JPH04122849A - 酵素電極 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、酵素電極に関し、特に、血液、尿等の体液成
分中に含有する微量の生体基質濃度を測定する酵素セン
サーとして適したものである。

（従来の技術） 酵素の優れた基質特異性を利用した分析法が、臨床分析
化学、食品製造、環境化学等の分野で注目されている。

とりわけ、臨床分析化学の分野では、従来から、グルコ
ース、尿素、尿酸などを選択的に検出しうる酵素電極が
知られている。

これら酵素電極は、一般には、電極と酵素固定膜とから
構成され、酵素反応による物質変化を電極により電気信
号の変化量として読み取ることにより、その酵素が特異
的に作用する基質の濃度を測定するものである。具体的
には、下記式に従い、生成または消費される過酸化水素
、酸素等の電極活性な物質を電極でモニターすることに
より、生体基質濃度を測定しようとするものがある。

グルコースの定量を例にとると、酵素としてはグルコー
スオキシダーゼが一般に用いられ、生成した過酸化水素
を電気的にモニターすることで、グルコース濃度を測定
する。ここで過酸化水素をモニターする方法としては、
白金電極、炭素電極等を用い、一定電圧下で酸化するこ
とにより得られる酸化電流を計測することにより行われ
る。

ところが、このような原理に基づく酵素電極は、次のよ
うな問題点を含んでいる。

■上記式で明らかなように、基質が反応するためには、
化学量論的な酸素を必要とする。ところが、例えばグル
コースセンサーを例にとると、糖尿病患者の血中グルコ
ース濃度は、１５ｍＭ以上、健常者でも約７ｍＭ程度で
あるのに対し、溶存酸素量は、水の場合でも１ｍＭ、体
液ではそれ以下である。従って、糖尿病患者の血中グル
コース濃度を測定する場合、測定濃度範囲での直線性は
不可能である。

そのため、試料血液を希釈したり、何らかの方法で酸素
を補給するといった手段が構じられている。

■過酸化水素を電気的にモニターする場合、試料溶液中
に過酸化水素と同様の電位で酸化される物質、例えばア
スコルビン酸のような還元性物質が存在すると、測定′
ｇｉ流にこれら妨害物質の酸化電流が上乗せされ、測定
誤差を生じる。そこで、これら誤差を取り除くため、酵
素を固定していない電極を補償極として補正したり、酸
素、過酸化水素分子と、測定基質は透過させるが、アス
コルビン酸の如く電極活性な緩衝物質を透過させないと
いった選択透過膜を装着する必要があった。

一方、これらの問題点を解決するため、導電性高分子を
利用した酵素電極、電子メデイエータ−を利用した酵素
電極が捉案されている。前者は、ポリピロール、ポリア
ニリン等の導電性高分子の電解重合時に、酵素をモノマ
ー溶液中に共存させ、重合時に重合膜中に酵素を捕捉す
るか、あるいはあらかじめ重合した導電性高分子膜上に
公知方法により酵素固定膜を設けることにより、導電性
の酵素固定膜を得るものである。この酵素電極では、例
えばグルコースを例にとると、 酵素 グルコース□グｌレコノラクトン＋２８”＋２ｅの反応
により生ずる電子を、導電性高分子のπ電子共役系を介
して移動させることにより、酵素の電子移動を行う。こ
の方式では、溶存酸素に影響されず、グルコース濃度を
測定することができる。

電子メデイエータ−を利用した酵素電極は、カーボンペ
ースト等の中にフェロセン類、ハンゾキノン、フェリシ
アン化イオン、Ｎ−メチルツェナジニウム等の電子メデ
イエータ−を封し込め、カーボンペースト電極表面に酵
素を固定化し、適当な高分子膜で被覆したものである。

これは、グルコースセンサーでは次のような機構で濃度
測定を行うものである。即ち、グルコースが酸化される
と酵素が還元型となり、電子受容体であるメデイエータ
−へ電子移動することにより、酵素が酸化型に戻る。こ
の還元型メデイエータ−が電極反応により酸化型に戻る
際の電流により、グルコ−人濃度を測定するものである
。

従って、溶存酸素量の影響を受けないという利点の他、
この時の電極電位は前出の過酸化水素をモニターする時
の電位（Ａｇ／ＡｇＣ１対比約０．７Ｖ）　ニ比べ著し
く小さイ（Ａｇ／ＡｇＣｌ対比約０．１〜０．２Ｖ）た
め、妨害物質の酸化も起こりにくく、その結果、高精度
に測定できるという利点がある。

（発明が解決しようとする諜Ｂ） 上記の如く、酵素反応に伴い生成、あるいは消費される
物質の濃度を測定する原理に基づくセンサーは、溶存酸
素の影響、及び妨害物質の影響といった問題を有してい
る。また、酵素固定膜を酸素、過酸化水素電極に装着す
るという形態を必要とするため、微小化にも限界がある
。

一方、導電性高分子を利用して、酵素反応に伴う電子移
動を直接検知する酵素電極は、これらの問題を解決でき
る可能性はあるが、応答性が低く、応答時間が長い等の
問題がある。さらに、電解重合時に重合膜中に酵素を捕
捉するといった手法を取る場合は、固定化される酵素量
を制御することは難しく、また酵素電極として利用する
際、酵素の脱離による経時的な基質応答性の低下は避け
ることができない。

また、従来の電子メデイエータ−を利用した酵素電極で
は電導度が低く応答性、応答時間の点で不十分である他
、電子メデイエータ−をカーボンペースト中に分散させ
た形態をとるため、電子メデイエータ−の溶出、脱離に
伴う経時的な応答性の低下といった問題を含んでいる。

本発明は、以上のことに鑑みて、溶存酸素の影響を受け
ず、また妨害物質の影響の少ない酵素電極とするために
、酵素反応に伴う電子移動を直接検知する方式をとり、
なおかつ、経時安定性に優れ、長期にわたり、高精度な
応答を与える酵素電極を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、有機電荷移動錯体を含有する導電性材料
が、電気伝導性に優れ、安定な電極材料として作用する
ことを見い出し、この新規な電極材料に生体触媒を固定
化することにより、酵素反応に伴う電子移動を直接検知
する酵素電極を提供しうるとの着想に基づいて、本発明
の酵素電極を完成させた。

本発明は、導電性基体と、この基体表面に設けた有機電
荷移動錯体結晶を含有するｓｔ性被被膜を有し、この導
電性被膜中および／またはその表面上に酵素が固定化さ
れていることを特徴とする酵素電極、を要旨とする。

（作用） 本発明の酵素電極において使用する電極は、導電性基体
と、この基体表面に設けた有機電荷移動錯体結晶を含有
する導電性被膜とから構成される。

ｓｉｉ性基体としては、銅、銀、白金、金等の金属やカ
ーボン電極の他、これらの導電性材料からなる導電層を
蟇着等の手段により表面に設けた基体、あるいはこれら
の導電性材料の粉末を含有するペーストから作成した基
体等が使用できる。

有機電荷移動錯体結晶を含有する導電性被膜は、絶縁性
高分子フィルム内に、有ｍ電荷移動錯体結晶を、このフ
ィルムが導電性となるように含有させたものである。例
えば、絶縁性高分子フィルムの厚さ方向にこのフィルム
を貫通するように有機電荷移動錯体結晶を成長させた被
膜が導電性を示し、現時点では好ましい。

ここで、有機電荷移動錯体（以下、有機ＣＴ錯体と称す
る）とは、有機電子受容体と電子供与体とから、両者の
間の電荷移動反応に伴い形成される化合物である。

この有機ＣＴ錯体の形成に用いる有機電子受容体として
は、特に制限されないが、シアノメチレン官能基を有す
る化合物が好ましく、中でもジシアノメチレン官能基と
、キノンあるいはナフトキノン骨格とを有する化合物が
好適である。このうちでも特に、７，７，８．８−テト
ラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）はＣＴ錯錯体形成炉
強く、得られる有機ＣＴ錯体の電気伝導度が高いため応
答時間、応答性で有利である。また工業的にも比較的入
手が容易であることから好適である。

有＠ＣＴ錯体の形成に用いる電子供与体としては、使用
する有機電子受容体と、導電性を有するＣＴ錯体を形成
しうるものであれば、特に制限されるものではなく、有
機、無機のいずれでもさしつかえない、具体的には、無
機材料としては銅、銀、コバルト、ニッケル、鉄、マン
ガンなど、また有機材料としては、テトラチアフルバレ
ン、テトラセレノフルバレン等のテトラセン類、及びそ
の誘導体、あるいは２，２゛−ビスピリジニウム、Ｎ−
メチルモノリニウム等、公知の電子供与体を使用するこ
とができる。

有機ＣＴＴ体結晶を含有させる絶縁性高分子としては、
有機電子受容体と電子供与体とのＣＴＴ体化反応を妨げ
ずに結晶を成長させることができ、適度な電気絶縁性を
有し、かつＣＴ錯体形成時に使用する有機電子受容体溶
液の溶剤に対して著しい溶解、膨潤等を起こすことのな
い、フィルム形成性のポリマーが望ましい。このような
ポリマーとしては、ポリビニルブチラール、ポリエステ
ル、ポリアミド、ポリエステルアミド等の熱可塑性ポリ
マーが例示され、これらの１種または２種以上を使用で
きる。

上記絶縁性高分子としては、後述の酵素固定化方法に応
じ、また基質の拡散性等を考慮して適宜ポリマーを選択
でき、例えば、ポリビニルブチラールは、水不溶性であ
りながら親水性、吸水性を有し、しかも非常にミクロな
ボアを有するため、酵素の固定化に有利である。

有機ＣＴｔｉＦ体結晶を上記絶縁性高分子フィルム内で
フィルム厚さ方向に成長させる方法としては、例えば以
下のような方法が可能である。

まず基体表面に電子供与体層を設けるか、あるいは電子
供与体としても機能する銅板等の基体を使用し、この電
子供与体上にポリマー被膜を形成させる。この場合の基
体は、後述するように導電性である必要はない。被膜の
形成は、一般の塗布方法によって行うことができ、例え
ば、ポリマーを適当な溶剤に溶解したポリマー溶液、あ
るいは溶融ポリマーをそのまま、ロールコータ−、ナイ
フコーター等により塗布することができる。

電子供与体と有機電子受容体とのＣＴ錯体化反応時にお
ける反応速度、および得られる有１ＩＣＴ錯体微結晶を
含有するフィルムの電気伝導度を考慮すると、ポリマー
被膜の膜厚は通常０．０１〜５０μｍの範囲内であり、
好ましくは０．１〜１０μ−である。

ポリマー被膜の膜厚が厚すぎると、続いて行うＣＴ錯体
化反応時において、有機電子受容体のポリマー膜中への
浸透速度が低下し、有機ＣＴ錯体結晶がポリマーフィル
ムを貫通するまで成長するのに長時間を要することにな
る。また、ポリマー被膜の膜厚が薄すぎると、ピンホー
ルの発生等を惹起することになり、その結果、電極材料
として使用する際、基体材料の溶出といった問題を生ず
ることがある。

ポリマー被膜の膜厚は、使用するポリマー溶液の量やポ
リマー濃度を変化させることにより、任意の厚さとする
ことができる。

このようにして表面に電子供与体層を有する基体表面を
ポリマーで被覆した後、必要に応じて全体を乾燥する。

次いで、このポリマー被膜表面の一部、ないし全部を有
機電子受容体を含有する溶液と接触させる。これにより
、溶液中の有機電子受容体は、ポリマー被膜の中に拡散
、浸透し、基体の表面を構成する電子供与体との間でｃ
ｔｔＷ体化反応化反応し、有＠ＣＴ錯体結晶がポリマー
フィルムの基体側から徐々に成長し、やがてポリマーフ
ィルムを貫通し、目的とする有機ＣＴｔｆ体含有フィル
ムが得られる。

有機電子受容体含有溶液の調製に使用する溶媒としては
、極性のある非プロトン溶削、例えばアセトニトリル、
ジオキサン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチル
スルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、メチルエ
チルケトン等が好適である。

この溶液における有機電子受容体の濃度は、溶剤１００
重量部に対して通常０．０１重量部〜飽和濃度、好まし
くは０．１重量部〜飽和濃度が適当である。

有機ＣＴ錯体の形成は、通常、１０〜３０°Ｃの温度で
行うが、用いる有機電子受容体と基体表面の電子供与体
の組み合わせによっては、ＣＴ錯体化反応が急激に進み
、緻密で均一な目的フィルムが得にくい場合がある。そ
のような場合は、必要に応して溶液、基体、雰囲気温度
を下げたり、溶液の濃度を低くすればよい、また逆に、
錯体化反応が遅く、有＠ＣＴ錯体結晶がフィルムを貫通
するまで成長するのに長時間を要する場合は、必要に応
じて、加熱することができる。

有機電子受容体含有溶液の接触時間は、用いる有機電子
受容体と電子供与体との組み合わせや目的とするポリマ
ー被膜の膜厚に大きく依存するが、一般に１０秒から１
時間程度である。

このようにして、基体上に、絶縁性高分子被膜層内にそ
の厚さ方向に貫通するように有１１ＣＴ錯体結晶を成長
させた導電性被膜が形成される。導電性被膜は、必要に
応じ洗浄、乾燥する。

使用した基体が導電性の場合は、上記導電性被膜が形成
された基体を、そのまま使用しても、この導電性被膜を
フィルムとして基体から剥離した後、他の導電性基体に
装着して電極材料とすることも可能である。使用した基
体がｉｔ性でない場合は、被膜を剥離して導電性基体に
装着して電極材料とする。

上記のようにして得た電極の、導電性被膜中あるいはそ
の表面上に酵素を固定して、本発明の酵素電極を得る。

本発明の酵素電極において、導電性被膜中または表面に
固定する酵素としては、対象とする物質や目的とする化
学反応に応じ、酵素の基質特異性及び反応特異性を考慮
して適宜選択することができる。使用しうる酵素は、特
に制限されないが、例えばグルコースオキシダーゼ、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラ
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダー
ゼ、ペニシリナーゼ等が挙げられる。また、酸化還元酵
素と補酵素との組み合わせも可能である。

これらの酵素を導電性被膜に固定化するには、酵素を導
電性被膜に公知の固定化方法で直接固定化することがで
き、例えば、担体結合法、共有結合法、イオン結合法、
吸着法、架橋法などの固定化方法を用いることができる
。また、公知方法で得た酵素固定膜を導電性被膜に結合
させてもよい。

この場合、酵素から有機ＣＴ錯体へのスムーズな電子移
動性を確保して応答性をよくするには、酵素固定膜は薄
い方がよく、また必ずしも均一な膜である必要はなく、
酵素と有機ＣＴ錯体が直接接触するようにすればよい。

このようにして得られた本発明の酵素電極は、導電性基
体上に設けた導電性被膜上に酵素が接触するように固定
させた構造であり、従来の過酸化水素電極、酸素電極等
に比べ構造的に簡単であり、小型化が可能である。

本発明の酵素電極で使用する有ＷＩＣＴ錯体結晶を含有
する導電性被膜は、酵素との間で電子移動が容易である
のみならず、従来電子メデイエータ−として使用されて
いたフェロセン類等と比較して、その結晶のポリマー分
散膜の電気伝導度は著しく大きい。これは、これら有機
ＣＴ錯体が発達した針状結晶を構成するため、同し含有
量でも膜中の導電パス数が多くなり、電子移動に有効に
寄与するためと考えられる。

更に、これらの錯体結晶を膜厚方向に結晶成長させるこ
とにより、より有効に電子移動がなされる。

これらの観点から、本導電性被膜は酵素電極に使用する
電極材料として好適であり、従来の電子メデイエータ−
を利用した電極あるいは導電性高分子電極に比べて、応
答性、応答時間の点で優れている。

また、従来の電子メデイエータ−を含む電極では電子メ
デイエータ−の溶出、脱離が避けられないが、本発明の
電極材料ではそのような欠点はない。

本発明の酵素電極で測定しうる物質としては、グルコー
ス等の糖分、乳酸、アルコール等の血液や尿中の微量生
体物質や、食品加工プロセスにおける糖分、アルコール
分等がある６本発明酵素電極を用いれば、上記のような
物質を選択的に高精度で、しかも長期にわたって繰り返
し分析することが可能である。また、物質の測定に限ら
ず、バイオリアクター等に使用することも可能である。

実施例１ 厚み０．５１の銅板の片側に、電極部（３−麟×３１Ｉ
−）及び端子部を除いてエポキシ樹脂でモールドしたも
のを、５３１量％硫酸純水で洗浄し、乾燥した。

ポリビニルブチラール樹脂（商品名：エスレックＢ、　
ＢＸ−Ｌ　、槽水化学工業■製）の５重量％エチルアル
コール溶液を調製し、この溶液３０μｌを、上記銅板の
電極部に滴下し、乾燥し、ポリマー被覆銅電極を得た（
ポリマー膜厚：５μｍ）。

７．７．８．８−テトラシアノキノジメタン（試薬、キ
シダ化学製、以下ＴＣＮΩと略す）　１．ＯＪ！をアセ
トニトリル（試薬、スペクトル用）３０蒙！中に加えて
ＴＣＮＱの飽和溶液を調製した。

このＴＣＮＱ飽和溶液中に、上記ポリマー被覆銅電極の
電極部を浸漬し、１０分間放置した。浸漬から１０分後
には、ポリマー表面に針状微結晶の析出が確認された。

こうして得られた有機ＣＴ錯体微結晶含有ポリマーが被
覆された電極をグルコースオキシダーゼ（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ由来、Ｓｉｇｍａ社製、７ｙｐ
ｅ　Ｖｌｌ）１０ｅｎｇ／ｍ　ｌ水溶液に浸漬し、４℃
で２４時間放置して酵素固定化電極を得た。

上記電極を作用極とし、バッチ式測定装置の測定セルに
装着し、１００＋Ｍ　リン酸緩衝液（ｐｈ　７．０）に
浸漬した。１ｃｍ２白金板を対向電極、銀／塩化銀電極
を参照電極とし、０．１５Ｖ（Ａｇ／ＡｇＣ］対比）の
電位を印加して、第１表に示す各グルコース濃度に対す
る応答電流を測定した。その結果を第１表に示す。この
ように、測定濃度範囲で良い直線関係が得られた。

次に、同じ測定装置、同し溶液を用い、窒素バブルを３
０分行った後、第１表に示す各グルコース濃度に対する
応答電流を測定した。その結果を第１表に示す。この結
果から、本酵素電極の応答電流は、溶存酸素濃度の影響
をほとんど受けていないことがわかる。

さらに、緩衝液を入れ換えて、０．１Ｍアスコルビン酸
を含む１００−一リン酸緩衝液（ｐ）ｌ　７．０）を用
い、同様に測定を行った。その結果を第１表に示す。

また、このセンサーをリン酸緩衝液中３０日室温放！後
においても、初期の約８０％の応答性を維持しており、
保存性に優れたものであった。

第１表 （発明の効果） 本発明の酵素電極は、酵素反応に伴う電子移動を直接検
知する方式をとるので、溶存酸素の多少に影響を受けず
、また電気化学的妨害物質に影響されることもない。し
かも応答寿命に優れた酵素電極である。従って、酵素セ
ンサーとして長期にわたり正確な測定を行うことができ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）導電性基体と、この基体表面に設けた有機電荷移
   動錯体結晶を含有する導電性被膜とを有し、この導電性
   被膜中および／またはその表面上に酵素が固定化されて
   いることを特徴とする酵素電極。
2. （２）有機電荷移動錯体結晶を含有する導電性被膜が、
   絶縁性高分子フィルム内に、このフィルムの厚さ方向を
   貫通するように有機電荷移動錯体を結晶成長させたもの
   から形成される請求項１記載の酵素電極。