CN108239629A - 来自食神鞘氨醇杆菌的肝素酶及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从食神鞘氨醇杆菌（Sphingo. spiritivorum）细菌中得到的新型肝素酶SShepI、SShepII，这两种酶均为未经过报道的新型肝素酶。酶的获得是通过将Sphingo. spiritivorum细菌发酵培养、粗酶提取、多步柱层析纯化等步骤最终得到。性质研究表明这两种酶在酶解肝素方面具有特异性，有望用于低分子肝素制备或肝素类质量检测研究。
Description
技术领域
本发明涉及未经报道过的新型肝素酶，具体而言是涉及来源于Sphingo.spiritivorum细菌，经过细菌发酵、细胞破碎、多步柱层析分离技术制备出来的新型肝素酶SShepI、SShepII，以及这两种酶的制备方法和应用。
背景技术
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，其应用十分广泛，如：清除血液中残存肝素、制备低分子肝素、用于肝素结构的研究和质量检测等。肝素酶最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后又陆续在一些微生物和动物组织中也发现了肝素酶的存在。目前有学术论文报道的肝素酶有20多种，例如Yang V.C.从肝素黄杆菌中发现肝素酶I、II、III；Robert W. Bellamy等人从杆菌属BH100 (FERM BP-2613) 细菌中发现的产生于胞外的肝素酶，Wan-Seok Kim等人从粪便拟杆菌HJ-15中发现一种肝素裂解酶[Carbohydrate Research,2012,359:37-43]；课题组前期从Sphingobacteriumdaejeonense细菌中得到的新型肝素酶SDhepI和SDhepII [专利号201410839278.8]，以及从脑膜脓毒性金黄杆菌 (Chryseobacterium meningosepticum) 细菌中得到新型肝素酶CMhepI [专利号201510040524.8]，上述酶均为不同的肝素酶。
从自然界中得到的不同的产肝素酶微生物，所产肝素酶也多种多样，用于酶解肝素得到的产物也各不相同，目前研究和应用最广泛的是来自肝素黄杆菌的肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III，他们分别是分子量大约为43、78、66kDa的单体蛋白质，等电点均在9.0左右。肝素酶的发现为肝素结构研究和质量检测起了重要的推动作用，其中产自肝素黄杆菌的酶I、II、III已经用于肝素类质量检测和低分子肝素生产。
随着对低分子肝素的研究不断深入，人们发现，低分子肝素除了具有抗凝活性外，还对肿瘤、炎症、产科妊娠等疾病具有广泛作用，针对低分子肝素的不同药理活性进行新药开发具有广阔的前景。但肝素的结构高度复杂，具有某种药理作用的活性位点在整个混合物中较少，而且容易受其它近似结构干扰，由此对药物开发带来干扰。而肝素酶对肝素的酶切位点比较专一，由此可分离得到较大量结构相同的片段，有利于药物开发。因此，寻找裂解位点独特的新型肝素酶，具有重要意义。
本发明所阐述的肝素酶为未经报道过的新型肝素酶，其性质不同于目前已知肝素酶，酶解肝素可得到特异性的低分子肝素产物，显示酶裂解肝素具有一定特殊性，有望用于新型低分子肝素的制备以及肝素和低分子肝素的质量检测。
发明内容
本发明给出了从细菌Sphingo. spiritivorum中纯化出的两种新型胞内肝素酶SShepI、SShepII，SShepI的分子量为71 kD，SShepII的分子量为92 kD。
本发明包括以下：
1. 菌种来源：从中国四川省成都杜甫草堂遗址附近地表以下10~15cm处土壤中分离得到一菌株，编号CDF1-2，发酵后产肝素酶量大约为80 IU/L。经广东省微生物分析检测中心鉴定，为革兰氏阴性、短杆菌，通过16S rDNA与已知菌株进行基因序列比对，确定其属于食神鞘氨醇杆菌 (Sphingo. Spiritivorum)。发酵培养该菌可产肝素酶两种，分别命名为SShepI、SShepII。
2. 肝素酶的制备：
(1) 菌的发酵及粗酶液制备：
将菌体从平板或斜面上刮取两环接种到种子培养基中，培养1~2天后，按5~20%接种量接入二级液体种子培养基中，培养1~2天，再按5~20%接种量接入2 L发酵培养基中，培养1~5天。收集菌液，3800 rpm，4℃离心20 min~1 h，收集沉淀，悬浮在Tris-HCl缓冲液中，用高压均质机4℃、800 bar，破碎1~5个循环，12000 rpm离心30 min，收取上清，冰浴条件下做硫酸铵沉淀，收取硫酸铵饱和度60%~80%的沉淀。将沉淀溶解于100 mL的Tris-HCl缓冲液中，于相同的缓冲液中透析过夜。
(2) 酶的粗分离：
将硫酸铵沉淀后的酶上样于SP Sepharose Fast Flow层析柱，用200 mL 前述Tris-HCl缓冲液平衡，再用同样缓冲液中0~0.3 M NaCl (各100 mL) 梯度洗脱。在上样液和洗脱液中均分布有肝素酶活性的组分，分开收集。
(3) SShepI酶的纯化：
将上述与SP柱结合后被洗脱下来的有酶活性的组分，用2 L前述Tris-HCl缓冲液8-10℃过夜透析，然后上样CS (Cellufine Sulfate) 柱。用200 mL 0.1 M NaCl (溶于同样缓冲液) 平衡，再用同样缓冲液中0.1~1 M NaCl (各100ml) 梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分。
将上述CS柱后收集到的有酶活性的组分，用2 L前述Tris-HCl缓冲液8~10℃过夜透析，然后再次上样SP柱，用200 mL 0.09 M NaCl (溶于同样缓冲液) 平衡，再用500 mL0.105 M NaCl等度洗脱，收集有酶活性组分的洗脱液。
将再次过SP柱后收集到的有酶活性的组分，用等体积的前述Tris-HCl缓冲液混合稀释，然后再上CS柱。用200 mL 0.1 M NaCl (溶于同样缓冲液) 平衡，再用同样缓冲液中0.1~1M NaCl (各100 mL) 梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，得到纯的肝素酶，定名SShepI。
(4) SShepII酶的纯化：
将前述SP柱上样流出液有酶活性的组分上样于Q Sepharose Fast Flow层析柱，用200mL 前述Tris-HCl缓冲液平衡，再用同样缓冲液中0~0.5 M NaCl (各100 mL) 梯度洗脱，收集有酶活性组分。
将Q柱后收集到的活性组分，用2 L前述Tris-HCl缓冲液8~10℃过夜透析，然后过CS柱。用200 mL的0.1 M NaCl (溶于同样缓冲液) 平衡，然后用同样缓冲液中0.1~0.6 MNaCl (各100 mL) 梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，得到纯的肝素酶，定名SShepII。
过程中肝素酶酶活性测定参考专利“一种肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法”(专利申请号201110241260.4)。蛋白质含量测定及酶纯度测定方法参考文献[Carbohydrate Research,2012,359:37-43]。
步骤(1)所述的种子培养基组成参考专利“一种肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法”(专利申请号201110241260.4)。
步骤(1)中所述的发酵培养基组成(g/L)为：胰蛋白胨 2，肝素 8， NaCl 5， (NH4)2SO4 1，KH2PO4 2.5，MgSO4·7H2O 0.5，pH7.0。
步骤(1)、(2)、(3)、(4)中所述的Tris-HCl缓冲液为含CaCl2的Tris-HCl，pH6.5~8.0，Tris-HCl优选的浓度为10~50 mM，最优选的浓度为25 mM；CaCl2的含量优选1~50 mM，优选10~20 mM，最优选10 mM；优选的pH范围为7.0~7.5，最优选7.0。
3. 肝素酶的性质
(1) 本发明所涉及的肝素酶SShepI、SShepII分别用SDS-PAGE测定分子量约为71 kDa、92 kDa。
(2) 肝素酶降解肝素试验。
酶解过程：将1 g肝素用20 mL 50 mM Tris-HCl (含10 mM CaCl2，pH7.4) 缓冲液溶解后加入4 IU纯化后的SShepI或SShepII酶，45℃水浴酶解48 h，水浴100℃煮沸使酶灭活后离心得上清，上清加入氯化钠至终浓度为2.5%，加入1.4倍乙醇 (w/w)，8~10℃静置24h后离心，烘干沉淀。分别得到产物0.71 g (SShepI酶解) 和0.45 g (SShepII酶解)。
分析了酶解产物的分子量分布、抗FXa效价和抗FIIa效价。分子量分布见说明书附图2，从左到右依次为1、2、3，其中1为未降解的肝素，2为SShepI酶解肝素产物，3为SShepII酶解肝素产物。从分子量分布可以看出，两种酶降解肝素均可得到低分子肝素，其中前者的分子量主要分布在2000~8000 Da，后者分布在600~4000 Da。经测定效价，SShepI酶解肝素产物抗FXa效价为126 IU/mg，抗FIIa效价为29 IU/mg；SShepII酶解肝素产物抗FXa效价为135 IU/mg，抗FIIa效价为8 IU/mg。
本发明提供了两种来源于食神鞘氨醇杆菌 (Sphingo. Spiritivorum) 的肝素酶，通过细菌发酵、细胞破碎、硫酸铵沉淀和多步柱层析分离纯化而来。所述肝素酶SShepI、SShepII的分子量不同于目前已知的其它肝素酶。
用得到的新肝素酶试制低分子肝素，显示SShepI酶解产物的分子量分布在2000~8000 Da，抗FXa效价126 IU/mg，抗FIIa效价29 IU/mg；SShepII酶解产物的分子量分布在600~4000 Da，抗FXa效价为135 IU/mg，抗FIIa效价为8 IU/mg。这两种新型酶制低分子肝素与目前已有的药品低分子肝素如依诺肝素、达肝素、亭扎肝素等性能都有所区别，有望开发成抗凝血效果更好，或具有新临床功能的低分子肝素药物。降解产物的特殊性，显示这二种肝素酶裂解位点的特殊性，由此可通过使用该二种肝素酶裂解肝素或低分子肝素并测定产物组成以判断肝素或低分子肝素质量水平。
附图说明
图1是：SShepI (左)和SShepII (右)SDS-PAGE电泳图。
图2是：新型肝素酶降解肝素分子量分布图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：肝素酶的制备和纯化
将菌体从平板或斜面上刮取两环接种到种子培养基中，培养24 h后，按15%接种量接入二级液体种子培养基中，培养24 h，再按20%接种量接入2 L发酵培养基中，培养24 h。收集菌液，3800 rpm、4℃离心45 min，将沉淀悬浮在25 mM Tris-HCl缓冲液 (含10 mM CaCl2，pH7.0) 中，用高压均质机4℃、800 bar，破碎3~4个循环，并离心30 min (12000 rpm，4℃)，得粗酶液。
将粗酶液在冰浴条件下做硫酸铵沉淀，收取硫酸铵饱和度60%~80%的沉淀并溶解于100 mL的前述Tris-HCl缓冲液中，用4 L同样缓冲液8~10℃过夜透析。
将硫酸铵沉淀后的酶上样于SP Sepharose Fast Flow层析柱，用200 mL 前述Tris-HCl缓冲液平衡，再用同样缓冲液中0~0.3 M NaCl (各100 mL) 梯度洗脱。在上样液和洗脱液中均分布有肝素酶活性的组分，分开收集。
将上述与SP柱结合后被洗脱下来的有酶活性的组分，用2 L前述Tris-HCl缓冲液8~10℃过夜透析，然后上CS (Cellufine Sulfate) 柱。用200 mL 0.1 M NaCl (溶于同样缓冲液) 平衡，再用同样缓冲液中0.1~1 M NaCl (各100 mL) 梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分。
将上述CS柱后收集到的有酶活性的组分，用2 L前述Tris-HCl缓冲液8~10℃过夜透析，然后再次上SP柱，用200 mL 0.09 M NaCl (溶于同样缓冲液) 平衡，再用500 mL0.105 M NaCl等度洗脱，收集有酶活性组分的洗脱液。
将再次过SP柱后收集到的有酶活性的组分，用等体积的前述Tris-HCl缓冲液混合稀释，然后再上CS柱。用200 mL 0.1 M NaCl (溶于同样缓冲液) 平衡，再用同样缓冲液中0.1~1 M NaCl (各100 mL) 梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，得到纯的肝素酶，定名SShepI。
将前述SP柱上样流出液有酶活性的组分上样于Q Sepharose Fast Flow层析柱，用200 mL 前述Tris-HCl缓冲液平衡，再用同样缓冲液中0~0.5 M NaCl (各100 mL)梯度洗脱，收集有酶活性组分。
将Q柱后收集到的活性组分，用2 L前述Tris-HCl缓冲液8~10℃过夜透析，然后过CS柱。用200 mL的0.1 M NaCl (溶于同样缓冲液)平衡，然后用同样缓冲液中0.1~0.6 MNaCl (各100 mL)梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，得到纯的肝素酶，定名SShepII。
上述步骤中每一步完成后所得酶活、蛋白含量、(比活) 纯化倍数、(总活力) 产率分别如下表所示：
表1：SShepI酶纯化表
表2：SShepII酶纯化表
实施例2：肝素酶分子量测定
纯化后得到了比较纯的酶蛋白，SShepI和SShepII分子量分别约为71 kD和92 kD。
如图1 (说明书附图1) 所示为纯化肝素酶的SDS-PAGE分析图。
实施例3：肝素酶降解肝素试验
酶解过程：将1 g肝素用20 mL 50 mM Tris-HCl (含10 mM CaCl2，pH7.4) 缓冲液溶解后加入4 IU纯化后的SShepI或SShepII酶，45℃水浴酶解48 h，水浴100℃煮沸使酶灭活后离心得上清，上清加入氯化钠至终浓度为2.5%，加入1.4倍乙醇 (w/w)，8~10℃静置24 h后离心，烘干沉淀。分别得到产物0.71 g (SShepI酶解) 和0.45 g (SShepII酶解)。
分析酶解产物的分子量分布、抗FXa效价和抗FIIa效价：
如图2 (说明书附图2) 所示为酶解肝素产物的分子量分布图，从左到右依次为1、2、3，其中1为未降解的肝素，2为SShepI酶解肝素产物，3为SShepII酶解肝素产物。
从分子量分布可以看出，两种酶降解肝素均可得到低分子肝素，其中前者的分子量主要分布在2000~8000 Da，后者分布在600~4000 Da。
经测定效价，SShepI酶解肝素产物抗FXa效价为126 IU/mg，抗FIIa效价为29 IU/mg；SShepII酶解肝素产物抗FXa效价为135 IU/mg，抗FIIa效价为8 IU/mg。
Claims (4)
1.从Sphingo. spiritivorum细菌中得到新型肝素酶SShepI、SShepII，所述肝素酶经SDS-PAGE检测分子量分别约为71 kD、92 kD。
2.Sphingo. spiritivorum细菌中得到新型肝素酶SShepI、SShepII的方法，包括以下步骤：
(1) 将Sphingo. spiritivorum菌株制备成斜面或其它保存用种子；
(2) 将步骤(1)所述的菌株接种到种子培养基中，培养1~2天后，接入二级液体种子培养基中，培养1~2天后，再接入发酵培养基中，培养1~5天，收集细胞，离心；
(3) 将步骤(2)得到的沉淀悬浮在Tris-HCl缓冲液中，低温下破碎细胞，离心取上清，冰浴经硫酸铵沉淀后收集饱和度60%~80%的沉淀组分，将沉淀溶解于Tris-HCl缓冲液中，透析；
(4) 酶的粗分离：
将硫酸铵沉淀后的酶用SP层析柱纯化，在上样液和洗脱液中均分布有肝素酶活性的组分，分别收集；
(5) SShepI酶的纯化：
将上述与SP柱结合后被洗脱下来的有酶活性组分上样于CS柱，平衡后以0.1~1 M NaCl(溶于Tris-HCl缓冲液) 线性梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，8~10 ℃过夜透析；之后，将活性组分上样于SP柱，平衡后用0.105 M NaCl (溶于Tris-HCl缓冲液) 等度洗脱，收集有酶活的洗脱液；最后，将收集到的活性组分稀释后上样于CS柱，平衡后以0.1~1 M NaCl(溶于Tris-HCl缓冲液) 线性梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，即为肝素酶 SShepI；
(6) SShepII酶的纯化：
将前述SP柱上样流出液有酶活性的组分上样于Q柱，平衡后在同样缓冲液中用0~0.5 MNaCl梯度洗脱，收集有酶活性组分， 8~10 ℃过夜透析；将活性组分上样于CS柱，平衡后在同样缓冲液中用0.1~0.6 M NaCl梯度洗脱，收集洗脱液中有活性的组分，得到纯的肝素酶SShepII；
步骤(3)、(4)、(5)、(6)中所述的Tris-HCl缓冲液为含CaCl2的Tris-HCl, pH 6.5-8.0,Tris-HCl优选的浓度为5-50 mM，最优选的浓度为20 mM；CaCl2的含量优选1~50 mM，最优选10 mM；优选的pH范围为7.0~7.5，更优选7.0；
步骤(4)中所述的SP柱为SP-Sepharose Fast Flow，也可为其它强阳离子交换柱；
步骤(5)、(6)中所述的CS柱为Cellufine Sulfate，也可为结合了肝素的CNBr-activated Sepharose CL-4B等可与肝素酶结合的亲和柱；
步骤(6)中所述的Q柱为Q-Sepharose Fast Flow，也可为Q-Sepharose Big Beads、Q-Sepharose XL、Q-Sepharose High Performance等强阴离子交换柱。
3.新型肝素酶SShepI、SShepII用于低分子肝素、超低分子肝素的生产制备。
4.新型肝素酶SShepI、SShepII用于肝素、低分子肝素、超低分子肝素的质量检测。
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