JP6259209B2

JP6259209B2 - コラーゲン産生促進剤

Info

Publication number: JP6259209B2
Application number: JP2013126530A
Authority: JP
Inventors: 高野　義彦; 義彦高野; 晴彦加藤; 宏上野; 敏也小林
Original assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Current assignee: Megmilk Snow Brand Co Ltd
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2018-01-10
Anticipated expiration: 2033-06-17
Also published as: JP2015000862A; WO2014203885A1

Description

本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下、関節機能低下等を防止するのに有用なコラーゲン産生促進剤、コラーゲン産生促進用飲サプリメント、食品及びコラーゲン産生促進用化粧料に関する。さらに詳しくは、本発明は、リポカリンファミリータンパク質あるいはそのリポカリンファミリータンパク質を分解して得られるリポカリンファミリータンパク質分解物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤に関する。

近年、皮膚のメカニズムに関して、多くの研究が進められている。
皮膚の乾燥感や肌荒れの原因としてマクロ的には、加齢による新陳代謝の減衰によるものがある。その他、太陽光（紫外線）、乾燥、酸化等の作用が皮膚の乾燥肌や肌荒れの原因に、複雑に関与していることが確認されてきた。これらの因子による作用によって、真皮の最も主要なマトリックス成分であるコラーゲン繊維が顕著に減少することが明らかとなってきた。コラーゲン繊維によって保たれていた皮膚のハリや弾力性といった張力保持機構が、コラーゲン繊維が減少する事により破壊され、皮膚はシワやたるみを増した状態になる。また、コラーゲンは水分を保持する機能を有しており、皮膚をしっとりとした状態に保つことにも役立っている。外的因子により、コラーゲンが破壊されると、肌は乾燥し、荒れた状態になる。以上のことから、真皮層の主要な成分の一つであるコラーゲンの生合成を促進させることによって、皮膚のシワやたるみを防止できると思われる。そこで、コラーゲン産生促進剤が望まれていた。
コラーゲン産生促進剤としてはトウダイグサ科アムラ、ローマンカモミールからの抽出物が開示されている。（特許文献１，２）
一方、関節軟骨中のコラーゲンは、関節機能の円滑な作動に役立っている。変形性関節症(ＯＡ)の場合、関節周囲の血行が悪くなり酸素の供給が低下することで、軟骨細胞によるコラーゲンやプロテオグリカンなどの産生を低下させ、死滅した軟骨細胞が滑膜を刺激、炎症を起こし、関節に痛みを生じさせることとなる。さらに、炎症時のサイトカインの放出が、軟骨細胞死を誘導し、痛みの症状を激化させる。
ＯＡの対症療法としては、痛み止めや抗炎症製剤の投与、高分子ヒアルロン酸(ヒアルロン酸ナトリウム)の関節腔内への注入等があげられる。近年では、対症療法以外の方法として、軟骨細胞の分化促進または軟骨細胞の肥大化の抑制、軟骨細胞によるコラーゲン、プロテオグリカンの転写、合成促進などのアプローチが取られ始めている。
以上のことから、コラーゲン産生の促進は、肌荒れ等の皮膚疾患、関節リウマチや外傷性関節症、骨関節炎、変形性関節症といった関節疾患の予防、治療に有効である。したがって、日常の生活の中で手軽に摂取できるコラーゲン産生促進剤を含有するサプリメント、クリームあるいは飲食品が望まれていた。
リポカリン２（ＬＣＮ２）及びβラクトグロブリンは、８本のβ−バレル構造を有するリポカリンファミリーに属するタンパク質である。
リポカリン２（ＬＣＮ２）は、ヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ＮＧＡＬ）とも呼ばれ、９２ｋＤａのヒト好中球タイプIVコラゲナーゼに結合するタンパク質として同定されている。肝臓から分泌されるリポカリン２は、ジデロフォア-Fe³⁺と選択的に結合することで、バクテリアの鉄利用を阻害し増殖を阻害するといった抗菌作用を持つ。また、血漿、血中のリポカリン２が炎症や感染のマーカーとして、尿中のリポカリン２が乳がんなどの悪性腫瘍のマーカーとして利用できるとの報告がある。リポカリン２は、牛乳中にも含まれることが知られているが、成熟乳に比べて初乳中に多く含まれるとの報告がある。しかしながら牛乳中のリポカリン２の機能についての報告はない。
βラクトグロブリンは牛乳中の主要な乳清タンパク質である。有用生理活性物質であるレチノール等の疎水性物質の結合能を有しており、優れた機能特性（乳化性、ゲル化性、起泡性）を有する。

特開２０１１−２２９１１１特開２０１０−１８０１７９

特許文献１，２に開示されている発明では、植物由来の原材料を用いる為、コラーゲン産生促成剤の原料の栽培が特定の地域に限られていたり、季節による供給の変動が大きいなど安定供給が出来ないという課題がある。そこで、本発明は、日常の生活の中で手軽に摂取できる、コラーゲン産生促進剤を提供すること、及びそのような物質を配合したコラーゲン産生促進用サプリメント、飲食品及びコラーゲン酸産生促進用化粧料を提供することを課題とする。

本発明者らは、これらの課題を解決するために、皮膚コラーゲン産生促進作用を示す物質について、鋭意、探索を進めたところ、リポカリンファミリータンパク質あるいはそのリポカリンファミリータンパク質を分解して得られるリポカリンファミリータンパク質分解物が、皮膚のコラーゲン産生量を増加させることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の態様を含むものである。
（１）リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
（２）上記リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物が、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物である、（１）記載のコラーゲン産生促進剤。
（３）上記リポカリンファミリー及び／又はリポカリンファミリー分解物が、βラクトグロブリン及び／又はβラクトグロブリン分解物である、（１）記載のコラーゲン産生促進剤。
（４）前記リポカリン２分解物が、分子量３００以上、８０００以下であることを特徴とする（２）に記載のコラーゲン産生促進剤。
（５）前記リポカリン２分解物が、リポカリン２をタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする（２）記載のコラーゲン産生促進剤。
（６）前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする（５）記載のコラーゲン産生促進剤。
（７）請求項１〜６のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤を配合したサプリメント。
（８）請求項１〜６のいずれかに記載のコラーゲン産生促進剤を配合した飲食品。
（９）請求項１〜６のいずれかに記載のコラーゲン産生促進用を配合した化粧料。

本発明により、リポカリンファミリータンパク質及び／またはリポカリンファミリータンパク質分解物を有効成分とすることで、安全性を向上させたコラーゲン産生促進剤を提供する事が出来る。

はリポカリン２によるコラーゲン産生促進効果を示す。

本発明のコラーゲン産生促進剤の特徴は、リポカリン２及び／またはリポカリン２をタンパク質分解酵素で分解して得られるリポカリン２分解物を有効成分とすることにある。本発明のリポカリン２はどのような由来のものであっても使用可能である。たとえば、ヒト及びウシ由来のリポカリン２はすでにその遺伝子配列が明らかになっており、遺伝子組換えによる生産が可能であるが、本発明では、遺伝子工学的手法により生産されたリポカリン２も使用可能であり、細胞培養の培養液から回収した細胞由来のものも使用可能である。また、リポカリン２はウシ初乳中に含有されており、乳から回収したものであっても良く、生乳や粉乳、脱脂乳、還元乳等から、加熱処理、加塩処理、エタノール処理、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマト処理、限外濾過処理等によって取得することも可能である。

リポカリン２分解物は、リポカリン２をトリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のタンパク質分解酵素で分子量が８，０００以下となるように限定分解したペプチド混合物を使用することが可能である。但し、分子量の下限は３００以上であることが好ましい。

本発明のコラーゲン産生促進剤は、経口投与あるいは塗布することにより、コラーゲン産生促進効果を発揮する。本発明のコラーゲン産生促進剤を経口投与するに際しては、有効成分であるリポカリン２あるいはリポカリン２分解物をそのままの状態で用いることもできるが、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。本発明において、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、例えば、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等の賦形剤を用いて常法によって製剤化することが可能である。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用してもよい。より具体的には、結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられ、崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース等が挙げられる。また、界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等、流動性促進剤としては無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が挙げられる。
さらには、これらのリポカリン２やリポカリン２分解物をそのままあるいは製剤化した後、これを栄養剤や飲食品等に配合することも可能である。なお、リポカリン２あるいはリポカリン２分解物は、比較的熱に対して安定であるので、リポカリン２あるいはリポカリン２分解物を含む原料を通常行われるような条件で加熱殺菌することも可能である。

本発明のコラーゲン産生促進剤を塗布するに際しては、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能で、好ましい組成物として軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明のコラーゲン産生促進剤をワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸、ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、ロウ、樹脂、水及び、要すればパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料に混合することによって、コラーゲン産生促進用化粧料や医薬品を製造することができる。

本発明のコラーゲン産生促進剤の経口投与による有効量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、及びこれを適用される患者の年齢、体重、病状により適宜規定され一定でないが、ラットを用いた動物実験の結果、リポカリン２及び／またはリポカリン２分解物は、ラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ以上摂取させることでコラーゲン産生促進作用を示すことが明らかとなった。したがって、外挿法によると、通常、成人一人当たり一日１０μｇ以上のリポカリン２及び／またはリポカリン２分解物を摂取すればコラーゲン産生促進効果が期待できるため、この必要量を確保できるよう飲食品に配合するか、あるいは、医薬として投与すれば良い。なお、投与は必要に応じて一日数回に分けて行うことも可能である。

本発明のコラーゲン産生促進剤の塗布による有効量は、剤形により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは、０．００１〜２重量％となるように、リポカリン２及び／またはリポカリン２分解物を配合すれば良い。ただし、入浴剤のように使用時に希釈されるものは、さらに配合量を増やすことができる。

以下、実施例および試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明する。実施例および試験例における「％」は断らない限り「重量％」を意味するものとする。
以下に、実施例及び試験例を示して本発明を詳細に説明するが、これらは単に本発明の実施態様を例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

Ｓセファロース３,０００ｇを充填したカラムを脱イオン水で充分洗浄し、脱脂乳１０,０００Ｌを通液して、脱イオン水で充分洗浄した後、０．１〜１．０Ｍの塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。その後、リポカリン２を含む溶出画分を再度フェニルＳセファロース疎水性カラムクロマトグラフィーで分画した。さらに、この画分をＨＰＬＣシステムにてＣ４およびＣ８逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーで順次処理し、リポカリン２４００ｍｇ（画分Ａ）を得た。なお、このようにして得られたリポカリン２は、そのままコラーゲン産生促進剤として使用可能である。

実施例１で得られた画分Ａ２５ｍｇを、水１００ｍｌに懸濁し、最終濃度が１％となるようにパンクレアチンを加え、３７℃で５分から６時間、酵素処理を行った。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥して、リポカリン２分解物２４ｍｇ（画分Ｂ、Ｃ、Ｄ）を得た。なお、このようにして得られたリポカリン２分解物の平均分子量は、Ｂが約８，０００、Ｃが約５００、Ｄが約３００であった。また、実施例１で得られた画分Ａ２５ｍｇを、水１００ｍｌに懸濁し、最終濃度が０．０１％となるようにペプシンを添加し、ｐＨを２〜３に調整した後、３７℃で１２時間酵素処理を行い、さらにｐＨを８に調整した後、最終濃度が０．０１％となるようにトリプシンを添加し、３７℃で１２時間酵素処理を行った。そして、９０℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥し、リポカリン２分解物２４ｍｇ（画分Ｅ）を得た。画分Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは、そのままコラーゲン産生促進剤として使用可能である。

［試験例１］
実施例１で得られた試料Ａ及び実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｅについて、ラットを用いた動物実験によりコラーゲン産生促進作用を調べた。７週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラットを、生理食塩水投与群（対照群）、実施例１で得られた試料Ａをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ａ−１群）、実施例１で得られた試料Ａをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ａ−２群）、実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｄをラット体重１ｋｇ当たり１０μｇ投与する群（Ｂ−１〜Ｅ−１群）、実施例２で得られた試料Ｂ乃至Ｄをラット体重１ｋｇ当たり１００μｇ投与する群（Ｂ−２〜Ｅ−２群）の１１試験群（ｎ＝６）に分け、それぞれを毎日１回ゾンデで経口投与して１０週間飼育した。皮膚のコラーゲン量については、以下の手順にて行った。ラットの真皮をＮｉｍｎｉらの方法（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２９２頁，１９６７年参照）に準じて処理した後、可溶性画分に含まれるヒドロキシプロリン量を測定した。ヒドロキシプロリンはコラーゲンのみに含まれる特殊なアミノ酸で、コラーゲンを構成する全アミノ酸の約１０％を占めることからコラーゲン量の推定した（浅野隆司ら，ＢｉｏＩｎｄｕｓｔｏｒｙ，１２頁，２００１年参照）。その結果を表１に示す。

この結果、１０週間後の可溶性画分中コラーゲン量は、対照群に比べ、すべての試験群で有意に高い値を示した。このことから、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物には、コラーゲン産生促進作用があることが明らかとなり、コラーゲン産生促進剤として有用であることが示された。また、このコラーゲン産生促進作用はリポカリン２及び／又はリポカリン２分解物をラット体重１ｋｇ当たり少なくとも１０．０μｇ投与した場合に認められることが明らかとなった。

［試験例２］
実施例１で得られた試料Ａ及び実施例２で得られた試料Ｂ、Ｃ、Ｄについて、正常ヒト線維芽細胞株〔白人女性の皮膚より採取されたＣＣＤ４５ＳＫ（ＡＴＣＣＲＬ１５０６）〕を用いた実験によりコラーゲン産生促進作用を調べた。１０容量％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略記）含有変法イーグル培地（ＭＥＭ、１０‐１０１、大日本製薬社製）を用いて、正常ヒト線維芽細胞株を４×１０^４個／ウエル／０．４ｍｌとなるように２４ウエルプレートに播種して、５％炭酸ガス、飽和水蒸気下、３７℃で２４時間培養した後、０．６容量％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培地に置換した。そして、実施例１で得られた試料Ａ及び実施例２で得られた試料Ｂ、Ｃ、Ｄを、各ウエルに０．１容量％となるように添加（ｎ＝６）して、２４時間培養した後、β−アミノプロピオニトリルを５０μｇ／ｍｌ、トリチウム−Ｌ−プロリンを１μＣｉ／ｍｌとなるように添加して、さらに２４時間培養して培養液を得た。Ｗｅｂｓｔｅｒらの方法（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２０頁，１９７９年参照）に従い、このようにして得られた培養液の、コラーゲン画分に取り込まれた放射能を測定した。なお、対照として、リポカリン２又はリポカリン２分解物を添加しないで同様の試験を行った。その結果を表２に示す。

表２の結果、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を添加した群は、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を添加していない群（対照）に比べていずれも２倍以上のコラーゲン産生促進能を示した。このことから、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物には、皮膚線維芽細胞に働きかけ、コラーゲン産生を促進する作用があることが明らかとなり、コラーゲン産生促進剤として有用であることが示された。

［試験例３］
市販のヒトリポカリン２リコンビナントタンパク質（ＮＧＡＬ）（ＰＲＯＳＰＥＣ社）、及び正常ヒト新生児包皮皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ（ＮＢ））を用いた細胞実験により、リポカリン２によるコラーゲン産生促進作用について調べた。ＮＨＤＦ（ＮＢ）細胞を１２穴プレートに８×１０^３cells/wellになる様に播種し、ＭＥＤＩＵＭ１０６培地(ＧＩＢＣＯ社製)にて３７℃、５％ＣＯ^２環境下にて３日間培養した。ＮＧＡＬが１０ｎＭになるようにＭＥＤＩＵＭ１０６培地に溶解したものを培養した細胞に添加し、７２時間培養した。このようにして得られた培養液のヒト・プロコラーゲンI型Ｃ末端ペプチド（ＰIＰ）量をコラーゲン量として測定キットＰｒｏｃｏｌｌａｇｅｎＴｙｐｅ I Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰIＰ）ＥＩＡｋｉｔ（タカラバイオ）にて測定した。その結果を図１に示す。

この結果、コントロールと比較し、ＮＧＡＬを添加したサンプルは、コラーゲン量が有意に増加したことから、リポカリン２がコラーゲン産生を促進剤すること確認された。

表３に示す配合のコラーゲン産生促進用飲料を常法により製造した。製造した飲料の風
味は良好で、沈殿等の問題もなかった。

表４に示す配合のドウを常法により作製し、成形した後、焙焼してコラーゲン産生促進
用ビスケットを製造した。

表５に示す配合のコラーゲン産生促進剤を常法により製造した。

表６に示す配合の化粧水を常法により製造した。

表７に示す配合のクリームを常法により製造した。

［試験例４］
実施例６で得られた化粧水及び実施例７で得られたクリームを用いて、実使用テストを行った。比較品としては、リポカリン２及び／又はリポカリン２分解物を除いた以外は実施例６及び７と同じ配合のものを用いた。顔面のたるみや小ジワが認められる乾燥肌を有する成人女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ａ、Ｂ群）に、また、手に肌荒れが認められる女性２０人を、それぞれ１０人ずつ無作為に２群（Ｃ、Ｄ群）に分け、Ａ群の顔面には本発明品の化粧水２ｇを、Ｂ群の顔面には比較品の化粧水２ｇを、Ｃ群の手指には本発明品のクリーム２ｇを、Ｄ群の手指には比較品のクリーム２ｇを、それぞれ１日２回通常の使用状態と同様に１０日間塗布した。結果を表８に示す。

表８の結果より、本発明品の化粧水は、比較品の化粧水に比べて、乾燥感の改善、肌荒
れ等の改善が顕著であり、コラーゲン産生促進効果に優れていることが実証された。また、本発明品のクリームについても、比較品のクリームに比べて、乾燥感の改善、肌荒れに顕著な改善がみられ、肌荒れ等の自然増悪抑制効果を有することが明らかとなった。
［試験例５］
変形性関節炎による軽度の痛みを有する患者２０名を対象に、実施例３に示す飲料を１日１回１００ｇ飲用し、１年間の臨床試験を行った。関節の疼痛および機能の評価を、疼痛に対するビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）、及び、関節炎の関節における疼痛、機能、および硬直に関するＷｅｓｔｅｒｎＯｎｔａｒｉｏａｎｄＭｃＭａｓｔｅｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ（ＷＯＭＡＣ）指標にて変形性関節症の評価を行った。結果を表９に示す。

表９の結果より、ＶＡＳおよびＷＭＡＣの両指標とも、摂取開始時の値と比較し、摂取6ヶ月後から有意に改善されている事がわかる。従って、本発明品の被験食は、比較品の被験食に比べて、関節の疼痛および機能の改善が顕著であり、コラーゲン産生促進効果に優れていることが実証された。

本発明は、皮膚の荒れ、シワ、弾性低下、関節機能低下等を防止するのに有用なコラーゲン産生促進剤、コラーゲン産生促進用サプリメント、飲食品及びコラーゲン産生促進用化粧料に関する。

Claims

リポカリン２及び／又はペプチド混合物であるリポカリン２分解物を有効成分とする皮膚コラーゲン産生促進剤。
前記リポカリン２分解物が、分子量３００以上、８０００以下であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
前記リポカリン２分解物が、リポカリン２をタンパク質分解酵素で分解して得られたものであることを特徴とする請求項２に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼから選択されるいずれか１種以上であることを特徴とする請求項３に記載の皮膚コラーゲン産生促進剤。
請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を配合した皮膚コラーゲン産生促進用サプリメント。
請求項１〜４のいずれかに記載の皮膚コラーゲン産生促進剤を配合した皮膚コラーゲン産生促進用飲食品。