CN110709416A

CN110709416A - TGF-β诱饵受体

Info

Publication number: CN110709416A
Application number: CN201880008625.9A
Authority: CN
Inventors: J·康诺利; R·霍普金; 艺杰·P·王; S·H·彼得森
Original assignee: Tech Co
Current assignee: Tech Co
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2020-01-17
Also published as: EP3574006A1; US20190352373A1; JP2020505069A; WO2018138003A1; SG11201906552WA; AU2018212403A1; TW201831193A; KR20190111058A

Abstract

公开了包含TGF‑β结合区和脂质锚定区的TGF‑β诱饵受体。还公开了包含TGF‑β结合区的嵌合抗原受体(CAR)。还公开了包含TGF‑β诱饵受体和CAR的组合物和使用方法。

Description

TGF-β诱饵受体

技术领域

本发明涉及转化生长因子β(TGF-β)的诱饵受体。

背景技术

用离体扩增或遗传修饰的T细胞进行的免疫疗法在治疗血液恶性肿瘤方面显示出巨大的期望。然而，转移入的T细胞的长期维持持续受其活化状态和与宿主相关因子的相互作用的限制。另外，克服肿瘤微环境的抑制性质仍然是T细胞免疫疗法的主要挑战。

转化生长因子β(TGF-β)是一种免疫抑制细胞因子，其表达在多种癌症中上调。TGF-β通过异二聚体TGF-β受体复合物发出信号，该复合物由1型和2型亚基组成。已显示通过TGF-β受体的信号传导抑制T细胞增殖、体内维持持续性和效应子功能。

发明内容

在一个方面，本发明提供TGF-β诱饵受体，其包含TGF-β结合区结构域和细胞膜锚定区或由其组成。在一些实施方案中，细胞膜锚定区包含脂质锚或由脂质锚组成。在一些实施方案中，脂质锚是GPI锚。

另一方面，本发明提供TGF-β诱饵受体，其包含TGF-β结合区结构域和脂质锚定区或由其组成。

TGF-β诱饵受体可以是包含任选通过接头与细胞膜锚定区共价连接的TGF-β受体的细胞外结构域或由其组成的融合蛋白，所述TGF-β受体的细胞外结构域与细胞膜锚定区共价连接，任选地通过接头。

在一些实施方案中，脂质锚定区包含脂质锚或由脂质锚组成。在一些实施方案中，脂质锚是GPI锚。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺乏跨膜结构域。

在一些实施方案中，脂质锚定区包含作为脂质锚定信号序列的氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列是脂质锚定信号序列。在一些实施方案中，脂质锚定信号序列是糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列。

在一些实施方案中，TGF-β结合区结构域包含对应于TGF-β受体的TGF-β结合区结构域的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，TGF-β受体是II型TGF-β受体(TGF-βR2)。

在一些实施方案中，TGF-β结合结构域TGF-β结合区包含与SEQ ID NO：4具有出现至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，细胞膜锚定区包含对应于CD48、CD44、CD55、CD90或胎盘型碱性磷酸酶之一的GPI信号序列的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，脂质锚定区域包含以下和GPI锚或由以下和GPI锚组成：(i)与SEQ ID NO：15-18中任一个具有出现至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(ii)GPI锚，和与SEQ ID NO：19-22中的任一个具有出现至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含以下和GPI锚或由以下和GPI锚组成：(i)与SEQ ID NO：5-8中的任一个具有出现至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO：11-14任一之一出现具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，以及GPI锚。

另一方面，本发明提供了包含TGF-β结合区的嵌合抗原受体(CAR)，其包含所述TGF-β结合区包含对应于TGF-β受体的TGF-β结合结构域TGF-β结合区的氨基酸序列或由其组成的TGF-β结合结构域。

在一些实施方案中，TGF-β受体是II型TGF-β受体(TGF-βR2)。在一些实施方案中，TGF-β结合结构域TGF-β结合区包含与SEQ ID NO：4具有出现至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

另一方面，本发明提供了编码本发明的TGF-β诱饵受体或CAR的核酸。

另一方面，本发明提供了包含本发明核酸的载体。

另一方面，本发明提供了一种细胞，其包含本发明的TGF-β诱饵受体或CAR、核酸或载体。

另一方面，本发明提供了产生表达TGF-β诱饵受体或CAR的细胞的方法，包括将本发明的核酸或载体导入细胞，并在适于细胞表达细胞的核酸或载体的条件下培养细胞。

另一方面，本发明提供了通过本发明的制备表达TGF-β诱饵受体或CAR的细胞的制备方法而获得或可获得的细胞。

另一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的TGF-β诱饵受体或CAR、核酸、载体或细胞，和药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。

另一方面，本发明提供了根据本发明的一些实施方案、TGF-β诱饵受体或CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物，以用于治疗或预防疾病或病症的方法或条件。

另一方面，本发明提供了根据本发明的TGF-β诱饵受体或CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途或条件。

另一方面，本发明提供治疗或预防疾病或病症的方法，包括给予受试者根据本发明的治疗或预防有效量的本发明TGF-β诱饵受体或CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物。

另一方面，本发明提供治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，包括：

从受试者中分离至少一个细胞；

修饰该至少一个种细胞以表达或包含本发明的TGF-β诱饵受体或CAR、核酸或载体，和；

将该修饰的至少一个种细胞给予受试者。

从受试者中分离至少一个细胞；

将根据本发明的核酸或载体导入该至少一个细胞，从而修饰该至少一个细胞；和

将该修饰的至少一个种细胞给予受试者。

在根据本发明的各个方面的一些实施方案中，所述疾病或病症为癌症。

另一方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含本发明的预定量的本发明TGF-β诱饵受体或CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物。

具体实施方式

本发明涉及能够结合并抑制TGF-β介导的信号传导的TGF-β诱饵受体，编码这种TGF-β诱饵受体的核酸和表达它们的细胞。本发明的TGF-β诱饵受体作为TGF-β的诱饵受体起作用。还描述了多肽、核酸和细胞的治疗用途。

TGF-β和TGF-β介导的信号传导

转化生长因子β(TGF-β)是具有三种形式的多功能细胞因子，分别为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。在细胞因子的TGF-β超家族内，TGF-β1-3形成高度相似的蛋白质的亚家族。

人TGF-β1(NCBI参考序列：NP_000651.3)为390个氨基酸的蛋白，而TGF-β2(NCBI参考序列：NP_001129071.1)为442个氨基酸的蛋白，和TGF-β3(NCBI参考序列：NP_001316868.1)含有412个氨基酸。TGF-β1-3各自在N末端具有分泌所必需的20-30个氨基酸信号肽，称为潜伏相关肽(LAP)的前区和112-114个氨基酸C末端区域，其中在前区蛋白水解切割后成为成熟的TGF-β分子(Khail等人1999年Microbes Infect.1(15):1255–63)。成熟的单体TGF-β二聚化以产生生物活性的25KDa蛋白。TGF-β1-3可以与相同类型的TGF-β形成同源二聚体，或者可以与另一类TGF-β形成异二聚体(例如TGF-β1：TGF-β2异二聚体)。TGF-β包含九个保守的半胱氨酸残基，其中八个形成二硫键以形成TGF-β超家族特征性的半胱氨酸结状结构。剩余的半胱氨酸与另一TGF-β单体的半胱氨酸相互作用形成二聚体。位于第五和第六保守半胱氨酸残基之间的表面暴露区域是TGF-β1-3蛋白中最不保守的区域，并且被认为对TGF-β的受体结合和特异性是重要的。

在本说明书中，“TGF-β”是指来自任何物种的TGF-β，包括来自任何物种的TGF-β的亚型、片段、变体或同源物。在一些实施方案中，TGF-β是人TGF-β、灵长类动物TGF-β、非人灵长类动物TGF-β、啮齿动物TGF-β、鼠TGF-β或哺乳动物TGF-β。在一些实施方案中，TGF-β受体是TGF-β1(TGF-β1)、TGF-β2(TGF-β2)或TGF-β3(TGF-β3)。

TGF-β通过与TGF-β受体结合并激活经由TGF-β受体的信号传导而发挥其功能性效果。TGF-β受体包含具有TGF-β结合区的胞外域、单跨膜结构域和包含丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的胞内域。TGF-β受体有三种主要类型：TGF-βR1(NCBI参考序列：NP_004603.1)、TGF-βR2(NCBI参考序列：NP_001020018.1)和TGF-βR3(NCBI参考序列：NP_003234.2)。

在本说明书中，“TGF-β受体”是指来自任何物种的TGF-β受体，包括来自任何物种的TGF-β受体的亚型、片段、变体或同源物。在一些实施方案中，TGF-β受体是人TGF-β受体、灵长类动物TGF-β受体、非人灵长类动物TGF-β受体、啮齿动物TGF-β受体、鼠TGF-β受体或哺乳动物TGF-β受体。在一些实施方案中，TGF-β受体是TGF-β受体1(TGF-βR1)、TGF-β受体2(TGF-βR2)或TGF-β受体3(TGF-βR3)。

人TGF-βR1(包括33个氨基酸信号肽)是503个氨基酸的蛋白，而成熟形式为470个氨基酸，其中包含93个氨基酸的胞外域、21个氨基酸的跨膜域和356个氨基酸的胞内域。蛋白质的胞外域包含TGF-βR1的TGF-β结合区。人TGF-βR1的氨基酸序列(NCBI参考序列：NP_004603.1)及其结构域如下所示：

人TGF-βR1(NP_004603.1)

信号肽(第1-33位残基)；胞外域(第34-126位残基)；跨膜域(第127-147位残基)；

(第148-503位残基)。

人TGF-βR2(包括22个氨基酸信号肽)是592个氨基酸的蛋白，成熟形式为570个氨基酸，其中包含169个氨基酸的胞外域、21个氨基酸的跨膜域和380个氨基酸的胞内域。该蛋白的胞外域包含TGF-βR2的TGF-β结合区(Hart等人2002年，Nat Struct Biol.9(3)：203-8；pfam08917：ecTbetaR2)。人TGF-βR2的氨基酸序列(NCBI参考序列：NP_001020018.1)及其结构域如下所示：

人TGF-βR2(NP_001020018.1)

信号肽(第1-22位残基)；胞外域(第23-191位残基)；

(第74-177位残基)；

(第192-212位残基)；

(第213-592位残基)。

人TGF-βR3(包括18个氨基酸信号肽)是851个氨基酸的蛋白，成熟形式是833个氨基酸，包含769个氨基酸的胞外域、22个氨基酸的跨膜域和42个氨基酸的胞内域。该蛋白的胞外域包含TGF-βR3的TGF-β结合区。人TGF-βR3的氨基酸序列(NCBI参考序列：NP_003234.2)及其结构域如下所示：

人TGF-βR3(NP_003234.2)

信号肽(第1-18位残基)；胞外域(第19-787位残基)；跨膜域(第788-809位残基)；胞内域(第810-851位残基)。

其他TGF-β结合蛋白已经被描述。Onichtchouk等人1999年，Nature 401(6752)：480-485描述了BMP与活化膜结合抑制剂(BAMBI)蛋白，BAMBI蛋白是一种跨膜糖蛋白，其与TGF-β家族的I型受体的胞外域密切相关，但是具有较短的无酶活性的胞内域。已显示BAMBI通过阻断TGF-βR1和TGF-βR2之间的相互作用来抑制TGF-β信号传导。Bollard等人2002年，Blood 99(9)：3179-3187和Zhang等人2013年，Gene Therapy 20,575-580描述了抗原反应性T细胞的工程化以表达显性失活TGF-βR2(DN-TGF-βR2)，其包含TGF-βR2的胞外域和跨膜区，但缺乏信号传导所需的胞质域。Penafuerte等人2011年，J Immunol.186(12)：6933-6944描述了IL-2与TGF-βR2的可溶性胞外域的嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白作为诱饵受体，捕获溶液中的活性TGF-β，并与IL-2反应性淋巴细胞相互作用，诱导IL-2R介导的信号传导。Russo等人2009年，Int J Biochem Cell Biol 41：472-476和Zhang等人2013(同上)描述了可溶性TGF-β受体分子，该受体分子包含TGF-β受体的胞外TGF-β结合域。在一些情况下，可溶性TGF-β受体分子还包含Fc结构域。

TGF-β介导的信号传导参与胚胎发生和组织稳态，并通过调节细胞增殖、分化、凋亡、粘附、侵袭和细胞微环境介导其作用，如在Meulmeester和Ten Dijke 2011年，J Pathol223：205–218中所描述。

活性TGF-β二聚体通过TGF-βI型和II型受体(分别为TGF-βR1和TGF-βR2)介导信号传导。TGF-βR2负责将TGF-β募集到异聚体TGF-β：TGF-βR1：TGF-βR2受体复合物中，并且TGF-βR2与TGF-β1和TGF-β3结合的K_D小于5pM，而与TGF-β3结合的K_D为～5nM(De Crescenzo等人2003年，J Mol Biol.328(5):1173-83)。膜锚定的TGF-βR3有助于TGF-β与TGF-βR2的结合(Lopez-Casillas等人，Cell 1993；73：1435-1444)。TGF-β与TGF-βR2的高亲和力结合，导致其与TGF-βR1形成异四聚体复合物，异四聚体复合物进而通过TGF-βR2导致TGF-βR1的磷酸化。

在大多数细胞类型中，TGF-βR1转导信号传导，而在某些细胞类型中，ALK1或其他TGF-β超家族I型受体可介导信号传导响应。TGF-βR1通过募集和磷酸化受体调节的Smad蛋白来传播信号传导。活化的Smads与普通Smad形成复合物(co-Smad；哺乳动物中的Smad4)并穿梭进入细胞核，在细胞核它们与DNA结合转录因子相互作用以调节靶基因的转录。Smad非依赖性信号传导也可通过TRAF6-TAK1-p38/JNK途径发生，TGF-βR1也通过直接磷酸化Shc的酪氨酸和丝氨酸残基位点，激活Erk-MAP激酶信号传导(Lee等人，2007年EMBO J 26：3957-3967).TGF-wβR2也可以通过直接磷酸化Par6，TGF-βR1非依赖性地传导信号(Ozdamar等人，Science；307：1603-1609).

如本文所用，“TGF-β介导的信号传导”是指由TGF-β和/或TGF-β受体、TGF-β和/或TGF-β受体的片段、以及包含TGF-β、TGF-β受体和/或其片段的多肽复合物介导的信号传导。

在本说明书中，TGF-β受体是指能够结合TGF-β的多肽。TGF-β受体可以来自任何物种，包括来自任何物种的TGF-β受体的亚型、片段、变体或同源物。在优选的实施方案中，该物种是人(智人(Homo sapiens))。在一些实施方案中，TGF-β受体可以是TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3。TGF-β受体的同种型、片段、变体或同源物可任选地表征为与来自给定物种(例如人类)的TGF-β受体的氨基酸序列同一性为至少70％，优选为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。TGF-β受体的同种型、片段、变体或同源物可任选地通过与TGF-β(优选来自相同物种)结合和刺激表达TGF-β受体的细胞中的信号转导的能力来表征。TGF-β受体的片段可出现任何长度(氨基酸数)，但可任选地为成熟TGF-β受体长度的至少25％，并且最大长度为成熟TGF-β受体长度的50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。TGF-β受体片段的片段的最小长度可以有10个氨基酸，并且最大长度为15、20、25、30、40、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700或800个氨基酸之一。

在一些实施方案中，TGF-β受体可包含TGF-βR2的TGF-β结合区或由其组成。根据Hart等人2002年Nat Struct Biol.9(3)：203-8的定义，人TGF-βR2的TGF-β结合区对应于SEQ ID NO：2的氨基酸第74-177位(pfam08917：ecTbetaR2)。在一些实施方案中，TGF-β受体可任选地表征为与来自给定物种的TGF-βR2的TGF-β结合区的氨基酸序列的同一性至少为70％，优选为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一些实施方案中，TGF-β受体可包含TGF-βR2的胞外域或由其组成。人TGF-βR2的胞外域对应于SEQ ID NO：2的氨基酸23-191。在一些实施方案中，TGF-β受体可任选地表征为与来自给定物种的TGF-βR2的胞外域的氨基酸序列的同一性至少为70％，优选为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一些实施方案中，TGF-β受体可包含TGF-βR1的胞外域或由其组成。人TGF-βR1的胞外域对应于SEQ ID NO：1的氨基酸第34-126。在一些实施方案中，TGF-β受体可任选地表征为与来自给定物种的TGF-βR1的胞外域的氨基酸序列的同一性至少为70％，优选为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一些实施方案中，TGF-β受体可包含TGF-βR3的胞外域或由其组成。人TGF-βR3的胞外域对应于SEQ ID NO：3的氨基酸19-787。在一些实施方案中，TGF-β受体可任选地表征为与来自给定物种的TGF-βR3的胞外域的氨基酸序列的同一性至少为70％，优选为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一些实施方案中，TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)是哺乳动物(例如食蟹猴、人和/或啮齿动物(例如大鼠和/或鼠)的TGF-β)。TGF-β的同种型、片段、变体或同源物可任选地表征为与来自给定物种(例如人)的未成熟或成熟TGF-β的氨基酸序列的同一性至少为70％，优选为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。TGF-β的同种型、片段、变体或同源物可任选地通过结合TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3；优选来自相同物种)并刺激表达TGF-β受体的细胞中的信号转导的能力来表征。TGF-β的片段可以是任何长度(氨基酸数)，但可任选地为成熟TGF-β长度的至少25％，并且最大长度可为成熟TGF-β长度的50％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。TGF-β的片段的最小长度可以为10个氨基酸，并且最大长度为15、20、25、30、40、50、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425或440个氨基酸之一。

TGF-β介导的信号传导和疾病

TGF-β/TGFβ受体信号传导也与癌症有关，例如在Nacif和Shaker 2014年J CancerTher 5：735-747，Meulmeester和Ten Dijke 2011年J Pathol 223205-218，以及Akhurst和Hata 2012年Nat Rev Drug Discov.11(10):790-811中所述。

TGF-β信号传导组分的突变已经在许多癌症中观察到；例如，在结肠癌、胃癌、胆管癌、肺癌、卵巢癌、食管癌和头颈癌中，TGF-β受体突变伴随微卫星不稳定性(MSI)高表达，并且在胰腺癌和胃肠道肿瘤中观察到Smad4突变。TGF-β发挥肿瘤抑制作用，例如通过调节细胞增殖，凋亡，及间接通过肿瘤基质。

虽然TGF-β对上皮细胞或肿瘤发生的早期生长敏感阶段发挥保护性或肿瘤抑制作用，但在肿瘤发展后期，癌细胞对TGF-β介导的生长抑制作用耐受，并且在恶性肿瘤发展的晚期阶段由过量的TGF-β驱动。

在肿瘤微环境中，TGF-β通过对血管和免疫细胞和成纤维细胞的促肿瘤作用刺激肿瘤进展，促进侵袭和转移。一旦肿瘤细胞经历遗传和/或表观遗传变化，减弱TGF-β的生长抑制作用，TGF-β1就可以驱动恶性进展和转移(Connolly等人2012年Journal ofBiological Sciences，8,964-978)。不同类型的肿瘤如胶质瘤、乳腺癌和前列腺癌突变似乎优先发生于，TGF-β信号传导的非核心成分，并保留利用TGF-β信号传导诱导促进上皮-间质转化(EMT)、肿瘤侵袭、转移性传播和免疫系统逃逸的途径的能力。

Torre-Amione等人1990年Proc Natl Acad Sci USA 87：1486-1490报道了TGF-β能够抑制肿瘤诱导的CD8+溶细胞性T淋巴细胞(CTL)介导的小鼠肿瘤排斥反应，并且在所有T细胞表达显性失活形式的TGF-βR2(DN-TGF-βR2)的小鼠中，黑素瘤或淋巴瘤细胞系的生长和转移减少(Gorelik等人2001年Nature Med 7：1118-1122)。已证明TGF-β抑制CTL中促凋亡因子的产生，例如穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B、FAS配体和干扰素-γ(Thomas等人2005年Cancer Cell 8：369-380)。Bollard等人2002年Blood 99(9)：3179-3187报道，工程化表达DN-TGF-βR2的EBV特异性CTL对TGF-β的抗增殖和抗细胞毒性作用出现抗性，并继续分泌细胞因子以响应抗原性刺激；这样的CTL出现选择性的功能和生存优势(Bollard等人2002年Blood 99(9)：3179-3187)。工程化表达可溶性TGFβ-2R或DN-TGF-βR2的T细胞已经显示出对体外TGF-β诱导的Smad2磷酸化的抗性，以及在黑素瘤肿瘤模型中抗原特异性CD8+和CD4+的T细胞中DN-TGF-βR2的表达已证明提高了肿瘤治疗效果(Zhang人2013年Gene Therapy20,575-580)。

TGF-β也被证明可以抑制天然杀伤(NK)细胞的活性；通过中和抗TGF-β的抗体，抑制TGF-β，增加NK细胞活性，从而抑制接种的乳腺癌细胞系的转移发成(Arteaga等人1993年J Clin Invest 92：2569-2576)。TGF-β通过抑制NKG2D和NKp30的转录抑制NK介导的细胞毒性(和抗肿瘤活性)(Castriconi等人2003年Proc Natl Acad Sci USA 100：4120–4125；Kopp等人2009年Cancer Res 69：7775-7783)。

TGF-β介导的信号传导在其他疾病/病症的病理学中也是重要的，如例如在Nacif和Shaker 2014年(同上)及Akhurst和Hata 2012年(同上)中所述。TGF-β信号传导涉及以纤维化为特征的疾病的病理学，例如特发性肺纤维化(IPF)、肾纤维化、心脏纤维化(例如与心肌梗塞、缺血性、扩张性和肥大性心肌病和充血性心力衰竭相关的纤维化)、硬皮病、骨髓增生异常综合征(MDS)、冠状动脉搭桥术或血管成形术后再狭窄、Marfan综合征、眼部病症术后瘢痕形成(例如小梁切除术治疗青光眼或角膜手术后)、糖尿病和肥胖症。

TGF-β诱饵受体

本发明提供TGF-β诱饵受体。TGF-β诱饵受体是能够结合TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)的肽/多肽或其多个(例如非共价复合物)。“受体”包括其片段和衍生物。“TGF-β诱饵受体”是能够以细胞因子受体与其配体结合的方式结合TGF-β又不能发出信号的肽/多肽或其多个。因此，诱饵受体通过与TGF-β结合并使配体不能结合信号传导的TGF-β受体而充当TGF-β介导的信号传导的抑制剂。

根据本发明的TGF-β诱饵受体能以分离的形式提供。

TGF-β诱饵受体不是TGF-β的特异性抗体或抗体的抗原结合片段。TGF-β诱饵受体缺乏编码能够特异性结合TGF-β的抗体或抗原结合片段的重链和轻链互补决定区(CDR)和/或重链和轻链可变区的序列。

如本文所用，“肽”是通过肽键连接的两个或更多个氨基酸单体的链。肽通常长约2-50个氨基酸。“多肽”是两个或更多个肽的聚合物链。多肽通常长于约50个氨基酸。

本发明的TGF-β诱饵受体与TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)结合。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体与人TGF-β(例如人TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)结合。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体与非人灵长类动物TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3结合。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体与鼠TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3结合。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体与含TGF-β的分子/复合物结合，例如TGF-β：TGF-β受体复合物。例如，TGF-β诱饵受体可以与例如TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)和TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的复合物结合。

本发明的TGF-β诱饵受体可以结合TGF-β和含有TGF-β的复合物，从而使这些种类不能与TGF-β受体(例如内源性TGF-β受体)结合。

本发明的TGF-β诱饵受体不能传导信号。TGF-β诱饵受体优选缺乏TGF-β受体信号转导所需的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺乏编码TGF-β受体的功能性催化结构域的氨基酸序列；例如，TGF-β诱饵受体可能缺少编码功能性丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺乏TGF-β受体信号转导所必需的因子的募集或激活所必需的氨基酸序列。

因此，本发明的TGF-β诱饵受体充当TGF-β和含TGF-β的复合物的“诱饵”受体，其方式与例如Bollard等人2002年Blood 99(9)：3179-3187和Zhang等人2013年Gene Therapy20,575-580描述的显性负性TGF-βR2(即DN-TGF-βR2)充当TGF-β的诱饵受体相同。

如本文所用，“显性负性的TGF-βR2”和“DN-TGF-βR2”是指包含TGF-βR2的TGF-β结合区和TGF-βR2的跨膜结构域却缺乏功能性激酶结构域的种类。

与不表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞(如用TGF-β处理后)的信号传导水平相比，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞的TGF-β介导的信号传导被降低。

本发明的TGF-β诱饵受体优选通过一个或多个TGF-β结合域与TGF-β结合。TGF-β结合域是TGF-β的天然存在的受体分子的TGF-β结合域，或者衍生自TGF-β结合域或与其同源。例如，本发明的TGF-β诱饵受体可以包含一个或多个TGF-β结合域或由其组成，所述TGF-β结合域衍生自TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3的TGF-β结合域或与其同源。

如本文所解释的，TGF-β和含有TGF-β的复合物能够通过与细胞表面上表达的TGF-β受体结合而激活TGF-β介导的信号传导。本发明的TGF-β诱饵受体能够结合TGF-β和含TGF-β的物质，例如抑制这些物质与细胞膜结合的TGF-β受体相互作用的能力，从而抑制TGF-β介导的信号。

这优选通过TGF-β诱饵受体与结合TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3)如内源性表达的TGF-β受体所需的TGF-β区域结合来实现。

也就是说，TGF-β诱饵受体减少可用于结合细胞表达的功能性TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3)并通过其激活信号传导的TGF-β和含TGF-β的物质的数量。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体能够结合与TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3结合的TGF-β区域中的TGF-β。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体能够与TGF-β的结合区域与TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3结合的TGF-β区域相同或是TGF-β的重叠区域。可以使用竞争性结合测定法(例如竞争性ELISA)分析在与TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3结合的区域的相同区域或重叠区域中结合TGF-β的能力。在这样的测定中，相比于TGF-β诱饵受体不存在时的相互作用水平，在有TGF-β诱饵受体存在下或者在一种或两种相互作用伴侣与TGF-β诱饵受体孵育后观察到TGF-β和TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3)之间的相互作用水平降低/减小，表明TGF-β诱饵受体结合于TGF-β受体所结合区域的相同TGF-β区域或重叠区域。还可通过多种现有技术方法分析相互作用来确定本发明的TGF-β诱饵受体与TGF-β结合的区域是TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3结合的相同区域还是重叠区域，包括受体-配体复合物的X射线共结晶分析、肽扫描、诱变映射、通过质谱法的氢-氘交换分析、噬菌体展示和基于蛋白水解的“保护”方法。此类方法描述于例如Gershoni等人BioDrugs，2007,21(3)：145-156中，本文将其整体引入。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含对应于TGF-β受体的TGF-β结合区的氨基酸序列。本文中，“对应于TGF-β受体的TGF-β结合区的氨基酸序列”可以是TGF-β受体的TGF-β结合区的氨基酸序列，或能与TGF-β结合且与TGF-β受体的TGF-β结合区的氨基酸序列的同一性至少为60％，例如至少为65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。TGF-β受体和TGF-β可以来自任何物种，并且包括来自任何物种的同种型、片段、变体或同源物。在一些实施方案中，TGF-β受体是TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3。在一些实施方案中，TGF-β是TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含TGF-β受体的TGF-β结合区。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与TGF-β受体的TGF-β结合区至少70％序列同一性的氨基酸序列。

给定TGF-β受体的TGF-β结合区可通过本领域技术人员熟知的常规方法鉴定，例如，通过与已知的TGF-β结合区比较，和/或通过分析TGF-β受体的肽/多肽片段与TGF-β结合的能力，例如通过ELISA测定。

根据Hart等人2002年，Nat Struct Biol.9(3)：203-8的TGF-βR2的TGF-β结合区(pfam08917：ecTbetaR2)对应于人TGF-βR2的第74-177位(NCBI参考序列：NP_001020018.1)如SEQ ID NO：2所示，即：

技术人员能够通过常规方法鉴定人TGF-βR2的给定同源物的TGF-β结合区。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的TGF-β结合区的序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的TGF-β结合区的序列同一性大于70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与TGF-βR2的TGF-β结合区的序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与TGF-βR2的TGF-β结合区的序列同一性为大于70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与SEQ ID NO：4的序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与SEQ ID NO：4的序列同一性为大于70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。

氨基酸序列之间的序列同一性可以通过本领域技术人员已知的方法确定。例如，为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，可以比对待比较的序列(例如，可以在第一和第二氨基酸序列中的一个或两个中引入空位以进行最佳比对)，也可以比较相应位置的氨基酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸占据时，序列在该位置出现“同一性”。为了序列的最佳比对，需要引入这些间隙，考虑到间隙的数量和每个间隙的长度，两个序列之间的同一性百分比是相同位置的数量的函数。优选在所比较的氨基酸序列的全长上确定序列同一性。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与如本文所述的TGF-β诱饵受体，例如图1所示的TGF-β诱饵受体的TGF-β结合区具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。

图1中所示的TGF-β诱饵受体包含衍生自TGF-βR2的区域，其包含TGF-β结合区。图1的TGF-β诱饵受体的TGF-βR2衍生区如下所示：

TGF-βR2衍生区包含TGF-β结合区：

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNP(SEQ ID NO：9)

其残基1-22代表TGF-βR2的信号肽，因此SEQ ID NO：9的成熟序列是：

TIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNP(SEQ ID NO：10)

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与SEQ ID NO：9或10的序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含与SEQ ID NO：9或10的序列同一性大于70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。

本发明的TGF-β诱饵受体包含细胞膜锚定区。如本文所用，“细胞膜锚定区”是提供将TGF-β诱饵受体锚定于表达TGF-β诱饵受体的细胞的细胞膜的区域。“锚定”可能是可逆的或不可逆转的。

在一些实施方案中，细胞膜锚定区可包含氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，细胞膜锚定区可包含脂质部分或由其组成。

锚定可以通过细胞膜锚定区与细胞膜或其组分(例如磷脂)的非共价或共价结合直接实现。在一些实施方案中，锚定可以通过细胞膜锚定区与膜结合因子或定位于细胞膜的因子(例如外周或整合细胞膜相关蛋白)的共价或非共价结合间接实现。

细胞膜锚定区可以直接通过该区域与细胞膜/其组分/因子的共价或非共价结合提供锚定作用。

在一些实施方案中，细胞膜锚定区可通过编码指导受体的加工(例如翻译后修饰)的信号序列来提供锚定作用，导致与细胞膜/其组分/因子的共价或非共价结合。例如，细胞膜锚定区可包含糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列或由其组成，引导受体的加工以连接GPI锚。

细胞膜锚定区优选不是跨膜域。本发明的TGF-β诱饵受体优选缺乏跨膜域。也就是说，TGF-β诱饵受体缺乏编码跨膜域的氨基酸序列。本文中，“跨膜域”是指在生物膜(例如细胞膜)中形成热力学稳定的三维结构的氨基酸序列。跨膜域通常能够跨越细胞膜的脂质双层，例如，作为疏水性α螺旋或β桶形结构。跨膜结构域记录在数据库中，例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白质信息资源(Protein Information Resource)、蛋白质数据库(Protein Data Bank)、Ensembl和InterPro，和/或可以鉴定/预测例如使用氨基酸序列分析工具，如TMHMM(Krogh等人2001年J Mol Biol 305：567-580)。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体的细胞膜锚定区可以是脂质锚定区。在一些实施方案中，脂质锚定区包含脂质锚(例如GPI锚)或由其组成。在一些实施方案中，脂质锚定区包含脂质锚定信号序列或由其组成。

如本文所用，“脂质锚”是指能够与生物膜(例如细胞膜)的脂质组分缔合(例如共价)的部分。通过这种结合作用，附着有脂质锚的蛋白“锚定”在细胞膜中。脂质锚的实例包括异戊二烯基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、脂肪酰基、二酰基甘油、甾醇基、磷脂和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚。

在一些实施方案中，脂质锚定区包含脂质锚定信号序列或由其组成。本文中，“脂质锚定信号序列”是指指导蛋白加工以附着脂质锚定物的氨基酸序列。在这样的处理之后，TGF-β诱饵受体包含脂质锚。

脂质锚通常包含亲脂基团。脂质锚，其亲脂基团和蛋白质的修饰以附着脂质锚定如Resh 2013年Curr Biol.23(10):R431-R435中所述，其全部内容在此引入作为参考。

脂质锚可包含异戊二烯基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、脂肪酰基、二酰基甘油、甾醇基或磷脂基或由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚或由其组成。

异戊二烯基可以包含15个(法呢基)或20个(香叶基香叶基)碳原子，其通过硫醚键与蛋白C-末端的半胱氨酸残基连接。半胱氨酸的羧基也可以是甲基化的。具有与其共价连接的异戊二烯基(例如法呢基或香叶基香叶基)的蛋白可以称为异戊烯化蛋白。

肉豆蔻酰基是14碳的饱和脂肪酰基，其可以通过酰胺键与甘氨酸残基连接。具有与其共价连接的肉豆蔻醇基团的蛋白可称为豆蔻酰化蛋白。

棕榈酰基是16碳的饱和脂肪酰基，其可以通过硫醚键与蛋白质的半胱氨酸或残基连接，或者可以通过酯键与丝氨酸或苏氨酸残基连接。具有与其共价连接的棕榈酰基的蛋白可称为棕榈酰化蛋白。

脂肪酰基和1,2-二酰基甘油基可以分别通过酰胺和硫醚键与蛋白的半胱氨酸残基连接。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体可以是GPI锚定的、异戊烯化的、肉豆蔻酰化的、棕榈酰化的、脂肪酰化的、二酰基甘油化的、硬脂酰化的或磷脂化的蛋白。

在一些实施方案中，脂质锚定信号序列将异戊二烯基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、脂肪酰基、二酰基甘油、硬脂酰基或磷脂基团或糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚连接-TGF-β诱饵受体，以提供该受体的修饰。在加工由脂质锚定信号序列引导的TGF-β诱饵受体后，受体可包含脂质或由其组成。

在一些实施方案中，'脂质锚定信号序列'是GPI锚定信号序列。因此，在一些实施方案中，本发明的脂质锚是GPI锚。

“GPI信号序列”是指导蛋白修饰以将GPI锚连接于蛋白的氨基酸序列。GPI信号序列指导蛋白的翻译后修饰，将GPI锚与蛋白C末端的共价连接。GPI锚及其与蛋白的连接描述于例如Vidal C.J.(编辑)蛋白质评论Protein Reviews 13，Springer Science 2011年，“健康和疾病中的GPI锚定蛋白质”(GPI-Anchored Proteins in Health and Disease)的第2章，其通过引用整体并入本文。

本文中，“GPI锚”是指包含磷脂酰肌醇基团的部分，所述磷脂酰肌醇基团通过糖苷键与四糖聚糖核心连接，所述四糖聚糖核心依倍与磷酸乙醇胺连接。

四糖聚糖核心可以是三甘露糖基-非乙酰化葡糖胺(Man3-GlcN)核心。磷脂酰肌醇基团的脂质尾部可以是例如酰基或烷基脂肪酸、或神经酰胺。

GPI锚可以通过核心聚糖上的磷酸乙醇胺桥与共价连接到蛋白C末端的α-羧基上：-6-甘露糖(α1-2)甘露糖(α1-6)甘露糖(α1-4)葡糖胺(α1-6)肌醇，其进而通过肌醇环通过磷酸二酯桥连接-脂质部分。脂质部分可以变化，但在大多数哺乳动物中，这是1-烷基-2-酰基甘油。可以通过添加乙醇胺和糖侧链来修饰核心聚糖，可以用脂质基团修饰肌醇环，还可以重构脂肪酸。

引导GPI锚加到蛋白上的GPI信号序列位于氨基酸链的C末端。序列通常包含15-25个氨基酸残基，在其C-末端出现一段疏水残基。C末端疏水序列之前是引导GPI锚添加的共有序列：ω，ω+1和ω+2，其中ω＝具有小侧链的氨基酸(例如Ala、Asn、Asp、Cys、Gly或Ser)，ω+1＝除Pro或Trp之外的任何残基，其中ω+2＝Gly或Ala(或偶尔为Ser或Thr)。

在切割了ω和ω+1残基之间多肽后，预组装的GPI锚通过转酰胺酶在ER中连接到ω残基的C-末端侧。转酰胺酶是一种多蛋白复合物，包含催化成分Gpi8P和其他成分Gaa1p、Gpi16p(PIG-T)和Gpi17p(PIG-S)(Fraering等人2001年Molecular Biology of the Cell，12,3295-3306)。

在GPI锚附着后，GPI锚定蛋白缺乏ω残基C-末端的氨基酸序列。可以使用GPI修饰位点的预测工具，包括例如：big-PI预测服务器(Eisenhaber等人Protein Engineering(1998)11，第12卷,1155-1161；Sunyaev等人Protein Engineering(1999)12，第5卷,387-394；艾森哈伯等人JMB(1999)292(3)，741-758；和艾森哈伯等人TIBS(2000)25(7)，340-341)。这些工具可用于识别ω残基。

在图1中，指出了使用big-PI Prediction Server预测的针对不同GPI信号序列的ω残基。图2显示了为附着GPI锚处理了图1中所示的氨基酸序列后的成熟GPI锚定蛋白的结构。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体包含GPI信号序列，例如，在附着GPI锚点的处理之前。GPI信号序列是能够指导附着GPI锚的变换后处理的任何序列。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含GPI信号序列直到包括ω残基，例如，处理附加GPI锚点之后。

对于许多GPI锚定蛋白，GPI信号序列及其ω残基是已知的，并且记录在诸如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、Protein Information Resource蛋白质信息资源、Protein Data Bank蛋白质数据库、Ensembl和InterPro等数据库中，和/或可以被识别/预测，例如使用氨基酸序列分析工具，例如big-PI预测服务器(以上)。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体包含GPI信号序列(例如在连接GPI锚处理之前)，或包含GPI信号序列直到包括ω残基(例如，在附着GPI锚处理之后)，对应于GPI锚定蛋白的GPI信号序列。在一些实施方案中，GPI锚定蛋白是以下之一：归巢细胞粘附分子(HCAM；CD44)、神经细胞粘附分子(NCAM；CD56)、5'核苷酸酶(CD73)、衰变加速因子(DAF；CD55)、CD90(Thy1)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、肠碱性磷酸酶、胎盘碱性磷酸酶、MAC抑制蛋白(CD59)、CD14、CD16、CD24、CD28、CD48、CDw52、CD58、CD66a、CD66c、CD66d、CD66E、CD67、CD87、CD108、CD157、乙酰胆碱酯酶(AchE)、尿激酶型纤溶酶原激活受体(uPAR)、JMH蛋白、GDNFR、CNTFR、TAG-1、PrP、磷脂酰肌醇蛋白、信号素7、CEA、GFR、Ly6G、转铁蛋白受体、接触素(F3)和T-钙粘蛋白。该蛋白可以来自任何物种，并且包括来自任何物种的同种型、片段、变体或同源物。

在一些实施方案中，GPI锚定蛋白是CD48(BLAST-1)、CD44(HCAM)、CD55(DAF)，胎盘碱性磷酸酶和CD90(Thy1)之一。

本文中，对应于“对应于参比GPI信号序列的GPI信号序列”是这样的氨基酸序列，其能够指导GPI锚与包含该序列的蛋白连接，并且与参比GPI信号序列的序列同一性至少为60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体包含GPI信号序列(例如在连接GPI锚处理之前)，或包含GPI信号序列直到包含ω残基(例如，在附着GPI锚处理之后)，对应于SEQID NO：15-18之一的GPI信号序列(ω残基加下划线)：

CD48 GPI：

DVCSPPCTLARSFGVEWIASWLVVTVPTILGLLLT(SEQ ID NO：15)

附着GPI处理后的序列：

DVCSPPCTLARS(SEQ ID NO：19)

CD55 GPI：

HETTPNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT(SEQ ID NO：16)

附着GPI处理后的序列：

HETTPNKGSGTTS(SEQ ID NO：20)

PLAC ALKPHOS GPI：

TACDLAPPAGTTDAAHPGPSVVPALLPLLAGTLLLLGTATAP(SEQ ID NO：17)

附着GPI处理后的序列：

TACDLAPPAGTTD(SEQ ID NO：21)

CD90 GPI：

NVTVLRDKLVKCEGISLLAQNTSWLLLLLLSLSLLQATDFMSL(SEQ ID NO：18)

附着GPI处理后的序列：

NVTVLRDKLVKC(SEQ ID NO：22)

源自CD48的SEQ ID NO：15的序列对应于SEQ ID NO：15的第4-35位。源自CD48的 SEQ ID NO：19的序列对应于SEQ ID NO：19的第4-12位。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体包含GPI信号序列(例如在连接GPI锚处理之前)，其与SEQ ID NO：15-18之一或与SEQ ID NO：15的第4-35位的序列同一性至少为60％，例如，至少为65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体包含与SEQ ID NO：19-22之一或SEQ ID NO：19的或4-12位具有至少60％序列同一性的氨基酸序列和GPI锚(例如附着GPI锚处理之后)，例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体可包含如图1或2所示的结构或由其组成。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含TGF-β结合区，其包含与SEQ ID NO：9或10的序列同一性至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和GPI信号序列(例如，在附着GPI锚处理之前)，其与SEQ ID NO：15-18之一或SEQ ID NO：15的第4-35位的序列同一性至少为60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体包含TGF-β结合区，其包含与SEQ ID NO：9或10的序列同一性至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和与SEQ ID NO：19-22之一或SEQ ID NO：19的4-12位具有至少60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性之一的氨基酸序列和GPI锚(例如在附着GPI锚处理之后)。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体包含TGF-β结合区和GPI信号序列(例如在附着GPI锚处理之前)，并且包含与SEQ ID No：5-8之一的序列的同一性至少为60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体包含TGF-β结合区和GPI锚或由其组成，并且包含与SEQ ID NO：11-14之一的序列同一性为60％，例如至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一的氨基酸序列。

GPI锚定蛋白在细胞膜上被引导，其中氨基酸序列的N末端朝向胞外空间(即顶端表面)的ω残基。本发明的TGF-β诱饵受体在GPI信号序列N末端具有TGF-β结合区。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体可包含前导序列(也称为信号肽或信号序列)。前导序列通常由形成单个α螺旋的5-30个疏水性氨基酸序列组成。分泌蛋白和在细胞表面表达的蛋白通常包含前导序列。前导序列可以存在于TGF-β诱饵受体的N末端，并且可以存在于新合成的受体(例如在除去前导序列处理前)中。前导序列使TGF-β诱饵受体在细胞内有效运输。前导序列通常通过切割除去，因此不包含于成熟TGF-β诱饵受体中。

对于许多蛋白，前导序列是已知的，并且记录在诸如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、Protein Information Resource蛋白质信息资源、Protein Data Bank蛋白质数据库、Ensembl和InterPro的数据库中，和/或可以识别/预测，例如使用氨基酸序列分析工具，如SignalP(Petersen等人2011年Nature Methods 8：785-786)或Signal-BLAST(Frank和Sippl，2008年Bioinformatics 24：2172-2176)。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体的前导序列包含与SEQ ID NO：23的氨基酸序列的序列同一性至少为80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列或其组成。

TGF-βR2前导序列：

MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS(SEQ ID NO：23)

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体可在TGF-β结合区和脂质锚定区之间包含一个或多个接头。接头可以包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，并且可以与TGF-β结合区和脂质锚定区的氨基酸序列的末端共价键合(例如通过肽键)。

接头可以是肽或多肽接头。接头可以是柔性接头。柔性接头的氨基酸序列是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Chen等人Adv Drug Deliv Rev(2013)65(10)：1357-1369中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，柔性接头序列包含丝氨酸和甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是由1-100,1-50,1-20,1-10或1-5个氨基酸残基的氨基酸序列组成的肽/多肽。

本发明的TGF-β诱饵受体不同于天然存在的TGF-β结合分子，例如，天然存在的TGF-β诱饵受体。

本发明的TGF-β诱饵受体也不同于DN-TGF-βR2；DN-TGF-βR2包含TGF-βR2的跨膜域，而本发明的TGF-β诱饵受体缺乏跨膜域。

本发明的TGF-β诱饵受体也不同于现有技术中公开的缺乏细胞膜锚定区的可溶性TGF-βR2种类。相反，本发明的TGF-β诱饵受体包含细胞膜锚定区，例如脂质锚定区。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺乏对应于TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的跨膜和/或胞内域的氨基酸序列。

本文中，“对应于”给定肽/多肽的参比区域或序列的氨基酸序列与该参比区域/序列的氨基酸序列的序列同一性至少为60％，例如，至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺少对应于SEQ ID NO：1的残基127-147的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺少对应于SEQ ID NO：2的残基192-212的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺少对应于SEQ ID NO：3的残基788-809的氨基酸序列。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺少对应于SEQ ID NO：1的残基148-503的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺少对应于SEQ ID NO：2的残基213-592的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺少对应于SEQ ID NO：3的残基810-851的氨基酸序列。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺少对应于SEQ ID NO：1的残基127-503的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺少对应于SEQ ID NO：2的残基192-592的氨基酸序列。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体缺少对应于SEQ ID NO：3的残基788-851的氨基酸序列。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体可包含其他功能性氨基酸序列。例如，TGF-β诱饵受体可包含促进TGF-β诱饵受体的表达、折叠、运输、加工、纯化或检测的氨基酸序列。例如，TGF-β诱饵受体可以包含编码蛋白质标签的序列，例如任选在N-或C-末端的FLAG、His(例如6XHis)、Myc、GST、MBP、HA、E或生物素标签。

本发明的TGF-β诱饵受体可以被可检测地标记，或至少能够被检测。例如，TGF-β诱饵受体可以用放射性原子或有色分子或荧光分子或可以任何其他方式容易检测的分子标记。合适的可检测分子包括荧光蛋白、荧光素酶、酶底物、放射性标记和结合部分。可以通过与TGF-β诱饵受体缀合进行标记。TGF-β诱饵受体可以用可检测的标记物直接标记，或者可以间接标记。在一些实施方案中，标记可以选自：放射性核苷酸、正电子发射放射性核素(例如用于正电子发射断层扫描(PET)、MRI造影剂或荧光标记。

本发明的TGF-β诱饵受体可以与药物部分，例如细胞毒性小分子缀合。这种复合物可用于靶向杀死表达抗原分子的细胞。

嵌合抗原受体

本发明还提供了嵌合抗原受体(CAR)。CAR包含如本文所述的TGF-β结合区。

嵌合抗原受体(CAR)是提供抗原结合和T细胞活化功能的重组受体。例如，在Dotti等人Immunol Rev(2014)257(1)中综述了CAR结构和工程，该文献通过引用整体并入本文。

CAR包含与细胞膜锚定区和信号传导区连接的抗原结合区。任选的铰链区可以在抗原结合区和细胞膜锚定区之间提供分离作用，并且可以充当柔性接头。

CAR的抗原结合区可以是基于对CAR靶向的抗原的特异性抗体的抗原结合区，或者能够结合目标的其他试剂。例如，CAR的抗原结合区可包含互补决定区(CDR)的氨基酸序列、或特异性结合靶蛋白的抗体的完整轻链和重链可变区的氨基酸序列。CAR的抗原结合区可基于其他蛋白:蛋白相互作用而靶向抗原，如配体:受体结合；例如，已经使用基于IL-13的抗原结合域开发了IL-13Rα2靶向的CAR(参见例如Kahlon等人2004年Cancer Res 64(24)：9160-9166)。

在一些实施方案中，本发明的CAR包含如本文所述的TGF-β结合区。在一些实施方案中，TGF-β结合区包含对应于TGF-β受体(如TGF-βII型受体(TGF-βR2)的TGF-β结合区的氨基酸序列或由其组成。

细胞膜锚定区设置在抗原结合区和CAR的信号传导区之间。细胞膜锚定区域用于将CAR锚定至表达CAR的细胞的细胞膜，其中抗原结合区在胞外空间中，信号传导区在细胞内。已经描述了CAR的细胞膜锚定区，其衍生自CD3-ζ、CD4、CD8或CD28的跨膜区序列。

在一些实施方案中，本发明的CAR包含如本文所述的细胞膜锚定区。细胞膜锚定区可以例如是通过脂质锚定区。

在一些实施方案中，本发明的CAR包含如本文所述的TGF-β结合区和如本文所述的细胞膜锚定区。在一些实施方案中，CAR包含如本文所述的TGF-β诱饵受体或由其组成。

信号传导区允许激活T细胞。CAR信号传导区可以包含CD3-ζ的胞内域的氨基酸序列，其提供基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，用于磷酸化和激活表达CAR的T细胞。包含其他含ITAM的蛋白的序列的信号传导区也已用于CAR，例如包含含有ITAM的FcγRI区域的结构域(Haynes等人2001年J Immunol 166(1)：182-187)。包含源自CD3-ζ的胞内域的信号传导区的CAR通常被称为第一代CAR。

CAR的信号传导区还可以包含源自共刺激分子的信号传导区的共刺激序列，以促进表达CAR的T细胞的活化与靶蛋白结合。合适的共刺激分子包括CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27。具有包括其他共刺激序列的信号传导区的CAR通常被称为第二代CAR。

在一些情况下，CAR被设计为提供不同细胞内信号传导途径的共刺激作用。例如，与CD28共刺激相关的信号传导优先激活磷脂酰肌醇3激酶(P13K)途径，而4-1BB介导的信号传导是通过TNF受体相关因子(TRAF)配体蛋白。因此，CAR的信号传导区有时含有来自多于一种共刺激分子的信号传导区域的共刺激序列。包含具有多个共刺激序列的信号传导区的CAR通常被称为第三代CAR。

任选的铰链区可以在抗原结合域和跨膜域之间提供分隔作用，并且可以充当柔性接头。铰链区域可以是柔性域，允许将结合部分定位于不同方向。铰链区可以源自IgG1或免疫球蛋白的CH₂CH₃区。

CAR可与共刺激配体、嵌合共刺激受体或细胞因子组合以进一步增强T细胞效力、特异性和安全性(Sadelain等人，嵌合抗原受体(CAR)设计的基本原理The basicprinciples of chimeric antigen receptor(CAR)design.Cancer Discov.2013年4月；3(4)：388-398.doi：10.1158/2159-8290.Cd-12-0548,具体地通过引用并入本文)。

还提供了包含本发明的CAR的细胞。本发明的CAR可用于产生T细胞。将CAR转入T细胞可以在体外培养期间进行，用于转导和扩增，例如在过继T细胞疗法的T细胞扩增期间进行。

编码TGF-β诱饵受体和CAR的核酸

本发明提供了编码本发明的TGF-β诱饵受体或CAR的核酸。在一些实施方案中，核酸从，例如其他核酸或天然存在的生物材料中纯化或分离。

本发明还提供了包含编码本发明的TGF-β诱饵受体或CAR的核酸的载体。

如本文所用的“载体”是用作将外源核酸转移到细胞中的载体的核酸(DNA或RNA)。载体可以是用于在细胞中表达核酸的表达载体。此类载体可包括与编码待表达序列的核酸可操作地连接的启动子序列。载体还可包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于从本发明的载体表达本发明的TGF-β诱饵受体/CAR。

在本说明书中，术语“可操作地连接”可包括这样的情况，其中所选的核酸序列和调节性核酸序列(例如启动子和/或增强子)的共价连接方式使得核苷酸序列的表达在调节性序列的影响或控制下(从而形成表达盒)。因此，如果调节序列能够影响核酸序列的转录，则调控序列与所选的核酸序列可操作地连接。在适当的情况下，然后可以将得到的转录物翻译成所需的多肽。

优选提供本发明的核酸和/或载体用于引入细胞，例如原发性人体免疫细胞。合适的载体包括质粒、二元载体、DNA载体、mRNA载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒(MLV)源载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体和疱疹病毒)、基于转座子的载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)，例如如Maus等人Annu RevImmunol(2014)32：189-225或Morgan和Boyerinas的Biomedicines 2016 4,9中所述，它们均通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，病毒载体可以是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或单纯疱疹病毒载体。在一些实施方案中，慢病毒载体可以是pELNS、或可以源自pELNS。在一些实施方案中，载体可以是编码CRISPR/Cas9的载体。

包含/表达TGF-β诱饵受体和CAR的细胞

本发明还提供了包含或表达本发明的TGF-β诱饵受体或CAR的细胞。还提供了包含或表达本发明的核酸或载体的细胞。

细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。哺乳动物可以是人、或非人哺乳动物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿动物(包括啮齿目动物中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括乳牛，例如奶牛，或牛科(Bos)的任何动物)、马(包括马科(Equidae)中的任何动物)、驴和非人类灵长类动物。

在一些实施方案中，细胞可以来自人受试者，或者可以从人受试者获得。

在一些实施方案中，细胞是通常对TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)起反应的细胞，例如表达TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的细胞。

细胞可以是免疫细胞。细胞可以是造血来源的细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天性淋巴细胞(ILC)或其前体。细胞可以表达例如CD3多肽(例如CD3γ、CD3ε、CD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。

在一些实施方案中，细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+，CD8+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞是细胞毒性T细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。

在一些实施方案中，细胞可以是包含/表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞，例如CAR-T细胞。在一些实施方案中，细胞可以是包含/表达编码CAR的核酸或载体的细胞。嵌合抗原受体(CAR)是提供抗原结合和T细胞活化功能的重组受体。例如，在Dotti等人Immunol Rev(2014)257(1)中综述了CAR结构和工程改造，该文献通过引用整体并入本文。

还提供了包含/表达CAR的细胞，其包含/表达本发明的TGF-β诱饵受体或CAR。细胞可以是CAR-T细胞。将CAR转入T细胞可以在体外培养期间进行，用于转导和扩增，例如在过继T细胞疗法的T细胞扩增期间进行。

在一些实施方案中，细胞是抗原特异性T细胞。在本文的实施方案中，“抗原特异性”T细胞是对T细胞特异性的抗原或表达所述抗原的细胞其反应而表现出T细胞的某些功能特性的细胞。在一些实施方案中，所述特性是与效应T细胞，例如细胞毒性T细胞相关的功能特性。

在一些实施方案中，抗原特异性T细胞可以显示一种或多种以下特性：细胞毒性，例如针对包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞；增殖，IFNγ表达，CD107a表达，IL-2表达，TNFα表达，穿孔素表达，颗粒酶表达，颗粒溶素表达和/或FAS配体(FASL)表达，例如，对T细胞特异性的抗原或包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞起反应。

本文中，IFNγ、CD107a、IL-2、TNFα、穿孔素、颗粒酶和/或FASL的“表达”可以指基因表达或蛋白表达。基因表达可以通过本领域技术人员已知的各种方法测量，例如通过定量实时PCR(qRT-PCR)或通过基于报告分子的方法，测量mRNA的水平。类似地，蛋白表达可以通过本领域熟知的各种方法测量，例如，通过基于抗体的方法，例如通过蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT或基于报告分子的方法。“增加的表达”是指表达水平高于未与T细胞特异性的抗原、或包含或表达T细胞特异性的抗原的细胞接触的T细胞的基因/蛋白的表达水平，或对不包含或不表达T细胞特异性抗原的细胞起反应的T细胞的表达水平。

在一些实施方案中，T细胞特异性的抗原可以是病毒的肽或多肽，例如，EB病毒(EBV，Epstein-Barr virus)、流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、单纯疱疹病毒(HSV)或人类乳头状瘤病毒(HPV)。

本发明还提供了用于产生包含本发明的核酸或载体的细胞的方法，包括将本发明的核酸或载体导入细胞中。本发明还提供了产生表达本发明的TGF-β诱饵受体或CAR的细胞的方法，包括将本发明的核酸或载体导入细胞中。在一些实施方案中，所述方法还包括在适于细胞表达核酸或载体的条件下培养细胞。在一些实施方案中，所述方法体外进行。

在一些实施方案中，将本发明的分离的核酸或载体引入细胞中包括转导，例如逆转录病毒转导。因此，在一些实施方案中，分离的核酸或载体包含在病毒载体中，或载体是病毒载体。在一些实施方案中，该方法包括通过电穿孔引入本发明的核酸或载体，例如，如Koh等人Molecular Therapy-Nucleic Acids(2013)2，e114中所述，其通过引用整体并入本文。

本发明还提供了通过本发明的细胞的制备方法获得或可获得的细胞。

组合物

本发明还提供了包含本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体或细胞的组合物。

本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体和细胞可以配制成临床使用的药物组合物，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。

根据本发明，还提供了制备药学上有用的组合物的方法，这种制备方法可包括选自以下的一个或多个步骤：分离如本文所述的TGF-β诱饵受体、CAR、细胞、核酸或载体；和/或将如本文所述的TGF-β诱饵受体、CAR、细胞、核酸或载体与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。

例如，本发明的另一方面涉及配制或生产用于治疗癌症的药物或药物组合物的方法，该方法包括通过将如本文所述的TGF-β诱饵受体、CAR、细胞、核酸或载体与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合，来配制药物组合物或药物。

TGF-β诱饵受体和表达TGF-β诱饵受体的细胞的特性

本发明的TGF-β诱饵受体和CAR以及表达这些受体的细胞可以参考某些特性来表征。

具体地，本发明的TGF-β诱饵受体可具有以下一种或多种性质：

与TGF-β结合(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)；

抑制TGF-β与TGF-β受体(如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)之间的相互作用；

抑制由TGF-β介导的信号传导；

抑制通过TGF-β与TGF-β受体结合介导的信号传导。

附着于细胞膜；

定位于脂筏；

诱导脂筏聚集的能力；

诱导脂质相关信号传导的能力。

本发明的CAR还可以参考一种或多种这样的性质来表征。

能够与TGF-β结合的TGF-β诱饵受体优选以更高的亲和力结合TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)；和/或相比TGF-β以外的蛋白，与TGF-β结合的持续时间更长。在一些实施方案中，相比TGF-β细胞因子超家族的一个或多个其他成员，本发明的TGF-β诱饵受体对TGF-β出现更大的亲和力。在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体对TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)的亲和力可以大于对TGF-α的亲和力。

在一些实施方案中，与TGF-β之外的蛋白结合的程度小于TGF-β诱饵受体与TGF-β结合的约10％，例如通过ELISA，SPR，生物层干涉测量法测量(BLI)，MicroScaleThermophoresis(MST)，或通过放射免疫测定(RIA)。或者，TGF-β的结合特异性可以反映在结合亲和力方面，其中本发明的TGF-β诱饵受体与TGF-β结合的KD比与另一个非目标分子的KD至少大0.1个数量级(即0.1×10n，其中n是表示数量级的整数)。这可以任选地为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0中的一个。

结合亲和力可以用解离常数(KD)表示。结合亲和力可以通过本领域已知的方法测量，例如通过ELISA(例如，如Antibody Engineering，vol.1(第二版)，SpringerProtocols，Springer(2010年)，第五章，pp657-665中所述)，表面等离子体共振(SPR；参见例如Hearty等人Methods Mol Biol(2012)907：411-442；或Rich等人，Anal Biochem.2008年2月1；373(1)：112-20)，生物层干涉测量法(参见例如Lad等人(2015)J Biomol Screen20(4)：498-507；或Concepcion等人梳状化学高通量筛选Comb Chem High ThroughputScreen.2009年9月；12(8)：791-800)，MicroScale Thermophoresis(MST)分析(参见例如Jerabek-Willemsen等人Assay Drug Dev Technol.2011年8月；9(4)：342-353)，或通过放射性标记的抗原结合试验(RIA)。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体结合TGF-β，其KD为5μM或更低，优选≤1μM、≤500nM、≤100nM、≤75nM、≤50nM、≤40nM、≤30nM、≤20nM、≤15nM、≤12.5nM、≤10nM、≤9nM、≤8nM、≤7nM、≤6nM、≤5nM、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤500pM。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体结合TGF-β，其结合亲和力(例如通过ELISA测定)EC50＝1000ng/ml或更低，优选≤900ng/ml、≤800ng/ml、≤700ng/ml、≤600ng/ml、≤500ng/ml、≤400ng/ml、≤300ng/ml、≤200ng/ml、≤100ng/ml、≤90ng/ml、≤80ng/ml、≤70ng/ml、≤60ng/ml、≤50ng/ml、≤40ng/ml、≤30ng/ml、≤20ng/ml、≤15ng/ml、≤10ng/ml、≤7.5ng/ml、≤5ng/ml、≤2.5ng/ml、或≤1ng/ml之一。

本发明的TGF-β诱饵受体抑制TGF-β介导的信号传导。在本文中，“抑制”是指相对于对照条件的减少、减弱或降低。例如，TGF-β诱饵受体对过程的抑制是指在没有TGF-β诱饵受体存在下，和/或在有适当的对照受体存在下，该过程的程度/等级的减少、减弱或降低。

技术人员能够鉴定给定测定的适当对照条件。例如，对照受体可以是针对靶蛋白的受体，该靶蛋白已知不具有参与测定中所研究的性质的作用。

抑制在本文中也可称为中和或拮抗作用。也就是说，能够抑制某功能或过程(例如TGF-β介导的相互作用、信号传导或其他活性)的TGF-β诱饵受体可以说是针对相关的功能或过程的“中和”或“拮抗”的TGF-β诱饵受体。例如，能够抑制TGF-β介导的信号传导的TGF-β诱饵受体可以被称为能够中和TGF-β介导的信号传导，或者可以被称为拮抗TGF-β介导的信号传导的TGF-β诱饵受体。

本发明的TGF-β诱饵受体优选与一种或多种天然存在的TGF-β受体，例如TGF-βR1，TGF-βR2，TGF-βR3或TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的变体/亚型/同源物或TGF-β结合片段竞争结合TGF-β。在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体是结合TGF-βR1，TGF-βR2，TGF-βR3或TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的变体/亚型/同源物或TGF-β结合片段中的一种或多种的竞争性抑制剂。即，在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体能够抑制TGF-β与一种或多种天然存在的TGF-β受体之间的相互作用。

如本文所用，“天然存在的受体”是自然界可发现的受体。天然存在的受体和/或其组成的肽/多肽可以是来自给定宿主物种的内源核酸的转录、mRNA加工(例如剪接)、翻译和翻译后加工(例如蛋白水解切割、糖基化)的产物。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体在一种或多种天然存在的TGF-β受体结合的区域，与TGF-β结合。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体与TGF-β结合的区域是TGF-β的一种或多种天然存在的受体所结合的区域的相同区域或重叠区域。在一些实施方案中，天然存在的TGF-β受体是TGF-βR1、TGF-βR2、TGF-βR3。在一些实施方案中，天然存在的TGF-β受体是TGF-βR2。

TGF-β诱饵受体与天然存在的TGF-β受体(例如TGF-βR1，TGF-βR2，TGF-βR3，或TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的变体/同种型/同源物或TGF-β结合片段)竞争结合TGF-β(即抑制TGF-β与天然存在的受体之间的相互作用)的能力，可以在有TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞存在下，或在TGF-β或TGF-β和天然存在的受体与TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞孵育后，通过分析TGF-β与天然存在的受体之间的相互作用来确定。

用于确定给定TGF-β诱饵受体是否与TGF-βR1，TGF-βR2，TGF-βR3，或TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的变体/同种型/同源物或TGF-β结合片段竞争结合TGF-β的合适测定的实例是竞争性结合测定，例如竞争ELISA测定。

与没有TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞存在下(或在有适当对照受体/细胞存在下)的相互作用水平相比，在有TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞存在下或在将一个或两个相互作用伴侣与TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞孵育后，通过观察相互作用伴侣之间的相互作用水平降低/减少来鉴定能够抑制给定的相互作用(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3之一与TGF-β之间)的TGF-β诱饵受体。合适的分析可以体外进行，例如，使用重组相互作用伴侣或使用表达相互作用伴侣的细胞。表达相互作用伴侣的细胞可以是内源性地，或者可以来自引入细胞的核酸。出于这种测定目的，一种或两种相互作用伴侣和/或TGF-β诱饵受体可以与可检测实体结合标记或使用，以检测和/或测量相互作用水平。

此类测定还可用于确定TGF-β诱饵受体结合TGF-β的区域是与TGF-β的一个或多个天然存在的受体结合TGF-β的相同区域还是重叠区域。即，与没有TGF-β诱饵受体/细胞的存在下的相互作用水平相比，在有TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞存在下或在一个或两个相互作用伴侣与TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞孵育后，观察到TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)与例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3之间的相互作用水平的减少/降低，表明TGF-β诱饵受体与TGF-β的一个或多个天然存在的受体结合于TGF-β的相同区域或重叠区域。

本发明的TGF-β诱饵受体是否与TGF-β的一个或多个天然存在的受体结合TGF-β的相同区域或重叠区域，也可以通过使用本领域熟知的各种方法进行相互作用的分析确定，包括受体-配体复合物的X射线共结晶分析、肽扫描、诱变映射、通过质谱法的氢、氘交换分析、噬菌体展示和基于蛋白水解的“保护”方法。此类方法描述于例如Gershoni等人BioDrugs，2007,21(3)：145-156中，其通过引用并入本文。

TGF-β诱饵受体抑制两个相互作用伴侣之间相互作用的能力，也可以通过分析相互作用的下游功能性后果来确定，如TGF-β受体信号传导。

TGF-β信号传导的测定是本领域已知的，包括例如因响应TGF-β刺激而转录上调/下调的基因的基因表达分析，TGF-β信号传导的细胞内介质的活化分析测定(例如通过分析相关因子的磷酸化确定)，与TGF-β信号传导相关的蛋白质表达/处理变化的分析测定，以及用于分析与TGF-β信号传导相关的细胞的表型变化的测定。

例如，TGF-β信号传导的测定可涉及用TGF-β处理细胞并分析SMAD2、SMAD3、SMAD1、SMAD5、SMAD9和p38中的一种或多种的磷酸化，和/或分析CREB和NFκB中的一种或多种的表达。可以进行TGF-β信号传导的测定，如本公开的实施例8中所述。

此类测定也可用于分析由TGF-β介导的信号传导，例如，通过TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)与TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的结合介导的信号传导。

如本文所用，“TGF-β介导的信号传导”和/或由TGF-β介导的过程包括由TGF-β片段和包含TGF-β或其片段的多肽复合物介导的信号传导。TGF-β介导的信号传导可以是由人TGF-β和/或小鼠TGF-β介导的信号传导。TGF-β介导的信号传导,可以在TGF-β或含有TGF-β的复合物与TGF-β或所述复合物结合的受体结合后发生。

基因表达可以通过本领域技术人员已知的各种方法测量，例如通过定量实时PCR(qRT-PCR)或通过基于报告分子的方法，测量mRNA的水平。类似地，蛋白质表达可以通过本领域熟知的各种方法测量，例如，通过基于抗体的方法，例如通过蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT或基于报告分子的方法。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体或表达该受体的细胞能够将TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)与TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)之间的相互作用抑制至小于在没有TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞(或在有适当的对照受体/细胞存在下)存在下TGF-β和TGF-β受体之间的相互作用水平的100％，例如99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少、或1％或更少。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体或表达该受体的细胞能够将TGF-β和TGF-β受体之间的相互作用水平抑制到小于在没有TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞(或在有适当的对照受体/细胞存在下)存在下的TGF-β与TGF-β受体之间的相互作用的1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.85倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍其中之一。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体能够抑制TGF-β的生物学活性。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体在对于TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)结合重要的区域中与TGF-β结合，从而破坏通过受体结合和/或发出信号。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体是通过TGF-β受体(如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的信号转导激活的一种或多种信号传导途径的拮抗剂。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体能够通过一种或多种包含TGF-β受体的免疫受体复合物抑制信号传导。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体或表达该受体的细胞能够将TGF-β介导的信号传导抑制至小于在没有TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞(或在有适当的对照受体/细胞存在下)存在下的信号传导水平的100％，例如，99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少、或1％或更低水平。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体或表达该受体的细胞能够将TGF-β介导的信号传导抑制至少于在没有TGF-β诱饵受体或表达TGF-β诱饵受体的细胞(或在有适当的对照受体/细胞存在下)存在下的信号水平的1倍，例如，≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.85倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍其中之一。

这种信号传导可以，例如，通过用TGF-β处理表达TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的细胞加以分析。

本发明的TGF-β诱饵受体可以在表达TGF-β诱饵受体的细胞中附着于细胞膜，例如通过细胞膜锚定区。在一些实施方案中，细胞膜锚定区可以是脂质锚定区，脂质锚定区可以包含脂质锚，例如脂质锚或由其组成，如GPI锚。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体可通过受体与细胞膜或其组分(例如磷脂)的结合(例如共价结合)，附着于表达TGF-β诱饵受体的细胞的细胞膜。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体可以附着于细胞膜双层的外层。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体可通过GPI锚与细胞膜或其组分的结合，附着于表达TGF-β诱饵受体的细胞的细胞膜。在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体可通过GPI锚的脂质组分与细胞膜的脂质组分之间的相互作用，附着于表达TGF-β诱饵受体的细胞的细胞膜。

通过用磷脂酶C(PLC)处理可以实现GPI锚定蛋白的释放，其中磷脂酶C水解磷脂酰肌醇的磷酸二酯键。

在一些实施方案中，TGF-β诱饵受体可定位于表达TGF-β诱饵受体的细胞的细胞膜内的脂筏。可以通过脂质锚定区(例如GPI锚)定位于脂筏。

脂筏是细胞膜的区域，其特征在于富含胆固醇，鞘糖脂，鞘磷脂，带酰基链的磷脂和GPI连接蛋白，以及其他膜蛋白，例如先天免疫受体(Lingwood和Simmons 2010年Science327：46-50)。

可以通过本领域熟知的方法分析给定因子在脂筏的定位。例如，可以使用荧光标记标记活细胞的脂筏，可以分析和量化因子在脂筏的定位。脂筏标记试剂盒的一个实例是

555脂质筏标记试剂盒(ThermoFisher Scientfic)。也可以通过从表达该因子的细胞中分离脂筏组分，并随后分析该因子的脂筏(例如通过基于抗体的方法，例如通过蛋白质印迹，ELISA，免疫染色等，或基于报告子的方法)，以分析给定因子的脂筏定位。脂筏的分离和分析描述于例如Lee，Methods Mol Biol.2013；1066：131-45和Lemaire-Vieille等人(2013)Bio-protocol 3(16)：e854，两者均通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体可以在表达受体的细胞中诱导脂筏聚集。在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体可以诱导脂质相关信号传导。

可以，例如如Janes等人1999年，细胞生物学杂志The Journal of Cell Biology，147(2)：447-461中所述分析脂筏聚集。脂质相关信号传导可以是由脂质信号传导分子介导的信号传导，例如鞘脂(神经酰胺、鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸、葡萄糖神经酰胺、神经酰胺-1-磷酸、磷脂酰肌醇二磷酸、溶血磷脂酸(LPA)、血小板活化因子(PAF)、内源性大麻素、前列腺素、羟基脂肪酸脂肪酸酯(FAHFA)、视黄醇衍生物、类固醇激素、维甲酸或前列腺素)。脂质相关信号传导可涉及下游激活，例如src，ras或rac。可以分析脂质相关信号传导，例如使用基因表达分析对转录被脂质相关信号传导上调/下调的基因，分析脂质相关信号传导的细胞内介质的活化(例如通过分析相关因子的磷酸化确定)，分析蛋白质相关的脂质相关信号的表达/加工变化的传导分析，以及用于分析与脂质相关信号传导相关的细胞中的表型变化的测定。

脂筏聚集和脂质相关信号传导可以提供增强的T细胞受体信号传导，并且还能够逆转TGF-β介导的信号传导的作用。脂筏聚集和脂质相关信号传导可导致src、ras、rac或sox中的一种或多种的下游活化，因此本发明的TGF-β诱饵受体可能能够将来自TGF-β的抑制信号转化为T细胞激活的信号。以这种方式，TGF-β处理对包含/表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞的作用可以是促进性的，而不是抑制性的。

在一些实施方案中，相比于另一TGF-β结合蛋白，本发明的TGF-β诱饵受体可以更大程度地定位于表达TGF-β诱饵受体的细胞的脂筏。在一些实施方案中，相比于天然存在的TGF-β结合蛋白如TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)，BAMBI(如Onichtchouk等人同上所述)，或Bollard等人、Russo等人、Zhang等人或Penafuerte等人描述的TGF-β结合蛋白(上文)，例如DN-TGF-βR2，本发明的TGF-β诱饵受体可以更大程度地定位于表达TGF-β诱饵受体的细胞的脂筏。

给定分子定位于脂筏的程度可以，例如，通过分析表达相关分子的细胞的脂筏和非脂筏部分，并确定与脂筏和/或非脂筏部分相关的分子的比例得以确定。

在一些实施方案中，与另一种TGF-β结合蛋白相比，本发明的TGF-β诱饵受体可以在更大程度上诱导表达受体的细胞中的脂筏聚集。在一些实施方案中，与另一种TGF-β结合蛋白相比，本发明的TGF-β诱饵受体可以更大程度地诱导脂质相关信号传导。

相比于另一种TGF-β结合蛋白，例如TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)，或BAMBI(如Onichtchouk等人的同上中所述)，或Bollard等人、Russo等人、张等人、或Penafuerte等人描述的TGF-β结合蛋白(上文)，例如DN-TGF-βR2，在表达所述TGF-β结合蛋白的细胞中所表现出的定位、诱导脂筏聚集、诱导脂质相关信号传导的程度，脂筏的定位、诱导脂筏聚集的能力、诱导脂质相关信号传导的能力的程度更高，可以大于1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍。

在一些实施方案中，与另一种TGF-β结合蛋白在表达所述TGF-β结合蛋白的细胞的表面的表达水平相比，本发明的TGF-β诱饵受体在表达TGF-β诱饵受体的细胞表面可表现出增加的表达水平。例如，TGF-β诱饵受体可以表现出向细胞表面的运输改善，可以更稳定地与细胞膜结合，可以表现出从细胞表面的内化减少，或者可以表现出从细胞表面的释放减少。

TGF-β诱饵受体的表面表达水平的增加与可用于结合信号传导的TGF-β受体的TGF-β的量减少的优点有关，从而导致对TGF-β介导的信号传导的更大抑制。

在一些实施方案中，与天然存在的TGF-β结合蛋白，如TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)，或BAMBI(如Onichtchouk等人同上所述)，或Bollard等人、Russo等人、Zhang等人或Penafuerte等人描述的TGF-β结合蛋白(上文)，例如DN-TGF-βR2在表达这种TGF-β结合蛋白的细胞表面上的表达水平相比，本发明的TGF-β诱饵受体可以在表达TGF-β诱饵受体的细胞上表现出表面表达水平增加。给定蛋白的细胞表面表达可以通过本领域熟知的各种方法测量，例如，通过基于抗体的方法，例如通过蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT或基于报道分子的方法。

例如，TGF-β诱饵受体的细胞表面表达的测定，可涉及使用能够识别诱饵受体的TGF-β结合区的抗体进行分析。例如，可以如本公开的实施例7中所述进行测定。

相比于另一个TGF-β结合蛋白，如TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)，或BAMBI(如Onichtchouk等人同上所述)，或Bollard等人、Russo等人、Zhang等人或Penafuerte等人描述的TGF-β结合蛋白(上文)，例如DN-TGF-βR2在表达所述TGF-β结合蛋白的细胞表面所表现出的表面表达水平，细胞表面表达水平增加可以大于1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍。

在一些实施方案中，本发明的TGF-β诱饵受体能够比另一种TGF-β结合蛋白更大程度地抑制表达TGF-β诱饵受体的细胞中TGF-β介导的信号传导。例如，TGF-β诱饵受体可表现出与TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)结合的改善(例如更大亲和力和/或更高亲合力)，或抑制TGF-β与有信号传导能力的TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)相互作用的能力改善。

表达给定TGF-β结合蛋白的细胞的TGF-β介导的信号传导可如本文所述进行分析，例如，在用TGF-β处理细胞后。

相比于另一个TGF-β结合蛋白，如TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)，或BAMBI(如Onichtchouk等人同上所述)，或Bollard等人、Russo等人、Zhang等人或Penafuerte等人描述的TGF-β结合蛋白(上文)，例如DN-TGF-βR2所表现出的TGF-β介导的信号传导的抑制程度，TGF-β介导的信号传导的抑制程度更高，可以大于1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍。

在一些实施方案中，与另一种TGF-β结合蛋白从表达该TGF-β结合蛋白的细胞的分泌程度相比，本发明的TGF-β诱饵受体从表达诱饵受体的细胞分泌程度可以更高。有利地，分泌的TGF-β诱饵受体能够结合可溶性TGF-β，从而降低可用于结合细胞信号传导的TGF-β受体的可溶性TGF-β的水平。

可以通过测量表达蛋白质的细胞的细胞培养上清液中受体的量来分析来自细胞的给定蛋白质的分泌水平。通过基于抗体的方法，例如通过蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、ELISA、ELISPOT或基于报道分子的方法。

相比于另一个TGF-β结合蛋白如TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)，或BAMBI(如Onichtchouk等人同上所述)，或Bollard等人、Russo等人、Zhang等人或Penafuerte等人描述的TGF-β结合蛋白(上文)，例如DN-TGF-βR2从表达所述TGF-β结合蛋白的细胞的分泌程度，分泌程度程度更高，可以大于1倍，例如，≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍之一。

与不表达TGF-β诱饵受体的相当细胞的TGF-β介导的信号传导水平相比，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞可表现出TGF-β介导的信号传导水平降低，例如，用TGF-β处理后。如本文所述，可以分析细胞的TGF-β介导的信号传导。

在一些实施方案中，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞表现出的TGF-β介导信号传导水平(例如，响应于用TGF-β处理)比不表达TGF-β诱饵受体的相当细胞的信号传导水平低100％，例如，低100％、99％或更少、95％或更少、90％或更少、85％或更少、75％或更少、70％或更少、65％或更少、60％或更少、55％或更少、50％或更少、45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少、或1％或更低。在一些实施方案中，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞表现出的TGF-β介导信号传导水平(例如，响应于用TGF-β处理)比不表达TGF-β诱饵受体的相当细胞的信号传导水平低1倍，例如≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.85倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍其中之一。

类似地，与不表达TGF-β诱饵受体的相当细胞的反应水平相比，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞可表现出与TGF-β介导的信号传导相关的应答水平降低，例如，用TGF-β处理后。也就是说，与不表达TGF-β诱饵受体的相当细胞相比，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞可显示出对TGF-β处理的敏感性降低。

在一些实施方案中，表达TGF-β诱饵受体的细胞可表现出对TGF-β介导的细胞活性抑制的低敏感性。与不表达TGF-β诱饵受体的相当细胞相比，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞可以显示出一种或多种下列特性，例如，用TGF-β处理后：

扩增速度加快；

一种或多种生长因子(例如IL-2)的表达增加；

生存率提高；

一种或多种细胞毒性/效应因子(例如IFNγ、颗粒酶、穿孔素、颗粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)的表达增加；

细胞毒性增加；

抗癌作用改善。

在一些实施方案中，与没有用TGF-β处理的相同细胞的性质水平相比，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞在用TGF-β处理后可以表现出前一段中描述的一种或多种性质。

细胞可以是造血来源的细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天性淋巴细胞(ILC)或其前体。细胞可以表达例如CD3多肽(例如CD3γ、CD3ε、CD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。在一些实施方案中，细胞可包含或表达CAR(或可包含/表达编码CAR的核酸/载体)；例如细胞可以是CAR-T细胞。

可以通过技术人员熟知的方法分析这些性质。

可以分析细胞或细胞群的增殖或扩增速率，例如，通过测量不同时间点的细胞数，或通过分析³H-胸苷或CFSE稀释测定的掺入，例如，如Fulcher和Wong，Immunol Cell Biol(1999)77(6)：559-564中所述。增殖和/或扩增可以体内测量，或者在体外或离体培养中测量。

可以测量生长因子和细胞毒性/效应因子的基因或蛋白表达，例如通过qPCR分析mRNA水平，和/或通过基于免疫测定的方法检测相关蛋白，例如ELISA、流式细胞术、免疫印迹等。

细胞的存活/持续(例如体内存活/持续存在，或体外或离体培养)可通过检测细胞数随时间的变化，通过检测用可检测标记物标记的细胞来确定。

例如，可以使用Zaritskaya等人，Expert Rev Vaccines(2011)，9(6)：601-616中综述的任何方法研究细胞毒性，该文献通过引用整体并入本文，例如，通过⁵¹Cr释放试验。

可以研究抗癌作用，例如通过分析表达TGF-β诱饵受体的细胞杀死癌细胞的能力，例如，体外。癌症可以表达细胞特异性的抗原。还可以在癌症的动物模型中体内研究抗癌作用，例如通过在施用表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞后分析癌症症状的产生、进展或严重程度、和/或动物的存活，并与适当的对照条件进行比较。

相比于由不表达TGF-β诱饵受体的相当细胞显示的细胞毒性或抗癌作用，对于表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞，其增加的基因或蛋白表达、增殖、扩增、存活、细胞毒性或抗癌作用可以是大于1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍。

在一些实施方案中，与表达另一种TGF-β结合蛋白如TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)，BAMBI(如Onichtchouk等人同上所述)，或Bollard等人、Russo等人、Zhang等人或Penafuerte等人描述的TGF-β结合蛋白(上文)，例如DN-TGF-βR2的相当细胞相比，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞对TGF-β介导的细胞活性抑制的敏感性降低。

在一些实施方案中，与表达另一种TGF-β结合蛋白如TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)，BAMBI(如Onichtchouk等人同上所述)，或Bollard等人、Russo等人、Zhang等人或Penafuerte等人描述的TGF-β结合蛋白(上文)，例如DN-TGF-βR2的相当细胞相比，表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞可以表现出一种或多种以下特性，例如，用TGF-β治疗后：

增殖或扩增的速度增加，例如体外和/或体内；

一种或多种生长因子(例如IL-2)的表达增加；

生存率提高；

细胞毒性增加；

抗癌作用改善。

相比于表达另一种TGF-β结合蛋白如TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)，BAMBI(如Onichtchouk等人同上所述)，或Bollard等人、Russo等人、Zhang等人或Penafuerte等人描述的TGF-β结合蛋白(上文)，例如DN-TGF-βR2的相当细胞表现出的表达、增殖、扩增、存活、细胞毒性或抗癌作用水平，对于表达本发明的TGF-β诱饵受体的细胞，其增加的基因或蛋白质表达、增殖、扩增、存活、细胞毒性或抗癌作用可以是大于1倍，例如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍。

治疗应用

本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物用于治疗和预防的方法。

本发明提供了本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物，其用于医学治疗或预防方法。本发明还提供了本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物在制备用于治疗或预防疾病或病症的药物中的用途。本发明还提供治疗或预防疾病或病症的方法，包括给予受试者治疗或预防有效量的本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物。

特别地，本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物可用于治疗或预防与TGF-β介导的信号传导相关的疾病/病症。如本文所解释的，本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物可用于降低TGF-β介导的信号传导的水平。因此，本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物可用于治疗或预防降低TGF-β介导的信号传导水平有治疗或预防益处的疾病/病症。

例如，“治疗”可以是减少疾病/病症的发生或进展，减轻疾病/病症的症状或减少疾病/病症的病理。治疗或缓解疾病/病症可有效预防疾病/病症的进展，例如防止病情恶化或减缓发展速度。在一些实施方案中，治疗或缓解可以导致疾病/病症的改善，例如，减轻疾病/病症的症状或减少疾病/病症的程度/活动的一些其他相关性。预防疾病/病症可以指预防疾病恶化或预防疾病/病症的发展，例如，预防早期疾病/病情发展到晚期、慢性阶段。

在一些实施方案中，待治疗或预防的疾病或病症可以是与TGF-β介导的信号传导相关的疾病/病症(例如，在病理学上涉及TGF-β介导的信号传导的疾病/病症)，和/或TGF-β介导的信号传导对其而言是一个危险因素。在一些实施方案中，与对照状态相比，疾病/病症可能与TGF-β介导的信号传导水平增加有关。

治疗可以旨在降低TGF-β介导的信号传导的水平，和/或降低与TGF-β介导的信号传导相关的应答水平。

在一些实施方案中，治疗可以旨在降低TGF-β介导的信号传导的水平。施用本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物可通过螯合TGF-β引起TGF-β介导的信号传导水平的降低。

在一些实施方案中，所述治疗可以旨在降低受试者或受试者的细胞、细胞群、组织或器官的TGF-β介导的信号传导的水平。

在一些实施方案中，所述治疗可以包括修饰细胞或细胞群以包含/表达本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸或载体，随后对TGF-β的反应性较低。在一些实施方案中，所述治疗可包括向受试者施用经修饰以包含/表达本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸或载体的细胞或细胞群。

在一些实施方案中，所述治疗旨在向受试者提供免疫细胞或免疫细胞群，所述免疫细胞或免疫细胞群对TGF-β介导的对此细胞或细胞群活性的抑制较不敏感，例如，通过给予本发明的细胞，或产生本发明的细胞。

待治疗的受试者可以是任何动物或人。受试者优选为哺乳动物，更优选为人。受试者可以是非人哺乳动物，但更优选是人。受试者可以是男性或女性。受试者可以是患者。受试者可能已被诊断患有需要治疗的疾病或病症，或怀疑患有此类疾病或病症。

待治疗的受试者可显示出TGF-β介导的信号传导水平升高，例如，通过使用适当的测定法分析受试者或从受试者获得的样品(例如细胞，组织，血液样品)来确定。

受试者可能出现TGF-β介导的信号传导的正调节因子/效应物例如TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)或TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3)的表达或活性水平增加，或者可以出现受TGF-β介导的信号传导上调的因子的表达水平或活性增加。受试者可出现受TGF-β介导的信号传导上调的活性水平增加。

受试者可出现TGF-β介导的信号传导的负调节物的表达或活性水平降低，或可出现TGF-β介导的信号传导下调的因子的表达或活性水平降低。受试者可出现TGF-β介导的信号传导下调的活性水平降低。

增加/减少可以相对于没有相关疾病/病症的表达/活性水平，例如，健康对照受试者或从健康对照受试者获得的样品中的表达/活性水平。

在一些实施方案中，受试者可能有发展/感染疾病或病症的风险。

在一些实施方案中，待治疗或预防的疾病或病症可以是癌症。TGF-β介导的信号传导涉及多种癌症的发生/进展。例如在Nacif和Shaker 2014年，Akhurst和Hata 2012年，以及Meulmeester和Ten Dijke 2011年(同上)中综述了癌症中的TGFβ信号传导。

癌症可以是任何不期望的细胞增殖(或任何通过不期望的细胞增殖表现出来的疾病)、赘生物或肿瘤，或增加不期望的细胞增殖、赘生物或肿瘤的风险或倾向。癌症可以是良性或恶性的，可以是原发性或继发性(转移性)。赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织的实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或排除脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、神经胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、大网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。

待治疗的肿瘤可以是神经系统或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能起源于中枢神经系统或外周神经系统，例如胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突神经胶质瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织，例如黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤、慢性粒细胞白血病(CML)、急性髓性白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、NSCLC、血液癌和肉瘤。

在一些实施方案中，待治疗的癌症是以下一种或多种：鼻咽癌(NPC；例如Epstein-Barr病毒(EBV)阳性NPC)、宫颈癌(CC；例如人乳头瘤病毒(HPV)阳性CC)、口咽癌(OPC；例如HPV阳性OPC)、胃癌(GC；例如EBV阳性GC)、肝细胞癌(HCC；例如乙型肝炎病毒(HBV)阳性HCC)、肺癌(例如非小细胞肺癌；NSCLC)和头颈癌(例如源自唇、口、鼻、鼻窦、咽或喉的组织的癌症，例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))。

在一些实施方案中，癌症与病毒相关或由其引起。在一些实施方案中，癌症是EBV阳性癌症。在一些实施方案中，癌症是HPV阳性癌症。

在一些实施方案中，癌症是头颈癌、鼻咽癌(NPC)、口咽癌(OPC)、宫颈癌(CC)、胃/胃癌、胃癌或肺癌之一。

在一些实施方案中，癌症是表达TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)或TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3)的癌症。可以通过本领域技术人员熟知的任何合适的方法确定癌症表达TGF-β或TGF-β受体。表达TGF-β或TGF-β受体的癌可以通过检测TGF-β或TGF-β受体的表达来鉴定。

在一些实施方案中，癌症过度表达TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)或TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3)。TGF-β或TGF-β受体的过表达可以通过检测TGF-β或TGF-β受体的表达水平来确定，所述TGF-β或TGF-β受体的表达水平大于等效的非癌细胞/非肿瘤组织的TGF-β或TGF-β受体的表达水平。

在一些实施方案中，可以基于检测例如，在从受试者获得的样品中表达TGF-β或TGF-β受体，或过表达TGF-β或TGF-β受体的癌症为本发明的治疗方法选择患者。

表达可以是基因表达或蛋白表达。基因表达可以，例如通过检测编码TGF-β或TGF-β受体的mRNA，如通过定量实时PCR(qRT-PCR)来确定。蛋白质表达可以，例如通过检测TGF-β或TGF-β受体蛋白，如通过基于抗体的方法，如通过蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术或ELISA来确定。

癌症可能出现TGF-β介导的信号传导的正调节因子/效应物，例如TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)或TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3)的表达或活性水平增加，或者可以出现由TGF-β介导的信号传导上调的因子的表达水平或活性增加。癌症可能出现TGF-β介导的信号传导的负调节物的表达或活性水平降低，或者可能出现TGF-β介导的信号传导下调的因子的表达或活性水平降低。增加/减少可以与等效非癌细胞/组织中的表达或活性水平有关。

在一些实施方案中，癌症可能与TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3)或TGF-β受体(例如TGF-βR1、TGF-βR2和/或TGF-βR3)的突变有关。在一些实施方案中，这种突变可能与基因或蛋白表达水平增加有关，或者可能与相对于在没有突变时观察到的表达/信号传导水平的TGF-β介导的信号传导水平增加相关。

在一些实施方案中，待治疗的疾病/病症可以是以下之一：以纤维化为特征的疾病，例如特发性肺纤维化(IPF)、肾纤维化、心脏纤维化(例如与心肌梗塞相关的纤维化、缺血性，扩张性和肥厚性心肌病和充血性心力衰竭)、硬皮病、骨髓增生异常综合征(MDS)、冠状动脉搭桥术或血管成形术后再狭窄、马凡综合征、眼部病症术后瘢痕形成(例如小梁切除术治疗青光眼或角膜手术后)、糖尿病和肥胖症。

在一些实施方案中，疾病/病症可以是T细胞功能障碍疾病。T细胞功能障碍性疾病可以是正常T细胞功能受损的疾病或病症，导致受试者对致病性抗原的免疫应答下调，例如，通过外源物质如微生物、细菌和病毒感染产生，或由宿主在某些疾病状态下产生，例如某些形式的癌症(例如以肿瘤相关抗原的形式)。T细胞功能障碍性疾病的功能受损可以是以下一种或多种：细胞毒性，例如针对包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞；增殖，IFNγ表达，CD107a表达，IL-2表达，TNFα表达，穿孔素表达，颗粒酶表达，颗粒溶素表达和/或FAS配体(FASL)表达，例如，响应于T细胞特异性的抗原或包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞。

在一些实施方案中，所述治疗可以旨在增加/增强T细胞的一种或多种以下特性：细胞毒性，例如针对包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞；增殖，IFNγ表达，CD107a表达，IL-2表达，TNFα表达，穿孔素表达，颗粒酶表达，颗粒溶素表达和/或FAS配体(FASL)表达，例如，响应于T细胞特异性的抗原或包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞。在一些实施方案中，所述治疗可旨在提供或产生T细胞或T细胞群，所述T细胞或T细胞群出现以下一种或多种性质水平的增加/增强：细胞毒性，例如针对包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞；增殖，IFNγ表达，CD107a表达，IL-2表达，TNFα表达，穿孔素表达，颗粒酶表达，颗粒溶素表达和/或FASL表达，例如，响应于T细胞特异性的抗原或包含/表达T细胞特异性的抗原的细胞。

T细胞功能障碍性疾病可表现为感染，或不能产生针对感染的有效免疫应答。感染可以是慢性的、持续的、潜伏的或缓慢的，并且可以是细菌、病毒、真菌或寄生虫感染的结果。因此，可以向患有细菌、病毒或真菌感染的患者提供治疗。细菌感染的实例包括幽门螺杆菌感染。病毒感染的实例包括HPV、EBV、HIV、HBV和HCV的感染。T细胞功能障碍性疾病可能与癌症有关。

该治疗可以旨在预防T细胞功能障碍，例如，预防感染，预防癌症的发展或进展。因此，本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞和药物组合物可用于预防疾病或疾病状态的发生/进展。这可以在疾病或疾病状态的症状发作之前实施，和/或可以给予被认为处于疾病或疾病状态的更高风险发展/进展的受试者。

医学治疗方法还可以涉及体内、离体和适应性免疫疗法，包括使用自体和/或异源细胞或永生化细胞系的那些。

给药

给药优选为足以表现对个体的益处的“治疗有效量”。施用的实际量、施用的速率和时间过程将取决于所治疗疾病的性质和严重程度。治疗的处方，例如关于剂量等的决定，由全科医生和其他医生负责，并且通常考虑待治疗的病症、个体患者的状况、分娩的部位、给药方法和从业者已知的其他因素。上述技术和方案的实例可以在《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第20版，2000年，Lippincott，Williams&Wilkins出版社中找到。

本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体和细胞可以配制成临床使用的药物组合物或药物，并且可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。该组合物可以配制用于局部、不经肠胃、全身、腔内、静脉内、动脉内、肌肉内、鞘内、眼内、结膜内、肿瘤内、皮下、皮内、鞘内、口服或透皮给药途径，其可包括注射或输注。合适的制剂可包含无菌或等渗培养基中的、TGF-β诱饵受体、CAR核酸、载体或细胞。药物和药物组合物可以配制成流体，包括凝胶形式。可以配制流体制剂用于通过注射或输注(例如通过导管)给予人体或动物体的选定区域。

根据本发明，还提供了用于制备药学上有用的组合物的方法，这种制备方法可包括选自以下的一个或多个步骤：分离本文所述的TGF-β诱饵受体、CAR核酸、载体或细胞；和/或将如本文所述的、TGF-β诱饵受体、CAR核酸、载体或细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。

例如，本发明的另一方面涉及配制或生产用于医学治疗方法的药物或药物组合物的方法，该方法包括通过混合如本文所述的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体或细胞与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂来配制药物组合物或药物。

施用本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物优选为足以对受试者表现出益处的“治疗有效”或“预防有效”量。给药的实际量、给药的速率和时间过程将取决于疾病或病症的性质和严重程度。治疗的处方，例如关于剂量等的决定，由全科医生和其他医生负责，并且通常考虑待治疗的疾病/病症、个体受试者的状况、分娩的部位、给药方法和从业者已知的其他因素。上述技术和方案的实例可以在《雷明顿药物科学》，第20版，2000年，Lippincott，Williams&Wilkins出版社中找到。

给药可以单独给药或，取决于待治疗的病症与其它治疗同时或顺序组合给药。本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物和治疗剂可以同时或顺序施用。

在一些实施方案中，用本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物治疗可以伴随其他治疗性或预防性干预，例如，化学疗法、免疫疗法、放射疗法、手术、疫苗接种和/或激素疗法。

同时给药是指将TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物和治疗剂一起给药，例如作为含有两种药剂的药物组合物(组合制剂)，或者接连且任选地通过相同的给药途径，例如到同一动脉、静脉或其他血管。顺序给药是指在给定的时间间隔后通过单独给予TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物或治疗剂之一后，再给予其中另一种药剂。尽管在一些实施方案中是这种情况，但不要求两种药剂通过相同的途径给药。时间间隔可以是任何时间间隔。

化学疗法和放射疗法分别指用药物或用电离辐射(例如使用X射线或γ射线的放射疗法)治疗癌症。药物可以是化学实体，例如，小分子药物、抗生素、DNA嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂，例如，抗体、抗体片段、核酸或肽适体、核酸(例如DNA，RNA)、肽，多肽或蛋白质。药物可以配制成药物组合物或药物。制剂可包含一种或多种药物(例如一种或多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

治疗可包括给予一种以上的药物。药物可以单独给药或与其它治疗组合给药，同时或顺序取决于待治疗的病症。例如，化学疗法可以是涉及施用两种药物的共同疗法，其中一种或多种药物可以用于治疗癌症。

化疗可以通过一种或多种给药途径给药，例如，给药、不经肠胃、静脉注射、口服、皮下、皮内或瘤内。

可以根据治疗方案施用化学疗法。治疗方案可以是化学品施用的预定时间表、计划、方案或时间表，其可以由医师或医师准备并且可以定制以适合需要治疗的患者。

治疗方案可以指示以下的一种或多种：给予患者的化疗类型；每种药物或辐射的剂量；多次处理之间的时间间隔；每次治疗的时间长短；如果有的话，任何治疗休息期的数量和性质，等。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，其指示每种药物的施用方式。

化学治疗药物和生物制剂可选自：烷化剂，例如顺铂、卡铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；嘌呤或嘧啶抗代谢物，如硫唑嘌呤或巯嘌呤；生物碱和萜类化合物，如长春花生物碱(如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛)、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇如紫杉醇(TaxolTM)、多西紫杉醇；拓扑异构酶抑制剂如I型拓扑异构酶抑制剂喜树碱伊立替康和拓扑替康，或II型拓扑异构酶抑制剂安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷；抗肿瘤抗生素(如蒽环类抗生素)，如放线菌素、多柔比星(AdriamycinTM)、表柔比星、博来霉素、雷帕霉素；基于抗体的药物，如抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM-3、抗CTLA-4、抗-4-1BB、抗GITR、抗CD27、抗BLTA、抗OX43、抗VEGF、抗TNFα、抗IL-2、抗GpIIb/IIIa、抗CD-52、抗CD20、抗RSV、抗HER2/neu(erbB2)、抗TNF、抗EGFR抗体、单克隆抗体或抗体片段，实例包括：西妥昔单抗，帕尼单抗、英夫利昔单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗

阿昔单抗、达利珠单抗、吉妥珠单抗、阿仑单抗、利妥昔单抗

帕利珠单抗、曲妥珠单抗、依那西普、阿达木单抗、尼莫珠单抗；EGFR抑制剂如厄洛替尼、西妥昔单抗和吉非替尼；抗血管生成剂如贝伐单抗

癌症疫苗，如思雷特(Sipuleucel-T，

)。

其他化学治疗药物可选自：13-顺式维甲酸，2-氯脱氧腺苷，5-氮杂胞苷5-氟尿嘧啶，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，伯拉喜安(Abraxane)，

放线菌素-D阿霉素，

Ala-

阿德卢金(Aldesleukin)，阿仑单抗，阿丽塔(ALIMTA)，阿利维A，Alkaban-

全反式维甲酸，α干扰素，六甲嘧胺，氨甲蝶呤，氨磷汀，氨鲁米特，阿那格雷，

阿那曲唑，阿糖胞苷，

三氧化二砷，天冬酰胺酶，

阿扎胞苷，BCG，BCNU，苯达莫司汀，贝伐单抗，蓓萨罗丁，

比卡鲁胺，BiCNU，博来霉素，硼替佐米，白消安，

钙甲酰四氢叶酸，喜树碱-11，卡培他滨，Carac^TM，卡铂，卡莫司汀，CC-5013，CCI-779，CCNU，CDDP，CeeNU，

西妥昔单抗，苯丁酸氮芥，顺铂，甲酰四氢叶酸钙因子，克拉屈滨，可的松，CPT-11，环磷酰胺，

阿糖胞苷，Cytosar-

地西他滨，放线菌素D，阿法达贝泊汀，达沙替尼，道诺霉素，柔红霉素，盐酸柔红霉素，柔红霉素脂质体，

地塞米松，地西他滨，Delta- 地尼白介素，DepoCyt^TM，地塞米松，醋酸地塞米松，地塞米松磷酸钠，地塞米松，右丙亚胺，DHAD，DIC，迪奥德克斯(Diodex)，多西紫杉醇，

多柔比星，阿霉素脂质体，Droxia^TM，DTIC，DTIC-

Eligard^TM，Ellence^TM，Eloxatin^TM，表柔比星，重组人红细胞生成素阿法依泊汀，爱必妥，埃罗替尼，欧文氏菌L-天冬酰胺酶，雌莫司汀，

依托泊苷，依托泊苷磷酸盐，

依维莫司，依西美坦，非格司亭，氟尿苷，

氟达拉滨，

氟尿嘧啶，氟甲睾酮，氟他胺，亚叶酸，

氟维司群，吉非替尼，吉西他滨，吉妥珠单抗，Gleevec^TM，

Thfer，戈舍瑞林，粒细胞-集落刺激因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，赫赛汀，地塞米松，

六甲基三聚氰胺，HMM，

氢化可的松，氢化可的松磷酸钠，氢化可的松琥珀酸钠，氢化可的松，羟基脲，替伊莫单抗，替伊莫单抗，

去甲氧基柔红霉素，

IFN-α，异环磷酰胺，IL-11，IL-2，甲磺酸伊马替尼，咪唑甲酰胺，干扰素α，干扰素α-2b(PEG结合物)，白细胞介素-2，白细胞介素-11，内含子

(干扰素α-2b)，

伊立替康，异维A酸，伊沙匹隆，Ixempra^TM，天冬酰胺酶，

拉帕替尼，L-天冬酰胺酶，LCR，来那度胺，来曲唑，甲酰四氢叶酸，苯丁酸氮芥，Leukine^TM，亮丙瑞林，长春新碱，Leustatin^TM，脂质体Ara-C，

洛莫司汀，L-PAM，L-沙可来新，

马昔德克斯(Maxidex)，氮芥，盐酸氮芥，

甲地孕酮，醋酸甲地孕酮，美法仑，巯嘌呤，美司钠，Mesnex^TM，甲氨蝶呤，甲氨蝶呤钠，甲基强的松龙，

丝裂霉素，丝裂霉素C，米托蒽醌，M-MTC，MTX，

氮芥，Mylocel^TM，

奈拉滨，

Neulasta^TM，

尼鲁米特，

氮芥菜，

奥曲肽，醋酸奥曲肽，

Onxal^TM，奥普瑞白介素，

奥沙利铂，紫杉醇，紫杉醇蛋白结合，氨羟二磷酸二钠，帕尼单抗，PEG干扰素，培门冬酶，乙二醇化非格司亭，PEG-INTRON^TM，PEG-L-天冬酰胺酶，培美曲塞PEMETREXED，喷司他丁，苯丙氨酸芥末，

Platinol-

泼尼松龙，泼尼松，

丙卡巴肼，

含卡莫司汀植入物的普非司盘20(Prolifeprospan 20)

雷洛昔芬，

利妥昔单抗，Roferon-(干扰素Alfa-2a)，氯化氢红霉素，

沙格司亭，Solu-

Solu-

索拉非尼，SPRYCEL^TM，STI-571，链脲佐菌素，SU11248，舒尼替尼，

他莫昔芬，

替莫唑胺，替西罗莫司，替尼泊苷，TESPA，沙利度胺，

硫鸟嘌呤，硫鸟嘌呤硫代磷酰胺，

噻替哌，

托泊替康，托瑞米芬，

托西莫单抗，曲妥珠单抗，

维甲酸，Trexall^TM，

TSPA，

VCR，Vectibix^TM，Viadur^TM，

长春碱，长春碱硫酸盐，

长春新碱，长春瑞宾，长春瑞滨酒石酸盐，VLB，VM-26，伏立诺他，VP-16，

Zevalin^TM，

唑来膦酸，伏立诺他，

可以提供多剂量的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物。一个或多个(或每个)剂量可以伴随另一种治疗剂的同时或顺序给药。

多剂量可以分开预定的时间间隔，其可以选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天，或1、2、3、4、5或6个月中之一。举例来说，可以每7、14、21或28天(加或减3、2或1天)给予一倍剂量。

过继转移

在本发明的实施方案中，治疗或预防的方法可包括免疫细胞的过继转移。

过继细胞转移(ACT)通常是指通常通过抽取分离细胞的血液样品从受试者获得细胞(例如免疫细胞)的过程。然后通常以某种方式处理或改变细胞，然后将其施用于相同的受试者或不同的受试者。该治疗通常旨在向受试者提供出现某些所需特征的细胞群，或增加该受试者中出现这种特征的细胞的频率。

在本发明中，可以进行过继转移，目的是将细胞或细胞群引入受试者，和/或增加受试者中细胞或细胞群的频率。

例如，在Kalos和June 2013年Immunity 39(1)：49-60中描述了T细胞的过继转移，这些文献的全部内容通过引用并入本文。例如，在Davis等人2015年Cancer J.21(6)：486-491，的专利中描述了NK细胞的过继转移，其全部内容通过引用并入本文。

细胞可以是例如是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞或单核细胞。淋巴细胞可以是例如T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞或先天性淋巴细胞(ILC)或其前体。在一些实施方案中，细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD3+，CD8+ T细胞。在一些实施方案中，T细胞是细胞毒性T细胞(例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))。在一些实施方案中，T细胞是病毒特异性T细胞。在一些实施方案中，T细胞对EBV、HPV、HBV、HCV或HIV出现特异性。

本发明提供了治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，该方法包括修饰从受试者获得的至少一种细胞，以表达或包含本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸或载体，任选地扩增经修饰的至少一种细胞，并将经修饰的至少一种细胞施用于受试者。

在一些实施例中，该方法包括：

从受试者中分离至少一个细胞；

修饰该至少一个细胞以表达或包含本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸或载体，

任选地扩增该经修饰的至少一个细胞，和；

将该经修饰的至少一个细胞给予受试者。

在一些实施方案中，分离细胞的受试者是施用经修饰细胞的受试者(即，过继转移是来自自体细胞)。在一些实施方案中，分离细胞的受试者是与施用修饰细胞的受试者不同的受试者(即，过继转移是同种异体细胞)。

根据本发明修饰的至少一个细胞可以根据技术人员熟知的方法进行修饰。修饰可以包括核酸转移，用于永久或瞬时表达转移的核酸。

在一些实施方案中，可另外修饰细胞以包含或表达嵌合抗原受体(CAR)，或编码CAR的核酸或载体。

可以使用任何合适的基因工程平台来修饰本发明的细胞。用于修饰细胞的合适方法包括使用基因工程平台，例如γ逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、DNA转染、基于转座子的基因递送和RNA转染，例如Maus等人，Annu Rev Immunol(2014)32：189-225)中所述，在此引入作为参考。

在一些实施方案中，该方法可包括以下步骤中的一个或多个：从受试者中取血样；从血液样品中分离和/或扩增至少一个细胞；在体外或离体细胞培养中培养该至少一个细胞；将本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸或载体导入该至少一个细胞，从而修饰该至少一个细胞；扩增该经修饰的至少一个细胞；收集该经修饰的至少一个细胞；将经修饰的细胞与佐剂、稀释剂或载体混合；将经修饰的细胞施用于受试者。

在一些实施方案中，所述方法可另外包括处理细胞以诱导/增强TGF-β诱饵受体、CAR、核酸或载体的表达。例如，核酸/载体可包含控制元件，用于诱导从响应于用特定物质处理的核酸/载体的TGF-β诱饵受体或CAR的上调表达。在一些实施方案中，通过将药剂施用于已施用根据本发明的经修饰细胞的受试者，治疗可以是体内。在一些实施方案中，通过将药剂离体或体外施用于培养物中的细胞，可以离体或体外进行治疗。

技术人员能够确定用于根据本发明的细胞过继转移的合适的试剂和程序，例如参考Dai等人，2016年J Nat Cancer Inst 108(7)：djv439，其整个通过引用并入本文。

在相关方面，本发明提供了制备修饰细胞的方法，该方法包括将本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸或载体导入细胞，从而修饰至少一个细胞。该方法优选体外或离体进行。

在一个方面，本发明提供治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，包括：

从受试者中分离至少一个细胞；

在该至少一个细胞中导入本发明的核酸或载体，从而修饰该至少一个细胞；和

将该经修饰的至少一个细胞给予受试者。

在一些实施方案中，可另外修饰细胞以引入编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸或载体。

在一些实施方案中，该方法另外包括治疗性或预防性干预，例如，用于治疗或预防癌症。在一些实施方案中，治疗性或预防性干预选自化学疗法、免疫疗法、放射疗法、手术、疫苗接种和/或激素疗法。

检测方法

本文所述的TGF-β诱饵受体和CAR可用于涉及TGF-β诱饵受体或CAR与TGF-β(例如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)结合的方法中。这些方法可涉及检测TGF-β诱饵受体或CAR与TGF-β的结合复合物。因此，在一个实施方案中，提供了一种方法，该方法包括使含有或怀疑含有TGF-β的样品与如本文所述的TGF-β诱饵受体或CAR接触，并检测TGF-β诱饵受体/CAR和TGF-β复合物的形成。。

合适的方法形式是本领域熟知的，包括免疫测定，例如夹心测定，例如ELISA。该方法可以包括用可检测的标记物标记TGF-β诱饵受体/CAR或TGF-β或两者，例如荧光，发光或无线电标签。TGF-β表达可以通过免疫组织化学(IHC)测量，例如通过活组织检查获得的组织样品。在一些实施方案中，标记可以选自：放射性核苷酸、正电子发射放射性核素(例如用于正电子发射断层扫描(PET))、MRI造影剂或荧光标记。

由TGF-β介导的过程的体外或体内分析可涉及通过正电子发射断层扫描(PET)、磁共振成像(MRI)或荧光成像(例如，通过检测适当标记的物种)进行分析。

这种方法可以提供诊断需要检测和/或定量TGF-β的疾病或病症的方法的基础。这些方法可以在患者样品上体外进行，或者在对患者样品进行处理后进行。一旦收集了样品，就不需要患者出现的体外诊断方法，因此该方法可以是不在人体或动物体上实施的方法。

此类方法可涉及确定患者样品中存在的TGF-β的量。该方法可以进一步包括将确定的量与标准值或参考值进行比较，作为达到诊断的过程的一部分。其他诊断测试可以与这里描述的那些一起使用，以增强诊断或预后的准确性，或确认通过使用这里描述的测试获得的结果。

存在于患者样品中的TGF-β水平，可以指示患者可以对本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物的治疗作出响应。样品中存在高水平的TGF-β可用于为如本文所述的治疗选择患者，例如，如携带本文所述的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物。因此，本发明的TGF-β诱饵受体和CAR可用于为如本文所述治疗选择患者。

样品中TGF-β的检测可用于诊断疾病或病症、患疾病或病症的倾向性、或用于提供疾病或病症的预后(预测)的目的。诊断或预后可能涉及现有的(先前诊断的)疾病/病症。

可以从任何组织或体液中取样。样品可包含或可源自：一定量的血液；来自个体血液的一定量血清，其可包括去除纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液的液体部分；组织样本或活组织检查；胸水；脑脊液(CSF)；或从所述个体分离的细胞。在一些实施方案中，样品可以从受疾病/病症影响的组织或组织(例如表现疾病症状、或涉及疾病/病症发病机理的组织或组织)中获得或衍生。

本发明的方法可以优选地体外进行。术语“体外”旨在包括培养细胞的实验，而术语“体内”旨在包括完整多细胞生物体的实验和/或处理。

试剂盒

在本发明的一些方面，提供了一套试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可具有至少一个容器，其包含预定量的本发明TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物。

该试剂盒可以提供TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物以及给予患者以便治疗特定疾病/病症的说明书。可以配制TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或组合物，以便适合注射或输注到肿瘤或血液中。

在一些实施方案中，试剂盒可包含用于产生本发明的细胞的材料。例如，试剂盒可包含用于修饰细胞以表达或包含本发明的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸或载体的材料，或用于根据本发明将核酸或载体导入细胞的材料。

在一些实施方案中，试剂盒可以进一步包含至少一个容器，其中含有预定量的另一种治疗剂(例如抗感染剂或化学治疗剂)。在此类实施方案中，试剂盒还可包含第二药物或药物组合物，使得两种药物或药物组合物可同时或分开施用，使得它们提供针对特定疾病或病症的组合治疗。还可以配制治疗剂以便适合注射或输注到肿瘤或血液中。

蛋白表达

适于在细胞中产生本发明蛋白(例如TGF-β诱饵受体和CAR)的分子生物学技术是本领域熟知的，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册Molecular Cloning：ALaboratory Manual,纽约:冷泉港出版社Cold Spring Harbor Press,1989年中所述的那些。多肽可以由核酸序列表达。核酸序列可以包含在细胞中存在的载体中，或者可以掺入细胞的基因组中。

适合于表达多肽的任何细胞可用于产生本发明的蛋白。细胞可以是原核生物或真核生物。合适的原核细胞包括大肠杆菌。真核细胞的实例包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。在一些情况下，细胞不是原核细胞，因为一些原核细胞不允许与真核生物相同的翻译后修饰。此外，在真核生物中可能出现非常高的表达水平，并且使用适当的标签可以更容易地从真核生物中纯化蛋白质。还可以使用特定的质粒，其增强蛋白质分泌到培养基中。

产生目标多肽的方法可以包括培养或发酵经修饰以表达多肽的细胞。培养或发酵可以在生物反应器中进行，所述生物反应器提供适当的营养物、空气/氧气和/或生长因子供应。可以通过从培养基/发酵液中分离细胞，提取蛋白质含量，并分离单个蛋白质以分离分泌的多肽来收集分泌的蛋白质。培养、发酵和分离技术是本领域技术人员所熟知的。

生物反应器包括一个或多个可以培养细胞的容器。生物反应器中的培养可以连续进行，持续的反应物液流，和持续的来自反应器的培养细胞液流流入反应器。或者，培养可以分批进行。生物反应器监测和控制环境条件，例如容器内的pH、氧气、流入和流出的流速、以及搅拌，从而为培养的细胞提供最佳条件。

在培养表达目的多肽的细胞后，优选分离该多肽。可以使用用于从本领域已知的细胞培养物中分离多肽的任何合适方法。为了从培养物中分离目标多肽，可能需要首先将培养的细胞与含有目标多肽的培养基分离。如果感兴趣的多肽是从细胞分泌的，则可以通过离心将细胞与含有分泌的多肽的培养基分离。如果目标多肽聚集在细胞内，则必须在离心之前破坏细胞，例如使用超声处理\快速冻融或渗透裂解。离心将产生含有培养细胞或培养细胞的细胞碎片的沉淀，以及含有培养基和目标多肽的上清液。

然后可能需要从上清液或培养基中分离目标多肽，其可含有其他蛋白质和非蛋白质组分。从上清液或培养基中分离多肽组分的常用方法是通过沉淀。不同溶解度的多肽/蛋白质在不同浓度的沉淀剂如硫酸铵中沉淀。例如，在低浓度的沉淀剂下，提取水溶性蛋白质。因此，通过添加增加浓度的沉淀剂，可以区分不同溶解度的蛋白质。随后可以使用透析从分离的蛋白质中除去硫酸铵。

用于区分不同多肽/蛋白质的其他方法是本领域已知的，例如离子交换色谱法和粒度色谱法。这些可以用作沉淀的替代，或者可以在沉淀之后进行。

一旦从培养物中分离出目的多肽，就可能需要浓缩蛋白质。许多浓缩目的蛋白质的方法是本领域已知的，例如超滤或冷冻干燥。

序列鉴定

为了确定两个或更多个氨基酸或核酸序列之间的同一性百分比，可以以本领域技术人员已知的各种方式实现成对和多序列比对，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如ClustalOmega(

J.2005年，生物信息学Bioinformatics 21,951-960)，T-coffee(Notredame等人2000年，J.Mol.Biol.(2000)302,205-217)，Kalign(Lassmann和Sonnhammer 2005年，BMC Bioinformatics，6(298))和MAFFT(Katoh和Standley 2013年，分子生物学与进化Molecular Biology and Evolution，30(4)772-780)软件。使用此类软件时，默认参数，例如优选使用间隙罚分和延伸罚分。

***

本发明包括所述方面和优选特征的组合，除非明显不允许或明确避免这种组合。

这里使用的章节标题仅用于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。

现在将参考附图通过示例说明本发明的各方面和实施例。其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言是显而易见的。本文中提到的所有文献都通过引用并入本文。

在整个说明书中，包括随后的权利要求，除非上下文另有要求，否则词语“包括”和诸如“包括”和“包含”的变体将被理解为暗示包括所述整数或步骤或整数组或步骤，但不排除任何其他整数或步骤或整数组或步骤。

必须注意，如说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数个参考物，除非上下文另有明确说明。范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解该特定值形成另一个实施例。

附图简述

现在将参考附图讨论说明本发明原理的实施例和实验，其中：

图1.由本发明的TGF-β诱饵受体构建体编码的氨基酸序列。

图2.本发明的成熟TGF-β诱饵受体的示意图。

图3A至3H.散点图显示了转染的HeLa细胞表面上的TGF-β诱饵受体的表达，通过流式细胞术使用抗人TGF-βRII抗体克隆REA903检测。3A至3E显示了用编码DN-TGF-βR2(3A),TGF-βRII-PLAC ALKPHOS GPI锚(B),TGF-βRII-CD48 GPI锚(3C),TGF-βRII-CD55 GPI锚(3D)或TGF-βRII-CD90 GPI锚(3E)的载体转染后在细胞表面表达TGF-βR2胞外域的细胞百分比。3F和3G显示了在抗人TGF-βRII抗体染色(3F)或未染色(3G)的野生型，未转染的HeLa细胞中细胞表面表达TGF-βR2胞外域的细胞的百分比。3H显示了用编码GFP的载体转染后表达GFP的细胞百分比。

图4.通过使用抗人TGF-βRII抗体克隆REA903流式细胞术检测，在转导的活化T细胞表面上TGF-β诱饵受体表达的散点图。4A-4E显示了用编码DN-TGF-βR2的慢病毒(4A),TGF-βRII-PLAC ALKPHOS GPI锚(4B),TGF-βRII-CD48 GPI锚(4C),TGF-βRII-CD55 GPI锚(4D)或TGF-βRII-CD90 GPI锚(4E)转导后在细胞表面表达TGF-βR2胞外域的细胞百分比。4F显示了在用抗人TGF-βRII抗体染色的野生型、非转导的活化T细胞的细胞表面表达TGF-βR2胞外域的细胞百分比。4G和4H显示了抗人TGF-βRII抗体染色(4G)或未染色的(4H)的活化T细胞中，用编码GFP的慢病毒转导后表达GFP的细胞的百分比。

图5A-5C.图表显示了使用流式细胞仪确定的，在非转导的活化T细胞(wt)或用编码GFP(GFP)或TGF-βRII-CD90 GPI锚(CD90)的慢病毒转导的活化T细胞中表达不同蛋白的白细胞百分比。5A显示了白细胞总数，5B显示了GFP+细胞百分比，5C显示在细胞表面表达TGF-βR2胞外域的细胞的百分比。

图6A和6B.图表显示了通过流式细胞术测定的，在非转导活化T细胞(wt)或用编码GFP(GFP)，DN-TGF-βR2(DN)，TGF-βRII-CD48 GPI锚(CD48)或TGF-βRII-CD90 GPI锚(CD90)的慢病毒转导的活化T细胞中，表达不同蛋白的CD3+ T细胞占白细胞总数的百分比。5A显示了CD3+ T细胞的百分比，6B显示GFP+ CD3+ T细胞的百分比。

图7A-7D.图表显示了通过流式细胞术测定的，在非转导活化T细胞(wt)或用编码GFP(GFP)或转化生长因子TGF-βRII-CD90 GPI锚(CD90)的慢病毒转导的活化T细胞中，表达不同蛋白的CD4和CD8 T细胞亚群占CD3+细胞群的百分比。7A显示了CD4+，GFP+细胞的百分比，7B显示CD8+，GFP+细胞的百分比，7C显示在细胞表面表达TGF-βR2胞外域的CD4+细胞的百分比，7D显示细胞表面的表达TGF-βR2胞外域CD8+的细胞的百分比。

图8A-8E.图表显示了通过流式细胞仪测定的，用指定浓度的TGF-β刺激30分钟后，在非转导HeLa细胞(wt)、或用编码GFP(GFP)或TGF-βRII-CD90 GPI锚定的慢病毒转导的HeLa细胞(CD90)中，表达不同蛋白的HeLa细胞占总细胞群的百分比。8A显示了磷酸化SMAD2/3染色阳性的细胞百分比，8B显示了磷酸化SMAD1/5/9染色阳性细胞百分比，8C显示了NFκBp65染色阳性细胞百分比，8D显示了磷酸化的MAPKK染色阳性细胞百分比，和8E显示了CREB阳性细胞的百分比。

图9A-9C.图表显示了通过流式细胞仪测定的，用指定浓度的TGF-β刺激30分钟后，在非转导活化T细胞(wt)，或用编码GFP(GFP)的慢病毒转导DN-TGF-βR2(DN)，TGF-βRII-CD48 GPI锚(CD48)或TGF-βRII-CD90 GPI锚(CD90)的活化T细胞中，表达不同蛋白的CD8+细胞占CD3+细胞群的比例。9A显示了CD8和磷酸化SMAD2/3染色阳性的CD3+细胞的百分比，9B显示了CD8和NFκB p65染色阳性的CD3+细胞百分比，9C显示了CD8和CREB染色阳性的CD3+细胞百分比。

图10A-10C.图表显示了通过流式细胞仪测定的，用指定浓度的TGF-β刺激30分钟后，在非转导活化T细胞(wt)或用编码GFP(GFP)，DN-TGF-βR2(DN)，TGF-βRII-CD48 GPI锚(CD48)或TGF-βRII-CD90 GPI锚(CD90)的慢病毒转导的活化T细胞中，表达不同蛋白的CD4+细胞占CD3+细胞群的百分比。10A显示了CD4和磷酸化SMAD2/3染色阳性的CD3+细胞的百分比，10B显示了CD4和NFκBp65染色阳性的CD3+细胞的百分比，10C显示了CD4和CREB染色阳性的CD3+细胞的百分比。

图11.图像显示了用指定浓度的TGF-β刺激30分钟后，在非转导激活的T细胞(wt)或者用编码TGF-βRII-CD90 GPI锚(CD90)的慢病毒转导的活化T细胞中，磷酸化SMAD2/3水平的蛋白质印迹分析结果。上样对照已示。

图12.图像显示了用指定浓度的TGF-β刺激30分钟后，在非转导HeLa细胞(wt)或用编码GFP(GFP)或TGF-βRII-CD90 GPI锚(CD90)的慢病毒转导的HeLa细胞中，磷酸化SMAD2/3水平的蛋白质印迹分析结果。上样对照已示。

图13A和13B.图显示了用TGF-β刺激后，定位于非转导HeLa细胞(WT)以及用编码TGF-βRII-CD48 GPI锚(48)，TGF-βRII-CD90 GPI锚(90)或DN-TGF-βR2(DN)的慢病毒转导的HeLa细胞的细胞核的(13A)磷酸化p38和(13B)磷酸化SMAD2水平的荧光显微镜分析结果。

在以下实施例中，发明人描述了TGF-β结合诱饵受体分子的设计及其功能表征。

实施例1：TGF-β诱饵受体设计

慢病毒载体用于制备TGF-β诱饵受体构建体，其编码TGF-β的II型受体的TGF-β结合域和不同的细胞膜锚定区。

将TGF-β的II型受体细胞外域的cDNA与编码CD48、CD44、CD55、CD90或胎盘型碱性磷酸酶的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定序列的cDNA同框克隆(其构造编码的氨基酸序列如图1所示)。

实施例2：表达TGF-β诱饵受体的人T淋巴细胞的产生

对于慢病毒转导，将5×10⁶HEK 293T细胞接种在预涂有0.002％聚-L-赖氨酸(Sigma，St.Louis MO)的10cm²培养皿上。用编码包装和包膜基因的质粒共转染慢病毒载体，共转染几天后收集含病毒的上清液并通过0.45μm过滤器。然后通过在25,000rpm下超速离心浓缩上清液，滴定，然后在-80℃下储存直至使用。

获得从健康供体分离的原代人T淋巴细胞。T细胞在完全培养基(补充有10％灭活的FBS，青霉素和硫酸链霉素的RPMI 1640)中培养，并通过用抗CD3和抗CD28mAb包被珠(Invitrogen)刺激而活化。激活12小时后，在聚凝胺存在下用慢病毒载体转导T细胞。每隔一天通过加入IL-2扩增和维持人T淋巴细胞。

实施例3：表达TGF-β诱饵受体的T细胞的功能表征

3.1表面表达

分析经修饰以表达TGF-β诱饵受体的T细胞的诱饵受体的表面表达。

简而言之，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体、阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导T细胞，并使用能够特异性结合TGF-βR2胞外域的抗体进行流式细胞术分析来分析细胞表面的表达。

与用阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导的T细胞相比，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体转导的T细胞显示出更多的抗TGF-βR2抗体表面染色。

3.2可溶性表达

分析经修饰以表达TGF-β诱饵受体的T细胞的诱饵受体的可溶性表达。

简而言之，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体，阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导T细胞，并使用能够特异性结合TGF-βR2胞外域的抗体对细胞培养上清液作ELISA，以测量受体的可溶性表达。

与用阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导的T细胞相比，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体转导的T细胞分泌更多的可溶性受体。

3.3 TGF-β介导的信号传导

分析经修饰以表达TGF-β诱饵受体的T细胞对TGF-β刺激的反应能力。

简而言之，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体、阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导T细胞。然后通过TGF-β处理刺激细胞，并分析TGF-β介导的信号传导水平。

与用阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导的T细胞相比，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体转导的T细胞显示较少的TGF-β介导的信号传导。

3.4增殖/扩增

分析经修饰以表达TGF-β诱饵受体的T细胞的体外增殖能力.

简而言之，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体、阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导T细胞。然后用TGF-β处理刺激细胞，并分析细胞的增殖。

与用阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导的T细胞相比，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体转导的T细胞增殖更多。

3.5存活

分析经修饰以表达TGF-β诱饵受体的T细胞的持久性/存活能力。

简而言之，用编码根据本发明的TGF-β诱饵受体的构建体、阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导T细胞。然后用TGF-β处理刺激细胞，并随时间监测细胞数量。

与用阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导的T细胞相比，发现用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体转导的T细胞出现存活率增加。

3.6细胞毒性

分析经修饰以表达TGF-β诱饵受体的T细胞的体外细胞毒性。

简而言之，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体、阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导T细胞。然后用TGF-β处理刺激细胞，并分析对表达T细胞特异性抗原的细胞的细胞毒性。还分析细胞的细胞毒性/效应因子的基因或蛋白表达。

与用阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导的T细胞相比，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体转导的T细胞显示出细胞毒性改善和细胞毒性/效应因子的表达增加。

3.7体外杀伤肿瘤细胞的能力

分析经修饰以表达TGF-β诱饵受体的T细胞在体外杀伤肿瘤细胞的能力。

简而言之，用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体、阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导T细胞。然后分析修饰的细胞体外裂解肿瘤细胞的能力。

发现与用阴性对照构建体转导的T细胞或编码DN-TGF-βR2的构建体相比，发现本发明的表达TGF-β诱饵受体的T细胞更快地杀伤肿瘤细胞。甚至在对效应细胞：肿瘤细胞比例进行标准化后也观察到这种情况。

3.8治疗体内癌症

在小鼠模型中分析经修饰以表达TGF-β诱饵受体的T细胞在体内治疗癌症的能力。

简而言之，用编码根据本发明的TGF-β诱饵受体的构建体、阴性对照构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转导T细胞。然后将修饰的细胞施用于出现确定的癌症模型的小鼠，并监测癌症进展和存活。

与用阴性对照构建体转导的T细胞或编码DN-TGF-βR2的构建体相比，发现用编码本发明的TGF-β诱饵受体的构建体转导的用T细胞治疗的小鼠出现存活率改善或疾病进展的严重性降低。

实施例4：TGF-β诱饵受体的特征鉴定

下面提供了以下实施例中表征的TGF-β诱饵受体分子的概述：

名称	受体
		DN TGFBR2	TGF-βR2ECD-TGF-βR2跨膜区
TGFBR2 ECTO CD48 GPI	TGFβR2ECD-CD48 GPI(SEQ ID NO：5)
		TGFBR2 ECTO CD55 GPI	TGFβR2ECD-CD55 GPI(SEQ ID NO：6)
TGFBR2 ECTO ALKPHOS PLAC GPI	TGFβR2ECD-PLAC ALKPHOS GPI(SEQ ID NO：7)
		TGFBR2 ECTO CD90 GPI	TGFβR2ECD-CD90 GPI(SEQ ID NO：8)
HA DN TGFBR2	HA-Tag-DN-TGF-βR2
		HA TGFBR2 ECTO CD48 GPI	HA-tag-TGFβR2ECD-CD48 GPI
HA TGFBR2 ECTO CD55 GPI	HA-tag-TGFβR2ECD-CD55 GPI
		HA TGFBR2 ECTO ALKPHOS PLAC GPI	HA-tag-TGFβR2ECD-PLAC ALKPHOS GPI

慢病毒载体pD2109-EFs：EF1a-ORF，Lenti-ElecD(ATUM，Newark，CA，USA)用于制备编码TGF-β诱饵受体的构建体和编码GFP的对照构建体。

实施例5：活化T细胞(ATCs)的制备

通过Ficoll梯度纯化来自不同供体的血液样品的PBMC。随后使用CD3磁珠(Miltenyi)从PBMC中选择阳性的CD3+ T细胞。

然后刺激T细胞。简言之，将1x10⁶细胞T细胞接种于含有IL-2(40U/ml)和CD3/CD28Dynabeads(Gibco)的1ml CTL培养基(50％RPMI，50％CLICK培养基，10％FBS)中24至72小时获得活化T细胞(ATCs)。

实施例6：产生慢病毒并转导靶细胞

6.1慢病毒的生产

将1.2-2.4×10⁶293T细胞接种于含有10ml含10％FBS和抗生素的DMEM培养基的10cm²细胞培养皿中。

第二天制备DNA混合物，其包含3μg的慢病毒载体构建体DNA，1.5μg的包膜质粒pMD2.G，1.5μg的包装质粒pRSV-REV和1.5μg的包装质粒pMDLg/pRRE。分别制备18μl的Fugene6(Roche)和270μl不含FBS的DMEM或Opti-MEM的混合物，通过涡旋混合10秒，离心并在室温下温育5分钟。然后合并DNA和Fugene混合物，通过涡旋将10个切片进行混合，离心并在室温下温育15-45分钟。然后将混合物加入293T细胞的培养物中。

第三天，从培养的细胞中除去细胞培养基，向细胞中加入8-10ml新鲜细胞培养基。根据待用病毒转导的细胞类型选择新鲜细胞培养基。例如，使用RPMI-1640培养基，其中病毒用于转导T细胞。

第四天，收集含有慢病毒的细胞培养基并在4℃下保存，并向细胞中加入8-10ml新鲜细胞培养基。第五天，再次收集含有慢病毒的细胞培养基，并与前一天收集的含有慢病毒的细胞培养基组合。然后使用0.45μm硝酸纤维素膜过滤混合物，并加入聚凝胺至终浓度为5-8μg/ml。然后将含慢病毒的培养基立即用于转导，或储存在-80℃。

在一些情况下，使用Amicon Ultra-100管(Millipore)将含有慢病毒的培养基浓缩10-20倍。简而言之，通过UV光处理将管灭菌1小时或过夜，并将含有慢病毒的培养基加入管中并以2,500-3,500rpm离心10-30分钟。

6.2靶细胞的转导

简而言之，收获培养物中的靶细胞，将0.25-1×10⁶细胞重悬于0.5-1ml含有慢病毒的细胞培养基中(参见实施例6.1)。然后将混合物转移到24孔或12孔板中，并在30-35℃下以2,500rpm离心1.5小时(称为“旋转感染”)。然后将细胞在培养箱(5％CO₂,37℃)中培养过夜。第二天收获细胞并重悬于5-10ml新鲜细胞培养基中。在一些情况下，在转导后36-48小时将嘌呤霉素加入培养物中的细胞中，以选择转导子。

如下转导活化的T细胞(ACT)。将2.5x10⁵ATC重悬于500μl含有8μg/ml聚凝胺的浓缩病毒上清液(10x浓缩，MOI至7000)中，接种于24孔板中，并在800g，32℃下离心90分钟。在旋转感染后，将细胞在37℃，5％CO₂下温育最多24小时，然后用含有IL-2和CD3/CD28Dynabeads的CTL培养基替换上清液(参见实施例5)。

对于Hela细胞转导，将4x10⁵HeLa细胞重悬于1ml含有8μg/ml聚凝胺的浓缩病毒上清液(10x浓缩，MOI至7000)中，接种于24孔板中，并在800g，32℃下离心90分钟。

实施例7：TGF-β诱饵受体在细胞表面的表达分析

7.1用编码TGF-β诱饵受体的构建体转染的HeLa细胞的表达

本发明人研究了用不同构建体转染的HeLa细胞上的TGF-β诱饵受体的表面表达。

简言之，根据制造商的说明书，使用Lipofectamine，用编码TGF-β诱饵受体的构建体，编码GFP作为转染对照的构建体或编码DN-TGF-βR2的构建体转染HeLa细胞。

转染72小时后，使用抗人TGF-βRII抗体克隆REA903(#130-115，Miltenyi)，通过流式细胞术分析细胞在细胞表面的受体表达，其结合TGF-βR2的细胞外结构域。分析转染对照的GFP表达。

结果显示在图3A-3H中。转染72小时后，在HeLa细胞表面检测到TGF-β诱饵受体的高表达(～60-70％的细胞受体表达阳性)。

7.2用编码TGF-β诱饵受体的构建体转导的活化T细胞(ATC)的表达

发明人接下来研究了用不同的慢病毒构建体转导的ATC上的TGF-β诱饵受体的表面表达，或在非转导细胞上的表达。

转导后72小时(参见实施例6.2)，使用抗人TGF-βRII抗体克隆REA903，通过流式细胞术分析细胞表面表达受体。分析对照条件的GFP表达。

结果显示在图4A-4H中。发现用编码CD48、CD55和CD90 GPI锚定序列的TGF-β诱饵受体转导的ATC在细胞表面显示出最高水平的TGF-β诱饵受体表达。这些诱饵受体的表达高于用编码DN-TGF-βR2的构建体转导的细胞检测到的表达水平(图4A)。

如实施例6.2中所述，转导72小时后，发明人接着研究了衍生自三种不同供体的转导ATC中具有CD48或CD90 GPI锚定序列的TGF-β诱饵受体的表达。

图5A显示转导的细胞培养物中白细胞的百分比。图5B显示了转导细胞培养物中GFP+细胞的百分比。图5C显示转导细胞培养物中TGF-βRII+细胞的百分比。

图6A显示了CD3+细胞占白细胞总数的比例，图6B显示了GFP+ CD3+细胞占白细胞总数的比例。

图7A显示了CD4+，GFP+细胞占CD3+细胞群的比例。图7B显示了CD8+，GFP+细胞占CD3+细胞群的比例的百分比。图7C显示CD4+，TGF-βRII+细胞占CD3+细胞群的比例。图7D显示了CD8+，TGF-βRII+细胞占CD3+细胞群的比例。

在用编码TGF-βRII-CD90 GPI锚的慢病毒转导的细胞中检测到高比例的表达TGF-βRII的细胞(参见图5C，7C和7D)。

实施例8：分析表达TGF-β诱饵受体的细胞中TGF-β介导的信号传导的抑制

发明人接下来研究了响应于TGF-β刺激而表达TGF-β诱饵受体的细胞中下游信号传导的激活。

用编码TGF-βRII-CD90 GPI锚的慢病毒或编码GFP的构建体转导细胞(参见实施例6.2)。

转导后72小时，将细胞嘌呤霉素加入细胞培养物中，终浓度为2μg/ml，以选择转导细胞。

在嘌呤霉素存在下培养7天后，将细胞重悬于新鲜细胞培养基中并培养24小时，然后用不同浓度的TGF-β处理。在37℃，5％CO₂下刺激细胞30分钟。然后收获细胞并通过流式细胞术(参见实施例8.1)和蛋白质印迹(参见实施例8.2)分析细胞内信号蛋白的磷酸化。在冰上制备样品以供流式细胞术或蛋白质印迹分析。

8.1 Phosflow分析

以下抗体用于流式细胞术分析：

荧光染料抗原	克隆	公司目录
			PECF594-CD56	NCAM16.2(也称为NCAM 16)	BD 564849
PC5-CD16	3G8	BL 302010
			BV421-CD3	SP34-2	BD 562877
BV786-CD4	SK3	BD 563877
			BV650-CD8	RPA-T8	BD 563821
BV711-CD14	M5E2	BL 301838
			FITC-P38	36/p38(pT180/pY182)	BD 612594
PE-pERK1/2	20A	BD 612566
			PECy7-p65 NFkB	K10-895.12.50	BD 560335
AF647-pSAPK	(Thr183/Tyr185)(G9)	细胞信号传导#9257
			APCy7-L/d		ThermoFisher L10119

将100μl刺激的细胞(～200,000个细胞)转移到96孔板的孔中。然后将细胞在4℃下以3000rpm离心30秒，将细胞沉淀重悬于30μL的1：200活/死染液中，并将细胞在室温下温育30秒。然后加入100μL染色缓冲液，并在4℃下3000rpm离心30秒以洗涤细胞。然后将细胞沉淀重悬于1：1混合的细胞培养基和BD静态磷物质流分析模型phosflow缓冲液I(每孔50μl)中，预热至37℃并在37℃下孵育10分钟。然后通过以1500rpm离心5分钟收获细胞，并用150μL染色缓冲液洗涤两次。然后将细胞沉淀重悬于50μL PermBuffer III中，并将细胞在冰上孵育30分钟。然后通过以1500rpm离心5分钟收获细胞，并用150μL染色缓冲液洗涤两次。然后将细胞沉淀重悬于25μL抗体混合物中，并在室温下在黑暗中温育1小时。然后通过以1500rpm离心5分钟收获细胞，并用150μL染色缓冲液洗涤两次。最后，将细胞沉淀重悬于150μL染色缓冲液中，并通过流式细胞术分析细胞。

图8A-8E显示了用不同浓度的TGF-β刺激后，非转导的HeLa细胞(wt)、用编码TGF-βRII-CD90 GPI锚(CD90)的慢病毒转导的HeLa细胞或用编码GFP的慢病毒(GFP)转导的HeLa细胞的信号传导的分析结果。用TGF-βRII-CD90 GPI锚转导的细胞在响应TGF-β刺激时显示出较少的TGF-β介导的信号传导激活，这可通过磷酸化信号蛋白(SMAD)染色阳性的细胞百分比降低和CREB转录因子阳性细胞染色百分比降低来证明。

图9和10显示了用不同浓度的TGF-β刺激后，非转导ATC(wt)、用编码TGF-βRII-CD90 GPI锚(CD90)的慢病毒转导的ATC、用编码TGF-βRII-CD48 GPI锚的慢病毒转导的ATC(CD48)、用编码“DN-TGF-βR2(DN)的慢病毒转导的ATC或用编码GFP(GFP)的慢病毒转导的ATC中信号分析的结果。图9A-9C显示了对CD3+细胞群内的不同标记物染色阳性的CD8+细胞的百分比，图10A-10C显示了对CD3+细胞群内的不同标记物染色阳性的CD4+细胞的百分比。

与用编码DN-TGF-βR2的慢病毒转导的细胞相比，用具有GPI锚定序列的TGF-β诱饵受体转导的细胞响应于TGF-β的刺激表现出相似或降低的TGF-β介导的信号传导。

8.2蛋白质印迹

将刺激的细胞重悬于冰冷的PBS中，通过在4℃下离心沉淀并在冰冷的PBS中洗涤两次。然后将细胞沉淀重新悬浮于含有磷酸酶/蛋白酶抑制剂混合物(1：100，ThermoFisher，#78440)的冰冷RIPA裂解缓冲液中，并在冰上孵育30分钟，偶尔涡旋。然后使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)测量蛋白质浓度，并在样品之间标准化浓度。然后将含有10％MeEtOH的4x Laemmli缓冲液加入样品中，然后在95℃下煮沸10分钟。然后将样品在冰上冷却，然后进行SDS-PAGE。

将硝酸纤维素膜在5％牛奶溶液中封闭2小时，然后与1：1000稀释度的一抗(α-Smad2/3抗体，Cell Signaling，#5678)孵育12小时。然后将膜在TBS-T溶液中洗涤3倍，然后以1:10 000的稀释度与第二抗兔-HRP抗体一起温育。然后将膜在TBS-T溶液中洗涤3倍并使用增强化学发光(ECL，Biorad)显色。使用Chemidoc MP成像系统(Bio-Rad)使条带可视化。

图11显示了在用TGF-β刺激后，用抗CD3/CD28刺激激活并用编码TGF-βRII-CD90GPI锚的慢病毒转导的原代人T细胞、或未转导的细胞中检测的磷酸化SMAD2/3。

图12显示在用TGF-β刺激后，用编码TGF-βRII-CD90 GPI锚的慢病毒，编码GFP的慢病毒的HeLa细胞或非转导的细胞中检测的磷酸化SMAD2/3。

在用编码TGF-βRII-CD90 GPI锚的慢病毒转导的细胞中检测到磷酸化SMAD2/3的水平降低。

8.3荧光显微术

用编码TGF-βRII-CD90 GPI锚，TGF-βRII-CD48 GPI锚，DN-TGF-βR2(参见实施例6.2)的慢病毒转导HeLa细胞，或未转导(WT)HeLa细胞。然后将细胞接种于384孔板的孔中，在反向时程实验中用1ngTGF-β刺激。

通过荧光显微术分析p38和SMAD2的磷酸化和亚细胞定位。用TGF-β刺激的白细胞中p38的磷酸化已被证实减少，从而导致免疫功能下降。SMAD2磷酸化已被证明是TGF-β信号传导的直接效应物，并且导致免疫功能下降。

实验结果如图13A和13B所示。发现用编码TGF-βRII-CD90 GPI锚的慢病毒转导的细胞响应于用TGF-β刺激，显示出最高水平的定位于细胞核的磷酸化p38，和最低水平的定位于细胞核的磷酸化SMAD2。这表明表达TGF-βRII-CD90诱饵受体的细胞对TGF-β刺激的反应最小。

与用编码DN-TGF-βR2的慢病毒转导的细胞相比，用编码TGF-βRII-CD48 GPI锚的慢病毒转导的细胞在用TGF-β刺激后显示出相似水平的定位于细胞核的磷酸化p38和磷酸化SMAD2。

Claims

1.一种TGF-β诱饵受体，其中包含TGF-β结合结构域TGF-β结合区和脂质锚定区。

2.根据权利要求1所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其中所述脂质锚定区包含脂质锚或由其组成。

3.根据权利要求2所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其中所述脂质锚是GPI锚。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其中缺乏跨膜结构域。

5.根据权利要求1所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其中所述脂质锚定区包含作为脂质锚定信号序列的氨基酸序列或由其组成。

6.根据权利要求5所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其中所述脂质锚定信号序列是糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号序列。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其中所述TGF-β结合结构域TGF-β结合区包含对应于TGF-β受体的TGF-β结合结构域TGF-β结合区的氨基酸序列或由其组成。

8.根据权利要求7所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于其中，TGF-β受体是TGF-βII型受体(TGF-βR2)。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其中所述TGF-β结合结构域TGF-β结合区包含与SEQ ID NO：4具有出现至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其中所述细胞膜锚定区包含对应于CD48、CD55、CD90或胎盘型碱性磷酸酶之一的GPI信号序列的氨基酸序列或由其组成。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其中所述脂质锚定区包含以下或由以下组成：

(i)与SEQ ID NO：15-18中任一个具有出现至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或

(ii)GPI锚，和与SEQ ID NO：19-22中的任一个具有出现至少80％氨基酸序列同一性的GPI锚和氨基酸序列。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的TGF-β诱饵受体，其特征在于，其包含以下或由以下组成：

(i)与SEQ ID NO：5-8中的任一个具有出现至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或要么

(ii)与SEQ ID NO：11-14中的任一个具有出现至少80％序列同一性的氨基酸序列和GPI锚。

13.一种包含TGF-β结合结构域TGF-β结合区的嵌合抗原受体(CAR)，其中包含对应于TGF-β受体的TGF-β结合结构域TGF-β结合区的氨基酸序列或由其组成。

14.根据权利要求13所述的CAR，其特征在于其中，TGF-β受体是TGF-βII型受体(TGF-βR2)。

15.根据权利要求13或14所述的CAR，其特征在于，其中所述TGF-β结合结构域TGF-β结合区包含与SEQ ID NO：4具有出现至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

16.一种核酸，编码权利要求1-15中任一项的TGF-β诱饵受体或CAR的核酸。

17.一种载体，其包含权利要求16的核酸。

18.一种细胞，其包含权利要求1-15中任一项的TGF-β诱饵受体或CAR，权利要求16的核酸，或权利要求17的载体。

19.一种产生表达TGF-β诱饵受体或CAR的细胞的方法，包括将权利要求16的核酸或权利要求17的载体导入细胞，并在适于细胞表达核酸或载体的条件下培养该细胞。

20.一种细胞，通过权利要求19的方法获得或可获得的细胞。

21.一种药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项的TGF-β诱饵受体或CAR，权利要求16的核酸，权利要求17的载体，或权利要求18或权利要求20的细胞，和药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂。

22.用于治疗或预防疾病或病症的，根据权利要求1-15中任一项的TGF-β诱饵受体或CAR，根据权利要求16的核酸，根据权利要求17的载体，根据权利要求18或权利要求20的细胞或根据权利要求21的药物组合物，用于治疗或预防疾病或病症的方法。

23.根据权利要求1-15中任一项的TGF-β诱饵受体或CAR，根据权利要求16的核酸，根据权利要求17的载体，根据权利要求18或权利要求20的细胞或根据权利要求21的药物组合物的用途，用于制备治疗或预防疾病或病症的药物制备。

24.一种治疗或预防疾病或病症的方法，包括给予受试者治疗或预防有效量的权利要求1-15中任一项的TGF-β诱饵受体或CAR，权利要求16的核酸，根据权利要求17的载体，根据权利要求18或权利要求20的细胞或根据权利要求21的药物组合物。

25.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，包括：

(a)从受试者中分离至少一个细胞；

(b)修饰该至少一个种细胞以表达或包含权利要求1-15中任一项的TGF-β诱饵受体或CAR，权利要求16的核酸，或权利要求17的载体；和

(c)将该经修饰的至少一个种细胞给予受试者。

26.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，包括：

(a)从受试者中分离至少一个细胞；

(b)将权利要求16的核酸或权利要求17的载体导入该至少一个种细胞，从而修饰该至少一个种细胞；和

(c)将该经修饰的至少一个种细胞给予受试者。

27.根据权利要求22所述应用的TGF-β诱饵受体、CAR、核酸、载体、细胞或药物组合物，根据权利要求23的用途，或根据权利要求24-26中任一项的方法，其中所述疾病或病症病情是一种癌症。

28.一种试剂盒，其包含预定量的根据权利要求1-15中任一项的TGF-β诱饵受体或CAR，根据权利要求16的核酸，根据权利要求17的载体，根据权利要求18或权利要求20的细胞，或根据权利要求21所述的药物组合物。