JP6046636B2

JP6046636B2 - プロバイオティクス果実飲料

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Publication number: JP6046636B2
Application number: JP2013549838A
Authority: JP
Inventors: ホルンベークティナ; トレビエンゴットリエブカロリネ; マリングトールセンティナ; ソマーペーター
Original assignee: セーホーエル．ハンセンアクティーゼルスカブ
Priority date: 2011-01-21
Filing date: 2012-01-23
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2032-01-23
Also published as: JP2014502849A; MX352698B; US20130295226A1; MX2013008050A; EP2665378B1; CN103857297A; WO2012098254A1; CN103857297B; JP2017006138A; ES2811978T3; KR20140005988A; KR101972140B1; US9693578B2; EA201391067A1; EP2665378A1; AR084912A1; BR112013018626A2; EA027964B1

Description

本発明は生存数の高いプロバイオティクスから成る果実飲料の製造方法に関する。本発明はさらに、プロバイオティクス果実飲料の製造のための酸適応プロバイオティクス細菌の使用又は方法により得られる、プロバイオティクス果実飲料に関する。

一部の細菌は、プロバイオティックな性質を有する、即ち、十分な生存数を接種した場合に宿主の健康状態に利益をもたらすことが知られている。特にラクトバシラス（Lactobacillus）及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する細菌株は、多くの研究の対象となっており、これらの研究により、種々の分野において、且つ特定の生理学的作用について予防的な臨床効果を示すことについて多くの研究テーマとなっている。斯かるプロバイオティクスは概ね安全であり、しかも注目すべきことに、腸内細菌の適切な活動を促進することができる。細菌がプロバイオティクスとしての要件を満たすには、消費者の健康に有益な効果を及ぼすことを示す明確な証拠に加え、腸内で生存し、コロニーを作り、そして食品加工及び保存の過酷な工程において生存できることが必要である。臨床的証拠が示すところによれば、プロバイオティクス細菌の１日当たりの摂取量が最低10⁹ＣＦＵでプロバイオティクスとしての効果が保証される。

プロバイオティクス製品市場は成長を続けている。プロバイオティクスは乳酸菌の培地に比較的良く適応するため、特に乳製品に用いられる。現在、オレンジジュースや他の同様の果実ジュース、並びに果実ピューレ及び果実汁を含む飲料は、果実とプロバイオティクスとの両方の利点を併せ持つ、重要なプロバイオティクス培養物のビヒクルとして認識されてきている。加えて、乳成分を含まない果実飲料は、例えばＬカゼイ431^登録商標（L. casei 431） (Chr. Hansen,Hoersholm, Denmark).のような低アレルギー性バイオティクスの優れた摂取方法である。

しかし、基準となるプロバイオティクス原料を、例えばオレンジジュースに加えた場合、果実ジュースの酸性環境は、初期細胞数の著しい減少を引き起こす。プロバイオティクス培養物の果実飲料への応用を成功させるには、保存期間中は十分なプロバイオティクス細胞濃度が保証されなければならない。即ち、オレンジジュース中又は他の果実飲料においてプロバイオティック培養物の生存率を上昇させることは、非常に重要であると考えられている。

十分な量の生きたラクトバシリ（Lactobacilli）を含む果実飲料の製造方法は公知であり、例えば欧州特許ＥＰ0113055は、静菌性の成分を除去するために、果実ジュースを固体薬剤へ移送し接触させ、次いでｐＨ4.0以下の果実ジュース中でラクトバチラス（Lactobacillus）を増殖させることを含む方法に関する。

しかし、そのような果実飲料においては、ガス及び異臭の生成を誘導し、果実飲料を消費に適さないものとしてしまう、菌の生長及び/又は活性が確認される可能性がある。

米国特許出願ＵＳ2010/0086646は、生きたプロバイオティクス及び食用のプロトン化弱モノアシッド(monoacid）を含む、ｐＨ３〜４の生鮮植物ジュース及び/又は乳を主原料とする食品を開示する。ここで、モノアシッド(monoacid）は、プロバイオティクスが当該食品内で好ましくない味及び/又はガスを生成することを防ぐ。

国際特許出願WO 2010/132017は、少なくとも１種のプロバイオティクス菌株、及びアセロラ、ザクロ、クランベリー、アロニア、ブラックカラント、クロウメモドキ又はエルダベリーから選択される少なくとも１つのガス生成低減物を含むプロバイオティクス果実飲料を対象とする。

モノアシッド(monoacid）添加は食品の官能特性に影響し、またプロバイオティクス細菌の生存率に悪影響を及ぼすことも確認されてきた。また、酸生成低減剤の添加も、プロバイオティクス細菌の生存率に悪影響を及ぼすと考えられる。さらに、静菌性化合物除去剤、並びに/若しくは、食品中の異臭及び/又はガスの発生低減剤を添加することは、コスト高にも繋がる。

実際、当該技術分野では、高いプロバイオティクス値を有し、悪味又はガス発生の無い、良好な味を示し、長期保存が可能な、プロバイオティック果実飲料の新たな製造方法が依然として求められている。特に、固体薬剤、モノアシッド、又は果実飲料の官能特性に影響し得るその他の化合物の添加を含まない方法が求められている。

本発明は、果実飲料へ接種する前に酸適応化したプロバイオティック菌を含む果実飲料の製造のための代替方法を提示するものである。

本発明の目的は、果実飲料の酸性環境下でも生存し得る強固なプロバイオティック細菌を含む、プロバイオティック飲料を提供することである。もう一つの本発明の目的は、良好な味のプロバイオティック果実飲料を提供することである。さらに他の本発明の目的は、長期保存可能なプロバイオティック果実飲料を提供することである。

過剰量のプロバイオティクス細菌を添加することなく高いCFU/mlのプロバイオティクス細菌を得るために、本発明の発明者等はプロバイオティクス細菌の酸適応化を進め、その結果、低いｐHに対し強固なプロアバイオティクス細菌を完成した。

本発明は、プロバイオティック細菌を、ｐH調整剤を用いることなく酸性条件下で一定期間培養することにより、培養における収率に著しい影響を及ぼすことなく、酸適応化し得るものであるとの知見に基づく。

酸適応プロバイオティクス細菌は、低いｐH（ｐH4.2未満）の果実飲料に加えるプロバイオティクス組成物として極めて有用である。プロバイオティクス細菌と、果物の高い栄養価との組合せにより有益な効能を発揮する。

本発明の方法は、果実飲料に対し、プロバイオティクス飲料の官能特性に影響し得る化学物質を加えることを含まない。

従って、第１の観点において、本発明はプロバイオティクス実飲料を製造する方法であり、当該方法は以下の方法を含む：
(a)少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株を増殖中に酸適応化させ；
(b)工程(a)で得られた少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を、果実飲料中に接種し；
(c)任意により、プロバイオティクス果実飲料として包装する；
ことを含む、製造方法。

また、本発明のある実施形態において、プロバイオティック細菌を酸適応化する工程（a）は以下により行われる：
(i) 少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を、pH安定剤の非存在下、25℃から43℃の範囲で、好ましくは25℃から40℃の範囲で、初期pH値が約6.0〜約7.0である好適な培地中で増殖させ、ここで当該培地は、当該培地のpH値を約5.0〜約4.0まで到達させることが可能な組成を有し；
(ii) 少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を回収し；
(iii)任意により、少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を濃縮し；
及び、
(iv)任意により、少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を凍結又は凍結乾燥する。

より好ましい実施形態では、工程(i)の培地は、接種後少なくとも８時間で、当該培地のpH値を約5.0〜約4.0まで到達させることが可能な組成を有する。

さらに好ましい実施形態では、酸適応プロバイオティクス細菌株は工程(iii)において濃縮され、例えば酸適応細菌を回収後に行う。

本発明の第２の観点は、第１の観点の方法によって得られるプロバイオティック果実飲料に関する。また、本発明は、ラクトバシラスパラカゼイパラカゼイ亜種CRL431株（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei strain CRL431 、Ｌ．カゼイ431^登録商標（L. casei 431））を含むプロバイオティック果実飲料に関する。

本発明の第３の観点は、酸適応化プロバイオティクス細菌株培養物を得る方法に関し、当該方法は以下の工程を含む：
(a) 少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を、pH安定剤の非存在下、25℃から43℃の範囲で、好ましくは25℃から40℃の範囲で、初期pH値が約6.0〜約7.0である好適な培地中で増殖させ、ここで当該培地は、当該培地のpH値を約5.0〜約4.0まで到達させることが可能な組成を有し；
(b) 少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を回収し；
(c)任意により、少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を濃縮し；
及び、
(d)任意により、少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を凍結又は凍結乾燥する。

より好ましい実施形態では、工程(a)の培地は、接種後少なくとも８時間で、当該培地のpH値を約5.0〜約4.0まで到達させることが可能な組成を有する。

特に好ましい実施形態では、酸適応プロバイオティクス細菌株は工程（c）において濃縮され、例えば酸適応プロバイオティクス細菌を回収後に濃縮される。

第４の観点は、本発明の第３の観点の方法により得られる、酸適応プロバイオティクス細菌株の培養物に関する。

第５の観点は、本発明の第４の観点により得られる、酸適応プロバイオティクス細菌株の培養物の、プロバイオティクス果実飲料の製造のための使用に関する。

図１は、L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）株によるMRS培地(ディフコ（Difco）)の酸性化条件を示す。酸適応化細胞はｐH5.0、ｐH4.5、及びｐH4.0において遠心分離により回収した。

図２は、大スケール産生中のL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の細胞数を表す。

図３は、産生時に酸未適応の（菱形）、或いはｐH4.0（三角形）又はｐH5.0（四角形）に酸適応させたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を、イチゴ／バナナジュースに対して低濃度（5x10⁷ CFU/ml、黒塗）又は高濃度（1x10⁸ CFU/ml, 白塗）で加えた場合の細胞数を示す。

図４は、産生時に酸未適応の（菱形）、或いはｐH4.0（三角形）又はｐH5.0（四角形）に酸適応させたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を、トロピカルジュースに対して低濃度（5x10⁷ CFU/ml、黒塗）又は高濃度（1x10⁸ CFU/ml, 白塗）で加えた場合の細胞数を示す。

図５は、産生時に酸未適応の（菱形）、或いはｐH4.0（三角形）又はｐH5.0（四角形）に酸適応させたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を、赤色果実ジュースに対して低濃度（5x10⁷ CFU/ml、黒塗）又は高濃度（1x10⁸ CFU/ml, 白塗）で加えた場合の細胞数を示す。

図６は、産生時に酸未適応の（対照）、或いはｐH4.0、ｐＨ４．５又はｐH5.0に酸適応させたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を、１００％オレンジジュースに対して１．５×１０⁸CFU/mlで加えた場合の細胞数を示す。

図７は、産生時に酸未適応の（対照）、又は、ｐHがｐH4.0、4.5又は5.0に酸適応させたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を、−５０℃で冷凍ペレットとして保存し、解凍した培養物の生存性を一定時間ごとに混釈平板法により試験した場合の細胞数を示す。

図８は、産生時に酸未適応の（対照）、又は、ｐHがｐH4.0に酸適応させたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を、−５０℃で６か月間冷凍ペレットとして保存し、その後８℃で保存したオレンジジュースに添加した場合の細胞数を、ｘ軸に表す時間の経過に沿って示す。

図９は、L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の細胞数について、100％オレンジジュースに対し、産生時に酸未適応の（四角形）、又は、ｐH4.0に酸適応させた菌（三角形）につき、8℃で保存した場合の細胞数を示す。

定義
本文中の「果実ジュース」なる用語は、新鮮な果実を、熱や溶媒を加えることなく、機械的に絞る又は潰すことにより自然に得られる液体のことをいう。「果実ジュース」は１種類の果物からなっていてもよく、又は１以上の果物の混合物からなっていてもよい。

本文中の「果実ドリンク」なる用語は、0〜29％の果実ジュースを含む飲料を指す。

本文中の「ネクター」なる用語は、30〜99％の果実ジュースを含む飲料を指す。

本文中の「ピューレ」なる用語は、熱や溶媒を加えることなく、粉砕し、押し潰し、及び/又は裏ごしし半固体の又は柔らかいペースト状の稠度とした果実のことを指す。「ピューレ」とは100％果実より製造され、単に果実のジュースから製造されるものとは対照的に区別される。

本文中の「果実飲料」なる用語は、果実ジュース、果実濃縮物及び/又は果実ピューレを含む飲料をいう。ここで、「果実飲料」なる用語は、本明細書で定義される「果実ジュース」「果実ドリンク」「ネクター」を含む。「果実飲料」は果肉を含むものであってもよく、遠心分離などのような操作により果肉が除去されたものであってもよい。さらに、果実飲料はエンバク、大豆、アーモンド、ホエイ及び/又は非発酵牛乳を、例えば乳粉末の形態で含んでいてもよい。特に好適な実施態様によれば、本発明の果実飲料は、牛乳等の乳成分を含まない。

本文中の「酸適応」（細菌）は、培養途中に徐々にｐH値を下げる環境に曝すことにより低ｐH耐性化された生きた細菌のことをいう。そして、酸適応プロバイオティクス細菌株の製造工程は、通常、ｐH値を徐々に低下させる条件、例えばｐH4.0〜5.0に達する条件における、当該菌株の培養を含む。好適に自身が酸適応化を受けるプロバイオティクス細菌は、培地中で累積して増殖する間に酸を産生する。より好適には、酸産生プロバイオティクス細菌は乳酸菌群に属する。これに代えて、また、酸適応化を受けるプロバイオティクス細菌が自発的に酸を産生しない条件でも、外からの酸の添加によりｐH低下が達成される。

酸適応化工程は、好ましくは、プロバイオティクス細菌を、ｐＨ安定化の非存在下、培地中で増殖させることにより行う。「ｐＨ安定化の非存在下」との表現は、ｐＨが徐々に低下するのを防ぐ手段を講じないということを意味する。例えば、ある実施態様では、プロバイオティクス細菌を培養する培地は、酸の生成や増加に対してｐＨを一定に保つことのできる緩衝剤を通常含まない。代わりに、開始時にある一定濃度の緩衝剤を含む場合は、緩衝剤が用い尽くされるまで培養を継続させ、培養期間中はさらなる緩衝剤の追加は行わないとしてもよい。特に、低下したｐＨを中和させるために培養期間中に通常の化合物を加えることはない。

「異臭」は食品中の異常な風味を意味する。「異臭」は消費者によって不快であり、そのため不要である。果物の性質に起因するいわゆる「良い」香りもまた製品中から感知し得るが、本発明による「異臭」には含めない。

本文中でプロバイオティクス果実飲料を「包装する」との用語は、例えば、プロバイオティクス果実飲料が消費者又は消費者グループにより摂取することができるように、製品を最終的に包装することに関する。適切な包装は、瓶、パック又はそれに類似のもであり、適切な量は、より好ましくは、例えば10〜5000mlであり、実際は50ml〜1000ml、例えば200〜1000ｍｌ等が好ましい。

「プロバイオティクス細菌」との用語は、消費者において健康増進効果の促進を目的として消費者へ十分の量が摂取される、生きた細菌のことを意味する。プロバイオティクスは個別の投与形態、例えば、カプセル、懸濁液、及びそのようなものにより投与される。それに代えて、プロバイオティクス細菌は、食品や栄養サプリメントの形で投与される。プイロバイオティクス細菌は、摂取後に消化管内の環境で生存することができ、消費者の腸内でコロニーを形成する。本発明において、プロバイオティクス細菌として、異なる型の細菌が用いられ、例として、ラクトバシラス属の細菌（genus Lactobacillus）、例えばラクトバシラスアシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラスパラカゼイ（ Lactobacillus paracasei）、ラクトバシラスラムノサス（ Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラスカゼイ（ Lactobacillus casei）、ラクトバシラスデルブルエキ（ Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバシラスラクティス（Lactobacillus lactis）、ラクトバシラスプラタルム（ Lactobacillus plantarum）、ラクトバシラスロイテリ（ Lactobacillus reuteri）、及びラクトバシラスジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium,）属の細菌、例えば、ビフィドバクテリウムアニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウムブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウムインファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウムロングン（Bifidobacterium longum）等を含む。また、プロバイオティクス細菌株は、他の属由来のもの、例えばエスケリキア（Escherichia）及びバシラス（Bacillus）についても述べられてきた。

本文中、「突然変異体（mutant）」との用語は、本発明の菌株（又は親株）に由来する、又は由来する可能性のある株であって、例えば遺伝子工学、放射線照射及び/又は化学的処理等の手段により変異したものと解されるべきである。また、突然変異体は自然発生的にも変異が起こる可能性がある。好ましくは、変異体は機能的に等価の変異体であって、例として、親株と比較して実質的に同等か、又は進化した性質（例えば、香りに関すること、酸性化後、酸性化速度、及び/又は酸性化能力）のものが挙げられる。そのような変異体は、本発明の一部分を構成する。特に、「変異体」との用語は、突然変異原となる化学物質、例えばメチルエチルスルホネート（ＥＭＳ）又はＮメチル-Ｎ-ニトロソ-Ｎ-ニトログアニジン（ＮＴＧ）による処置、ＵＶ照射による処置、等を含む任意の従来から用いられる変異生成処置による変異、又は自然発生的に起こる変異によって得られた菌株を意味する。変異体を複数の変異生成処置に供してもよい（ここで個々の処置は、１つの変異化工程に次ぐスクリーニング/選別工程であると理解される）。しかし、現在のところ、実施する処置（又はスクリーニング/選別工程）の数は２０未満、又は１０未満、又は５未満であるのが好ましい。ここでは、突然変異体は、親株と比べて、細菌ゲノム中の5％以下、又は1％以下、又は0.1％以下の核酸塩基が、他の核酸塩基に伴って移動又は消失することが好ましい。

本文中、「変種（variant)」なる用語は、本発明の菌株と機能的に等価な菌株として理解されるべきであり、例として、実質的に同等、又は進化した性質（例えば香りに関すること、酸性化後、酸性化速度、及び/又は酸性化能力）が挙げられる。それらの変種は、適切なスクリーニング技術を使用することにより同定され、本発明の一部分を構成する。

本発明の説明（特に添付の特許請求の範囲）中、冠詞（a, an, the）及び同様の指示語は、文中で別途指示する場合、或いは明らかに文意に矛盾する場合を除き、単数及び複数の両方を含むものとする。また、「構成する」(comprising)「有する」(having)及び「含む」(containing)の語は、特記される場合を除き、制限のない（例えば「含む」を意味するがそれに限定されるものではない）語と解釈される。

本明細書中の数値範囲の記載は、特段の指示がない限り、範囲内にある個々の数値を個別に記載せず、簡略化して表記したものであり、これらの個々の数値は各々、個別に記載するのと同様に、本明細書中に組込まれる。本明細書で述べられるすべての方法は、特段の指示がない限り、又は明らかに文意に矛盾しない限り、適切な任意の順序で実施される。ここで、任意の全ての例、又は例示的表記（「例えば」（such as）等）は、本発明をより理解しやすくするためのものにすぎず、特許請求の範囲によって別途特定された発明に、何ら限定を加えるものではない。明細書中の何れの記載も、特許請求の範囲に記載されていない何らかの要素を、発明の実施に必須の要件であると示すものとして解釈してはならない。

プロバイオティクス菌株、例えばラクトバチラス（Lactobacillus）及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の菌株は、飲料に用いられる。しかし、それらは酸性環境に敏感であり、ｐＨ値が4.2以下の培地に接種した場合、細胞の生存数は急激に減少する。

本発明者等は驚くべきことに、酸適応プロバイオティクス菌株を用いることにより、果実の酸のため通常のｐＨが３〜４と低い範囲である果実飲料中でも生存率が顕著に増加することを見出した。果実飲料中、酸適応プロバイオティクス細菌の生存能力は低ｐＨ値、10週間の冷蔵保存においても実質的に影響を受けることはなく、細菌の冷凍保存の間、酸性条件下における高い生存能力が維持された。

さらに、酸適応プロバイオティクス細菌を、赤色果実、トロプカルフルーツ及びストロベリー/バナナのような果実飲料に添加した場合、異臭は確認されなかった。

実際、第１の観点において、本発明は、果実飲料に少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌を接種することによる、プロバイオティクス果実飲料の製造方法に関する。

本発明の使用に好適な果実飲料の例は、低いｐＨ値を示すものであり、特に、シトラス果実のジュース、例えばオレンジジュース、ブドウジュース、ライムジュース、マンダリンジュース及びそれらの混合物が挙げられる。果実飲料の他の実施例は、リンゴジュースからなる果実飲料を含む。

本発明の使用に好適な果実飲料の例は、果実ジュース、濃縮果実ジュース、果実ドリンク及び果実ネクターであり、任意に果実ピューレ及び/又は水を含む。

果実飲料中の果実ジュース及び/又は果実ピューレの含有量は、通常、約20〜約99.99重量％であり、好適には、約30〜95重量％であり、さらに好適には、約40〜90重量％であり、より好適には、約50〜80重量％であり、最も好適には、60〜70重量％である。

ある実施形態では、果実飲料は、実質的に乳成分を含まないが、野菜ジュース、野菜濃縮物及び/又は野菜ピューレを含む。

ある実施形態では、当該果実飲料のｐＨ値は3.2〜4.2、好適には3.5〜3.9の範囲内である。

ある好適な実施形態では、果実飲料の全体又は一部は、イチゴ、バナナ、ブドウ、オレンジ、マンゴ、モモ、ブルーベリー、パイナップル、ライム、ラズベリー及びブラックカラント、並びにそれらの混合から成る群から選択される果物より製造される。

本発明のより好適な実施形態によれば、果実飲料は、イチゴピューレ、バナナピューレ、ブドウピューレ、オレンジピューレ、マンゴピューレ及びブルーベリーピューレを含む。

本発明のより好適な実施形態によれば、果実飲料は、パイナップルジュース、オレンジジュース、バナナピューレ、マンゴピューレ及びライムジュースを含む。

本発明の更に好適な実施形態によれば、果実飲料は、ラズベリーピューレ、ブラックカラントジュース、ブルーベリーピューレ、ブドウジュース、イチゴピューレ及びバナナピューレを含む。

少なくとも１種のプロバイオティクス細菌は、適切な培地上ｐＨ安定剤の非存在下で培養することにより酸適応化されたものである。ある実施形態において、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌は、ｐＨ安定剤の非存在下、25〜43℃の範囲で、好ましくは25〜40℃の範囲で、初期ｐＨ値が約6.0〜7.0である好適な培地中で増殖させ、ここで当該培地は、当該培地のｐＨ値を約5.0〜4.0まで到達させることが可能な組成を有し、好適には少なくとも8時間の培養後、それにより少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を製造し、該少なくとも一種の酸適応プロバイオティクス細菌株を回収し、好ましくは該少なくとも一種の酸適応プロバイオティクス細菌株を濃縮し、該少なくとも一種の酸適応プロバイオティクス細菌株を任意に凍結又は凍結乾燥させる。

プロバイオティクス細菌の酸適応化に用いる培地は、好適には、プロバイオティクス細菌培養中、当該培地のｐＨ値を約5.0〜4.0まで到達させることが可能な組成を有する。これは、プロバイオティクス細菌により、又はその代わりに継続的に又は段階的に培養物中に酸を添加することにより、酸が生成するため培地のｐＨ値が減少することを意味する。培地は、ｐＨ約5.0〜4.0において、分解するか又は無効又は毒性を示す物質を必須のものとして含まない。培地中に必須の要素とは、プロビオティクス細菌の培養に必要とされる化合物であって、例えば栄養、炭素及び窒素源、ビタミン類又はこれらに類似するものをいう。

好適な実施態様において培養に用いられる培地は、少なくとも0.4%の酵母抽出物及び２％の糖を含む。

プロバイオティクス細菌、特に乳酸菌について培養に用いられ得る好適な培地は、周知技術である。例えば、プロバイオティクス細菌のうち乳酸菌に対して用いられる場合、任意の市販の乳酸菌培養用の培地、例えばラクトバクシリＭＲＳ（Lactobacilli MRS, de Man, Rogosa and Sharpe)培地を用いることができる。プロバイオティクス細菌の培養に用いられ得る典型的なＭＲＳ培地組成は、ペプトン1.0％、肉抽出物0.8％、酵母抽出物0.4％、グルコース2.0％、酢酸ナトリウム３水和物0.5％、ポリソルベート80（別名Tween 80）0.1％、リン酸水素２カリウム0.2％、クエン酸アンモニウム(triammonium citrate)0.2%、硫酸マグネシウム7水和物0.02％、及び硫酸マグネシウム4水和物0.005％を含む。当該培地を酸適応プロバイオティクス細菌に用いる場合、特にリン酸水素２カリウム成分を除外することが望ましい。これは、細菌により、又は酸を系外から添加することにより酸が生成するのに対し、ｐＨの安定化が起こらないようにするためである。さらにより好適な実施形態では、リン酸水素２カリウム及び酢酸ナトリウム３水和物成分をＭＲＳ培地から除外する。しかし、ここで、他の部分の概略に示されるように、酸適応化細菌に使用される培地中、緩衝成分がそのまま残される場合もある。この場合、緩衝能が消費し尽くされた後にｐＨの降下が起こる。プロバイオティクス細菌の培養は、他に外部からの塩基の添加を受けることはない。

通常、当業者はプロバイオティクス細菌の培養に好適な培地を把握している。上記培地は、緩衝成分の存在又は非存在下、種培養物（starter cultures）での培養、例えば約100ml, や約500ml, 約1000ml, 約2000ml,約4000ml又はそれ以上の容量を有する種培養物れの培養に適している。また同様に、例えば約100l以上, 約200l以上, 約400l以上の容量の系を有する、大スケールの細菌培養にも適している。そのような大スケールの培養は典型的には発酵槽内で行う。以下の実施例１は、好適な培地の使用について例証する。

培地の初期ｐＨ値とは、プロバイオティクス細菌の添加前の培地中のｐＨ値のことである。好適な実施態様においては、培地の初期ｐＨ値は約6.0〜約7.0の間であり、好適には、約6.2〜6.6の間である。

本発明の１つの好適な実施態様においては、プロバイオティクス細菌の培養後、好適には最低６時間後、最低８時間後、最低１０時間後、より好ましくはプロバイオティクス細菌の培養後最低１２時間後、培地のｐＨ値は約5.0〜約4.0に達する。特に好ましい実施態様においては、少なくとも約8時間後に、培地のｐＨ値が約5.0〜約4.0に達する。

プロバイオティクス細菌は、発酵中の乳酸産生により、培養中のｐＨ値の低下を引き起こす。好適な実施態様において、本発明の方法で用いられる培地は当該ｐＨ低下が許容される。なぜならば、培養中の乳酸生成に対し、ｐＨの安定化が行われないようにするため、緩衝剤を含まない、又は実質的に含まない条件が必須となるためである。

好適には、プロバイオティクス細菌はｐＨ安定剤の非存在下、25℃から43℃の範囲、好適には25℃から40℃の範囲、より好適には30℃から40℃の範囲、最も好適には37℃の温度で、培養される。

本発明の好適な実施態様においては、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株が、ラクトバシラス（Lactobacillus）及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）から成る群から選ばれる。

本発明のより好適な実施態様においては、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株が、ラクトバシラスパラカゼイ種（the species Lactobacillus paracasei）に属する。ラクトバシラスパラカゼイ種（the species Lactobacillus paracasei）が用いられる場合、培養温度は37又は38℃が好適である。

ラクトバシラスパラカゼイパラカゼイ亜種CRL431株（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei strain CRL431 (L. casei 431^登録商標)）は、特許手続上の微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約により、米国培養細胞系統保存機関（American Tissue Type Collection、10801 University Blvd, Manassas, VA 20110, USA）、1994年1月24日付、受託番号ATCC55544として寄託された。周知のプロバイオティクス細菌はクリスチャン・ハンセンＡ/Ｓ（Chr. Hansen A/S, 10-12 Boege Aile, DK-2970 Hoersholm、Denmark,）より、製品名：Probio-Tec^登録商標 F-DVS L. casei-431^登録商標, 製品番号501749、及び製品名：Probio-Tec^登録商標 C-Powder-30, 製品番号687018として購入可能である。

本発明のより好適な実施態様において、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株が、米国培養細胞系統保存機関（American Tissue Type Collection）受託番号ATCC55544として寄託されるラクトバシラスパラカゼイパラカゼイ亜種CRL431株（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei strain CRL431 (L. casei 431^登録商標)）、その突然変異体（mutant）及び変種（variant）から成る群から選ばれる。

酸適応プロバイオティクス細菌の回収及び濃縮方法は周知技術である。例えば、細菌培養物を遠心分離し培養物の上清を除去することにより細菌の回収を達成できる。遠心分離は、細菌の破壊を回避できる程度の強度で行う。遠心分離による細胞の回収は通常知られるものであり、例えば、2000〜6000×ｇで2〜20分間行う例が含まれる。濃縮方法についても同様に知られるとおりである。例えば、細菌の濃縮は遠心分離により達成され、続いてより少量の体積中に再懸濁し、凍結乾燥又はフィルターろ過、例えばカラム又はフィルターを通すろ過を行う。

通常、少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌の果実飲料への接種は、少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株の含有量（果実飲料１ｍｌ当たりの初期ＣＦＵ値）が、果実飲料１ｍｌ当たり１×１０⁴〜１×１０¹⁰ＣＦＵ、より好ましくは１×１０⁵〜１×１０⁹ＣＦＵ、さらに好ましくは１×１０⁶〜１×１０⁸ＣＦＵとなる量で行われる。

驚くべきことに、プロバイオティクス細菌の生存率は、上記の酸性条件への適応後に特に高く、4〜10℃で数か月間保存後も高いままである。ある１つの実施態様において、最低３０日間、例えば最低４２日間又は最低７０日間、８℃で保存後の少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株の生存率が、果実飲料１ｍｌ当たりの初期ＣＦＵ値に対し少なくとも50％である。

ある好適な実施態様では、少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株の生存率が、上述の保存条件において、果実飲料１ｍｌ当たりの初期ＣＦＵ値に対し少なくとも60％、少なくとも70％又は少なくとも８０％である。

生存細胞数の計測は、技術的に標準の方法にしたがい、連続希釈法におけるコロニー形成単位数（ＣＦＵ）を、寒天プレート上のコロニー数を計上することにより同定した。好適な培地及びインキュベーション条件は以下の実施例に示す。

回収後及び/又は濃縮後、酸適応細菌は任意に冷凍凍結乾燥される。例えば、プロバイオティクス細菌は約-20℃、好ましくは約-80℃、又はそれ以下で冷凍され得る。冷凍方法は、好ましくはできる限り急速に行われ、好ましくは衝撃凍結（shock-freezing）を、細胞損傷を避けるために行う。衝撃凍結は、例えば、細菌の入った容器を液体窒素中に浸すことにより行う。実際、特に好ましい実施態様では、酸適応プロバイオティクス細菌は-１９６℃で衝撃凍結される。凍結乾燥法も同様に周知技術である。凍結乾燥においては、材料を冷凍後、周囲の圧力を低下させることにより、材料中の水分を固相から直接気相へと昇華させる。酸適応プロバイオティクス細菌を凍結又は衝撃凍結させた後、細菌は約20℃、約-55℃、-80℃又は液体窒素中の-196℃で保存される。特に好適には、酸適応プロバイオティクス細菌は約-55℃で保存される。

本発明のある実施態様によれば、プロバイオティクス果実飲料は便宜的に、10〜5000ｍｌ、例えば50〜1000ｍｌ又は200〜1000ｍｌの内容量のパック製品として密封包装される。

第２の観点において、本発明は、本発明の第１の観点による方法にしたがい得られるプロバイオティクス果実飲料であって、プロバイオティクス果実飲料は少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌を含むものに関する。

ある実施態様において、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌が果実飲料中に存在し、その量は最低３０日間、例えば最低42日間、８℃の条件下で保存後、少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株の含有量（果実飲料１ｍｌ当たりの初期ＣＦＵ値）が、果実飲料１ｍｌ当たり１×１０⁴〜１×１０¹⁰ＣＦＵ、より好ましくは１×１０⁵〜１×１０⁹ＣＦＵ、さらに好ましくは１×１０⁶〜１×１０⁸ＣＦＵである。

生存細胞数の計測は、本技術分野の標準法にしたがい、連続希釈法におけるコロニー形成単位数（ＣＦＵ）を、寒天プレート上のコロニー数を計上することにより同定した。好適な培地及びインキュベーション条件は以下の実施例に示す。

第３の観点において、本発明は、酸適応プロバイオティクス細菌の、ｐＨ安定剤の非存在下での増殖による直接的な製造方法を示す。より好適な実施形態において、プロバイオティクス細菌はｐＨ安定剤の非存在下、25〜43℃の範囲で、好ましくは25〜40℃の範囲で、初期ｐＨ値が約6.0〜7.0である好適な培地中で増殖させ、ここで当該培地は、当該培地のｐＨ値を約5.0〜4.0まで到達させることが可能な組成を有し、好適には少なくとも8時間の培養後、それにより少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を製造し、該少なくとも一種の酸適応プロバイオティクス細菌株を回収し、好ましくは該少なくとも一種の酸適応プロバイオティクス細菌株を濃縮し、該少なくとも一種の酸適応プロバイオティクス細菌株を任意に凍結又は凍結乾燥させる。

好適な１つの実施形態において、培地は少なくとも0.4%の酵母抽出物及び少なくとも2%の糖を含む。

本発明の１つの好適な実施態様においては、プロバイオティクス細菌の培養後、最低１０時間後、好ましくはプロバイオティクス細菌の培養後、最低１２時間後、培地のｐＨ値は約5.0〜約4.0に達する。

本発明のより好適な実施態様においては、少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株が、ラクトバシラスパラカゼイ種（the species Lactobacillus paracasei）に属する。

本発明の第４の観点は、本発明の第３の観点による、酸適応プロバイオティクス細菌の培養に関する。

第５の観点は、第４の観点による培養物を用いてプロバイオティクス果実飲料を生産することを示す。

１つの好適な実施形態では、プロバイオティクス果実飲料のｐＨ値はほぼ4.2である。

本発明は以下の実施例によりさらに説明されるが、これらに限定されるものではない。

実施例１．酸適応L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）株の産生
MRS培地（ディフコ（Difco）、ref.288110)に冷凍保存されたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）株を1％（Ｖ/Ｖ）となるように接種した。37℃、終夜、ｐＨが3.9以下となるまで培養し、使用時まで5℃で保存した。終夜培養した培養物を、MRS培地（ディフコ（Difco）) ４リットル（1％Ｖ/Ｖ）に接種し、37℃、終夜、ｐＨが3.9以下となるまでインキュベートし、使用時まで5℃で保存した。当該予備接種工程は、発酵に十分な接種量が確保できるまで行った。400ｌの適切な培地が入ったバイオリアクターに、予備接種工程で得られた全量を、10℃で接種した。温度を35℃まで上昇させて発酵を開始し、発酵に続いて炭水化物の代謝による乳酸産生が起こるとともにｐＨが低下するのを監視した。当該ｐＨの低下に伴い細胞は徐々に低ｐＨへ適応する。酸適応細胞をｐＨ5.0、4.5及び4.0の各点において遠心分離により回収した。発酵時間は回収の時点に応じ10〜17時間であった（図１）。
濃縮物の細胞全量は直ちに液体窒素(-196℃)で凍結し、使用時まで-55℃で保存した。

実施例２．酸適応L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）株の回収基準の最適化
最大の生存細胞数を求めるため、以下のように最適な回収基準を決定した。バイオリアクターを予備接種により接種し、実施例１で述べたように発酵を開始した。予備接種（ｐＨ4.5相当）の11時間後から、30分毎にｐＨが4.0を下回るまで発酵物のサンプルを取出し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）数を決定することにより生存数を評価した（図２）。ＣＦＵはＭＲＳ寒天培地で約10倍希釈した後、37℃、3日間嫌気性条件でインキュベートすることにより決定した。

細胞数は接種後１２時間後（ｐＨ4.24相当）まで増え続け、発酵完了後一定レベルで15が残存した。このことは、細胞が頑強でありｐＨ4.0以下に低下した場合も生存していたことを意味する。実行可能な工程時間内では、酸適応化され生存する細胞を十分量供給し得るための好適な回収基準はｐＨ4.0未満と決定された。

実施例３．酸適応L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）種々の果実飲料の、生存活性及び官能特性
実施例１で述べた手順により生産されたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）株を、以下の組成による、異なる果実による飲料に対する接種に使用した。

イチゴ／バナナジュース（ｐＨ3.75）
31% イチゴピューレ
26% バナナピューレ
ブドウジュース、オレンジジュース、マンゴピューレ、モモピューレ及びブルーベリーピューレを加え合計100％とする。

トロピカルジュース（ｐＨ3.88）
32％パイナップルジュース
32% オレンジジュース
26% バナナピューレ
7% マンゴピューレ
3% ライムピューレ

赤色果実ジュース（ｐＨ3.55）
16％の異なる赤色果実（ラズベリーピューレ、ブラックカラントジュース、ブルーベリーピューレ）
グレープジュース、イチゴピューレ及びバナナピューレを加え合計１００％とする。

プロバイオティクスＦ-ＤＶＳ培養物をペプトン生理食塩水で希釈し、異なる果実ジュースの包装単位に対し1% v/vとなるよう接種し、初期細胞数5x107 又は1x108 CFU/mlのいずれかを得た。当該ジュースに、ｐＨ4.0、5.0適応の、及び対照として非適応のL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を接種した。官能分析のための対照として、包装単位に対し同量のペプトン生理食塩水を接種した。接種済のジュースは遮光条件下８℃で保存された。L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の細胞数は、一定時間ごとに、ＭＲＳ寒天培地で約10倍希釈した後、37℃、3日間嫌気性条件でインキュベートすることにより決定した。保存期間中、官能評価は訓練された官能評価者３名により行われた。

異なる果実ジュース中のL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の細胞数を図３、４及び5に示す。ｐＨ3.5-3.9の酸性条件下で最低３０日間保存した場合、酸適応L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）菌は生存率に影響を受けなかったのに対し、非適応のL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）菌の場合、果実飲料中の生存率が1000倍低下した。

30日保管後の官能評価では、L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）株を添加したものは、同種類の対応するペプトン生理食塩水を加えたものと比較して、いずれも官能特性に変化は認められなかった。

実施例４．３種の異なるｐＨ値で適応化されたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の、オレンジジュース中での生存率
実施例１で説明された手順により生産されたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）菌を、100％オレンジジュース（ｐＨ3.8）に接種した。プロバイオティクスＦ-ＤＶＳ培養物をペプトン生理食塩水で希釈し、オレンジジュースの包装単位に対し1% v/vとなるよう接種し、初期細胞数1.5×10⁸ＣＦＵ/ｍｌを得た。当該ジュースに、ｐＨ4.0、4.5、5.0適応の、及び対照として非適応のL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を接種した。ジュースは遮光条件下８℃で42日間保存され、細胞数は通常どおり、サンプルをＭＲＳ寒天培地で約10倍希釈した後、37℃、3日間嫌気性条件でインキュベートすることにより決定した。

図６に示すように、L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の細胞数は、ｐＨ4.0、4.5、5.0適応のものはほぼ一定であったのに対し、非適応のL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を用いた場合は、細胞数の顕著な減少が観察された。

実施例５．冷凍保存における酸適応Ｌカゼイの安定性
実施例１に従って産生されたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）菌を-50℃の冷凍ペレットとして保存し、通常の生存率試験を行った。細胞数は、解凍培養物をＭＲＳ寒天培地で５プレートを約10倍希釈後、37℃、3日間嫌気性条件でインキュベートすることにより決定した。図７に示すように、-50℃、6か月間保存した場合、非適応、及びｐＨ4.0、4.5、5.0適応のL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）のいずれを用いた場合も、細胞数は非常に安定していた。

本明細書には、本発明を実施する上で本発明者等が知る限り最良の形態を含む、本発明の好適な態様を記載した。以上の記載に接した当業者には、これらの好適な実施態様に対し種々の変形を加え得ることは自明であろう。本発明者等の理解によれば、当業者であれば斯かる種々の変形を適宜採用するであろうし、また、本明細書に具体的に記載された態様とは異なる形で本発明を実施するのは、発明者等が意図するところでもある。従って、本発明は、適用法が許す限り、添付の特許請求の範囲に記載の主題に対するあらゆる変更や等価物が含まれるものとする。さらに、別段特段の指示や、文意との明らかな矛盾が無い限り、上述の要素の考え得るあらゆる変形を含む任意の組合せが、本発明に含まれる。

実施例６．長期冷凍保存後の、ジュース中のL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の生存率
-50℃、６か月間、冷凍ペレットとして保存後、100％オレンジジュース中、ｐＨ4.0適応L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の２５バッチの生存率を決定した。プロバイオティクスＦ-ＤＶＳ培養物をペプトン生理食塩水で希釈し、オレンジジュースのパック単位に対し1% v/vとなるよう接種し、初期細胞数1.5×10⁸ＣＦＵ/ｍｌを得た。対照として、他の包装単位の100％オレンジジュースに対し非適応L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を加え、-50℃で6か月間保存した。
ジュースは遮光条件下８℃で42日間保存され、一定間隔でのL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）サンプルの細胞数は、プレートをＭRＳ寒天培地で約10倍希釈した後、37℃、3日間嫌気性条件でインキュベートすることにより決定した。

図８に示されるように、ｐＨ4.0適応産生のものを用い、６か月-50℃で保存後、オレンジジュース中で６週間冷蔵保存した場合でもなお、L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の細胞数は一定に保たれた。一方、非適応L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を用いた場合は、６か月-50℃で保存後、オレンジジュース中に加えた場合、細胞数は著しく減少した。このことは、培養物が-50℃で長期凍結保存後であっても、ｐＨ4.0適応産生のL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）は、オレンジジュース中の生存率が高いことを示す。

実施例７．適応L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）菌の、オレンジジュース中での長期保存安定性
実施例１の方法により産生されたL.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を用いて100％オレンジジュース（ｐＨ3.8）に接種を行った。プロバイオティクスＦ-ＤＶＳ培養物をペプトン生理食塩水で希釈し、おおよその初期細胞数を確定した。果実ジュースの包装単位に対し1% v/vとなるよう接種したところ初期細胞数は1e08 CFU/mlであった。当該ジュースに、ｐＨ4.0に適応の、及び対照として非適応の「対照」L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）を接種した。接種済のジュースは遮光条件下８℃で70日間保存し、一定間隔でサンプルを採取し、採取サンプルの細胞数は、プレートをＭＲＳ寒天培地で約10倍希釈した後、37℃、3日間嫌気性条件でインキュベートすることにより決定した。

図９に示すように、L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）の細胞数は、ｐＨ4.0適応産生のものを用い、オレンジジュース中10週間冷蔵保存後も一定していた。一方、非適応L.カゼイ431^登録商標（L. casei 431）をオレンジジュース中で冷蔵保存した場合、3週間後、最初のサンプル摘出時点で細胞数の顕著な減少が見られた。このことは、オレンジジュース中10週間冷蔵保存後でも、ｐＨ４．０適応のＬカゼイの生存率はより高いことを示す。

参考文献：
欧州特許0113055号
米国特許出願2010/0086646号
ＰＣＴ特許出願2010/132017号

本明細書に引用する全ての文献は、その全体が、参照により本明細書に組込まれる。

Claims

プロバイオティクス果実飲料の製造方法であって、以下の工程：
(a)少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株を増殖中に酸適応化させ、ここで前記工程(a)が以下の工程：
(i) ラクトバシラス（Lactobacillus）及びビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）から成る群から選ばれる、前記少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株を、pH安定剤の非存在下、25℃から43℃の範囲で、初期pH値が6.0〜7.0であり、そして少なくとも2%の糖及び0.4%の酵母抽出物を含む好適な培地中で増殖させ、ここで前記培地は、前記培地のpH値を5.0〜4.0まで到達させることが可能な組成を有し；
(ii) 前記少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を回収し；そして
(iii) 前記少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を濃縮する
ことを含み；
(b)前記工程(a)で得られた少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を、果実飲料中に接種し；そして
(c)任意により、プロバイオティクス果実飲料として包装する
ことを含む、製造方法。
前記工程(a)における酸適応化が、前記少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株を、pH安定剤の非存在下、25℃から40℃の範囲で増殖させることを含む、請求項１の方法。
さらに前記少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株を凍結又は凍結乾燥することを含む、請求項１又は２の方法。
前記工程(b)において、前記少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株の含有量（果実飲料１ｍｌ当たりの初期ＣＦＵ値）が、果実飲料１ｍｌ当たり１×１０⁴〜１×１０¹⁰ＣＦＵとなるように接種される、請求項１〜３の何れか１項の方法。
最低３０日間、８℃で保存後の前記少なくとも１種の酸適応プロバイオティクス細菌株の生存率が、果実飲料１ｍｌ当たりの初期ＣＦＵ値に対し少なくとも50％である、請求項１〜４の何れか１項の方法。
前記プロバイオティクス果実飲料のｐＨ値が3.2〜4.2である、請求項１〜５の何れか１項の方法。
前記プロバイオティック果実飲料が、20重量％〜99.99重量％の果実ジュース及び／又は果実ピューレを含む、請求項１〜６の何れか１項の製造方法。