CN103275941B

CN103275941B - 一种制备丙酮酸氧化酶的方法

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Publication number: CN103275941B
Application number: CN201310236929.XA
Authority: CN
Inventors: 董永胜
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2033-06-14
Also published as: CN103275941A

Abstract

本发明涉及一种制备丙酮酸氧化酶的方法，包括：（1）含丙酮酸氧化酶的微生物细胞培养、离心收集菌体细胞、细胞破碎；（2）配制聚乙二醇/无机盐双水相萃取体系溶液；（3）利用双水相萃取体系进行三次萃取分离，得到含有丙酮酸氧化酶的无机盐溶液；（4）超滤膜过滤浓缩，截留液冷冻干燥，制得丙酮酸氧化酶产品。本发明可以实现丙酮酸氧化酶制备的连续化、规模化，并且酶的制备工艺简便，生产周期短，操作条件温和，酶活力回收率高，丙酮酸氧化酶的生产成本较低。

Description

一种制备丙酮酸氧化酶的方法

技术领域

本发明涉及一种制备丙酮酸氧化酶的方法，特别涉及利用双水相萃取技术制备丙酮酸氧化酶的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

丙酮酸氧化酶（Pyruvate oxidase，EC1.2.3.3）是一种用途广泛的临床诊断用酶制剂，主要用于血液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的活力测定，此外，还用于丙酮酸激酶活性测定以及丙酮酸、无机磷酸、尿素等化合物的测定。

丙酮酸氧化酶的制备采用微生物发酵法，即通过培养具有高活性丙酮酸氧化酶的微生物细胞如植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、绿色气球菌（Aerococcus viridans）等获得，其制备过程包括微生物细胞的培养和酶的分离纯化。在丙酮酸氧化酶的生产成本构成中，分离纯化等下游工序的成本占有相当大的比例，因此，如何采用高效的分离技术是丙酮酸氧化酶生产中需要解决的技术问题。

目前，丙酮酸氧化酶的分离纯化方法主要采用盐析法、凝胶色谱法、离子交换法等，如陶家权（华东理工大学硕士论文，2007）在进行丙酮酸氧化酶研究时，对重组大肠杆菌中的丙酮酸氧化酶采用Ni-IDA亲和层析的纯化方法，得到的丙酮酸氧化酶的酶比活力为1.21U/mg、酶回收率为23.1％、纯化倍数为7.1；该研究还采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、UltrogelAcA34凝胶过滤三步纯化的方法，得到的丙酮酸氧化酶的酶比活力为1.1U/mg、酶回收率为29.8％、纯化倍数为10。中国专利文献CN101659943A（申请号200910092897.4）采用镍柱亲和层析、硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶G-25层析柱脱盐方法获得了丙酮酸氧化酶。上述方法存在工艺复杂、生产周期较长、酶活力回收率低、不能连续生产等问题，从而导致了丙酮酸氧化酶的生产成本较高。因此，改进现有生产技术以及开发新的生产技术以降低丙酮酸氧化酶的生产成本势在必行。

双水相萃取技术是近年来发展起来的生物分离技术，是分离纯化生物活性物质的有效方法。双水相系统是指两种不同种类的聚合物水溶液混合或者一种聚合物水溶液和一种盐溶液混合后，当两者浓度达到一定值时，混合液静置后分层产生的两液相系统。双水相系统萃取的原理是基于生物物质在体系中的选择性分配。双水相萃取具有操作条件温和、处理量大、分离步骤少、能耗低，无有机溶剂残留，易于工业化操作等优点。目前双水相萃取已被广泛地应用于生物工程技术领域进行生物转化、蛋白质（酶）及核酸等生物大分子的分离纯化等方面。

在生化分离工程中常用的双水相体系是聚合物/聚合物体系以及聚合物/无机盐体系，聚合物/聚合物体系如：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dex）体系。由于PEG/葡聚糖体系形成的下相中葡聚糖的黏度非常高，经常会产生凝胶状物质，使溶液的过程控制产生困难，限制了PEG/葡聚糖系统的应用。

除了聚合物/聚合物体系以及聚合物/无机盐体系之外，还有一些有机溶剂（如醇类）和无机盐也能形成双水相体系，该体系也可用于蛋白质（酶）的分离，如中国专利文献CN101693735A（申请号200910309154.8），公开了一种双水相萃取分离蛋白质和酶的方法，其特点在于将多元醇与无机盐按比例直接加入到蛋白质或酶溶液中，搅拌均匀，室温下静置，形成两相，蛋白质或酶主要分配到上相，且保留较高的活性，从而达到有效的分离提取目的。但由于多元醇的分子量较聚合物（如PEG）的分子量小很多，多元醇和无机盐在形成双水相体系时，两者在体系中需要至少有一种具有较高的浓度（相对于聚乙二醇/无机盐体系），多元醇作为一种有机溶剂，当其浓度较高时，酶在其溶液中活力会下降，且随着其浓度的增高，酶活性下降也增加；当无机盐浓度较高时，酶蛋白会因盐析作用而产生沉淀，从而导致酶活力回收率的下降。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种工艺简单、酶活力回收率高、生产成本低，便于规模化生产的丙酮酸氧化酶的制备方法。

本发明的方法是利用聚乙二醇/无机盐双水相萃取技术制备丙酮酸氧化酶，从而达到降低生产成本，取得较好经济效果的目的。

为实现上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：

一种利用双水相萃取体系制备丙酮酸氧化酶的方法，包括以下步骤：

（1）将含丙酮酸氧化酶的微生物细胞进行培养，得细胞培养液，离心，制得湿菌体细胞，将菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞悬浮液，破碎细胞，得到细胞破碎液；

（2）配制无机盐水溶液，向该无机盐水溶液中添加聚乙二醇，在总体系中无机盐的质量百分比浓度为10～20wt%、聚乙二醇的质量百分比浓度为20～30wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/无机盐双水相体系溶液；

（3）向步骤（1）制得的细胞破碎液中加入步骤（2）制得的聚乙二醇/无机盐双水相体系溶液，双水相体系溶液与细胞破碎液的体积比为1：（1～2），混合均匀，静置分相，制得无机盐下相溶液和含有丙酮酸氧化酶的聚乙二醇上相溶液；

（4）向步骤（3）制得的聚乙二醇上相溶液中加入无机盐，使无机盐在总体系中的质量浓度为6～10wt%，混合均匀，静置分相，制得二次分离的无机盐下相溶液和含有丙酮酸氧化酶的二次分离的聚乙二醇上相溶液；

（5）向步骤（4）制得的聚乙二醇上相溶液中加入无机盐，使无机盐在总体系中的质量浓度为5～6wt%，调节溶液的pH值为5.5～6.0，混合均匀，静置分相，制得含有丙酮酸氧化酶的无机盐下相溶液和聚乙二醇上相溶液；

（6）将步骤（5）制得的含有丙酮酸氧化酶的无机盐下相溶液，采用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得丙酮酸氧化酶。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的离心条件为：3000～5000r/min离心10～20min。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的细胞悬浮液中的细胞质量百分比浓度为25～35%。

根据本发明优选的，所述步骤（1）中的破碎细胞采用高压细胞破碎机，操作压力为50～60MPa，操作温度为5～15℃。

根据本发明优选的，所述步骤（2）、（3）、（4）、（5）、（6）中的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸钾或酒石酸钾钠之一；

根据本发明优选的，所述步骤（2）、（3）、（4）、（5）中的聚乙二醇分子量为1000、1500或2000之一；

根据本发明优选的，所述步骤（3）、（4）、（5）中的静置分相时间为10～60min。

根据本发明优选的，所述步骤（6）中的超滤膜工作压力为0.1～0.3MPa，膜的截留分子量为40000～50000Dal，操作温度为25℃。

根据本发明优选的，所述步骤（5）还包括将聚乙二醇上相溶液经回收用的超滤膜过滤浓缩后，参与配制步骤（2）中聚乙二醇/无机盐双水相体系溶液的步骤。

根据本发明进一步优选的，所述的回收用的超滤膜的截留分子量为2500Dal。

有益效果

1、本发明所述的制备方法可以实现丙酮酸氧化酶制备的连续化、规模化，便于其工业化生产。

2、本发明根据丙酮酸氧化酶的特点，采用聚乙二醇/无机盐双水相萃取技术制备丙酮酸氧化酶，该萃取体系形成的两相之间密度差小、粘度低，更适用于重力沉降分相，并且操作条件温和、酶活力回收率高、能耗低、易于自动控制。

3、本发明的制备方法工艺简便，生产周期短，易于工程放大，聚乙二醇可循环使用，极大地降低了丙酮酸氧化酶的生产成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体描述或作进一步说明，目的在于更好地理解本发明的方法，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

本发明中丙酮酸氧化酶的活力测定步骤如下：

（1）测定原理

丙酮酸氧化酶使样本中的内源性丙酮酸发生反应生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下生成水和氧，以消耗样本中的内源性丙酮酸，其催化下列反应：

由以上反应式可知，可以通过在550nm波长处测定醌亚胺染料的吸光度值来确定丙酮酸氧化酶的酶活。

（2）测定试剂

（A）反应混合液1：1mol/L的磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液（pH5.8）2.0mL，2mmol/L的黄素腺嘌呤二核苷酸0.1mL，3mmol/L的硫胺素焦磷酸酯0.2mL，15mmol/L的4-氨基安替比林溶液1.0mL，50U/mL的过氧化物酶溶液1.0mL，蒸馏水1.7mL。

（B）反应混合液2：0.2%的2,4-二氯苯酚2.0mL，0.15mol/L的硫酸镁溶液2.0mL。

（C）底物溶液：1.0mol/L的丙酮酸钾溶液。

（D）反应终止液：将3.72mg的EDTA二钠盐溶解于100mL的水中。

（E）酶稀释液：50mmol/L的磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液（pH5.8）。

（3）测定操作过程

（A）取0.6mL的反应混合液1、0.3mL的反应混合液2和0.1mL的底物溶液，充分混合，然后加热到37℃。

（B）用酶稀释液将丙酮酸氧化酶样品稀释至酶活力单位为0.1～0.2U/mL，然后取0.02mL的样品稀释液加入到步骤（A）形成的混合液中，混匀，在37℃下恒温10min。

（C）加入反应终止液2.0mL，在37℃下平衡5min。

（D）取0.1mL的上述酶溶液，在37℃恒温的分光光度计（岛津UV-2450分光光度计）中，于550nm下测定吸光度值（A₁）。

（E）用酶稀释液代替丙酮酸氧化酶样品按上述步骤操作，测定吸光度值（A₂）。

（F）计算ΔA值：ΔA=A₁-A₂。

（4）酶活力单位定义：在上述条件下，1分钟内消耗1μmol丙酮酸的酶量为1U。

（5）酶活计算公式：

酶活力（U/mg）＝（0.82×ΔA×D_f）÷C

其中：10为反应时间；Vt为总体积3.02mL；Vs为样品体积0.02mL；D_f为丙酮酸氧化酶样品的稀释倍数；1/2为反应中2mol H₂O₂产生1mol的醌亚胺染料物质；36.88为在测定条件下醌亚胺染料的摩尔吸光系数(cm²/μmol)；C为溶液中酶的浓度(mg/mL)。

依据上述丙酮酸氧化酶的酶活力测定方法可计算酶活力的回收率；细胞破碎液和无机盐下相溶液中的蛋白质的含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定；纯化倍数等于无机盐下相溶液中的比酶活力与细胞破碎液的比酶活力的比值。

原料来源：

聚乙二醇购自美国陶氏化学公司，丙酮酸氧化酶样品购自上海宝曼生物科技有限公司，丙酮酸购自上海谱振生物科技有限公司，过氧化物酶购自上海佳和生物科技有限公司。

实施例1

本实施例所用菌种为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCC8014，该菌种购自美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）。

取产丙酮酸氧化酶的菌种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCC8014接种于装有20mL种子培养基的三角瓶中，30℃静置培养24h后，制得液体种子；然后按接种量10%（V/V）接种于200mL的发酵培养基中，37℃、250r/min摇床培养18h，制得含有丙酮酸氧化酶的菌体细胞培养液。经检测产酶活力可达1562U/L。

种子培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，葡萄糖20，乙酸钠5，柠檬酸二铵2，吐温-801，K₂HPO₄2，MgSO₄1，MnSO₄0.5，pH值6.5。

发酵培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，葡萄糖20，乙酸钠3，柠檬酸二铵2，吐温-801，K₂HPO₄2，MgSO₄0.5，MnSO₄0.2，pH值6.5。

（1）将含丙酮酸氧化酶的植物乳杆菌细胞培养液1000mL在3000r/min条件下离心20min，制得湿菌体细胞，将菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量浓度为35wt%的悬浮液，冷却至10℃左右，采用德国APV公司生产的APV-2000-1型高压细胞破碎机进行三次细胞破碎，破碎机操作压力为60MPa，制得含有丙酮酸氧化酶的细胞破碎溶液198mL。

（2）配制硫酸铵水溶液200mL，向该溶液中添加分子量为1000的聚乙二醇（PEG1000），使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为15wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为25wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/硫酸铵双水相体系溶液。

（3）向步骤（1）制得的细胞破碎液中按等体积加入步骤（2）制得的聚乙二醇/硫酸铵双水相体系溶液，搅拌10min混匀后，静置50min分相，制得硫酸铵下相溶液118mL和聚乙二醇上相溶液278mL。

聚乙二醇上相溶液中含有丙酮酸氧化酶以及少部分的杂蛋白、多糖和核酸等物质，硫酸铵下相溶液中含有全部的细胞碎片以及大部分的杂蛋白、多糖和核酸等物质。经过第一次双水相萃取分离，经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到98.3%。

（4）向步骤（3）制得的聚乙二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在溶液中的质量浓度为10wt%，搅拌10min混匀后，静置40min分相，制得二次分离的硫酸铵下相溶液122mL和含有丙酮酸氧化酶的二次分离的聚乙二醇上相溶液156mL。

含有丙酮酸氧化酶的二次分离的聚乙二醇上相溶液中含有丙酮酸氧化酶以及微量的杂蛋白，二次分离的硫酸铵下相溶液中含有杂蛋白、多糖和核酸等物质。经过第二次双水相萃取分离，经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到96.7%。

（5）向步骤（4）制得的含有丙酮酸氧化酶的二次分离的聚乙二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在溶液中的质量浓度为6wt%，用盐酸调溶液的pH值为5.7，搅拌10min混匀后，静置30min分相，制得含有丙酮酸氧化酶的硫酸铵下相溶液55mL和聚乙二醇上相溶液101mL。

聚乙二醇上相溶液中含有聚乙二醇和杂蛋白，含有丙酮酸氧化酶的硫酸铵下相溶液中含有丙酮酸氧化酶和硫酸铵。对上相溶液采用截留分子量为2500Dal的超滤膜过滤，除去杂蛋白，收集聚乙二醇过滤液，聚乙二醇可循环使用。经过第三次双水相萃取分离，经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到94.4%。

（6）将步骤（5）制得的硫酸铵下相溶液，在0.15MPa压力下采用截留分子量为40000Dal的超滤膜过滤浓缩，除去硫酸铵和残留的聚乙二醇，收集截留液，截留液冷冻干燥，制得丙酮酸氧化酶428mg。

经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到93.2%，纯化倍数达到7.5左右。

实施例2

如实施例1所述的利用双水相萃取体系制备丙酮酸氧化酶的方法，不同之处在于：

步骤（2）中，配制硫酸钠水溶液200mL，向该溶液中添加分子量为1500的聚乙二醇（PEG1500），使硫酸钠在总体系中的质量百分比浓度为16wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为26wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/硫酸钠双水相体系溶液。

经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到92.1%，纯化倍数达到7.3左右。

实施例3

步骤（2）中，配制酒石酸钾钠水溶液200mL，向该溶液中添加分子量为1000的聚乙二醇（PEG1000），使酒石酸钾钠在总体系中的质量百分比浓度为20wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为20wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/酒石酸钾钠双水相体系溶液。

经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到90.6%，纯化倍数达到7.1左右。

实施例4

如实施例1所述的利用双水相萃取体系提取丙酮酸氧化酶的方法，不同之处在于：

步骤（2）中，配制磷酸钾水溶液200mL，向该溶液中添加分子量为1500的聚乙二醇（PEG1500），使磷酸钾在总体系中的质量百分比浓度为10wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为30wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/磷酸钾双水相体系溶液。

经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到91.2%，纯化倍数达到7.2左右。

实施例5

步骤（2）中，配制磷酸氢二钠水溶液200mL，向该溶液中添加分子量为1500的聚乙二醇（PEG1500），使磷酸氢二钠在总体系中的质量百分比浓度为20wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为20wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/磷酸氢二钠双水相体系溶液。

经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到90.5%，纯化倍数达到7.1左右。

实施例6

本实施例所用菌种为绿色气球菌（Aerococcus viridans）ATCC11563，该菌种购自美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）。

取产丙酮酸氧化酶的菌种绿色气球菌（Aerococcus viridans）ATCC11563接种于装有20mL种子培养基的三角瓶中，30℃、150r/min摇床培养24h后，制得液体种子；然后按接种量10%接种于200mL的发酵培养基中，30℃、250r/min摇床培养18h，制得含有丙酮酸氧化酶的菌体细胞培养液。经检测产酶活力可达1253U/L。

种子培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏5，蛋白胨5，NaCl5，KH₂PO₄2，MgSO₄1，MnSO₄1，pH值7.0。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl3，KH₂PO₄1，MgSO₄0.5，pH值6.5。

（1）将含丙酮酸氧化酶的绿色气球菌细胞培养液1000mL在5000r/min条件下离心10min，制得湿菌体细胞，将菌体细胞重悬于去离子水中，制得细胞质量浓度为30wt%的悬浮液，冷却至10℃左右，采用德国APV公司生产的APV-2000-1型高压细胞破碎机进行四次细胞破碎，破碎机操作压力为50MPa，制得含有丙酮酸氧化酶的细胞破碎溶液186mL。

（2）配制硫酸铵水溶液200mL，向该溶液中添加分子量为2000的聚乙二醇（PEG2000），使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为10wt%，聚乙二醇在总体系中的质量百分比浓度为30wt%，混合均匀，制得聚乙二醇/硫酸铵双水相体系溶液。

（3）向步骤（1）制得的细胞破碎液中按等体积加入步骤（2）制得的聚乙二醇/硫酸铵双水相体系溶液，搅拌10min混匀后，静置45min分相，制得硫酸铵下相溶液112mL和聚乙二醇上相溶液260mL。

聚乙二醇上相溶液中含有丙酮酸氧化酶以及少部分的杂蛋白、多糖和核酸等物质，硫酸铵下相溶液中含有全部的细胞碎片以及大部分的杂蛋白、多糖和核酸等物质。经过第一次双水相萃取分离，经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到98.1%。

（4）向步骤（3）制得的聚乙二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在总体系中的质量浓度为6wt%，搅拌10min混匀后，静置40min分相，制得二次分离的硫酸铵下相溶液114mL和含有丙酮酸氧化酶的二次分离的聚乙二醇上相溶液146mL。

含有丙酮酸氧化酶的二次分离的聚乙二醇上相溶液中含有丙酮酸氧化酶以及微量的杂蛋白，二次分离硫酸铵下相溶液中含有杂蛋白、多糖和核酸等物质。经过第二次双水相萃取分离，经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到96.5%。

（5）向步骤（4）制得的含有丙酮酸氧化酶的二次分离的聚乙二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在总体系中的质量浓度为5wt%，用盐酸调溶液的pH值为6.0，搅拌10min混匀后，静置30min分相，制得含有丙酮酸氧化酶的硫酸铵下相溶液51mL和聚乙二醇上相溶液95mL。

聚乙二醇上相溶液中含有聚乙二醇和杂蛋白，硫酸铵下相溶液中含有丙酮酸氧化酶和硫酸铵。对上相溶液采用截留分子量为2500Dal的超滤膜过滤，除去杂蛋白，收集聚乙二醇过滤液，聚乙二醇可循环使用。经过第三次双水相萃取分离，经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到94.2%。

（6）将步骤（5）制得的硫酸铵下相溶液，在0.2MPa压力下采用截留分子量为50000Dal的超滤膜过滤浓缩，除去硫酸铵和残留的聚乙二醇，收集截留液，截留液冷冻干燥，制得丙酮酸氧化酶356mg。

经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到92.8%，纯化倍数达到7.4左右。

实施例7

如实施例6所述的利用双水相萃取体系制备丙酮酸氧化酶的方法，不同之处在于：

步骤（3）中，向步骤（1）制得的细胞破碎液中加入步骤（2）制得的聚乙二醇/硫酸铵双水相体系溶液，双水相体系溶液与细胞破碎液的体积比为1：2，搅拌15min混匀后，静置25min分相，制得硫酸铵下相溶液84mL和聚乙二醇上相溶液195mL。

经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到90.1%，纯化倍数达到7.0左右。

对比例1

（1）同实施例1的步骤（1）。

（2）配制硫酸铵水溶液200mL，向该溶液中添加1,4-丁二醇，使硫酸铵在总体系中的质量百分比浓度为40wt%，1,4-丁二醇在总体系中的质量百分比浓度为56wt%，混合均匀，制得1,4-丁二醇/硫酸铵双水相体系溶液。

（3）向步骤（1）制得的细胞破碎液中按等体积加入步骤（2）制得的1,4-丁二醇/硫酸铵双水相体系溶液，搅拌10min混匀后，静置50min分相，制得硫酸铵下相溶液107mL和1,4-丁二醇上相溶液289mL，1,4-丁二醇上相溶液中含有丙酮酸氧化酶。经过第一次双水相萃取分离，经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到92.5%。

（4）向步骤（3）制得的1,4-丁二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在溶液中的质量浓度为20wt%，搅拌10min混匀后，静置40min分相，制得硫酸铵下相溶液123mL和1,4-丁二醇上相溶液166mL，1,4-丁二醇上相溶液中含有丙酮酸氧化酶。经过第二次双水相萃取分离，经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到85.6%。

（5）向步骤（4）制得的1,4-丁二醇上相溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵在溶液中的质量浓度为15wt%，用盐酸调溶液的pH值为5.7，搅拌10min混匀后，静置30min分相，制得硫酸铵下相溶液57mL和1,4-丁二醇上相溶液109mL。1,4-丁二醇上相溶液中含有1,4-丁二醇和杂蛋白，硫酸铵下相溶液中含有丙酮酸氧化酶和硫酸铵。经过第三次双水相萃取分离，经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到81.3%。

（6）将步骤（5）制得的硫酸铵下相溶液，在0.15MPa压力下采用截留分子量为40000Dal的超滤膜过滤浓缩，除去硫酸铵和残留的1,4-丁二醇，收集截留液，截留液冷冻干燥，制得丙酮酸氧化酶372mg。

经检测丙酮酸氧化酶的酶活力回收率达到80.1%，纯化倍数达到5.7左右。

在对比例1中，每次萃取过程中酶活力回收率与实施例1的差距都较大，到步骤（5）时酶活力回收率下降了13.1%。在实施例1和对比例1中，酶的三次萃取操作是相同的，区别是在对比例1中形成双水相的物质是1,4-丁二醇和硫酸铵。由于1,4-丁二醇的分子量（90.12）是实施例1的PEG的分子量（1000）的9%，其分子比PEG小许多，所以1,4-丁二醇和硫酸铵在形成双水相体系时，1,4-丁二醇和硫酸铵的浓度比PEG/硫酸铵体系的PEG和硫酸铵浓度高1倍以上。高浓度的硫酸铵使得溶液的离子浓度过强，酶蛋白会因盐析作用而产生沉淀，且高浓度的1,4-丁二醇也使酶活性下降；并且丙酮酸氧化酶是由四个亚基构成，当其处于较高浓度的1,4-丁二醇和硫酸铵溶液中时，亚基之间的结合会减弱，酶的活性中心也会受影响发生改变，从而也导致酶活力的下降。

此外，在实施例1中，聚乙二醇可以采用超滤膜过滤，过滤液浓缩后收集PEG，PEG可循环使用，而1,4-丁二醇因分子大小与水分子接近，难以采用成本较低的超滤膜浓缩分离，其使用成本相对较高。

因此，采用聚乙二醇/无机盐双水相体系制备丙酮酸氧化酶是一种酶活力回收率高、生产成本较低的工艺路线。

Claims

1.一种利用双水相萃取体系制备丙酮酸氧化酶的方法，包括以下步骤：

（3）向步骤（1）制得的细胞破碎液中加入步骤（2）制得的聚乙二醇/无机盐双水相体系溶液，双水相体系溶液与细胞破碎液的体积比为1：（1~2），混合均匀，静置分相，制得无机盐下相溶液和含有丙酮酸氧化酶的聚乙二醇上相溶液；

（5）向步骤（4）制得的聚乙二醇上相溶液中加入无机盐，使无机盐在总体系中的质量浓度为5～6wt%，调节溶液的pH值为5.5~6.0，混合均匀，静置分相，制得含有丙酮酸氧化酶的无机盐下相溶液和聚乙二醇上相溶液；

（6）将步骤（5）制得的含有丙酮酸氧化酶的无机盐下相溶液，采用超滤膜过滤浓缩，收集截留液，冷冻干燥，制得丙酮酸氧化酶；

所述步骤（2）、（3）、（4）、（5）、（6）中的无机盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸钾或酒石酸钾钠之一；

所述步骤（2）、（3）、（4）、（5）中的聚乙二醇分子量为1000、1500或2000之一。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的离心条件为：3000~5000r/min离心10~20min。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的细胞悬浮液中的细胞质量百分比浓度为25～35%。

4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的破碎细胞采用高压细胞破碎机，操作压力为50~60MPa，操作温度为5~15℃。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）、（4）、（5）中的静置分相时间为10～60min。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（6）中的超滤膜工作压力为0.1~0.3MPa，膜的截留分子量为40000～50000Dal，操作温度为25℃。

7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）还包括将聚乙二醇上相溶液经回收用的超滤膜过滤浓缩后，参与配制步骤（2）中聚乙二醇/无机盐双水相体系溶液的步骤。

8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的回收用的超滤膜的截留分子量为2500Dal。