｇ０６１Ｔ、Ｇ０６１Ｙ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ１５８Ｇ、Ｓ１５８Ｈ、Ｓ１５８Ｍ、Ｓ１５８Ｎ、Ｓ１５８Ｑ、Ｓ１５８Ｔ、Ｓ１５８Ｖ、Ｌ０９０Ｅ、Ｌ０９０Ｆ、Ｌ０９０Ｇ、Ｌ０９０Ｎ、Ｌ０９０Ｐ、Ｌ０９０Ｑ、Ｌ０９０Ｒ、Ｌ０９０Ｙ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｄ、Ｖ１４８Ｅ、Ｖ１４８Ｇ、Ｖ１４８Ｌ、Ｖ１４８Ｍ、Ｖ１４８Ｑ、Ｖ１４８Ｓ、Ｎ１８４Ａ、Ｎ１８４Ｓ、Ｆ１８９Ａ、Ｆ１８９Ｄ、Ｆ１８９Ｅ、Ｆ１８９Ｇ、Ｆ１８９Ｈ、Ｆ１８９Ｉ、Ｆ１８９Ｋ、Ｆ１８９Ｌ、Ｆ１８９Ｍ、Ｆ１８９Ｎ、Ｆ１８９Ｐ、Ｆ１８９Ｑ、Ｆ１８９Ｓ、Ｆ１８９Ｔ、Ｆ１８９Ｖ、Ｐ２０１Ｌ、Ｐ２０１Ｓ、Ｐ２０１Ｔ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｆ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｐ、Ｑ２４５Ｒ、Ｑ２４５Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｗ、Ｑ２４５Ｙ、Ｉ２４６Ａ、Ｉ２４６Ｆ、Ｉ２４６Ｍ、Ｉ２４６Ｖ、Ｌ２７４Ｆ、Ｌ２７４Ｍ、Ｌ２７４Ｙ、Ｎ２４３Ｄ、Ｎ２４３Ｋ、Ｎ２４３Ｌ、Ｎ２４３Ｐ、Ｎ２４３Ｒ、Ｔ２５３Ｆ、Ｔ２５３Ｇ、Ｔ２５３Ｋ、Ｔ２５３Ｎ、Ａ２５４Ｇ、Ａ２５４Ｔ、Ｈ０１７Ｉ、Ｈ０１７Ｌ、Ｈ０１７Ｐ、Ｈ０１７Ｓ、Ｈ０１７Ｔ、Ｈ０１７Ｖ、Ｖ０２１Ｄ、Ｖ０２１Ｆ、Ｖ０２１Ｇ、Ｖ０２１Ｈ、Ｖ０２１Ｋ、Ｖ０２１Ｍ、Ｖ０２１Ｒ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｃ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｈ、Ｌ２５７Ｉ、Ｌ２５７Ｍ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｑ、Ｌ２５７Ｖ、Ｖ２７０Ｉ、Ｖ２７０Ｌ、Ｖ２７０Ｍ、Ｖ２７０Ｑ、Ｖ２７０Ｔ、Ｖ２７０Ｗ、Ｖ２７０Ｙ、Ｓ０２４Ｇ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｉ、Ｓ０２４Ｐ、Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｋ、Ｑ２７５Ｌ、Ｑ２７５Ｎ、Ｑ２７５Ｒ、Ｑ２７５Ｗ、Ｑ２７５Ｙ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｉ、Ａ０４８Ｋ、Ａ０４８Ｌ、Ａ０４８Ｎ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｗ、Ｅ０５４Ｄ、Ｅ０５４Ｆ、Ｅ０５４Ｇ、Ｅ０５４Ｈ、Ｅ０５４Ｉ、Ｅ０５４Ｋ、Ｅ０５４Ｌ、Ｅ０５４Ｍ、Ｅ０５４Ｎ、Ｅ０５４Ｐ、Ｅ０５４Ｒ、Ｅ０５４Ｓ、Ｅ０５４Ｔ、Ｅ０５４Ｖ、Ｅ０５４Ｗ、Ａ０７３Ｇ、Ａ０７３Ｉ、Ａ０７３Ｋ、Ａ０７３Ｌ、Ａ０７３Ｔ、Ａ０７３Ｖ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｉ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｒ、Ｔ０７８Ｖ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｆ、Ｎ０８７Ｈ、Ｎ０８７Ｐ、Ｎ０８７Ｑ、Ｎ０８７Ｓ、Ａ０８８Ｄ、Ａ０８８Ｇ、Ａ０８８Ｎ、Ａ０８８Ｐ、Ａ０８８Ｑ、Ｄ０８９Ｆ、Ｄ０８９Ｋ、Ｄ０８９Ｌ、Ｄ０８９Ｒ、Ｄ０８９Ｔ、Ｄ０８９Ｗ、Ｙ０９１Ｈ、Ｙ０９１Ｉ、Ｙ０９１Ｍ、Ｙ０９１Ｎ、Ｙ０９１Ｖ、Ｙ０９１Ｗ、Ｇ０２０Ｅ、Ｇ０２０Ｈ、Ｇ０２０Ｌ、Ｇ０２０Ｎ、Ｇ０２０Ｑ、Ｇ０２０Ｔ、Ｇ０２０Ｖ、Ｇ０２０Ｙ、Ｍ２４１Ｈ、Ｍ２４１Ｉ、Ｍ２４１Ｑ、Ｍ２４１Ｓ、Ｖ２４４Ｌ、Ｖ２４４Ｑ、Ｎ２５２Ｆ、Ｎ２５２Ｉ、Ｎ２５２Ｌ、Ｎ２５２Ｑ、Ｎ２５２Ｒ、Ｎ２５２Ｓ、Ｆ２６１Ｙ、Ｋ２６５Ｓ、Ｋ２６５Ｖ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｈ、Ｓ２７２Ｋ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｎ、Ｓ２７２Ｐ、Ｓ２７２Ｑ、Ｓ２７２Ｔ、Ｓ２７２Ｖ、Ｎ０５６Ａ、Ｎ０５６Ｅ、Ｎ０５６Ｉ、Ｎ０５６Ｌ、Ｎ０５６Ｍ、Ｎ０５６Ｐ、Ｎ０５６Ｑ、Ｎ０５６Ｓ、Ｎ０５６Ｖ、Ａ０７４Ｇ、Ａ０７４Ｓ、Ｎ０７７Ｇ、Ｌ１３５Ｉ、Ｌ１９６Ｍ、Ｔ２０８Ａ、Ｔ２０８Ｉ、Ｔ２０８Ｌ、Ｔ２０８Ｎ、Ｔ２０８Ｖ、Ａ２３１Ｇ、Ａ２３１Ｌ、Ａ２３１Ｓ、Ａ２３１Ｙ、Ｒ２４９Ｋ、Ｒ２４９Ｗ、Ａ０１８Ｆ、Ａ０１８Ｋ、Ａ０１８Ｌ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１８Ｓ、Ａ０１８Ｔ、Ａ０１８Ｗ、Ａ０１８Ｙ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｉ、Ｎ０３８Ｋ、Ｎ０３８Ｐ、Ｎ０３８Ｔ、Ｎ０３８Ｙ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｅ２７１Ａ、Ｅ２７１Ｄ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｌ、Ｅ２７１Ｍ、Ｅ２７１Ｑ、Ｅ２７１Ｗ、Ｅ２７１Ｙ、Ｆ０５０Ａ、Ｆ０５０Ｉ、Ｆ０５０Ｋ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｓ、Ｆ０５０Ｗ、Ｆ０５０Ｙ、Ｖ０５１Ａ、Ｖ０５１Ｄ、Ｖ０５１Ｅ、Ｖ０５１Ｆ、Ｖ０５１Ｇ、Ｖ０５１Ｈ、Ｖ０５１Ｉ、Ｖ０５１Ｋ、Ｖ０５１Ｌ、Ｖ０５１Ｍ、Ｖ０５１Ｎ、Ｖ０５１Ｐ、Ｖ０５１Ｑ、Ｖ０５１Ｒ、Ｖ０５１Ｔ、Ｖ０５１Ｗ、Ｖ０５１Ｙ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｅ、Ｎ０７６Ｉ、Ｎ０７６Ｋ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｒ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７６Ｔ、Ｎ０７６Ｙ、Ｔ０７９Ｋ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ａ０５７Ｃ、Ａ０５７Ｄ、Ａ０５７Ｅ、Ａ０５７Ｉ、Ａ０５７Ｋ、Ａ０５７Ｌ、Ａ０５７Ｍ、Ａ０５７Ｎ、Ａ０５７Ｐ、Ａ０５７Ｑ、Ａ０５７Ｒ、Ａ０５７Ｓ、Ａ０５７Ｔ、Ａ０５７Ｖ、Ａ０５７Ｙ、Ｌ０７５Ａ、Ｌ０７５Ｄ、Ｌ０７５Ｅ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｈ、Ｌ０７５Ｉ、Ｌ０７５Ｋ、Ｌ０７５Ｎ、Ｌ０７５Ｑ、Ｌ０７５Ｒ、Ｌ０７５Ｓ、Ｌ０７５Ｔ、Ｌ０７５Ｖ、Ｌ０７５Ｗ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｙ、Ｉ１７５Ａ、Ｉ１７５Ｆ、Ｉ１７５Ｑ、Ｉ１７５Ｓ、Ｉ１７５Ｔ、Ｉ１７５Ｖ、Ｇ０５３Ａ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｉ、Ｇ０５３Ｌ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｐ、Ｇ０５３Ｑ、Ｐ０５５Ａ、Ｐ０５５Ｇ、Ｐ０５５Ｋ、Ｐ０５５Ｍ、Ｐ０５５Ｎ、Ｐ０５５Ｒ、Ｐ０５５Ｓ、Ｐ０５５Ｗ、Ｐ０５５Ｙ、Ｙ１４３Ｅ、Ｙ１４３Ｌ、Ｙ１４３Ｍ、Ｙ１４３Ｎ、Ｙ１４３Ｑ、Ｙ１４３Ｔ、Ｙ１４３Ｖ、Ｓ１８１Ａ、Ｔ０７１Ａ、Ｔ０７１Ｇ、Ｔ０７１Ｍ、Ｔ０７１Ｎ、Ｔ０７１Ｐ、Ｔ０７１Ｓ、Ｔ０７１Ｖ、Ｓ１９４Ｇ、Ｓ１９４Ｉ、Ｓ１９４Ｍ、Ｓ１９４Ｖ、Ａ２３２Ｈ、Ａ２３２Ｉ、Ａ２３２Ｌ、Ａ２３２Ｍ、Ａ２３２Ｎ、Ａ２３２Ｑ、Ａ２３２Ｓ、Ａ２３２Ｔ、Ｉ２３４Ａ、Ｉ２３４Ｆ、Ｉ２３４Ｍ、Ｉ２３４Ｎ、Ｉ２３４Ｑ、Ｉ２３４Ｓ、Ｉ２３４Ｖ、Ｉ２３４Ｗ、Ｉ２３４Ｙ、Ｋ２３７Ｆ、Ｋ２３７Ｇ、Ｋ２３７Ｉ、Ｋ２３７Ｌ、Ｋ２３７Ｍ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｑ、Ｋ２３７Ｒ、Ｋ２３７Ｓ、Ｋ２３７Ｔ、Ｋ２３７Ｖ、Ｋ２３７Ｗ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ａ２１５Ｆ、Ａ２１５Ｇ、Ａ２１５Ｈ、Ａ２１５Ｋ、Ａ２１５Ｌ、Ａ２１５Ｍ、Ａ２１５Ｎ、Ａ２１５Ｙ、Ａ１６９Ｓ、Ｖ２０３Ａ、Ｖ２０３Ｄ、Ｖ２０３Ｅ、Ｖ２０３Ｇ、Ｖ２０３Ｌ、Ｖ２０３Ｔ、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３３Ｄ、Ｌ２
３３Ｇ、Ｌ２３３Ｈ、Ｌ２３３Ｍ、Ｌ２３３Ｔ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５０Ｔ、Ｋ０１２Ｄ、Ｋ０１２Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０１２Ｈ、Ｋ０１２Ｌ、Ｋ０１２Ｍ、Ｋ０１２Ｒ、Ｋ０１２Ｔ、Ｋ０１２Ｙ、Ｄ０３６Ａ、Ｄ０３６Ｅ、Ｄ０３６Ｗ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｄ、Ｖ０７２Ｅ、Ｖ０７２Ｆ、Ｖ０７２Ｋ、Ｖ０７２Ｐ、Ｖ０７２Ｑ、Ｖ０７２Ｔ、Ｙ１６７Ａ、Ｙ１６７Ｄ、Ｙ１６７Ｅ、Ｙ１６７Ｆ、Ｖ１８０Ａ、Ｖ１８０Ｎ、Ｖ１８０Ｓ、Ｖ１８０Ｔ、Ｇ０８０Ｆ、Ｇ０８０Ｍ、Ｇ０８０Ｙ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｉ、Ｓ１５６Ｌ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｓ１５６Ｖ、Ｓ１７２Ｈ、Ｓ１７２Ｉ、Ｓ１７２Ｌ、Ｓ１７２Ｍ、Ｓ１７２Ｎ、Ｓ１７２Ｔ、Ｓ１７２Ｖ、Ｓ１７２Ｙ、Ｓ１８８Ｇ、Ｓ１８８Ｈ、Ｓ１８８Ｔ、Ｓ１８８Ｙ、Ｙ２３８Ａ、Ｙ２３８Ｃ、Ｙ２３８Ｄ、Ｙ２３８Ｆ、Ｙ２３８Ｇ、Ｙ２３８Ｉ、Ｙ２３８Ｋ、Ｙ２３８Ｌ、Ｙ２３８Ｍ、Ｙ２３８Ｑ、Ｙ２３８Ｔ、Ｙ２３８Ｖ、Ｙ２３８Ｗ、Ｔ２５５Ａ、Ｔ２５５Ｄ、Ｔ２５５Ｆ、Ｔ２５５Ｇ、Ｔ２５５Ｈ、Ｔ２５５Ｉ、Ｔ２５５Ｋ、Ｔ２５５Ｌ、Ｔ２５５Ｍ、Ｔ２５５Ｎ、Ｔ２５５Ｑ、Ｔ２５５Ｓ、Ｔ２５５Ｗ、Ｔ２５５Ｙ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｋ、Ｎ２５６Ｌ、Ｎ２５６Ｍ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｑ、Ｎ２５６Ｒ、Ｎ２５６Ｖ、Ｎ２５６Ｗ、Ｉ０３５Ａ、Ｉ０３５Ｆ、Ｉ０３５Ｇ、Ｉ０３５Ｌ、Ｉ０３５Ｍ、Ｉ０３５Ｔ、Ｖ２２７Ｆ、Ｖ２２７Ｓ、Ｖ２２７Ｔ、Ｖ２２７Ｙ、Ｆ２６２Ｅ、Ｆ２６２Ｓ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｉ、Ｇ１０６Ｎ、Ｇ１０６Ｓ、Ｔ１３３Ａ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｍ、Ｔ１３３Ｎ、Ｔ１３３Ｑ、Ｔ１３３Ｖ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｎ１６１Ｆ、Ｎ１６１Ｍ、Ｎ１６１Ｑ、Ｎ１６１Ｗ、Ｎ１６１Ｙ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｌ、Ｒ１７０Ｍ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ａ１０８Ｌ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｈ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｒ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１１８Ｙ、Ｇ１４６Ｑ、Ｇ１４６Ｒ、Ｄ０６０Ａ、Ｄ０６０Ｅ、Ｄ０６０Ｆ、Ｄ０６０Ｈ、Ｄ０６０Ｋ、Ｄ０６０Ｌ、Ｄ０６０Ｍ、Ｄ０６０Ｎ、Ｄ０６０Ｐ、Ｄ０６０Ｑ、Ｄ０６０Ｓ、Ｄ０６０Ｔ、Ｄ０６０Ｖ、Ｄ０６０Ｙ、Ｗ１１３Ｆ、Ｗ１１３Ｈ、Ｗ１１３Ｙ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４０Ｆ、Ｎ１４０Ｇ、Ｎ１４０Ｉ、Ｎ１４０Ｌ、Ｎ１４０Ｍ、Ｎ１４０Ｑ、Ｎ１４０Ｔ、Ｎ１４０Ｖ、Ｎ１４０Ｗ、Ｎ１４０Ｙ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｄ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｆ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｈ、Ｖ１４９Ｉ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｐ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｖ１４９Ｔ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｍ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ｎ２１２Ｆ、Ｎ２１２Ｇ、Ｎ２１２Ｌ、Ｎ２１２Ｐ、Ｎ２１２Ｗ、Ｓ２１６Ａ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｉ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｖ、Ｐ２３９Ｗ、Ｑ００２Ｅ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ００２Ｗ、Ｑ００２Ｙ、Ｓ２０７Ｔ、Ｓ２０７Ｖ、Ｆ２１７Ｄ、Ｆ２１７Ｅ、Ｆ２１７Ｈ、Ｆ２１７Ｉ、Ｆ２１７Ｒ、Ｆ２１７Ｔ、Ｆ２１７Ｖ、Ｈ２２６Ｄ、Ｈ２２６Ｅ、Ｈ２２６Ｆ、Ｈ２２６Ｇ、Ｈ２２６Ｌ、Ｈ２２６Ｑ、Ｈ２２６Ｔ、Ａ２３０Ｄ、Ａ２３０Ｆ、Ａ２３０Ｈ、Ａ２３０Ｍ、Ａ２３０Ｑ、Ａ２３０Ｙ、Ｑ０５９Ｉ、Ｑ０５９Ｎ、Ａ０１６Ｅ、Ａ０１６Ｇ、Ａ０１６Ｈ、Ａ０１６Ｉ、Ａ０１６Ｋ、Ａ０１６Ｌ、Ａ０１６Ｑ、Ａ０１６Ｔ、Ａ０１６Ｗ、Ｇ０２３Ａ、Ａ２００Ｓ、Ｐ２１０Ｄ、Ｐ２１０Ｅ、Ｐ２１０Ｆ、Ｐ２１０Ｉ、Ｐ２１０Ｌ、Ｐ２１０Ｑ、Ｐ２１０Ｓ、Ｐ２１０Ｔ、Ｐ２１０Ｖ、Ｐ２１０Ｗ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｓ１５９Ｔ、Ｇ０６３Ａ、Ｇ０６３Ｄ、Ｇ０６３Ｅ、Ｇ０６３Ｆ、Ｇ０６３Ｈ、Ｇ０６３Ｌ、Ｇ０６３Ｍ、Ｇ０６３Ｎ、Ｇ０６３Ｐ、Ｇ０６３Ｒ、Ｇ０６３Ｓ、Ｇ０６３Ｔ、Ｇ０６３Ｖ、Ｇ０６３Ｗ、Ｇ０６３Ｙ、Ａ０９８Ｈ、Ａ０９８Ｌ、Ａ０９８Ｍ、Ａ０９８Ｐ、Ａ０９８Ｑ、Ａ０９８Ｓ、Ａ０９８Ｔ、Ａ０９８Ｖ、Ｑ１０９Ｋ、Ｉ１２２Ｌ、Ｉ１２２Ｍ、Ｇ１２８Ｎ、Ｖ１９８Ａ、Ｖ１９８Ｃ、Ｖ１９８Ｆ、Ｔ２０９Ｅ、Ｔ２０９Ｍ、Ｔ２０９Ｑ、Ｔ２０９Ｒ、Ｔ２０９Ｓ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｎ２１３Ａ、Ｎ２１３Ｄ、Ｎ２１３Ｅ、Ｎ２１３Ｆ、Ｎ２１３Ｇ、Ｎ２１３Ｍ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｆ、Ａ２３６Ｇ、Ａ２３６Ｌ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｖ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｉ、Ｓ２４０Ｍ、Ｓ２４０Ｐ、Ｓ２４０Ｑ、Ｓ２４０Ｖ、Ｓ２４０Ｗ、Ｔ２４２Ａ、Ｔ２４２Ｅ、Ｔ２４２Ｇ、Ｔ２４２Ｈ、Ｔ２４２Ｉ、Ｔ２４２Ｋ、Ｔ２４２Ｌ、Ｔ２４２Ｐ、Ｔ２４２Ｑ、Ｔ２４２Ｓ、Ｔ２４２Ｖ、Ｔ２４２Ｙ、Ｐ２６０Ｃ、Ｐ２６０Ｉ、Ｐ２６０Ｌ、Ｐ２６０Ｍ、Ｐ２６０Ｎ、Ｐ２６０Ｓ、Ｐ２６０Ｖ、Ｇ２５８Ｄ、Ｙ２６３Ｔ、Ｙ２６３Ｗ、Ｎ１４１Ｇ、Ｎ１４１Ｔ、Ｓ１７３Ａ、Ｓ１７３Ｄ、Ｓ１７３Ｎ、Ｓ１７３Ｔ、Ｙ２１４Ｆ、Ｙ２１４Ｇ、Ｙ２１４Ｉ、Ｙ２１４Ｍ、Ｙ２１４Ｎ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｈ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｒ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｈ０１０Ａ、Ｈ０１０Ｌ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｓ１１６Ｆ、Ｓ１１６Ｍ、Ｇ０２５Ａ、Ｖ０４４Ａ、Ｖ０４４Ｉ、Ｖ０８１Ｇ、Ｖ０８１Ｌ、Ｖ０８１Ｍ、Ｖ０８１Ｐ、Ｖ０８１Ｙ、Ｎ２６９Ｋ、Ｎ２６９Ｔ、Ｎ２６９Ｖ、Ｈ０３９Ｇ、Ｈ０３９Ｓ、Ｈ０３９Ｔ、Ｋ２３５Ａ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｖ２６７Ａ、Ｖ２６７Ｅ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｇ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｋ、Ｖ２６７Ｌ、Ｖ２６７Ｎ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ａ１５１Ｈ、Ａ１５１Ｉ、Ａ１５１Ｑ、Ａ１５１Ｓ、Ａ１５１Ｔ、Ｇ１６０Ｆ、Ｇ１６０Ｈ、Ｇ１６０Ｍ、Ｇ１６０Ｖ、Ｍ２２２Ｅ、Ｍ２２２Ｈ、Ｍ２２２Ｌ、及びＭ２２２Ｙ
洗濯安定性＋ＨＤＬ（ｐＨ６）において最も有効な変異一覧
Ｉ０３０Ａ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｙ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｎ、Ｎ１８３Ｅ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｍ１２４Ｓ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｎ１２０Ｅ、Ｖ１２１Ｇ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ａ２２４Ｓ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｔ０２２Ｄ、Ｔ０２２Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｌ０９０Ｐ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｉ２４６Ｎ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｆ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｅ、Ｑ２７５Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｑ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｙ０９１Ｈ、Ｍ２４１Ｓ、Ｍ２４１Ｗ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｑ、Ｔ０７９Ｌ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｙ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｙ１４３Ｄ、Ｙ１４３Ｅ、Ｓ１８１Ｈ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｔ２５５Ｄ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｎ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｄ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｍ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｌ０９６Ｅ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｖ２６７Ｓ、及びＭ２２２Ｑ
洗濯安定性＋ＨＤＬ（ｐＨ８）において最も有効な変異一覧
Ａ０２９Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｎ１８３Ｅ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｑ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｋ０１５Ｖ、Ｔ１８５Ｑ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｒ１４５Ｗ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｖ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｗ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｎ２５２Ｅ、Ｋ２６５Ｄ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｙ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｎ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１４６Ｎ、Ａ１３８Ｅ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｉ１５０Ａ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｎ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｖ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ｓ２４０Ｐ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｔ、Ｌ０９６Ｅ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｓ１１６Ｅ、Ｋ２３５Ｄ、及びＫ２３５Ｅ
洗濯安定性＋ＨＤＤにおいて最も有効な変異一覧
Ａ０２９Ｔ、Ｉ０３０Ｖ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｙ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｇ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｓ０５２Ｎ、Ｎ１８３Ｅ、Ｖ０９３Ｔ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ１１７Ｅ、Ｎ１１７Ｆ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｇ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｑ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ａ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１２９Ｑ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｇ１３１Ｄ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｖ１２１Ｇ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ａ２２４Ｓ、Ｋ０１５Ｖ、Ｔ１８５Ｑ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｗ、Ｑ１３６Ｄ、Ｑ１３６Ｈ、Ｎ１６３Ｄ、Ａ０１９Ｍ、Ｔ０２２Ｅ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｓ１５８Ｄ、Ｌ０９０Ｐ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｓ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｔ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｑ２７５Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｑ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｙ０９１Ｈ、Ｙ０９１Ｎ、Ｍ２４１Ｑ、Ｍ２４１Ｓ、Ｋ２６５Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｙ、Ｖ０５１Ｉ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｓ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｌ０７５Ｇ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｙ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｑ、Ｙ１４３Ｅ、Ｓ１８１Ａ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｔ２５５Ｄ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｗ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｍ、Ｔ１３３Ｎ、Ｔ１３３Ｖ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ２２８Ｓ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｗ、Ｆ２１７Ｒ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｇ１２８Ｎ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ｓ２４０Ｐ、Ｓ２４０Ｑ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｖ０８１Ｍ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｉ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、及びＭ２２２Ｈ
洗濯安定性＋ＨＤＬ（ｐＨ８）＋ＨＤＤにおいて最も有効な変異一覧
Ａ０２９Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｎ１８３Ｅ、Ｍ１２４Ｓ、Ｌ１２６Ｑ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｋ０１５Ｖ、Ｔ１８５Ｑ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｔ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｗ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｓ２７２Ｑ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｆ０５０Ｙ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｃ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｎ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ａ１３８Ｅ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｉ１５０Ａ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｖ、Ａ２３６Ｃ、Ｓ２４０Ｐ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｔ、Ｌ０９６Ｈ、Ｌ０９６Ｉ、Ｋ２３５Ｄ、及びＫ２３５Ｅ
洗濯安定性＋ＨＤＤ＋ＨＤＬ（ｐＨ６）＋ＨＤＬ（ｐＨ８）において最も有効な変異一覧
Ａ０４０Ｅ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｆ、Ｎ１８３Ｅ、Ｍ１２４Ｓ、Ｎ１２３Ｄ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｑ１３７Ｅ、Ｇ１０２Ｅ、Ｉ１０７Ｑ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｔ００３Ｅ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｔ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｑ１３６Ｄ、Ｎ１６３Ｄ、Ｒ１４５Ｎ、Ｒ１４５Ｔ、Ｓ１５８Ｄ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｗ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｗ、Ｎ０８７Ｓ、Ｓ２７２Ｍ、Ｎ０３８Ｄ、Ｎ０３８Ｅ、Ｎ０３８Ｔ、Ｋ２５１Ａ、Ｋ２５１Ｃ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｍ、Ｋ２５１Ｎ、Ｋ２５１Ｒ、Ｋ２５１Ｓ、Ｋ２５１Ｔ、Ｋ２５１Ｖ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｋ２３７Ｎ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｋ０１２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ｓ１５６Ｄ、Ｓ１５６Ｎ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｆ２６２Ｅ、Ｇ１０６Ｅ、Ｔ１３３Ｄ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｒ１７０Ｌ、Ａ１０８Ｃ、Ｓ１１４Ｔ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ａ１３８Ｅ、Ｎ１４０Ｄ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｉ１５０Ａ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２４２Ｅ、Ｓ１７３Ｄ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｔ、Ｋ２３５Ｄ、及びＫ２３５Ｅ
ＡＤＷ安定性において最も有効な変異一覧
Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｒ、Ｑ００２Ｆ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｒ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ００２Ｗ、Ｔ００３Ｇ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ｔ００３Ｙ、Ｇ００７Ｎ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｈ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｒ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１９Ｍ、Ｔ０２２Ｅ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｇ０２５Ａ、Ｇ０２５Ｈ、Ｖ０２６Ｎ、Ｋ０２７Ｐ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ａ０２９Ｓ、Ｉ０３０Ｖ、Ｔ０３３Ｅ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｑ、Ｎ０３８Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｒ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｖ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｈ、Ｎ０４３Ｋ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｍ、Ｎ０４３Ｓ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｎ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｗ、Ｆ０５０Ａ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｒ、Ｆ０５０Ｓ、Ｖ０５１Ｉ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｑ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｑ、Ｐ０５５Ｎ、Ａ０５７Ｐ、Ｑ０５９Ｉ、Ｈ０６７Ａ、Ｈ０６７Ｇ、Ｈ０６７Ｐ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ａ０７３Ｇ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｒ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７７Ｔ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｋ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｒ、Ｔ０７８Ｓ、Ｔ０７８Ｖ、Ｔ０７９Ｋ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｇ０８０Ｍ、Ｖ０８１Ｍ、Ｙ０８６Ｐ、Ｎ０８７Ｈ、Ｄ０８９Ｆ、Ｌ０９０Ｐ、Ｙ０９１Ｉ、Ｙ０９１Ｍ、Ｙ０９１Ｖ、Ｌ０９６Ｅ、Ｌ０９６Ｎ、Ｓ０９７Ｎ、Ａ０９８Ｎ、Ａ０９８Ｑ、Ａ０９８Ｓ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０１Ｔ、Ｇ１０２Ｆ、Ｇ１０２Ｙ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｇ、Ｔ１０３Ｓ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｎ、Ｇ１０６Ｔ、Ｉ１０７Ｑ、Ｉ１０７Ｖ、Ｗ１１３Ｈ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｓ１１６Ｅ、Ｓ１１６Ｆ、Ｓ１１６Ｍ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｈ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｒ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１１８Ｙ、Ｍ１１９Ｑ、Ｖ１２１Ａ、Ｖ１２１Ｇ、Ｌ１２６Ｇ、Ｌ１２６Ｉ、Ｌ１２６Ｋ、Ｇ１２８Ｎ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｈ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、Ｇ１３１Ｈ、Ｔ１３３Ａ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｖ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３７Ｅ、Ｑ１３７Ｔ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４４Ｈ、Ｎ１４４Ｙ、Ｒ１４５Ｗ、Ｇ１４６Ｎ、Ｇ１４６Ｒ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｐ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ１５１Ｈ、Ａ１５２Ｐ、Ａ１５２Ｖ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｋ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５６Ｑ、Ｓ１５８Ｖ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｎ１６１Ｍ、Ｎ１６１Ｒ、Ｍ１６５Ｖ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ１６６Ｙ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｈ、Ｓ１８１Ｎ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｍ、Ｓ１８２Ｒ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ｒ、Ａ１８７Ｗ、Ｓ１８８Ｈ、Ｓ１９４Ｐ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｔ２０９Ｙ、Ｎ２１３Ｋ、Ｓ２１６Ｆ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ｆ２１７Ｒ、Ｍ２２２Ｌ、Ａ２２４Ｓ、Ａ２２８Ｓ、Ｉ２３４Ｖ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｋ２３７Ａ、Ｙ２３８Ｆ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｍ、Ｓ２４０Ｐ、Ｍ２４１Ｗ、Ｔ２４２Ｓ、Ｎ２４３Ｇ、Ｖ２４４Ｆ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｉ２４６Ｎ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５０Ｍ、Ｋ２５１Ｒ、Ｎ２５２Ｅ、Ｔ２５５Ｉ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｋ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｑ、Ｎ２５６Ｒ、Ｎ２５６Ｗ、Ｋ２６５Ｓ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｋ、Ｖ２６７Ｎ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ｅ２７１Ｗ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｋ、Ｓ２７２Ｎ、Ｓ２７２Ｑ、及びＱ２７５Ｅ
ＡＤＷ性能において最も有効な変異一覧
Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｈ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｒ、Ｑ００２Ｆ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｒ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ００２Ｗ、Ｑ００２Ｙ、Ｔ００３Ｅ、Ｔ００３Ｇ、Ｔ００３Ｈ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ｔ００３Ｙ、Ｇ００７Ｎ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｈ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｒ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ｋ０１２Ｇ、Ｋ０１２Ｒ、Ｋ０１５Ｈ、Ｋ０１５Ｖ、Ｋ０１５Ｙ、Ａ０１８Ｆ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１８Ｑ、Ａ０１８Ｒ、Ａ０１８Ｔ、Ａ０１９Ｋ、Ａ０１９Ｌ、Ａ０１９Ｍ、Ａ０１９Ｒ、Ａ０１９Ｗ、Ｇ０２０Ｎ、Ｔ０２２Ｄ、Ｔ０２２Ｅ、Ｔ０２２Ｓ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｉ、Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｇ０２５Ａ、Ｖ０２６Ｎ、Ｖ０２６Ｓ、Ｋ０２７Ｄ、Ｋ０２７Ｅ、Ｋ０２７Ｇ、Ｋ０２７Ｌ、Ｋ０２７Ｍ、Ｋ０２７Ｐ、Ｋ０２７Ｑ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ｖ０２８Ｅ、Ｖ０２８Ｔ、Ａ０２９Ｓ、Ａ０２９Ｔ、Ｉ０３０Ａ、Ｉ０３０Ｅ、Ｉ０３０Ｖ、Ｌ０３１Ｑ、Ｌ０３１Ｔ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｑ、Ｎ０３８Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｒ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｖ、Ａ０４０Ｗ、Ａ０４０Ｙ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｇ、Ｎ０４３Ｈ、Ｎ０４３Ｉ、Ｎ０４３Ｋ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｍ、Ｎ０４３Ｑ、Ｎ０４３Ｓ、Ｎ０４３Ｗ、Ｎ０４３Ｙ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｅ、Ｋ０４５Ｆ、Ｋ０４５Ｌ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ｋ０４５Ｗ、Ｇ０４６Ｎ、Ａ０４８Ｄ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｇ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｋ、Ａ０４８Ｎ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｗ、Ｆ０５０Ａ、Ｆ０５０Ｋ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｒ、Ｆ０５０Ｓ、Ｆ０５０Ｙ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｈ、Ｓ０５２Ｌ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｑ、Ｓ０５２Ｒ、Ｓ０５２Ｔ、Ｓ０５２Ｖ、Ｇ０５３Ａ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｑ、Ｇ０５３Ｒ、Ｐ０５５Ｋ、Ｐ０５５Ｎ、Ｐ０５５Ｒ、Ａ０５７Ｐ、Ｌ０５８Ｄ、Ｑ０５９Ｉ、Ｇ０６１Ｅ、Ｇ０６１Ｍ、Ｇ０６１Ｙ、Ｎ０６２Ｋ、Ｎ０６２Ｌ、Ｎ０６２Ｐ、Ｎ０６２Ｗ、Ｈ０６７Ａ、Ｈ０６７Ｇ、Ａ０６９Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ａ０７３Ｇ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｑ、Ｌ０７５Ｒ、Ｌ０７５Ｗ、Ｎ０７６Ｄ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７６Ｙ、Ｎ０７７Ｔ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｉ、Ｔ０７８Ｋ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｒ、Ｔ０７８Ｓ、Ｔ０７８Ｖ、Ｔ０７９Ｋ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｇ０８０Ｍ、Ｇ０８０Ｙ、Ｖ０８１Ｍ、Ｇ０８３Ｓ、Ａ０８５Ｓ、Ｙ０８６Ｐ、Ｎ０８７Ｈ、Ｎ０８７Ｓ、Ｄ０８９Ｆ、Ｌ０９０Ｅ、Ｌ０９０Ｎ、Ｌ０９０Ｐ、Ｙ０９１Ｈ、Ｙ０９１Ｉ、Ｙ０９１Ｍ、Ｙ０９１Ｎ、Ｙ０９１Ｔ、Ｙ０９１Ｖ、Ｙ０９１Ｗ、Ｖ０９３Ｔ、Ｌ０９６Ｉ、Ｌ０９６Ｎ、Ｓ０９７Ｇ、Ｓ０９７Ｈ、Ｓ０９７Ｉ、Ｓ０９７Ｌ、Ｓ０９７Ｍ、Ｓ０９７Ｎ、Ａ０９８Ｆ、Ａ０９８Ｈ、Ａ０９８Ｋ、Ａ０９８Ｍ、Ａ０９８Ｎ、Ａ０９８Ｑ、Ａ０９８Ｓ、Ａ０９８Ｔ、Ｓ０９９Ｉ、Ｓ０９９Ｋ、Ｓ０９９Ｌ、Ｓ０９９Ｖ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｓ１０１Ａ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０１Ｒ、Ｓ１０１Ｔ、Ｓ１０１Ｖ、Ｇ１０２Ｅ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｈ、Ｔ１０３Ｋ、Ｔ１０３Ｎ、Ｔ１０３Ｒ、Ｔ１０３Ｓ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｎ、Ｇ１０６Ｓ、Ｇ１０６Ｔ、Ｇ１０６Ｖ、Ｉ１０７Ｑ、Ｉ１０７Ｔ、Ｉ１０７Ｖ、Ａ１０８Ｃ、Ａ１０８Ｉ、Ｑ１０９Ｋ、Ｉ１１１Ｖ、Ｗ１１３Ｆ、Ｗ１１３Ｈ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｓ１１６Ｅ、Ｓ１１６Ｆ、Ｓ１１６Ｍ、Ｎ１１７Ｇ、Ｎ１１７Ｋ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｎ１１７Ｙ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｈ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｒ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１１８Ｙ、Ｍ１１９Ａ、Ｍ１１９Ｆ、Ｍ１１９Ｈ、Ｍ１１９Ｉ、Ｍ１１９Ｌ、Ｍ１１９Ｑ、Ｍ１１９Ｓ、Ｍ１１９Ｔ、Ｎ１２０Ｅ、Ｖ１２１Ａ、Ｎ１２３Ａ、Ｎ１２３Ｄ、Ｎ１２３Ｅ、Ｎ１２３Ｇ、Ｎ１２３Ｈ、Ｎ１２３Ｑ、Ｇ１２８Ｎ、Ｓ１２９Ａ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１２９Ｇ、Ｓ１２９Ｈ、Ｓ１２９Ｑ、Ｓ１２９Ｔ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｆ、Ｓ１３０Ｈ、Ｓ１３０Ｌ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、Ｇ１３１Ａ、Ｇ１３１Ｄ、Ｇ１３１Ｈ、Ｇ１３１Ｐ、Ｇ１３１Ｒ、Ｇ１３１Ｓ、Ｓ１３２Ａ、Ｔ１３３Ａ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｍ、Ｔ１３３Ｎ、Ｔ１３３Ｑ、Ｔ１３３Ｖ、Ｑ１３６Ｄ、Ｑ１３６Ｆ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３６Ｒ、Ｑ１３６Ｗ、Ｑ１３７Ｅ、Ｑ１３７Ｈ、Ｑ１３７Ｔ、Ａ１３８Ｅ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４０Ｑ、Ｎ１４０Ｙ、Ｎ１４１Ｔ、Ｙ１４３Ｅ、Ｎ１４４Ｈ、Ｎ１４４Ｍ、Ｎ１４４Ｖ、Ｎ１４４Ｗ、Ｎ１４４Ｙ、Ｒ１４５Ｗ、Ｇ１４６Ｎ、Ｇ１４６Ｒ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｍ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４８Ｇ、Ｖ１４８Ｓ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｐ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ａ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｓ、Ｉ１５０Ｔ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ１５１Ｈ、Ａ１５２Ｖ、Ａ１５３Ｇ、Ａ１５３Ｓ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｋ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５８Ｄ、Ｓ１５８Ｍ、Ｓ１５８Ｔ、Ｓ１５８Ｖ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｋ、Ｓ１５９Ｍ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｓ１５９Ｙ、Ｇ１６０Ｆ、Ｎ１６１Ｄ、Ｎ１６１Ｅ、Ｎ１６１Ｋ、Ｎ１６１Ｍ、Ｎ１６１Ｒ、Ｎ１６１Ｓ、Ｎ１６３Ｄ、Ｍ１６５Ｖ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ１６６Ｙ、Ｒ１７０Ｋ、Ｒ１７０Ｌ、Ｓ１７２Ｈ、Ｉ１７５Ｑ、Ｉ１７５Ｓ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｈ、Ｓ１８１Ｋ、Ｓ１８１Ｎ、Ｓ１８１Ｑ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｄ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｈ、Ｓ１８２Ｉ、Ｓ１８２Ｍ、Ｓ１８２Ｒ、Ｓ１８２Ｙ、Ｎ１８３Ｅ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ｒ、Ａ１８７Ｄ、Ａ１８７Ｇ、Ａ１８７Ｈ、Ａ１８７Ｐ、Ａ１８７Ｑ、Ａ１８７Ｖ、Ａ１８７Ｗ、Ｓ１８８Ｈ、Ｓ１８８Ｙ、Ｓ１９４Ｆ、Ｓ１９４Ｋ、Ｓ１９４Ｐ、Ｓ１９４Ｒ、Ｌ２０６Ｙ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｔ２０９Ｙ、Ｎ２１３Ｋ、Ａ２１５Ｄ、Ａ２１５Ｅ、Ｓ２１６Ａ、Ｓ２１６Ｆ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ｆ２１７Ｒ、Ｍ２２２Ｌ、Ａ２２４Ｓ、Ａ２２８Ｓ、Ｉ２３４Ｖ、Ｋ２３５Ｄ、Ｋ２３５Ｅ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｆ、Ａ２３６Ｇ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｋ２３７Ａ、Ｋ２３７Ｇ、Ｋ２３７Ｎ、Ｋ２３７Ｑ、Ｋ２３７Ｒ、Ｙ２３８Ｆ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｃ、Ｐ２３９Ｄ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｉ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｌ、Ｐ２３９Ｍ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｐ２３９Ｔ、Ｐ２３９Ｖ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｉ、Ｓ２４０Ｍ、Ｓ２４０Ｐ、Ｓ２４０Ｑ、Ｓ２４０Ｖ、Ｓ２４０Ｗ、Ｍ２４１Ｉ、Ｍ２４１Ｑ、Ｍ２４１Ｓ、Ｍ２４１Ｗ、Ｔ２４２Ａ、Ｔ２４２Ｅ、Ｔ２４２Ｉ、Ｔ２４２Ｋ、Ｔ２４２Ｐ、Ｔ２４２Ｑ、Ｔ２４２Ｓ、Ｔ２４２Ｖ、Ｎ２４３Ｇ、Ｖ２４４Ｆ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｆ、Ｑ２４５Ｍ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｑ２４５Ｗ、Ｑ２４５Ｙ、Ｉ２４６Ａ、Ｉ２４６Ｎ、Ｉ２４６Ｖ、Ｅ２４８Ｄ、Ｅ２４８Ｈ、Ｅ２４８Ｋ、Ｅ２４８Ｍ、Ｅ２４８Ｙ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５０Ｍ、Ｋ２５１Ｆ、Ｋ２５１Ｒ、Ｎ２５２Ｅ、Ｎ２５２Ｆ、Ｔ２５５Ｄ、Ｔ２５５Ｉ、Ｎ２５６Ｄ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｋ、Ｎ２５６Ｍ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｑ、Ｎ２５６Ｒ、Ｎ２５６Ｗ、Ｆ２６２Ｅ、Ｋ２６５Ｄ、Ｋ２６５Ｓ、Ｖ２６７Ａ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｋ、Ｖ２６７Ｎ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ｅ２７１Ａ、Ｅ２７１Ｆ、Ｅ２７１Ｈ、Ｅ２７１Ｋ、Ｅ２７１Ｗ、Ｅ２７１Ｙ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｋ、Ｓ２７２Ｎ、Ｓ２７２Ｑ、Ｑ２７５Ｅ、Ｑ２７５Ｇ、Ｑ２７５Ｎ、及びＱ２７５Ｒ
ＡＤＷ安定性＋ＡＤＷ性能において最も有効な変異一覧
Ａ００１Ｇ、Ａ００１Ｋ、Ａ００１Ｒ、Ｑ００２Ｆ、Ｑ００２Ｋ、Ｑ００２Ｐ、Ｑ００２Ｒ、Ｑ００２Ｓ、Ｑ００２Ｗ、Ｔ００３Ｇ、Ｔ００３Ｉ、Ｔ００３Ｖ、Ｔ００３Ｙ、Ｇ００７Ｎ、Ｐ００９Ａ、Ｐ００９Ｇ、Ｐ００９Ｈ、Ｐ００９Ｉ、Ｐ００９Ｍ、Ｐ００９Ｑ、Ｐ００９Ｒ、Ｐ００９Ｓ、Ｐ００９Ｔ、Ｐ００９Ｖ、Ａ０１８Ｎ、Ａ０１９Ｍ、Ｔ０２２Ｅ、Ｓ０２４Ｈ、Ｓ０２４Ｒ、Ｓ０２４Ｔ、Ｓ０２４Ｖ、Ｇ０２５Ａ、Ｖ０２６Ｎ、Ｋ０２７Ｐ、Ｋ０２７Ｒ、Ｋ０２７Ｓ、Ｋ０２７Ｔ、Ａ０２９Ｓ、Ｉ０３０Ｖ、Ｎ０３８Ａ、Ｎ０３８Ｑ、Ｎ０３８Ｔ、Ａ０４０Ｄ、Ａ０４０Ｅ、Ａ０４０Ｈ、Ａ０４０Ｋ、Ａ０４０Ｌ、Ａ０４０Ｎ、Ａ０４０Ｒ、Ａ０４０Ｔ、Ａ０４０Ｖ、Ｎ０４３Ａ、Ｎ０４３Ｄ、Ｎ０４３Ｅ、Ｎ０４３Ｆ、Ｎ０４３Ｈ、Ｎ０４３Ｋ、Ｎ０４３Ｌ、Ｎ０４３Ｍ、Ｎ０４３Ｓ、Ｋ０４５Ｄ、Ｋ０４５Ｑ、Ｋ０４５Ｒ、Ｋ０４５Ｓ、Ａ０４８Ｅ、Ａ０４８Ｈ、Ａ０４８Ｎ、Ａ０４８Ｑ、Ａ０４８Ｗ、Ｆ０５０Ａ、Ｆ０５０Ｑ、Ｆ０５０Ｒ、Ｆ０５０Ｓ、Ｓ０５２Ｄ、Ｓ０５２Ｍ、Ｓ０５２Ｎ、Ｓ０５２Ｑ、Ｇ０５３Ｄ、Ｇ０５３Ｅ、Ｇ０５３Ｎ、Ｇ０５３Ｑ、Ｐ０５５Ｎ、Ａ０５７Ｐ、Ｑ０５９Ｉ、Ｈ０６７Ａ、Ｈ０６７Ｇ、Ｖ０７２Ａ、Ｖ０７２Ｇ、Ｖ０７２Ｔ、Ａ０７３Ｇ、Ｌ０７５Ｆ、Ｌ０７５Ｇ、Ｌ０７５Ｒ、Ｎ０７６Ｑ、Ｎ０７６Ｓ、Ｎ０７７Ｔ、Ｔ０７８Ａ、Ｔ０７８Ｄ、Ｔ０７８Ｅ、Ｔ０７８Ｆ、Ｔ０７８Ｇ、Ｔ０７８Ｈ、Ｔ０７８Ｋ、Ｔ０７８Ｌ、Ｔ０７８Ｒ、Ｔ０７８Ｓ、Ｔ０７８Ｖ、Ｔ０７９Ｋ、Ｔ０７９Ｌ、Ｔ０７９Ｑ、Ｇ０８０Ｍ、Ｖ０８１Ｍ、Ｙ０８６Ｐ、Ｎ０８７Ｈ、Ｄ０８９Ｆ、Ｌ０９０Ｐ、Ｙ０９１Ｉ、Ｙ０９１Ｍ、Ｙ０９１Ｖ、Ｌ０９６Ｎ、Ｓ０９７Ｎ、Ａ０９８Ｎ、Ａ０９８Ｑ、Ａ０９８Ｓ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｅ、Ｓ１０１Ｍ、Ｓ１０１Ｔ、Ｔ１０３Ｄ、Ｔ１０３Ｅ、Ｔ１０３Ｓ、Ｇ１０６Ｅ、Ｇ１０６Ｎ、Ｇ１０６Ｔ、Ｉ１０７Ｑ、Ｉ１０７Ｖ、Ｗ１１３Ｈ、Ｓ１１４Ｇ、Ｓ１１４Ｔ、Ｓ１１６Ｅ、Ｓ１１６Ｆ、Ｓ１１６Ｍ、Ｎ１１７Ｓ、Ｎ１１７Ｔ、Ｇ１１８Ｄ、Ｇ１１８Ｅ、Ｇ１１８Ｈ、Ｇ１１８Ｑ、Ｇ１１８Ｒ、Ｇ１１８Ｓ、Ｇ１１８Ｔ、Ｇ１１８Ｙ、Ｍ１１９Ｑ、Ｖ１２１Ａ、Ｇ１２８Ｎ、Ｓ１２９Ｄ、Ｓ１３０Ｅ、Ｓ１３０Ｈ、Ｓ１３０Ｎ、Ｓ１３０Ｑ、Ｓ１３０Ｔ、Ｓ１３０Ｖ、Ｇ１３１Ｈ、Ｔ１３３Ａ、Ｔ１３３Ｄ、Ｔ１３３Ｆ、Ｔ１３３Ｌ、Ｔ１３３Ｖ、Ｑ１３６Ｈ、Ｑ１３７Ｅ、Ｑ１３７Ｔ、Ａ１３８Ｓ、Ｎ１４０Ｄ、Ｎ１４４Ｈ、Ｎ１４４Ｙ、Ｒ１４５Ｗ、Ｇ１４６Ｎ、Ｇ１４６Ｒ、Ｉ１４７Ａ、Ｉ１４７Ｈ、Ｉ１４７Ｓ、Ｖ１４９Ａ、Ｖ１４９Ｅ、Ｖ１４９Ｇ、Ｖ１４９Ｌ、Ｖ１４９Ｎ、Ｖ１４９Ｐ、Ｖ１４９Ｑ、Ｖ１４９Ｓ、Ｉ１５０Ｎ、Ｉ１５０Ｖ、Ａ１５１Ｈ、Ａ１５２Ｖ、Ｓ１５６Ａ、Ｓ１５６Ｈ、Ｓ１５６Ｋ、Ｓ１５６Ｍ、Ｓ１５６Ｎ、Ｓ１５８Ｖ、Ｓ１５９Ｄ、Ｓ１５９Ｅ、Ｓ１５９Ｎ、Ｓ１５９Ｑ、Ｎ１６１Ｍ、Ｎ１６１Ｒ、Ｍ１６５Ｖ、Ｇ１６６Ａ、Ｇ１６６Ｄ、Ｇ１６６Ｅ、Ｇ１６６Ｆ、Ｇ１６６Ｈ、Ｇ１６６Ｉ、Ｇ１６６Ｌ、Ｇ１６６Ｍ、Ｇ１６６Ｎ、Ｇ１６６Ｑ、Ｇ１６６Ｓ、Ｇ１６６Ｔ、Ｇ１６６Ｙ、Ｓ１８１Ａ、Ｓ１８１Ｈ、Ｓ１８１Ｎ、Ｓ１８２Ａ、Ｓ１８２Ｅ、Ｓ１８２Ｍ、Ｓ１８２Ｒ、Ｔ１８５Ｍ、Ｔ１８５Ｑ、Ｔ１８５Ｒ、Ａ１８７Ｗ、Ｓ１８８Ｈ、Ｓ１９４Ｐ、Ｔ２０９Ｆ、Ｔ２０９Ｖ、Ｔ２０９Ｗ、Ｔ２０９Ｙ、Ｎ２１３Ｋ、Ｓ２１６Ｆ、Ｓ２１６Ｉ、Ｓ２１６Ｔ、Ｆ２１７Ｒ、Ｍ２２２Ｌ、Ａ２２４Ｓ、Ａ２２８Ｓ、Ｉ２３４Ｖ、Ａ２３６Ｃ、Ａ２３６Ｄ、Ａ２３６Ｅ、Ａ２３６Ｎ、Ａ２３６Ｑ、Ａ２３６Ｓ、Ｋ２３７Ａ、Ｙ２３８Ｆ、Ｐ２３９Ａ、Ｐ２３９Ｅ、Ｐ２３９Ｆ、Ｐ２３９Ｇ、Ｐ２３９Ｈ、Ｐ２３９Ｋ、Ｐ２３９Ｎ、Ｐ２３９Ｒ、Ｐ２３９Ｓ、Ｐ２３９Ｗ、Ｓ２４０Ｆ、Ｓ２４０Ｍ、Ｓ２４０Ｐ、Ｍ２４１Ｗ、Ｔ２４２Ｓ、Ｎ２４３Ｇ、Ｖ２４４Ｆ、Ｑ２４５Ａ、Ｑ２４５Ｎ、Ｑ２４５Ｓ、Ｑ２４５Ｔ、Ｉ２４６Ｎ、Ｌ２５０Ｉ、Ｌ２５０Ｍ、Ｋ２５１Ｒ、Ｎ２５２Ｅ、Ｔ２５５Ｉ、Ｎ２５６Ｅ、Ｎ２５６Ｋ、Ｎ２５６Ｐ、Ｎ２５６Ｑ、Ｎ２５６Ｒ、Ｎ２５６Ｗ、Ｋ２６５Ｓ、Ｖ２６７Ｆ、Ｖ２６７Ｋ、Ｖ２６７Ｎ、Ｖ２６７Ｓ、Ｖ２６７Ｔ、Ｖ２６７Ｙ、Ｅ２７１Ｗ、Ｓ２７２Ｆ、Ｓ２７２Ｋ、Ｓ２７２Ｎ、Ｓ２７２Ｑ、及びＱ２７５Ｅ
Figure 0006678108
（実施例４）
ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼと関連する分子の比較
相同なプロテアーゼの同定
クエリー配列としてＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ（配列番号３）の成熟タンパク質のアミノ酸配列を利用し、検索パラメーターはデフォルト値に設定して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）により、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベース及びＧｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｓｔ Ｐａｔｅｎｔデータベースで相同物を同定した。いずれの検索セットに関しても、同一率（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。表中、「配列長」と記載される値は、掲載されている受け入れ番号により参照されるタンパク質の長さ（アミノ酸）に対応するものであるのに対し、「アライメント長」は、アライメント及びＰＩＤの算出に使用した配列について参照するものである。表５には、ＮＣＢＩの非冗長タンパク質データベースのＬＧ１２ｓｐｒＣに対する同一率（％）とともに配列一覧を提供し、表６には、Ｇｅｎｏｍｅ Ｑｕｅｓｔ Ｐａｔｅｎｔデータベースの配列一覧を提供する。
Figure 0006678108
Figure 0006678108
Figure 0006678108
Figure 0006678108
Figure 0006678108
Figure 0006678108
（実施例５）
ＬＧ１２ｓｐｒＣ及びバチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３、スブチリシンＥ（１）プロテアーゼの機能比較
バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）（受け入れ番号ＷＰ＿０１０１９２４０３．１、旧称ＺＰ＿０７７０７６５７．１）は、ＬＧ１２ｓｐｒＣに対し同一率が９２％であることが判明した（実施例４、表５）。特性をＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼの特性と比較するため、実施例２に記載のＬＧ１２ｓｐｒＣのクローニング工程後に、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）タンパク質をコードしている合成遺伝子（配列番号５）を作成し、ｐＨＹＴベクターにクローニングした。簡単に記載すると、タンパク質のプロ配列に対応させて、ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位と隣りあわせた合成ＤＮＡを作製し、予めｐＨＹＴベクター内に存在していたＡｐｒＥシグナル配列と融合させる。
配列番号５には、ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を利用して遺伝子をｐＨＹＴベクターにクローニングするのに利用した、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）タンパク質の前駆体をコードするヌクレオチド配列を示す。
ＧＣＴＡＧＣＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＡＣＴＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＧＣＴＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＡＴＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＡＣＡＴＴＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＡＧＣＧＡＡＡＡＡＴＣＣＴＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＡＡＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＴＡＣＴＧＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＧＣＡＣＧＣＴＴＣＡＧＧＴＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣＧＧＴＣＣＴＴＧＡＴＡＣＡＧＧＡＡＴＴＧＡＴＧＣＡＡＡＣＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＡＧＧＡＧＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＣＧＧＡＴＣＴＴＴＡＴＧＣＡＧＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＴＡＧＴＧＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＡＴＣＧＣＡＣＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＧＴＧＧＴＣＣＡＴＴＧＣＴＡＡＴＧＡＴＡＴＧＧＡＣＧＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＡＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＣＧＧＴＴＣＴＡＡＡＧＧＴＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＧＴＴＡＣＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＡＧＴＴＣＴＧＴＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＧＧＴＣＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＣＡＴＣＴＴＴＣＴＣＡＡＧＴＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＴＧＴＡＡＧＴＡＴＣＣＴＴＡＧＣＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡＡＣＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＴＡＴＣＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＧＡＡＴＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＣＴＡＡＣＣＴＴＧＧＣＧＡＴＧＣＧＴＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＧＴＡＡＴＴＡＡＣＧＴＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＧＣＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴＴ
配列番号６には、ｐＨＹＴプラスミドにおいて配列番号５の遺伝子配列として表される完全長のバチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）タンパク質のアミノ酸配列（３８３残基）を示す。
Figure 0006678108
以降のバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）細胞ヘの形質転換及びタンパク質の単離は実施例２における記載と同様にした。複数のアッセイにおいて、成熟型のバチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）タンパク質（配列番号７）の清澄な上清サンプルを、ＬＧ１２ｓｐｒＣの野生型タンパク質のとともに試験した。使用した方法については実施例１に記載してある。
配列番号７には、成熟型のバチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）タンパク質（２７５残基）のアミノ酸配列を示す。
ＡＱＴＶＰＷＧＩＰＨＩＫＡＤＫＡＨＡＳＧＶＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＤＡＮＨＡＤＬＮＶＫＧＧＡＳＦＶＳＧＥＰＮＡＬＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＴＴＧＶＬＧＶＡＹＮＡＤＬＹＡＶＫＶＬＳＡＳＧＳＧＴＬＳＧＩＡＱＧＩＥＷＳＩＡＮＤＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＳＴＧＳＴＡＬＱＱＡＣＤＮＡＹＡＳＧＩＶＶＶＡＡＡＧＮＳＧＳＫＧＫＲＮＴＭＧＹＰＡＲＹＳＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＮＲＡＳＦＳＳＶＧＳＥＬＥＶＭＡＰＧＶＳＩＬＳＴＴＰＧＮＮＹＳＳＦＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＫＡＫＹＰＳＭＴＮＶＱＩＲＥＫＬＫＮＴＡＴＮＬＧＤＡＦＹＹＧＨＧＶＩＮＶＥＳＡＬＱ
表７には、ＯＭＯ洗剤又はＫｉｒｋｌａｎｄ ＨＤＬ洗剤のいずれかを使用し、ＭＴＰアッセイを実施して、ＢＭＩ布見本小片に対する洗濯クリーニング活性を評価することで得られた試験結果、ＧＳＭ（ｐＨ９）又はＳｕｎ ａｌｌ ｉｎ Ｏｎｅ洗剤を使用することによる、卵のシミ付き布見本小片に対するＡＤＷクリーニング、ＯＭＯ ＨＤＬ又はＬＡＳ／ＥＤＴＡのいずれかにおけるタンパク質安定性、並びにＡＡＰＦ−ｐＮＡに対するプロテアーゼ活性の要約を示す。バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）（受け入れ番号ＷＰ＿０１０１９２４０３．１、旧称ＺＰ＿０７７０７６５７．１）及びＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼは、試験した系間で非常に類似する特性を示す。
Figure 0006678108
（実施例６）
セリンプロテアーゼＢｈｏｎ０３３２１の発見及び同定
バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ ８７１９（Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨから入手）を工業用途に有用である可能性のある酵素供給源として選択した。ＤＳＭ ８７１９による酵素産生及びこれらの酵素をコードする遺伝子を同定するため、合成（ＳＢＳ）法によるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定法を利用してＤＳＭ８７１９の完全なゲノムを配列決定した。ゲノムの配列決定及び配列データのアセンブリはＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。コンティグはＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により注釈付した。ＤＳＭ ８７１９株においてこの方法により同定された遺伝子のうち１つが、様々なその他の細菌のセリンプロテアーゼに対し相同性を示すタンパク質をコードする。この遺伝子の配列、Ｂｈｏｎ０３３２１．ｎを配列番号８に示す。
配列番号８には、Ｂｈｏｎ０３３２１遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
ＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＡＴＡＣＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＧＴＴＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＴＣＣＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＴＴＡＡＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＡＣＣＴＣＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＧＴＴＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＴＴＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＴＴＣＧＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＡＡＣＡＴＡＧＣＡＴＴＣＧＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＣＧＴＡＧＡＧＧＴＴＡＴＧＧＣＧＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＧＧＧＧＣＡＴＣＣＣＧＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＴＣＣＴＴＧＡＴＡＣＡＧＧＧＡＴＣＧＡＣＧＣＣＡＡＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＴＧＴＡＡＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＡＡＧＴＴＴＴＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＧＡＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＡＣＧＧＡＡＣＴＣＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＧＧＴＴＧＣＣＧＣＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＣＧＴＴＣＴＡＧＧＧＧＴＣＧＣＴＴＡＣＡＡＣＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＡＴＧＣＧＧＴＡＡＡＡＧＴＴＣＴＴＡＧＣＧＣＴＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＧＡＣＴＴＴＡＡＧＴＧＧＣＡＴＣＧＣＡＣＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＡＴＧＧＴＣＣＡＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＡＡＴＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＡＴＡＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧＣＴＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＣＡＡＣＡＣＴＡＴＣＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴＴＣＣＡＡＴＡＡＣＡＡＣＣＧＣＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＣＧＣＣＧＧＧＴＧＣＴＡＡＴＡＴＣＴＴＧＡＧＣＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＡＴＧＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＣＧＧＡＡＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＴＡＴＣＣＴＡＧＣＡＴＧＡＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＧＡＴＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＴＧＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＡＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡ
Ｂｈｏｎ０３３２１．ｎ遺伝子によりコードされるプレプロ酵素を配列番号９に示す。１残基目のメチオニンは、Ｂｈｏｎ０３３２１．ｎ遺伝子のｔｔｇ開始コドンによりコードされる。このタンパク質は、Ｎ−末端に、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮにより予想される通りの長さ２７残基のシグナルペプチドを有する（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００７）２：９５３〜９７１）。配列番号９において、このシグナルペプチド配列には下線を引き、ボールド体で示す。シグナルペプチドが存在することから、このセリンプロテアーゼは分泌酵素であることが示唆される。その他のセリンプロテアーゼ同様、この酵素は７９残基であることが予想されるプロ配列を有する（配列番号９においてイタリック体で示す）。この予想は、ＢＰＮ’などの相同なセリンプロテアーゼとのプロ成熟の分岐点（pro-mature junction）に基づく（Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８３）１１：７９１１〜２５）。完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予想される配列（Ｂｈｏｎ０３３２１，２７５残基）を配列番号１０に示す。配列番号９には、セリンプロテアーゼ前駆体Ｂｈｏｎ０３３２１のアミノ酸配列を示す。
Figure 0006678108
配列番号１０には、成熟型Ｂｈｏｎ０３３２１プロテアーゼのアミノ酸配列を示す（２７５残基）。
ＡＱＴＶＰＷＧＩＰＨＩＫＡＤＫＡＨＡＡＧＶＴＧＳＧＶＫＶＡＩＬＤＴＧＩＤＡＮＨＡＤＬＮＶＲＧＧＡＳＦＶＡＧＥＰＮＡＬＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＴＧＶＬＧＶＡＹＮＡＤＬＹＡＶＫＶＬＳＡＳＧＳＧＴＬＳＧＩＡＱＧＩＥＷＳＩＡＮＧＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＳＳＧＳＴＡＬＱＱＡＣＮＮＡＹＮＲＧＩＶＶＩＡＡＡＧＮＳＧＳＳＧＮＲＮＴＩＧＹＰＡＲＹＳＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＮＮＮＲＡＳＦＳＳＶＧＮＥＬＥＶＭＡＰＧＡＮＩＬＳＴＴＰＧＮＮＹＡＳＦＮＧＴＳＭＡＡＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＫＡＫＹＰＳＭＴＮＶＱＩＲＤＲＬＲＮＴＡＴＮＬＧＤＰＦＦＹＧＮＧＶＩＮＶＥＳＡＬＱ
（実施例７）
更なるバチルス・ホリコシィ（B. horikoshii）セリンプロテアーゼの発見及び同定
バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）ＤＳＭ ９７１１、バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）ＤＳＭ ９７１２及びバチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii)ＤＳＭ ６９５１も、ＬＧ１２−系統群のスブチリシン及びその他の工業用途に有用な酵素に可能性のある供給源として選択した。これらの株は、Ｌｅｉｂｎｉｚ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨから得た。これらの株及びこれらの酵素をコードしている遺伝子により産生された酵素を同定するため、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定を使用し、合成（ＳＢＳ）法により全３種のバチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株を配列決定した。ゲノム配列決定、配列データのアセンブリ、及びコンティグの注釈付はＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）ＤＳＭ ９７１１株においてこの方法で同定された遺伝子のうち１つが、ＬＧ１２−系統群のスブチリシンに属するタンパク質をコード質している。この遺伝子の配列、ＤＳＭ９７１１＿ｓｐｒＣを配列番号１１に示す。
配列番号１１には、ＤＳＭ９７１１＿ｓｐｒＣ遺伝子のヌクレオチド配列を示す：
ＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＡＴＡＣＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＧＴＴＡＧＣＡＴＴＴＧＧＴＡＣＴＧＣＧＣＡＧＧＣＡＧＡＡＴＣＧＴＣＣＡＧＴＣＣＣＡＡＴＧＣＴＡＧＴＧＣＡＡＡ
ＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＧＣＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＴＧＣＣＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＧＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＡＣＧＴＴＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＧ
ＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣＴＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＡＧＡＴＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣＣＴＡＡＣＡＴＣＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＣＡＡＡＣＴＧＴＧ
ＣＣＡＴＧＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＣＧＣＡＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＧＡＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＴＣＡＡＡＧＴＣＧＣＧＡＴＣＣＴＡＧＡＴＡＣＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＡＴＡＣＴＧＡ
ＴＣＴＴＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＧＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＡＴＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＧＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴ
ＣＴＡＣＴＧＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＴＧＣＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＣＴＴＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＡＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＧＡＡＴＣＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＧＡＧＴＧＧＴＣＣ
ＡＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＧＴＴＴＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＡＴＧＣＡＡＧＡＧＧＴＡＴＴＧＴＣＧＴＣＡＴＴＧＣ
ＧＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＧＴＴＡＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＣＡＧＣＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＡＧＡＴＴＣＣＡＧＴＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＴ
ＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＴＡＧＧＡＡＡＣＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＣＡＣＣＧＧＧＴＧＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＡＡＧＣＡＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＣＡＡＣＴＡＴＧＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＧＧＡＡＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＧＴＣＴ
ＣＣＡＣＡＣＧＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＣＡＡＡＧＣＧＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＡＡＴＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＧＧＴＧＡＴＣＣＴＴＴ
ＣＴＴＣＴＡＣＧＧＴＡＡＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＡＡ
ＤＳＭ９７１１＿ｓｐｒＣ遺伝子によりコードされるプレプロ酵素を配列番号１２に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端に、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮにより予想される通りの長さ２７残基のシグナルペプチドを有する（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００７）２：９５３〜９７１）。配列番号１２において、このシグナルペプチド配列には下線を引き、ボールド体で示す。シグナルペプチドが存在することから、このセリンプロテアーゼは分泌酵素であることが示唆される。この酵素は、７９残基であることが予想されるプロ配列を有する（配列番号１２においてイタリック体で示す）。完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予想される配列（ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣ，２７５残基）を配列番号１３に示す。
配列番号１２には、セリンプロテアーゼ前駆体ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣのアミノ酸配列を示す。
Figure 0006678108
配列番号１３には、成熟型ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列を示す（２７５残基）。
ＡＱＴＶＰＷＧＩＰＨＩＫＡＤＫＡＨＡＳＧＶＴＧＳＧＶＫＶＡＩＬＤＴＧＩＤＡＮＨＴＤＬＮＶＫＧＧＡＳＦＶＳＧＥＰＮＡＬＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＴＧＶＬＧＶＡＹＮＡＤＬＹＡＶＫＶＬＳＡＳＧＳＧＴＬＳＧＩＡＱＧＩＥＷＳＩＡＮＧＭＮＶＩＮＭＳＬＧＧＳＴＧＳＴＡＬＱＱＡＣＤＮＡＹＡＲＧＩＶＶＩＡＡＡＧＮＳＧＳＲＧＫＱＮＴＭＧＹＰＡＲＹＳＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＮＲＡＳＦＳＳＶＧＮＥＬＥＶＭＡＰＧＶＮＩＬＳＴＴＰＧＮＮＹＡＳＦＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＫＡＫＹＰＳＭＴＮＶＱＩＲＤＲＬＫＮＴＡＴＮＬＧＤＰＦＦＹＧＫＧＶＩＮＶＥＳＡＬＱ
バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）ＤＳＭ ９７１２では、ＬＧ１２−系統群のスブチリシンをコードしている別の遺伝子が同定された。この遺伝子配列、ＤＳＭ９７１２＿ｓｐｒＣを配列番号１４に示す。
配列番号１４には、ＤＳＭ９７１２＿ｓｐｒＣ遺伝子のヌクレオチド配列を示す：
ＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＡＴＡＣＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＴＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＡＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＣＧＡＧＴＧＣＴＧＧ
ＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＴＡＣＴＴＡＡＴＴＧＧＡＴＴＴＡＣＧＡＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＧＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣＴＣＣＣＡＡＡＡＴＣＴＡＧＴＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＣＡＣＡＴＴＣＣＡＡＴ
ＡＣＡＴＧＧＡＴＧＴＡＧＴＧＧＡＡＧＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＡＡＣＡＴＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＣＧＴＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＣＧＡＣＴＧＣＡＣＡＧ
ＡＣＡＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＴＡＴＴＣＣＧＣＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＡＴＡＡＧＧＣＡＣＡＴＧＣＣＧＣＴＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＴＧＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡＴＣＣＴＴＧＡＣＡＣＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＣＴＡＡＣＣＡ
ＴＧＣＣＧＡＣＣＴＴＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＡＡＡＴＧＣＣＣＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＴＡＧＣＧＧＧＡＡＣＧＧＴＴＧＣＴＧＣＧＴＴＡＡ
ＡＴＡＡＣＡＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＣＴＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＣＧＧＡＴＣＴＴＴＡＴＧＣＡＧＴＴＡＡＡＧＴＣＣＴＴＡＡＣＧＣＡＴＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＧＡＣＧＴＴＡＡＧＴＧＧＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＧ
ＴＧＧＴＣＣＡＴＴＧＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＡＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＴＡＧＴＡＡＴＡＡＴＧＣＴＴＡＣＡＡＴＡＧＡＧＧＣＡＴＴＧＴＣＧＴ
ＣＡＴＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＡＡＴＴＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＡＧＧＣＡＡＴＣＧＧＡＡＴＡＣＡＡＴＴＧＧＧＴＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＧＣＧＧＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＴＧＡＣＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣ
ＧＴＧＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＧＣＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＴＡＴＧ
ＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＴＡＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＡＡＴＡＣＣＣＧＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＣＧＴＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＧＡＴＣＧＣＣＴＧＡＧＡＡＡＴＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴＧＧＴＧＡ
ＴＣＣＡＴＴＣＴＴＣＴＡＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＡＡ
ＤＳＭ９７１２＿ｓｐｒＣ遺伝子によりコードされるプレプロ酵素を配列番号１５に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端に、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮにより予想される通りの長さ２９残基のシグナルペプチドを有する。配列番号１５において、このシグナルペプチド配列には下線を引き、ボールド体で示す。シグナルペプチドが存在することから、このセリンプロテアーゼは分泌酵素であることが示唆される。この酵素は７９残基であることが予想されるプロ配列を有する（配列番号１５においてイタリック体で示す）。完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予想される配列（ＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣ，２７５残基）を配列番号１６に示す。
配列番号１５には、セリンプロテアーゼ前駆体ＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣのアミノ酸配列を示す。
Figure 0006678108
配列番号１６には、成熟型ＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列を示す（２７５残基）。
ＡＱＴＶＰＷＧＩＰＨＩＫＡＤＫＡＨＡＡＧＶＴＧＳＧＶＫＶＡＩＬＤＴＧＩＤＡＮＨＡＤＬＮＶＫＧＧＡＳＦＶＳＧＥＰＮＡＬＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＴＴＧＶＬＧＶＡＹＮＡＤＬＹＡＶＫＶＬＮＡＳＧＳＧＴＬＳＧＩＡＱＧＩＥＷＳＩＡＮＧＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＳＴＧＳＴＡＬＱＱＡＳＮＮＡＹＮＲＧＩＶＶＩＡＡＡＧＮＳＧＳＬＧＮＲＮＴＩＧＹＰＡＲＹＳＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＮＮＮＲＡＳＦＳＳＶＧＳＥＬＥＶＭＡＰＧＶＮＩＬＳＴＴＰＧＮＮＹＡＳＦＮＧＴＳＭＡＡＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＫＡＫＹＰＮＭＴＮＶＱＩＲＤＲＬＲＮＴＡＴＮＬＧＤＰＦＦＹＧＲＧＶＩＮＶＥＳＡＬＱ
バチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）ＤＳＭ ６９５１では、ＬＧ１２−系統群のスブチリシンをコードしている別の遺伝子が同定された。この遺伝子配列、ＤＳＭ６９５１＿ｓｐｒＣを配列番号１７に示す。
配列番号１７には、ＤＳＭ６９５１＿ｓｐｒＣ遺伝子のヌクレオチド配列を示す：
ＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＡＴＡＣＴＴＡＴＣＧＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＴＣＧＴＴＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＡＡＴＧＣＴＡＧＴＧＣＡＡＡ
ＧＡＡＡＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＧＡＣＡＴＡＣＡＡＣＡＴＡＣＡＴＴＣＣＡＧＴＡＣＡＴＧＧ
ＡＴＧＴＴＧＴＧＧＡＡＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＣＴＧＴＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＡＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧＴＴＧＡＧＧＡＡＡＡＣＧＴＣＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＡＣＴＧＣＴＣＡＡＡＣＡＧＴＴ
ＣＣＴＴＧＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＣＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＧＡＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＡＴＧＣＣＧＡ
ＴＣＴＴＡＡＣＧＴＡＡＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＡＧＣＣＧＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＡＴＧＧＡＡＣＡＣＡＣＧＴＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＴＡＡＣＡ
ＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＣＴＴＡＣＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＴＡＴＡＴＧＣＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＣＴＴＡＧＴＧＣＴＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＡＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＡＴＴＧＡＧＴＧＧＴＣＣ
ＧＴＴＧＣＴＡＡＣＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＡＴＧＡＧＴＣＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＴＡＡＴＧＣＴＴＡＴＧＣＴＡＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＣ
ＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＡＴＧＧＧＧＴＡＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＡＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＧＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＴＴＣＣＡＧＴＡＡＣＡＡＣＣＧＴＧＣＣＴ
ＣＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＴＧＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＧＣＡＣＧＡＣＴＣＣＴＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＡＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＴ
ＣＣＧＣＡＣＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＴＡＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＡＡＴＡＣＣＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＡＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＴＣＣＴＴＴ
ＣＴＴＣＴＡＣＧＧＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＡＡ
ＤＳＭ６９５１＿ｓｐｒＣ遺伝子によりコードされるプレプロ酵素を配列番号１８に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端に、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮにより予想される通りの長さ２７残基のシグナルペプチドを有する。配列番号１８において、このシグナルペプチド配列には下線を引き、ボールド体で示す。シグナルペプチドが存在することから、このセリンプロテアーゼは分泌酵素であることが示唆される。この酵素は７９残基であることが予想されるプロ配列を有する（配列番号１８においてイタリック体で示す）。完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予想される配列（ＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣ残基）を配列番号１９に示す。
配列番号１８には、セリンプロテアーゼ前駆体ＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣのアミノ酸配列を示す。
Figure 0006678108
配列番号１９には、成熟型ＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列を示す（２７５残基）。
ＡＱＴＶＰＷＧＩＰＨＩＫＡＤＫＡＨＡＡＧＶＴＧＳＧＶＫＶＡＩＬＤＴＧＩＤＡＮＨＡＤＬＮＶＫＧＧＡＳＦＶＳＧＥＰＮＡＬＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＴＴＧＶＬＧＶＡＹＮＡＤＬＹＡＶＫＶＬＳＡＳＧＳＧＴＬＳＧＩＡＱＧＩＥＷＳＶＡＮＧＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＳＳＧＳＳＡＬＱＱＡＣＤＮＡＹＡＲＧＶＶＶＩＡＡＡＧＮＳＧＳＲＧＫＱＮＴＭＧＹＰＡＲＹＳＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＮＲＡＳＦＳＳＶＧＮＥＬＥＶＭＡＰＧＶＮＩＬＳＴＴＰＧＮＮＹＡＳＦＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＫＡＫＹＰＳＭＴＮＶＱＩＲＥＲＬＫＮＴＡＴＮＬＧＤＰＦＦＹＧＫＧＶＩＮＶＥＳＡＬＱ
配列番号２０には、成熟型ＫＳＭ−ＬＤ１，ＳＢ（ＢＡＤ２１１２８）プロテアーゼのアミノ酸配列を示す（２７６残基）。
ＳＱＴＶＰＹＧＶＰＨＩＫＡＤＶＡＨＳＱＮＶＴＧＮＧＶＫＶＡＩＬＤＴＧＩＤＡＡＨＥＤＬＲＶＶＧＧＡＳＦＶＡＧＥＰＮＡＬＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＱＶＧＶＬＧＶＡＹＤＶＤＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＳＧＴＬＳＧＩＡＱＧＩＥＷＳＩＡＮＮＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＳＴＧＳＴＴＬＫＱＡＡＤＮＡＹＮＳＧＬＶＶＶＡＡＡＧＮＳＧＤＦＦＧＬＩＮＴＩＧＹＰＡＲＹＤＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＮＮＲＲＡＳＦＳＳＶＧＳＱＬＥＶＭＡＰＧＶＮＩＬＳＴＬＰＧＮＳＹＧＳＬＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＬＬＡＱＤＰＴＬＴＮＶＱＶＲＥＩＬＲＤＴＡＴＮＬＧＳＳＦＹＹＧＮＧＶＩＤＶＥＫＡＬＱ
（実施例８）
バチルス・ホリコシィ（B. horikoshii）セリンプロテアーゼの異種発現
バチルス・スブチリス（B. subtilis）ａｐｒＥプロモーターの下流のＢｈｏｎ０３３２１、ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣ、ＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣ及びＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣのプロ成熟配列、バチルス・スブチリス（B. subtilis）ａｐｒＥシグナルペプチド配列、並びに末端のＢＰＮ転写終結配列、をコードしているＤＮＡ配列から構成された発現カセットを使用して、Ｂｈｏｎ０３３２１、ＤＳＭ９７１１、ＤＳＭ９７１２及びＤＳＭ６９５１プロテアーゼをバチルス・スブチリス（B. subtilis）で産生させた。４つの異なるカセットをｐＨＹＴ複製シャトルベクターにクローニングし、適切なバチルス・スブチリス（B. subtilis）株に形質転換した。ＢｓｔＥＩＩ及びＥｃｏＲＩ認識部位を使用して、テトラサイクリン耐性遺伝子の後ろに転写終結部位を付加し、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）からｐＨＹＴベクターを誘導した（配列番号２１、転写終結配列、ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＧＣＴＣＧＧＴＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＧＡＡＴＴＣ）。ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ認識部位にクローニングされているリンカーを利用して、ｐＨＹ３００ＰＬＫのＨｉｎｄＩＩＩ認識部位も除去した（配列番号２２、新しいリンカー配列、ＧＧＡＴＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴ）。
Ｂｈｏｎ０３３２１遺伝子（ｐＨＹＴ−Ｂｈｏｎ０３３２１）を含有しているｐＨＹＴベクターのマップを図３に示す。ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣ、ＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣ及びＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣ（図示せず）の発現プラスミドは類似しており、各プロテアーゼのプロ成熟部分をコードしている配列のみが異なっている。
Ｂｈｏｎ０３３２１、ＤＳＭ９７１１、ＤＳＭ９７１２、及びＤＳＭ６９５１プロテアーゼを産生するため、尿素を主要な窒素源とし、グルコースを主要な炭素源とし、ロバストな細胞増殖のため１％ソイトンを添加した、ＭＯＰｓ緩衝系の富化半合成培地で、それぞれｐＨＹＴ−Ｂｈｏｎ０３３２１、ｐＨＹＴ−ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣ、ｐＨＹＴ−ＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣ、又はＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣを含有するバチルス・スブチリス（B. subtilis）形質転換体を培養した。培地には２５ｐｐｍテトラサイクリンを添加した。インキュベート後（３２℃で２日間）、全４株の増殖培地でプロテアーゼを検出した。遠心分離及びろ過後、Ｂｈｏｎ０３３２１、ＤＳＭ９７１１、ＤＳＭ９７１２及びＤＳＭ６９５１プロテアーゼを含む培養上清を、アッセイ及び濾過に用いた。
（実施例９）
バチルス・ホリコシィ（B. horikoshii）セリンプロテアーゼのクリーニング性能
洗濯系用途に関してはＢＭＩ（綿に血液／牛乳／インクを染みこませたもの）布見本小片（ＥＭＰＡ−１１６、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及び食器系の用途に関しては卵黄（ポリアクリル布に卵黄を染みこませ、エージングし、カーボンブラック染料で染色したもの）布見本小片（ＰＡＳ−３８、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に対し、バチルス・ホリコシィ（B. horikoshii）セリンプロテアーゼＢｈｏｎ０３３２１、ＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿６９５１）、ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿９７１１）、及びＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿９７１２）のクリーニング性能を試験した。
自動食器洗浄（ＡＤＷ）クリーニングアッセイ（ＧＳＭ−Ｂ ９及びＧＳＭ−Ｂ １０．５）を、４０℃で３０分間実施した。インキュベート後、１００μＬの上清を新しいＭＴＰ（Ｃｏｓｔａｒ ９０１７）に移し、ＰＡＳ−３８布見本小片については４０５ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用い吸光度を読み取った。緩衝液のみの対照から得られた吸光度を差し引き、４０５ｎｍで得られたＯＤ値をプロテアーゼ濃度の関数としてプロットした。このデータをシグモイド曲線に代入した。
市販のＨＤＬ（ＯＭＯ Ｋｌｅｉｎ ＆ Ｋｒａｃｈｔｉｇ，Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）又はＨＤＤ（ＯＭＯ Ｃｏｌｏｒ，Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）洗剤処方による洗濯物クリーニングアッセイを２５℃で１５分間実施した。インキュベート後、１００μＬの上清を新しいＭＴＰ（Ｃｏｓｔａｒ ９０１７）に移し、４０５ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを使用して、ＢＭＩ布見本小片［血液、牛乳及びインクを染みこませたもの、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）］の吸光度を読み取った。緩衝液のみの対照から得られた吸光度を差し引き、４０５ｎｍで得られたＯＤ値をプロテアーゼ濃度の関数としてプロットした。ＨＤＬ洗剤を用いるアッセイにはウェル当たり２枚の布見本小片を使用し、ＨＤＤ洗剤を用いるアッセイはウェル当たり１枚の布見本小片を用い実施した。このデータをラングミュア曲線に代入した。ＬＧ１２系統群のプロテアーゼ：Ｂｈｏｎ０３３２１、ＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿６９５１）、ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿９７１１）、及びＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿９７１２）のクリーニング性能を図４〜７に示す。
（実施例１０）
ＬＧ１２及び相同体の安定性
高温でのインキュベート後に残存している活性を測定することにより、Ｂｈｏｎ０３３２１、ＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿６９５１）、ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿９７１１）、ＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿９７１２）、及びＬＧ１２ＳｐｒＣプロテアーゼの、４０〜８０℃の範囲の温度下、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）；２ｍＭ ＣａＣｌ２中での安定性について試験した。希釈した酵素をストレッサーと混合し、かつストレスを加えていないプロテアーゼの活性を測定した。ストレッサーに加えた希釈サンプルを高温でインキュベートし、インキュベート後に、ストレスを加えたプロテアーゼの活性を測定した。非ストレス条件に関しては、酵素の活性はＤＭＣ法で直ちに評価した（下記の通り）。ストレス条件に関しては、ＰＣＲプレートをシールし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ３８４サーモサイクラーにより５分間高温でインキュベートした後、活性についてアッセイした。ストレス付加時及び未付加時の活性を、ＤＭＣ法により評価した。
ＤＭＣアッセイに関し、使用した試薬溶液は、１００ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）中２．５％ジメチルカゼイン（ＤＭＣ，Ｓｉｇｍａ）１００ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）、０．０７５％ ＴＮＢＳＡ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とした。希釈用液：１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ−８０、０．０２％アジ化ナトリウム。ＭＴＰ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＰＳ−マイクロウェル３８４）に２０ｐｐｍプロテアーゼの上清５μＬを入れた後、２７．５μＬ ＤＭＣ基質を入れた。次に、ゆっくりと混合しながら２７．５μＬのＴＮＢＳＡを加えた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを、室温にて動態解析モードで使用して、活性をｍＯＤ／ｍｉｎで表し、４０５ｎｍで５分間にわたって活性を測定した。
緩衝液のみの対照から得られた吸光度を差し引き、４０５ｎｍで得られたＯＤ値を温度の関数としてプロットした。可能性のある場合、データを４パラメーターのロジスティック関数に代入した（ｙ＝ａ＋ｂ／（１＋（ｘ／ｃ）＾ｄ））。ＬＧ１２、Ｂｈｏｎ０３３２１、ＤＳＭ６９５１＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿６９５１）、ＤＳＭ９７１１＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿９７１１）、及びＤＳＭ９７１２＿ＳｐｒＣ（ＤＳＭ＿９７１２）プロテアーゼでは、活性の５０％が保存されているものと算出された。これらを表８に示す。
Figure 0006678108
（実施例１１）
成熟型のＬＧ１２−系統群のスブチリシン及びその他のスブリシンの系統樹
近隣結合法（ＮＪ）（Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．；及びＮｅｉ，Ｍ．（１９８７）．Ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ：ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ Ｇｕｉｄｅ Ｔｒｅｅｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ ４，４０６〜４２５）を利用して、実施例４、表５に示すＮＣＢＩでの検索により同定された成熟配列のサブセット、並びに新しく発見されたバチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）セリンプロテアーゼ：Ｂｈｏｎ０３３２１（配列番号１０）、ＤＳＭ＿９７１１（配列番号１３）、ＤＳＭ＿９７１２（配列番号１６）、及びＤＳＭ＿６９５１（配列番号１９）について、系統樹を作製した。ＮＪ法は、解析するすべての配列対間の距離行列を検討するものである。これらの距離は、配列間の相違の度合いに関係する。木構成は、以下のパラメーターを用い算出した：配列距離については木村の相関を用い、ギャップ位置は無視した。図８に示す木表示にはＭＥＧＡ６プログラムを使用した。Ｂｈｏｎ０３３２１、ＤＳＭ＿９７１１、ＤＳＭ＿９７１２、及びＤＳＭ＿６９５１の配列は、ＬＧ１２−系統群を構成する１０種のプロテアーゼのクラスターで見られる。今までのところ、ＬＧ１２−系統群のメンバーは、ＬＧ１２ｓｐｒＣ（配列番号３）、ＤＳＭ＿９７１１（配列番号１３）、ＤＳＭ＿９７１２（配列番号１６）、ＤＳＭ＿６９５１（配列番号１９）、Ｂｈｏｎ０３３２１（配列番号１０）、バチルス種（Bac sp）ＷＰ＿０１０１９２４０３．１、バチルス種（Bac sp）ＬＧ１２ＳｐｒＤ ＡＡＣ４３５８１、バチルス種（Bac sp）ＷＰ＿０１０１９２４０５．１、及びバチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８の組み合わせが同定されている。
（実施例１２）
相同体配列のアラインメント
ＬＧ１２−系統群間で同定された成熟型スブチリシン配列のアミノ酸配列：ＬＧ１２ｓｐｒＣ（配列番号３）、ＤＳＭ＿９７１１（配列番号１３）、ＤＳＭ＿９７１２（配列番号１６）、ＤＳＭ＿６９５１（配列番号１９）、Ｂｈｏｎ０３３２１（配列番号１０）、バチルス種（Bac sp）ＢＡＤ１１９８８、バチルス種（Bac sp）ＷＰ＿０１０１９２４０３．１、バチルス種（Bac sp）ＬＧ１２ＳｐｒＤ ＡＡＣ４３５８１、バチルス種（Bac sp）ＷＰ＿０１０１９２４０５．１、バチルス種（Bac sp）ＢＡＤ２１１２８を互いに及び距離から言ってより関連性のあるバチルス・レンタス（B lentus）（Ｐ２９６００）のスブチリシンに対しアライメントした。ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェア（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）をデフォルトパラメーターで使用し、ＬＧ１２ｓｐｒＣの１〜２７５番目の残基の領域についてタンパク質配列のアライメントを実施した。これらの１１種のプロテアーゼのアライメントを図９に示す。
（実施例１３）
ＬＧ１２−系統群のスブチリシンにより共有される固有の配列の同定
ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼとその他のスブチリシンプロテアーゼとの構造ベースの配列アライメントを図１０に示す。洗剤プロテアーゼのバチルス・レンタス（Bacillus lentus）（ｐｄｂ ｃｏｄｅ １ＪＥＡ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens)（ｐｄｂ ｃｏｄｅ ２ＳＴ１．Ａ）、及びバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（ｐｄｂ ｃｏｄｅ ３ＵＮＸ．Ａ）の成熟タンパク質の配列を、ＬＧ１２ｓｐｒＣ（配列番号３、ＡＡＣ４３５８０．１）及び相同体：バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）（配列番号７、ＷＰ＿０１０１９２４０３．１、旧称ＺＰ＿０７７０７６５７．１）、バチルス種（Bac sp）ＫＳＭ−ＬＤ１、ＳＡ（ＢＡＤ１１９８８．２）、バチルス種（Bac sp）ＫＳＭ−ＬＤ１、ＳＢ（ＢＡＤ２１１２８．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（２）（ＷＰ＿１０１９２４０５．１、旧称ＺＰ＿０７７０７６５８．１）、Ｂｈｏｎ０３３２１（配列番号１０）、ＤＳＭ＿９７１１、ＤＳＭ＿９７１２、ＤＳＭ＿６９５１及びＬＧ１２ｓｐｒＤ（ＡＡＣ４３５８１．１）の配列とアライメントした。
図１０には、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼの配列及びその相同体の他の洗剤プロテアーゼの配列と異なっている部分について下線を付した領域を３つ示す。あるものでは、Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、ＢＰＮ’及びバチルス・レンタス（B. lentus）などのその他の洗剤プロテアーゼに見られる非常に相同な領域の代わりに、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ及びその相同体において、５５〜５８番目の位置にＰ、Ｎ又はＤ、Ａ、及びＬが見られる。
全てのＬＧ１２−系統群のスブチリシンにより共有されているのが判明している別のものとしては、その他の市販の洗剤プロテアーゼにおいて見られるＰ及びＳ配列の代わりに、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ及びその相同体の位置８６にＹと、これに続く位置８７にＮ又はＤが見られる。そして最後に、市販の洗剤プロテアーゼで見られるＱ／Ｓ及びＹ／Ｖの代わりに、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ及びその相同体における位置１０３及び１０４にＴ及びＬが存在する。
バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、及びバチルス・レンタス（B. lentus）のスブチリシン構造について最も高い配列同一性を共有するスブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（ｐｄｂコード３ＵＮＸ．Ａ）の構造を元に、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼの相同体モデルを作製した。ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼの相同体モデルにおけるＴｙｒ８６及びＡｓｎ８７付近の構造を図１１に示す。Ｔｙｒ８６の側鎖は、Ｈｉｓ１７に対し水素結合を形成し、Ａｓｎ８７の側鎖はＴｈｒ２２に対し水素結合を形成する位置にある。上記図１０のアライメントにおいて、全てのＬＧ１２−様配列において、直前にあるＡｌａ１６とともにＨｉｓ１７が保存されており、同様にして全てのＬＧ１２ｓｐｒＣ−様配列において、直前にあるＶａｌ２１とともにＴｈｒ２２が保存されていることは興味深い。これらの水素結合は安定なループに供され、全てのＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ様酵素に共通の構造モチーフを表すことが予想される。その他に知られるスブチリシン構造において、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ及びその相同体の位置８６に対し相同な位置でＰｒｏが見られ、分子中のこの領域を安定化させる代替手段として供される。
ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ及びその相同体に同定される別の共通の配列モチーフには、Ｔｈｒ１０３及びＬｅｕ１０４の保存がある。これらの残基は、図１２に示す通り、基質結合クレフトの部分を形成する。Ｓｅｒ２２１、Ｈｉｓ６４及びＡｓｐ３２を含む触媒３残基は、Ｔｈｒ１０３及びＬｅｕ１０４残基とともにスティック図として示す。基質結合クレフトにおいて見られるはこの残基の組み合わせは、ＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼ及びＬＧ１２系統群のプロテアーゼの基質特異性に関与することが見込まれる。
ＬＧ１２−系統群の野生型酵素により共有される固有の配列モチーフとしては：２７５残基の成熟配列におけるＴｈｒ１０３、Ｌｅｕ１０４、及びＴｙｒ８６、Ａｓｐ／Ａｓｎ８７が挙げられる。更に、ＬＧ１２系統群のプロテアーゼは、Ｃ−末端に、位置２６７から始まるシグネチャモチーフを示す：Ｖ、Ｉ、Ｎ／Ｄ、Ｖ／Ｌ、Ｅ、Ｘ、Ａ、Ｌ、Ｑ、ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す。Ｖ２６７〜Ｑ２７５のこれらの配列（Ｖ、Ｉ、Ｎ／Ｄ、Ｖ／Ｌ、Ｅ、Ｘ、Ａ、Ｌ、Ｑ）は、ＬＧ１２系統群のスブチリシンに固有に見られる。
シグネチャ配列モチーフは、これまでに、全てのＬＧ１２−系統群のスブチリシンメンバーについて同定されている［ＬＧ１２ｓｐｒＣ（配列番号３、ＡＡＣ４３５８０．１）及び相同体：バチルス種（Bacillus sp.）ｍ３−１３スブチリシンＥ（１）（配列番号７、ＷＰ＿０１０１９２４０３．１、旧称ＺＰ＿０７７０７６５７．１）、バチルス種（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＬＤ１、ＳＢ（ＢＡＤ２１１２８．１）、バチルス種（Bacillus sp.)ｍ３−１３スブチリシンＥ（２）（ＷＰ＿１０１９２４０５．１、旧称ＺＰ＿０７７０７６５８．１）、Ｂｈｏｎ０３３２１（配列番号１０）、ＤＳＭ＿９７１１、ＤＳＭ＿９７１２、ＤＳＭ＿６９５１及びＬＧ１２ｓｐｒＤ（ＡＡＣ４３５８１．１）］。配列モチーフは、Ｐｒｏ５５−Ａｓｐ／Ａｓｎ５６−Ａｌａ５７−Ｌｅｕ５８及びＴｙｒ８６−Ａｓｐ／Ａｓｎ８７及びＴｈｒ１０３−Ｌｅｕ１０４から構成される。第５５〜５８番目の残基が、ＬＧ１２−ＳｐｒＣの構造で観察されるループに固有の構成を付与する。第８６〜８８番目の残基が、最終的な立体構造において空間を充填するのに対し、第１０３〜１０４番目の残基は活性部位に隣接し、この系統群においてスブチリシンの基質結合特性に影響を与えているものと考えられる。

Claims (18)

  1. ＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対しアミノ酸の変更を含む、ＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体であって、前記変更は生産的位置１６６におけるものであり、前記ＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体は、配列番号３のＢａｃｉｌｌｕｓ＿ｓｐ＿ＬＧ１２ｓｐｒＣ＿ＡＡＣ４３５８０．１；配列番号７のバチルス種（Bacillus sp.）ＷＰ０１０１９２４０３ Ｍ３−１３スブチリシン酵素Ｅ（１）；配列番号１０のバチルス種（Bacillus sp.）ＤＳＭ ８７１９スブチリシン酵素Ｂｈｏｎ０３３２１；配列番号１３のバチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１１；配列番号１６のバチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１２；配列番号１９のバチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿６９５１；配列番号２４のバチルス種（Bacillus sp.）ＬＧ１２＿ＳｐｒＤ ＡＡＣ４３５８１．１；配列番号２５のバチルス種（Bacillus sp.）ＷＰ０１０１９２４０５ Ｍ３−１３；配列番号２３のバチルス種（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＬＤ１，ＳＢ ＢＡＤ１１９８８；および／または配列番号２０のバチルス種（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＬＤ１，ＳＢ（ＢＡＤ２１１２８．１）から選択されたＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有し、前記ＬＧ１２−系統群のスブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号３に示すバチルス種（Bacillus sp.）ＬＧ１２ｓｐｒＣスブチリシンのアミノ酸配列に対応させて付番され、前記ＬＧ１２−系統群のスブチリシン変異体は、前記ＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素よりも改善された洗浄性能及び／又は安定性を有する、ＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体。
  2. 前記ＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体が、次の基準ａ）〜ｃ）のうち少なくとも１つを満たす、請求項１に記載のＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体：
    ａ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．９以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれか一つについてＰＩが１．０以上である：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；
    ｂ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．８以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれか一つについてＰＩが１．２以上である：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；
    ｃ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．５以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれか一つについてＰＩが１．５以上である：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ。
  3. 前記ＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体が、次の基準ａ）〜ｃ）のうち少なくとも１つを満たし：
    ａ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．９以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれか一つについてＰＩが１．０以上である：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；
    ｂ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．８以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれか一つについてＰＩが１．２以上である：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；
    ｃ）次の１）〜４）の試験に関し、最小性能指数（ＰＩ）がＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素に対し０．５以上であるのに加えて、これらの試験のうちのいずれか一つについてＰＩが１．５以上である：１）ｐＨ９又はｐＨ１０下でのＰＡＳ−３８布見本小片のクリーニング；及びｐＨ６、ｐＨ８、又はｐＨ１０下でのＥＭＰＡ−１１６布見本小片のクリーニングから選択された少なくとも１つのクリーニングアッセイ；２）ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡに対する活性；３）タンパク質発現；並びに４）洗剤安定性アッセイ及び熱安定性アッセイから選択される少なくとも１つの安定性アッセイ；
    ここで、前記変更は、残基１６６（Ｇ，Ｋ，Ｗ，Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ａ，Ｄ，Ｅ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｓ，Ｔ又はＹ）におけるものである、請求項１に記載のＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体。
  4. 前記ＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体の汚れ除去が、配列番号３、７、１０、１３、１６、１９、２０、２３、２４および２５から選択された前記ＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素と比較して向上されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体。
  5. 前記ＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素が、Ｓｅｒ２２１、Ｈｉｓ６４、及びＡｓｐ３２を含む触媒三残機；位置５５〜５８に由来するＰ、Ｎ／Ｄ、Ａ、Ｌモチーフ；Ｔｈｒ１０３−Ｌｅｕ１０４モチーフ；Ｔｙｒ８６−Ａｓｎ／Ａｓｐ８７モチーフ；Ａｌａ１６−Ｈｉｓ１７モチーフ；Ｖａｌ２１−Ｔｈｒ２２モチーフ；位置２６７〜２７５のＶ、Ｉ、Ｎ／Ｄ、Ｖ／Ｌ、Ｅ、Ｘ、Ａ、Ｌ、Ｑモチーフ；Ｔｙｒ８６−Ａｓｎ／Ａｓｐ８７モチーフ、及びＶａｌ２１−Ｔｈｒ２２モチーフ；および／またはＴｙｒ８６−Ａｓｎ／Ａｓｐ８７モチーフ、Ａｌａ１６−Ｈｉｓ１７モチーフ、Ｖａｌ２１−Ｔｈｒ２２モチーフを含むものであり、ここで、前記アミノ酸位置が、配列番号３に示すＬＧ１２ｓｐｒＣプロテアーゼのアミノ酸配列に対応させて付番される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体。
  6. 前記ＬＧ１２−系統群の親スブチリシン酵素が、配列番号３のＢａｃｉｌｌｕｓ＿ｓｐ＿ＬＧ１２ｓｐｒＣ＿ＡＡＣ４３５８０．１；配列番号７のバチルス種（Bacillus sp.）ＷＯ０１０１９２４０３ Ｍ３−１３スブチリシン酵素Ｅ（１）；配列番号１０のバチルス種（Bacillus sp.）ＤＳＭ ８７１９スブチリシン酵素Ｂｈｏｎ０３３２１；配列番号１３のバチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１１；配列番号１６のバチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿９７１２；配列番号１９のバチルス・ホリコシィ（Bacillus horikoshii）株ＤＳＭ＿６９５１；配列番号２４のバチルス種（Bacillus sp.）ＬＧ１２＿ＳｐｒＤ ＡＡＣ４３５８１．１；配列番号２５のバチルス種（Bacillus sp.）ＷＰ０１０１９２４０５ Ｍ３−１３；配列番号２３のバチルス種（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＬＤ１，ＳＢ ＢＡＤ１１９８８；および／または配列番号２０のバチルス種（Bacillus sp.）ＫＳＭ−ＬＤ１，ＳＢ（ＢＡＤ２１１２８．１）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体。
  7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体を少なくとも１種含む、組成物。
  8. 前記組成物が、顆粒、粉末、固体、棒状物、液体、錠剤、ジェル、単位用量又はペースト組成物である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記組成物が、クリーニング組成物である、請求項７または８に記載の組成物。
  10. 前記クリーニング組成物が、洗剤組成物である、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記洗剤組成物が、洗濯洗剤、布地柔軟化洗剤、食器洗浄洗剤、及び硬質表面クリーニング洗剤からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記組成物が、界面活性剤を更に含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記界面活性剤が、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、少なくとも１つの安定化剤；前記スブチリシン酵素を約０．００１〜約１０重量％；少なくとも１種の漂白剤；少なくとも１種の補助成分；および／またはアシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ，カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、その他のメタロプロテアーゼ酵素、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の追加の酵素又は酵素誘導体を更に含む、請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記組成物が、リン酸塩を含まない、請求項９〜１３の何れか一項に記載の組成物。
  15. 表面又は物品を、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体を少なくとも１種含むクリーニング組成物または請求項７〜１４のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程を含む、クリーニング方法。
  16. 前記表面又は物品をそれぞれ前記組成物と接触させた後に、前記表面又は物品をすすぎ洗いする工程を更に含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記物品が食器または布地である、請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 請求項１〜６のいずれか一項に記載のＬＧ１２−系統群のスブチリシン酵素変異体を含む、地加工組成物、動物飼料組成物、皮革加工組成物、羽毛加工組成物、穀物加工組成物、セルロース由来エタノール加工組成物、レンズクリーニング組成物、組織創傷清拭組成物または組織細胞培養用添加剤組成物。
JP2016542111A 2013-09-12 2014-09-11 Ｌｇ１２−系統群プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 Active JP6678108B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361877087P 2013-09-12 2013-09-12
US61/877,087 2013-09-12
PCT/US2014/055223 WO2015038792A1 (en) 2013-09-12 2014-09-11 Compositions and methods comprising lg12-clade protease variants

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2016537011A JP2016537011A (ja) 2016-12-01
JP2016537011A5 JP2016537011A5 (ja) 2017-10-19
JP6678108B2 true JP6678108B2 (ja) 2020-04-08

Family

ID=51726858

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016542111A Active JP6678108B2 (ja) 2013-09-12 2014-09-11 Ｌｇ１２−系統群プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20160222368A1 (ja)
EP (2) EP3044313B1 (ja)
JP (1) JP6678108B2 (ja)
CN (1) CN105593365B (ja)
BR (1) BR112016005286A2 (ja)
DK (1) DK3044313T3 (ja)
WO (1) WO2015038792A1 (ja)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3174724B1 (en) * 2014-07-31 2019-01-23 Kornit Digital Ltd. Process and system for continuous inkjet printing
WO2016145428A1 (en) 2015-03-12 2016-09-15 Danisco Us Inc Compositions and methods comprising lg12-clade protease variants
EP3294884B1 (en) 2015-05-13 2021-01-27 Danisco US Inc. Aprl-clade protease variants and uses thereof
CN107849549B (zh) 2015-06-17 2024-04-05 丹尼斯科美国公司 吉氏芽孢杆菌进化枝丝氨酸蛋白酶
MX2017016499A (es) * 2015-06-17 2018-03-12 Danisco Us Inc Proteasas con regiones de propeptido modificadas.
EP3371307B1 (en) 2015-11-05 2024-12-04 Danisco US Inc. Paenibacillus and bacillus spp. mannanases
WO2017079751A1 (en) 2015-11-05 2017-05-11 Danisco Us Inc Paenibacillus sp. mannanases
US20180362946A1 (en) 2015-12-18 2018-12-20 Danisco Us Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
EP3452585B1 (en) 2016-05-03 2024-11-27 Danisco US Inc. Protease variants and uses thereof
CN109072213A (zh) * 2016-05-05 2018-12-21 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
US11661567B2 (en) 2016-05-31 2023-05-30 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
EP4527923A3 (en) 2016-06-17 2025-06-11 Danisco US Inc Protease variants and uses thereof
EP3275990A1 (en) * 2016-07-28 2018-01-31 The Procter and Gamble Company Process for reblending a first liquid detergent composition into a second liquid detergent composition
EP3535365A2 (en) 2016-11-07 2019-09-11 Danisco US Inc. Laundry detergent composition
EP3559226B1 (en) 2016-12-21 2023-01-04 Danisco US Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
CN110312795B (zh) 2016-12-21 2024-07-23 丹尼斯科美国公司 蛋白酶变体及其用途
CN110621778A (zh) 2017-03-15 2019-12-27 丹尼斯科美国公司 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其用途
CA3057713A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Danisco Us Inc Alpha-amylase combinatorial variants
CN111212906B (zh) 2017-08-18 2024-02-02 丹尼斯科美国公司 α-淀粉酶变体
CN111373039A (zh) 2017-11-29 2020-07-03 丹尼斯科美国公司 具有改善的稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体
WO2019245705A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants
WO2019245704A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants
CN112805361A (zh) 2018-07-31 2021-05-14 丹尼斯科美国公司 具有降低广义酸的PKA的氨基酸取代的变体α-淀粉酶
JP2022503923A (ja) 2018-09-27 2022-01-12 ダニスコ・ユーエス・インク 医療用器具を洗浄するための組成物
US20210355469A1 (en) 2018-10-12 2021-11-18 Danisco Us Inc Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants
WO2020112599A1 (en) 2018-11-28 2020-06-04 Danisco Us Inc Subtilisin variants having improved stability
CN109949867B (zh) * 2019-01-25 2023-05-30 中国农业科学院特产研究所 一种多条序列比对算法的优化方法和系统、存储介质
US20220220419A1 (en) 2019-05-24 2022-07-14 Danisco Us Inc Subtilisin variants and methods of use
WO2020247582A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Danisco Us Inc Methods and compositions for cleaning
EP4048683A2 (en) 2019-10-24 2022-08-31 Danisco US Inc Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
CN111575265B (zh) * 2020-05-22 2022-07-22 江南大学 一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体
US20240034960A1 (en) 2020-08-27 2024-02-01 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2022165107A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Danisco Us Inc Compositions for cleaning and methods related thereto
US20240294888A1 (en) 2021-06-30 2024-09-05 Danisco Us Inc. Variant enzymes and uses thereof
EP4396320A2 (en) 2021-09-03 2024-07-10 Danisco US Inc. Laundry compositions for cleaning
EP4448749A2 (en) 2021-12-16 2024-10-23 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods of use
EP4448751A2 (en) 2021-12-16 2024-10-23 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods of use
CN118715318A (zh) 2021-12-16 2024-09-27 丹尼斯科美国公司 枯草杆菌蛋白酶变体及其用途
CA3241094A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Jonathan LASSILA Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
WO2023168234A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
AU2023272468A1 (en) 2022-05-14 2024-11-14 Novonesis Plant Biosolutions A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN119487167A (zh) 2022-06-21 2025-02-18 丹尼斯科美国公司 用于清洁的包含具有嗜热菌蛋白酶活性的多肽的组合物和方法
CN119816592A (zh) 2022-09-02 2025-04-11 丹尼斯科美国公司 甘露聚糖酶变体和使用方法
EP4581138A1 (en) 2022-09-02 2025-07-09 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods related thereto
EP4581119A1 (en) 2022-09-02 2025-07-09 Danisco US Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024102698A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
DE102022213538A1 (de) 2022-12-13 2024-06-13 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und reinigungsmittel enthaltend protease
DE102022213537A1 (de) 2022-12-13 2024-06-13 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und reinigungsmittel enthaltend protease
WO2024163584A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2024186819A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2024191711A1 (en) 2023-03-16 2024-09-19 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Brevibacillus fermentate extracts for cleaning and malodor control and use thereof
WO2025071996A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 Danisco Us Inc. Variant cutinase enzymes with improved solubility and uses thereof
WO2025085351A1 (en) 2023-10-20 2025-04-24 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US202535A (en) 1878-04-16 Improvement in devices for supplying feed-water to boilers
GB1296839A (ja) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
GB2048606B (en) 1979-02-28 1983-03-16 Barr & Stroud Ltd Optical scanning system
US4302544A (en) 1979-10-15 1981-11-24 University Of Rochester Asporogenous mutant of B. subtilis for use as host component of HV1 system
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
GR76237B (ja) 1981-08-08 1984-08-04 Procter & Gamble
US4450235A (en) 1982-04-21 1984-05-22 Cpc International Inc. Asporogenic mutant of bacillus subtilis useful as a host in a host-vector system
US4561998A (en) 1982-05-24 1985-12-31 The Procter & Gamble Company Near-neutral pH detergents containing anionic surfactant, cosurfactant and fatty acid
US4550862A (en) 1982-11-17 1985-11-05 The Procter & Gamble Company Liquid product pouring and measuring package with self draining feature
US4597898A (en) 1982-12-23 1986-07-01 The Proctor & Gamble Company Detergent compositions containing ethoxylated amines having clay soil removal/anti-redeposition properties
US4760025A (en) 1984-05-29 1988-07-26 Genencor, Inc. Modified enzymes and methods for making same
US4515707A (en) 1983-06-27 1985-05-07 The Chemithon Corporation Intermediate product for use in producing a detergent bar and method for producing same
EP0134048B2 (en) 1983-07-06 1996-08-14 Gist-Brocades N.V. Molecular cloning and expression in industrial microorganism species
US4515705A (en) 1983-11-14 1985-05-07 The Procter & Gamble Company Compositions containing odor purified proteolytic enzymes and perfumes
US4537706A (en) 1984-05-14 1985-08-27 The Procter & Gamble Company Liquid detergents containing boric acid to stabilize enzymes
US5801038A (en) 1984-05-29 1998-09-01 Genencor International Inc. Modified subtilisins having amino acid alterations
US5972682A (en) * 1984-05-29 1999-10-26 Genencor International, Inc. Enzymatically active modified subtilisins
US5264366A (en) 1984-05-29 1993-11-23 Genencor, Inc. Protease deficient bacillus
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
DK154572C (da) 1985-08-07 1989-04-24 Novo Industri As Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler
US4933287A (en) 1985-08-09 1990-06-12 Gist-Brocades N.V. Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US4810414A (en) 1986-08-29 1989-03-07 Novo Industri A/S Enzymatic detergent additive
GB8629837D0 (en) 1986-12-13 1987-01-21 Interox Chemicals Ltd Bleach activation
US4765916A (en) 1987-03-24 1988-08-23 The Clorox Company Polymer film composition for rinse release of wash additives
US4972017A (en) 1987-03-24 1990-11-20 The Clorox Company Rinse soluble polymer film composition for wash additives
WO1988009367A1 (en) 1987-05-29 1988-12-01 Genencor, Inc. Cutinase cleaning composition
ES2076939T3 (es) 1987-08-28 1995-11-16 Novo Nordisk As Lipasa recombinante de humicola y procedimiento para la produccion de lipasas recombinantes de humicola.
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
DE68924654T2 (de) 1988-01-07 1996-04-04 Novonordisk As Spezifische Protease.
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US4977252A (en) 1988-03-11 1990-12-11 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Modified starch emulsifier characterized by shelf stability
US4968451A (en) 1988-08-26 1990-11-06 The Procter & Gamble Company Soil release agents having allyl-derived sulfonated end caps
WO1990009446A1 (en) 1989-02-17 1990-08-23 Plant Genetic Systems N.V. Cutinase
WO1991016422A1 (de) 1990-04-14 1991-10-31 Kali-Chemie Aktiengesellschaft Alkalische bacillus-lipasen, hierfür codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren
US5354559A (en) 1990-05-29 1994-10-11 Grain Processing Corporation Encapsulation with starch hydrolyzate acid esters
DE69133035T2 (de) 1991-01-16 2003-02-13 The Procter & Gamble Company, Cincinnati Kompakte Waschmittelzusammensetzungen mit hochaktiven Cellulasen
GB9108136D0 (en) 1991-04-17 1991-06-05 Unilever Plc Concentrated detergent powder compositions
US5340735A (en) 1991-05-29 1994-08-23 Cognis, Inc. Bacillus lentus alkaline protease variants with increased stability
ES2174853T3 (es) * 1992-09-24 2002-11-16 Genencor Int Composiciones limpiadoras que contienen nuevas proteasas alcalinas.
CA2150562A1 (en) 1992-12-01 1994-06-09 Palle Schneider Enhancement of enzyme reactions
WO1994016048A1 (en) 1993-01-18 1994-07-21 The Procter & Gamble Company Machine dishwashing detergent compositions
WO1994026859A1 (de) 1993-05-08 1994-11-24 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien Silberkorrosionsschutzmittel i
DE59408548D1 (de) 1993-05-08 1999-09-02 Henkel Kgaa Silberkorrosionsschutzmittel ii
DK77393D0 (da) 1993-06-29 1993-06-29 Novo Nordisk As Aktivering af enzymer
US5698504A (en) 1993-07-01 1997-12-16 The Procter & Gamble Company Machine dishwashing composition containing oxygen bleach and paraffin oil and benzotriazole compound silver tarnishing inhibitors
US5486303A (en) 1993-08-27 1996-01-23 The Procter & Gamble Company Process for making high density detergent agglomerates using an anhydrous powder additive
DE4342680A1 (de) 1993-12-15 1995-06-22 Pfeiffer Erich Gmbh & Co Kg Austragvorrichtung für Medien
US5861271A (en) 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
ES2364774T3 (es) 1994-02-24 2011-09-14 HENKEL AG & CO. KGAA Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen.
US5691295A (en) 1995-01-17 1997-11-25 Cognis Gesellschaft Fuer Biotechnologie Mbh Detergent compositions
DE69535736T2 (de) 1994-02-24 2009-04-30 Henkel Ag & Co. Kgaa Verbesserte enzyme und diese enthaltene detergentien
US5686014A (en) 1994-04-07 1997-11-11 The Procter & Gamble Company Bleach compositions comprising manganese-containing bleach catalysts
PE6995A1 (es) 1994-05-25 1995-03-20 Procter & Gamble Composicion que comprende un polimero de polialquilenoamina etoxilado propoxilado como agente de separacion de sucio
ES2180645T3 (es) 1994-06-17 2003-02-16 Genencor Int Metodo de limpieza basado en composiciones que contienen una enzima capaz de degradar las paredes celulares de las plantas y su uso en metodos de limpieza.
GB2294268A (en) 1994-07-07 1996-04-24 Procter & Gamble Bleaching composition for dishwasher use
US5879584A (en) 1994-09-10 1999-03-09 The Procter & Gamble Company Process for manufacturing aqueous compositions comprising peracids
US5516448A (en) 1994-09-20 1996-05-14 The Procter & Gamble Company Process for making a high density detergent composition which includes selected recycle streams for improved agglomerate
US5691297A (en) 1994-09-20 1997-11-25 The Procter & Gamble Company Process for making a high density detergent composition by controlling agglomeration within a dispersion index
US5489392A (en) 1994-09-20 1996-02-06 The Procter & Gamble Company Process for making a high density detergent composition in a single mixer/densifier with selected recycle streams for improved agglomerate properties
DE69515331T2 (de) 1994-12-09 2000-10-19 The Procter & Gamble Company, Cincinnati Diacylperoxydteilchen enthaltende zusammensetzungen für automatische geschirreinigung
US5534179A (en) 1995-02-03 1996-07-09 Procter & Gamble Detergent compositions comprising multiperacid-forming bleach activators
US5574005A (en) 1995-03-07 1996-11-12 The Procter & Gamble Company Process for producing detergent agglomerates from high active surfactant pastes having non-linear viscoelastic properties
US5569645A (en) 1995-04-24 1996-10-29 The Procter & Gamble Company Low dosage detergent composition containing optimum proportions of agglomerates and spray dried granules for improved flow properties
US5597936A (en) 1995-06-16 1997-01-28 The Procter & Gamble Company Method for manufacturing cobalt catalysts
JP4592832B2 (ja) 1995-06-16 2010-12-08 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー コバルト触媒を含む自動皿洗い組成物
US5565422A (en) 1995-06-23 1996-10-15 The Procter & Gamble Company Process for preparing a free-flowing particulate detergent composition having improved solubility
WO1997004160A1 (en) 1995-07-19 1997-02-06 Novo Nordisk A/S Treatment of fabrics
US5576282A (en) 1995-09-11 1996-11-19 The Procter & Gamble Company Color-safe bleach boosters, compositions and laundry methods employing same
ES2261305T3 (es) 1995-09-18 2006-11-16 THE PROCTER & GAMBLE COMPANY Sistema de liberacion de perfume.
MA24137A1 (fr) 1996-04-16 1997-12-31 Procter & Gamble Fabrication d'agents de surface ramifies .
US5929022A (en) 1996-08-01 1999-07-27 The Procter & Gamble Company Detergent compositions containing amine and specially selected perfumes
CN1262632C (zh) 1997-03-07 2006-07-05 普罗格特-甘布尔公司 含有金属漂白催化剂和漂白活化剂和/或有机过羧酸的漂白组合物
WO1998039335A1 (en) 1997-03-07 1998-09-11 The Procter & Gamble Company Improved methods of making cross-bridged macropolycycles
GB2327947A (en) 1997-08-02 1999-02-10 Procter & Gamble Detergent tablet
US6376445B1 (en) 1997-08-14 2002-04-23 Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising a mannanase and a protease
MA25044A1 (fr) 1997-10-23 2000-10-01 Procter & Gamble Compositions de lavage contenant des variants de proteases multisubstituees.
US5935826A (en) 1997-10-31 1999-08-10 National Starch And Chemical Investment Holding Corporation Glucoamylase converted starch derivatives and their use as emulsifying and encapsulating agents
WO1999027082A1 (en) 1997-11-21 1999-06-03 Novo Nordisk A/S Protease variants and compositions
DK1042501T3 (da) 1997-12-24 2007-08-13 Genencor Int Fremgangsmåde til analyse af vaskeevnen af et enzym
CA2331199C (en) 1998-06-10 2012-10-23 Markus Sakari Kauppinen Isolated mannanases for use in treating cellulosic or synthetic fibers
US6376450B1 (en) 1998-10-23 2002-04-23 Chanchal Kumar Ghosh Cleaning compositions containing multiply-substituted protease variants
US6294514B1 (en) 1998-11-24 2001-09-25 The Procter & Gamble Company Process for preparing mono-long chain amine oxide surfactants with low nitrite, nitrosamine and low residual peroxide
CA2348893A1 (en) 1998-11-30 2000-06-08 The Procter & Gamble Company Process for preparing cross-bridged tetraaza macrocycles
US6440991B1 (en) 2000-10-02 2002-08-27 Wyeth Ethers of 7-desmethlrapamycin
US6582914B1 (en) 2000-10-26 2003-06-24 Genencor International, Inc. Method for generating a library of oligonucleotides comprising a controlled distribution of mutations
GB0114847D0 (en) 2001-06-18 2001-08-08 Unilever Plc Water soluble package and liquid contents thereof
EP1321513A1 (en) * 2001-12-21 2003-06-25 Direvo Biotech AG Subtilisin variants with improved characteristics
JP4212340B2 (ja) * 2002-11-01 2009-01-21 花王株式会社 アルカリプロテアーゼ
JP2004313043A (ja) * 2003-04-14 2004-11-11 Kao Corp アルカリプロテアーゼ
ATE387487T1 (de) 2003-05-23 2008-03-15 Procter & Gamble Waschmittelzusammensetzung zum gebrauch in einer textilwasch- oder geschirrspülmaschine
ES2375360T3 (es) 2003-11-06 2012-02-29 Danisco Us Inc. Péptidos soportados y de unión a vegf para tratar enfermedades de la piel.
CN1981035B (zh) 2003-12-03 2011-06-08 金克克国际有限公司 过水解酶
CN101341248B (zh) 2005-10-12 2015-05-13 金克克国际有限公司 储存稳定的中性金属蛋白酶的用途和制备
EP2038394A2 (en) 2006-06-05 2009-03-25 The Procter & Gamble Company Enzyme stabilizer
NZ573467A (en) 2006-07-18 2012-02-24 Danisco Us Inc Genencor Div Subtilisin variants active over a broad temperature range
EP2100947A1 (en) 2008-03-14 2009-09-16 The Procter and Gamble Company Automatic dishwashing detergent composition
EP2647702A3 (en) * 2008-06-06 2013-12-25 The Procter and Gamble Company Compositions and methods comprising variant microbial proteases
BR112014010045B1 (pt) 2011-10-28 2021-12-21 Danisco Us Inc Polipeptídeo de alfa-amilase variante formadoras de malto-hexaose, composição compreendendo o mesmo, célula hospedeira, e métodos para remover uma mancha ou sujeira amilácea, para sacarificar uma composição que compreende amido, produção de uma composição alimentícia de desengomagem de um têxtil

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015038792A1 (en) 2015-03-19
JP2016537011A (ja) 2016-12-01
EP3044313A1 (en) 2016-07-20
EP3044313B1 (en) 2019-11-06
DK3044313T3 (da) 2020-02-17
EP3653707B1 (en) 2025-07-16
BR112016005286A2 (pt) 2017-09-12
CN105593365B (zh) 2021-08-27
US20160222368A1 (en) 2016-08-04
CN105593365A (zh) 2016-05-18
EP3653707A1 (en) 2020-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6678108B2 (ja) Ｌｇ１２−系統群プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法
US12305205B2 (en) AprL-clade protease variants and uses thereof
US10696958B2 (en) Metalloproteases
US20200407703A1 (en) Serine proteases of bacillus species
EP3268471B1 (en) Compositions and methods comprising lg12-clade protease variants
US20180080017A1 (en) Novel metalloproteases
JP2018138028A (ja) サーモリシンプロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170908

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20170908

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180828

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20181126

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190128

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190226

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20190521

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190718

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190917

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191211

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20200218

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20200316

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6678108

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250