JP6618908B2 - 免疫抑制を低減又は軽減するためのｃｄ９６阻害抗体又は抗体断片の使用 - Google Patents

Description

本発明は、免疫受容体ＣＤ９６に関する。より詳しくは、本発明は、ＣＤ９６を阻害することにより、腫瘍、及び免疫系を回避し得る他の疾患又は状態を標的とする免疫系の能力を増強することに関する。

生産的な免疫応答の進行は、幾つかの免疫チェックポイントの通過を必要とする。通過には、興奮性共刺激シグナルの存在、又は負のシグナル若しくは共抑制シグナルの回避を必要とする場合があり、これらは免疫活性を低下又は停止させるように作用する。免疫グロブリンスーパーファミリーは、この協調的な免疫応答に中心的な重要性を有しており、ＣＤ２８／細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）：Ｂ７．１／Ｂ７．２受容体／リガンド型は、そうした免疫調節因子の原型的な例である。これらチェックポイントの役割は、部分的には、不要で有害な自己に対する活性の可能性を警戒することである。自己免疫の予防を支援するこの機能は、必要なものではあるが、それらが由来する細胞と同じ一連の表面分子を主に提示する悪性自己細胞の標的化を目的とする免疫療法を成功させるためには障害として作用する場合がある。特にＴ細胞の抑制チェックポイントを阻止することにより、こうした末梢寛容機序の克服を目的とする療法は、単独療法として、又は免疫系に対する腫瘍エピトープの提示を直接的又は間接的に増強する他の療法との相乗作用としてのいずれの場合でも、抗腫瘍活性をもたらす可能性を提供する。そのような抗Ｔ細胞チェックポイント抗体は、ヒト進行癌の初期臨床試験で有望であることが示されている。

更に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、初期腫瘍増殖及び転移を制限するために重要な先天性リンパ球である（非特許文献１）。また、ＮＫ細胞の機能は、広範な活性化及び抑制性受容体により伝達されるシグナルを統合することにより制御される（非特許文献２）。例えば、ＮＣＲ、ＮＫＧ２Ｄ、又はＤＮＡＭ−１等の活性化受容体により病原体由来リガンド又はストレス誘導性リガンドが認識されると、ＮＫ細胞の細胞毒性、及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）等の炎症促進性メディエータの分泌が刺激される（非特許文献３）。対照的に、抑制性受容体は、標的細胞をＮＫ細胞媒介性細胞死から保護する（非特許文献４）。これら受容体は、主にＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスI関連分子を認識する。これら受容体には、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）ファミリー及びＬＩＲ（白血球免疫グロブリン様受容体）ファミリー、マウスのＬｙ４９ファミリー、及び両種のＣＤ９４／ＮＫＧ２ヘテロダイマーが含まれる。

最近は、ネクチン及びネクチン様（ｎｅｃｌ）ファミリーのリガンドと相互作用する免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーという新しいグループが、ＮＫ細胞及びＴ細胞の機能に影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献５）。これらには、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ−１）（非特許文献６）、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）（非特許文献７）、ＴＩＧＩＴ（Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン）（非特許文献８、９）、及びＣＲＴＡＭ（クラスＩ制限Ｔ細胞関連分子）（非特許文献１０）が含まれる。ＤＮＡＭ−１及びＴＩＧＩＴは、このファミリーの最も広範に研究されているメンバーであり、共通のリガンドであるＣＤ１５５（ｎｅｃｌ−５；ＰＶＲ）及びＣＤ１１２（ネクチン−２；ＰＶＲＬ２）を共有する（非特許文献８、１１）。ＴＩＧＩＴは、更なるリガンドＣＤ１１３（ＰＶＲＬ３）にも結合する（非特許文献８）。ＮＫ細胞に対するＤＮＡＭ−１及びＴＩＧＩＴの機能は、カウンターバランスであると報告されている（非特許文献１２）。ＤＮＡＭ−１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、幅広い腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性を増強し（非特許文献１３、１４）、ｉｎ ｖｉｖｏでは、腫瘍免疫監視に重要である（非特許文献１３、１５、１６）。対照的に、ＴＩＧＩＴは、ＩＴＩＭモチーフを有し、抑制性Ｌｙ４９又はＫＩＲとＭＨＣクラスＩとの相互作用と同様に、自己組織損傷を防止すると提唱されている（非特許文献１７）。実際、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＴＩＧＩＴがＣＤ１５５と結合すると、ＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生及び細胞毒性が制限されることが示されている（非特許文献１８、１９）。しかしながら、他のネクチン受容体ＤＮＡＭ−１及びＣＤ９６に対する、ＮＫ細胞生物学におけるＴＩＧＩＴの役割は、ｉｎ ｖｉｖｏでは評価されていない。

２０年前にクローニングされているにも関わらず（非特許文献７）、ＤＮＡＭ−１及びＴＩＧＩＴとＣＤ１５５リガンドを共有する別のＩｇファミリーメンバーであるＣＤ９６についてはほとんど知られていない（非特許文献２０、２１）。ヒトの場合、ＣＤ９６の発現は、主にＮＫ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、及びＣＤ４ Ｔ細胞に限定されている（非特許文献７）。ＣＤ９６の主要なリガンドはＣＤ１５５であるが、ＣＤ９６は、ＣＤ１１１（ネクチン−１）と結合し、ＮＫ細胞及びＴ細胞接着の促進に役割を果たすことも報告されている（非特許文献２１、２２）。

Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ．，Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ，Ｅ．，Ｂａｒａｔｉｎ，Ｍ．，Ｗａｌｚｅｒ，Ｔ．＆Ｕｇｏｌｉｎｉ，Ｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９巻、５０３〜５１０頁（２００８年） Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．Ｕｐ ｏｎ ｔｈｅ ｔｉｇｈｔｒｏｐｅ：ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９巻、４９５〜５０２頁（２００８年） Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｍｙｔｈ，Ｍ．Ｊ．＆Ｍａｒｔｉｎｅｔ，Ｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ．Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（２０１３年） Ｒａｕｌｅｔ，Ｄ．Ｈ．＆Ｖａｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．Ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ ６巻、５２０〜５３１頁（２００６年） Ｆｕｃｈｓ，Ａ．＆Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｃｔｉｎ ａｎｄ ｎｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １６巻、３５９〜３６６頁（２００６年） Ｓｈｉｂｕｙａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．ＤＮＡＭ−１，ａ ｎｏｖｅｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４巻、５７３〜５８１頁（１９９６年） Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｌ．，Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｓ．，Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．＆Ｋｒｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｍ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔａｃｔｉｌｅ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｔｈａｔ ｉｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｇ ｇｅｎｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８巻、２６００〜２６０８頁（１９９２年） Ｙｕ，Ｘ．ら、Ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＩＧＩＴ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０巻、４８〜５７頁（２００９年） Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｓ．ら、Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ＤＣ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３９巻、６９５〜７０３頁（２００９年） Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｊ．ら、Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｌａｓｓ−Ｉ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＣＲＴＡＭ）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ６７巻、７２５〜７３４頁（２０００年） Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．ら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＶＲ（ＣＤ１５５） ａｎｄ Ｎｅｃｔｉｎ−２（ＣＤ１１２） ａｓ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６） ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９８巻、５５７〜５６７頁（２００３年） Ｌｏｚａｎｏ，Ｅ．，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ−Ｖｉｌｌａｒ，Ｍ．，Ｋｕｃｈｒｏｏ，Ｖ．＆Ｈａｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｔｈｅ ＴＩＧＩＴ／ＣＤ２２６ ａｘｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８８巻、３８６９〜３８７５頁（２０１２年） Ｌａｋｓｈｍｉｋａｎｔｈ，Ｔ．ら、ＮＣＲｓ ａｎｄ ＤＮＡＭ−１ ｍｅｄｉａｔｅ ＮＫ ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １１９巻、１２５１〜１２６３頁（２００９年） Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｊ．ら、ＤＮＡＭ−１／ＣＤ１５５ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｏｒｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８４巻、９０２〜９１１頁（２０１０年） Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ，Ｓ．ら、ＤＮＡＭ−１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｎｏｎｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０５巻、２９６５〜２９７３頁（２００８年） Ｉｇｕｃｈｉ−Ｍａｎａｋａ，Ａ．ら、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ＤＮＡＭ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０５巻、２９５９〜２９６４頁（２００８年） Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ，Ｎ．ら、Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＩＧＩＴ ｗｉｔｈ ＰＶＲ ａｎｄ ＰＶＲＬ２ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｕｍａｎ ＮＫ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １０６巻、１７８５８〜１７８６３頁（２００９年） Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ，Ｎ．ら、Ｍｏｕｓｅ ＴＩＧＩＴ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＫ−ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｕｐｏｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＰＶＲ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１３年） Ｌｉｕ，Ｓ．ら、Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｒｂ２ ａｎｄ ＳＨＩＰ１ ｂｙ ｔｈｅ ＩＴＴ−ｌｉｋｅ ｍｏｔｉｆ ｏｆ ＴＩＧＩＴ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｇｒａｎｕｌｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２０巻、４５６〜４６４頁（２０１３年） Ｆｕｃｈｓ，Ａ．，Ｃｅｌｌａ，Ｍ．，Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．＆Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．Ｐａｒａｄｏｘｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＮＫｐ４４．Ｂｌｏｏｄ １０６巻、２０７６〜２０８２頁（２００５年） Ｓｅｔｈ，Ｓ．ら、Ｔｈｅ ｍｕｒｉｎｅ ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ ＣＤ９６ ｉｓ ａｎ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ＣＤ１５５ ａｎｄ ｎｅｃｔｉｎ−１．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３６４巻、９５９〜９６５頁（２００７年） Ｆｕｃｈｓ，Ａ．，Ｃｅｌｌａ，Ｍ．，Ｇｉｕｒｉｓａｔｏ，Ｅ．，Ｓｈａｗ，Ａ．Ｓ．＆Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｍ．Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ＣＤ９６（ｔａｃｔｉｌｅ）ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＮＫ ｃｅｌｌ−ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＤ１５５）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２巻、３９９４〜３９９８頁（２００４年）

驚くべきことに、本発明者らは、ＣＤ９６が、Ｔ細胞抗腫瘍機能及びＮＫ細胞抗腫瘍機能の負の調節因子として作用することを発見した。したがって、本発明は、概して、ＣＤ９６を少なくとも部分的に阻止又は阻害することにより、ＣＤ９６媒介性免疫抑制を低減又は軽減して、哺乳動物の免疫監視を強化又は回復させる作用剤の使用に関する。ある実施形態では、これは、癌及び／又はウイルス感染症等の、ＣＤ９６の少なくとも部分的な阻止又は阻害に応答する疾患又は状態の治療を容易にすることができる。

第１の態様では、本発明は、哺乳動物の免疫抑制を低減又は軽減する方法であって、哺乳動物の１つ又は複数の細胞のＣＤ９６活性を少なくとも部分的に阻害又は低減することにより、哺乳動物の免疫抑制を軽減、及び／又は免疫監視を強化若しくは回復させるステップを含む方法を提供する。

好適には、哺乳動物のＣＤ９６活性を阻害又は低減するステップは、哺乳動物のＣＤ９６発現細胞を死滅させることを含まないか又はそれに少なくとも依存しない。幾つかの実施形態では、哺乳動物のＣＤ９６活性を阻害又は低減するステップは、ＣＤ１５５に対するＣＤ９６の結合を阻害又は低減すること、及び／又はＣＤ９６を発現する哺乳動物の１つ又は複数の細胞の細胞内シグナル伝達を阻害又は低減することを含む。幾つかの実施形態では、哺乳動物のＣＤ９６活性を阻害又は低減するステップは、ＣＤ９６の細胞表面発現を除去及び／又は下方制御することを含む。

１つの特定の実施形態では、哺乳動物のＣＤ９６活性を阻害又は低減するステップは、１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインの発現、産生、及び／又は分泌を増加又は増強することを含む。好ましくは、サイトカインは、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）である。典型的には、哺乳動物の１つ又は複数の細胞は、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むＴ細胞である。

好ましい実施形態では、本方法は、哺乳動物の免疫抑制を軽減することにより、及び／又は免疫監視を強化若しくは回復させることにより、哺乳動物の癌又は癌転移を治療又は予防する。

他の実施形態では、本方法は、哺乳動物の免疫抑制を軽減することにより、及び／又は免疫監視を強化若しくは回復させることにより、哺乳動物のウイルス感染症を治療又は予防する。

第２の態様では、本発明は、ＣＤ９６阻害剤を、スクリーニング、設計、遺伝子操作、又は他の手段で製造するための方法であって、候補分子が、ＣＤ９６活性を少なくとも部分的に阻害又は低減することにより、哺乳動物の免疫抑制を軽減することが可能であるか否か、及び／又は免疫監視を強化若しくは回復させることが可能であるか否かを決定するステップを含む方法を提供する。

第３の態様では、本発明は、第２の態様の方法によりスクリーニング、設計、遺伝子操作、又は他の手段で製造されたＣＤ９６阻害剤を提供する。
１つの実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は、抗体又は抗体断片である。

１つの特定の実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は抗癌剤である。
別の特定の実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は抗ウイルス剤である。
第４の態様では、本発明は、第１の態様の方法に従って使用するための、第３の態様によるＣＤ９６阻害剤を提供する。

前述の態様によると、哺乳動物は、ヒトであることが好適である。
状況が別様に要求しない限り、用語「含む」、又は類似の用語は、非限定的な包含を意味することが意図されており、要素又は特徴を列挙したリストは、記載又は列挙されている要素のみを含むのではなく、列挙又は記載されていない他の要素又は特徴を含む場合がある。

不定冠詞「１つの」は、本明細書では、単数又は複数の要素又は特徴を参照又は包含するように使用されており、要素又は特徴が「１つ」又は「単一」であることを意味又は規定するものと解釈されるべきではない。

ＣＤ９６は、ＣＤ１５５結合をＤＮＡＭ−１と競合する。ａ、ｂ Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴ（薄灰色）及びＣＤ９６^−／−マウス（暗灰色）に由来する表示の脾臓リンパ球集団でのＣＤ９６の発現をフローサイトメトリーで分析した。代表的なＦＡＣＳヒストグラム（ａ）及び３つの実験のうち１つの代表的な実験の３匹のマウスの平均±ＳＤ（ｂ）が示されている。ｃ、ｄ 新しく単離したか又はＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で４８時間活性化したＷＴ脾臓ＮＫ細胞での、ＣＤ９６、ＤＮＡＭ−１、及びＴＩＧＩＴの発現を測定した。ｅ．ＷＴ、ＣＤ９６^−／−、ＤＮＡＭ−１^−／−、又はＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−マウスから新しく単離した精製ＮＫ細胞に対する、ＡＦ−６４７結合マウスＣＤ１５５−Ｆｃの結合を、表示されている濃度で、フローサイトメトリーにより評価した。ｆ．精製ＷＴ ＮＫ細胞に対する、ＡＦ−６４７結合ＣＤ１５５−Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）の結合を、抗ＣＤ９６ｍＡｂ又は抗ＤＮＡＭ−１ｍＡｂの存在下で分析した。ｇ．ＢＭＤＣの細胞表面でのＡＦ−６４７標識ＤＮＡＭ−１−Ｆｃ（０．５〜１０μｇ／ｍｌ）の結合を、５０μｇ／ｍｌの対照Ｉｇ、組換えＣＤ９６、又はＴＩＧＩＴ−Ｆｃの存在下で分析した。ｃ〜ｇ．代表的なＦＡＣＳヒストグラム、及び少なくとも３つの実験のうち１つの代表的な実験の三重反復ウェルの平均±ＳＤが示されている。^＊＊＊ｐ＜０．００１ スチューデントＴ検定。 ＣＤ１５５に対するＣＤ９６の結合は、ＮＫ細胞でのＩＦＮγ産生を制御する。ＣＤ１５５−Ｆｃに対するＣＤ９６の結合は、外来性サイトカイン（ａ、ｂ、ｄ）及びＮＫ細胞受容体（ｃ）により誘導されるＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの産生を制限する。ａ、ｂ、ｄ．本発明者らは、ＣＤ１５５−Ｆｃ（０．５μｇ／ウェル）を用いて又は用いずにコーティングしたプレートを使用して、抗ＣＤ９６（５０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、ＩＬ−１２（２５〜１００ｐｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）に応答する、新しく精製したＣＤ９６^−／−、ＴＩＧＩＴ^−／−、及びＷＴ ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの細胞内産生を分析した。ｃ．本発明者らは、抗ＮＫ１．１（２．５μｇ／ウェル）及びＣＤ１５５−Ｆｃ（０．５μｇ／ウェル）でコーティングしたプレートを使用して、ＣＤ９６^−／−及びＷＴマウスに由来するＩＬ−２活性化ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの細胞内産生を分析した。代表的なＦＡＣＳヒストグラム（ａ）、及び３つの実験うち１つの代表的な実験の三重反復ウェルの平均±ＳＤ（ｂ、ｃ、ｄ）が示されている。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントＴ検定。 ＣＤ９６は、ＮＫ細胞依存性腫瘍免疫監視を制限する。ａ、ｂ．ＣＤ９６及びＤＮＡＭ−１は、Ｂ１６Ｆ１０転移の制御に逆の役割を有する。ａ．２×１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞を、ＷＴ、ＣＤ９６^−／−、ＤＮＡＭ−１^−／−、及びＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−マウスに静脈内注射し、１４日後に肺の転移量を定量した。３つの実験のうち代表的な実験。ｂ．２×１０^５個及び５×１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞を注射した２週間後の、ＷＴ及びＣＤ９６^−／−マウスの肺を示す画像。２つの実験うちの代表的な実験。ｃ．ＣＤ９６及びＴＩＧＩＴは、Ｂ１６Ｆ１０の細胞表面でのＣＤ１５５の結合をＤＮＡＭ−１と競合する。Ｂ１６Ｆ１０細胞の細胞表面でのＡＦ−６４７標識ＤＮＡＭ−１−Ｆｃ（０．５〜２０μｇ／ｍｌ）の結合を、５０μｇ／ｍｌの対照Ｉｇ、組換えＣＤ９６、又はＴＩＧＩＴ−Ｆｃの存在下で分析した。ＦＡＣＳヒストグラム、及び３つの実験うち１つの代表的な実験の三重反復ウェルの平均±ＳＤが示されている。ｄ．４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイを、表示されているエフェクター標的比にて、Ｂ１６Ｆ１０細胞と、ＷＴ、ＤＮＡＭ−１^−／−、及びＣＤ９６^−／−マウスに由来するＩＬ−２活性化ＮＫ細胞との間で実施した。黒い円はＷＴ ＮＫ細胞を表し、白抜き円はＣＤ９６^−／−ＮＫ細胞を表し、黒い正方形はＤＮＡＭ−１^−／−ＮＫ細胞を表す。ｅ〜ｈ．ＣＤ９６及びＤＮＡＭ−１は、ＮＫ細胞により媒介されるＭＣＡ誘導性線維肉腫の免疫監視において逆の役割を有する。ｅ〜ｈ １５〜３０匹の雄ＷＴ、ＤＮＡＭ−１^−／−、及びＣＤ９６^−／−、及びＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−マウスの群に、ＭＣＡ（１００μｇ／マウス）を注射した。肉腫を有する個々のマウスの生存率（ｅ〜ｇ）及び増殖曲線（ｈ）が示されている。ｆ．「材料及び方法」に規定されているように、抗ＣＤ９６、抗ＤＮＡＭ−１、又は抗ＣＤ１５５ｍＡｂでＷＴマウスを処置した。ｇ．ＷＴ及びＣＤ９６^−／−マウスに１００μｇのＭＣＡを注射し、対照抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、又は抗ａｓｉａｌｏＧＭ１のいずれかで処置した。^＊ｐ＜０．０５ マンテル−コックス検定。 抗ＣＤ９６ｍＡｂは、単剤活性を有し、抗ＰＤ１の非腫瘍応答を増強する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスに、ＡＴ３−ＯＶＡ^ｄｉｍ腫瘍細胞（１０^６細胞）を皮下注射し、１６、２０、及び２４日目に、抗ＣＤ９６ｍＡｂ（３．３、２５０μｇ ｉ．ｐ）又は抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１−１４、２５０μｇ ｉ．ｐ．）の腹腔内注射で処置した。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭ（ｍｍ^２）が示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定によりｃＩｇ単独と比較）。 抗ＣＤ９６ｍＡｂは、ドキソルビシン（ＤＯＸ）化学療法により生成される抗腫瘍応答を増強する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）、ＤＮＡＭ−１^−／−、及びＣＤ９６^−／−マウスに、ＡＴ３−ＯＶＡ^ｄｉｍ腫瘍細胞（１０^６細胞）を皮下注射し、１４日目に、対照ＰＢＳ又はＤＯＸ（５０マイクロリットル、２ｍＭ、腫瘍内）で処置した。また、ＷＴマウスの幾つかの群は、１２、１４、１８、２１、２４、及び２８日目に、抗ＣＤ９６ｍＡｂ（３．３、２５０μｇ ｉ．ｐ）又は抗ＤＮＡＭ−１（４８０．１、２５０μｇ ｉ．ｐ．）の腹腔内注射を受けた。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭ（ｍｍ^２）が示されている。 宿主がＣＤ９６を欠損する場合のドキソルビシン（ＤＯＸ）化学療法の抗腫瘍応答の増強。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）、ＤＮＡＭ−１^−／−、及びＣＤ９６^−／−マウスに、ＡＴ３−ＯＶＡ^ｄｉｍ腫瘍細胞（１０^６細胞）を皮下注射し、１６日目に、対照ＰＢＳ又はＤＯＸ（５０マイクロリットル、２ｍＭ、腫瘍内）で処置した。１群当たり５匹のマウスの平均±標準誤差（ｍｍ^２）が示されている。 抗ＣＤ９６ｍＡｂは、ドキソルビシン（ＤＯＸ）化学療法により生成される抗腫瘍応答を増強する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）に、ＡＴ３−ＯＶＡ^ｄｉｍ腫瘍細胞（１０^６細胞）を皮下注射し、１６日目に、対照ＰＢＳ又はＤＯＸ（５０マイクロリットル、２ｍＭ、腫瘍内）で処置した。また、ＷＴマウスの幾つかの群は、１６、２０、及び２３日目に、抗ＣＤ９６ｍＡｂ（３．３、２５０μｇ ｉ．ｐ）の腹腔内注射を受けた。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭ（ｍｍ^２）が示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定によりｃＩｇ単独と比較）。 初期抗ＣＤ９６ｍＡｂは、抗ＰＤ−１及び抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂにより生成される抗腫瘍応答を増強する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスに、Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫細胞（１０^５細胞）を皮下注射し、１、５、及び９日目に、抗ＣＤ９６ｍＡｂ（３．３、２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＰＤ−１ｍＡｂ（ＲＭＰ１−１４、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＴＬＡ−４（ＵＣ１０−４Ｆ１０、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＤ９６／抗ＰＤ−１ｍＡｂ（各２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＣＤ９６／抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ（各２５０μｇ ｉ．ｐ）、又は対照Ｉｇ（ｃＩｇ）（２Ａ３、２５０μｇ ｉ．ｐ）の腹腔内注射で処置した。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭ（ｍｍ^２）が示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定により抗ＣＤ９６単独と比較）。 後期抗ＣＤ９６ｍＡｂは、抗ＰＤ−１ｍＡｂにより生成される抗腫瘍応答を増強する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスに、Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫細胞（１０^５細胞）を皮下注射し、１６、２０、及び２４日目に、抗ＣＤ９６ｍＡｂ（３．３、２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＰＤ−１ｍＡｂ（ＲＭＰ１−１４、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＴＬＡ−４（ＵＣ１０−４Ｆ１０、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＤ９６／抗ＰＤ−１ｍＡｂ（各２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＣＤ９６／抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ（各２５０μｇ ｉ．ｐ）、又は対照Ｉｇ（ｃＩｇ）（２Ａ３、２５０μｇ ｉ．ｐ）の腹腔内注射で処置した。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭ（ｍｍ^２）が示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定により抗ＣＤ９６単独と比較）。 宿主ＣＤ９６は、Ｂ１６Ｆ１０肺転移を促進する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）、ＤＮＡＭ−１^−／−、ＣＤ９６^−／−、及びＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−マウスに、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（１０^５細胞）を静脈内注射し、１４日後に肺表面のコロニーを計数することにより、肺の転移量を定量した。１群当たり９〜１７匹のマウスの平均±ＳＥＭが示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定によりＷＴと比較）。 宿主ＣＤ９６は、ＲＭ−１肺転移を促進する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）、ＤＮＡＭ−１^−／−、ＣＤ９６^−／−、及びＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−マウスに、ＲＭ１前立腺癌細胞（１０^４細胞）を静脈内注射し、１４日後に肺表面のコロニーを計数することにより、肺の転移量を定量した。１群当たり１０〜１５匹のマウスの平均±ＳＥＭが示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定によりＷＴと比較）。 宿主ＣＤ９６は、３ＬＬ肺転移を促進する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）、ＤＮＡＭ−１^−／−、ＣＤ９６^−／−、及びＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−マウスに、３ＬＬ肺癌細胞（１０^５細胞）を静脈内注射し、１４日後に肺表面のコロニーを計数することにより、肺の転移量を定量した。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭが示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定によりＷＴと比較）。 抗ＣＤ９６は、単独で又はＴ細胞チェックポイント遮断との組み合わせで、Ｂ１６Ｆ１０肺転移を抑制する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスに、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞（１０^５細胞）を静脈内注射した。腫瘍接種後の０日目及び３日目に、マウスを、抗ＣＤ９６ｍＡｂ（３．３、２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＰＤ−１ｍＡｂ（ＲＭＰ１−１４、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＴＬＡ−４（ＵＣ１０−４Ｆ１０、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＤ９６／抗ＰＤ−１ｍＡｂ（各２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＣＤ９６／抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ（各２５０μｇ、ｉ．ｐ）、又は対照Ｉｇ（ｃＩｇ）（２Ａ３ ２５０μｇ ｉ．ｐ）の腹腔内注射で処置した。１４日後に肺表面のコロニーを計数することにより、肺の転移量を定量した。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭが示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定により抗ＣＤ９６単独と比較）。 抗ＣＤ９６は、単独で又はＴ細胞チェックポイント遮断との組み合わせで、ＲＭ−１肺転移を抑制する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスに、ＲＭ−１前立腺癌細胞（１０^４細胞）を静脈内注射した。腫瘍接種後の０日目及び３日目に、マウスを、抗ＣＤ９６ｍＡｂ（３．３、２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＰＤ−１ｍＡｂ（ＲＭＰ１−１４、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＴＬＡ−４（ＵＣ１０−４Ｆ１０、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＤ９６／抗ＰＤ−１ｍＡｂ（各２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＣＤ９６／抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ（各２５０μｇ、ｉ．ｐ）、又は対照Ｉｇ（ｃＩｇ）（２Ａ３ ２５０μｇ ｉ．ｐ）の腹腔内注射で処置した。１４日後に肺表面のコロニーを計数することにより、肺の転移量を定量した。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭが示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定により抗ＣＤ９６単独と比較）。 後期抗ＣＤ９６ｍＡｂは、抗ＰＤ−１ｍＡｂにより生成される抗腫瘍応答を増強する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスに、ＭＣ３８−ＯＶＡ^ｄｉｍ結腸腺癌細胞（１０^６細胞）を皮下注射し、１４、１８、２２、及び２６日目に、抗ＣＤ９６ｍＡｂ（３．３、２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＰＤ−１ｍＡｂ（ＲＭＰ１−１４、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＴＬＡ−４（ＵＣ１０−４Ｆ１０、２５０μｇ ｉ．ｐ．）、抗ＣＤ９６／抗ＰＤ−１ｍＡｂ（各２５０μｇ ｉ．ｐ）、抗ＣＤ９６／抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ（各２５０μｇ ｉ．ｐ）、又は対照Ｉｇ（ｃＩｇ）（２Ａ３、２５０μｇ ｉ．ｐ）の腹腔内注射で処置した。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭ（ｍｍ^２）が示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定により抗ＣＤ９６単独と比較）。 ＡＴ３−ＯＶＡ^ｄｉｍ乳癌に対する抗ＣＤ９６単独の抗腫瘍効果の機序。（Ａ〜Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）及びｐｆｐ^−／−マウスに、ＡＴ３−ＯＶＡ^ｄｉｍ乳癌（１×１０^６細胞）をｓ．ｃ．注射した。腫瘍接種後の（Ａ）１６、２０、及び２４日目、又は（Ｂ）１２、１６、１８日目に、マウスを、ｃＩｇ（２５０μｇ ｉ．ｐ．）又は抗ＣＤ９６ｍＡｂ（２５０μｇ ｉ．ｐ．）のｉ．ｐ．注射で処置した。マウスの幾つかの群を、腫瘍接種後の（Ａ）１４、１６、及び２３日目に、ｃＩｇ、抗ＣＤ４／抗ＣＤ８β（１００μｇ ｉ．ｐ．）、又は抗ａｓＧＭ１（１００μｇ ｉ．ｐ．）で、又は腫瘍接種後の（Ｂ）１０、１２、及び１８日目に、ｃＩｇ又は抗ＩＦＮ−γ（２５０μｇ ｉ．ｐ．）で処置した。その後、マウスの腫瘍増殖をモニタリングした。１群当たり５匹のマウスの平均±ＳＥＭ（ｍｍ^２）が示されている（^＊：ｐ＜０．０５ マン−ホイットニー検定によりｃＩｇ処置マウスを抗ＣＤ９６処置マウスと比較）。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＮＫ細胞活性化。ヒトＮＫ細胞からのＩＦＮγ産生を分析するために、９６ウェルＵ底プレートを、組換えヒトＣＤ１５５−Ｆｃキメラ（０．２５μｇ／ウェル）で一晩４℃にてコーティングした。３回洗浄した後、バフィコートから新たに単離し、ＦＡＣＳ選別した２．５×１０^４個のヒトＮＫ細胞を、ヒト抗ＣＤ９６抗体（クローンＮＫ９２．３９、５０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、ヒトＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全ＲＰＭＩに播種した。ＣＤ１５５−Ｆｃコーティングを含有していないウェルにも培養物をセットアップした。２４時間インキュベーションした後、細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＩＦＮγ産生を分析した。条件は全て、三重反復で実行した。エラーバーは±ＳＥＭを表す。ＩＬ−１２、１８、及び１５を使用したフローサイトメトリーの結果。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＮＫ細胞活性化。ヒトＮＫ細胞からのＩＦＮγ産生を分析するために、９６ウェルＵ底プレートを、組換えヒトＣＤ１５５−Ｆｃキメラ（０．２５μｇ／ウェル）で一晩４℃にてコーティングした。３回洗浄した後、バフィコートから新たに単離し、ＦＡＣＳ選別した２．５×１０^４個のヒトＮＫ細胞を、ヒト抗ＣＤ９６抗体（クローンＮＫ９２．３９、５０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、ヒトＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全ＲＰＭＩに播種した。ＣＤ１５５−Ｆｃコーティングを含有していないウェルにも培養物をセットアップした。２４時間インキュベーションした後、細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＩＦＮγ産生を分析した。条件は全て、三重反復で実行した。エラーバーは±ＳＥＭを表す。異なるドナー（１７Ａに示されているドナー１ではない）のＩＦＮγ陽性ＮＫ細胞の割合を示す結果。 ヒトＮＫ細胞に対するヒトＣＤ９６ｍＡｂ（ＮＫ９２．３９）の結合は、ＮＫ細胞表面に存在するＣＤ９６のレベルを低減した。全ＮＫ細胞を、ヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．社）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ネガティブ選択により精製した。その後、単離したＮＫ細胞を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で標識して、細胞増殖を測定した。ＣＦＳＥ標識ＮＫ細胞を、９６ウェルＵ底プレートに５×１０^４細胞／ウェルで播種し、３０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ又は抗ＣＤ９６ｍＡｂ（クローンＮＫ９２−３９）の存在下にて、表示の濃度（１０単位／ｍｌ及び２５単位／ｍｌ）の組換えＩＬ−２で刺激した。３日目及び６日目に、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、増殖の変化（Ａ）又は表面ＣＤ９６の有無；及び（Ｂ）について、ＮＫ細胞を評価した。分析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）を使用して実施した。

本発明は、ＣＤ９６が、休止ＮＫ細胞及びＴ細胞のサブセットにより高度に発現され、休止ＮＫ細胞上でのＣＤ１５５の結合をＤＮＡＭ−１と競合するという予想外の発見に、少なくとも部分的に基づく。ＣＤ９６が、ＣＤ１５５結合に対するＤＮＡＭ−１との競合により、及び直接阻害により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＮＫ細胞でのＩＦＮ−γ産生を低下又は抑制することは、ＣＤ９６^−／−マウスを使用して示される。更に、ＣＤ９６^−／−マウスは、発癌の指標としての３’−メチルコラントレン（ＭＣＡ）誘導性腫瘍形成、又はＢ１６Ｆ１０（黒色腫）、ＲＭ−１（前立腺癌）、３ＬＬ（肺癌）の実験的転移に対して、より抵抗性であることが示された。ヒトＮＫ細胞では、抗ＣＤ９６抗体の投与は、細胞表面ＣＤ９６を除去するか又は喪失させ、かつ／又はＣＤ９６細胞表面発現の下方制御を引き起こすと考えられる。これらの観察に基づき、特にＩＦＮ−γ産生及び／又は分泌を抑制することのみによらないが、ＣＤ９６が通常、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の抗腫瘍機能の負の調節因子として作用することが提唱される。したがって、本発明は、ＣＤ９６の負の免疫制御機能を軽減又は低減することにより、特にＴ細胞及びＮＫ細胞による免疫監視を促進又は回復させ、それにより、癌、癌細胞転移、及び／又はウイルス感染症を治療又は予防するための方法を提供する。

したがって、本発明の１つの態様は、哺乳動物の免疫抑制を低減又は軽減する方法であって、哺乳動物の１つ又は複数の細胞のＣＤ９６活性を少なくとも部分的に阻害又は低減することにより、哺乳動物の免疫抑制を軽減、及び／又は免疫監視を強化若しくは回復させるステップを含む方法を提供する。

ＣＤ９６に関しての「免疫抑制を軽減する」とは、通常ＣＤ９６を発現する細胞の１つ又は複数の免疫機能を抑制又は阻害する、ＣＤ９６の正常な活性又は機能を少なくとも部分的に解消、除去、又は克服することを意味する。典型的には、通常ＣＤ９６を発現する１つ又は複数の細胞は、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むＴ細胞である。幾つかの実施形態では、免疫抑制の軽減は、外来病原体、外来病原体を提示する宿主細胞（例えば、自己ＭＨＣに関しては、外来病原体由来ペプチドを提示する）、及び／又は宿主の癌性細胞若しくは組織に対する末梢寛容を抑制することを含むか又は抑制することに関する。

「免疫監視を強化又は回復させる」とは、免疫系の１つ又は複数の要素が、外来病原体、外来病原体を提示する宿主細胞（例えば、自己ＭＨＣに関しては、外来病原体由来ペプチドを提示する）、及び／又は宿主の癌性細胞若しくは組織を、監視、検出、及び／又は応答する能力を、少なくとも部分的に向上又は促進することを意味する。好適には、免疫系の要素は、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ Ｔ細胞、並びにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むＴ細胞等の、通常ＣＤ９６を発現する１つ又は複数の細胞である。

哺乳動物の１つ又は複数の細胞におけるＣＤ９６活性の少なくとも部分的な阻害又は低減は、哺乳動物に「ＣＤ９６阻害剤」を投与することにより実施、促進、又は達成することができる。ＣＤ９６阻害剤は、ＣＤ９６の生物活性を少なくとも部分的に抑制又は低減する能力を有するか又は示す任意の分子であり得る。ＣＤ９６の生物活性には、以下の１つ又は複数が含まれる：ＣＤ１５５との結合、細胞表面発現、細胞内シグナル伝達の誘発、並びに／又はサイトカイン若しくはケモカインの発現及び／若しくは分泌の刺激若しくは誘導。好ましくは、サイトカイン又はケモカインには、限定するものではないが、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γを含む任意の炎症促進性サイトカイン又はケモカインが含まれる。好ましくは、サイトカインはＩＦＮ−γである。

本明細書で開示されているように、ＣＤ９６は、ヒトでは２つのアイソフォームが存在する膜貫通型タンパク質である。アイソフォーム１は、急性骨髄性白血病で検出されており、アイソフォーム２と比較して追加のアミノ酸を含む。ヒトでは、アイソフォーム２がより一般的な形態であり、アイソフォーム２の予想ドメイン構造は、表１に列挙されているように、３つの外部免疫グロブリン様ドメイン（ドメイン１、２、及び３）を有する。ヒトＣＤ９６アイソフォーム１のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。アイソフォーム２をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１に示されている。マウスＣＤ９６は、単一のアイソフォームとして存在し、そのアミノ酸配列は、配列番号４に示されている。マウスＣＤ９６をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３に示されている。また、マウスＣＤ９６の外部免疫グロブリン様ドメイン（ドメイン１、２、及び３）は、表１に列挙されている。

好ましい形態では、ＣＤ９６阻害剤は、ＣＤ９６の１つ又は複数の外部免疫グロブリン様ドメインのアミノ酸配列と結合又は相互作用する。例えば、ＣＤ９６阻害剤は、ドメイン１；ドメイン２；ドメイン３；ドメイン１及びドメイン２；ドメイン１及びドメイン３；ドメイン２及びドメイン３；又はドメイン１、ドメイン２、及びドメイン３のアミノ酸配列と結合又は相互作用することができる。

１つの実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は、ヒトＣＤ９６アイソフォーム２の１つ又は複数の外部免疫グロブリン様ドメインと結合又は相互作用する。
また、ＣＤ９６阻害剤は、１つ又は複数の外部又は細胞外免疫グロブリン様ドメインに加えて、他のＣＤ９６ドメイン又はアミノ酸配列と結合又は相互作用してもよいことが理解されるであろう。

１つの実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は、ＣＤ９６とＣＤ１５５との結合相互作用を阻害、阻止、又はそれと拮抗する。例に過ぎないが、ＣＤ９６阻害剤は、ＣＤ１５５と相互作用する（例えば、ＣＤ１５５と結合するか又はＣＤ１５５により結合される）ことが可能なＣＤ９６の細胞外ドメイン又はその部分に結合することにより、ＣＤ１５５に対するＣＤ９６の結合を少なくとも部分的に阻害又は阻止することができる。

別の実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は、ＣＤ９６シグナル伝達活性を阻害又は低減する能力を有するか又は示す分子である。ＣＤ９６シグナル伝達活性の阻害又は低減は、ＣＤ１５５との結合相互作用を阻害、阻止、又は拮抗することによるものであってもよく、又はＣＤ１５５結合に応答して通常生じるであろうＣＤ９６誘発シグナル伝達を阻止することによるものであってもよい。例として、ＣＤ９６は、免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。ＩＴＩＭは、チロシン（Ｙ）残基を含み、Ｎ末端（Ｙ−２）及びＣ末端（Ｙ＋３）残基が部分的に保存されている、６アミノ酸の配列として構造的に規定される。一般的だが非限定的なモチーフは（Ｓ／Ｉ／Ｖ／ＬＸＹＸＸＩ／Ｖ／Ｌ）であり、配列中Ｘは任意のアミノ酸である。例えば、ＣＤ９６のアイソフォーム１は、ＩＴＩＭ配列ＩＫＹＴＣＩを含み、配列中Ｙは、残基５６６である。

ＩＴＩＭは、活性化受容体と共凝集すると、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼによりリン酸化され、活性化シグナルと拮抗するＳｒｃ相同性２ドメイン含有ホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）を動員することが可能になると提唱されている。したがって、１つの実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は、ＣＤ９６ ＩＴＩＭにより媒介されるＣＤ９６シグナル伝達活性を阻害又は低減する能力を有するか又は示す。好ましくは、ＣＤ９６ ＩＴＩＭにより媒介されるＣＤ９６シグナル伝達活性の阻害又は低減は、サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）の発現、産生、及び／又は分泌の増加又は増強を可能にする。

別の実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は、細胞表面ＣＤ９６を除去、及び／又はＣＤ９６の細胞表面発現を低減又は下方制御する分子である。
ＣＤ９６阻害剤は、タンパク質（ペプチド、抗体、及び抗体断片を含む）、核酸（リボザイム、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ等の抑制性ＲＮＡ分子を含むが、それらに限定されない）、脂質、炭水化物、有機小分子、又はこれらの任意の組み合わせ（例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸等）であってもよい。

１つの特定の実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は、ＣＤ９６に結合する抗体又は抗体断片である。
好ましい形態では、抗体又は抗体断片は、ＣＤ９６の１つ又は複数の外部又は細胞外免疫グロブリン様ドメインのアミノ酸配列と結合又は相互作用する。例えば、抗体又は抗体断片は、ドメイン１；ドメイン２；ドメイン３；ドメイン１及びドメイン２；ドメイン１及びドメイン３；ドメイン２及びドメイン３；又はドメイン１、ドメイン２、及びドメイン３のアミノ酸配列と結合又は相互作用することができる。

１つの実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ９６アイソフォーム２の１つ又は複数の外部免疫グロブリン様ドメインと結合又は相互作用する。
１つの形態では、抗体は、ＣＤ９６と結合し、ＣＤ１５５に対するＣＤ９６の結合を少なくとも部分的に阻止又は阻害する。

抗体は、ポリクローナルであってもよく又はモノクローナルであってもよく、天然物であってもよく又は組換え体であってもよい。抗体断片には、Ｆａｂ断片及びＦａｂ’２断片、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、並びに単鎖抗体断片（例えば、ｓｃＶ）が含まれるが、それらに限定されない。別の種で産生されているか又は別の種に由来する抗体及び抗体断片は、「外来性」抗体に対する有害な免疫応答を誘発せずにある種に投与可能になるように修飾されていてもよい。ヒトに関しては、これは、別の種で産生されるか又は別の種に由来する抗体の「ヒト化」である。そのような方法は、当技術分野で周知であり、一般的に、ヒト抗体スキャフォールド又は骨格に、非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を組換え「接合」すること含む。

好適には、哺乳動物のＣＤ９６活性を阻害又は低減するステップは、哺乳動物のＣＤ９６発現細胞を死滅させることを含まない。この文脈では、「死滅」は、補体媒介性細胞溶解及び抗体媒介性細胞媒介性細胞傷害機序（ＡＤＣＣ、antibody-mediated cell-mediated cytotoxic mechanism）等の、任意の抗体媒介性細胞傷害機序を指す場合があり、後者は、典型的にはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、及び好酸球により媒介される。この点で、Ｆｃ部分を欠如するか又は突然変異Ｆｃ部分を有する抗体断片を使用することが有利であり得る。

哺乳動物のＣＤ９６活性を阻害又は低減するステップは、哺乳動物にＣＤ９６阻害剤を投与することにより達成又は促進することができる。
「投与する」とは、ＣＤ９６阻害剤を特定の経路で哺乳動物に導入することを意味する。好適には、治療上有効量のＣＤ９６阻害剤が、哺乳動物に投与される。

用語「治療上有効量」は、その作用剤で治療される哺乳動物で所望の効果を達成するのに十分な特定の作用剤の量を指す。
一般的に、本発明の方法は、ＣＤ９６媒介性の免疫阻害、抑制、又は末梢寛容を低減又は軽減するのに有用であり得る。好適には、本方法は、ＣＤ９６媒介性の免疫阻害、抑制、又は末梢寛容の少なくとも部分的阻止に応答する１つ又は複数の疾患又は状態の治療又は予防を容易にする。

「治療する」又は「治療」は、本明細書で使用される場合、ＣＤ９６媒介性の免疫阻害、抑制、又は末梢寛容の少なくとも部分的阻止に応答する疾患又は状態の１つ又は複数の既存の又は以前に特定されている症状を少なくとも部分的に解消又は改善する治療介入を指す。

「予防する」又は「予防」は、本明細書で使用される場合、ＣＤ９６媒介性の免疫阻害、抑制、又は末梢寛容の少なくとも部分的阻止に応答する疾患又は状態の症状が発症する前の、症状の発生を少なくとも部分的に又は一時的に予防するための予防的処置を指す。

典型的には、ＣＤ９６媒介性の免疫阻害、抑制、又は末梢寛容の少なくとも部分的な阻止に応答する疾患又は状態は、免疫監視の強化又は回復が、疾患又は状態を罹患している対象体に有益であり得る任意の疾患又は状態である。そのような疾患及び状態には、疾患又は状態の持続を、細胞媒介性免疫により制御又は抑制することができるものが含まれる。非限定的な例には、癌及びウイルス感染症が含まれる。本発明により企図される特定のウイルス感染症には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ１及びＨＳＶ２を含むＨＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、帯状疱疹ウイルス（ＶＳＶ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）により引き起こされるもの等の持続性ウイルス感染症が含まれるが、それらに限定されない。

好ましい実施形態では、本方法は、哺乳動物の免疫抑制を低減又は軽減して、哺乳動物の癌又は癌転移を治療又は予防する。好適には、癌は、ＣＤ９６媒介性の免疫阻害、抑制、又は末梢寛容の少なくとも部分的な阻止に応答するものであればよい。癌は、固形腫瘍、肉腫、リンパ腫、ミエローマ、カルシノーマ、黒色腫、細胞腫、及び髄膜腫の形態であってもよいが、それらに限定されない。癌の非限定的な例には、副腎、膀胱、硬骨、骨髄、脳、胸部、頚部、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、下垂体、副甲状腺、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。特定の非限定的な癌の例には、結腸癌、肺癌、及び前立腺癌が含まれる。幾つかの実施形態では、癌は、体内の別の部位、組織、又は器官に移動し、その部位、組織、又は器官で腫瘍を形成することが可能な転移癌である。これは、経時的に繰り返して生じる場合がある。本発明により企図される特に侵襲性の転移性癌は、転移性黒色腫である。

また、癌を治療又は予防するための方法は、癌治療又は癌予防を促進する１つ又は複数の他の治療剤を同時投与することを更に含んでいてもよいことが理解されるであろう。例に過ぎないが、他の治療剤には、限定するものではないが、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキサート、及びシスプラチン等の化学療法剤；及び／又は限定するものではないが、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ）及び抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）等の生物学的治療剤が含まれる。また、ＣＤ９６と、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ４を含むがそれらに限定されない１つ又は複数の他の分子との両方に結合する二重特異性抗体が企図される。

癌治療又は癌予防を促進する１つ又は複数の他の作用剤は、当技術分野で十分に理解されているように、ＣＤ９６阻害剤と組み合わせて投与してもよく、又は別々に投与してもよい。

幾つかの実施形態では、ＣＤ９６阻害剤は、単独で、又は１つ若しくは複数の他の作用剤と一緒に、医薬組成物の形態に製剤化してもよい。
ヒト投与を含む哺乳動物投与用の、ＣＤ９６阻害剤単独の、又は他の治療剤と一緒にしたＣＤ９６阻害剤の好適な用量は、当業者であれば、容易に決定することができる。

好適には、医薬組成物は、適切な薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤は、哺乳動物に対する、より好ましくはヒトに対する投与に好適である。

「薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤」とは、全身性投与用に安全に使用することができる固形又は液体の充填剤、希釈剤、又は封入物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野で周知の種々の担体、希釈剤、及び賦形剤を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張性生理食塩水、並びに塩酸塩、臭化物、及び硫酸塩を含む鉱酸塩等の塩、アセタート、プロピオナート、及びマロナート等の有機酸、並びに発熱物質除去水を含む群から選択することができる。

薬学的に許容される担体、希釈剤、及び賦形剤が記載されている有用な文献は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．社、ニュージャージー州、米国、１９９１年）である。

任意の安全な投与経路を使用して、ＣＤ９６阻害剤を含む組成物を対象体に提供することができる。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、頬側、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、及び経皮等を使用することができる。

本発明の更なる態様は、ＣＤ９６阻害剤を、スクリーニング、設計、遺伝子操作、又は他の手段で製造するための方法であって、候補分子が、ＣＤ９６活性を少なくとも部分的に阻害又は低減することにより、哺乳動物の免疫抑制を軽減することが可能であるか否か、及び／又は免疫監視を強化若しくは回復させることが可能であるか否かを決定するステップを含む方法を提供する。

また、本発明は、上述の態様によりスクリーニング、設計、遺伝子操作、又は他の手段で製造されたＣＤ９６阻害剤を提供する。
候補分子は、タンパク質（ペプチド、抗体、及び抗体断片を含む）、核酸（リボザイム、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ等の抑制性ＲＮＡ分子を含むが、それらに限定されない）、脂質、炭水化物、有機小分子、又はこれらの任意の組み合わせ（例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド核酸等）であってもよい。

幾つかの実施形態では、候補調節因子は、候補調節因子が、ＣＤ１５５結合、細胞内シグナル伝達、並びに／又はＩＦＮ−γ産生及び／若しくは分泌等の、ＣＤ９６の１つ又は複数の生物活性を阻止又は阻害し得ることを示す、所望の又は予想される構造特性又は特徴に基づき、ｄｅ ｎｏｖｏで合理的に設計又は遺伝子操作されていてもよい。他の実施形態では、候補調節因子は、候補調節因子が、ＣＤ９６の１つ又は複数の生物活性を阻止又は阻害し得ることを示す、所望の又は予想される構造特性又は特徴に基づき、初期選択を行わずに分子ライブラリーをスクリーニングすることにより特定してもよい。そのようなライブラリーは、無作為に生成又は誘導された、タンパク質、ペプチド、核酸、組換え抗体若しくは抗体断片（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、炭水化物、及び／若しくは脂質のライブラリー、天然分子のライブラリー、並びに／又は合成有機分子のコンビナトリアルライブラリーを含む。

候補調節因子を設計及び／又はスクリーニングするために適用可能な技術の非限定的な例は、当技術分野で周知である、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ分光法、コンピュータ支援構造データベーススクリーニング、コンピュータ支援モデリング、又は分子結合相互作用を検出する生化学的若しくは生物物理学的技術を使用することができる。

分子相互作用を特定する生物物理学的及び生化学的技術には、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、１９９７年）の第２０章に提供されているような、競合的放射性リガンド結合アッセイ、共免疫沈降、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）結合アッセイを含む蛍光に基づくアッセイ、電気生理学法、分析超遠心法、標識転移、化学的架橋、質量分光法、マイクロカロリメトリー、表面プラズモン共鳴法、及び光バイオセンサーに基づく方法が含まれる。ツーハイブリッド及びファージディスプレイスクリーニング法等の生化学的技術は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、１９９７年）の第１９章に提供されている。

したがって、本方法の初期ステップは、ＣＤ９６に結合する能力等の、幅の広い構造的及び／又は機能的属性により選択される複数の候補分子を特定することを含んでもよい。
本方法は、候補分子への応答におけるＣＤ９６の１つ又は複数の生物活性の変化を測定又は検出する更なるステップを含んでいてもよい。それらには、ＣＤ１５５結合、細胞表面ＣＤ９６の有無、細胞内シグナル伝達、サイトカイン及び／若しくはケモカインの産生若しくは分泌、並びに／又はｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける腫瘍攻撃からの保護が含まれていてもよい。

候補分子による、ＣＤ９６に対するＣＤ１５５結合の阻害は、競合的放射性リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴法（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ（商標）分析）、共免疫沈降、及びＣＤ９６に対するＣＤ１５５結合を阻止する候補阻害剤の能力の蛍光に基づく分析（ＣＤ１５５がフルオロフォアで標識されているフローサイトメトリー等による）を含む、当技術分野で知られている幾つかの技術のいずれかにより決定することができる。フルオロフォアの非限定的な例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＦＡＭ及びＲＯＸ等のフルオロセイン誘導体、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＬ）、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）、Ａｌｅｘａ及びＢｏｄｉｐｙフルオロフォアが含まれるが、それらに限定されない。

或いは、この蛍光に基づく分析は、ＦＲＥＴ分析（例えば、１つのタンパク質がドナーフルオロフォアに結合され、他方がアクセプターフルオロフォアに結合される）を含むことができるが、それに限定されない。

幾つかの実施形態では、細胞内シグナル伝達は、ＮＫ細胞又はT細胞のサブセットにより発現されるＣＤ９６によるＳＨ２ドメイン含有ＰＴＰａｓｅの動員を測定すること等により、ＣＤ９６のレベルで直接測定することができる。本発明の候補分子は、ＣＤ１５５の存在下でＣＤ９６によるＳＨ２ドメイン含有ＰＴＰａｓｅの動員を適切に防止又は低減する。この実施形態によると、候補分子は、ＣＤ９６とＣＤ１５５との結合を少なくとも部分的に阻害又は防止することにより、ＣＤ９６による細胞内シグナル伝達を少なくとも部分的に阻害又は防止することができ、かつ／又はＣＤ１５５結合にも関わらずＣＤ９６による細胞内シグナル伝達を少なくとも部分的に阻害又は防止することができる。

他の実施形態では、ＣＤ９６に対する候補分子の効果は、ＣＤ９６を発現する細胞による１つ又は複数のサイトカイン又はケモカインの発現、産生、及び／又は分泌を測定することにより決定することができる。一般的に、サイトカイン又はケモカインの発現、産生、及び／又は分泌の変化の測定は、サイトカインｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより、細胞内に位置するサイトカイン若しくはケモカインタンパク質を測定することにより（例えば、サイトカイン特異的抗体又はケモカイン特異的抗体を使用する免疫細胞化学法により）、並びに／又はフローサイトメトリーのサイトカインビーズアレイ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社等から市販されている）、サイトカイン特異的抗体若しくはケモカイン特異的抗体を使用したＥＬＩＳＡ、及びサイトカイン応答性細胞系若しくはケモカイン応答性細胞系を使用して細胞上清に分泌されたサイトカイン及び／若しくはケモカインを測定するバイオアッセイ等により、分泌されたサイトカイン又はケモカインを測定することにより可能である。サイトカインは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γを含む任意の炎症促進性サイトカイン又はケモカインであってもよいが、それらに限定されない。好ましくは、サイトカインは、ＩＦＮ−γである。

候補ＣＤ９６阻害剤の効果は、細胞表面発現及びＣＤ９６遺伝子発現を含むＣＤ９６発現に対してであってもよい。限定ではないがＮＫ細胞等のある細胞では、ＣＤ９６阻害剤は、ＣＤ９６発現の除去、喪失、及び／又は下方制御を引き起こすか又は促進することができることが理解されるであろう。したがって、幾つかの実施形態では、細胞表面でのＣＤ９６発現の除去、喪失、及び／又は下方制御が含まれていてもよい。これは、細胞表面ＣＤ９６の内部移行又はエンドサイトーシスが増強される結果として、及び／又はＣＤ９６遺伝子発現の下方制御又は抑制により生じる場合がある。特定の実施形態では、ＣＤ９６細胞表面発現は、上述したように、典型的にはＣＤ９６に結合する抗体又は抗体断片による、フローサイトメトリー、免疫沈降法、免疫細胞化学法、又は免疫組織化学法により検出又は測定することができる。特定の実施形態では、ＣＤ９６遺伝子発現は、核酸配列増幅（例えば、定量的及び半定量的ＰＣＲを含むＰＣＲ）又はノーザンブロット法等の核酸ハイブリダイゼーション技術により測定することができる。

好ましくは、候補分子のＣＤ９６阻害効果は、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍攻撃モデルを使用して決定することができる。例えば、ＣＤ９６発現マウスが使用されるマウスモデルを使用して、メチコラントレン（ＭＣＡ）等の、投与した発癌物質に応答した腫瘍形成及び／又は増殖を阻害又は防止する候補分子の能力を決定することができる。別の例では、ＣＤ９６発現マウスが使用されるマウスモデルを使用して、限定するものではないが、黒色腫、結腸腺癌、前立腺癌、及び乳癌腫等の腫瘍細胞の投与に応答した腫瘍形成及び／又は増殖を阻害又は防止する候補分子の能力を決定することができる。他のマウスモデルでは、ＭＭＴＶ−ポリオーマ、ＭＴ乳癌、ＤＭＢＡ／ＴＰＡ誘導性皮膚癌、ｐ５３喪失リンパ腫／肉腫、及びＴＲＡＭＰ Ｔｇ前立腺癌を含むがそれらに限定されない腫瘍を自然に形成し易いマウスを使用してもよい。

この態様の方法は、反復して実施することができ、それによりスクリーニング、設計、及び生物学的試験が複数ラウンド実施されることが理解されるであろう。これは、各ラウンドの前に候補分子を構造的に変更し、それにより候補分子の「微調整」を可能にすることを含んでいてもよい。

また、本方法は、特に候補分子の特定及び選択の初期段階では、「ハイスループット」、「自動化」、「半自動化」の様式で実施することができることが理解されるであろう。
好ましい実施形態では、候補分子は抗体又は抗体断片である。上述のように、抗体は、ポリクローナルであってもよく又はモノクローナルであってもよく、天然物であってもよく又は組換え体であってもよい。抗体断片には、Ｆａｂ断片及びＦａｂ’２断片、ダイアボディ、並びに単鎖抗体断片（例えば、ｓｃＶ）が含まれるが、それらに限定されない。抗体産生、選択、精製、及び使用に適用可能な周知のプロトコールは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク州、１９９１〜１９９４年）の第２章、及びＨａｒｌｏｗ，Ｅ．＆Ｌａｎｅ，Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年に見出すことができる。これら両文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

ポリクローナル抗体は、例えば、マウス又はウサギを含んでいてもよい産生種に、ＣＤ９６又はその断片（例えば、ペプチド）を注射して、ポリクローナル抗血清を得ることにより調製することができる。ポリクローナル抗体を産生する方法は、当業者に周知である。使用することができる例示的なプロトコールは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（上記）及びＨａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、１９８８年（上記）に記載されている。

モノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻、４９５頁の論文に記載されているような標準的方法を使用して産生することができる。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。或いは、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（上記）に記載されているような、より最近のその改良法により、又は本発明の単離されたタンパク質、断片、変異体、若しくは誘導体の１つ若しくは複数を接種した産生種に由来する不死化脾臓若しくは他の抗体産生細胞により産生することができる。好適には、抗体又は抗体断片は、ヒト投与に好適である。この状況では、上述のように、抗体又は抗体断片は、別の種で産出されたか又は別の種に由来する抗体又は抗体断片の「ヒト化」形態であってもよい。そのような方法は、当技術分野で周知であり、一般的に、ヒト抗体スキャフォールド又は骨格に、非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を組換え「接合」すること含む。

好ましい実施形態では、抗体又は抗体断片は、ヒトに投与してもＣＤ９６発現細胞を死滅させない。この文脈において、「死滅」は、補体媒介性細胞溶解及び抗体媒介性細胞媒介性細胞傷害機序（ＡＤＣＣ）等の任意の抗体媒介性細胞傷害機序を指す場合があり、後者は、典型的にはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、及び好酸球により媒介される。この点で、Ｆｃ部分を欠如するか又はヒトＦｃ部分（例えば、ヒト化抗体）を有する抗体断片を使用することが有利であり得る。

前述の態様によりスクリーニング、設計、遺伝子操作、又は他の手段で製造されたＣＤ９６阻害剤は、第１の態様の方法により（例えば、抗癌剤及び／又は抗ウイルス剤として）、好ましくは、上述のような医薬組成物の形態で使用することができる。

本発明を容易に理解し、実用的効果を実現させることができるように、以下の非限定的な例を参照する。
実施例
実施例１
マウス腫瘍モデルにおけるＣＤ１５５に対するＣＤ９６結合並びにＣＤ９６阻害及びノックアウトの効果
材料及び方法
マウス
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ又はＡＲＣ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ９６^−／−マウスは、ワシントン大学医学部（セントルイス、ミズーリ州、米国）のＭａｒｃｏ Ｃｏｌｏｎｎａ博士及びＳｕｓａｎ Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ博士により、以下のようにして作り出された。開始部位を含むＣＤ９６のエキソン１及び２を、ｌｏｘＰ部位に挟まれたＭＣ１−ｎｅｏｒ遺伝子と置換するように設計された標的構築体を、Ｅ１４．１（１２９Ｐ２／ＯｌａＨｓｄ）胚性幹細胞にエレクトロポレーションした（図Ｓ１）。標的化対立遺伝子を運搬するキメラを２つのクローンから取得し、その後Ｃ５７ＢＬ／６胚盤胞に注射した。標的化対立遺伝子を保持するマウスを、ＣＭＶプロモーター支配下でＣｒｅトランスジーンを発現するＣ５７ＢＬ／６マウスと交配して、ＭＣ１−ｎｅｏｒ遺伝子を欠失させた（Ｓｃｈｗｅｎｋら、１９９５年）。ＣＤ９６欠失は、Ｃ５７ＢＬ／６バックグランドに戻し交配し、各生成において１０センチモルガン間隙で、多型マイクロサテライトマーカーをゲノムワイドスクリーニングすることにより促進させた。ＣＤ９６^＋／−＞９９％のＣ５７ＢＬ／６マウスを互いに交配させて、ＣＤ９６^−／−マウスを作出した。ＤＮＡＭ−１^−／−マウスは、既に記載されている。ＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−は、ＣＤ９６^−／−をＤＮＡＭ−１^−／−マウスと互いに交配させることにより生成した。マウスを飼育して、６〜１４週齢で使用した。実験は全て、動物倫理委員会の承認を受けた。

細胞培養
Ｂ１６Ｆ１０、ＲＭ−１、３ＬＬ、ＡＴ３、ＭＣ３８、及びＹＡＣ−１細胞系を、５％ＣＯ_２中３７℃にて、完全ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で、すなわち１０％ＦＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＲＰＭＩ培地で増殖させた。細胞毒性アッセイ及びＩＬ−１２／ＩＬ−１８滴定実験の場合、一次ＮＫ細胞を脾臓から回収し、マウスＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）及びＡｕｔｏＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を使用して選別し、その後、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社）、ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、β−２−メルカプトエタノール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、及び１０００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を添加したＲＰＭＩ培地で５日間培養した。細胞は全て５％ＣＯ_２中３７℃でインキュベートした。

ｉｎ ｖｉｖｏ ＬＰＳ攻撃
ＰＢＳに懸濁したＬＰＳ（大腸菌０１２７由来：Ｂ８、Ｓｉｇｍａ社）を、記載されている用量でマウスに腹腔内注射した。生存曲線を得るために、マウスの敗血症の症状を毎時チェックした。これらのマウスの血清を、サイトカイン分析用に、後眼窩出血又は心臓出血により種々の時点で採取した。また、種々の時点で脾臓を採取して、受容体及びリガンド発現、並びにＮＫ細胞の細胞内ＩＦＮ−γ発現を分析した。

ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍攻撃
マウスＢ１６Ｆ１０又はＢ１６−ＯＶＡ黒色腫、ＲＭ−１前立腺癌、３ＬＬ肺癌、ＭＣ３８−ＯＶＡ^ｄｉｍ結腸腺癌、又はＡＴ３−ＯＶＡ^ｄｉｍ乳癌を、ＷＴ、ＤＮＡＭ−１^−／−、ＣＤ９６^−／−、又はＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−マウスに、表示されている用量で皮下又は静脈内注射し、固形腫瘍増殖又は転移をそれぞれモニタリングした。図凡例に示されるように処置を行った。固形腫瘍増殖をモニタリングするために、触知可能な腫瘍の長さ及び幅をカリパスで計測することにより、成長した腫瘍の面積を計算し、時間に対してプロットした。転移形成をモニタリングするために、細胞を注射した１４日後に肺を回収し、ブアン固定液中に置き、解剖顕微鏡を使用して転移を計数した。

ＭＣＡ誘導性線維肉腫
ＷＴ、ＤＮＡＭ−１^−／−、ＣＤ９６^−／−、及びＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−マウスの右側腹に、種々の用量のＭＣＡ（５〜４００μｇ、例えば、１００μｇのＭＣＡ）を皮下注射し、線維肉腫形成を経時的にモニタリングした。加えて、幾つかのマウスを対照抗体で処置し、抗ａｓｉａｌｏＧＭ１（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社；−１日目、０日目、及びその後は８週目まで毎週、１００μｇをｉ．ｐ．注射した）での処置によりＮＫ細胞を欠乏させ、ＩＦＮ−γ（Ｈ２２、−１日目、０日目、及びその後は８週目まで毎週、２５０μｇをｉ．ｐ．注射した）、ＣＤ１５５、ＤＮＡＭ−１、又はＣＤ９６を無効化した。

樹状細胞（ＢＭＤＣ）：ＮＫ細胞共培養アッセイ
ＢＭＤＣを、以前の記載ように作製した。簡潔に述べると、本発明者らは、マウスの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を回収し、１０％ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、β−２−メルカプトエタノール、及び２５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加したＤＭＥＭ中で６日間培養した。ＷＴ又はＣＤ９６^−／−ＮＫ細胞を脾臓から回収し、ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）抗体及びＴＣＲβ（Ｈ５７−５９７）抗体及びＣＤ３（１７Ａ２）抗体での染色により、高純度にＦＡＣＳ選別した。ＮＫ細胞は、アッセイ当日に回収した。アッセイのセットアップは、５×１０^４個のＢＭＤＭを、９６ウェルＵ底プレートに播種した。その後、ＮＫ細胞を、様々な用量設定で（２：１、１：１、０．５：１、及び０．２５：１）ＢＭＤＭに添加した。アッセイには、ＢＭＤＭのみ及びＮＫのみが対照として常に含まれていた。細胞を全て播種したら、各ウェルを適量の培地で満たして、ウェル間の容積を等しくした。その後、ウェルに１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを添加し、２時間後、５ｍＭの精製ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ社）を添加して３０分間おいた。これは、５％ＣＯ_２中３７℃で実施した。また、アッセイには、ＬＰＳのみ及びＡＴＰのみが対照として含まれていた。ＡＴＰの３０分後に、上清を回収し、分析まで−２０℃で保存した。

^５１Ｃｒ細胞毒性アッセイ
標準的^５１Ｃｒ細胞毒性アッセイを使用して、ＷＴ細胞及びＣＤ９６^−／−ＮＫ細胞の標的を死滅させる能力を分析した。簡潔に述べると、１００μＣｉの^５１Ｃｒで標識した２０，０００個の標的を、Ｖ底プレートに添加し、その後、ＮＫ細胞を、規定のエフェクター対標的比で標的に添加した。５％ＣＯ_２中３７℃で４時間後に上清を回収し、^５１Ｃｒのレベルをガンマカウンター（Ｗａｌｌａｃ Ｗｉｚａｒｄ社）で計数した。比死滅率は、以下の式を使用して決定した：（試料Ｃｒ放出−自然Ｃｒ放出）／（総Ｃｒ放出−自然Ｃｒ放出）×１００。

サイトカイン検出
ＩＬ−１８を除いて、血清又は上清におけるサイトカイン検出は全て、サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）技術（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用することにより達成した。データ取得は、ＣａｎｔｏＩＩ又はＬＳＲＩＩフローサイトメトリーアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して実施した。分析は、ＦＣＡＰアレイソフトウェアを使用して実施した。ＩＬ−１８は、製造業者（ＭＲＬ社）の説明書に従ってＥＬＩＳＡにより検出した。細胞内サイトカインを検出する場合、単離リンパ球を肝臓から取得し、表面マーカーを染色し、固定し、透過処理し（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、抗ＩＦＮ−γ抗体（ＸＭＧ１．２）で染色した。

フローサイトメトリー分析及び選別
免疫細胞恒常性及びＣＤ９６／ＣＤ１５５発現の分析：種々の器官（リンパ節、肺、脾臓、骨髄、及び肝臓）を、赤血球細胞溶解物を含む単一リンパ球懸濁液に加工した。１×１０^６〜５×１０^６個の細胞を、特異的抗体を使用する前に、まず２．４Ｇ２と共にインキュベーションして、非特異的Ｆｃ抗体の結合を阻止した。ＮＫ細胞恒常性及びＩＦＮ−γ産生を分析するために、以下の抗体を使用した：抗マウスＮＫ１．１、抗マウスＴＣＲβ、抗マウスＣＤ２７（ＬＧ．７Ｆ９）、抗マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、及び抗マウスＩＦＮ−γ。Ｔ細胞の場合：抗マウスＴＣＲβ、抗マウスＣＤ８（５３−６．７）、及び抗マウスＣＤ４（ＲＭ４−５）。Ｂ細胞の場合：抗マウスＢ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、抗ＣＤ１９（１Ｄ３）。ＮＫ Ｔ細胞の場合：α−ガラクトシルセラミドを負荷したマウスＣＤ１ｄ四量体（メルボルン大学のＤａｌｅ Ｇｏｄｆｒｅｙ教授の厚意により提供）、抗マウスＴＣＲβ又は抗マウスＣＤ３、抗マウスＣＤ４、及び抗マウスＮＫ１．１。マクロファージの場合：抗マウスＦ４／８０（ＢＭ８）及び抗マウスＣＤ１１ｂ。好中球の場合：抗マウスＬｙ６Ｇ（１Ａ８）及び抗マウスＣＤ１１ｂ。従来型ＤＣの場合：抗マウスＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）及び抗マウスＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）。γδＴ細胞の場合：抗マウスγδＴＣＲ（ＧＬ３）及び抗マウスＣＤ３。ＣＤ９６及びＣＤ１５５発現を分析するために、目的の特定の細胞タイプを、抗マウスＣＤ９６（３．３．３）又は抗マウスＣＤ１５５（４．２４．３）と共に上記の抗体カクテルを使用して選別した。データ取得は、ＬＳＲＩＩ又はＣａｎｔｏＩＩフローサイトメトリーアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して実施した。分析は、Ｆｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社）を使用して達成した。

細胞選別
脾臓に由来する未感作ＮＫ細胞及びマクロファージを、上述のように調製及び染色した。その後、これらの細胞を、Ａｒｉａ ＩＩ ＦＡＣＳソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、高純度に選別した。

統計分析
統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して達成した。データは、ｐ値が０．０５以下であった場合に、統計的に有意であるとみなした。使用した統計検定は、独立スチューデントｔ検定、マン−ホイットニーｔ検定、及びマンテル−コックス生存検定であった。使用した適切な検定は、図凡例に規定されている。

結果
ＣＤ９６は、ＣＤ１５５との結合においてＤＮＡＭ−１と競合し（図１）、ＣＤ９６がＣＤ１５５と結合すると、ＮＫ細胞でのＩＦＮγ産生が下方制御される（図２）。ＣＤ９６は、ＭＣＡ処置マウスのＮＫ細胞依存性腫瘍免疫監視を制限し、実験的Ｂ１６Ｆ１０肺転移を促進する（図３）。

図４のデータは、抗ＣＤ９６ｍＡｂが単剤活性を有し（つまり、抗ＰＤ１処置を必要としない）、また抗ＰＤ１の抗腫瘍応答を増強することを示す。また、抗ＣＤ９６ｍＡｂ処置は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）化学療法により生じる抗腫瘍応答を増強する（図５及び７）。これは、ドキソルビシン（ＤＯＸ）化学療法に対する抗腫瘍応答の増強が、ＣＤ９６欠損宿主で観察された図６と一致する。図８及び９を参照すると、初期でも後期でも、抗ＣＤ９６ｍＡｂは、抗ＰＤ−１ｍＡｂ及び抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂにより生じる抗腫瘍応答を増強し、抗ＰＤ−１との著しく強力な相乗効果を示す。

腫瘍転移の促進に対するＣＤ９６の効果も調査した。図１０では、Ｂ１６Ｆ１０肺転移の制御を、Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）、ＤＮＡＭ−１^−／−、ＣＤ９６^−／−、及びＤＮＡＭ−１^−／−ＣＤ９６^−／−マウスで調査した。図１１では、宿主ＣＤ９６は、ＲＭ−１肺転移を促進した。図１２では、宿主ＣＤ９６は、３ＬＬ肺転移を促進した。図１３は、抗ＣＤ９６ｍＡｂが、単独で又はＴ細胞チェックポイント遮断との組み合わせで、Ｂ１６Ｆ１０肺転移を抑制することを示す。図１４では、抗ＣＤ９６は、単独で又はＴ細胞チェックポイント遮断との組み合わせで、ＲＭ−１肺転移を抑制する。図１５では、抗ＣＤ９６ｍＡｂは、MC３８結腸腫瘍に対する抗ＰＤ−１ｍＡｂ及び抗ＣＴＬＡ−４ｍＡｂにより生じる抗腫瘍応答を増強し、抗ＰＤ−１との著しい強力な相乗効果を示す。

実施例２
抗ＣＤ９６抗体を特定するためのスクリーニングアッセイ
導入
以下のアッセイを使用して、本発明に有用な抗体を特定することができる。第１のアッセイを使用すれば、ヒトＣＤ９６とヒトＣＤ１５５との結合を阻止又は阻害可能なヒト抗体を識別することができるであろう。第２のアッセイを使用すれば、特定した抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を引き起こすか否かを試験することができる。その後、第３のアッセイを、主要候補に適用することができる。第３のアッセイは、ヒトＣＤ９６抗体が、ヒトリンパ球エフェクター機能を調節することができるか否かを決定することを含む。

材料及び方法
アッセイ１：ＣＤ１５５に対するＣＤ９６の結合
ＣＤ９６発現細胞（ＮＫ細胞等）の細胞表面に対するＣＤ１５５の結合を防止する候補抗ＣＤ９６抗体の能力は、以下のように試験されるであろう。ヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃ領域と融合させた組換えヒトＣＤ１５５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から入手可能なＣＤ１５５−Ｆｃ等）を、製造業者の説明書に従ってＺｅｎｏｎヒトＩｇＧ標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）を使用して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（ＡＦ６４７）等のフルオロフォアで標識する。健常ドナーの末梢血から新たに単離したＮＫ細胞又は他のＣＤ９６発現細胞を、様々な濃度の抗ＣＤ９６又は対照ＩｇＧの存在下で、ＡＦ６４７標識ＣＤ１５５−Ｆｃと共にインキュベートする（細胞を回収し、ＡＦ６４７−ＣＤ１５５−Ｆｃの細胞表面結合を、フローサイトメトリーにより試験する）。ＣＤ９６発現細胞に対するＣＤ１５５細胞の結合を防止する抗体は、ＣＤ９６発現細胞に対するＣＤ１５５−Ｆｃの結合を阻止する能力により特定されるであろう。

アッセイ２：ＡＤＣＣアッセイ
抗ＣＤ９６抗体の存在下での免疫細胞（ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞等）の生存率を、以下のように分析する。健常ドナーに由来する末梢血免疫細胞を、フィコール勾配分離により単離する。免疫細胞を、適切な用量のヒトＩＬ−２の存在下で抗ＣＤ９６ｍＡｂ濃度を増加させた９６ウェルプレートに播種する。ＣＤ９６発現細胞（ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞等）の生存率並びにパーセントを、フローサイトメトリーにより経時的に分析する。このアッセイに好適な市販キットの非限定的な例は、アネキシンＶアポトーシス検出キットである。

アッセイ３：ヒトＣＤ９６抗体によるヒト白血球エフェクター機能調節のアッセイ
新しい血液試料を、健常ドナーから収集する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配で遠心分離により調製する。高度に純粋なＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞を、磁気活性化細胞選別によりＰＢＭＣから得る。ヒトＮＫ細胞でのＩＦＮ−γ産生に影響を及ぼすＣＤ９６の能力を分析するために、９６ウェルＵ底プレートを、組換えヒトＣＤ１５５−Ｆｃキメラ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．社；０．２５μｇ／ウェル）又は無関係のヒトＩｇＧ１抗体で、一晩４℃にてコーティングする。その後、新しく精製したヒトＮＫ細胞を、ヒトＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び任意選択でＩＬ−１５を添加した完全ＲＭＰＩ培地に播種して２４時間後、ＩＦＮ−γの細胞内含有量及び上清レベルを、様々な培地で分析する。或いは、ヒトＮＫ細胞を、抗ＮＫＧ２Ｄ、抗ＮＫｐ４６、抗ＮＫｐ３０、又は抗ＣＤ１６抗体でコーティングしたウェルで２４時間刺激して、他のＮＫ細胞受容体と相互作用するＣＤ９６シグナル伝達の能力を分析する。試験する抗ヒトＣＤ９６抗体又は対照抗体を、上記のサイトカイン又は抗体を添加する前に培養に添加して、これらの試験抗ヒトＣＤ９６抗体が、ヒトＮＫ細胞のＩＦＮγ産生を増強する能力を確認する。ＩＦＮγ産生が対照よりも統計的に増加した場合を、有意であるとみなす。

実施例３
抗ＣＤ９６抗体によるマウスＮＫ細胞機能調節のアッセイ
また、追加の抗マウスＣＤ９６抗体を、ＣＤ９６シグナル伝達活性を調節する能力についてスクリーニングする。マウスＮＫ細胞でのＩＦＮ−γ産生を分析するために、９６ウェルＵ底プレートを、組換えマウスＣＤ１５５−Ｆｃキメラ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．社；０．２５μｇ／ウェル）又は無関係のヒトＩｇＧ１抗体で、一晩４℃にてコーティングする。ＰＢＳで３回洗浄した後、表示されているマウス株に由来する新しく精製したＮＫ細胞を、マウスＩＬ−１２（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；２５〜１００ｐｇ／ｍｌ）及びマウスＩＬ−１８（Ｒ＆Ｄ社；５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した完全ＲＭＰＩ培地に播種して２４時間おく。或いは、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６；０．１２５μｇ／ウェル）でコーティングしたウェルにて６時間刺激する。様々な時点で、抗マウスＣＤ９６抗体（５０〜２００μｇ／ｍｌ）又は対照抗体を添加して、ＣＢＡ分析により測定して、これらがＮＫ細胞でのＩＦＮ−ｇ産生を増強するか否かを決定する。

実施例４
マウス及びヒト抗ＣＤ９６抗体の産生
ヒトＣＤ９６は、膜貫通型タンパク質であり、２つのアイソフォームが存在する。アイソフォーム１は、急性骨髄性白血病で検出されており、アイソフォーム２と比較して追加のアミノ酸を含む。ヒトでは、アイソフォーム２が一般的な形態であり、アイソフォーム２の予想ドメイン構造は、表１に列挙されているように、３つの外部免疫グロブリン様ドメイン（ドメイン１、２、及び３）を有する。本発明での使用には、アイソフォーム２に対する抗体が好ましい。アイソフォーム２の核酸及びアミノ酸配列は、ＮＣＢＩコンセンサス配列番号ＣＣＤＳ２９５８．１（それぞれ配列番号１及び２）に示されている。

マウスＣＤ９６タンパク質も膜貫通型タンパク質であるが、マウスでは、配列番号３及び４に示されるような単一の転写物／アイソフォームのみが知られている。

マウス及びヒトＣＤ９６タンパク質の外部ドメインを、ヒト胚腎臓細胞等の哺乳動物細胞で発現させるための適切な発現構築体にクローニングする。好適な発現構築体には、典型的には、ＣＤ９６遺伝子断片の発現を駆動するＣＭＶプロモーターが含まれる。哺乳動物細胞に形質移入した後、抗体産生の前にタンパク質を好適な培養条件下で発現させてから精製する。

４匹のＣＤ９６ノックアウトマウスを、マウスＣＤ９６外部ドメインタンパク質で免疫し、同様に、４匹のＣＤ９６ノックアウトマウスを、精製したヒトＣＤ９６外部ドメインタンパク質で免疫する。免疫処置は、４週間間隔でおよそ３回行われる。マウスは、３回目の免疫の１０〜１２日後に出血させ、血清を、ＥＬＩＳＡにより抗原スクリーニングで滴定する。最も高い抗体価を有するマウスを融合に使用する。或いは、マウスが十分に応答しない場合、更なる免疫処置を試みる。選択したハイブリドーマをクローニングし、各クローンからｍＡｂを精製した後、個々のヒト又はマウスｍＡｂを、それぞれ実施例２又は３のスクリーニングアッセイを使用してスクリーニングする。任意選択で、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４抗体等の、ＡＤＣＣを誘導する可能性が低いか又は誘導することができない抗体を特定するために、クローンのアイソタイプ決定を行う。実施例４の表１に列挙されているように、ヒトＣＤ９６に対するおよそ２０個の抗体、及びマウスＣＤ９６に対する２０個の抗体を得る。

実施例５
マウス及びヒト抗ＣＤ９６抗体のスクリーニング
抗マウスＣＤ９６モノクローナル抗体及び抗ヒトＣＤ９６モノクローナル抗体の各々およそ２０個の抗体を、実施例４に記載のように得る。抗ヒトＣＤ９６抗体を、実施例２に記載のヒトＮＫ細胞アッセイを使用して、ＣＤ９６シグナル伝達活性を調節する能力についてスクリーニングする。また、更なる４つの市販の抗ヒトＣＤ９６抗体（１Ｃ８、ＮＫ９２．３９、３Ｈ８、ＭＡＡ６３５９）を、ＣＤ９６シグナル伝達を調節する能力についてスクリーニングする。また、抗マウスＣＤ９６ｍＡｂを、実施例３に記載のように、ＮＫ細胞機能を調節する能力についてスクリーニングする。

抗体の場合あり得ることだが、全ての抗体が、所与の標的に有用な効果を示すとは限らないことが予想される。したがって、ＣＤ９６シグナル伝達を、抗体毎に、ヒト又はマウスＮＫ細胞アッセイを使用して評価して、どの抗体がＣＤ９６シグナル伝達に効果を示すかを決定することになるであろう。

ヒトＮＫ細胞アッセイを使用した予備的結果
図１７Ａ及び１７Ｂに示されるように、実施例２に記載のヒトＮＫ細胞アッセイを使用して、ＮＫ９２．３９ヒトＣＤ９６ｍＡｂが、ヒトＮＫ細胞でのＩＦＮ−γレベルを増加させることを見出した。この結果は、ヒトＣＤ９６受容体に対する抗体が、ヒトＮＫ細胞でのＩＦＮ−γ産生を増加させるのに有効であり得ることを示す。

実施例６
癌モデルにおける抗マウスＣＤ９６抗体試験
マウス癌モデルにおいて、ＣＤ９６シグナル伝達の調節に活性があることが見出された抗マウスＣＤ９６抗体を、免疫抑制を軽減する、ＣＤ９６活性を低減する、及び／又は免疫監視を強化若しくは回復させる能力について試験する。

およそ１０個の活性抗マウスＣＤ９６抗体を、実施例１で使用したものと同じ又は同様のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍攻撃を使用して、およそ５〜７つの癌モデルで個々に試験する。
それぞれの腫瘍に対する各ＣＤ９６抗体の効力及び／又は腫瘍モデルでの効力は様々であり得る。あるものは、他よりも処置に対してより応答性であり得る。試験する腫瘍及び腫瘍モデルの非限定的な例には、乳癌、前立腺癌、肺癌、黒色腫、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮内膜癌、腎臓癌、腸癌、胃癌、食道癌、白血病、リンパ腫、卵巣癌、膀胱癌、及び脳腫瘍が含まれ、前述の癌の原発性腫瘍及び／又は転移が含まれる。

実施例７
ヒトＣＤ９６抗体結合研究
抗ヒトＣＤ９６抗体のサブセットを更に調査して、ＣＤ９６のどのドメインが、有効なＣＤ９６抗体と結合するかを決定する。上記の実施例３で議論されているように、ＣＤ９６のアイソフォーム２は、３つの外部ドメイン（ドメイン１、２、及び３）を含む。

抗体は、ＣＤ９６タンパク質と結合し、特定のＣＤ９６タンパク質残基は、水素／重水素交換及び質量分析法を使用して決定されるであろう^{２３，２４}。或いは、Ｘ線結晶解析、指定部位突然変異誘発、又は当技術分野で知られている他の方法等の、他の方法を使用して、抗体−ＣＤ９６結合部位を探索することができる。

有効な抗体は、ＣＤ９６タンパク質の１つ又は複数の外部ドメインに結合することができることが予想される。例えば、ヒトＮＫ細胞機能を調節する抗ＣＤ９６抗体は、外部ＣＤ９６ドメインの以下の組み合わせのいずれかと結合することができ、各々の考え得る単一の結合ドメイン又は結合ドメインの組み合わせは、括弧内に示される：（１）、（２）、（３）、（１、２）、（１、３）、（２、３）、（１、２、３）。

実施例８
ＮＫ及びＴ細胞機能の両方におけるＣＤ９６の役割
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、初期腫瘍増殖及び転移を制限するために重要であり得る先天性リンパ球であり、Ｔ細胞は、確立した原発性腫瘍の制御において、より重要であり得る。ＣＤ９６は、ＮＫ細胞機能及びＴ細胞機能の両方に影響を及ぼすことができるチェックポイント免疫調節物質である。

原発腫瘍を使用して、Ｔ細胞におけるＣＤ９６の役割を調査した。ＣＤ８^＋Ｔエフェクター細胞が腫瘍増殖を自然に制御することが知られているＡＴ３−ＯＶＡ^ｄｉｍモデルを使用した。ＡＴ３−ＯＶＡ^ｄｉｍ乳癌（１×１０^６細胞）を皮下注射した。その後、マウスの腫瘍増殖をモニタリングし、ノギスを使用して２つの直交する直径の積（ｍｍ^２）として測定を行った。

抗ＣＤ９６処置は、腫瘍増殖の速度を大幅に低減した。この有益な効果は、抗ＣＤ４／ＣＤ８抗体を使用してＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を枯渇させることにより、又は抗ＩＦＮ−γでの処置により、除去することができた（図１６Ａ及び１６Ｂ）。これは、抗ＣＤ９６ｍＡｂが、この特定の腫瘍モデルで完全な抗腫瘍活性を示すには、ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＩＦＮ−γを必要とすることが決定的に重要であることを示す。

実施例９
ＣＤ９６ｍＡｂ結合後のＮＫ細胞表面からのＣＤ９６の喪失
また、ＣＤ９６に対する抗体結合時に生じ得る機構的効果／シグナル伝達効果は、ＣＤ９６−ＣＤ１５５結合の効果に関する機能的情報を明らかにすることができる。これを更に研究するために、全ＮＫ細胞を、ヒトＮＫ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ．社）を使用して、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、ネガティブ選択により精製した。その後、細胞増殖を測るため、単離したＮＫ細胞をカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で標識した。ＣＦＳＥ標識ＮＫ細胞を、９６ウェルＵ底プレートに５×１０^４細胞／ウェルで播種し、３０μｇ／ｍｌの対照ＩｇＧ又は抗ＣＤ９６ｍＡｂ（クローンＮＫ９２−３９）の存在下にて、表示されている濃度（１０単位／ｍｌ及び２５単位／ｍｌ）の組換えＩＬ−２で刺激した。３日目及び６日目に、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して、増殖の変化又は表面ＣＤ９６の有無について、ＮＫ細胞を評価した。分析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ社）を使用して実施した（図１８（Ａ）及び（Ｂ）。ＣＤ９６に対する抗ＣＤ９６の結合は、ＮＫ細胞増殖に影響を及ばさなかったが、ｍＡｂ結合後のＣＤ９６内部移行、又は恐らくはＣＤ９６発現の低減のいずれかにより、６日目までに細胞表面のＣＤ９６レベルが大幅に低減したと考えられた。

明細書の全体にわたって、本発明を任意の１つの実施形態又は特定の一群の特徴に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を記載することが目的である。したがって、本開示を参照すれば、本発明の範囲から逸脱することなく、例示されている特定の実施形態に種々の改変及び変更をなすことができることは、当業者であれば理解するところである。

本明細書で参照されているコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許、及び科学文献は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
参考文献

Claims (21)

1. 哺乳動物の免疫抑制を低減するための医薬組成物の製造におけるＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片の使用であって、前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片は、ＣＤ１５５へのＣＤ９６の結合を阻害し、前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片は、前記哺乳動物の１つ又は複数のＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、又はそれらの両方におけるＣＤ９６活性を低減することにより、前記哺乳動物の免疫抑制を低減する、使用。
2. 前記哺乳動物におけるＣＤ９６活性を低減することが、前記哺乳動物のＣＤ９６発現細胞を死滅させることを含まないか、又は少なくともそれに依存しない、請求項１に記載の使用。
3. 前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片が、ＣＤ９６の１つ又は複数の外部免疫グロブリン様ドメインと結合又は相互作用する、請求項１に記載の使用。
4. 前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片が、ドメイン１；ドメイン２；ドメイン３；ドメイン１及びドメイン２；ドメイン１及びドメイン３；ドメイン２及びドメイン３；並びにドメイン１、ドメイン２及びドメイン３からなる群から選択される、ＣＤ９６の１つ又は複数の外部免疫グロブリン様ドメインと結合するか又はそれと相互作用する、請求項３に記載の使用。
5. 前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片が、ヒトＣＤ９６アイソフォーム２（配列番号２）の１つ又は複数の外部免疫グロブリン様ドメインと結合するか又はそれと相互作用する、請求項３又は請求項４に記載の使用。
6. 前記医薬組成物は、１つ又は複数の他の治療剤と組み合わせて投与されるものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
7. 前記１つ又は複数の他の治療剤が、化学療法剤と、ＰＤ１及びＣＴＬＡ４の少なくとも一方と結合する１つ又は複数の抗体又は抗体断片とを含む、請求項６に記載の使用。
8. 前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片は、前記哺乳動物の１つ又は複数のＴ細胞、ＮＫ細胞、又はそれらの両方による、サイトカイン及びケモカインの少なくとも一方の発現、分泌、又はそれらの両方を増加又は増強する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
9. 前記サイトカイン及びケモカインの少なくとも一方が、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、及びＩＦＮ−γを含む、請求項８に記載の使用。
10. 前記サイトカインがインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）である、請求項９に記載の使用。
11. 前記１つ又は複数のＴ細胞が、ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞、γδＴ細胞、及びＮＫＴ細胞のうちから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
12. 前記医薬組成物は、前記哺乳動物の癌又は癌転移を治療又は予防するための医薬組成物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
13. 前記医薬組成物は、前記哺乳動物のウイルス感染症を治療又は予防するための医薬組成物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
14. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
15. ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片を、哺乳動物の免疫抑制を低減することについてスクリーニングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される方法であって、
    ＣＤ９６を発現する１つ又は複数のＴ細胞、ＮＫ細胞、又はそれらの両方を、候補抗体又は候補抗体断片と接触させるステップ、及び
    候補抗体又は候補抗体断片が、ＣＤ１５５へのＣＤ９６の結合を阻害することで、前記ＣＤ９６を発現する１つ又は複数のＴ細胞、ＮＫ細胞、又はそれらの両方においてＣＤ９６活性を低減することが可能であるか否かを決定するステップを含み、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏのステップにより、ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片を、哺乳動物の免疫抑制を低減することについてスクリーニングする方法。
16. 前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片が、ＣＤ９６の１つ又は複数の外部免疫グロブリン様ドメインと結合又は相互作用する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片が、ドメイン１；ドメイン２；ドメイン３；ドメイン１及びドメイン２；ドメイン１及びドメイン３；ドメイン２及びドメイン３；並びにドメイン１、ドメイン２及びドメイン３からなる群から選択される、ＣＤ９６の１つ又は複数の外部免疫グロブリン様ドメインと結合又は相互作用する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片が、ヒトＣＤ９６アイソフォーム２（配列番号２）の１つ又は複数の外部免疫グロブリン様ドメインと結合又は相互作用する、請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
19. 前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片が、癌又は癌転移を治療又は予防するためのものである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記ＣＤ９６阻害抗体又はＣＤ９６阻害抗体断片が、ウイルス感染症を治療又は予防するためのものである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記哺乳動物がヒトである、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。