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CN116836301B - 基于TGF-beta抗体的陷阱受体 - Google Patents

基于TGF-beta抗体的陷阱受体 Download PDF

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CN116836301B CN202310830478.6A CN202310830478A CN116836301B CN 116836301 B CN116836301 B CN 116836301B CN 202310830478 A CN202310830478 A CN 202310830478A CN 116836301 B CN116836301 B CN 116836301B
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Abstract

本发明涉及基于TGF‑beta抗体的陷阱受体，所述陷阱受体包含：作为胞外区的抗TGF‑beta抗体或其抗原结合片段或突变体；跨膜区或GPI锚定区。本发明的陷阱受体能够有效阻断增强免疫细胞增殖的刺激性信号，降低TGF‑beta因子的免疫抑制效果。

Description

基于TGF-beta抗体的陷阱受体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种陷阱受体及其用途。
背景技术
在肿瘤过继细胞治疗中(ACT)，免疫系统的稳定性至关重要。反应过低可能造成严重感染，反应过强则发生过敏反应。人体免疫系统进化出精细、复杂的双向免疫调节机制对免疫应答进行正负双向调节。在排除外来抗原异物时，激活并加强免疫应答反应；外来抗原物质排除后，可使免疫应答减弱至终止。在肿瘤ACT中，效应T细胞的正向调节分子包括CD3/TCR复合物、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)等，负向调节分子包括PD-1(PDCD1、CD279)、CTLA-4(CD152)、LAG3(CD223)、TIM3(HAVCR2)等。然而在肿瘤微环境(TME)中，存在许多能负调控T细胞免疫应答的因素，使肿瘤细胞得以逃脱肌体免疫系统的监控与清除并不断恶性增殖、侵袭与转移。
TGF-β对全身免疫系统具有抑制作用并且抑制宿主的免疫监控。TGF-β在肿瘤的起始与进展中起到重要的作用。TGF-β具有肿瘤促进效果，其通常在多类肿瘤中大量产生并已知具有致癌作用，并且其对肿瘤免疫具有负面影响且显著抑制宿主的肿瘤免疫监控。TGF-β通过抑制编码多个关键蛋白的基因的转录显著地并直接地抑制细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的细胞毒性程序(cytotoxic program)，这些关键蛋白至少包括：穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B、Fas配体和g干扰素等细胞毒素。同时，TGF-β对CD4+T细胞的分化与功能也有显著影响。
针对免疫效应细胞负调控的TGF-β抑制性信号通路，CN110709416A公开了一种TGF-β诱饵受体，其包括TGF-β结合区结构域和脂质锚定区。TGF-β结合区结构域包含TGF-β受体(如TGF-βRII)。该诱饵受体缺乏跨膜区和胞内区，结合TGF-β因子后无下游的抑制性信号通路激活，减少了TGF-β对免疫效应细胞的抑制作用。为刺激免疫效应细胞的增殖和提升其肿瘤免疫的效果，目前仍然需要更多的包括功陷阱受体在内的手段对免疫效应细胞进行改造。
发明内容
本发明提供一种分离的融合蛋白，包含：作为胞外区的抗TGF-beta抗体或其抗原结合片段或突变体；跨膜区或GPI锚定区或其突变体。所述融合蛋白不包含共刺激信号分子的胞内结构域或胞内信号转导区域。
在一个或多个实施方案中，所述抗TGF-beta抗体为抗TGF-beta1抗体、抗TGF-beta2抗体或抗TGF-beta3抗体。
在一个或多个实施方案中，所述抗体包括选自单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)、纳米抗体(nanobody)、重链抗体(HCAb)、Fab、Fab’和F(ab’)2中的任一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述抗体具有如下HCDR：
HCDR1包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述抗体具有如下LCDR：
LCDR1包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗体为SEQ ID NO:4所示的单链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区包括来自CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、siglec-9、siglec-10、siglec-15、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD27和CD40的跨膜区中的任一种或多种。在一个或多个实施方案中，所述IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R是各自的alpha、beta或gamma亚基。优选地，所述跨膜区是CD28或IL7Ralpha的跨膜区。
在一个或多个实施方案中，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在一个或多个实施方案中，所述IL-7Ralpha跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在一个或多个实施方案中，所述GPI锚定区包括选自以下的一种或多种蛋白或其GPI锚定结构域：CD44、CD56、CD73、CD55、Thy1、AchE、IAP、ALPP、CD59、CD14、CD16、CD24、CD28、CD48、CD52、CD58、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e、CD67、CD87、CD108、CD157、uPAR、JMH蛋白、GDNFR、CNTFR、TAG-1、PrP、磷脂酰肌醇蛋白、信号素7、CEA、GFR、Ly6G、转铁蛋白受体、接触素(F3)和T-钙黏蛋白。优选地，所述GPI锚定区为CD52蛋白、CD48蛋白、CD55蛋白、ALPP蛋白、CD90蛋白或它们的GPI锚定结构域。
在一个或多个实施方案中，CD52蛋白的GPI锚定结构域的氨基酸序列如SEQ IDNO:12所示，CD48蛋白的GPI锚定结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，CD55蛋白的GPI锚定结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，ALPP蛋白的GPI锚定结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，CD90蛋白的GPI锚定结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白的胞外区是抗TGF-beta抗体的单链抗体(scFv)，所述单链抗体：
(1)具有如下CDR：HCDR1：SEQ ID NO:48，HCDR2：SEQ ID NO:49，HCDR3：SEQ ID NO:50，LCDR1：SEQ ID NO:51，LCDR2：SEQ ID NO:52，LCDR3：SEQ ID NO:53，
(2)具有如下可变区：VH：SEQ ID NO:46，VL：SEQ ID NO:47，或
(3)如SEQ ID NO:4所示，
并且，
所述跨膜区包括来自CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、siglec-9、siglec-10、siglec-15、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD27和CD40的跨膜区中的任一种或多种，
所述GPI锚定区包括选自以下的一种或多种蛋白或其GPI锚定结构域：CD44、CD56、CD73、CD55、Thy1、AchE、IAP、ALPP、CD59、CD14、CD16、CD24、CD28、CD48、CD52、CD58、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e、CD67、CD87、CD108、CD157、uPAR、JMH蛋白、GDNFR、CNTFR、TAG-1、PrP、磷脂酰肌醇蛋白、信号素7、CEA、GFR、Ly6G、转铁蛋白受体、接触素(F3)和T-钙黏蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:4所示的单链抗体，和，SEQ ID NO:8所示的CD28跨膜区、SEQ ID NO:10所示的IL7Ralpha跨膜区或SEQ ID NO:12所示的CD52的GPI锚定结构域。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白还包括位于抗TGF-beta抗体或其抗原结合片段或突变体的N端或C端的膜表面标签。优选地，所述膜表面标签包括BCMA胞外结构域或其变体。优选地，BCMA胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
在一个或多个实施方案中，所述膜表面标签还包括位于BCMA胞外结构域或其变体的N端或C端的接头或铰链区。
在一个或多个实施方案中，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:24或26所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白还包括信号肽。优选地，所述信号肽是CD8信号肽、TBRII信号肽或CD52信号肽。
本发明还提供一种多核苷酸分子，选自：编码本发明任一实施方案所述的融合蛋白的多核苷酸分子或互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，抗TGF-beta抗体的编码序列如SEQID NO:3所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，跨膜区是CD28跨膜区，其编码序列如SEQ ID NO:7所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，跨膜区是IL7Ralpha跨膜区，其编码序列如SEQ ID NO:9所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，GPI锚定区是CD52的GPI锚定结构域，其编码序列如SEQ ID NO:11所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，GPI锚定区是CD48的GPI锚定结构域，其编码序列如SEQ ID NO:13所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，GPI锚定区是CD55的GPI锚定结构域，其编码序列如SEQ ID NO:15所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，GPI锚定区是ALPP的GPI锚定结构域，其编码序列如SEQ ID NO:17所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白中，GPI锚定区是CD90的GPI锚定结构域，其编码序列如SEQ ID NO:19所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包含膜表面标签，所述膜表面标签包含编码序列如SEQ ID NO:21所示的BCMA胞外结构域。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸分子选自SEQ ID NO:31-45和SEQ IDNO:54-55中任一所示，或者为任一所示多核苷酸分子的互补序列。
本发明还提供一种核酸构建体，含有本发明任一实施方案所述的多核苷酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体为载体；包括病毒载体或非病毒载体，优选为非病毒载体。
在一个或多个实施方案中，所述载体为表达载体或整合载体。
本发明还提供一种基因工程化的细胞，其表达本发明任一实施方案所述的融合蛋白，和/或携带所述融合蛋白的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述细胞为免疫细胞。
在一个或多个实施方案中，所述免疫细胞包括T细胞、DN T细胞、NK细胞、CAR-T、CAR-NK、TCR-T、CIK、NKT和TIL。
在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达CAR，或携带CAR的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达外源TCR，或携带外源TCR的编码序列。
本发明还提供分选表达所述融合蛋白的细胞的方法，包括检测细胞表面的所述抗TGF-beta抗体或其抗原结合片段或突变体或所述膜表面标签。
本发明还提供药物组合物，包含药学上可接受的辅料或本发明任一实施方案所述的融合蛋白、多核苷酸分子、核酸构建体以及基因工程化细胞。所述药物组合物用于治疗或预防癌症。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。
本发明还提供本发明任一实施方案所述的融合蛋白、多核苷酸分子、核酸构建体以及基因工程化细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途。
本发明优点：与已经公开的常规的TGF-β陷阱受体相比，本发明的基于TGF-β抗体的陷阱受体与TGF-β因子亲和力更高，能更好地捕获肿瘤细胞分泌的TGF-β因子，减少免疫效应细胞所受到的抑制作用，提升免疫效应细胞的激活水平；并且跨膜区采用GPI蛋白膜表面锚定序列，能通过脂筏带来的聚集效应进一步提升上述效果。
附图说明
图1：TIL-CTRL、TIL-TBDR-7和TIL-TBDR-15对同源配对的黑色素瘤PDX肿瘤组织的体内杀伤效果。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明利用抗TGF-beta抗体作为陷阱受体的胞外区，与CN110709416A中所公开的基于TGF-β受体胞外区的陷阱受体相比，同TGF-β因子具有更高的亲和力，能更好地降低TGF-β因子的免疫抑制效果，并更进一步提升表达陷阱受体的免疫效应细胞的活化和增殖水平。
本发明中，免疫细胞具有本领域周知含义，指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。淋巴细胞包括T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞和NKT细胞。适用于本发明的免疫细胞尤其包括那些通常用于肿瘤过继细胞治疗的免疫细胞。
本发明的免疫细胞表达本发明所述的陷阱受体，和/或含有所述陷阱受体的编码序列。本发明的陷阱受体设计为结合抑制性分子但无胞内区触发下游抑制性信号通路。即，触发抑制性信号的配体被占用，减少了TGF-β因子对免疫效应细胞的抑制作用。
定义
本发明使用到以下术语。对于本文未具体定义的术语，其具有本领域公知含义。
术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列、PolyA加尾信号序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如陷阱受体、CAR)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“胞外区”指膜蛋白位于细胞外的区段。
术语“结构域”是指蛋白质中具有特异结构和独立功能的区域，常见结构域的氨基酸残基数在100～400个之间，最小的结构域只有40～50个氨基酸残基，大的结构域可超过400个氨基酸残基。
陷阱受体
本发明的陷阱受体为一种融合蛋白，包含与跨膜区或GPI锚定区融合的TGF-beta抗体或其抗原结合片段。更具体而言，本发明的陷阱受体包括作为胞外区的TGF-beta抗体或其抗原结合片段和跨膜区或GPI锚定区。该陷阱受体不包含共刺激信号分子的胞内结构域或胞内信号转导区域。进一步地，该陷阱受体不包含胞内区。
本发明中，“抗体”包括但不限于：单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体，单域抗体(sdAb)、重链抗体(HCAb)，纳米抗体(nanobody)，微型抗体(minibody)，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，单链抗体(scFv)、Fab、Fab’和F(ab’)2。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3(重链抗体中可简称为CDR1、CDR2、CDR3)以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大多采取beta-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成beta-折叠结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。通常，轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，重链可变区的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。
“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合，或者与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成；IgM和IgE的Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从重链位置C226或P230的氨基酸残基到羧基端的序列段，其中该编号是根据EU索引，如在Kabat中一样。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；scFv-Fc片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的区。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。
抗体在本文中也包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此，“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的beta-折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的CDR来决定。这类抗体的产生方法本领域周知，例如使用具有基因工程免疫系统的小鼠而产生。
“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。本发明任一实施方案所述的抗体为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。
在某些实施方案中，本文所述抗TGF-beta抗体的HCDR1如SEQ ID NO:48所示。在某些实施方案中，本文所述抗TGF-beta抗体的HCDR2如SEQ ID NO:49所示。在某些实施方案中，本文所述抗TGF-beta抗体的HCDR3如SEQ ID NO:50所示。在某些实施方案中，本文所述抗TGF-beta抗体的LCDR1如SEQ ID NO:51所示。在某些实施方案中，本文所述抗TGF-beta抗体的LCDR2如SEQ ID NO:52所示。在某些实施方案中，本文所述抗TGF-beta抗体的LCDR3如SEQ ID NO:53所示。在某些实施方案中，本文所述抗TGF-beta抗体的VH如SEQ ID NO:46所示。在某些实施方案中，本文所述抗TGF-beta抗体的VL如SEQ ID NO:47所示。
本发明中，抗TGF-beta抗体通过跨膜区或GPI锚定区而定位在细胞膜外表面上。跨膜区或GPI锚定区位于抗TGF-beta抗体的C端。
跨膜区可以是任意来源。适用于本发明的跨膜区包括但不限于CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、siglec-9、siglec-10、siglec-15、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD27和CD40的跨膜区或其保留了跨膜功能的突变体中的任一种或多种。本发明中，优选的跨膜区来自CD28或IL-7Ralpha跨膜区。CD28跨膜区的示例性氨基酸序列及其编码序列分别如SEQ ID NO:8和7所示。IL-7Ralpha跨膜区的示例性氨基酸序列及其编码序列分别如SEQ ID NO:10和9所示。跨膜区还可为WO2021244486中所述的IL-7Ralpha跨膜区的突变体，其通过引用全文纳入本文。
GPI锚定区包括选自以下的一种或多种或其GPI锚定结构域(本文还称为GPI信号序列)：CD44、CD56、CD73、CD55、Thy1、AchE、IAP、ALPP、CD59、CD14、CD16、CD24、CD28、CD48、CD52、CD58、CD66a、CD66c、CD66d、CD66e、CD67、CD87、CD108、CD157、uPAR、JMH蛋白、GDNFR、CNTFR、TAG-1、PrP、磷脂酰肌醇蛋白、信号素7、CEA、GFR、Ly6G、转铁蛋白受体、接触素(F3)和T-钙黏蛋白；选地，所述GPI锚定区为CD52蛋白、CD48蛋白、CD55蛋白、ALPP蛋白、CD90蛋白或它们的GPI锚定结构域。本领域知晓GPI锚定蛋白或其锚定结构域序列。而且，本领域技术人员可以根据GPI锚定蛋白的序列容易获得其中的锚定结构域序列。
在一个或多个实施方案中，所述GPI锚定区具有SEQ ID NO:12、14、16、18、20中任一所示序列，或与其具有至少90％序列相同性并且具有结合GPI的功能的变体。
应理解的是，本文所述的“功能片段”指保留了所需生物学功能的片段。例如，本文所述胞外区的功能片段指保留了该胞外区完整序列所形成的结构所具有的如结合相应的配体、抗原等的生物学功能的完整序列中的片段，适用于本发明的各胞外结构域的功能片段以及各跨膜区或GPI锚定区的功能片段可由本领域技术人员结合本领域现有技术手段容易确定。
本发明的陷阱受体还可在胞外具有膜表面标签。因此，在一些实施方案中，本文所述的胞外结构域包含所述抗TGF-beta抗体和膜表面标签。本文中，“膜表面标签”包括BCMA胞外结构域或其片段。优选地，BCMA胞外结构域包含SEQ ID NO:22所示氨基酸序列；其编码核酸序列包含SEQ ID NO:21所示序列。膜表面标签可以作为免疫刹车元件、识别元件、接头、诱导ADCC、ADCP和/或CDC效应的元件而发挥作用，同时还可以作为所述陷阱受体表达阳性细胞的分选标签。
膜表面标签在BCMA胞外结构域的N端或C端还可具有连接片段，用于与其他多肽或多肽部分连接。连接片段通常是铰链区或接头。示例性接头包含SEQ ID NO:24或26所示的序列，其核酸序列分别如SEQ ID NO:23或25所示。所述铰链区包括选自以下的一种或多种：CD8的胞外铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区。
在一些实施方案中，BCMA胞外结构域通过SEQ ID NO:24或26所示的接头连接于SEQ ID NO:4所示的抗TGF-beta抗体的C端；或者BCMA胞外结构域直接连接于SEQ ID NO:4所示的抗TGF-beta抗体的N端。
本文所述的“突变体”包括各抗体、跨膜区、GPI锚定区和膜表面标签的突变体，只要该突变体保留了所述抗体、跨膜区、GPI锚定区和膜表面标签各自相应的生物学功能即可。例如，适用于本发明的抗体的突变体包括与作为对比的抗体具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体；适用于本发明的跨膜区的突变体包括与作为对比的跨膜区具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体；适用于本发明的GPI锚定区的突变体包括与作为对比的GPI锚定区具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体；适用于本发明的膜表面标签的突变体包括与作为对比的膜表面标签具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体。或者，与作为对比的序列相比，本发明所述的突变体具有一个或多个(如20个以内、15个以内、10个以内、8个以内、5个以内或3个以内，如1-20、1-10等)氨基酸残基插入、取代或缺失。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有beta-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
本发明也包括前文所述陷阱受体的突变体，如与所述陷阱受体具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体。更具体而言，本发明包括与前文所述陷阱受体相比具有一个或多个(如20个以内、15个以内、10个以内、8个以内、5个以内或3个以内，如1-20、1-10等)氨基酸残基插入、取代或缺失的突变体。这类突变体保留了本发明所述陷阱受体的生物学功能，包括但不限于阻断由TGF-beta引起的抑制免疫细胞增殖的信号。突变可发生在本文所述胞外结构域、跨膜区和GPI锚定区中的任一个、任两个或全部三个。
本文所述多肽可以是经过修饰的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明示例性的陷阱受体包括但不限于含有下表1每一行所示的胞外结构域、跨膜区或GPI锚定区或由下表1每一行所示的胞外结构域、跨膜区或GPI锚定区组成的陷阱受体：
表1
胞外结构域 跨膜区或GPI锚定区
TGF-βscFv CD28跨膜区
BCMA胞外结构域-TGF-βscFv CD28跨膜区
TGF-βscFv IL7Ralpha跨膜区
TGF-βscFv CD52 GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头1-BCMA胞外结构域 CD52 GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头2-BCMA胞外结构域 CD52 GPI锚定结构域
BCMA胞外结构域-TGF-βscFv CD52 GPI锚定结构域
TGF-βscFv CD48 GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头1-BCMA胞外结构域 CD48 GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头2-BCMA胞外结构域 CD48 GPI锚定结构域
BCMA胞外结构域-TGF-βscFv CD48 GPI锚定结构域
TGF-βscFv CD55 GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头1-BCMA胞外结构域 CD55 GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头2-BCMA胞外结构域 CD55 GPI锚定结构域
BCMA胞外结构域-TGF-βscFv CD55 GPI锚定结构域
TGF-βscFv ALPP GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头1-BCMA胞外结构域 ALPP GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头2-BCMA胞外结构域 ALPP GPI锚定结构域
BCMA胞外结构域-TGF-βscFv ALPP GPI锚定结构域
TGF-βscFv CD90 GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头1-BCMA胞外结构域 CD90 GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头2-BCMA胞外结构域 CD90 GPI锚定结构域
BCMA胞外结构域-TGF-βscFv CD90 GPI锚定结构域
TGF-βscFv-接头1-BCMA胞外结构域 CD28跨膜区
在一些实施方案中，本文所述陷阱受体还包含信号肽。优选地，所述信号肽位于所述陷阱受体的N端。所述信号肽可以为本领域常规的任何能够引导多肽出核的信号肽，包括但不限于CD8、CD4、CD28、CD52、CD137、EGFR、TGFBRI、TGFBRII(TBRII)、TGFBRIII的信号肽或轻链信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:2、6或28所述的氨基酸序列，其编码序列分别如SEQ ID NO:1、5、27所示。
应理解，视需要，可在本文所述的胞外结构域与跨膜区或GPI锚定区之间、抗体与膜表面标签、信号肽与其他胞外结构域之间通过接头序列进行连接。可使用本领域周知的接头序列，如含有G和S的接头序列，如(GSSS)n或(GSSSS)n，其中，n为1-8的整数。
在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含以下任一项：(a)具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和CD28跨膜区，(b)BCMA胞外结构域、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和CD28跨膜区，(c)具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和IL7Rα跨膜区，(d)具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和CD52或CD48或CD55或ALPP或CD90的GPI锚定结构域，(e)具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv、接头1、BCMA胞外结构域、CD52的GPI锚定结构域，(f)具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv、接头2、BCMA胞外结构域、CD52的GPI锚定结构域，(g)BCMA胞外结构域、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和CD52的GPI锚定结构域，(h)具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv、接头1、BCMA胞外结构域和CD28跨膜区，其中，所述CD28跨膜区如SEQ ID NO:8所示，所述IL7Rα跨膜区如SEQ ID NO:10所示，所述CD52的GPI锚定结构域如SEQ ID NO:12所示，所述BCMA胞外结构域如SEQ ID NO:22所示，所述接头1如SEQ ID NO:24所示，所述接头2如SEQID NO:26所示。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白包含以下任一项：(aa)CD8信号肽、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和CD28跨膜区,(bb)CD8信号肽、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和IL7Rα跨膜区,(cc)TBRII信号肽、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和CD52的GPI锚定结构域,(dd)TBRII信号肽、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv、接头1、BCMA胞外结构域、CD52的GPI锚定结构域,(ee)TBRII信号肽、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv、接头2、BCMA胞外结构域、CD52的GPI锚定结构域,(ff)CD52信号肽、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv、CD52的GPI锚定结构域,(gg)CD52信号肽、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv、接头1、BCMA胞外结构域、CD52的GPI锚定结构域,(hh)CD52信号肽、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv、接头2、BCMA胞外结构域、CD52的GPI锚定结构域,(ii)CD52信号肽、接头1、BCMA胞外结构域、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和CD52的GPI锚定结构域,(jj)CD52信号肽、接头2、BCMA胞外结构域、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和CD52的GPI锚定结构域，(kk)TBRII信号肽、具有本文所述6个CDR的TGF-βscFv和CD52的GPI锚定结构域、接头2、BCMA胞外结构域和CD28跨膜区，其中，CD8信号肽如SEQ ID NO:2所示，TBRII信号肽如SEQ ID NO:6所示，CD52信号肽如SEQ ID NO:28所示，所述CD28跨膜区如SEQ ID NO:8所示，所述IL7Rα跨膜区如SEQ IDNO:10所示，所述CD52的GPI锚定结构域如SEQ ID NO:12所示，所述BCMA胞外结构域如SEQID NO:22所示，所述接头1如SEQ ID NO:24所示，所述接头2如SEQ ID NO:26所示。
本发明的免疫细胞可进一步表达CAR，或含有CAR的编码序列。本发明所述的CAR可以是本领域周知的各种CAR。
CAR可依次包含结合肿瘤细胞膜抗原的多肽(如scFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号区。可采用本领域周知的用于构建CAR的铰链区、跨膜区和胞内信号区来构建本发明的CAR。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原，该多肽通常插入有抗原表位，插入的位置选自如下3个位置中的任意1个、2个或3个：所述多肽的N端、所述多肽和所述铰链区之间和所述多肽内部。所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽为天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
本发明的嵌合抗原受体可针对如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13RL1、MART-1(又称粘蛋白-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP、MUC1(又称mucin1)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11R/、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)。
单个细胞可表达多个CAR，包括靶向不同肿瘤抗原的CAR。
T细胞受体(TCR)-T
本发明的免疫细胞可进一步表达外源TCR或含有表达外源TCR基因的编码序列。本发明所述的TCR可以是本领域所周知的各种TCR，例如是HLA分型相匹配的、序列和结构已知的且相结合的抗原肽序列也已知的TCR。
本发明所述的外源TCR包括αβ双链，其可以与免疫效应细胞如T细胞内源表达的γε、δε和ξξ的双链结构形成完整的TCR复合物。本发明所述的编码外源TCR的外源基因包括αβ双链的基因，α链和β链编码序列通过可在体内切断的接头序列如P2A、T2A或F2A序列的编码DNA序列共价连接，也可通过编码IRES序列的DNA片段共价连接。除了编码外源TCR的αβ双链外，编码本发明所述的外源TCR的基因还可以包含与αβ基因融合表达的标签蛋白基因，如EGFP、RFP、YFP基因等。所述标签蛋白基因可以通过可在体内切断的接头序列如2A序列，如P2A、T2A或F2A的编码DNA序列或通过编码IRES序列的DNA序列与αβ双链的基因共价相连接。所述标签蛋白，如EGFP、RFP、YFP基因等与TCRαβ双链共同表达，能够作为检测外源TCR表达的鉴定指标。
本发明的TCR-T可针对如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13RL1、MART-1(又称粘蛋白-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP、MUC1(mucin 1)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11R/、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR)、微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)。
单个细胞可表达多个外源TCR，包括靶向不同肿瘤抗原的外源TCR。
多核苷酸分子
本发明提供多核苷酸分子，其编码本发明所述的陷阱受体。本发明也提供该陷阱受体的编码序列的互补序列。该多核苷酸分子可以是重组核酸分子，也可以是合成的；其可包含DNA、RNA以及PNA(肽核酸)并且可以是其杂合体。
还提供是本发明陷阱受体的表达框，其为一种核酸构建体即含有启动子、陷阱受体编码序列和PolyA加尾信号序列。核酸构建体中还可含有其它表达所需的原件，包括但不限于增强子等。
还提供一种载体，其含有本文所述的多核苷酸分子、表达框或核酸构建体。载体可以是质粒、粘粒、病毒和噬菌体。载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。表达载体可以是转座子载体。在某些实施方案中，表达载体为选自如下转座子载体中的一种或多种：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty。除本发明所述的多核苷酸分子外，表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。在某些实施方案中，所述重组表达载体采用pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315系列载体作为骨架。在其它实施方案中，所述重组表达载体采用pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX载体或pDC315系列载体作为骨架。在某些实施方案中，本发明使用CN105154473A构建的pNB载体。在某些实施方案中，本发明使用WO2022078310A1中记载的pKB20载体。
本发明的CAR也可通过常规的载体在本发明所述的免疫细胞中表达。载体可以是常规的表达CAR的载体，包括但不限于前文所述的各类转座子载体和重组表达载体。
在一些实施方案中，同一载体同时编码本发明的陷阱受体和CAR。该载体可以是双顺反子。CAR的编码序列可设置在陷阱受体编码序列5’或3’端。CAR和陷阱受体的表达可处于相同或不同调控序列的指导下。
在多核苷酸序列已知的情况下，可采用本领域常规的方法制备得到各多核苷酸分子，并构建相应的载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组载体，参见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory)、Ausubel等(1989,Short Protocols in Molecular Biology,Wiley)或其他标准教科书中描述的技术。替代地，可将所述核酸分子和载体重建成用于递送到靶细胞的脂质体。含有本发明的核酸分子的载体可通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，可参见Sambrook等(见上)。
宿主细胞
本文中，在表达异源核酸序列时，“宿主细胞”是指真核细胞，其能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因。宿主细胞可用作载体的受主。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指外源性核酸转染或转导到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。本文所用的术语“工程改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞往往指其中已经导入外源性核酸序列，例如载体的细胞。因此，重组细胞可与不含导入的重组核酸的天然存在的细胞相区分。
本文中，宿主细胞包括携带本文所述多核苷酸分子和/或多肽的细胞。具体而言，本发明提供携带本发明所述陷阱受体和/或其编码序列的细胞。本发明的细胞优选为免疫细胞，可用于肿瘤过继细胞治疗。本发明这类细胞也称为本发明陷阱受体修饰的细胞。
更具体而言，本发明的细胞优选为免疫效应细胞，包括T细胞，如细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞)、NK细胞、NKT细胞、CAR-T、CAR-NK、TCR-T、CIK、TIL；和能引发效应功能的其他免疫细胞。
本文中，相对于接受它们的个体，细胞可以是自体细胞、同系细胞、同种异体细胞，并且甚至在一些情况中可以是异种移植细胞。
可将本发明的核酸构建物/重组表达载体转入感兴趣的细胞中。转入的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述核酸构建物或重组表达载体。
除携带本发明所述陷阱受体和/或其编码序列外，本发明的细胞还可具有可用于细胞免疫治疗(如肿瘤过继细胞治疗)的一种或多种其他特性。这类其他特性可以是对细胞而言固有的或可以是人进行遗传操作后细胞的一部分。例如，本发明的细胞可携带嵌合抗原受体、αβT细胞受体，和/或抗原特异性受体，例如肿瘤特异性受体，或其编码序列。
药物组合物
本文中，“药物组合物”指用于给予个体的组合物且涵盖用于免疫治疗的细胞的组合物。本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的运载体。合适的药物运载体的示例是本领域已知的且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，如油/水乳液、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。可通过熟知的常规方法配制包含这类运载体的组合物。这些药物组合物可以合适剂量给予对象。
可由主治医师和临床因素确定剂量方案。如医学领域所熟知，用于任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给药时间和给药途径、总体健康状况和同时给予的其他药物。
本发明的组合物可局部或全身性给予。在某些实施方式中，本发明提供的组合物(例如表达本发明所述的陷阱受体的细胞)可通过胃肠道外给予，例如静脉内、动脉内、鞘内、真皮下或肌内给予。在某些其他实施方式中，可直接将编码本发明提供的构建体的DNA给予至靶位点，例如通过基因枪递送到内部或外部靶位点或通过导管递送到动脉内位点。在优选的实施方式中，皮下给予药物组合物，且在更优选的实施方式中，静脉内给予。胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠道外载剂包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或固定油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格右旋糖的那些物质)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可包含蛋白性运载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人源的。除蛋白性嵌合细胞因子受体构建体或编码其的核酸分子或载体外，设想本发明的药物组合物还可包含生物活性试剂，这取决于该药物组合物的预定用途。
用于肠胃外(例如静脉内)施用本文所述细胞的组合物还可以冻干形式或在溶液中(例如冻存制剂)储存。冻存制剂可储存成即用形式或在施用前进一步配制的形式。冻存制剂可以耐受远距离运输而不损伤细胞。除了细胞本身外，冻存制剂通常还包括细胞冻存液、人血清白蛋白(HSA)等组分。在施用前(例如静脉输注)，冻存的药物组合物需低温保存(例如置于液氮中)。冻存制剂解冻后可直接或者配制为输注组合物向患者输注。本领域技术人员知晓常规冻存液的组分和浓度。例如，冻存液或输注组合物还可包含二甲亚砜、氯化钠、葡萄糖、醋酸钠、氯化钾或氯化镁等，其浓度可由本领域技术人员(例如有经验的医师)根据细胞、疾病、患者等状况确定。
方法和应用
本发明所述的陷阱受体、多核苷酸分子、载体、宿主细胞以及包含这些物质的药物组合物可用于预防、治疗或缓解癌症，尤其是癌细胞表面表达有相应肿瘤抗原的癌症，或用于制备用于预防、治疗或缓解癌症的药物。
本文所用“治疗”或“处理”包括对疾病或病理状况的症状或病变的任何有益或需要的效果，并且可包括治疗中的疾病或病症(例如，癌症)的一种或多种可测量标记物的甚至很小的减少。治疗可任选地包括疾病或病症的症状的减少或缓解，或者疾病或病症进展的延迟。“治疗”不一定表示疾病或病症或其相关症状的完全根除或治愈。
本文所用的“预防”表示用于预防、抑制或降低疾病或病症(例如，癌症)出现或复发的可能性的方法。其也指延迟疾病或病症的发生或复发或者延迟疾病或病症的症状的出现或复发。本文所用“预防”也包括在疾病或病症发生或复发之前降低疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。
本发明包括使用标准载体和/或基因递送系统将细胞、多核苷酸分子和载体单独或以任意组合的方式给予，任选地与药学上可接受的运载体或赋形剂一同使用。在某些实施方式中，给药后，所述多核苷酸分子或载体可稳定地整合至对象的基因组中。
在具体的实施方式中，可使用特异性针对某些细胞或组织且在所述细胞中持续存在的病毒载体。合适的药物运载体和赋形剂在本领域是众所周知的。根据本发明制备的组合物可而用于预防或治疗或延缓上述鉴定的疾病。
此外，本发明提供一种预防、治疗或缓解癌症的方法，包括以下步骤：向有此需要的对象给予有效量的细胞，所述细胞携带本发明所述和/或由本发明所述方法生成的陷阱受体、多核苷酸分子和/或载体。
本文中方法可用于预防、治疗或缓解各种癌症，包括各种实体瘤和血液肿瘤，包括但不限于肺癌(如非小细胞肺癌)，结肠癌，宫颈癌，肝癌，纤维肉瘤，红白血病，前列腺癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌，黑色素瘤和脑胶质瘤等。更具体的，本文癌症包括但不限于乳腺、前列腺、肺和结肠癌或上皮癌，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌、黑色素瘤；生殖-泌尿道癌症，例如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌；肾癌、肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌、甲状腺癌等。给予本发明的组合物可用于癌症的所有阶段和类型，包括用于例如微小残留病、早期癌症、晚期癌症和/或转移性癌症和/或难以治疗的癌症。
通过示例的方式，如下治疗癌症患者或易患癌症的患者或疑似患有癌症的患者。如本文所述修饰的细胞可给予个体并且停留延长的时间段。该个体可接受细胞的一次或多次给药，且给药的间隔时间可以是数天、数周、数月或数年。在具体实施方式中，多次给药可在数周或数月内发生，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周或月。在一些实施方式中，遗传修饰的细胞经包封以抑制免疫识别并位于肿瘤位点。在使用本发明的细胞进行初始治疗后肿瘤复发后向个体提供细胞的情况中，可改变这些细胞使其识别不同的靶肿瘤抗原。例如，当初始轮次包括携带本发明的陷阱受体和特异性针对特定抗原的另一受体的细胞时，后续轮次后(包括肿瘤复发后)可使用针对不同特定抗原的受体。
在一些实施方案中，向需要的个体提供有效量的治疗性细胞，所述治疗性细胞携带或表达本发明任一实施方案所述的陷阱受体和任选的CAR或外源转基因TCR。可与一种或多种其他癌症治疗同时或不同时递送这些细胞。可在同一或单独的制剂中递送这些细胞和其他癌症治疗剂。可以单独的递送途径向个体提供细胞和其他癌症治疗剂。可通过例如在肿瘤位点处注射或静脉内或口服来递送细胞和/或其他癌症治疗剂。这类组合物的常规递送途径是本领域已知的。
所采用的细胞数量将取决于多种情况，例如导入的目的、细胞的寿命、待使用的方案、给药的次数、细胞繁殖的能力、重组构建体的稳定性等。
可根据需要给予细胞。在某些实施方式中，可使用多种方案来调节方案参数。在具体实施方式中，给药的途径或次数或时机、细胞的寿命和/或存在的细胞数目可以发生变化。给药的次数可例如至少部分取决于上述因素。
试剂盒
本文所述的任意组合物可包含于试剂盒中。在一个非限制性实施例中，可在试剂盒中包含用于细胞疗法的表达本发明任一实施方案所述的陷阱受体的细胞和/或生成用于细胞疗法的一种或多种细胞的试剂，该疗法含有重组表达载体。以合适的容器方式提供试剂盒组分。
这些试剂盒的一些组分可包装在水性基质中或包装成冻干形式。这些试剂盒的容器用具通常包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器用具，其中该组分可放置，并优选适当分装于其中。在试剂盒中存在超过一种组分的情况中，该试剂盒通常还含有第二、第三或其他容器，其中可分开放置其他组分。然而，可在小瓶中包含组分的各种组合。本发明的试剂盒通常还包含用于市售的封闭约束形式含有该组分的器具。此类容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中保留所需小瓶。
当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水性溶液，特别优选无菌水性溶液。在一些情况中，容器用具本身可以是注射器、移液器和/或其他这类设备。
试剂盒的组也分可以干粉形式提供。当以干粉提供试剂和/或组分时，可通过加入合适的溶剂来重建粉末。因此，试剂盒还可包含含有无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其他稀释剂的第二容器用具。
试剂盒的组分也可以冻存制剂(例如冻存液)的形式提供。冻存制剂解冻后可直接或者配制为输注组合物向患者输注。因此，试剂盒还可包含细胞冻存袋、细胞冻存管、温度保持装置(例如含液氮的容器)、解冻装置等。
在本发明的具体实施方式中，在试剂盒中提供待用于本文所述细胞疗法的细胞。在一些实施方案中，细胞基本上是试剂盒的唯一组分。该试剂盒可包含制备所需细胞的试剂和材料。在具体实施方式中，该试剂和材料包含用于扩增所需序列的引物、核苷酸、合适的缓冲剂或缓冲试剂、盐等，并且在一些情况中，该试剂包括编码本文任一实施方案所述的陷阱受体和/或其调控元件的DNA和/或载体。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
实施例1：陷阱受体表达载体的构建
按照PCT申请WO2022078310A1说明书第21页实施例1记载的方法，构建pKB20载体。按照该实施例记载的方法，构建含有外源基因表达框的pKB20载体。具体地，委托公司合成获得SEQ ID NO:31-45和SEQ ID NO:54-55所示序列，代表不同的TGF-β陷阱受体(TBDR)，如下表2所示。分别将SEQ ID NO:31-45和SEQ ID NO:54-55所示的序列的2端用连接酶加上含有相应的酶切位点的接头后按照WO2022078310A1说明书第21页实施例1记载的方法克隆到制备好的pKB20载体中，分别命名为pKB20-TBDR-1、pKB20-TBDR-2、pKB20-TBDR-3……pKB20-TBDR-17。将上述获得的重组质粒转化到E.coli(DH5c)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。
表2：TGF-β陷阱受体结构与序列
实施例2：黑色素瘤组织来源TIL细胞的分离培养
收集新切除的黑色素瘤标本，立即在无菌条件下进行处理。根据WO2022111571A1实施1中记载的培养基和实施例2记载的肿瘤样本处理方法与TIL培养方法对本实施例黑色素瘤组织进行处理并培养获得TIL。WO2022111571A1通过引用全文纳入本申请。
具体如下：
1)配制含有终浓度100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和50μg/mL庆大霉素的生理盐水待用；
2)在二级生物安全柜中无菌环境下将获得的新鲜分离的肿瘤患者的肿瘤组织样本置于已加入30mL步骤1)配制的生理盐水的10cm培养皿中洗涤，再转移至新的加入30mL步骤1)配制的生理盐水的10cm皿中洗涤，共重复洗3次；
3)用无菌手术刀片剔除脂肪组织与坏死组织，将肿瘤组织切割成为直径3×3×3mm3的小块，取2个G-REX100培养罐(购自Wilsonwolf)，每个G-REX100培养罐中放置42块随机选取的肿瘤组织块，培养罐中加入种子细胞培养基，种子培养基的组分包括：3000IU/mLIL-2、20ng/mL IL-7、20ng/mL IL-15、500U/mL GM-CSF、1000IU/mL IFN-γ、3μg/mL抗CD137mAb、3μg/mL抗CD28 mAb、3μg/mL抗PD-1mAb、10ng/mL TNF-α、5％v/v人AB血清、1×PS双抗和补至终体积的X-VIVO 15基础培养基；多余的肿瘤组织块用CryoStor10(购自BioLifeSolutions)冻存液通过程序降温仪液氮冻存；
4)3)中含有肿瘤组织块的G-REX100培养罐中加入1L上述种子细胞培养基后，对肿瘤组织块37℃5％CO2进行培养，每隔4天移除一半体积的旧种子细胞培养基，补加一半体积的新鲜种子细胞培养基，第12天离心收获TIL种子细胞后统计细胞总数与活率；
5)取4)中收获的种子细胞，用含有500IU/mL IL-2、7ng/mL IL-7、30ng/mL IL-15、5％v/v人AB血清、1×PS双抗和补齐至终体积的X-VIVO 15基础培养基的扩大培养基重悬至5.0×105/mL，加入到经过抗CD3 mAb、抗CD28 mAb和抗CD137 mAb包被预处理的细胞培养器皿中，37℃5％CO2激活2天，然后将激活后的细胞离心收集，接种至加入有已事先预热的扩大培养基的G-REX500M培养罐中，G-REX500M培养罐中的扩大培养基与上述扩大培养基相同。每个G-REX500M中扩大培养基体积为5L。激活后的种子细胞按照2.5×105/cm2的接种密度接种，37℃5％CO2进行培养，每隔4天进行细胞计数后，移除一半体积的旧扩大培养基，补加一半体积的新鲜扩大培养基，待每个G-REX500M罐中的细胞总数达到1.0×1010后，按1﹕2比例进行分瓶，每瓶补加新鲜扩大培养基至5L后继续培养。在G-REX500M培养罐的扩大培养基中前后总共培养12天后收获细胞，获得TIL。
实施例3：TIL的遗传修饰与增殖
1)预先将AIM-V培养基加入12孔板内，总计18个孔，每孔2mL，随后转入细胞培养箱内37℃5％ CO2预热1小时；
2)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：
100μL NucleocuvetteTMStrip(μL)
NucleofectorTM溶液的体积 82
电转补充溶液 18
按照需要测试的质粒pKB20-TBDR-1、pKB20-TBDR-2、pKB20-TBDR-3……pKB20-TBDR-17以及对照空载质粒pKB20，准备实验组电转体系17组和对照组1组；
3)取实施例2获得的TIL至18个EP管内，每个EP管内加入5×106个细胞，1200rpm离心5min，弃上清，随后用500μL生理盐水重悬细胞，重复离心步骤洗涤细胞沉淀；
4)向2)中配置好的每个不同实验组和对照组的电转液分别加入质粒pKB20-TBDR-1、pKB20-TBDR-2、pKB20-TBDR-3……pKB20-TBDR-17及对照空载质粒pKB20 6μg，随后室温静置30min以内；
5)用4)中配置好的含质粒的电转液重悬所有试管，每管100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA NucleofectorTM2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择X001；
6)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至EP管中，每管加入预热的AIM-V培养基200μL，随后转入1)中12孔板内含预热AIM-V培养基的孔中，37℃、5％CO2培养；培养5天后，获得过表达TBDR-1-TBDR-17的TIL细胞与对照组TIL细胞，分别命名为TIL-TBDR-1、TIL-TBDR-2……TIL-TBDR-17和TIL-CTRL。
实施例4：表达TBDR的TIL的表型检测
1、电转TBDR的TIL的细胞存活率与阳性率
通过台盼蓝染色和细胞计数仪计数检测各组细胞存活率。结果显示，实施例3制备的TIL-TBDR-1-TIL-TBDR-17和TIL-CTRL的细胞存活率均在95％以上。
通过间接标记法荧光标记上述各电转TBDR的TIL，流式细胞仪检测TBDR受体基因表达阳性的细胞占比，方法如下：
1)收集TIL-TBDR-1-TIL-TBDR-17和TIL-CTRL各组细胞，每组细胞数量收集1×106个，800g，离心3min；
2)弃上清，各细胞样品加入生理盐水重悬细胞，800g，离心3min；
3)弃上清，各细胞样品加入100μL生理盐水重悬细胞，每管各加2μL偶联生物素的浓度为1μg/mL细胞因子TGF-β1(购自acrobiosystems；货号：TG1-H8217)，室温孵育30分钟；800g，离心3min，洗涤两遍；
4)弃上清，每管沉淀加入100μL生理盐水，重悬细胞，每管加入2μL PE-链霉亲和素(PE Streptavidin，购自BDbiosciences；货号：554061)，室温孵育30分钟，800g，离心3min，洗涤两遍，弃上清；
5)用400μL生理盐水重悬，上流式细胞仪检测。
同时，针对表达含有BCMA胞外结构域的TBDR受体的TIL(TIL-TBDR-4、TIL-TBDR-5、TIL-TBDR-7、TIL-TBDR-8、TIL-TBDR-9、TIL-TBDR-10、TIL-TBDR-16、TIL-TBDR-17)，将BCMA胞外结构域(或其突变体)作为标签，通过直接标记法流式细胞仪检测BCMA阳性细胞的占比，方法如下：
1)收集TIL-TBDR-4、TIL-TBDR-5、TIL-TBDR-7、TIL-TBDR-8、TIL-TBDR-9、TIL-TBDR-10、TIL-TBDR-16、TIL-TBDR-17各组细胞，每组细胞数量收集1×106个，800g，离心3min；
2)弃上清，各加入生理盐水重悬细胞，800g，离心3min；
3)弃上清，各加入100μL生理盐水重悬细胞，每管各加2μL BCMA流式抗体(购自Biolegend货号：357504)，室温孵育30分钟；
4)各加入适量生理盐水，800g，离心3min，洗涤两遍，弃上清；
5)用400μL生理盐水重悬，上流式细胞仪检测。
结果显示，各组细胞阳性率如下表3所示：
表3间接标记法与直接标记法检测TBDR表达阳性细胞占比
结果如表3所示，在对照组细胞TIL-CTRL中，BCMA阳性细胞占比为0，表达TGF-β受体的细胞占比约17％，表明在制备的天然TIL中，不存在BCMA表达阳性的细胞，有约17％细胞表达天然TGF-β受体。在TIL-TBDR-4、TIL-TBDR-5、TIL-TBDR-7、TIL-TBDR-8、TIL-TBDR-9、TIL-TBDR-10、TIL-TBDR-16、TIL-TBDR-17中，间接标记法检测获得的阳性比例均高于直接标记法检测获得的比例，高出的部分与自身表达的天然TGF-β受体的TIL的比例基本一致(可认为是间接法结果中的假阳性部分)，而通过BCMA胞外结构域作为标签的直接标记法获得的阳性细胞比例范围在约50％-60％，相对准确地反映了TBDR表达阳性TIL的占比。
以下实施例涉及到阳性率的，TIL-TBDR-4、TIL-TBDR-5、TIL-TBDR-7、TIL-TBDR-8、TIL-TBDR-9、TIL-TBDR-10、TIL-TBDR-16和TIL-TBDR-17采用直接标记法结果，TIL-TBDR-1、TIL-TBDR-2、TIL-TBDR-3、TIL-TBDR-6、TIL-TBDR-11、TIL-TBDR-12、TIL-TBDR-13、TIL-TBDR-14和TIL-TBDR-15采用间接标记法减去TIL-CTRL间接标记法阳性率数值(17.2％)后的结果。
2、电转TBDR的TIL的淋巴细胞表型
各组细胞的相关淋巴细胞表型如表4所示
表4 TIL-TBDR-1-TIL-TBDR-17细胞表型
样品名称 CD45+(％) CD3+(％) CD4+(％) CD8+(％)
TIL-TBDR-1 100 99.52 41.66 54.89
TIL-TBDR-2 100 96.21 36.75 54.62
TIL-TBDR-3 99.97 96.75 32.21 57.13
TIL-TBDR-4 100 99.27 24.98 54.78
TIL-TBDR-5 99.89 94.17 31.66 59.43
TIL-TBDR-6 99.95 96.76 42.18 51.08
TIL-TBDR-7 100 92.24 29.46 54.04
TIL-TBDR-8 100 98.08 42.01 52.86
TIL-TBDR-9 99.99 94.85 17.89 65.45
TIL-TBDR-10 99.86 91.97 32.05 53.88
TIL-TBDR-11 100 90.01 37.14 52.21
TIL-TBDR-12 99.94 92.97 24.87 61.01
TIL-TBDR-13 100 94.81 30.09 61.98
TIL-TBDR-14 100 97.44 42.16 50.72
TIL-TBDR-15 99.98 99.65 35.97 60.71
TIL-TBDR-16 100 93.86 29.14 62.16
TIL-TBDR-17 99.79 90.25 40.77 47.85
TIL-CTRL 100 96.59 41.39 52.91
实施例5：表达TBDR的TIL中的TGF-β介导的信号传导的抑制
将实施例3中获得的TIL-TBDR-1-TIL-TBDR-17和TIL-CTRL用终浓度50ng/mL TGF-β1因子在37℃，5％ CO2条件下孵育1小时后，用BD Biosciences的BDTM Phosphoflow流程检测各样本中TGF-β受体胞内下游信号通路磷酸化的细胞的比例，步骤如下：
1)使用前5-10分钟37℃水浴加热固定缓冲液(BDTMPhosflow Fix Buffer I，Cat.No.：557870,BD Biosciences，)；
2)300g 5min离心收集TGF-β1处理后的TIL-TBDR-1-TIL-TBDR-17和TIL-CTRL，立即用固定缓冲液对细胞进行固定以维持细胞的磷酸化状态，颠倒或涡旋EP管混匀；
3)37℃孵育细胞10-15分钟；
4)300g离心5分钟去除上清；
5)加入通透缓冲液(BDTMPhosflow Perm Buffer III，Cat.No.：558050,BDBiosciences，1×106细胞/mL)，室温静置孵育10分钟；
6)用通透缓冲液洗涤细胞两次；300g离心5分钟去除上清；
7)用通透缓冲液按1×107细胞/mL密度重悬细胞；
8)取1×106细胞，加入5μL Smad2/3荧光抗体(BD PhosflowTMAlexa647Anti-Smad2(pS465/pS467)/Smad3(pS423/pS425)，Cat.No.:562696,BD Biosciences)，室温避光孵育30分钟；
9)用2mL染色缓冲液(BD PharmingenTMStain Buffer(FBS)，Cat.No.：554656,BDBiosciences)洗涤一次；300g离心5分钟，去除上清；
10)用500μL染色缓冲液重悬，上流式细胞仪检测。
将流式检测获得的各样品(TIL-TBDR-1-TIL-TBDR-17)中磷酸化Smad2/3阳性细胞比例(Smad2/3P％)根据TBDR表达阳性率(见实施例4)进行均一化后得到均一化的Smad2/3P％(NSmad2/3P％)，TIL-CTRL的Smad2/3P％为对照Smad2/3P％，计算各样本细胞中对TGF-β信号传导的抑制率，计算公式如下：
结果如表5所示：
表5：TIL-TBDR-1-TIL-TBDR-17中的TGF-β信号传导抑制率
表5结果显示，结构上具有TGF-βscFv胞外区和GPI锚定区的TBDR(TBDR-3-TBDR-10)对TGF-β信号传导的抑制明显高于其他结构的TBDR。拥有GPI锚定区的TBDR与其跨膜区为常规跨膜区(CD28或IL7Rα跨膜区)的结构相比对TGF-β信号传导的抑制也明显更高(TBDR-17vs TBDR-1\TBDR-2)。另外，在几个包含不同的GPI锚定区的TBDR中(TBDR-11-TBDR-15)，具有CD52 GPI锚定区的TBDR(TBDR-11\16)产生的TGF-β信号传导抑制率最高，且明显高于包含其他GPI锚定区的TBDR(TBDR-12\13\14\15)。
实施例6：过表达TBDR的TIL对同源肿瘤细胞的杀伤效果
将实施例2的新鲜的黑色素瘤组织切割成为3×3×3mm大小的碎块，碎块尽量均匀混合后按照Robert Suriano et al.Ex Vivo Derived Primary Melanoma Cells:Implications for Immunotherapeutic Vaccines J Cancer 2013；4(5):371-382.Materials and Methods部分记载的方法培养获得原代黑色素瘤细胞。待肿瘤原代细胞贴壁后取上清根据TGF-β1ELISA试剂盒(Human TGF beta 1ELISA Kit，Cat.No.:ab100647,abcam)说明书检测TGF-β1浓度。结果显示培养基上清中的TGF-β1的浓度为12.7ng/mL。
应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例3获得的TIL-TBDR-1、TIL-TBDR-2……TIL-TBDR-17和TIL-CTRL细胞对其同源的黑色素瘤原代细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：将培养获得的黑色素瘤原代细胞按每孔104个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定后，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养18h-24h后，观察细胞指数，当细胞指数为1时，分别加入效应细胞TIL-TBDR-1、TIL-TBDR-2……TIL-TBDR-17和TIL-CTRL，每孔50μL，效靶比为2:1，开始步骤3，共培养超过48后，观察细胞增殖曲线,计算靶细胞杀伤率。靶细胞杀伤率计算公式如下：
其中A为未加入任何效应细胞仅存在靶细胞(即肿瘤细胞)组的细胞指数，B为加入效应细胞各组的细胞指数。
结果如表6所示。与TIL-CTRL相比，TIL-TBDR-1、TIL-TBDR-2……TIL-TBDR-17对同源的黑色素瘤原代肿瘤细胞具有明显更强的杀伤效果。同时，与TIL-TBDR-11-TIL-TBDR-16对肿瘤细胞的杀伤相比，TIL-TBDR-1-10的杀伤力明显更强。表明与基于TGF-β受体II胞外结构域的陷阱受体相比，基于TGF-βscFv的陷阱受体能够更好地降低TGF-β因子的免疫抑制效果，提升免疫效应细胞的激活水平，从而进一步提升对肿瘤细胞的杀伤。并且，与常规的跨膜区相比，通过GPI锚定区锚定在膜表面的TBDR能够进一步提升陷阱受体的功能，提升对靶细胞的杀伤效果。
表6：表达TBDR的TIL对同源靶细胞的杀伤率
实施例7：表达TBDR的TIL细胞对同源配对的肿瘤移植物(Patient-derivedxenograft，PDX)肿瘤组织的杀伤
实验动物
选用免疫缺陷B-NDG小鼠(购自百奥赛图)作为PDX模型构建实验动物。
实验设计和分组：如下表7所示
表7：小鼠给药方案及分组
组2-组4中所用TIL为实施例3中制备的TIL中的TIL-CTRL、TIL-TBDR-7和TIL-TBDR-15。尾静脉注射给药前将细胞离心重悬于PBS，制成细胞密度为1×108/mL PBS细胞悬液。
动物饲养
采购所需用量的B-NDG小鼠后，饲养于SPF级实验动物房，适应期7-10天。
环境：小鼠将被安置于动物房的透明树脂塑料笼中。鼠笼垫料为经高压灭菌的木屑和玉米芯垫料，定期更换。动物房间配备高效空气过滤器，温度将保持在20-26℃(68-79°F)之间，相对湿度为40-70％。持续观测并记录温度和湿度。照明条件为每天12小时日光灯照射和12小时无照明。
食物和饮水：实验用小鼠可无限量获取专用鼠粮(经辐照消毒，上海斯莱克实验动物责任有限公司，中国)，可无障碍在任何时间接近灭菌的洁净饮水。
PDX模型的构建
1)患者肿瘤组织样本处理：取实施例2中的黑色素瘤组织一部分，无菌条件下剔除坏死部分组织、脂肪组织、结缔组织等，冲洗干净后用手术刀分割成若干5×5×5mm3组织块，置于含肿瘤样本运输保存液UW中，准备用瘤块接种B-NDG小鼠；
2)肿瘤组织样本接种：取若干B-NDG小鼠，小鼠肩胛部备皮后用小鼠皮下肿瘤接种固定器固定小鼠，碘伏消毒，利多卡因局麻后用PDX模型瘤块接种套管针将1)中瘤块接种至右侧腹股沟部。接种当天记为P0，每周量瘤2次，肿瘤体积计算公式为:V＝0.5×a×b2，其中a和b分别为肿瘤的长径和短径；
3)PDX组织传代：观察各接种小鼠肿瘤组织生长情况，等到有肿瘤组织体积长到超过300mm3后，麻醉小鼠，取出瘤块，无菌条件下手术刀切割成5×5×5mm3组织块后重复步骤2)，接种到新的小鼠右侧腹股沟部，等待PDX肿瘤的下一代生长；
4)重复步骤3)，继续传代2-3代后，取部分小鼠体内PDX组织进行组织切片病理分析，确定PDX组织仍然为人源组织(而非鼠源组织)后，按表6的实验设计中使用的小鼠数量的1.5倍继续用PDX组织接种小鼠(即PDX组织块接种60只鼠)，观察小鼠成瘤情况，每周量瘤2次，等待成瘤。
动物分组及给药
等PDX接种小鼠的肿瘤体积达到～50mm3左右时，从60只动物中选取40只肿瘤体积合适的动物，按肿瘤体积进行随机分组，n＝8，确保所有组在基线上具有可比性。分组当天记为D0，按表6方案进行给药。实验期间每周3次测定动物体重和肿瘤体积，每日进行观察动物的临床症状。肿瘤体积用mm3表示，肿瘤测量公式同上述。
结果
实验结果如图1所示。不同组别间肿瘤体积大小差异进行单向方差分析(one-wayANOVA analysis)，随后采用Bonferroni法进行事后检验(Bonferroni post hoc test)，观察不同组别两两间是否有显著差异。*：p<0.05；**:p<0.01。图1显示，截止到给药后第40天，与注射PBS的对照组荷瘤小鼠相比，TIL-CTRL给药组的小鼠肿瘤体积增长受到了显著的抑制。而与TIL-CTRL给药组相比，TIL-TBDR-7与TIL-TBDR-15给药组的荷瘤小鼠的肿瘤体积又进一步地有了显著或非常显著的缩小。并且与TIL-TBDR-15相比，TIL-TBDR-7对小鼠PDX肿瘤的抑制更加显著。以上结果表明，未经修饰TIL-CTRL对其同源配对的PDX肿瘤组织有显著的抑制效果，而经过TBDR-7或TBDR-15的转基因修饰后，TIL对同源的PDX肿瘤组织的抑制效果在此基础上又有了更显著的提升，证明TBDR能显著激活免疫效应细胞，提升免疫效应细胞的肿瘤杀伤能力。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (28)

1.一种分离的融合蛋白，从N端至C端由以下组成：
（1）由抗TGF-beta抗体或其抗原结合片段组成的胞外区，和（2）跨膜区或GPI锚定区，或
（1）膜表面标签，和（2）由抗TGF-beta抗体或其抗原结合片段组成的胞外区，和（3）跨膜区或GPI锚定区，或
（1）由抗TGF-beta抗体或其抗原结合片段组成的胞外区，和（2）膜表面标签，和（3）跨膜区或GPI锚定区，
其中，
所述膜表面标签是BCMA胞外结构域，和/或，所述膜表面标签还包括位于BCMA胞外结构域的N端或C端的接头，
所述融合蛋白不包含共刺激信号分子的胞内结构域或胞内信号转导区域，
所述抗TGF-beta抗体具有如下HCDR和LCDR：HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示，
所述跨膜区是CD28的跨膜区，
所述GPI锚定区为CD52蛋白的GPI锚定结构域，和
所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述CD52蛋白的GPI锚定结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述BCMA胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:24或26所示。
2.一种分离的融合蛋白，从N端至C端由以下组成：由抗TGF-beta抗体或其抗原结合片段组成的胞外区，和IL-7Ralpha跨膜区，
其中，
所述抗TGF-beta抗体具有如下HCDR和LCDR：HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:53所示，和
所述IL-7Ralpha跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗TGF-beta抗体包括选自单链抗体、Fab、Fab’和F(ab’)2中的任一种或多种。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗TGF-beta抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示，和/或所述抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示。
5.如权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗TGF-beta抗体为SEQ ID NO:4所示的单链抗体。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括信号肽。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述信号肽是CD8信号肽、TBRII信号肽或CD52信号肽。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其特征在于，信号肽具有SEQ ID NO:2、6或28所述的氨基酸序列。
9.一种多核苷酸分子，其具有编码权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白的核酸序列。
10.如权利要求9所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述融合蛋白中，抗TGF-beta抗体的编码序列如SEQ ID NO:3所示。
11.如权利要求9所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述融合蛋白中，跨膜区是CD28跨膜区，其编码序列如SEQ ID NO:7所示。
12.如权利要求9所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述融合蛋白中，跨膜区是IL7Ralpha跨膜区，其编码序列如SEQ ID NO:9所示。
13.如权利要求9所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述融合蛋白中，GPI锚定区是CD52的GPI锚定结构域，其编码序列如SEQ ID NO:11所示。
14.如权利要求9所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述融合蛋白包含膜表面标签，所述膜表面标签的BCMA胞外结构域的编码序列如SEQ ID NO:21所示。
15.如权利要求9所述的多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子选自SEQ IDNO:31-45和SEQ ID NO:54-55中任一所示。
16.一种核酸构建体，含有权利要求15所述的多核苷酸分子。
17.如权利要求16所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为载体。
18.如权利要求17所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为非病毒载体。
19.如权利要求18所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为表达载体或整合载体。
20.一种基因工程化的细胞，其表达权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，和/或携带所述融合蛋白的编码序列。
21.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述细胞为免疫细胞。
22.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞或NK细胞。
23.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述免疫细胞选自：DN T细胞、TCR-T、CAR-T、CAR-NK、CIK、NKT和TIL。
24.如权利要求22所述的细胞，其特征在于，所述细胞还表达CAR，或携带CAR的编码序列。
25.如权利要求22所述的细胞，其特征在于，所述细胞还表达外源TCR，或携带外源TCR的编码序列。
26.一种分选表达权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白的细胞的方法，包括检测细胞表面的所述抗TGF-beta抗体或其抗原结合片段或所述膜表面标签。
27.一种药物组合物，包含药学上可接受的辅料，和，权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白、权利要求9-15中任一项所述的多核苷酸分子、权利要求16-19中任一项所述的核酸构建体、和权利要求20-24中任一项所述的细胞中的任一种或多种。
28.权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白、权利要求9-15中任一项所述的多核苷酸分子、权利要求16-19中任一项所述的核酸构建体、和权利要求20-24中任一项所述基因工程化细胞在制备治疗或预防癌症用的药物中的用途，所述癌症的肿瘤细胞分泌TGF-beta，所述癌症选自：乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌和甲状腺癌。
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