JP6186630B2

JP6186630B2 - 酵素電極

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Publication number: JP6186630B2
Application number: JP2014522638A
Authority: JP
Inventors: 理志塚田; 真由美多島
Original assignee: Bioengineering Laboratories LLC
Current assignee: Bioengineering Laboratories LLC
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2013-06-25
Publication date: 2017-08-30
Anticipated expiration: 2033-06-25
Also published as: EP2866024B1; JPWO2014002999A1; US20150129425A1; EP2866024A1; WO2014002999A1; BR112014032201A2; EP2866024A4; CN104520700B; CN104520700A

Description

本発明は、酵素電極に関する。

電極と、電極上に形成された酵素を含む検知層とを備えた酵素電極がある。酵素電極は、酵素反応により生じた電子を電極から取り出す構造を有する。

特開平０１−０７５９５６号公報特開昭６３−０５０７４８号公報特開平１０−１００３０６号公報特開２００６−２３４７８８号公報

Brianna C. Thompson et al., Macromol. Rapid Commun. 2010, 31, 1293-1297 A. Kros et. al., Third generation Polyethylenedioxythiophene (PEDOT) based glucose sensor, Symposia Papers Presented Before the Division of Enviromental Chemistry, American Chemical Society Anaheim, CA March 21-25, 1999 A. Kros et. al., Poly (pyrrole) versus poly (3,4-ethylenedioxythiophene): implications for biosensor applications, Sensors and Acutuators B 106 (2005) 289-295 C. G. J. Koopal et al., Glucose sensor utilizing polypyrrole incorporated in track-etch membranes as the mediator, Biosensor and Bioelectronics 7 (1992) 461-471

一般的に、酵素電極の検知層に含まれた酵素が不活状態となると、酵素電極としての機能が損なわれる。酵素の不括化要因の一つには、熱による不活化がある。例えば、保管や輸送時における環境下で、酵素電極に不括化の要因となる熱が加わる可能性がある。また、酵素電極の使用中においても、熱が加わる可能性がある。酵素電極が好適な熱耐性を示すことは、酵素電極の寿命を延ばす意味において好ましい。

本発明の一側面は、熱耐性の向上した酵素電極を提供することを目的とする。

本発明の一側面は、上述した目的を達成するために、以下の構成を採用する。すなわち、本発明の一側面は、酵素電極であり、電極と、前記電極と接触し、酸化還元酵素と、水溶性導電性ポリマーと、導電性粒子とを含む検知層と、を含み、上記検知層における直接電子移動によって上記酵素と上記電極間で電子授受が行われることを特徴とする。水溶性導電性ポリマーは、例えばポリアニリンスルホン酸である。

本発明の一側面における酸化還元酵素は、シトクロムを含むサブユニットを有することができる。また、酸化還元酵素は、シトクロムを含むドメインを有することができる。また、酸化還元酵素は、少なくとも触媒サブユニットおよびシトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素を適用することができる。また、酸化還元酵素は、更に、少なくとも触媒ドメインおよびシトクロムを含むドメインから構成されている酵素を適用することができる。上記触媒サブユニット、及び上記触媒ドメインのそれぞれは、ピロロキノリンキノン、フラビンアデニンジヌクレオチドの少なくとも何れか１つを含むことができる。

また、本発明の一側面における導電性粒子は、炭素を含むことができる。
上記ポリアニリンスルホン酸の濃度は、例えば、０．０１〜５％である。また、上記ポリアニリンスルホン酸の官能基は、水酸基又はスルホ基である。

また、本発明の一側面における、上記電極と上記検知層との少なくとも一方は、導電性粒子を含むのが好ましい。

また、本発明の一側面に係る酵素電極は、熱耐性が向上したことを特徴とする。
本発明の他の側面の一つは、電極と、前記電極と接触し、酸化還元酵素と、ポリアニリンスルホン酸と、導電性粒子とを含む検知層と、を含み、前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われる酵素電極を備えたバイオセンサである。

また、本発明の他の側面の一つは、電極と、上記電極と接触し、酸化還元酵素と、ポリアニリンスルホン酸と、導電性粒子とを含む検知層と、を含み、上記検知層における直接電子移動によって上記酵素と上記電極間で電子授受が行われる酵素電極を備えた電子機器である。

また、本発明の他の側面の一つは、電極と、上記電極と接触し、酸化還元酵素と、ポリアニリンスルホン酸と、導電性粒子とを含む検知層と、を含み、上記検知層における直接電子移動によって上記酵素と上記電極間で電子授受が行われる酵素電極と、上記酵素電極での酵素反応によって生じた電流を負荷に供給する供給部とを含む装置である。また、本発明の他の態様は、上記バイオセンサを含んだ電子機器、上記装置を含んだ電子機器を含むことができる。

また、本発明の他の側面の一つは、電極上に、酸化還元酵素と、ポリアニリンスルホン酸と、導電性粒子とを含む、直接電子移動によって上記酵素と上記電極間で電子授受を行う検知層を形成する、ことを含む酵素電極の製造方法である。

また、本発明の他の側面の一つは、酸化還元酵素と、ポリアニリンスルホン酸と、導電性粒子と、を含み、熱耐性を向上させたことを特徴とする試薬である。

本発明の一側面によれば、熱耐性の向上した酵素電極を提供することができる。

図１は、実施形態に係る酵素電極の構造を模式的に示す図である。図２は、検知層内を模式的に示す図である。図３は、熱処理の時間を固定した場合における、熱処理時の温度と応答電流との関係を示すグラフである。図４は、熱処理の温度を固定し、熱処理の時間を変動させた場合における時間と応答電流との関係を示すグラフである。図５は、ポリアニリンスルホン酸の濃度と熱耐性との関係を示すグラフである。図６は、ポリアニリンスルホン酸の濃度と熱耐性との関係を示すグラフである。図７は、試験４の結果（試薬中に添加するポリマー濃度の影響）を示すグラフである。図８は、試験５の結果（熱処理時間による影響）を示すグラフである。

以下、本発明の一実施形態としての酵素電極について図面を参照して説明する。以下に挙げる実施形態はそれぞれ例示であり、本発明は以下の実施形態の構成に限定されない。

〔酵素電極の構成〕
図１は、実施形態に係る酵素電極の側面を模式的に示した図である。図１において、酵素電極１０は、電極１と、電極１の表面（図１では上面）に形成された検知層２とを備える。

＜電極＞
電極１は、金（Au），白金（Pt），銀（Ag），パラジウムのような金属材料、或いはカーボンのような炭素材料を用いて形成される。電極１は、例えば、図１に示すような絶縁性基板３上に形成される。絶縁性基板３は、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ），ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ），ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂、ポリイミド樹脂、エポキシ樹脂のような各種の樹脂（プラスチック），ガラス，セラミック，紙のような絶縁性材料で形成される。電極１をなす電極材料，及び絶縁性基板３の材料は、公知のあらゆる材料を適用することができる。電極１及び絶縁性基板３の大きさ、厚さは適宜設定可能である。以下、絶縁性基板３と電極１との組合せを「基材」と呼ぶこともある。

＜検知層＞
図２は、図１に示した検知層２内の状態を模式的に示す。図２に示すように、検知層２は、電極１と接触し、酸化還元酵素４（以下、単に“酵素４”と表記することもある）と、導電性ポリマー（ポリアニリン：例えば、ポリアニリンスルホン酸）５を含んでおり、電子伝達メディエータを含んでいない。

図２に示すように、検知層２内において、酵素４の分子は、導電性ポリマー５と複雑に絡み合った構造を有している。酵素反応により生じた電子は、直接的に、または、導電性ポリマー５を伝って電極１に移動することができる。すなわち、実施形態に係る酵素電極１０は、検知層２における直接電子移動によって酵素４と電極１との間で電子授受が行われる。

このように、酵素電極１０は、直接電子移動型の酵素電極である。“直接電子移動型の酵素電極”とは、検知層で酵素反応により生じた電子が、電子伝達メディエータのような酸化還元物質が関与することなく直接電極に伝達されることにより、酵素と電極間の電子授受が行われるタイプの酵素電極である。

また、“直接電子移動型の酵素電極”は、酵素としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）が適用された場合における、酵素反応により生じた過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）が電極上で酸化されるような、酵素反応により生じた物質を介して電子が電極に伝達されるタイプの酵素電極からも区別される。

なお、生理学的反応系において直接電子移動が起こる限界距離は10-20Åと云われており、電極と生体分子（酵素）から構成される電気化学的な反応系における電子授受においてもこれより長い距離では、酵素やメディエータの物質移動（例えば拡散による移動）を伴わない限りは電極上での電子授受の検知が困難となる。

酵素電極１０によれば、検知層２において、酵素４の分子と導電性ポリマー５とが絡み合うことで、外部からの熱エネルギーが酵素４に及ぼす作用（酵素分子の構造変化）を和らげるように作用するものと考えられる。

また、検知層２内では、酵素４の電子伝達部位（酵素反応において電子授受が行われる部位）近傍に導電性ポリマー５の導電性部位が配置されることによって酵素４と電極１の間における電子移動が起きやすい状態となっている。本発明の一側面における効果としては、酵素４は、導電性ポリマー５によって周囲を囲まれていることで、分子の高次構造を維持しやすい環境になっていると考えられる。また、酵素４から発生した電子は導電性ポリマー５の導電性部位を介して、酵素４から電極１への複数の好適な電子伝達経路が形成された状態となっていると考えられる。このため、本発明の一側面における効果としては、外部からの熱エネルギーにより、酵素４に対する作用（物理的な変化や配置の変化）が起こったとしても、複数の好適な電子伝達経路が確保されていることにより、酵素４から電極１への電子移動が大きく、或いは急激に妨げられることが緩和されるものと考えられる。よって、実施形態に係る酵素電極１０は、好適な熱耐性を有することができる。

また、検知層２内では、導電性高分子（導電性ポリマー５）のゼーべック効果による熱電変換特性により、酵素４への熱ストレスの影響を緩和しているものと考えられる。特に、導電性ポリマー５としてポリアニリンスルホン酸が適用される場合、ポリアニリンスルホン酸はπ電子共役系を示す分子鎖が長いことからゼーべック効果もより高く、水分散性ではなく、水溶性であることから酵素４との親和性（混ざり）が良く、検知層２内において、構造的に酵素４を包括しやすいと考えられる。よって、少なくとも酵素電極１０の作製時における、酵素４に他対する熱影響の抑制効果が向上すると考えられる。

＜＜酸化還元酵素＞＞
酵素４として適用し得る酸化還元酵素は、シトクロムを含むことができる。また、酸化還元酵素は、電子伝達サブユニットを含むことができる。電子伝達サブユニットを有する酸化還元酵素としては、例えば、シトクロムを含むグルコースデヒドロゲナーゼ（CyGDH）、ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ（PQQGDH複合体）、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（Sorbitol DH）、Ｄ-フルクトースデヒドロゲナーゼ（Fructose DH）、Agrobacterium tumefasience由来のグルコース-3-デヒドロゲナーゼ（Glucose-3-Dehydrogenase）（G3DH from Agrobacterium tumefasience)、セロビオースデヒドロゲナーゼのうちから少なくとも１つを選択することができる。電子伝達サブユニットとしては、シトクロムを含むサブユニットを適用するのが好ましい。シトクロムを含むサブユニットを有する酸化還元酵素としては、例えば、上述したCyGDHや、PQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質を適用することができる。また、酸化還元酵素は、電子伝達ドメインを含むことができる。電子伝達ドメインを有する酸化還元酵素としては、例えば、コレステロールデヒドロゲナーゼ（CDH）、キノヘムエタノールデヒドロゲナーゼ（QHEDH (PQQ Ethanol dh), “QHGDH” (fusion enzyme; GDH with heme domain of QHGDH)）のうちから少なくとも１つを選択することができる。電子伝達ドメインは、シトクロムを含むドメインを適用するのが好ましい。例えば、上記したQHEDHのシトクロムドメインを適用するのが好ましい。

上述したシトクロムを含むサブユニットの例示であるPQQGDHとシトクロムとの融合蛋白質、及びシトクロムを含むドメインの例示であるQHGDHのシトクロムドメインは、例えば、国際公開WO2005/030807号公報に開示されている。
また、酸化還元酵素は、触媒サブユニットを含み、更に、当該触媒サブユニットは、電子伝達サブユニットを有することができる。触媒サブニットの一例として、シトクロムを含むグルコースデヒドロゲナーゼのαサブユニットを挙げることができる。酸化還元酵素としては、少なくとも触媒サブユニットおよびシトクロムを含むサブユニットから構成されているオリゴマー酵素を適用するのが好ましい。また、酸化還元酵素は、少なくとも触媒ドメインおよびシトクロムを含むドメインから構成されている酵素を適用するのが好ましい。
また、酸化還元酵素は、更に、触媒ドメインを含み、更に、当該触媒ドメインは、電子伝達ドメインを有することができる。触媒ドメインの一例として、コレステロールデヒドロゲナーゼのフラビンドメインを挙げることができる。
上記した触媒サブユニット、及び触媒ドメインのそれぞれは、ピロロキノリンキノン（PQQ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）のうち少なくとも一方を含むことができる。

＜＜ポリアニリンスルホン酸＞＞
導電性ポリマー５として適用し得るポリアニリンスルホン酸として、様々な属性（例えば、水溶性）を有するポリアニリンスルホン酸を適用することができる。ポリアニリンスルホン酸６の濃度は、例えば、０．０１〜５％であり、好ましくは０．０１〜２％である。また、ポリアニリンスルホン酸の官能基は、水酸基又はスルホ基である。

＜＜導電性粒子＞＞
酵素電極１０の検知層２は、図示しないが、導電性粒子をさらに含むことができる。検知層２が導電性粒子を含むことで、より好適な電極への電子伝達を期待することができる。導電性粒子は、例えば炭素を含むことができる。具体的には、導電性粒子は、金、白金、銀、パラジウムのような金属製粒子、或いは、炭素を材料とした高次構造体を適用することができる。高次構造体は、例えば、導電性カーボンブラック，ケッチェンブラック，カーボンナノチューブ（ＣＮＴ），フラーレンのような、炭素粒子又は炭素微粒子を含むことができる。導電性粒子は、上記のような金属及び炭素の少なくとも一方を選択することができる。

なお、検知層２表面は、セルロースアセテート（ＣＡ）のような外層膜によって被覆されても良い。
〔酵素電極の作製方法〕
上記した酵素電極１０は、例えば、以下のようにして作製される。すなわち、絶縁性基板３の片面に、電極１として機能する金属層を形成する。例えば、所定の厚さ（例えば１００μｍ程度）のフィルム状の絶縁性基板３の片面に、金属材料を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）によって成膜することによって、所望の厚さ（例えば３０ｎｍ程度）を有する金属層が形成される。金属層の代わりに、炭素材料で形成された電極層を形成することもできる。

次に、電極１上に検知層２が形成される。すなわち、シトクロムを含む酸化還元酵素４，導電性ポリマー５としてのポリアニリンスルホン酸を含有する溶液（試薬）が調整される。溶液（試薬）は、電極１の表面に滴下される。溶液（試薬）が電極１上で乾燥により固化することで、電極１上に検知層２が形成された酵素電極１０を得ることができる。

〔実施例〕
以下、酵素電極の実施例について説明する。

＜試験１＞
＜＜試薬溶液の調製＞＞
最初に、以下のような実施例１、比較例に係る２種類の試薬溶液を調製した。

［実施例１］
・ケッチェンブラック：０．８％
・水溶性ポリアニリン（商品名AquaPASS (以下“AQP”と表記)）：０．４５％
・シトクロムを含むグルコース脱水素酵素（Ｃｙ−ＧＤＨ）：０．５６％
・安定化剤（スクロース）：０．５％
・リン酸バッファ（ｐＨ５．８）：１６ｍＭ
なお、“％”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量％濃度を示す。

[比較例]
・ケッチェンブラック：０．８％
・シトクロムを含むグルコース脱水素酵素（Ｃｙ−ＧＤＨ）：０．５６％
・安定化剤（スクロース）：０．５％
・リン酸バッファ（ｐＨ５．８）：１６ｍＭ
なお、“％”は、試薬溶液中に含まれる試薬の重量％濃度を示す。このように、比較例の試薬溶液は、実施例１の試薬溶液からＡＱＰが除かれたものである。

＜＜酵素電極（試料）の作製＞＞
次に、片面に金蒸着によって電極（電極層）が形成された複数の絶縁性基板（基材）を用意し、各絶縁性基板に実施例１、比較例に係る試薬溶液を夫々分注し、低湿度乾燥炉で３０分間放置し、乾燥させた。このようにして、試薬が電極上で固化することにより検知層が形成された実施例１に係る酵素電極（試料）と、比較例に係る酵素電極（試料）とを得た。

このとき、実施例１、比較例の夫々について、３０℃，８０℃，１００℃，１２０℃の各炉内温度（乾燥温度）で乾燥させた４種類（合計８種類）の試料を得た。
＜＜グルコース濃度の測定＞＞
次に、熱処理後の上記試料のグルコース100mg/dlに対する応答電流値の測定を行った。グルコース測定は、３７℃に加温したリン酸バッファ（ｐＨ７．４）中に上記試料を浸漬し、対極に白金線、参照極に銀/塩化銀電極を用い、作用極への印加電圧を＋０．４Ｖ（vs.Ag/AgCl）とした。

＜＜測定結果の評価＞＞
図３は、試験１の結果、すなわち上記した８種類の試料に対する応答電流値（μＡ）と乾燥温度（℃）との関係を示すグラフである。図３において、実施例１に係る試料の結果は白の棒グラフで示し、比較例に係る試料の結果は黒の棒グラフで示す。なお、測定は、種類毎に、２つの試料を用いて２回行い、図４に示す結果は、２回の測定結果の平均値を示す。

図３に示す試験結果によれば、ＡＱＰが無添加の試料（比較例）は、乾燥温度の上昇に伴い、明らかな応答感度の低下が認められたのに対し、ＡＱＰが添加された試料（実施例１）は、乾燥温度が上昇するに伴い、高い応答感度が維持されていた。このように、ＡＱＰが添加された試料では、電極応答の熱耐性が大きく向上しており、応答感度向上も図られていることが分かる。

＜試験２＞
上記した試験１と同様の手法で、実施例１及び比較例に係る８種類の試薬溶液を調製するとともに、試験１で用いた基材と同様の基材における電極上に、各試薬溶液を分注した。その後、低湿度乾燥炉（乾燥温度１００℃）で、試薬溶液を乾燥させて、酵素電極（試料）を得た。但し、試験２では、炉内での乾燥時間（熱処理時間）を、１０分，３０分，６０分，１２０分と変化させて、実施例１、比較例の夫々について４種類（合計８種類）の酵素電極（試料）を得た。その後、試験１と同様の手法（測定手法及び測定条件）で、グルコースに対する応答電流値の測定を行った。

図４は、試験２の結果、すなわち上記した８種類の試料に対する応答電流値（μＡ）と乾燥時間（ｍｉｎ）との関係を示すグラフである。図４において、実施例１に係る試料の結果は白の棒グラフで示し、比較例に係る試料の結果は黒の棒グラフで示す。なお、測定は、種類毎に、２つの試料を用いて行い、図４に示す結果は、二つの測定結果の平均を示す。

図４に示す試験結果によれば、ＡＱＰが無添加の試料（比較例）は、乾燥時間の長期化に伴い、顕著に応答感度が低下する傾向が認められたのに対し、ＡＱＰが添加された試料（実施例１）は、乾燥時間の変化（長期化）に拘らず、好適な応答感度を維持する傾向が認められた。このように、ＡＱＰが添加された試料は、長時間に亘って好適な熱耐性を具備し得ることが分かる。

＜試験３＞
次に、ＡＱＰの濃度を変えた４種類の試薬溶液を調製した。ＡＱＰの濃度（重量％）は、０（比較例），０．２０％，０．４５％（実施例１），１％とした。なお、ＡＱＰを除く試薬溶液中の成分は、実施例１と同じ内容で調製した。

このようにして得た４種類の試薬溶液について、試験１と同様の手法で、電極上に試薬溶液を分注し、１０分，３０分，６０分，１２０分（乾燥温度は何れも１００℃）の各乾燥温度で乾燥させた１６種類の酵素電極（試料）を得た。そして、試験１と同様の手法で、グルコースに対する応答電流値の測定を行った。

＜試験３の結果＞
図５は、試験３の結果、すなわち、各試料に係る乾燥時間（熱処理時間）（分）と応答電流値（μＡ）との関係を示すグラフである。図５において、各熱処理時間に対し、４つの棒グラフが示されている。４つの棒グラフは、左から順に、ＡＱＰの濃度が０，０．２０％，０．４５％，１％の応答電流値（応答感度）を示す。

図６は、試験３における熱処理時間１０分のときの応答感度を１００％としたときの熱処理時間３０分，６０分，１２０分における相対的な応答感度（％）を示すグラフである。図６において、各熱処理時間に対し、４つの棒グラフが示されている。４つの棒グラフは、左から順に、ＡＱＰの濃度が０，０．２０％，０．４５％，１％の相対的な応答感度を示す。

なお、試験３において、１種類の試料に対する測定は、同種類の二つの試料を用いて２回行った。図５及び図６に示す結果は、２回の測定結果の平均値を示す。

図５及び図６に示す結果より、ＡＱＰの濃度０（添加無し）の場合には、熱処理時間が長くなるにつれて、応答感度が低下し、６０分、１２０分の熱処理時間では応答感度が殆ど無くなることが確認された。これに対し、ＡＱＰの濃度が０．２０％の場合、３０分，６０分，１２０分の熱処理時間のときの応答感度は、熱処理時間１０分のときの応答感度より低下するが、ＡＱＰの濃度が０の場合に比べて良好な応答感度を示すことが確認された。ＡＱＰの濃度が０．４５％の場合、熱処理時間３０分，６０分，１２０分のときの応答感度は、熱処理時間１０分のときの応答感度と比べて、殆ど変わらないか、それ以上となることが確認された。そして、ＡＱＰの濃度が１％の場合には、３０分，６０分及び１２０分のいずれの熱処理時間でも、熱処理時間が１０分のときの応答感度に比べて２倍以上の応答感度を示すことが確認された。上記の結果より、酵素電極が好適な熱耐性を得るためのポリアニリンスルホン酸の上限濃度は、酵素電極の作成の容易さを考慮すると５％以下であり、好ましくは１％以下である。また、好適な熱耐性を得るための下限濃度としては、０．０１％以上であり、好ましくは０．２％以上、さらに好ましくは０．４５％以上である。

＜試験４＞
次に、試薬溶液中に添加する導電性ポリマーの濃度の影響についての試験を行った結果について説明する。

＜＜酵素電極（グルコースセンサ）の調製手順＞＞
グルコースセンサの調製手順は以下の通りである。すなわち、電極上に混合試薬を０．１ｕｌ滴下し、室温で２０分間静置させた後、オーブンを用い、１２０℃の炉内温度で３０分間乾燥させた。
[混合試薬の組成（“％”は重量％濃度）]
・カーボンブラック：４％
・Tween20水溶液：１．６％（界面活性剤）
・安定化剤：０．５％
・リン酸バッファ（ｐＨ７．０）：１６ｍＭ
・グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）水溶液：５．６ｍｇ／ｍｌ
・ポリアニリンスルホン酸水溶液（０，０．０１％，０．０５％，０．１％，０．２％，０．４％，０．７５％，１％，１．５％，２％）
・水（Ｈ_２Ｏ）
＜＜評価手順＞＞
上記により調製したグルコースセンサの電極として、作用極及び参照極には銀／塩化銀電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ（ＢＡＳ社製））を用い、対極には白金（Ｐｔ）線を用いた。このようなグルコースセンサを用い、ＰＢＳ(Phosphate Buffered Saline)溶液中でアンペロメトリーによるグルコース応答電流（応答感度）を測定した。具体的には、印加電圧を＋０．４Ｖ（vs.Ag/AgCl）とし、ＰＢＳ溶液中でバックグラウンドの電流がプラトーに達してから終濃度が１００ｍｇ／ｄＬとなるように、２Ｍグルコース水溶液を添加した。グルコース水溶液の添加に対するグルコースセンサの応答電流値は、添加後の応答電流値を記録し、バックグラウンドの電流値を差し引いた値を応答電流値とした。

＜＜試験４の結果＞＞
図７は、上記した評価手順により得られた試験４の結果を示すグラフである。図７を見ると、１２０℃では、０．１〜２％の濃度に亘って、適当な応答電流値が得られていることが分かる。通常、酵素は高温下で失活する。これに対し、１２０℃という高温を経ても適当な応答電流値が得られることから、ポリアニリンスルホン酸によって酵素が熱から適正に保護されていることが分かる。そして、ポリアニリンスルホン酸の濃度として採り得る範囲が、酵素電極の作成の容易さを考慮すると５％以下であり、好ましくは２％以下であり、さらに好ましくは１％以下であり、また、好適な熱耐性を得るための下限濃度としては、０．０１％以上であり、好ましくは０．２％以上、さらに好ましくは０．４５％以上であることも、図７に示した結果から把握することができる。

＜試験５＞
次に、試験５として、グルコースセンサの熱処理時間による影響について試験を行った結果について説明する。試験５では、試験４に関して説明した組成を有する混合試薬を０．１ｕｌ電極上に滴下し、２０分間、室温下で静置させた後、オーブンを用い、所定の炉内温度（１００℃）で、複数の異なる乾燥時間（熱処理時間１０分，３０分，６０分，１２０分）の熱処理を経た複数のグルコースセンサを用いた。試験５におけるグルコースセンサの電極構成，及び評価手順は、試験４と同じである。

図８は、試験５の結果を示すグラフである。図８には、４つの熱処理時間（１０分，３０分，６０分，１２０分）に関して、ポリマー濃度と応答電流値との関係を示す４つのグラフが図示されている。どのポリマー濃度においても、熱処理時間の影響なく、グルコースセンサとして適用し得る応答電流値が得られていることが分かる。よって、ポリアニリンスルホン酸を用いたグルコースセンサは、長時間高温下におかれても、応答感度に対する大きな影響を受けない（適正な熱耐性を発揮し得る）ことが分かる。

〔実施形態の作用効果〕
上述した酵素電極１０によれば、電極１上に酸化還元酵素４及び導電性ポリマー５（例えばポリアニリンスルホン酸）を含む検知層２を形成することで、好適な熱耐性を得ることができる。これによって、熱による酵素ないし試薬の機能低下、或いは機能損失を抑えることができる。このように、酵素電極１０がその運搬、保管、使用時の夫々において、好適な熱耐性を発揮することで、酵素電極１０の寿命を延ばすことができる。

なお、酵素電極１０は、例えば、上記したようなグルコース測定に適用されるバイオセンサや電子機器（例えば、測定装置）に適用することができる。或いは、酵素反応により生じた電流（電極に伝達される電子による電流）を、電極と負荷とを結ぶ供給部を通じ、負荷に電力として供給する電源装置の一部としての適用も考えられる。電子機器は、実施形態に係る酵素電極が適用されたバイオセンサを含んだ電子機器、実施形態に係る酵素電極が適用された上記装置（電源装置）を含んだ電子機器を含むことができる。上述した実施形態において説明した構成要素は、適宜組み合わせることができる。

１・・・電極
２・・・検知層
３・・・絶縁性基板
４・・・酵素
５・・・導電性ポリマー
１０・・・酵素電極

Claims

電極と、
前記電極と接触し、酸化還元酵素と、水溶性導電性ポリマーと、導電性粒子とを含む検知層と、を含み、
前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われ、
前記酸化還元酵素が、触媒サブユニットと、シトクロムを含む電子伝達サブユニットと、を含有するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＣｙＧＤＨ）であり、
前記電子授受は、前記シトクロムを含む電子伝達サブユニットと、前記電極と、の間で行われることを特徴とする、酵素電極。
前記水溶性導電性ポリマーが、ポリアニリンスルホン酸である
請求項１に記載の酵素電極。
前記触媒サブユニットが、フラビンアデニンジヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の酵素電極。
前記導電性粒子は、炭素を含むことを特徴とする、
請求項１から３のいずれか１項に記載の酵素電極。
前記ポリアニリンスルホン酸の濃度は、０．０１〜２％である
請求項２に記載の酵素電極。
前記ポリアニリンスルホン酸の官能基は、水酸基又はスルホ基である
請求項２又は５に記載の酵素電極。
前記酵素電極において、熱耐性が向上したことを特徴とする、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵素電極。
電極と、
前記電極と接触し、酸化還元酵素と、水溶性導電性ポリマーと、導電性粒子とを含む検知層と、を含み、
前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われ、
前記酸化還元酵素が、触媒サブユニットと、シトクロムを含む電子伝達サブユニットと、を含有するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＣｙＧＤＨ）であり、
前記電子授受は、前記シトクロムを含む電子伝達サブユニットと、前記電極と、の間で行われる、酵素電極を備えたバイオセンサ。
請求項８に記載のバイオセンサを含む電子機器。
電極と、
前記電極と接触し、酸化還元酵素と、水溶性導電性ポリマーと、導電性粒子とを含む検知層と、を含み、
前記検知層における直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受が行われ、
前記酸化還元酵素が、触媒サブユニットと、シトクロムを含む電子伝達サブユニットと、を含有するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＣｙＧＤＨ）である酵素電極と、
前記酵素電極での酵素反応によって生じた電流を負荷に供給する供給部と
を含み、
前記電子授受は、前記シトクロムを含む電子伝達サブユニットと、前記電極と、の間で行われる、装置。
請求項１０に記載の装置を含む電子機器。
電極上に、酸化還元酵素と、水溶性導電性ポリマーと、導電性粒子とを含む、直接電子移動によって前記酵素と前記電極間で電子授受を行う検知層を形成する、
ことを含み、
前記酸化還元酵素が、触媒サブユニットと、シトクロムを含む電子伝達サブユニットと、を含有するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＣｙＧＤＨ）であり、
前記電子授受は、前記シトクロムを含む電子伝達サブユニットと、前記電極と、の間で行われる、酵素電極の製造方法。
酸化還元酵素と、
水溶性導電性ポリマーと、
導電性粒子と
を含み、
前記酸化還元酵素が、触媒サブユニットと、シトクロムを含む電子伝達サブユニットと、を含有するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＣｙＧＤＨ）であり、
熱耐性を向上させたことを特徴とする試薬。