JP6561143B2 - Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ由来のヘパリナーゼ及びその調製と応用 - Google Patents
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Description
本発明は報道したことのない新規ヘパリナーゼに関し、具体的には、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ細菌由来の、細菌発酵、細胞破砕、多段カラムクロマトグラフィー分離技術によって調製された二種の新規ヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IとＳＤｈｅｐ II、及びこの二種の酵素の調製方法、ヘパリンと低分子ヘパリンの品質検査への応用に関する。
ヘパリナーゼとは、ヘパリンとヘパリチンの主鎖グリコシド結合を特異的に分解できる酵素であり、その用途が幅広く、例えば、血液に残留されるヘパリンの除去、低分子ヘパリンの調製、ヘパリン構造の研究や品質検査等に用いられ得る。ヘパリナーゼは最初にフラボバクテリウム・ヘパリナムから発見されて分離したものであり、それ以降、一部の微生物や動物組織でもヘパリナーゼの存在が続々と発見された。従来、論文で報道したことのあるヘパリナーゼは１０種類余りあり、たとえばＹａｎｇ Ｖ．Ｃ．はフラボバクテリウム・ヘパリナムからヘパリナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩを発見し、Ｒｏｂｅｒｔ Ｗ．Ｂｅｌｌａｍｙ等は桿菌属ＢＨ１００（ＦＥＲＭ ＢＰ−２６１３）細菌から細胞外で発生するヘパリナーゼを発見し、Ｗａｎ−Ｓｅｏｋ Ｋｉｍ等はバクテロイデス・スターコリスＨＪ−１５からヘパリンリアーゼを発見した［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２、３５９：３７〜４３］。
従来の研究及び応用によれば、フラボバクテリウム・ヘパリナム由来のヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、ヘパリナーゼＩＩＩは最も幅広く使用されており、それらはそれぞれ分子量が約４３、７８、６６ｋＤａの単量体タンパク質であり、等電点が全て９．０程度である。ヘパリナーゼの発現はヘパリン構造の研究及び品質検査へ重要な促進作用を果たし、その中、フラボバクテリウム・ヘパリナム由来の酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩは既にヘパリン類の品質検査や低分子ヘパリンの生産に使用されている。
本発明に係るヘパリナーゼは、報道したことのない新規ヘパリナーゼであり、物理的および化学的性質が従来のヘパリナーゼと異なり、且つヘパリンを酵素分解する際に制限酵素切断部位の選択性が高いので、応用前景が期待できる。
本発明は細菌Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅから精製した二種の新規細胞内ヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IとＳＤｈｅｐ IIを提供し、精製方法及び得られた酵素の性質を説明した。ＳＤｈｅｐ Iは分子量が７４６９２Ｄａ、ミカエリス定数が０．５７３８、等電点が５．６４であり、ＳＤｈｅｐ IIは分子量が９４７１６Ｄａ、ミカエリス定数が０．００５２、等電点が５．７６であり、この二種のヘパリナーゼは今まで報道したことのない新規ヘパリナーゼである。
本発明は以下を含む。
１．菌種由来：中国湖北省雲夢県城関鎮城西の農地土壌サンプルから分離した、ヘパリン含有培地で培養するとヘパリナーゼを生産できる菌種（番号Ｚ４−２）。該菌種を斜面培地で培養して、−７０℃で保存した。広東省微生物分析検出センターにより同定した結果、該菌種はスフィンゴバクテリアＳｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅである。このような細菌は２００６年に報道したことがあるが［Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 、２００６、５６（Ｐｔ ９）：２０３１−６．］、今まで、ヘパリナーゼ生産に関する報道がなかった。
１．菌種由来：中国湖北省雲夢県城関鎮城西の農地土壌サンプルから分離した、ヘパリン含有培地で培養するとヘパリナーゼを生産できる菌種（番号Ｚ４−２）。該菌種を斜面培地で培養して、−７０℃で保存した。広東省微生物分析検出センターにより同定した結果、該菌種はスフィンゴバクテリアＳｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅである。このような細菌は２００６年に報道したことがあるが［Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 、２００６、５６（Ｐｔ ９）：２０３１−６．］、今まで、ヘパリナーゼ生産に関する報道がなかった。
２．ヘパリナーゼの調製：
（１）Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ菌株の発酵及び粗酵素液の調製：
菌体をプレート又は斜面から２ループ分掻きとってシード培地に接種して、１〜２日間培養後、５〜２０％の接種量で二段液体シード培地に接種して、１〜２日間培養し、５〜２０％の接種量で２Ｌの発酵培地に接種して、１〜５日間培養した。菌液１００００ｒｐｍを収集して、４℃で１５〜３０分間遠心分離し、沈殿を収集して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に懸濁させ、高圧ホモジナイザーを用いて４℃、８００ｂａｒで、１〜５サイクル破砕し、３０ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを収集し、氷浴条件において硫酸アンモニウム沈殿を行って、硫酸アンモニウム飽和率が３５％〜８５％の沈殿を収集した。沈殿を１００ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解して、同じ緩衝液において透析して一晩放置した。
菌体をプレート又は斜面から２ループ分掻きとってシード培地に接種して、１〜２日間培養後、５〜２０％の接種量で二段液体シード培地に接種して、１〜２日間培養し、５〜２０％の接種量で２Ｌの発酵培地に接種して、１〜５日間培養した。菌液１００００ｒｐｍを収集して、４℃で１５〜３０分間遠心分離し、沈殿を収集して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に懸濁させ、高圧ホモジナイザーを用いて４℃、８００ｂａｒで、１〜５サイクル破砕し、３０ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを収集し、氷浴条件において硫酸アンモニウム沈殿を行って、硫酸アンモニウム飽和率が３５％〜８５％の沈殿を収集した。沈殿を１００ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解して、同じ緩衝液において透析して一晩放置した。
（２）Ｑカラムによる粗酵素の粗分離：
ステップ（１）の酵素液を１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＱカラムに注入して、同じ緩衝液で平衡化し、次に同じ緩衝液中の塩化ナトリウム０〜０．５Ｍで線形勾配溶出を行い、試験管で流出液と平衡化液を収集して、各管におけるヘパリナーゼの活性を検査して、活性部分を収集して混合し、Ｑカラムと結合しないヘパリナーゼを得た。同様に、溶出液中のヘパリナーゼ活性のある各管を収集して、混合して透析し、Ｑカラムと結合したヘパリナーゼを得た。
ステップ（１）の酵素液を１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＱカラムに注入して、同じ緩衝液で平衡化し、次に同じ緩衝液中の塩化ナトリウム０〜０．５Ｍで線形勾配溶出を行い、試験管で流出液と平衡化液を収集して、各管におけるヘパリナーゼの活性を検査して、活性部分を収集して混合し、Ｑカラムと結合しないヘパリナーゼを得た。同様に、溶出液中のヘパリナーゼ活性のある各管を収集して、混合して透析し、Ｑカラムと結合したヘパリナーゼを得た。
（３）ＳＤｈｅｐ I酵素の精製：
ステップ（２）で得られたＱカラムと結合しないヘパリナーゼをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＣＳカラムに注入し、同じ緩衝液で平衡化し、次に同じ緩衝液中の塩化ナトリウム０〜０．５Ｍで線形勾配溶出を行い、ヘパリナーゼ活性のある各成分を収集して、透析した。透析後の酵素液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＳＰカラムに注入して、同じ緩衝液で平衡化し、次にＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の塩化ナトリウム０〜０．５Ｍで線形勾配溶出を行って、各活性成分を収集し、分画分子量３０ｋＤの限外濾過遠心管で０．２ｍｌになるまで濃縮させた。濃縮させた酵素液を１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラムに注入して、同じ緩衝液で溶出し、各成分を収集して混合して濃縮させた。
ステップ（２）で得られたＱカラムと結合しないヘパリナーゼをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＣＳカラムに注入し、同じ緩衝液で平衡化し、次に同じ緩衝液中の塩化ナトリウム０〜０．５Ｍで線形勾配溶出を行い、ヘパリナーゼ活性のある各成分を収集して、透析した。透析後の酵素液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＳＰカラムに注入して、同じ緩衝液で平衡化し、次にＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中の塩化ナトリウム０〜０．５Ｍで線形勾配溶出を行って、各活性成分を収集し、分画分子量３０ｋＤの限外濾過遠心管で０．２ｍｌになるまで濃縮させた。濃縮させた酵素液を１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラムに注入して、同じ緩衝液で溶出し、各成分を収集して混合して濃縮させた。
（４）ＳＤｈｅｐ II酵素の精製：
ステップ（２）で得られたＱカラムと結合したヘパリナーゼを１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＣＳカラムに注入し、同じ緩衝液で平衡化し、次に同じ緩衝液中の塩化ナトリウム０．１〜０．６Ｍで線形勾配溶出を行い、溶出液中のヘパリナーゼ活性の成分を検出して、収集して混合して透析した。酵素液を１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＱカラムに注入し、０．０８Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液で溶出し、活性成分を検出して収集した。１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＣＳカラムに注入し、同じ緩衝液で平衡化し、次に同じ緩衝液中の０〜１Ｍ塩化ナトリウムで線形勾配溶出を行い、活性成分を収集して混合して濃縮させた。
ステップ（２）で得られたＱカラムと結合したヘパリナーゼを１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＣＳカラムに注入し、同じ緩衝液で平衡化し、次に同じ緩衝液中の塩化ナトリウム０．１〜０．６Ｍで線形勾配溶出を行い、溶出液中のヘパリナーゼ活性の成分を検出して、収集して混合して透析した。酵素液を１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＱカラムに注入し、０．０８Ｍ塩化ナトリウムを含有する同じ緩衝液で溶出し、活性成分を検出して収集した。１本のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で平衡化したＣＳカラムに注入し、同じ緩衝液で平衡化し、次に同じ緩衝液中の０〜１Ｍ塩化ナトリウムで線形勾配溶出を行い、活性成分を収集して混合して濃縮させた。
ステップ（１）、（２）、（３）、（４）の前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液はＣａＣｌ２を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌであり、ｐＨが６．５〜８．０、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの濃度が好ましくは１０〜５０ｍＭ、最も好ましくは２５ｍＭであり、ＣａＣｌ２の含有量が好ましくは１〜５０ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭであり、ｐＨ範囲が好ましくは７．０〜７．５、より好ましくは７．０である。
ステップ（２）、（３）、（４）の前記ＱカラムはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗであっても、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ等の強アニオン交換カラムであってもよい。
ステップ（３）、（４）の前記ＣＳカラムはＣｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅであっても、ヘパリンを結合したＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ等のヘパリナーゼと結合可能な親和性カラムであってもよい。
ステップ（３）の前記ＳＰカラムはＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗであっても、ほかの強カチオン交換カラムであってもよい。
ステップ（３）の前記Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラムは、タンパク質１０〜１００ｋＤａの分離精製に適用できる他の仕様のゲルカラムであってもよい。
過程において、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼの活性測定は特許「フラボバクテリウム・ヘパリナムヘパリナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩの調製方法」（中国特許出願番号２０１１１０２４１２６０．４）を参照する。タンパク質含有量の測定及び酵素純度の測定方法は文献［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１２、３５９：３７−４３］を参照する。
ステップ（１）の前記シード培地の組成は特許「フラボバクテリウム・ヘパリナムヘパリナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩの調製方法」（中国特許出願番号２０１１１０２４１２６０．４）を参照する。
ステップ（１）の前記発酵培地の組成（ｇ／Ｌ）：トリプトン ２、ヘパリン ８、ＮａＣｌ ５、（ＮＨ４）２ＳＯ４ １、ＫＨ２ＰＯ４ ２．５、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５、ｐＨ７．０。
３．ヘパリナーゼの性質
（１）本発明に係るヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IとＳＤｈｅｐ IIについてはそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した結果、分子量は約７４７００Ｄａと９４７００Ｄａである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量分析法によりその正確な分子量を測定した結果、ＳＤｈｅｐ Iは７４６９２Ｄａ、ＳＤｈｅｐ IIは９４７１６Ｄａである。
（１）本発明に係るヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IとＳＤｈｅｐ IIについてはそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した結果、分子量は約７４７００Ｄａと９４７００Ｄａである。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量分析法によりその正確な分子量を測定した結果、ＳＤｈｅｐ Iは７４６９２Ｄａ、ＳＤｈｅｐ IIは９４７１６Ｄａである。
（２）本発明に係るヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IとＳＤｈｅｐ IIについて、等電点電気泳動で測定した等電点はそれぞれ５．６４と５．７６である。
（３）本発明に係るヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IとＳＤｈｅｐ IIは、ＨＥＰとＨＳを基質としては、最適な反応ｐＨがいずれも８．０である。
（４）本発明に係るヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IはＨＥＰとＨＳを基質とする際の最適な反応温度がそれぞれ４７℃と４５℃であり、ＳＤｈｅｐ IIはＨＥＰとＨＳを基質とする際の最適な反応温度が４３℃である。
（５）本発明に係るヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IとＳＤｈｅｐ IIに対し、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｍｎ２＋及びＣａ２＋はいずれも酵素活性を促進する作用を示し、その中、Ｃａ２＋の作用が最も強く、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋及びＦｅ３＋は酵素活性阻害作用を有する。
本発明はＳｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ由来の二種のヘパリナーゼを提供し、細菌発酵、細胞破砕、硫酸アンモニウム沈殿及び多段カラムクロマトグラフィー分離により精製して得る。前記二種のヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IとＳＤｈｅｐ IIの物理的および化学的性質、例えば分子量、等電点はいずれも従来のほかのヘパリナーゼと異なり、この二種のヘパリナーゼでＨＥＰとＨＳを酵素分解して得られた二糖の組成は特異性を有し、該酵素はヘパリン及びその類似体の構造分析、ヘパリンの品質検査、及び低分子ヘパリンの調製に用いられ得る。
以下は実施例をもって本発明を更に説明するが、本発明を制限するものではない。
実施例１：ＳＤｈｅｐ Iの調製
ａ）Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ菌株の発酵及び粗酵素液の調製：菌種をプレート又は斜面から２ループ分掻きとって５０ｍｌのシード培地に接種し、３０℃、１５０ｒｐｍで１２時間培養し、次に１０％の接種量で２００ｍｌの二段液体シード培地に接種して、３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養し、次に１０％の接種量で２Ｌの発酵培地に接種して、３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。１Ｌの菌液を取って１００００ｒｐｍ、４℃で３０ｍｉｎ遠心分離して、沈殿を収集し、１００ｍｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭのＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液に懸濁させて、高圧ホモジナイザーを用いて４℃、８００ｂａｒで、３サイクル破砕し、次に４℃、１００００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離し、上澄みとして粗酵素液を得た。硫酸アンモニウム沈殿を行って、硫酸アンモニウム飽和率が３５％〜８５％の沈殿を収集し、沈殿を１００ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解して、同じ緩衝液において透析して一晩放置した。
ａ）Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ菌株の発酵及び粗酵素液の調製：菌種をプレート又は斜面から２ループ分掻きとって５０ｍｌのシード培地に接種し、３０℃、１５０ｒｐｍで１２時間培養し、次に１０％の接種量で２００ｍｌの二段液体シード培地に接種して、３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養し、次に１０％の接種量で２Ｌの発酵培地に接種して、３０℃、１５０ｒｐｍで２４時間培養した。１Ｌの菌液を取って１００００ｒｐｍ、４℃で３０ｍｉｎ遠心分離して、沈殿を収集し、１００ｍｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭのＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液に懸濁させて、高圧ホモジナイザーを用いて４℃、８００ｂａｒで、３サイクル破砕し、次に４℃、１００００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離し、上澄みとして粗酵素液を得た。硫酸アンモニウム沈殿を行って、硫酸アンモニウム飽和率が３５％〜８５％の沈殿を収集し、沈殿を１００ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解して、同じ緩衝液において透析して一晩放置した。
ｂ）Ｑカラム分離：ステップａ）の酵素液を１本の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化した仕様２．５×３０ｃｍのＱカラムに注入し、同じ緩衝液で３つのカラム体積平衡化した。流出液と平衡化した流出液中のヘパリナーゼ活性を検出して、活性成分を収集して混合した。
ｃ）ＣＳカラム精製：ステップｂ）で収集した流出液と平衡化液を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化した仕様２．５×３０ｃｍのＣＳカラムに注入し、同じ緩衝液で３つのカラム体積平衡化し、次に緩衝液に塩化ナトリウム０〜１Ｍを加えて線形勾配溶出を行って、各活性成分を収集し、２Ｌ体積の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液で一晩透析した。
ｄ）ＳＰカラム精製：ステップｃ）で透析した酵素液を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化した仕様２．５×３０ｃｍのＳＰカラムに注入し、同じ緩衝液で３つのカラム体積平衡化し、次に緩衝液に塩化ナトリウム０〜０．５Ｍを加えて線形勾配溶出を行って、各活性成分を収集し、３０ｋＤの限外濾過遠心管で限外濾過して２００μＬになるまで濃縮させた。
ｅ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００カラム精製：ステップｄ）で濃縮させたサンプルを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化した仕様１．０×１００ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラムに注入し、同じ緩衝液で溶出して、蠕動ポンプで流速を約２ｍｌ／ｈに制御し、各成分を収集して、一つの管の体積を１ｍｌにして、各成分活性を測定し、酵素活性のある成分を収集し、３０ｋＤの限外濾過遠心管で限外濾過して２００μＬになるまで濃縮させ、１．５ｍｌのＥＰ管に投入して、３００μｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）の緩衝液を加えて、５００μｌのグリセリンを加えて１ｍｌに定容した。精製プロセスの各ステップで得た酵素活性及びタンパク質含有量は下表に示される。
実施例２：ＳＤｈｅｐ Iの性質研究
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定し、結果を図１に示す。ＳＤｈｅｐ Iの分子量は約７４７００Ｄａであり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量スペクトルにより測定して分析した結果、その正確な分子量は７４６９２Ｄａであった。
等電点電気泳動で測定した結果、ＳＤｈｅｐ Iの等電点は５．６４であった。
異なる基質濃度で各条件での酵素反応の初期速度を測定して、ミカエリス定数を求める。測定した結果、ＨＥＰとＨＳを基質とする場合、ＳＤｈｅｐ Iのミカエリス定数はそれぞれ０．５７３８と０．０４１８であった。
ヘパリナーゼＳＤｈｅｐ Iについては、それぞれＨＥＰとＨＳを基質とし、基質のｐＨを５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０の九つの勾配に設定して、上記基質での酵素活性を測定した結果から明らかなように、ＨＥＰを基質とする場合、活性を示すｐＨ範囲は６．５〜９．５、最も好ましくは８．０であり、ＨＳを基質とする場合、活性を示すｐＨ範囲は５．５〜９．０、最も好ましくは８．０であった。
ヘパリナーゼＳＤｈｅｐ Iについては、それぞれＨＥＰとＨＳを基質として、基質の温度を２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９℃の複数の勾配に設定して、上記基質での酵素活性を測定した結果から明らかなように、ＨＥＰを基質とする場合、最も好ましい温度は４７℃であり、ＨＳを基質とする場合、最も好ましい温度は４５℃であった。
金属イオンの種類によるＳＤｈｅｐ Iへの影響：それぞれ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を緩衝液として、基質ＨＥＰとＨＳに１０ｍＭのＭｇ２＋、Ｍｎ２＋及びＣａ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋等の金属イオンをそれぞれ添加することによるヘパリナーゼＳＤｈｅｐ Iへの影響を観察し、金属イオンを添加しないものを空白対照群として、得られた結果から明らかなように、金属イオンを添加する場合は、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｍｎ２＋及びＣａ２＋は全て酵素活性促進作用を示し、その中、Ｃａ２＋の促進作用は最も強く、酵素活性は大幅に向上し、それに次いで、Ｍｇ２＋とＮａ＋も顕著な促進作用を有するが、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋及びＦｅ３＋は酵素活性阻害作用を有し、酵素を不活性化させる。
金属イオン濃度によるＳＤｈｅｐ Iへの影響：それぞれＨＥＰとＨＳを基質とする場合に、促進作用を有するＭｇ２＋、Ｎａ＋及びＣａ２＋の０、１、１０、５０、１００、５００及び１０００ｍＭの濃度での酵素活性への影響を観察し、結果から明らかなように、ＨＥＰとＨＳを基質とする場合は、１００ｍＭのＭｇ２＋はＳＤｈｅｐ Iに対する活性促進作用が最も強い。ＨＥＰを基質とする場合は、５００ｍＭのＮａ＋はＳＤｈｅｐ Iに対する活性促進作用が最も強い。ＨＳを基質とする場合は、５０ｍＭのＮａ＋はＳＤｈｅｐ Iに対する活性促進作用が最も強い。ＨＥＰとＨＳを基質とする場合は、１００ｍＭのＣａ２＋はＳＤｈｅｐ Iに対する促進作用が最も強い。
変性剤によるＳＤｈｅｐ Iへの影響：Ｈ２Ｏ２、アセトニトリル、ＳＤＳ、塩酸グアニジン及び尿素を変性剤として、それぞれの濃度について、１ｍＭと１０ｍＭのＨ２Ｏ２、１％と１０％のアセトニトリル、１％のＳＤＳ、１Ｍの塩酸グアニジン及び１Ｍの尿素として設定し、且つ変性剤を添加しない空白対照群を設置することによって、変性剤によるヘパリナーゼ活性への影響を観察した。上記変性剤が存在する条件において、１％と１０％のアセトニトリル、１Ｍの尿素によるＳＤｈｅｐ I酵素への影響が小さく、１ｍＭと１０ｍＭのＨ２Ｏ２、１％のＳＤＳ、１Ｍの塩酸グアニジンによるＳＤｈｅｐ Iへの影響が大きく、顕著な阻害作用を示す。
実施例３：ＳＤｈｅｐ IでＨＥＰを酵素分解して得た産物についての特異性研究
ａ）ＳＤｈｅｐ I基質の特異性研究：それぞれヘパリン（ＨＥＰ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）を基質として、ＳＤｈｅｐ Iの活性を測定したところ、ＳＤｈｅｐ I酵素はＣＳとＤＳを基質とする時に酵素活性がなく、ＨＥＰとＨＳを基質とする時に酵素活性があり、且つ活性比が約ＨＥＰ：ＨＳ＝１：１．３であることを見出した。
ｂ）ＳＤｈｅｐ IでＨＥＰを酵素分解して得た二糖の組成：５０ｍｇのヘパリンに３ＩＵ（ヘパリンを基質とする時の酵素活性）のＳＤｈｅｐ Iを加えて、緩衝液２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）で５００μＬに定容し、３７℃の条件において２４ｈ酵素分解し、次に１００℃の水浴に投入して５ｍｉｎ不活性化させ、サンプルについて二糖成分の液相分析を行って、図２に示される結果から明らかなように、ＳＤｈｅｐ IでＨＥＰを酵素分解すると、産物の主成分はＩＶＡ、ＩＶＳ、ＩＩＡ、ＩＩＳ及びＩＳであり、その中ＩＩＡとＩＩＳが主であり、それぞれ１５．３５％と１２．２％を占め、ＩＳのピーク面積が５．２９％しかなく、上記の複数種の二糖以外、複数種の四糖成分も含む。
実施例４：ＳＤｈｅｐ IIの調製
ａ）菌株の発酵及び粗酵素液の調製は実施例１と同様である。
ｂ）Ｑカラム粗酵素の分離ステップは実施例１と同様であり、緩衝液で３つのカラム体積平衡化した後、該緩衝液に塩化ナトリウム０〜０．５Ｍを加えて線形勾配溶出を行って、溶出液の活性成分を収集して、一晩透析した。
ｃ）ＣＳカラム精製：ステップｂ）で透析した酵素液を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化したＣＳカラムに注入し、同じ緩衝液で３つのカラム体積平衡化し、次に緩衝液に塩化ナトリウム０〜１Ｍを加えて線形勾配溶出を行って、各活性成分を収集し、２Ｌ体積の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液で一晩透析した。
ｄ）Ｑカラム再精製：ステップｃ）で透析した酵素液を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化したＱカラムに注入し、次に同じ緩衝液に０．０８０Ｍ塩化ナトリウムを加えて、８００ｍｌ溶出し、活性成分を収集した。
ｅ）ＣＳカラム再精製：ステップｄ）で収集した酵素活性のある成分に等体積の緩衝液を加えて、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）緩衝液で平衡化したＣＳカラムに注入し、同じ緩衝液で３つのカラム体積平衡化し、次に緩衝液に塩化ナトリウム０〜１Ｍを加えて線形勾配溶出を行い、各活性成分を収集して、活性成分についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを製作して、電気泳動結果が単一バンドである酵素活性のある成分を収集して、３０ｋＤの限外濾過遠心管で限外濾過して２００μＬになるまで濃縮させ、取り出して１．５ｍｌのＥＰ管に投入し、３００μｌの２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）の緩衝液を加え、さらに５００μｌのグリセリンを加えて、１ｍｌに定容した。精製プロセスの各ステップで得た酵素活性とタンパク質含有量は下表に示される。
実施例５：ＳＤｈｅｐ IIの性質研究
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して、図１に示される結果から明らかなように、ＳＤｈｅｐ IIの分子量は約９４７００Ｄａであり、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ質量スペクトルで測定して分析した結果、その正確な分子量は９４７１６Ｄａであった。
等電点電気泳動で測定した結果、ＳＤｈｅｐ IIの等電点は５．７６であった。
異なる基質濃度で各条件下での酵素反応の初期速度を測定して、ミカエリス定数を求める。測定した結果、ＨＥＰとＨＳを基質とする場合、ＳＤｈｅｐ IIのミカエリス定数はそれぞれ０．００５２と１．６６１８であった。
ヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IIについては、それぞれＨＥＰとＨＳを基質として、基質のｐＨを５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０の九つの勾配に設定し、上記基質での酵素活性を測定した結果から明らかなように、ＨＥＰを基質とする場合は、活性を示すｐＨ範囲は６．５〜９．０、最も好ましくは８．０であり、ＨＳを基質とする場合は、活性を示すｐＨ範囲は６．５〜９．０、最も好ましくは８．０であった。
ヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IIについては、それぞれＨＥＰとＨＳを基質として、基質温度を２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９℃の複数の勾配に設定して、上記基質での酵素活性を測定した結果から明らかなように、ＨＥＰを基質とする場合、最も好ましい温度は４７℃であり、ＨＳを基質とする場合、最も好ましい温度は４３℃であった。
金属イオンの種類によるＳＤｈｅｐ IIへの影響：それぞれ２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を緩衝液として、基質ＨＥＰとＨＳにそれぞれ１０ｍＭのＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｎａ＋、 Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ２＋等の金属イオンを添加することによる酵素への影響を観察し、金属イオンを添加しないものを空白対照群として、得られた結果から明らかなように、金属イオンを添加する場合は、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｍｎ２＋及びＣａ２＋のいずれも酵素活性促進作用を示し、その中、Ｃａ２＋の促進作用は最も強く、酵素活性が大幅に向上し、それに次いで、Ｍｇ２＋とＮａ＋も顕著な促進作用を有するが、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋及びＦｅ３＋は酵素活性阻害作用を有し、酵素を不活性化させる。
金属イオン濃度によるＳＤｈｅｐ IIへの影響：０、１、１０、５０、１００、５００及び１０００ｍＭの濃度を有する酵素促進作用のあるＭｇ２＋、Ｎａ＋及びＣａ２＋によるヘパリナーゼ活性への影響を観察し、結果から明らかなように、ＨＥＰとＨＳを基質とする場合は、１００ｍＭのＭｇ２＋はＳＤｈｅｐ IIに対する活性促進作用が最も強い。ＨＥＰとＨＳを基質とする場合は、１００ｍＭと５０ｍＭのＮａ＋はＳＤｈｅｐ IIに対する活性促進作用が最も強い。１００ｍＭと５０ｍＭのＣａ２＋はＳＤｈｅｐ IIに対する活性促進作用が最も強い。
変性剤によるＳＤｈｅｐ IIへの影響：それぞれＨ２Ｏ２、アセトニトリル、ＳＤＳ、塩酸グアニジン及び尿素を変性剤として、それぞれの濃度について、１ｍＭと１０ｍＭのＨ２Ｏ２、１％と１０％のアセトニトリル、１％のＳＤＳ、１Ｍの塩酸グアニジン及び１Ｍの尿素として設定し、且つ変性剤を添加しない空白対照群を設置することによって変性剤によるヘパリナーゼＳＤｈｅｐ IIの活性への影響を観察した。上記変性剤が存在する条件において、１％と１０％のアセトニトリル、１Ｍの尿素はＳＤｈｅｐ II酵素への影響が小さく、１ｍＭと１０ｍＭのＨ２Ｏ２、１％のＳＤＳ、１Ｍの塩酸グアニジンはＳＤｈｅｐ IIに対して顕著な阻害作用を有する。
実施例６：ＳＤｈｅｐ IIでＨＥＰを酵素分解して得た産物の特異性研究
ａ）ＳＤｈｅｐ II基質の特異性研究：それぞれヘパリン（ＨＥＰ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳ）を基質として、ＳＤｈｅｐ Iの活性を測定したところ、ＳＤｈｅｐ I酵素はＣＳとＤＳを基質とする時に酵素活性がなく、ＨＥＰとＨＳを基質とする時に酵素活性があり、且つ活性比が約ＨＥＰ：ＨＳ＝１：３．５であることを見出した。
ｂ）ＳＤｈｅｐ IIでＨＥＰを酵素分解して得た二糖の分析：５０ｍｇのヘパリンに３ＩＵ（ヘパリンを基質とする時の酵素活性）のＳＤｈｅｐ IIを加えて、緩衝液２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１０ｍＭＣａＣｌ２含有、ｐＨ７．０）で５００μＬになるまで定容し、３７℃の条件において２４ｈ酵素分解し、次に１００℃の水浴に投入して、５ｍｉｎ不活性化させ、サンプルについて二糖成分の液相分析を行い、図３に示される結果から明らかなように、ＳＤｈｅｐ IIでＨＥＰを酵素分解した後、産物の主成分はＩＩＳとＩＳであり、その中、ＩＳのピーク面積は５６．３９％を占め、酵素分解産物の種類が少なく、酵素分解が十分であり、ＳＤｈｅｐ IでＨＥＰを酵素分解して得た産物とは異なる。従って、ＳＤｈｅｐ IとＳＤｈｅｐ IIは酵素分解特性が完全に異なるヘパリナーゼであり、ヘパリンの品質検査及び低分子ヘパリンの調製等の分野において応用価値が期待できる。
Claims (13)
- Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ細菌から得られ、分子量が７４６９２Ｄａであり、等電点が５．６４であるＳＤｈｅｐ Ｉであるヘパリナーゼ。
- Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ細菌から得られ、分子量が９４７１６Ｄａであり、等電点が５．７６であるＳＤｈｅｐ ＩＩであるヘパリナーゼ。
- 前記ＳＤｈｅｐ ＩであるヘパリナーゼのＨＳに対するミカエリス定数が０．０４１８であり、前記ＳＤｈｅｐ ＩであるヘパリナーゼのＨＥＰに対するミカエリス定数が０．５７３８である、請求項１に記載のＳＤｈｅｐ Ｉであるヘパリナーゼ。
- 前記ＳＤｈｅｐ ＩＩであるヘパリナーゼのＨＳに対するミカエリス定数が１．６６１８であり、前記ＳＤｈｅｐ ＩＩであるヘパリナーゼのＨＥＰに対するミカエリス定数が０．００５２である、請求項２に記載のＳＤｈｅｐ ＩＩであるヘパリナーゼ。
- ヘパリン、低分子ヘパリン、超低分子ヘパリンの品質検査に用いられる請求項１に記載のＳＤｈｅｐ Ｉであるヘパリナーゼ又は請求項２に記載のＳＤｈｅｐ ＩＩであるヘパリナーゼ。
- 低分子ヘパリン又は超低分子ヘパリンの生産調製に用いられる請求項１に記載のＳＤｈｅｐ Ｉであるヘパリナーゼ又は請求項２に記載のＳＤｈｅｐ ＩＩであるヘパリナーゼ。
- 請求項１に記載のＳＤｈｅｐ Ｉであるヘパリナーゼ又は請求項２に記載のＳＤｈｅｐ ＩＩであるヘパリナーゼを含む組成物。
- Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋のうちのいずれか１種を含む、請求項７に記載の組成物。
- Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅ細菌から請求項１に記載のＳＤｈｅｐ Ｉであるヘパリナーゼ及び請求項２に記載のＳＤｈｅｐ ＩＩであるヘパリナーゼのうち少なくとも一方を得る方法であって、
（１）菌種Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｅｊｅｏｎｅｎｓｅを斜面培地に接種するステップと、
（２）ステップ（１）の前記菌種をシード培地に接種して、１〜２日間培養後、二段液体シード培地に接種して、１〜２日間培養し、さらに発酵培地に接種して、１〜５日間培養した後、細胞を収集するステップと、
（３）ステップ（２）で得た前記細胞を懸濁して、前記細胞を破砕して、遠心分離して上澄みを収集し、氷浴条件において硫酸アンモニウム沈殿を行い、飽和率３５％〜８５％の沈殿成分を収集して、沈殿をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解して、透析して粗酵素液を得るステップと、を含み、
前記ヘパリナーゼがＳＤｈｅｐ Ｉである場合はさらにステップ（４）及びステップ（５）を行うことを含み、前記ヘパリナーゼがＳＤｈｅｐ Ｉ Ｉ である場合はさらにステップ（６）及びステップ（７）を行うことを含み、前記ヘパリナーゼがＳＤｈｅｐ Ｉ及びＳＤｈｅｐ Ｉ Ｉ の両方である場合はさらにステップ（４）、ステップ（５）、ステップ（６）及びステップ（７）を行うことを含む、前記方法：
（４）ステップ（３）で得た前記粗酵素液をＱカラムに注入して溶出し、注入した流出液及び平衡化液からヘパリナーゼ活性を有する画分を収集して、Ｑカラムと結合しないヘパリナーゼであるＳＤｈｅｐ Ｉを含む酵素液を得るステップ；
（５）ステップ（４）で得た前記酵素液をＣＳカラムに注入して溶出し、溶出液を透析してヘパリナーゼ活性を有する画分を収集し、ＳＰカラムに注入して溶出し、ヘパリナーゼ活性を有する画分を収集し、濃縮して、得られた酵素液をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００カラムに注入して溶出して、ヘパリナーゼ活性を有する画分を収集し、混合して濃縮させ、精製したＳＤｈｅｐ Ｉを得るステップ；
（６）ステップ（３）で得た前記粗酵素液をＱカラムに注入して溶出し、溶出液におけるヘパリナーゼ活性を有する画分を混合し透析して、Ｑカラムと結合するヘパリナーゼであるＳＤｈｅｐ Ｉ Ｉ を含む酵素液を得るステップ；
（７）ステップ（６）で得た前記粗酵素液をＣＳカラムに注入して溶出し、溶出液中のヘパリナーゼ活性を有する画分を収集して混合し、透析して、得られた酵素液をＱカラムに注入して溶出し、ヘパリナーゼ活性を有する画分を収集して、ＣＳカラムに注入して溶出し、ヘパリナーゼ活性を有する画分を収集して混合し、濃縮させて、精製したＳＤｈｅｐ Ｉ Ｉ を得るステップ。 - 前記Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液はＣａＣｌ２を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液であり、ｐＨが６．５〜８．０、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの濃度が１０〜５０ｍＭ、ＣａＣｌ２の含有量が１〜５０ｍＭである、請求項９に記載の方法。
- 前記ＱカラムはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ強アニオン交換カラムである、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
- 前記ＣＳカラムはＣｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅ親和性カラムである、請求項９〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＳＰカラムはＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ強カチオン交換カラムである、請求項９〜請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
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