CN103342760B - 一种从微生物发酵液中制备透明质酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种从微生物发酵液中制备透明质酸的方法。该透明质酸的制备方法包括：（1）将产透明质酸的微生物细胞进行培养，调发酵液的pH，过滤；（2）配制聚乙二醇/苹果酸钠双水相萃取体系溶液；（3）利用双水相萃取体系进行透明质酸的分离和纯化，得到含有透明质酸的苹果酸钠溶液；（4）超滤膜过滤浓缩，截留液真空干燥，制得透明质酸产品。本发明的双水相体系对生物活性物质具有保护作用，易于生产放大，特别适合透明质酸的分离纯化；本发明可以实现透明质酸生产的连续化、规模化，并且透明质酸制备工艺简便，萃取剂可循环使用，透明质酸的收率高、纯度高，生产成本较低。
Description
（一） 技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种从微生物发酵液中制备透明质酸的方法。
（二） 背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)又名玻璃酸，是一种酸性多糖，存在于动物的组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。HA具有高保湿性、粘弹性和生物相容性等许多优良性质，在医学研究、临床治疗、化妆品行业和保健食品行业等领域具有广泛的应用。
透明质酸的生产方法有以动物组织为原料的提取法和微生物发酵法。从动物组织中提取HA常用的原料有鸡冠、脐带、眼玻璃体和猪皮等，生产工艺过程主要包括原料脱水、磨碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分级分离等。提取法由于原料有限，且原料中HA含量较低，因而生产成本较高，限制了它的应用。微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜而生产透明质酸的方法，与动物组织提取法相比，发酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、保湿性强、品质稳定、有较高的相对分子量、分离纯化工艺简便、易于大规模生产、且无动物来源致病病毒污染的危险等优点。目前微生物发酵法已经取代动物组织提取法成为生产HA的主要方法，随着HA市场需求的不断扩大，有效提高发酵法生产HA的产率和采用更为有效的分离纯化技术以降低其生产成本是至关重要的。
微生物发酵法制备透明质酸的生产过程包括微生物发酵、透明质酸分离和透明质酸纯化。HA的分离主要采用乙醇沉淀法从发酵液中得到HA粗品，由于得到的HA粗品中含有蛋白质等杂质，因此需要进一步纯化。HA的纯化主要采用季铵盐沉淀、乙醇沉淀、离子交换层析或凝胶层析等方法。
如赵亚玲（化学工程，2009年04期）在进行兽疫链球菌NW-162发酵产生透明质酸的分离纯化研究时，采用乙醇（乙醇与上清液的体积比为2.5∶1.0）沉淀分离透明质酸、链霉蛋白酶酶解结合氯仿除去蛋白质及经氯化十六烷基吡啶（CPC）分级分离工艺，得到纯度为71.5%、蛋白质质量分数为2.8%的透明质酸产品；如史鹏（西北大学硕士论文，2005）在进行发酵法生产透明质酸的下游提取工艺方法的研究时，先对发酵液稀释一倍，再过滤去除菌体，然后用过滤液2倍体积的乙醇沉淀得到HA粗品；HA粗品经阳离子树脂交换去除杂蛋白，再经乙醇沉淀，干燥得化妆品级的HA，HA得率约为70％，HA中的蛋白含量低于0.5％；如刘金龙（河北农业大学硕士论文，2007）在进行透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺研究时，采用乙醇沉淀、沉淀物溶解、过滤、CPC络合、HA-CPC解离、成品沉淀、脱水、真空冷冻干燥等，得到HA的收率在75％左右；如吴华昌（生物技术通报，2009年12期）在进行从发酵液中分离提纯透明质酸的应用研究时，采用葡聚糖凝胶G-100，以0.1 mol/L氯化钠溶液为洗脱剂，对透明质酸发酵液进行分离纯化，HA提取率达到79.85%，蛋白质去除率为84.93%。
如中国专利文献CN 101704905A（申请号200910093777.6）在从透明质酸发酵液中分离提取透明质酸时，采用乙醇沉淀（乙醇的用量为被处理液体积的2-4倍）；然后将乙醇沉淀物溶解，再经络合剂进行络合沉淀，沉淀物用盐解离，过滤，滤液再经乙醇沉淀，最后沉淀物经脱水、干燥得到合格的透明质酸产品，HA的收率在83.6～86.8％。如中国专利文献CN 101089021B（申请号200710043728.2）采用含有透明质酸的发酵液，通过氯代十六烷基吡啶进行络合或通过乙醇进行醇沉；收集络合物或醇沉物，加入氯化钠水溶液，使络合物或醇沉物解离或溶解；收集解离物或溶解物中的透明质酸沉淀，用水溶解、干燥、获得医用级HA，HA得率约为90%。
在上述方法中存在着以下问题：乙醇沉淀法是通过使用体积为发酵液2~3倍的乙醇（质量浓度为95%）实现HA的分离，该方法乙醇用量大，其回收利用采用蒸馏的方法，需要蒸馏设备，投资大、能耗高，对生产车间的安全性要求高，增大了生产成本；季铵盐沉淀法中CPC的价格较高，用量大且毒性也相对较大，回收利用困难，应用成本较高，并且络合沉淀物的解离时间较长而不利于大生产操作；凝胶层析法和离子交换法的生产周期长，工艺复杂，生产成本较高，并且HA的提取率也比较低。在透明质酸的生产过程中，分离纯化等工序的成本在整个生产成本构成中占有相当大的比例。因此，如何采用高效的分离技术以降低HA的生产成本是HA制备中需要解决的技术问题。
双水相萃取技术是近年来发展起来的生物分离技术，是分离纯化生物活性物质的有效方法。双水相系统是指两种不同种类的聚合物水溶液混合或者一种聚合物水溶液和一种盐溶液混合后，当两者浓度达到一定值时，混合液静置后分层产生的两液相体系。双水相体系萃取的原理是基于生物物质在体系中的选择性分配。双水相萃取具有操作条件温和、处理量大、分离步骤少、能耗低，无有机溶剂残留，易于工业化操作等优点。在生化分离工程中常用的双水相体系是聚合物/聚合物体系以及聚合物/无机盐体系，聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）体系以及聚乙二醇（PEG）/硫酸盐体系或聚乙二醇（PEG）/磷酸盐体系分别是这两种体系的典型代表。
目前双水相萃取技术已被应用于蛋白质、多糖等生物大分子物质的分离纯化。如吴疆（食品研究与开发，2011年07期）在利用双水相体系提取双孢菇多糖时，以PEG和硫酸铵形成双水相体系，当PEG6000浓度为16.5%、硫酸铵浓度为21.4%时，多糖收率可达51%～59.7%。也有关于采用有机溶剂（如乙醇）/无机盐体系进行双水相分离多糖的报道，如中国专利文献CN 101961427A（申请号201010289158.7）公开了一种油茶蒲多糖和多酚的提取方法，采用乙醇和无机盐（硫酸铵、磷酸氢二钾）形成双水相体系，油茶蒲多糖进入无机盐下相，无机盐下相采用超滤膜浓缩和冷冻干燥得到油茶蒲多糖产品，产品中多糖含量为46～53%。上述利用PEG/无机盐（硫酸铵）双水相体系或乙醇/无机盐（硫酸铵）双水相体系提取多糖时，多糖的收率并不高。因此，在利用双水相体系分离纯化透明质酸时，需要选择分离效率更高的双水相体系。
（三） 发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种工艺简单、产品收率高、生产成本低的从微生物发酵液中制备透明质酸的方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种从微生物发酵液中制备透明质酸的方法，以含有透明质酸的微生物发酵液为原料，包括如下步骤：
（1）调微生物发酵液的pH值为4.0-4.5，静置，过滤，收集滤出液，调滤出液的pH值为6.0-6.5，制得含有透明质酸的滤出液；
（2）在20-30℃下，配制苹果酸钠水溶液，并向苹果酸钠水溶液中添加聚乙二醇，在总体系中使苹果酸钠的质量百分比浓度为20-30wt%、聚乙二醇的质量百分比浓度为20-30wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液；
（3）向含有透明质酸的滤出液中按等体积加入聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液，搅拌均匀，静置分相，制得聚乙二醇上相溶液和含有透明质酸的苹果酸钠下相溶液；
（4）向苹果酸钠下相溶液中加入等体积去离子水，再加入聚乙二醇，使聚乙二醇在总体系中的质量浓度为10-15wt%，调节溶液的pH值为6.0-6.5，搅拌均匀，静置分相，制得聚乙二醇上相溶液和含有透明质酸的苹果酸钠下相溶液；
（5）将苹果酸钠下相溶液采用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，截留液经真空干燥后，制得透明质酸产品。
透明质酸是一种酸性多糖，具有极强的亲水性，且分子量一般在400 KDa以上。实验过程中，当利用PEG/无机盐（如硫酸铵）双水相体系或乙醇/无机盐（如硫酸铵）双水相体系分离提取透明质酸时，透明质酸的分配系数相对较低，其得率在80-83%之间，并且透明质酸产品中的蛋白质含量也相对较高。
经研究发现，在一定条件下，聚乙二醇和苹果酸钠两种试剂能够形成一种目前文献中尚未见报道的双水相体系。苹果酸钠又名苹果酸二钠，易溶于水，常用作缓冲剂、调味剂、代盐剂。苹果酸钠是一种有机酸钠盐，其持水性强，并对生物大分子有保护作用，当其与聚乙二醇形成双水相体系时，亲水性多糖更容易分配在下相溶液。当利用PEG/苹果酸钠双水相体系分离透明质酸时，透明质酸几乎全部溶入到下相溶液中，从而实现HA的提取以及与蛋白质的分离。
本发明的更优方案为：
步骤（1）中，调微生物发酵液pH值时采用的是质量百分浓度为10-20wt%的三氯乙酸。
步骤（1）中，调滤出液pH值时采用的是质量百分浓度为10-20wt%的氢氧化钠。
步骤（1）中，过滤时采用硅藻土过滤。
步骤（2）、（3）和（4）中，采用的聚乙二醇的分子量为4000。
步骤（3）和（4）中，搅拌时间均为10-20min，静置分相时间为30-60min。
步骤（5）中，超滤膜过滤时的工作压力为0.1-0.3MPa，膜的截留分子量为100KDa，操作温度为20-30℃。
聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系的相图制作步骤如下：在20-30℃下，取一定量的聚乙二醇（质量浓度为50wt%）于10mL试管中，逐渐滴加苹果酸钠（质量浓度为50wt%），搅拌混匀，直到出现浑浊，记录此时的重量，计算出聚乙二醇和苹果酸钠的百分含量即为临界点含量；向试管中加入一定量的去离子水，搅拌混匀，溶液变澄清，再次滴加苹果酸钠至出现浑浊，记录此时的重量，计算出聚乙二醇和苹果酸钠的百分含量即为本次的临界点含量；重复进行操作找出不同聚乙二醇浓度时的临界点，以各个临界点对应的聚乙二醇和苹果酸钠的百分含量绘制出双水相相图。
在上述聚乙二醇与苹果酸钠形成的双水相体系中，聚乙二醇的分子量为4000（PEG4000），聚乙二醇的成相质量百分比浓度为2～45wt%，苹果酸钠的成相质量百分比浓度为2～35wt%。
本发明的方法是利用双水相体系从微生物发酵液中制备透明质酸，从而达到降低生产成本、取得较好经济效果的目的。
本发明根据透明质酸的特性提供了一种聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系，该双水相体系对生物活性物质具有保护作用，易于生产放大，特别适合透明质酸的分离提取。
本发明的方法是通过第一次双水相萃取从发酵液中分离透明质酸，再通过第二次双水相萃取进行纯化，最后通过采用超滤膜过滤浓缩、干燥得到透明质酸产品，该方法可以实现透明质酸制备的连续化、规模化，便于其工业化生产。
本发明采用双水相萃取技术从微生物发酵液中分离透明质酸，相比于乙醇沉淀分离方法，具有设备投资少、能耗低、生产车间安全性高、萃取剂使用量少以及聚乙二醇回收工艺简单等优点。
本发明采用双水相萃取棘手纯化透明质酸，使透明质酸与蛋白质分别处于两厢中，可实现它们的分离，相比于季铵盐络合沉淀、乙醇沉淀或离子交换等纯化方法，具有生产周期短，操作简便等优点。
本发明的制备工艺简便，萃取剂可循环使用，透明质酸的收率高、纯度高，生产成本低，便于规模化生产。
（四） 附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为本发明的聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液的相图。
图中，纵坐标为聚乙二醇（分子量为4000）的质量百分比浓度，横坐标为苹果酸钠质量百分比浓度。
（五） 具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
本发明中透明质酸含量的测定采用Bitter-Muir氏咔唑法，步骤如下：
（1）测定原理
在沸水中透明质酸被浓硫酸分解成葡萄糖醛酸，在酸性条件下葡萄糖醛酸与咔唑发生显色反应，且颜色的深浅与葡萄糖醛酸的含量成正比关系，再由葡萄糖醛酸含量除以0.4643（葡萄糖醛酸在HA中的含量为46.43%），即可知样品中HA的含量。
（2）试剂配制
葡萄糖醛酸标准溶液：称取20mg的葡萄糖醛酸（AR），溶于100mL水中，摇匀。
硫酸硼砂溶液：称取四硼酸钠4.77g，溶于浓硫酸（AR）500mL中即得。
咔唑试液：称取咔唑0.125g，溶于无水乙醇（AR）100mL中，置于棕色瓶内冰箱保存。
（3）标准曲线的制作
分别吸取葡萄糖醛酸标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL置于10mL试管中，加水至稀释至刻度，得10、20、30、40和50μg/mL浓度的标准溶液，慢慢加入5mL硫酸硼砂溶液，摇匀，放入冰浴中冷却至4℃左右，在沸水浴中煮沸10min，取出后冷却至室温。然后在每根试管中加0.2mL的咔唑试液，摇匀，再在沸水浴中煮沸15min，冷却后用752型分光光度计（购自上海光学仪器一厂）在530nm波长处测定吸光度（A），以10mL蒸馏水按同样显色操作为空白对照。以葡萄糖醛酸浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，制作标准曲线。标准曲线方程为：A=0.0218C-0.0016，R2=0.998，其中：A为吸光度值，C为葡萄糖醛酸浓度（mg/mL），R2为相关系数。
（4）HA样品的测定
用蒸馏水将制得的HA配成浓度为0.1mg/mL的溶液，取lmL样品溶液按标准曲线的测定方法测定530nm波长处的吸光度值，由所测得吸收度值从标准曲线上查出对应的葡萄糖醛酸浓度。
葡萄糖醛酸含量=（标准曲线上查出浓度/样品液浓度）×100%
（5）HA质量的确定
透明质酸含量=葡萄糖醛酸含量÷46.43%
透明质酸质量=透明质酸含量×样品液体积
（6）透明质酸得率的确定
透明质酸得率（%）=(处理后的HA透明质酸质量÷处理前的透明质酸质量) ×100%
本发明中蛋白质的含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定。
原料来源：聚乙二醇购自美国陶氏化学公司，苹果酸钠购自上海谷研实业有限公司，三氯乙酸购自上海凌峰化学试剂有限公司，硅藻土购自吉林长白硅藻土有限责任公司，咔唑、考马斯亮蓝均购自上海技术开发经营公司，HA标准样品购自上海华壹生物科技有限公司，葡萄糖醛酸购自上海工硕生物技术有限公司。
实施例1：
本实施例所用菌种为兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920，该菌种购自美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）。
取产透明质酸的菌株兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC39920接种于装有100mL种子培养基的三角瓶中，37℃、200r/min摇床培养16h后，制得液体种子；然后按接种量10%（v/v）接种于1000mL的发酵培养基中，37℃、300r/min摇床培养48h。发酵过程中通过补加NaOH（5mol/L）控制发酵液pH值在6.5～7.0，制得含有透明质酸的发酵液。经检测透明质酸的产量达到5.2g/L。
种子培养基（g/L）：蛋白胨 10，牛肉膏 5，酵母膏 5，葡萄糖 5，K2HPO4 2，MgSO4 0.5，MnSO4 0.5，NaHCO3 0.5，pH值7.0。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖 50，蛋白胨 10，酵母膏 10，K2HPO4 2，MgSO4 0.5，pH值7.0。
一种利用双水相萃取体系制备透明质酸的方法，包括以下步骤：
（1）将含有透明质酸的发酵液1000mL，用质量浓度为15wt%的三氯乙酸调发酵液的pH为4.5，常温下静置1h，使菌体细胞沉淀，用硅藻土过滤除去菌体细胞，收集滤出液。用质量浓度为15wt%的的氢氧化钠调滤出液的pH为6.0，制得含有HA的滤出液。
（2）在25℃下，配制苹果酸钠水溶液1000mL，向苹果酸钠溶液中添加分子量为4000的聚乙二醇（PEG4000），使苹果酸钠在总体系中的质量百分比浓度为25wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为25wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液。
（3）向步骤（1）制得的含有HA的滤出液中按等体积加入步骤（2）制得的聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液，搅拌15min混匀后，静置60min分相，制得含有透明质酸的苹果酸钠下相溶液和聚乙二醇上相溶液。聚乙二醇上相溶液中含有蛋白质等物质，苹果酸钠下相溶液中含有透明质酸。对上相溶液采用截留分子量为5000Da的超滤膜过滤，除去蛋白质，收集聚乙二醇过滤液，聚乙二醇可循环使用。
（4）向步骤（3）制得的苹果酸钠下相溶液中加入等体积的去离子水，再加入PEG 4000，使聚乙二醇在总体系中的质量浓度为15wt%，调节溶液的pH值为6.0，搅拌10min混匀后，静置50min分相，制得含有透明质酸的苹果酸钠下相溶液和聚乙二醇上相溶液。聚乙二醇上相溶液中含有蛋白质等物质，苹果酸钠下相溶液中含有透明质酸。对上相溶液采用截留分子量为5000Da的超滤膜过滤，除去蛋白质，收集聚乙二醇过滤液，聚乙二醇可循环使用。
（5）将步骤（4）制得的苹果酸钠下相溶液，在0.15MPa压力下采用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤浓缩，除去苹果酸钠和残留的聚乙二醇，收集截留液，截留液在常温下真空干燥，制得透明质酸产品4.8g。
经检测透明质酸的得率为92.3%，透明质酸中蛋白质的含量为0.3%。
实施例2：
如实施例1所述的利用双水相萃取体系制备透明质酸的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，配制苹果酸钠水溶液1000mL，向该溶液中添加PEG4000，使苹果酸钠在总体系中的质量百分比浓度为20wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为30wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液。
经检测透明质酸的得率为91.4%，透明质酸中蛋白质的含量为0.4%。
实施例3：
如实施例1所述的利用双水相萃取体系制备透明质酸的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，配制苹果酸钠水溶液1000mL，向该溶液中添加聚乙二醇，使聚乙二醇在总体系中的质量浓度为20wt%，苹果酸钠在总体系中的质量浓度为30wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液。
经检测透明质酸的得率为90.8%，透明质酸中蛋白质的含量为0.5%。
实施例4：
如实施例1所述的利用双水相萃取体系制备透明质酸的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，配制苹果酸钠水溶液1000mL，向苹果酸钠溶液中添加聚乙二醇，使苹果酸钠在总体系中的质量百分比浓度为30wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为30wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液。
经检测透明质酸的得率为91.8%，透明质酸中蛋白质的含量为0.4%。
对比例1：
如实施例1所述的利用双水相萃取体系制备透明质酸的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，配制硫酸铵水溶液1000mL，向硫酸铵溶液中添加分子量为4000的聚乙二醇（PEG4000），使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为25wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为25wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/硫酸铵双水相体系溶液。
经检测透明质酸的得率为82.3%，透明质酸中蛋白质的含量为1.1%。
对比例2：
如实施例1所述的利用双水相萃取体系制备透明质酸的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，配制磷酸氢二钾水溶液1000mL，向磷酸氢二钾溶液中添加分子量为4000的聚乙二醇（PEG4000），使磷酸氢二钾在总体系中的质量百分比浓度为25wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为25wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/磷酸氢二钾双水相体系溶液。
经检测透明质酸的得率为82.1%，透明质酸中蛋白质的含量为1.2%。
对比例3：
一种利用双水相萃取体系制备透明质酸的方法，包括以下步骤：
（1）同实施例1的步骤（1）。
（2）配制硫酸铵水溶液1000mL，向该溶液中添加乙醇，使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为30wt%，乙醇在总体系中的质量百分比浓度为36wt%，混合均匀，制得乙醇/硫酸铵双水相体系溶液。
（3）向步骤（1）制得的含有HA的滤出液中按等体积加入步骤（2）制得的乙醇/硫酸铵双水相体系溶液，搅拌10min混匀后，静置60min分相，制得含有透明质酸的硫酸铵下相溶液和乙醇上相溶液。对上相溶液采用截留分子量为1000Da的超滤膜过滤，收集过滤液，过滤液经蒸馏得到乙醇，乙醇可循环使用。
（4）向步骤（3）制得的硫酸铵下相溶液中加入等体积的去离子水，再加入乙醇，使乙醇在总体系中的质量浓度为18wt%，调节溶液的pH值为6.0，搅拌15min混匀后，静置50min分相，制得含有透明质酸的硫酸铵下相溶液和乙醇上相溶液。对上相溶液采用截留分子量为1000Da的超滤膜过滤，收集过滤液，过滤液经蒸馏得到乙醇，乙醇可循环使用。
（5）将步骤（4）制得的硫酸铵下相溶液，在0.15MPa压力下采用截留分子量为100kDa的超滤膜过滤浓缩，除去硫酸铵和残留的乙醇，收集截留液，截留液在常温下真空干燥，制得透明质酸产品4.2g。
经检测透明质酸的得率为80.8%，透明质酸中蛋白质的含量为1.3%。
对比例4：
如对比例3所述的利用双水相萃取体系制备透明质酸的方法，不同之处在于：
步骤（2）中，配制苹果酸钠水溶液1000mL，向该溶液中添加乙醇，使苹果酸钠在总体系中的质量百分比浓度为30wt%，乙醇在总体系中的质量百分比浓度为36wt%，混合均匀，制得乙醇/苹果酸钠双水相体系溶液
经检测透明质酸的得率为82.7%，透明质酸中蛋白质的含量为1.0%。
在上述实施例和对比例中，当使用聚乙二醇/苹果酸钠双水相萃取体系分离纯化透明质酸时， HA的收得率比PEG/无机盐双水相体系、乙醇/无机盐双水相体系以及乙醇/苹果酸钠双水相体系都要高，并且透明质酸产品中蛋白质的含量也都低，实验证明聚乙二醇/苹果酸钠双水相萃取体系非常适合透明质酸的分离纯化。
Claims (6)
1.一种从微生物发酵液中制备透明质酸的方法，以含有透明质酸的微生物发酵液为原料，其特征为，包括如下步骤：
（1）调微生物发酵液的pH值为4.0-4.5，静置，过滤，收集滤出液，调滤出液的pH值为6.0-6.5，制得含有透明质酸的滤出液；
（2）在20-30℃下，配制苹果酸钠水溶液，并向苹果酸钠水溶液中添加聚乙二醇，在总体系中使苹果酸钠的质量百分比浓度为20-30wt%、聚乙二醇的质量百分比浓度为20-30wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液；
（3）向含有透明质酸的滤出液中按等体积加入聚乙二醇/苹果酸钠双水相体系溶液，搅拌均匀，静置分相，制得聚乙二醇上相溶液和含有透明质酸的苹果酸钠下相溶液；
（4）向苹果酸钠下相溶液中加入等体积去离子水，再加入聚乙二醇，使聚乙二醇在总体系中的质量浓度为10-15wt%，调节溶液的pH值为6.0-6.5，搅拌均匀，静置分相，制得聚乙二醇上相溶液和含有透明质酸的苹果酸钠下相溶液；
（5）将苹果酸钠下相溶液采用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，截留液经真空干燥后，制得透明质酸产品；
其中，步骤（2）、（3）和（4）中，采用的聚乙二醇的数均分子量为4000。
2.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中制备透明质酸的方法，其特征在于：步骤（1）中，调微生物发酵液pH值时采用的是质量百分浓度为10-20wt%的三氯乙酸。
3.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中制备透明质酸的方法，其特征在于：步骤（1）中，调滤出液pH值时采用的是质量百分浓度为10-20wt%的氢氧化钠。
4.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中制备透明质酸的方法，其特征在于：步骤（1）中，过滤时采用硅藻土过滤。
5.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中制备透明质酸的方法，其特征在于：步骤（3）和（4）中，搅拌时间均为10-20min，静置分相时间为30-60min。
6.根据权利要求1所述的从微生物发酵液中制备透明质酸的方法，其特征在于：步骤（5）中，超滤膜过滤时的工作压力为0.1-0.3MPa，膜的截留分子量为100KDa，操作温度为20-30℃。
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