JP6041843B2 - ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させる方法 - Google Patents

Description

分野
本発明は、凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の凝集を低下させる方法に関する。本発明は、ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させることを含む薬剤調合物を改善する方法にも関する。本発明は、凝集が低下されているＩＬ−１ｒａを使用する疾病を治療する方法にも関する。最後に本発明は、凝集が低下されているＩＬ−１ｒａを含む組成物及びキットに関する。

インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）及びインターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は各々、特定の細胞タイプの表面上に見られる１型ＩＬ−１受容体（ＩＬ−１ＲＩ）に結合する。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは、炎症反応及び免疫反応に関連する特定の細胞を含む多くの異なる標的細胞への生理学的効果を有する。対照的に、ＩＬ−１ｒａはＩＬ−１ＲＩへ結合するが、似たような下流への生物学的反応を誘発しない。むしろ、ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βのＩＬ−１ＲＩへの結合を競合的に阻害する。ＩＬ−１ｒａの大腸菌により生成される１つのバージョンであるアナキンラは関節リウマチの治療用に市販されている。

要旨
ある実施態様において、凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の凝集を低下させる方法が提供される。ある実施態様において前記方法は、ＩＬ−１ｒａを少なくとも１つのアクセサリー分子とインキュベートすることを含む。

ある実施態様において、インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）薬物処方を調製する方法が提供される。ある実施態様において前記方法は、前記凝集性ＩＬ−１ｒａを少なくとも１つのアクセサリー分子とインキュベートすることを含む。ある実施態様において、凝集は低下する。

ある実施態様において、患者を治療する方法が提供される。ある実施態様において、関節炎を有する患者を治療する方法が提供される。ある実施態様において、関節リウマチを有する患者を治療する方法が提供される。ある実施態様において、変形性関節症を有する患者を治療する方法が提供される。ある実施態様において、クローン病、潰瘍性大腸炎、糸状体腎炎、又は白血病のうちの少なくとも１つを有する患者を治療する方法が提供される。ある実施態様において、ＩＬ−１の副作用を有する患者を治療する方法が提供される。ある実施態様において、患者を治療する方法は、（ｉ）凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の治療的有効量と（ｉｉ）少なくとも１つのアクセサリー分子とを含む組成物を前記患者へ投与することを含む。

ある実施態様において、キットが提供される。ある実施態様においてキットは、凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）及び少なくとも１つのアクセサリー分子を含む。

ある実施態様において、医薬組成物が提供される。ある実施態様において医薬組成物は、凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）及び少なくとも１つのアクセサリー分子を含む。

ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は、凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させる濃度にある。ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は、凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集の速度を低下させる濃度にある。ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は、糖及び多荷電陰イオンから選択される。ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は、多荷電陰イオンである。ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は１ないし２０ｍＭのピロリン酸塩である。ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は多荷電陰イオンである。ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は１ないし２０ｍＭのピロリン酸塩である。ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は１ないし２０ｍＭのクエン酸塩である。ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は少なくとも１つの糖である。ある実施態様において、前記糖の少なくとも１つは、グリセロール、ソルビトール又はショ糖である。ある実施態様において、このような糖の少なくとも１つは１ないし３％の濃度にある。

ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は、リジン反応性アクセサリー分子及びアルギニン反応性アクセサリー分子から選択される。ある実施態様において、少なくとも１つのアクセサリー分子は、６−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサン酸（ＮＢＤ−Ｘ）、リン酸メチルアセチル（ＭＡＰ）及びシトラコン酸無水物から選択される。

図１は、実施例２で論議された、ＰＳＥ（１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．５）、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ）若しくはＣＳＥ（１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ）のいずれかにおけるＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の経時的な凝集特性を示す。 図２は、実施例３において論議された、ＮＢＤ−Ｘにより誘導体化されたＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を示す。上部パネルは、２１５ｎｍでのＮＢＤ−Ｘにより標識されたＩＬ−１ｒａの吸光度を示す。下部パネルは、４８０ｎｍでの励起後の５３５ｎｍでの蛍光発光を示す。 図３は、実施例４で論議された、リン酸塩、ピロリン酸塩及びクエン酸塩陰イオンの濃度上昇の存在下におけるＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質についての凝集速度を示す。 図４は、実施例５で論議された、グリセロール、ソルビトール又はショ糖の上昇濃度の存在下におけるＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質についての凝集速度を示す。 図５は、分泌性リーダー配列を含む前駆体ヒトＩＬ−１ｒａのヌクレオチド配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 図６は、前記分泌性リーダー配列を欠失するヒトＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列を含む（配列番号３）。点（・）は、位置９３でのリジンを示す。プラス（＋）は、位置９７でのアルギニンを示す。トリプトファン−１６（△）及びチロシン−３４（○）の位置も示されている。 図７は、ＩＬ−１ｒａの典型的なＸ線結晶構造を示す。 図８は、図１について記載されるＸ線結晶構造における非対称性ＩＬ−１ｒａ二量体の２つのサブユニット間の界面の一部を示す。 図９は、実施例６において論議された円二色性により検出されるＩＬ−１ｒａの尿素により誘導される平衡折りたたみ開きを示す。 図１０は、実施例６において論議された固有蛍光により検出されるＩＬ−１ｒａの尿素により誘導される平衡折りたたみ開きを示す。 図１１は、実施例６において論議された円二色性によるＩＬ−１ｒａの塩酸グアニジンにより誘導される折りたたみ開きを示す。 図１２は、実施例６において論議された固有蛍光によるＩＬ−１ｒａの塩酸グアニジンにより誘導される折りたたみ開きを示す。 図１３は、実施例７において論議された、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）の存在下でリン酸メチルアセチル（ＭＡＰ）により親和標識されたＩＬ−１ｒａの逆相ＨＰＬＣを示す。 図１４は、実施例７において論議された、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．５）の存在下でのリン酸メチルアセチル（ＭＡＰ）により親和標識されたＩＬ−１ｒａの逆相ＨＰＬＣを示す。 図１５は、実施例７において論議された、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．５）、又は１０ｍＭピロリン酸塩（ｐＨ６．４）の存在下で４．５時間（２７０分間）リン酸メチルアセチルにより親和標識されたＩＬ−１ｒａの逆相ＨＰＬＣ特性の重ね合わせを示す。４つの弱く分離されたピークが１、２、３及び４として名付けて示される。 図１６は、実施例７において論議された、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）の存在下でリン酸メチルアセチルによるＩＬ−１ｒａの誘導体化の速度を示す。図１６Ａは、図１３からのクロマトグラムの再生を示す。図１６Ｂは、図１６Ａからの各クロマトグラムの解析結果を示す。図１６Ｃは、図１６Ｂから解析された各ピークの積分の対時間プロットを示す。 図１７は、実施例７において論議された、さまざまなｐＨでのさまざまな緩衝液の存在下におけるＩＬ−１ｒａのＭＡＰによる誘導体化の速度の比較を示す。 図１８は、実施例７において論議された、さまざまなｐＨレベルでの１０ｍＭクエン酸塩若しくは１０ｍＭリン酸塩の存在下でリン酸メチルアセチルにより親和標識されるＩＬ−１ｒａの５．５時間の逆相ＨＰＬＣ特性の重ね合わせを示す。 図１９は、実施例８において論議された、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５を有する緩衝液中でのリン酸塩のさまざまな濃度におけるＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の経時的凝集特性を示す。 図２０は、実施例９において論議された、クエン酸塩濃度上昇の関数としてのＩＬ−１ｒａへのクエン酸塩の結合を示す。 図２１は、実施例１０において論議された、ピロリン酸塩若しくはリン酸塩の濃度上昇によるＩＬ−１ｒａへのクエン酸塩の結合に対する競合を示す。 図２２は、実施例１０において論議された、溶液中におけるピロリン酸塩濃度の関数としてのＩＬ−１ｒａへのクエン酸塩の結合についてのＫ^ｄ _Ｌａｐｐのプロットを示す。ＩＬ−１ｒａの陰イオン結合部位へのピロリン酸塩の結合についてのＫ^ｄ _Ｘは２．９９４ｍＭであると算出された。 図２３は、典型的なＩＬ−１ｒａのヌクレオチド配列（配列番号４）及びアミノ酸配列（配列番号５）を示す。 図２４は、ｉｃＩＬ−１ｒａと呼ばれる典型的なＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列（配列番号６）を示す。配列番号６は、配列番号３と同一の配列を有するが、前記Ｎ末端にさらに７個のアミノ酸を有する。

典型的な実施態様の詳述。

本明細書で使用される節の見出しは、組織化に関する目的のためのみであり、記載されている対象に制限を加えるものとして解釈されるべきではない。本出願において引用されている参考文献はすべて、いずれかの目的のために本明細書に参照によって明示的に組み込まれる。

本出願において、単数形の使用は特段に記載されている場合を除き、複数形を含む。本出願において、「又は」の使用は、別に記載されている場合を除き、「及び／又は」を意味する。さらに、「包含する」という語の使用は、「含む」及び「包含された」などの他の形態と同様、制限を加えるものではない。また、「要素」又は「構成要素」などの語は、特段の記載がなければ、１を超えるサブユニットを含む、１つの単位及び要素及び構成要素を含む要素及び構成要素の両者を包含する。

さまざまな実施態様において、標準的な技術が、組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養、形質転換及び形質移入に使用できる。さまざまな実施態様において、酵素反応及び精製技術が製造者の規格に従って又は本分野において一般に達成されている又は本明細書に記載されているように実施できる。さまざまな実施態様において、技術及び手段が、本分野で公知の従来の方法に従って、及び明細書を通じて引用され及び論議されているように、及び又は当業者に公知のさまざまな一般的な及びより特殊な参考文献において記載されているように、一般的に使用できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９））を参照してほしい。特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学並びに医薬品化学及び製薬化学の実験室的手段及び技術並びにこれらに関連して利用される多くの命名は、本分野で公知であり一般に使用されているものである。さまざまな実施態様において、標準的な技術が化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、送達及び患者の治療のために使用できる。ある実施態様において、アミノ酸が別のアミノ酸と「置換」される場合、前記置換は例えば、前記アミノ酸をコードするポリヌクレオチドにおけるコドンを別のアミノ酸をコードするコドンへ変異させることによる組み換えにより実施できる。ある実施態様において、前記コドンを変異することは、本分野で公知のいずれかの方法によって実施できる。

定義
本開示に利用されているように、以下の語は、特段の記載がなければ、以下の意味を有すると理解されるべきである。

「単離されたポリヌクレオチド」という語は、ゲノムの、ｃＤＮＡの、又は合成由来のポリヌクレオチド、又はこれらのいくつかの組み合わせを意味すべきである。前記合成由来のポリペプチドは、（１）天然に見い出されるポリヌクレオチドの少なくとも一部を伴っていない、又は（２）天然において結合していないポリヌクレオチドに結合している、又は（３）天然には生じていない。

「機能可能に連結される」という語は、構成要素が意図されたように機能できる関係にある構成要素を指す。例えば、コード配列へ「機能可能に連結される」調節配列は、前記コード配列の発現が前記調節配列の機能と適合性のある条件下で達成されるような方法で連結される。

「調節配列」という語は、ポリヌクレオチド配列が連結されているコード配列の発現及びプロセシングに影響を及ぼしうるポリヌクレオチド配列を指す。このような調節配列の性質は宿主生物によって異なりうる。ある実施態様に従って、原核生物についての調節配列はプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を包含できる。ある実施態様に従って、真核生物についての調節配列はプロモーター及び転写終結配列を包含できる。ある実施態様において、「調節配列」は、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列を包含できる。

「ポリヌクレオチド」という語は、天然に存在する及び／又は天然に存在しない結合によって互いに結合されている天然に存在する及び／又は修飾されたリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを有するヌクレオチドのポリマー形態を意味する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは少なくとも長さ１０塩基である。前記語は、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの一本鎖及び二本鎖の形態、又はこれらの修飾された形態を包含する。

「オリゴヌクレオチド」という語は、天然に存在する及び／又は天然に存在しない結合によって互いに結合されている天然に存在する及び／又は修飾されたリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを有するポリマーを包含する。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのサブセットであり、一般に約２００塩基以下を含む。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは長さ約１０ないし約６０塩基である。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ないし４０塩基である。オリゴヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖でありうる。オリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスのオリゴヌクレオチドでありうる。

「天然に存在するヌクレオチド」という語は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。「修飾されたヌクレオチド」という語は、修飾され若しくは置換された糖基及び／又は修飾され若しくは置換されたヌクレオチド塩基を有するヌクレオチド及びその類似物を包含する。「オリゴヌクレオチド結合」及び「ポリヌクレオチド結合」という語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデート、及びそれらの類似物などの結合を包含する。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅほか、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：９０８１ （１９８６）、Ｓｔｅｃほか、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０６：６０７７ （１９８４）、Ｓｔｅｉｎほか、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９ （１９８８）、Ｚｏｎほか、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９ （１９９１）、Ｚｏｎほか、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｐｐ．８７−１０８ （Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、 Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ （１９９１））、Ｓｔｅｃほか、米国特許第５，１５１，５１０号、Ｕｈｌｍａｎｎ及びＰｅｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３ （１９９０）を参照してほしい。ある実施態様において、オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドは標識を包含できる。

対象へ適用される「天然に存在する」という語は、天然に見出されうる対象を指す。例えば、天然資源から単離でき、実験室若しくはその他において人間により修飾されなかった生物体（ウィルスを含む。）において存在するポリペプチド若しくはポリヌクレオチド配列は天然に存在する。

「単離されたタンパク質」という語は、合成手段によって作製されたタンパク質又はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ又は他のポリヌクレオチドによりコードされているタンパク質を意味する。単離されたタンパク質は（１）通常見出されるであろう少なくともいくつかのあるタンパク質が存在しない、又は（２）同一資源由来の、例えば同一種由来の、他のタンパク質が本質的に存在しない、又は（３）異なる種由来の細胞により発現される、又は（４）天然に存在しない。本明細書で使用されているポリペプチド表記法において、特段の記載がなければ、標準的な使用及び慣例に従って、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。

同様に、特段の記載がなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物への５’から３’の付加の方向は転写方向と呼ばれ、前記ＲＮＡ転写産物の５’末端に対して５’である前記ＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ、「コード化領域の上流」であり、前記ＲＮＡ転写産物の３’末端に対して３’である前記ＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれ、「コード化領域の下流」である。

本明細書で使用されるように、「標識」若しくは「標識された」という語は、検出可能な部分の存在を指す。検出可能な部分は、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの合成中に組み込み得、又は合成後に共有結合的若しくは非共有結合的のいずれかで結合させ得る。標識は、例えば、放射線標識されたアミノ酸の組み込み、標識されたアビジン（例、光学的若しくは比色的方法によって検出できる蛍光部分若しくは酵素活性を含有するストレプトアビジン）で検出できるビオチン部分の結合でありうる。ある実施態様において、前記標識若しくは検出可能な部分は治療用でありうる。ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを標識するさまざまな方法が本分野で公知である。ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドへの標識の例には放射性同位体若しくは放射性核種（例、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（例、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン）、酵素標識（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ビオチン基、二次リポーター（例、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）により認識される予め決めておいたポリペプチドエピトープがあるが、これらには限定されない。ある実施態様において標識は、立体障害についての可能性を低下させるためにさまざまな長さのスペーサーアームによって結合される。

本明細書において使用されるように、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略語は従来の使用に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （第２版、 Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， Ｍａｓｓ． （１９９１））を参照してほしい。前記２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸（α−，α−二置換されたアミノ酸など）、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非通常のアミノ酸も、本発明のポリペプチドについての適切な構成要素でありうる。典型的な非通常アミノ酸の非限定的例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の同様のアミノ酸及びイミノ酸が含まれる。

当業者は、公知の技術を使用してポリペプチドの適切な変異体を特定できるであろう。ある実施態様において当業者は、活性について重要であると信じられていない領域を対象とすることによって活性を破壊することなく変化させ得るポリペプチドの適切な領域を特定できる。ある実施態様において当業者は、類似のポリペプチド間で保存されているポリペプチドの残基及び部分を同定できる。ある実施態様において、生物活性若しくは構造について重要であるかもしれない領域でさえ、前記生物活性を破壊することなく又は前記ポリペプチド構造に負の影響を与えることなく、保存されたアミノ酸置換を受け入れうる。

さらに、ある実施態様において当業者は、構造−機能研究を検討して、活性若しくは構造について重要である類似のポリペプチドにおける残基を同定できる。このような比較の点において、当業者は、類似のタンパク質における活性若しくは構造について重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測できる。ある実施態様において、当業者はこのような予測できる重要なアミノ酸残基について化学的に類似のアミノ酸置換を選択できる。

ある実施態様において当業者は、類似のポリペプチドにおける公知の構造に関して３次元構造及びアミノ酸配列を分析できる。さらに、ある実施態様において当業者は、望ましい各アミノ酸残基における単一のアミノ酸置換を含有する検査変異体を作成できる。ある実施態様において前記変異体は次に、当業者に公知の活性アッセイを使用して選別し得る。このような変異体は適切な変異体についての情報を収集するのに使用できるであろう。例えばある実施態様においてもし当業者が、活性の破壊、活性の望ましくなく低下又は不適切な活性をもたらす特定のアミノ酸残基への変化を見い出せば、このような変化による変異体は回避できる。言い換えれば、このような日常的な実験から収集される情報に基づいて、当業者は、単独又は他の変異との組み合わせのいずれかで更なる置換を回避すべきアミノ酸を容易に決定できる。

ある実施態様において、欠失、挿入、及び／又は置換（個々に若しくは集約的に「変異体」と呼ばれる。）は、ＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質のアミノ酸配列内に作製される。本明細書で使用されるように、「ＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質」は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質を指し、必要に応じてそのＮ末端に更なるメチオニン残基を有し、それにより前記Ｎ末端配列はＭＲＰＳＧＲ…である。一般名「アナキンラ」を有する治療用タンパク質は、ＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質のこの定義内に収まる。アナキンラは、配列番号３と同一の配列番号５の配列を有するが、Ｎ末端のメチオニンを有する。ある実施態様において、化学的若しくは酵素的修飾などのＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質への変化は、タンパク質の翻訳若しくは合成後になされる。このように変化したＩＬ−１ｒａタンパク質は、個々に若しくは集約的に「誘導体」と呼ばれる。ＩＬ−１ｒａという語はＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質を包含し、また前記ＩＬ−１ｒａ受容体に対してアンタゴニスト活性を有する天然に存在する及び天然に存在しないＩＬ−１ｒａ変異体及び誘導体も包含する。

ある実施態様において、「正の電荷を有しないアミノ酸」は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンから選択される。正の電荷を有しないアミノ酸には、正の電荷を有しない非通常のアミノ酸も含まれるがそれらには限定されない。当業者は、特定のアミノ酸変異体がポリペプチドへ組み込まれるときに正の電荷を有するかどうかを決定できる。

ある実施態様において、「電荷を有しないアミノ酸」は、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンから選択される。電荷を有しないアミノ酸には電荷を有しない非通常アミノ酸も含まれるがそれらには限定されない。当業者は、ポリペプチドへ組み込まれるときに特定の非通常性アミノ酸変異体が電荷を有するかどうかを決定できる。

ある実施態様において、「電荷を有しない極性アミノ酸」は、システイン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン及びチロシンから選択される。電荷を有しない極性アミノ酸には、電荷を有しない極性のある非通常アミノ酸も含まれるがそれらには限定されない。当業者は、ポリペプチドへ組み込まれるときに、特定の非通常アミノ酸変異体が極性であるかどうか、及びそれが電荷を有するかどうかを決定できる。

ある実施態様において、「非芳香族アミノ酸」は、アラニン、アルギニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン及びバリンから選択される。非芳香性アミノ酸には、芳香族ではない非通常アミノ酸も含まれるがそれらには限定されない。当業者は、特定の非通常性アミノ酸変異体がポリペプチドへ組み込まれるときに芳香族であるかどうかを決定できる。

「陽イオン−パイ相互作用」という語は、陽イオン性アミノ酸と芳香族アミノ酸との間の非共有結合性相互作用を指す。ある実施態様において、前記陽イオン性アミノ酸はリジンでありうる。ある実施態様において、前記陽イオン性アミノ酸はアルギニンでありうる。ある実施態様において、前記芳香族アミノ酸はフェニルアラニンでありうる。ある実施態様において前記芳香族アミノ酸はチロシンでありうる。ある実施態様において前記芳香族アミノ酸はトリプトファンでありうる。前記陽イオン−パイ相互作用は単一のポリペプチド内（つまり分子内）であり得るか、又は前記陽イオン−パイ相互作用は２つ以上のポリペプチド間（つまり分子間）であり得る。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａの特定のアミノ酸残基は陽イオン−パイ相互作用に関係している。図１はＩＬ−１ｒａのＸ線結晶構造を示す。前記結晶構造は、１ＩＬＲ．ｐｄｂファイル及びＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ３Ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｅｗｅｒ （ＩｎｆｏｒＭａｘ社製）を使用して調製された。ＩＬ−１ｒａは非対称性二量体として結晶化した。例えば、Ｖｉｇｅｒｓほか、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９： １２８７４−１２８７９ （１９９４）を参照してほしい。図２は、図１の前記結晶構造の一部を示す。前記結晶構造において、あるＩＬ−１ｒａサブユニット上のリジン−９３は、他のＩＬ−１ｒａサブユニット上のトリプトファン−１６との陽イオン−パイ相互作用に関連しているように見える。同様に、あるＩＬ−１ｒａサブユニット上のアルギニン−９７は他のＩＬ−１ｒａサブユニット上のチロシン−３４との陽イオン−パイ相互作用に関連しているように見える。

本明細書で使用される「ポリペプチド断片」という語は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。ある実施態様において、断片は長さが少なくとも５ないし２０１個のアミノ酸である。ある実施態様において、断片は長さが少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２５、１５０、１７０、１７５、１７６、１７７、１８０、１８５、１９０、又は２００個のアミノ酸であることが認識されるであろう。

本明細書で使用される「生物試料」という語は、生体若しくは生体であったもの由来の物質のいずれかの量を包含するがそれには限定されない。このような生体にはヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、及び他の動物が含まれるが、これらには限定されない。このような物質には、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ節及び皮膚が含まれるが、これらには限定されない。

本明細書で使用されるように、「実質的に純粋な」は、対象の巨大分子種が、優勢に存在する主な巨大分子種であることを意味する（つまり、モル濃度ベースで組成物中のいずれかの他の個々の巨大分子種よりも豊富である）。ある実施態様において、実質的に精製された画分は、対象巨大分子種が、存在する巨大分子種すべての少なくとも約５０％（重量に基づいた）を含む組成物である。ある実施態様において、実質的に純粋な組成物において、前記対象の巨大分子種は前記組成物中に存在する巨大分子種すべての重量による約８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％を超えるものを含む。ある実施態様において、前記対象巨大分子種は本質的に均質になるよう精製される（すなわち、夾雑種は従来の検出方法によって組成物中において検出できない）。ある実施態様において、組成物は単一の巨大分子種から本質的になる。

患者という語にはヒト及び動物対象が含まれる。

インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、インターロイキン−１活性の阻害剤として作用するヒトタンパク質であり、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βも含むＩＬ−１ファミリーの一員である。ＩＬ−１受容体アンタゴニストの非包括的、非制限的、非網羅的リストには、Ｋｉｎｅｒｅｔ^（Ｒ）（アナキンラ）（例、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質）、ＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質（配列番号３の配列を有するタンパク質、又は配列番号５の配列を有するタンパク質を含むがこれらに制限されない。）、細胞内ＩＬ−１ｒａ（ｉｃｌＬ−１ｒａ）（配列番号６の配列を有するタンパク質を含むがこれに制限されない）、ＩＬ−１ｒａβ（例、ＰＣＴ発行番号第ＷＯ９９／３６５４１号参照）、ＩＬ−１ｒａ変異体、及びＩＬ−１ｒａ誘導体が含まれる。ＩＬ−１ｒａ及びその変異体並びに誘導体を含む特定のＩＬ−１ｒａ受容体アンタゴニスト、並びにそれらを作製する及び使用する方法は、例えば米国特許第５，０７５，２２２号、米国特許第６，５９９，８７３Ｂ１号、米国特許第５，８６３，７６９号、米国特許第５，８５８，３５５号、米国特許第５，７３９，２８２号、米国特許第５，９２２，５７３号、米国特許第６，０５４，５５９号、ＷＯ９１／０８２８５、ＷＯ９１／１７１８４、ＷＯ９１／１７２４９、豪州特許第９１７３６３６号、ＷＯ９２／１６２２１、ＷＯ９３／２１９４６、ＷＯ９４／０６４５７、ＷＯ９４／２１２７５、仏国特許第２７０６７７２号、ＷＯ９４／２１２３５、ドイツ特許第４２１９６２６号、ＷＯ９４／２０５１７、ＷＯ９６／２２７９３、ＷＯ９６／１２０２２、ＷＯ９７／２８８２８、ＷＯ９９／３６５４１、ＷＯ９９／５１７４４に記載されている。ＩＬ−１受容体アンタゴニストはグリコシル化されている又は非グリコシル化されていないことができる。

典型的なＩＬ−１ｒａには、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド及びこのようなポリペプチドの、インターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有する断片、変異体及び誘導体；配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド及びこのようなポリペプチドの、インターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有する断片、変異体及び誘導体；配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド及びこのようなポリペプチドの、インターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有する断片、変異体及び誘導体；並びに配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド及びこのようなポリペプチドの、インターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有する断片、変異体及び誘導体が含まれるがこれらに制限されない。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａという語は、前記インターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有するＩＬ−１ｒａ変異体を含むがそれらには限定されない。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ変異体は天然に存在している。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ変異体は人工的に構築される。例示的なＩＬ−１ｒａ変異体には、配列番号２、配列番号３、配列番号５又は配列番号６との比較において、１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は付加を有するアミノ酸配列が含まれるがこれらには限定されない。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ変異体は、配列番号３のアミノ酸配列と９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ変異体は配列番号３のアミノ酸配列と９０％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ変異体は、配列番号３のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸配列を含む。ＩＬ−１ｒａ変異体は、配列番号３のアミノ酸配列と７５％同一であるアミノ酸配列を含む。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａという語には前記インターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有するＩＬ−１ｒａ断片が含まれるがこれに限定されない。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ断片は天然に存在する。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ断片は人工的に構築される。典型的なＩＬ−１ｒａ断片には、配列番号２、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の配列の断片が含まれるが、これらに限定されない。ＩＬ−１ｒａ断片はＩＬ−１ｒａ変異体のサブセットである。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａという語には前記インターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有するＩＬ−１ｒａ誘導体が含まれるがこれに限定されない。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ誘導体は天然に存在する。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ誘導体は人工的に構築される。典型的なＩＬ−１ｒａ誘導体には、配列番号２、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の配列の化学的若しくは酵素的に修飾された形態が含まれるがこれらに限定されない。典型的なＩＬ−１ｒａ誘導体には、配列番号２、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の配列の変異体の化学的若しくは酵素的に修飾される形態も含まれるが、それらには限定されない。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａという語には分泌性リーダー配列を有するＩＬ−１ｒａが含まれるがこれには限定されない。ある実施態様において、分泌性リーダー配列を有するＩＬ−１ｒａは「前駆体ＩＬ−１ｒａ」と呼ばれる。典型的な前駆体ＩＬ−１ｒａアミノ酸配列は配列番号２に記載されている。「前駆体ＩＬ−１ｒａ」という語には、分泌でき、前記インターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有する形態へとプロセシングされ得る配列番号２の断片、変異体及び誘導体が含まれる。

ＩＬ−１ｒａという語には、凝集性ＩＬ−１ｒａ及び凝集性が低下したＩＬ−１ｒａの両者が含まれる。凝集性ＩＬ−１ｒａタンパク質は位置９３でリジンを、位置９７でアルギニンを有するが、位置９３でリジンを及び位置９７でアルギニンを有するＩＬ−１ｒａタンパク質がすべて凝集性ＩＬ−１ｒａであるというわけではない。「凝集性ＩＬ−１ｒａ」には、以下のアッセイに従って３９℃で凝集するＩＬ−１ｒａ野生型、変異体及び誘導体タンパク質が含まれる。対象のＩＬ−１ｒａの１００ｍｇ／ｍｌの溶液を１０ｍＭリン酸塩、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６．５（ＰＳＥ）中で３９℃においてインキュベートする。基準物質として、配列番号５の配列を有するＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の１００ｍｇ／ｍｌの溶液を３９℃においてＰＳＥ中でインキュベートする。３９℃でのインキュベーションの２時間後に各溶液の光学密度を４０５ｎｍで測定する。もし前記対象のＩＬ−１ｒａが、インキュベーションの２時間後に前記ＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の光学密度の少なくとも６０％であるインキュベーションの２時間後の光学密度を有すれば、前記対象のＩＬ−１ｒａは凝集性ＩＬ−１ｒａである。

「凝集性が低下したＩＬ−１ｒａ」には、前述のアッセイにおいて前記ＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の光学密度の６０％より低い光学密度を有するＩＬ−１ｒａ変異体及び誘導体タンパク質が含まれる。

ある実施態様において、「インターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有するＩＬ−１ｒａ」という語は、実施例３において記載されているＩＬ−１ｒａシグナル伝達複合体形成アッセイにおいて、配列番号５のアミノ酸配列を有するＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質と同じ活性の少なくとも５０％であるＩＬ−１ｒａ野生型、変異体又は誘導体タンパク質を指す。「活性の少なくとも５０％」は、対象のＩＬ−１ｒａのＥＣ５０をＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質のＥＣ５０と比較することによって決定される。

「アルギニン−９７」という語は、配列番号３における９７番目の位置にある又は配列番号３における９７番目の位置にあるアミノ酸残基に対応するＩＬ−１ｒａにおけるアミノ酸の位置にあるアミノ酸残基を指す。例えば、配列番号３のアルギニン−９７に対応するアミノ酸は、配列番号５の９８番目の位置にあるアルギニンである。前記アルギニンは、依然ＩＬ−１ｒａのアルギニン−９７と呼ばれる。ある実施態様において、アルギニン−９７は「Ｒ９７」と呼ばれ、前記Ｒはアルギニンについての単一文字コードであり、９７は配列番号３における位置を指す。ある実施態様において、もしＲ９７が別のアミノ酸と置換されれば、前記変異はＲ９７Ｘと呼ばれ得、Ｘは前記置換アミノ酸についての単一文字コードである。したがって、制限のない例として、もしＲ９７がアラニンによって置換されれば、前記変異はＲ９７Ａと呼ばれ得る。

「リジン−９３」という語は、配列番号３における９３番目の位置にある又は配列番号３における９３番目の位置にあるアミノ酸残基に対応するＩＬ−１ｒａにおけるアミノ酸の位置にあるアミノ酸残基を指す。例えば、配列番号３のリジン−９３に対応するアミノ酸は、配列番号５の９４番目の位置にあるリジンである。前記リジンは、依然ＩＬ−１ｒａのリジン−９３と呼ばれる。ある実施態様において、リジン−９３は「Ｋ９３」と呼ばれ、前記Ｋはリジンについての単一文字コードであり、９３は配列番号３における位置を指す。ある実施態様において、もしＫ９３が別のアミノ酸と置換されれば、前記変異はＫ９３Ｘと呼ばれ得、Ｘは前記置換アミノ酸についての単一文字コードである。したがって、制限のない例として、もしＫ９３がアラニンによって置換されれば、前記変異はＫ９３Ａと呼ばれ得る。

「トリプトファン−１６」という語は、配列番号３における１６番目の位置にある又は配列番号３における１６番目の位置にあるアミノ酸残基に対応するＩＬ−１ｒａにおけるアミノ酸の位置にあるアミノ酸残基を指す。例えば、配列番号３のトリプトファン−１６に対応するアミノ酸は、配列番号５の１７番目の位置にあるトリプトファンである。前記トリプトファンは、依然ＩＬ−１ｒａのトリプトファン−１６と呼ばれる。ある実施態様において、トリプトファン−１６は「Ｗ１６」と呼ばれ、前記Ｗはトリプトファンについての単一文字コードであり、１６は配列番号３における位置を指す。ある実施態様において、もしＷ１６が別のアミノ酸と置換されれば、前記変異はＷ１６Ｘと呼ばれ得、Ｘは前記置換アミノ酸についての単一文字コードである。したがって、制限のない例として、もしＷ１６がアラニンによって置換されれば、前記変異はＷ１６Ａと呼ばれ得る。

「チロシン−３４」という語は、配列番号３における３４番目の位置にある又は配列番号３における３４番目の位置にあるアミノ酸残基に対応するＩＬ−１ｒａにおけるアミノ酸の位置にあるアミノ酸残基を指す。例えば、配列番号３のチロシン−３４に対応するアミノ酸は、配列番号５の３５番目の位置にあるチロシンである。前記チロシンは、依然ＩＬ−１ｒａのチロシン−３５と呼ばれる。ある実施態様において、チロシン−３４は「Ｙ３４」と呼ばれ、前記Ｙはチロシンについての単一文字コードであり、３４は配列番号３における位置を指す。ある実施態様において、もしＹ３４が別のアミノ酸と置換されれば、前記変異はＹ３４Ｘと呼ばれ得、Ｘは前記置換アミノ酸についての単一文字コードである。したがって、制限のない例として、もしＹ３４がアラニンによって置換されれば、前記変異はＹ３４Ａと呼ばれ得る。

ある実施態様において、「低下した凝集」は、（１）条件Ｂ下でのポリペプチドの凝集と比較して低下する条件Ａ下での前記ポリペプチドの凝集、及び／又は（２）条件Ａ下での野生型ポリペプチドの凝集と比較して低下する同一の条件Ａ下でのポリペプチド変異体の凝集、及び／又は（３）同一の条件Ａ下での異なるポリペプチド変異体の凝集と比較して低下する条件Ａ下でのポリペプチド変異体の凝集として定義される。制限のない例として、場合（１）について相対的な凝集は以下のように決定できる。条件Ａ下でのポリペプチドの４０５ｎｍでの光学密度をさまざまな時間で測定する。次に、条件Ｂ下での前記ポリペプチドの４０５ｎｍでの光学密度を同一のさまざまな時間で測定する。各条件下での前記対象ポリペプチドについての凝集曲線を、Ｙ軸上に光学密度で、Ｘ軸上に時間でプロットする。もし条件Ａ下での前記ポリペプチドが時間ｔで、同一の時間ｔでの条件Ｂ下での前記ポリペプチドよりも低い光学密度を有していれば、条件Ａ下でのポリペプチドは条件Ｂ下での前記ポリペプチドと比較して凝集が低下したといえる。

異なる条件の実施例には、緩衝液組成物における差異、温度における差異、ポリペプチド濃度における差異、アクセサリー分子の有無、アクセサリー分子濃度における差異等が含まれるが、これらに限定されない。

「アクセサリー分子」という語は、１つ以上のポリペプチドの凝集を低下させる分子を指す。ある実施態様において、アクセサリー分子は１つ以上のポリペプチドの凝集を非特異的に低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子は前記ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸と相互作用することによって凝集を低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子は、前記ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸と共有結合的に相互作用し、「共有結合アクセサリー分子」と呼ばれる。ある実施態様において、アクセサリー分子は、前記ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸と非共有結合的に相互作用し、「非共有結合アクセサリー分子」と呼ばれる。

ある実施態様において、ポリペプチドの凝集における低下は、前記アクセサリー分子の濃度と関連する。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を実質的に除去できる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも１０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも２０％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも３０％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも４０％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも５０％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも６０％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも７０％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも７５％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも８０％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも８５％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも９０％まで低下させる。アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を少なくとも９５％まで低下させる。

ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を低下させる。ある実施態様において、ポリペプチドの凝集の速度における低下は前記アクセサリー分子の濃度に依存する。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集を実質的に除去する。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも１０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも２０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも３０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも４０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも５０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも６０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも７０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも７５％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも８０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも８５％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも９０％まで低下させる。ある実施態様において、アクセサリー分子はポリペプチドの凝集の速度を少なくとも９５％まで低下させる。

ある実施態様において、アクセサリー分子は１つ以上のアミノ酸残基においてポリペプチドと共有結合的もしくは非共有結合的に相互作用する。ある実施態様において、アクセサリー分子は１つ以上の特異的アミノ酸残基と相互作用する。ある実施態様において、アクセサリー分子は前記ポリペプチドの活性を実質的に低下させない。ある実施態様において、アクセサリー分子は前記ポリペプチドの活性を１０％超まで低下させない。ある実施態様において、アクセサリー分子は前記ポリペプチドの活性を２０％超まで低下させない。アクセサリー分子は前記ポリペプチドの活性を３０％超まで低下させない。アクセサリー分子は前記ポリペプチドの活性を５０％超まで低下させない。アクセサリー分子は前記ポリペプチドの活性を７５％超まで低下させない。

ある実施態様において、アクセサリー分子はアミノ酸残基に存在する電荷を除去する。ある実施態様において、アクセサリー分子は前記アミノ酸残基を共有結合的に修飾することによって電荷を除去する。ある実施態様において、アクセサリー分子は前記アミノ酸残基と非共有結合的に相互作用し、それにより電荷を「マスクする」ことによって前記電荷を除去する。

典型的な共有結合アクセサリー分子には、６−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサン酸（ＮＢＤ−Ｘ）、リン酸メチルアセチル（ＭＡＰ）及びシトラコン酸無水物が含まれるが、これらには制限されない。

典型的な非共有結合アクセサリー分子には、糖、単一荷電陰イオン及び多荷電陰イオンが含まれるが、これらには限定されない。アクセサリー分子でありうる典型的な糖にはグリセロール、ショ糖、マンニトール及びソルビトールが含まれるが、これらには限定されない。アクセサリー分子でありうる典型的な単一荷電陰イオンにはリン酸塩及び塩化物が含まれるが、これらには制限されない。アクセサリー分子でありうる典型的な多荷電陰イオンにはピロリン酸塩及びクエン酸塩が含まれるが、これらには限定されない。

「アルギニン反応性アクセサリー分子」という語は、アルギニン残基と特異的に相互作用するアクセサリー分子を指す。ある実施態様において、アルギニン反応性アクセサリー分子はアルギニンだけと相互作用する。ある実施態様において、アルギニン反応性アクセサリー分子は、アルギニンに加えて他のアミノ酸と相互作用する。ある実施態様において、アルギニン反応性アクセサリー分子はアルギニンと共有結合的に相互作用する。ある実施態様において、アルギニン反応性アクセサリー分子はアルギニンと非共有結合的に相互作用する。ある実施態様において、アルギニン反応性アクセサリー分子は、アルギニンを含有するポリペプチドの活性を実質的に低下させない。

「リジン反応性アクセサリー分子」という語は、リジン残基と特異的に相互作用するアクセサリー分子を指す。ある実施態様において、リジン反応性アクセサリー分子は単にリジンだけと相互作用する。ある実施態様において、リジン反応性アクセサリー分子は、リジンに加えて他のアミノ酸と相互作用する。ある実施態様において、リジン反応性アクセサリー分子はリジンと共有結合的に相互作用する。ある実施態様において、リジン反応性アクセサリー分子はリジンと非共有結合的に相互作用する。ある実施態様において、リジン反応性アクセサリー分子は、リジンを含有するポリペプチドの活性を実質的に低下させない。

「多荷電陰イオン」という語は、ｐＨ６．５及び２５℃で１を超える負の電荷を含む分子を指す。ある実施態様において多荷電陰イオンは、ｐＨ６．５及び２５℃で平均して１を超えるが２未満の負の電荷を有する。ある実施態様において、多荷電陰イオンは、ｐＨ６．５及び２５℃で平均して２以上の負の電荷を有する。ある実施態様において、多荷電陰イオンは、ｐＨ６．５及び２５℃で平均２ないし４の負の電荷を有する。さまざまな実施態様において、当業者は、特定の陰イオンがｐＨ６．５及び２５℃で、例えば前記陰イオンについて公開されたｐＫａ値から多荷電陰イオンであるかどうかを決定できる。「単一荷電陰イオン」という語は、ｐＨ６．５及び２５℃で平均して１以下の負の電荷を有する陰イオンを指す。さまざまな実施態様において、当業者は、特定の陰イオンがｐＨ６．５及び２５℃で、例えば前記陰イオンについて公開されたｐＫａ値から単一荷電陰イオンであるかどうかを決定できる。

「糖」という語は炭水化物を指す。典型的な糖には単糖類、二糖類及び三糖類が含まれるがこれらには限定されない。制限のない例示的な糖にはグリセロール、ショ糖、マンニトール及びソルビトールが含まれるがこれらには限定されない。

疾病若しくは医学的状態は、もし前記自発的若しくは実験的疾病若しくは医学的疾患が体液若しくは組織中のＩＬ−１のレベルの上昇と関係していれば及び／又はもし前記身体から採取された細胞若しくは組織が培養物中におけるＩＬ−１のレベルの上昇を生じていれば、「インターロイキン−１仲介性疾病」であると考慮される。ある実施態様において、このようなインターロイキン−１仲介性疾病も以下の２つの条件のうちの１つ以上によって認識される。すなわち、（１）前記疾病若しくは医学的状態を伴う病理学的所見が、ＩＬ−１の投与又はＩＬ−１の発現の上方制御によって動物において実験的に模倣することができる、及び／又は（２）前記疾病若しくは医学的状態の実験的動物モデルにおいて誘発される病状が、ＩＬ−１の作用を阻害する因子による治療によって抑制若しくは無効にできる。ある実施態様において、前述の条件の１つまたはそれ以上がＩＬ−１仲介性疾病において満たされる。ある実施態様において、前記条件のすべてがＩＬ−１仲介性疾病において満たされる。

急性及び慢性のインターロイキン−１（ＩＬ−１）仲介性疾病は、以下に限定されないが、以下を含む。急性膵炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、又はルー・ゲーリック病）、アルツハイマー病、カヘキシー／食欲不振症（ＡＩＤＳ誘発性カヘキシーを含むがこれに限定されない。）、喘息及び他の肺疾患、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性血管炎、慢性疲労症候群、クロストリジウム関連疾患（クロストリジウム関連下痢を含むがこれに限定されない。）、冠動脈状態及び症状（うっ血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋不全（例、敗血症と関連した）及び冠状動脈パイパス移植を含むがこれらに限定されない。）、癌［白血病（多発性骨髄腫白血病及び骨髄性白血病（例、ＡＭＬ及びＣＭＬ）を含むがこれらに限定されない。）及び腫瘍転移を含むがこれらに限定されない。］、糖尿病（インスリン依存性糖尿病を含むがこれに限定されない。）、子宮内膜症、発熱、線維筋痛症、糸球体腎炎、移植片対宿主病及び／又は移植臓器拒絶、出血性ショック、痛覚過敏、炎症性腸疾患、関節の炎症性状態（変形性関節症、乾癬性関節炎及び関節リウマチを含むがこれらに限定されない。）、炎症性眼疾患（限定されないが例えば角膜移植に関連したものを含む。）、虚血［脳虚血（それぞれが神経変性に至り得る例えばトラウマ、癲癇、出血又は発作の結果としての脳障害を含むがこれには限定されない。）を含むがこれに限定されない。］、川崎病、学習障害、肺疾患（急性呼吸窮迫症候群又はＡＲＤＳを含むがこれらに限定されない。）、多発性硬化症、筋症［例、筋タンパク質代謝（敗血症における筋タンパク質代謝を含むがこれには限定されない。）］、神経毒性（ＨＩＶによって誘発される状態を含むがこれに限定されない。）、骨粗鬆症、疼痛（ガン関連疼痛を含むがこれに限定されない。）、パーキンソン病、歯周病、早産、乾癬、再灌流障害、敗血症ショック、放射線療法からの副作用、顎関節症、睡眠障害、ぶどう膜炎並びに炎症性状態（例えば歪み、捻挫、軟骨損傷、トラウマ、整形外科的手術、感染又は他の疾病過程から生じるもの）。

いくつかの典型的な実施態様の詳述。

凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させる方法が提供される。ある実施態様において、凝集を低下させるべき凝集性ＩＬ−１ｒａは、配列番号２、配列番号３、配列番号５又は配列番号６におけるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、凝集を低下させるべき凝集性ＩＬ−１ｒａは、配列番号２、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片、変異体又は誘導体を含み、前記断片、変異体又は誘導体はインターロイキン−１受容体に対するアンタゴニスト活性を有する。

ＩＬ−１ｒａの凝集は、２つのＩＬ−１ｒａポリペプチドの表面残基の間の１つまたはそれ以上の陽イオン−パイ相互作用から生じうる。例えば、図２に示されるように、あるＩＬ−１ポリペプチドのリジン−９３は、第二のＩＬ−１ポリペプチドのトリプトファン−１６との陽イオン−パイ相互作用を形成し得る。同様に、あるポリペプチドのアルギニン−９７は、第二のポリペプチドのチロシン−３４との陽イオン−パイ相互作用を形成し得る。これらの相互作用は、２つのＩＬ−１ｒａポリペプチドを互いに結合させうる。さらに、前記結合が非対称性であり、このことは両者のポリペプチド上の同一面の間に結合が生じないことを意味し、したがって、それぞれのポリペプチドは２つのＩＬ−１ｒａポリペプチドへ同時に結合することができ得る。実際、もしさらなる非対称性結合接触がＩＬ−１ｒａポリペプチド間で可能であれば、１個のＩＬ−１ｒａポリペプチドは２個を超えるＩＬ−１ｒａポリペプチドへ同時に結合し得る。もしそれぞれのＩＬ−１ｒａポリペプチドが少なくとも２つの他のＩＬ−１ｒａポリペプチドへ、例えば図８に示される非対称性陽イオン−パイ相互作用を通じて、結合できれば、これら相互作用は溶液中におけるＩＬ−１ｒａの凝集をもたらしうる。

ある実施態様において、凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集は、リジン−９３における、アルギニン−９７における、又はリジン−９３及びアルギニン−９７の両者における正の電荷を低下させることによって低下させ得る。ある実施態様において、もし前記位置の一方又は両方の正の電荷を十分に低下させ得れば、陽イオン−パイ相互作用は、形成できず、又はもはやＩｌ−１ｒａの凝集を生じるのに十分安定ではないように弱め得る。ある実施態様において、凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集は他のメカニズムによって低下させ得る。この方法は、凝集における低下のメカニズムによって制限されない。凝集を低下させるための記載された方法のいずれもが、上に論議された典型的な提唱されたメカニズムによって又は記載された結果に到達するその他のメカニズムによって、生じうる。凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集を低下できる分子は、凝集を低下させるメカニズムに関係なく及び共有結合的に若しくは非共有結合的に作用するかどうかに関係なく、集約的に「アクセサリー分子」と呼ばれる。

ある実施態様において、アクセサリー分子はリジン−９３又はアルギニン−９７のうちの１方又は両方において正の電荷を低下させることにより、凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させ得る。さまざまな実施態様において、アクセサリー分子は、リジン−９３において、アルギニン−９７において、又はリジン−９３及びアルギニン−９７の両方において共有結合的に若しくは非共有結合的に正の電荷を低下させ得る。前記アミノ酸のうちの１方又は両方において正の電荷を低下させるとされるアクセサリー分子は、他のメカニズムを通じても凝集を低下させ得又は他のメカニズムによって完全に作用し得る。

ある実施態様において、凝集性ＩＬ−１ｒａを単一荷電陰イオン分子若しくは多荷電陰イオン分子とインキュベートすることによって、ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させ得る。ある実施態様において、凝集性の低下したＩＬ−１ｒａを単一荷電陰イオン分子若しくは多荷電陰イオン分子とインキュベートすることによってさらにＩＬ−１ｒａの凝集を低下させ得る。ある実施態様において、凝集における前記低下は、リジン−９３において、アルギニン−９７において、又はリジン−９３及びアルギニン−９７の両方において正の電荷と相互作用する単一荷電陰イオン分子若しくは多荷電陰イオン分子から生じうる。実施例２において記載された実験において論議され、図１に示されるように、１０ｍＭクエン酸塩を含有するＣＳＥ中の凝集性ＩＬ−１ｒａをインキュベートすることは、１０ｍＭリン酸塩を含有するＰＳＥ中の前記凝集性ＩＬ−１ｒａをインキュベートすることよりも（４０５ｎｍでの光学密度によって測定されるように）凝集が時間にわたって低下した。前記実験において、ＣＳＥ中の凝集は約０．５５のＯＤ_４０５に達したのに対し、ＰＳＥ中の凝集は約１．２のＯＤ_４０５に達した。したがって、ＣＳＥ中のインキュベーションは、前記実験においてＰＳＥ中の凝集に対して５０％を超えるまで凝集を低下させた。

同様に、実施例２に記載の実験において、ＣＳＥ中の凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集の速度は、ＰＳＥ中の凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集の速度よりも低かった。図１におけるＰＳＥ中の凝集の速度は、Ｋ_ａｇｇとして記される線の傾斜によって表される。同様の線が図１におけるＣＳＥについて描かれ得、ＰＳＥと比較してＣＳＥ中の凝集速度が低いことを示す、前記線はより浅い傾斜を有するであろう。

ある実施態様において、クエン酸塩はｐＨ６．５でリン酸塩よりも大きな負の電荷を有するため、凝集を低下させる上でより効果的でありうる。ある実施態様において、負の電荷の一定の量は、凝集を低下させる上で他者よりも効果的でありうる。さらに、ある実施態様において、負の電荷の特定の立体配置、例えばアクセサリー分子上の負の電荷間の距離及び前記負の電荷が空間的にどれだけ「固定されている」かも、アクセサリー分子の有効性に影響を及ぼしうる。したがって、ある実施態様において、さまざまなアクセサリー分子の有効性は負の電荷の量によって影響を及ぼされうるが、負の電荷の量は必ずしも決定的であるわけではない。ある実施態様において、多荷電陰イオンは、単一荷電陰イオンよりも凝集を低下させる上でより効果的でありうる。さまざまな実施態様において、当業者は、アクセサリー分子を選択でき、意図する特定の適用のために適切であると決定できる。例えば、特定のアクセサリー分子は、特定の温度でより効果的であり得又はあまり効果的であり得ない。さまざまな実施態様において、当業者は、凝集性ＩＬ−１ｒａがインキュベートされるか又は保存されるであろう特定の温度で効果的であるアクセサリー分子を選択できる。ある実施態様において、アクセサリー分子は約２０℃ないし４５℃で凝集を低下させるのに効果的であるものが選択される。ある実施態様において、アクセサリー分子は、約２５℃ないし４５℃で凝集を低下させるのに効果的であるものが選択される。ある実施態様において、アクセサリー分子は、約３０℃ないし４５℃で凝集を低下させるのに効果的であるものが選択される。ある実施態様において、アクセサリー分子は、約３５℃ないし４５℃で凝集を低下させるのに効果的であるものが選択される。

ある実施態様において、アクセサリー分子の濃度を変化させることは、凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集における低下又は凝集の速度における低下に影響を及ぼしうる。実施例４で論じられ図３に示された実験において、リン酸塩、クエン酸塩又はピロリン酸塩のさまざまな濃度においてインキュベートされた凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集の速度を考慮した。前記実験において、クエン酸及びピロリン酸塩は、凝集の速度における低下とこのアクセサリー分子の濃度との間に似た相関を示した。クエン酸塩及びピロリン酸塩は両者とも、１０ｍＭアクセサリー分子での凝集の速度におけるほぼ９０％の低下を示した。前記低下は２０ｍＭでクエン酸塩及びピロリン酸塩の両者について増大した後、１００ｍＭを超えたところで横ばい状態になった。対照的に、リン酸塩は１０ｍＭにおける凝集速度において約２０％だけの低下を示し、前記低下は約８０ｍＭになるまで横ばい状態にならなかった。実施例４において論議された実験の結果は、ピロリン酸塩及びクエン酸塩が２９℃で凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集の速度を低下させる上で実質的に等しく効果的であることを示唆している。クエン酸塩及びピロリン酸塩の両者は、ｐＨ６．５でリン酸塩よりも大きな負の電荷を有する。このことは、ある実施態様において、負の電荷の量が特定のアクセサリー分子の有効性に影響を及ぼしうることを示唆している。

ある実施態様において、糖はアクセサリー分子でありうる。アクセサリー分子でありうる典型的な糖は、制限されないが、ショ糖、グリセロール、マンニトール及びソルビトールを含み得る。実施例５は、ショ糖、グリセロール、又はソルビトールの濃度の上昇が、凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集の速度を低下させる典型的な実験を示す（図４参照）。３％において、前記３つの糖の各々は、０％の糖における２０凝集単位（ａ．ｕ．； １ａ．ｕ．は２００μｌの容積及びＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ（登録商標）プレート読み取り分光光度計を使用したときの１分間あたり４０５ｎｍにおける１ミリ光学密度単位の上昇に等しい。）を超える凝集の速度と比較して、５ａ．ｕ．未満まで凝集の速度を低下させた。

さまざまな実施態様において、当業者は、例えば実施例４若しくは実施例５の方法を使用することによって、特定の適用のために非共有結合的アクセサリー分子の適切な濃度を決定できる。ある実施態様において、アクセサリー分子は１ないし１００ｍＭの濃度で存在しうる。ある実施態様において、アクセサリー分子は１ないし５０ｍＭの濃度で存在しうる。ある実施態様において、アクセサリー分子は１ないし２０ｍＭの濃度で存在しうる。ある実施態様において、アクセサリー分子は１０ｍＭの濃度で存在しうる。

ある実施態様において、アクセサリー分子は０ないし１０％の濃度で存在しうる。ある実施態様において、アクセサリー分子は０ないし５％の濃度で存在しうる。ある実施態様において、アクセサリー分子は１％、２％、又は３％の濃度で存在しうる。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは１０ｍＭ未満である。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは７ｍＭ未満である。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは５ｍＭ未満である。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは４ｍＭ未満である。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは３ｍＭ未満である。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは０．１ｍＭないし５ｍＭである。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは１ｍＭないし５ｍＭである。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは０．１ｍＭないし４ｍＭである。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは１ｍＭないし４ｍＭである。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａに対する非共有結合的アクセサリー分子のＫ_ｄは２ｍＭないし４ｍＭである。

ある実施態様において、アクセサリー分子は、凝集性ＩＬ−１ｒａを共有結合的に修飾することによって凝集を低下させ得る。ある実施態様において、アクセサリー分子は、凝集の低下したＩＬ−１ｒａを共有結合により修飾することによって凝集をさらに低下できる。ある実施態様において、前記共有結合による修飾はリジン−９３において、アルギニン−９７において、又はリジン−９３及びアルギニン−９７の両者において、正の電荷を除去する。ある実施態様において、共有結合したアクセサリー分子は別のメカニズムによって、例えば、凝集性ＩＬ−１ｒａポリペプチド間の１つ以上の陽イオン−パイ相互作用又は他の相互作用の形成を立体的に阻害することによって凝集を低下させ得る。

ＩＬ−１ｒａを共有結合により修飾できる制限のない典型的なアクセサリー分子には、ＮＢＤ−Ｘ、ＭＡＰ及びシトラコン酸無水物が含まれるがこれらに限定されない。ある実施態様において、ＮＢＤ−Ｘは一級アミンを有する誘導体を形成する。実施例３において論議され図２に示された実験において、ＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質をＮＢＤ−Ｘ、ＳＥとインキュベートすることによって前記ポリペプチド及びリジン−９３のアミノ末端アミン基が誘導体化した。ある実施態様において、ＮＢＤ−Ｘによる誘導体化はリジン−９３の正の電荷を除去でき、誘導体化されるＩＬ−１ｒａの凝集を低下できる。ある実施態様において、ＭＡＰはポリペプチドのリジン残基及びＮ末端アミノ基をアセチル化する。実施例７において論議され図１３ないし１５に示された実験において、インキュベーションのさまざまな時間における、ＩＬ−１ｒａとＭＡＰとのインキュベーションにより、ＩＬ−１ｒａのＮ末端アミノ基の誘導体化、ＩＬ−１ｒａのＮ末端アミノ基及びリジン−６の誘導体化、ＩＬ−１ｒａのＮ末端アミノ基、リジン−６及びリジン−９３の誘導体化、又はＩＬ−１ｒａのＮ末端アミノ基、リジン−６及びリジン−９３及びリジン−９６の誘導体化が生じた。ある実施態様において、ＭＡＰによる誘導体化は、リジン−９３における正の電荷を除去でき、誘導体化されたＩＬ−１ｒａの低下した凝集をもたらし得る。

ある実施態様において、他のアミン反応性分子は、１つ以上の正の電荷を除去することによって又は別のメカニズムを通じて、凝集性ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させ得る。ある実施態様において、共有結合アクセサリー分子により誘導体化されたＩＬ−１ｒａは、同様に誘導体化されなかったＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の少なくとも９０％の活性がある。ある実施態様において、共有結合アクセサリー分子により誘導体化されたＩＬ−１ｒａは、同様に誘導体化されなかったＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の少なくとも８０％の活性がある。ある実施態様において、共有結合アクセサリー分子により誘導体化されたＩＬ−１ｒａは、同様に誘導体化されなかったＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の少なくとも７５％の活性がある。ある実施態様において、共有結合アクセサリー分子により誘導体化されたＩＬ−１ｒａは、同様に誘導体化されなかったＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の少なくとも５０％の活性がある。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ及び少なくとも１つのアクセサリー分子を含むキットが提供される。もし構成要素が個別に提供されれば、キットは必要に応じて、前記ＩＬ−１ｒａと前記少なくとも１つのアクセサリー分子とを組み合わせるための説明書を含み得る。ある実施態様において、キットは、前記ＩＬ−１ｒａ及び前記少なくとも１つのアクセサリー分子を使用するための説明書を含む。ある実施態様において、前記キットは少なくとも１つの共有結合アクセサリー分子及び／又は少なくとも１つの非共有結合アクセサリー分子を含むことができる。キットが少なくとも１つの共有結合アクセサリー分子を含むとき、前記キットはさらに、ＩＬ−１ｒａを前記共有結合アクセサリー分子とインキュベートした後に、誘導体化されたＩＬ−１ｒａからいずれかの残存する反応していないアクセサリー分子を除去するための説明書を含むことができる。ある実施態様において、キットは、少なくとも１つの共有結合アクセサリー分子ですでに誘導体化されたＩＬ−１ｒａを含有する。同様に、ある実施態様において、キットは少なくとも１つの非共有結合アクセサリー分子と共に有る組成物中にすでにあるＩＬ−１ｒａを含有できる。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａの治療的有効量と、医薬的に許容可能な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存料及び／又はアジュバントとを含む医薬組成物が提供される。

ある実施態様において、許容される処方材料は、採用される投与量及び濃度においてレシピエントに対して無毒性である。

ある実施態様において、医薬組成物は、前記組成物の例えばｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色彩、等張性、香り、無菌性、安定性、溶解若しくは放出の速度、吸収、及び／又は浸透を修飾、維持及び／又は保存するための処方材料を含むことができる。典型的な処方材料には、（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、及びリジンなどの）アミノ酸、抗菌剤、（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、及び亜硫酸水素ナトリウムなどの）抗酸化剤、（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、及び他の有機酸などの）緩衝液、（マンニトール及びグリシンなどの）充填剤、（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの）キレート剤、（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン及びヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどの）複合剤、賦形剤、単糖類、二糖類及び（グルコース、マンノース、及びデキストリンなどの）他の炭水化物、（血清アルブミン、ゼラチン、及び免疫グロブリンなどの）タンパク質、着色料、香料及び希釈剤、乳化剤、（ポリビニルピロリドンなどの）親水性ポリマー、低分子量ポリペプチド、（ナトリウムなどの）塩形成対イオン、（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、及び過酸化水素などの）保存料、（グリセリン、プロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどの）溶媒、（マンニトール及びソルビトールなどの）糖アルコール、懸濁剤、［プルロニクス、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、（ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などの）ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなどの］界面活性剤若しくは湿潤剤、（ショ糖及びソルビトールなどの）安定性亢進剤、［（塩化ナトリウム及び塩化カリウムなどの）ハロゲン化アルカリ金属、マンニトール、ソルビトールなどの］緊張度亢進剤、送達媒体、希釈剤、賦形剤及び医薬アジュバントが含まれるがこれらに限定されない。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ （１９９０）を参照してほしい。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａ及び／又は１つ以上の更なる治療剤は、半減期延長媒体に連結される。典型的な媒体には、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、及びデキストランが含まれるがこれらに限定されない。ある典型的な媒体は、例えば米国出願シリアル番号第０９／４２８，０８２号及び公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２５０４４号に記載されている。

ある実施態様において、最適な医薬組成物は、例えば投与の意図された経路、送達フォーマット及び望ましい投与量に依存して当業者によって決定される。例えば、前述のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照してほしい。ある実施態様において、このような組成物は、ＩＬ−１ｒａの物理的状態、安定性、生体内放出速度、及び生体内クリアランスの速度に影響を及ぼしうる。

ある実施態様において、医薬組成物中の一次媒体若しくは担体はまったく、水性若しくは非水性のいずれかでありうる。例えばある実施態様において、適切な媒体若しくは担体は、注射用の水、生理塩類溶液又は人工脳脊髄液でありえ、非経口投与のための組成物中において共通の、他の材料でおそらく補強される。ある実施態様において、中性の緩衝された塩類溶液又は血清アルブミンと混合された塩類溶液はさらに典型的な媒体である。ある実施態様において、医薬組成物は、ｐＨ約７．０ないし８．５のトリス緩衝液又はｐＨ４．０ないし５．５の酢酸緩衝液を含み、さらにソルビトール又は前記医薬組成物のための適切な基質を含むことができる。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａを含む組成物は、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ又はそれ以上の更なる治療剤を含み又は含まずして、前記選択された所望の純度を有する組成物をいずれかの最適な処方剤（前述のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と混合することによって、保存用に、凍結乾燥したケーキ又は水溶液の形態に調製できる。さらに、ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａを含む組成物は、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ又はそれ以上の更なる治療剤を含み又は含まずして、ショ糖などの適切な賦形剤を使用する凍結乾燥物として調合できる。

ある実施態様において、本発明の医薬組成物は非経口送達用に選択できる。ある実施態様において、前記組成物は、吸入のために又は経口用などの消化管を通じての送達のために選択できる。このような医薬的に許容可能な組成物の調製は、本分野の技術内である。

ある実施態様において、非経口投与が意図されるとき、治療用組成物は、医薬的に許容可能な媒中の、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ以上の更なる治療剤の入った若しくは入っていない、所望のＩＬ−１ｒａを含む、発熱物質を含まない、非経口的に許容可能な水溶液の形態にありうる。ある実施態様において、非経口的注射のための媒体は、ＩＬ−１ｒａが、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ以上の更なる治療剤を含み又は含まずして、適切に保存される滅菌済みの等張性溶液として処方される滅菌蒸留水である。ある実施態様において前記調製物は、製剤の徐放性向けに提供でき徐放性製剤注射を介して送達できる注射可能な微粒子、生体内分解性粒子、（ポリ乳酸若しくはポリグリコール酸などの）ポリマー化合物、ビーズ又はリポソームなどの作用物を伴う前記望ましい分子の調合を包含できる。ある実施態様において、ヒアルロン酸も使用でき、循環において時間の持続を促進する効果を有しうる。ある実施態様において、埋め込み可能な薬物送達デバイスは前記望ましい分子を導入するのに使用できる。

ある実施態様において、医薬組成物は吸入向けに処方できる。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａは、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ以上の更なる治療剤を含み又は含まずして、吸入用の乾燥粉末として処方できる。ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａを含む吸入溶液は、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ以上の更なる治療剤を含みまたは含まずして、エアロゾル送達のための噴霧剤とともに調合できる。ある実施態様において、溶液は噴霧できる。肺への投与はさらに、化学的に修飾されるタンパク質の肺への送達を記載するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に記載されている。

ある実施態様において、調合物が経口的に投与でき得ることが意図される。ある実施態様において、前記のように投与されるＩＬ−１ｒａは、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ又はそれ以上の更なる治療剤を含み又は含まずして、錠剤及びカプセルなどの固体剤形の混合において通常使用される担体と共に又は担体なしで調合される。ある実施態様において、カプセルは、胃腸管中の、生物学的利用能が最大化され、前全身的分解が最小化される場所において、前記調合物の活性部分が放出されるように設計され得る。ある実施態様において、少なくとも１つの更なる作用剤を、ＩＬ−１ｒａ及び／又はいずれかのアクセサリー分子及び／又はいずれかの更なる治療剤の吸収を容易にするために、含ませることができる。ある実施態様において、希釈剤、香料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤がまた使用できる。

ある実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ以上の更なる治療剤を含み又は含まずして、錠剤の製造に適した無毒性賦形剤との混合物として、ＩＬ−１ｒａの有効な量を含み得る。ある実施態様において、溶液は、錠剤を滅菌水又は別の適切な媒体中に溶解することによって、単位剤形に調製できる。ある実施態様において、適切な賦形剤は、以下に限定されないが、不活性希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若しくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース又はリン酸カルシウムなど）又は結合剤（澱粉、ゼラチン又はアカシアなど）又は潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又は滑石など）などを含む。

ＩＬ−１ｒａを含む調合物を含み、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ以上の更なる治療剤を含み又は含まない、徐放又は制御送達調合物である、更なる医薬組成物は、当業者に明らかである。ある実施態様において、リポソーム担体、生体内分解性微粒子又は多孔性ビーズ及び徐放性注射剤などの、他の多様な徐放または制御送達調合剤を調合技術が、また当業者に知られている。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の調節された放出を記載するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照。ある実施態様において、徐放性製剤は、成形された物品の形態、例えばフィルム又は微小カプセルの形態における、半透過性ポリマーマトリクスを包含できる。徐放性マトリクスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（例えば米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許第０５８，４８１号を参照）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎほか、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ， ２２：５４７−５５６ （１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）（Ｌａｎｇｅｒほか、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ．， １５：１６７−２７７ （１９８１）及びＬａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ．， １２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒほか、前述）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許第１３３，９８８号）を含み得る。ある実施態様において、徐放性組成物は、この分野で知られているいくつもの方法のいずれかによって調製できるリポソームを包み得る。例えばＥｐｐｓｔｅｉｎほか、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：３６８８−３６９２ （１９８５）、欧州特許第０３６，６７６号、欧州特許第０８８，０４６号及び欧州特許第１４３，９４９号を参照。

生体内投与のために使用される医薬組成物は典型的に滅菌済みである。ある実施態様において、この組成物は、滅菌用ろ過膜を通じてのろ過により達成できる。ある実施態様において、前記組成物が凍結乾燥されている場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前若しくは後のいずれかに実施できる。ある実施態様において、非経口投与のための組成物は凍結乾燥された形態として又は溶液中に保存できる。ある実施態様において、非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器に、例えば皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ若しくはバイアルに、入れられる。

ある実施態様において、医薬組成物が調合された後、これは、溶液、懸濁液、ジェル、乳化剤、固体として又は脱水され若しくは凍結乾燥された粉末として、滅菌バイアル中に保存できる。ある実施態様において、このような調合物は、直ちに使用できる形態又は投与前に再構成される（例、凍結乾燥した）形態のいずれかとして、保存できる。

ある実施態様において、キットは、単一投与量投与単位を調整するために提供される。ある実施態様において、前記キットは各々、乾燥したタンパク質を有する第一容器及び水性調合物を有する第二容器の両者を含有できる。ある実施態様において、単一及び複数のチャンバーのある予め充填されたシリンジ（例、液体シリンジ及び凍結シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。

ある実施態様において、治療上採用される、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ又はそれ以上の更なる治療剤を含むまたは含まない、ＩＬ−１ｒａを含む医薬組成物の有効量は、例えば治療内容及び目的に依存する。ある実施態様よれば、当業者は、治療のための適切な投与量レベルが、送達される分子により、ＩＬ−１ｒａが少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ又はそれ以上の更なる治療剤を含み又は含まずして使用される症状により、投与の経路により及び患者の大きさ（体重、体表面又は器官サイズ）及び／又は条件（年齢及び一般的な健康状態）により、部分的に変動するであろうことを認識する。ある実施態様において、臨床医は、投与量を調節でき、最適な治療効果を得るための投与の経路を修正できる。ある実施態様において、典型的な投与量は、前述の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲でありうる。ある実施態様において、前記投与量は０．１μｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、又は１μｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇ、又は５μｇ／ｋｇないし約１００ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。

ある実施態様において投与の頻度は、使用される調合物におけるＩＬ−１ｒａ及び／又はいずれかのアクセサリー分子及び／又はいずれかの更なる治療剤の薬物動態パラメータが考慮される。ある実施態様において、臨床医は、前記組成物を、投与量が所望の効果に達するまで投与する。ある実施態様において、前記組成物は、それゆえ、単回投与として又は経時的な２回以上の投与（所望の分子の同一量を含有してもよいし含有しなくともよい。）として又は埋め込みデバイス若しくはカテーテルを介しての連続注入として、投与できる。適切な投与量の更なる改良は当業者により日常的になされ、当業者により日常的になされる課題の範囲内にある。ある実施態様において、適切な投与量は、適切な投与反応のデータの使用を通じて確定できる。

ある実施態様において、前記医薬組成物の投与の経路は公知の方法に従っており、例えば、経口的に、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路による注射を通じて、徐放系によって又は埋め込みデバイスによって、なされる。ある実施態様において、前記組成物は、大量瞬時投与によって若しくは注入により連続的に又は埋め込みデバイスによって、投与できる。

ある実施態様において、前記組成物は、前記所望の分子が吸収又は封入されている膜、スポンジ又は別の適切な材料の埋め込みを介して、局所的に投与できる。ある実施態様において、埋め込みデバイスが使用される場合、前記デバイスはいずれかの適切な組織若しくは器官へと埋め込まれることができ、前記所望の分子の送達は、拡散、時限放出性大量瞬時投与又は連続投与を介してでありうる。

ある実施態様において、ＩＬ−１ｒａを含み、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ又はそれ以上の更なる治療剤を含み又は含まない医薬組成物を、エキソビボ様式で使用することが望まれうる。このような場合、患者から取り出された細胞、組織及び／又は器官を、ＩＬ−１ｒａを含み、少なくとも１つのアクセサリー分子及び／又は１つ又はそれ以上の更なる治療剤を含み又は含まない医薬組成物に暴露し、その後続いて、前記細胞、組織及び／又は器官を前記患者へ埋め戻す。

ある実施態様において、低下した凝集性を有するＩＬ−１ｒａ及び／又はいずれかのアクセサリー分子及び／又はいずれかの更なる治療剤は、ポリペプチドを発現させ及び分泌させるように、この分野で公知の方法を使用して遺伝子工学的に改変された特定の細胞を埋め込むことによって送達できる。ある実施態様において、このような細胞は、動物又はヒト細胞であり、自己起源の、異種起源の又は異種間のものでありうる。ある実施態様において、前記細胞は不死化できる。ある実施態様において、免疫学的反応の機会を低下させるため、細胞を封入して、周囲の組織の浸潤を回避することができる。ある実施態様において、前記封入材料は、典型的に、タンパク質製剤を放出させ得るようにする一方、患者の免疫系による又は取り囲んでいる組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防ぐことを可能にする生体適合性、半透過性のポリマー封入剤又は膜である。

（実施例）
実施した実験及び達成した結果を含む以下の実施例は、説明目的のためにのみ提供され、本発明に制限を加えるものとして解決されるべきものではない。

ＩＬ−１ｒａ野生型タンパク質の生成。
配列番号５の配列を有するヒト組み換え型インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、細胞回収段階を行っても行わなくともよい、欧州特許第ＥＰ０，５０２，９５６ Ｂ１号において論議される方法に従って、Ａｍｇｅｎ製造施設において調製できる。あるいは、配列番号５のアミノ酸配列を有するアナキンラがＡｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ， ＣＡから得られうる。配列番号５のアミノ酸配列を有する精製されたヒトＩＬ−１ｒａをここに記載の実施例において使用した。

ＩＬ−１ｒａ凝集。
リン酸塩緩衝液中及びクエン酸塩緩衝液中における３９℃でのＩＬ−１ｒａ凝集を以下のとおり決定した。ＩＬ−１ｒａストック溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）（ＣＳＥ）中の２００ないし２２０ｍｇ／ｍｌタンパク質）の１０ｍｌを４℃で一晩、１０ｍＭリン酸塩、１４０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）（ＰＳＥ）の２×２Ｌか又はＣＳＥの２×２Ｌのいずれかに対して透析した。前記透析溶液を０．２μｍフィルターを通じてろ過し、ＩＬ−１ｒａタンパク質濃度を適切な緩衝液による希釈によって１４０ｍｇ／ｍｌに調整した。

各緩衝液中のＩＬ−１ｒａの凝集を、９６穴ガラスプレート（Ｚｉｓｓｎｅｒ）及び温度調節プレート読み取り分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））を使用して測定した。ウェル１個あたりの試料サイズは１８０μｌであった。前記プレートを前記分光光度計において３９℃でインキュベートし、前記光学密度を４０５ｎｍで１分ごとに測定した。図１は、本実験について、時間の関数としてプロットされた４０５ｎｍにおける光学密度を示す。凝集の速度を、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して飽和曲線の初期直線領域の傾斜として決定した。ＣＳＥ中でインキュベートされたＩＬ−１ｒａの凝集の速度は、ＰＳＥ中でインキュベートされたＩＬ−１ｒａの凝集の速度と比較して低い。さらに、ＣＳＥ中でインキュベートされたＩＬ−１ｒａの凝集の程度は、ＰＳＥ中でインキュベートされたＩＬ−１ｒａの凝集の程度と比較して低い。

ＩＬ−１ｒａのＮＢＤ−Ｘ標識。
表面に露出されたアミノ基を、ＮＢＤ−Ｘ，ＳＥ（スクシニミジル６−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４イル）アミノ）ヘキサン酸、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いてＩＬ−１ｒａを標識することによって特定した。ＮＢＤ−Ｘはアミノ基による誘導体化により蛍光性になる。ＰＳＥ中の０．２ｍＭＩＬ−１ｒａの２０μｌμｌをＰＳＥの４８０μｌμｌで希釈した。ジメチルホルムアミド中の５０μｇ／μｌμｌＮＢＤ−Ｘ，ＳＥの８μｌを、室温で前記ＩＬ−１ｒａ溶液へ２μｌμｌずつ増分して添加した。反応物を、室温で１時間インキュベートした後、１．５Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ８．５）の５０μｌμｌの添加によって停止させた。反応混合物をＰＳＥで予め平衡化しておいた脱塩のためのゲルろ過カラムに通した。前記タンパク質ピークを、回収し、以下のようにＲＰ−ＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりさらに分析した。

逆相ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）５μＣ４カラム（３００Å、２５０×４．６ｍｍ）及びオンライン吸光検出器及び蛍光検出器が装備されたＨＰ１１００ＨＰＬＣシステムを使用して実施した。ポリペプチドの存在を検出するため、吸光度を２１５ｎｍで測定した。アミンにより誘導体化されるＮＢＤ−Ｘの存在を検出するため、４８０ｎｍでの励起後に蛍光発光を５３５ｎｍで測定した。溶出を０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び水中のメタノールの直線的な３０ないし４５％の勾配（ｖ／ｖ／ｖ）を使用して実施した。図２は、２１５ｎｍでのＮＢＤ−Ｘにより標識されたＩＬ−１ｒａの吸光度及び本実験用の４８０ｎｍでの励起後の５３５ｎｍでのＮＢＤ−Ｘにより標識されたＩＬ−１ｒａの蛍光発光を示す。蛍光ピークの同定を以下のとおり決定した。

２つの主要蛍光ピーク、すなわち、先に溶出する１６．７５分のピークおよび後に溶出する１７．５分のピークを特定した。図２の下部パネルを参照。これらのピークを手動で回収し、以下のとおりＬｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼにより消化した。各ピークを５回の個別のＨＰＬＣ実施から回収した。１６．７５ピークを主として含有する画分のすべてをプールした。１７．５分ピークを主として含有する画分のすべてをプールした。前記２つのプールされた試料を次に、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器を使用する遠心分離により乾燥させた。前記プールされた試料の各々を、１０ｍＭトリス、０．８Ｍ塩酸グイニジニウムを含有する消化緩衝液（ｐＨ８．０）４９０μｌμｌに溶解した。次に、５０μｌの消化緩衝液中に５μｇのＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ（配列決定級、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を溶解することによって調製されたＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ溶液の１０μｌを、プールされた各試料に添加した。前記試料を３７℃で一晩消化した。消化後、生じたペプチドを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ ＨＰＬＣの装備されたＦｉｎｎｅｇａｎ ＬＣＱ Ｄｅｃａを使用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳへ、標準的な製造者プロトコールに従って供した。

先に溶出するピーク（１６．７５分）について、消化により、２７６ａｍｕの加算された質量を有する、ＩＬ−１ｒａのアミノ末端ペプチドに対応する、質量１１０７．８ｍ／ｚの唯一のペプチドが生じた。このことは、ＮＢＤ誘導体の存在を示唆する。このペプチドのＭＳ／ＭＳ分析は、アミノ酸配列ＭＲＰＳＧＲＫに加えてメチオニン残基の２７６ａｍｕの追加の質量からなる断片を生じ、ＩＬ−１ｒａのアミノ末端メチオニンがＮＢＤ−Ｘにより誘導体化されたことを示唆した。

後に溶出するピーク（１７．５分）の消化により、１１４５．９ｍ／ｚの唯一のペプチドが得られ、ＮＢＤ誘導体からなる残基７２から９６に対応するＩＬ−１ｒａペプチドを示唆した。前記ペプチドのＭＳ／ＭＳ分析は、位置９３でＮＢＤにより誘導体化したリジンを有する残基７２から９６に対応するアミノ酸配列と一致する断片を生じた。

前述の結果によれば、ＩＬ−１ｒａの位置９３におけるリジンは、この実験において使用された条件下でＮＢＤ−Ｘによる誘導体化が可能である。これらの結果は、位置９３におけるリジンは、露出されていて、インタクトなＩＬ−１ｒａタンパク質において溶媒が近づき易い残基であることを、また示唆している。

リン酸塩、クエン酸塩又はピロリン酸塩の存在下でのＩＬ−１ｒａの凝集の速度。
ＩＬ−１ｒａの凝集の速度を、いくつもの異なる緩衝液組成物中で決定した。ＩＬ−１ｒａストック溶液（ＣＳＥ中２２０ｍｇ／ｍｌ）の１０ｍｌを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ透析チューブ（３．５ｋＤａカットオフ）を使用して１４０ｍＭＮａＣｌの２×４Ｌに対して４℃で透析した。透析したＩＬ−１ｒａ溶液の一定分量をクエン酸塩、リン酸塩又はピロリン酸塩のさまざまな濃度を、０．４５Ｍクエン酸塩の、０．５Ｍリン酸塩の又は０．４５Ｍピロリン酸塩のストック溶液（すべてｐＨ６．５）及び１４０ｍＭＮａＣｌの適切な量の添加によって調整し、各試料における１４０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−１ｒａの終濃度を得た。各試料中のクエン酸塩、リン酸塩又はピロリン酸塩の終濃度は１ないし１２５ｍＭの範囲であった。

各試料中におけるＩＬ−１ｒａの凝集を２９℃で４時間、前述の実施例２に記載の１分間隔で４０５ｎｍにおける光散乱を測定することによってモニターした。凝集の速度を、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏプログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して算出される飽和曲線の直線領域の傾斜として決定した。図３は、この実験において、ＩＬ−１ｒａの凝集の速度がクエン酸塩、リン酸塩又はピロリン酸塩の濃度の上昇に伴い低下したことを示す。とりわけ、クエン酸塩若しくはピロリン酸塩の緩衝液中でのＩＬ−１ｒａの凝集の速度は、リン酸塩緩衝液中での凝集の速度よりも急速に低下した。

リン酸塩上のイオン化可能な３つの水素の概算されるｐＫａは、ｐＨ６．５及び３９℃で、２．１４８、７．１９８及び１２．３５である。クエン酸塩上のイオン化可能な３つの水素の概算されるｐＫａは、ｐＨ６．５及び３９℃で、３．１２８、４．７６１及び６．３９６である。ピロリン酸塩上のイオン化可能な４つの水素の概算されるｐＫａは、ｐＨ６．５及び３９℃で、０．８３、２．２６、６．７２及び９．４６である。例えばＧｏｌｄｂｅｒｇほか、緩衝液のイオン化反応についての熱力学的定量、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｆ． Ｄａｔａ， ３１（２）： ２３１−３７０ （２００２）を参照。したがって、前述で論議され前記文献により報告されるｐＫａに従って概算されるように、リン酸塩はｐＨ６．５及び３９℃で主として１個の負の電荷を有すると予測されるのに対し、クエン酸塩はｐＨ６．５及び３９℃で３個の負の電荷を有すると予測され、ピロリン酸塩はｐＨ６．５及び３９℃で２ないし３個の負の電荷を有すると予測される。

このように、これらの結果は、多荷電陰イオンが特定のｐＨにおいて単一荷電陰イオンよりも効果的にＩＬ−１ｒａの凝集の速度を低下できることを示唆している。前記結果と一致して、単一荷電陰イオンであるＮａＣｌはリン酸塩と似たような凝集速度特性を有することがわかった（データは表していない。）。

ショ糖、グリセロール又はソルビトールの存在下でのＩＬ−１ｒａの凝集の速度。
ＩＬ−１ｒａの凝集の速度をいくつもの異なる糖の存在下で決定した。ＩＬ−１ｒａストック溶液（ＣＳＥ中の２２０ｍｇ／ｍｌ）の１０ｍｌを、Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｎａｋｅｓｋｉｎ透析チューブ（３．５ｋＤａカットオフ）を使用して１４０ｍＭＮａＣｌの２×４Ｌに対して４℃で透析した。透析したＩＬ−１ｒａ溶液の一定分量をショ糖、グリセロール又はソルビトールのさまざまな％濃度へ、各試料中において１４０ｍｇ／ｍｌのＩＬ−１ｒａの終濃度になるよう、２５％ショ糖、２５％グリセロール又は２５％ソルビトールのストック溶液及び１４０ｍＭＮａＣｌの適切な量を添加することによって調製した。各試料におけるショ糖、グリセロール又はソルビトールの終濃度は０％、１％、２％又は３％であった。凝集の速度を、実施例２に記載の方法を使用して３９℃での各ＩＬ−１ｒａ溶液の光学密度を測定することによって決定した。図４は本実験において、糖の上昇濃度はＩＬ−１ｒａの凝集の速度の低下をもたらすことを示している。０％糖において、本実験におけるＩＬ−１ｒａの凝集の速度は約２２凝集単位（ａ．ｕ．、１分間あたりの４０５ｎｍにおけるミリ光学密度における上昇として測定される。）であった。３％ショ糖、グリセロール又はソルビトールにおいては、ＩＬ−１ｒａの凝集の速度は０ないし５ａ．ｕ．の範囲まで低下した。

ＩＬ−１ｒａの尿素及び塩酸グアニジンにより誘導される折りたたみ開き（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）。
ＩＬ−１ｒａの平衡的な尿素により誘導される折りたたみ開きを以下のとおり実施した。遠紫外線円二色性研究のため、０．８６ｍｇ／ｍｌＩＬ−１ｒａの１ないし１．５ｍｌ試料及び尿素のさまざまな濃度（約０ないし１０Ｍ）をホイルに包み、それらを光から保護し、室温で一晩（１２時間超）インキュベートした。次に、各試料について２３０ｎｍでの円二色性を２３℃で決定した。図９は、本実験用に尿素のさまざまな濃度でインキュベートしたＩＬ−１ｒａについての２３０ｎｍでの円二色性シグナルを示す。これらデータをプロットし、折りたたみ開き曲線を３状態モデル、すなわち元の状態⇔中間状態⇔折りたたみ開きされた状態、にあてはめた。このモデルにおいて、第一移行の傾斜であるｍ１、及び第一移行の中間点であるＣ_ｍ１を制約した。これらのパラメータは、遠紫外線ＣＤが前記元の状態と前記中間状態の間を識別できないため、制約された。ｍ１及びＣ_ｍ１について制約された値は、前記元の状態を前記中間状態から識別できるいくつかの蛍光測定値を平均することによって得た。図９に示されているように、ＩＬ−１ｒａは本実験において約４ないし６Ｍ尿素において包括的な折りたたみ開きへの移行を経た。

蛍光研究について、０．０８６ｍｇ／ｍｌＩＬ−１ｒａの１ないし１．５ｍｌの試料及び尿素のさまざまな濃度（約０ないし１０Ｍ）をホイルに包み、これらを光から保護し、室温で一晩（１２時間超）インキュベートした。図１０は、尿素のさまざまな濃度においてインキュベートしたＩＬ−１ｒａの３５３ｎｍでの固有蛍光度を示す。これらのデータをプロットし、折りたたみ開き曲線を前述に論議した前記３状態モデルにあてはめた。本実験においては制約を適用しなかった。図１０に示されているように、前記蛍光実験は、０ないし約１．５Ｍ尿素での折りたたみ開きの移行の存在を示唆している。前記移行は遠紫外線ＣＤ実験においては観察されないため、前記移行は元の状態のような二次構造を有する中間状態の蓄積を反映しうる。前記中間状態は、構造へのより局所的な変化、例えば表面ループの脱安定化に関係し得、一方、ＩＬ−１ｒａの疎水性中心は実質的に混乱していないままでありうる。

平衡な塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）により誘導される折りたたみ開きを以下のとおり実施した。遠紫外線円二色性研究のため、０．８６ｍｇ／ｍｌＩＬ−１ｒａの１ないし１．５ｍｌ試料及びＧｕＨＣｌのさまざまな濃度（約０ないし５Ｍ）をホイルに包み、これらを光から保護し、室温で一晩（１２時間超）インキュベートした。次に、２３０ｎｍでの円二色性を２３℃で各試料について測定した。図１１は、ＧｕＨＣｌのさまざまな濃度においてインキュベートしたＩＬ−１ｒａについての２３０ｎｍでの円二色性シグナルを示す。前記データをプロットし、前記折りたたみ開き曲線を３状態モデル、すなわち、元の状態⇔中間状態⇔折りたたみ開きされた状態にあてはめた。このモデルにおいて、ｍ１、Ｃ_ｍ１、前記元の状態の基線の傾斜である「ｎｓ」、及び前記中間状態の基線の傾斜である「ｉｓ」を制約した。ＧｕＨＣｌにより誘導される折りたたみ開きについてのｍ１及びＣｍ１の制約された値を、尿素により誘導された折りたたみ開きについて前述したように実質的にして測定した。「ｎｓ」及び「ｉｓ」は、０を超えると制約した。これらのパラメータは、遠紫外線ＣＤが前記元の状態と前記中間状態の間を識別できないため、制約した。図１１に示されるように、ＩＬ−１ｒａは本実験において約１ないし２ＭＧｕＨＣｌでの包括的な折りたたみ開きへの移行を経た。

蛍光研究について、０．０８６ｍｇ／ｍｌＩＬ−１ｒａの１ないし１．５ｍｌの試料及びＧｕＨＣｌのさまざまな濃度（約０ないし５Ｍ）をホイルに包み、これらを光から保護し、室温で一晩（１２時間超）インキュベートした。図１２は、尿素のさまざまな濃度においてインキュベートしたＩＬ−１ｒａの３５３ｎｍでの固有蛍光度を示す。前記データをプロットし、折りたたみ開き曲線を前述に論議した前記３状態モデルにあてはめた。本実験においては制約を適用しなかった。図１２は、ＧｕＨＣｌのさまざまな濃度においてインキュベートしたＩＬ−１ｒａの３５３ｎｍでの固有蛍光度を示す。前記データをプロットし、折りたたみ開き曲線を前述に論議した前記３状態モデルにあてはめた。本実験においては制約を適用しなかった。図１２に示されるように、蛍光データは、約０ないし０．６ＭＧｕＨＣｌにおける折りたたみ開きの存在を示唆する。前記移行は遠紫外線ＣＤ実験において観察されないため、前記移行は元の状態のような二次構造を有する中間状態の蓄積を反映しうる。前記中間状態は、構造へのより局所的な変化に関係し得、及び／又は表面ループの脱安定化に関係し得る。一方、ＩＬ−１ｒａの疎水性中心は実質的に混乱していないままでありうる。

尿素により誘導された折りたたみ開きとＧｕＨＣｌにより誘導された折りたたみ開きとの差異は、ＩＬ−１ｒａの固有蛍光度に及ぼす前記２つの変性剤の異なる効果から生じうる。

さらに、各変性剤についての前記ＣＤデータと前記蛍光データとの差異は、タンパク質の三次構造における局所的な変化を検出するトリプトファン固有の蛍光度の能力に起因し得、一方、ＣＤはタンパク質の二次構造における変化を検出する。

リン酸メチルアセチル（ＭＡＰ）によるＩＬ−１ｒａの誘導体化。
ある実施態様において、リン酸メチルアセチル（ＭＡＰ）はポリペプチドのリジン残基及びＮ末端アミンをアセチル化する。ＭＡＰを、Ｋｌｕｇｅｒほか（１９８０）Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ４５： ２７２３において記載されるとおり調製した。生成物の同定をＮＭＲ及び質量分析により確認した。

クエン酸塩若しくはリン酸塩の存在下にＩＬ−１ｒａをＭＡＰにより次のとおり誘導体化した。クエン酸塩の存在下での誘導体化のために、ＭＡＰ（水中の１０ｍＭストック）の２０μｌ及びＩＬ−１ｒａ（ＣＳＥ中１０ｍＭストック）の２０μｌを、ＨＰＬＣバイアル中の１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）の１６０μｌへ添加した。反応物を３７℃でインキュベートし、ＨＰＬＣ自動サンプリング装置を使用して２５μｌの一定分量を０、４５、９０、１３５、１８０、２２５及び２７０分に採取した。Ｊｕｐｉｔｅｒ ５ｕ Ｃ４ ３００Ａ逆相ＨＰＬＣカラム（４．６×２５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）、オンライン紫外線検出器及び３７℃に設定された温度調節１００穴試料トレイが装備されたＡｇｉｌｅｎｔ１１０ＨＰＬＣを使用する逆相ＨＰＬＣによって各一定分量を分析した。流速を１ｍｌ／分に設定し、前記カラムを５０℃の温度に維持した。前記カラムを６５％緩衝液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液）及び３５％緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液）で１５分間（流速１ｍｌ／分）予め平衡化した。負荷後、３５％から５０％緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ水溶液）に２５分かけて傾斜する勾配を使用して前記分析物を溶出した。

リン酸塩の存在下での誘導体化のために、ＭＡＰ（水中１０ｍＭストック）の２０μｌ及びＩＬ−１ｒａ（ＣＳＥ中１０ｍＭストック）の２０μｌを、ＨＰＬＣバイアル中の１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．５）の１６０μｌへ添加した。反応物を３７℃でインキュベートし、ＨＰＬＣ自動サンプリング装置を使用して２５μｌの一定分量を０、４５、９０、１３５、１８０、２２５及び２７０分に採取した。クエン酸塩の存在下における誘導体化についての前述と同様に、各一定分量を逆相ＨＰＬＣにより分析した。

クエン酸塩の存在下における誘導体化の結果を図１３に示す。リン酸塩の存在下における誘導体化の結果を図１４に示す。これら二つのＨＰＬＣ特性によれば、本実験のＭＡＰによる誘導体化により４つの新たな弱く分離されたＩＬ−１ｒａピークが現れる。

ＩＬ−１ｒａを１０ｍＭピロリン酸塩（ｐＨ６．４）の存在下においてまたＭＡＰにより誘導体化した。ＭＡＰ（水中１０ｍＭストック）の２０μｌ及びＩＬ−１ｒａ（ＣＳＥ中１０ｍＭストック）の２０μｌを、ＨＰＬＣバイアルにある１０ｍＭピロリン酸塩（ｐＨ６．４）の１６０μｌへ添加した。前記反応物を３７℃でインキュベートし、ＨＰＬＣ自動サンプリング装置を使用して２５μｌの一定分量を０、４５、９０、１３５、１８０、２２５及び２７０分に採取した。クエン酸塩の存在下における誘導体化について前述したようにして、各一定分量を逆相ＨＰＬＣにより分析した。図１５は、クエン酸塩の存在下における、リン酸塩の存在下における、及びピロリン酸塩の存在下における４．５時間（２７０分間）のＭＡＰによるＩＬ−１ｒａの誘導体化の逆相ＨＰＬＣの結果の重ね合わせを示す。４つの弱く分離されたピークを本実験で同定し、図１５に示す。

図１５に示す、クエン酸塩の存在下での誘導体化についての２７０分時点からのピークの各々を以下のとおり、各々の同一性を決定するためにさらに分析した。４つの主要ピークを前述に論議されたＨＰＬＣ運転から回収した。試料は、５ないし１０μｌの最終容積へとＳｐｅｅｄＶａｃで濃縮した。次に、消化緩衝液（５０ｍＭトリス、０．８Ｍ塩酸グアニジン、ｐＨ８．０）の９０μｌを各試料へ添加した後、エンドプロテアーゼｌｙｓ−Ｃ（１０μｌ消化緩衝液中１μｇ）の１０μｌを添加した。各試料を３７℃で１６時間インキュベートした。生じたぺプチドを、Ｆｉｎｎｅｇａｎイオントラップを使用するオンラインＭＳ検出器が装備されたＡｇｉｌｅｎｔ１１０ＨＰＬＣを使用するＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。使用したＨＰＬＣカラムは、Ｊｕｐｉｔｅｒ ５ｕ Ｃ１８ １００Ａ逆相ＨＰＬＣカラム（２×１５０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）であった。流速を１分間あたり０．２ｍｌに設定し、前記カラムを５０℃の温度に維持した。前記カラムを９８％緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ水溶液）及び２％緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液）を使用して２２分間予め平衡化した。負荷後、２％から４５％緩衝液Ｂに５０分かけて傾斜する勾配を使用して、前記ＨＰＬＣカラムから前記分析物を溶出した。前記ＨＰＬＣカラムからの溶出物の１０％をＭＳ分析へ供した。ペプチド上の追加のアセチル基の存在により、修飾されていないペプチドのＭＳ特性と比べて、４２ｍ／ｚの上昇をもたらした。修飾された検出されたペプチド及び特定のアミノ酸残基の特定をＭＳ／ＭＳにより確かめた。

ピーク１のＩＬ−１ｒａポリペプチドは、そのＮ末端アミンにおいてのみ誘導体化されたようである。ピーク２のＩＬ−１ｒａポリペプチドは、そのＮ末端アミン及びリジン−６において誘導体化されたようである。ピーク３のＩＬ−１ｒａポリペプチドは、そのＮ末端アミン、リジン−６及びリジン−９３において誘導体化されたようである。最後に、ピーク４のＩＬ−１ｒａポリペプチドは、そのＮ末端アミン、リジン−６、リジン−９３、及びリジン−９６において誘導体化されたようである。

前記Ｎ末端アミン以外のすべての位置における誘導体化のレベルは、クエン酸塩若しくはピロリン酸塩の存在下においてよりもリン酸塩の存在下において大きいようである。これらの結果は、クエン酸塩及び／又はピロリン酸塩が、リン酸塩よりも良好に、ＩＬ−１ｒａにおいて正に荷電したリジン基をＭＡＰによる誘導体化から保護できることを示唆している。これらの結果は、クエン酸塩及び／又はピロリン酸塩がリン酸塩よりも強い親和性を、正に荷電したリジン残基に対して有していることを示唆していよう。

ＭＡＰによるＩＬ−１ｒａの誘導体化の速度を、クエン酸塩の存在下におけるＩＬ−１ｒａの誘導体化について図１３に示されている（及び図１６Ａに再生される）データを使用して決定した。特に、図１６Ａからの各クロマトグラムを、ＰｅａｋＦｉｔ（登録商標）（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して逆重畳化（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）した。次に、各時点（０、４５、９０、１３５，１８０、２２５及び２７０分）における逆重畳化したピーク（ピーク１から４）の各々の下の面積を積分した。ある時点についての典型的な逆重畳化した特性を図１６Ｂに示す。逆重畳化したピーク１ないし４に図１６Ｂに名付けて示し、それぞれの積分された下の面積をその下に示す。ピーク１は１６０．２８５９０の積分面積を有した。ピーク２は１９０．４１９６４の積分面積を有した。ピーク３は１８１．７６５４８の積分面積を有した。ピーク４は１７８．１８８４４の積分面積を有した。次に、時点０、４５、９０、１３５、１８０分における逆重畳化したピーク４の積分面積を、前記ピークを生じる反応のインキュベーション時間に対してプロットした。前記プロットを図１６Ｃに示す。生じた線は６８．９３１／時の傾斜を有する。

次に、ＭＡＰによるＩＬ−１ｒａの誘導体化の速度を、さまざまな緩衝液の存在下で及びさまざまなｐＨでの前述で論議される方法に従ったさまざまな実験について算出した。次に、前記さまざまな速度を図１７に示す棒グラフにプロットした。具体的には、ＭＡＰによるＩＬ−１ｒａの誘導体化の速度を、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．３）、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．３）、１０ｍＭピロリン酸塩（ｐＨ６．３）、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．５）、２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．５）、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）、２０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）、１０ｍＭピロリン酸塩（ｐＨ６．５）、２０ｍＭピロリン酸塩（ｐＨ６．５）、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．７）、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．７）、及び１０ｍＭピロリン酸塩（ｐＨ６．７）の存在下で決定した。

各ｐＨにおいて、ＭＡＰによるＩＬ−１ｒａの誘導体化の速度は、リン酸塩緩衝液におけるよりもクエン酸塩緩衝液若しくはピロリン酸塩緩衝液において低かった。図１７を参照してほしい。さらに、２０ｍＭのクエン酸塩若しくはピロリン酸塩の存在下における誘導体化の速度は、１０ｍＭのクエン酸塩もしくはピロリン酸塩の存在下における誘導体化の速度よりも低かった。これらの結果は、クエン酸塩及び／又はピロリン酸塩がリン酸塩よりも効果的にＩＬ−１ｒａのリジン残基をＭＡＰによる誘導体化から保護できることを示唆する。このように、ＭＡＰによるＩＬ−１ｒａの誘導体化の速度は、リン酸塩緩衝液の存在下においてよりもクエン酸塩緩衝液若しくはピロリン酸塩緩衝液の存在下において低い。

最後に、ＩＬ−１ｒａをＭＡＰにより、ｐＨ６．３、ｐＨ６．５又はｐＨ６．７における１０ｍＭクエン酸塩の存在下において、又はｐＨ６．３、ｐＨ６．５又はｐＨ６．７における１０ｍＭリン酸塩の存在下において、５．５時間、前述に論議された方法に従って誘導体化した。図１８は、前記緩衝液の各々の存在下における５．５時間のＭＡＰによるＩＬ−１ｒａ誘導体化の逆相ＨＰＬＣの結果の重ね合わせを示す。前記図は、ＩＬ−１ｒａが、検査されたｐＨレベルすべてにおいて、クエン酸塩の存在下においてよりもリン酸塩の存在下においてより大きな程度まで誘導体化されることを示す。これらの結果は、クエン酸塩が、ＩＬ−１ｒａのリジン残基をＭＡＰによる誘導体化から、リン酸塩よりも効果的に保護できることを示唆する。

図１８に示されるデータは、ｐＨが上昇するにつれＩＬ−１ｒａがより大きな程度まで誘導体化されることも示唆する。

リン酸塩のさまざまな濃度の存在下でのＩＬ−１ｒａの凝集。
ＩＬ−１ｒａストック（ＣＳＥ中２２０ｍｇ／ｍｌ）の１０ｍｌを１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５の総量８Ｌ（２Ｌずつの３回の緩衝液交換による２Ｌ）に対して４℃で４８時間透析した。ＩＬ−１ｒａ濃度を、１０ｍＭリン酸塩、１００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ６．５）で１６７ｍｇ／ｍｌに調整した。リン酸塩の１Ｍストックを、リン酸ナトリウムの適切な量を１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．５）、１００ｍＭＮａＣｌに溶解することによって調製した。リン酸塩の２０ｍＭ、６０ｍＭ、１１０ｍＭ、２１０ｍＭ、３１０ｍＭ、４１０ｍＭ、５１０ｍＭ、６１０ｍＭ、７１０ｍＭ、８１０ｍＭ、９１０ｍＭ、及び１Ｍ作業ストック溶液（ｐＨ６．５）を１Ｍストックから、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ６．５）、１００ｍＭＮａＣｌで希釈することによって調製した。

リン酸塩のさまざまな濃度におけるＩＬ−１ｒａの凝集を、９６穴ガラスプレート（Ｚｉｓｓｎｅｒ）及び温度調節プレート読み取り分光光度計（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ））を使用して測定した。１６７ｍｇ／ｍｌのＩＬ−１ｒａストック溶液の１８０μｌを各ウェルへ添加した。リン酸塩作業ストック溶液の２０μｌを次に各ウェルへ添加した（１個のウェルにつき１作業ストック）。前記ウェルにおけるリン酸塩の終濃度は、０ｍＭ、２ｍＭ、６ｍＭ、１１ｍＭ、２１ｍＭ、３１ｍＭ、４１ｍＭ、５１ｍＭ、６１ｍＭ、７１ｍＭ、８１ｍＭ、９１ｍＭ、１００ｍＭであった。前記プレートを前記分光光度計において３９℃でインキュベートし、光学密度を４０５ｎｍで１分ごとに測定した。図１９は、本実験についてのリン酸塩の各濃度に対する時間の関数としてプロットされた４０５ｎｍにおける光学密度を示す。図１９におけるデータは、ＩＬ−１ｒａの凝集の程度がリン酸塩の濃度上昇に伴い低下することを示唆する。

ＩＬ−１ｒａに対するクエン酸塩結合の測定。
クエン酸塩イオン結合部位の数及びＩＬ−１ｒａに対するクエン酸塩結合のＫ_ｄを以下のように決定した。１ｍＭＩＬ−１ｒａの１ｍｌの溶液を、クエン酸塩のさまざまな濃度を有する緩衝液（ｐＨ６．５）中に、適切な緩衝液中にＩＬ−１ｒａストック（ＣＳＥ中２２０ｍｇ／ｍｌ）を希釈することによって調製した。具体的には、５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭクエン酸塩のそれぞれ中にＩＬ−１ｒａの１ｍＭ溶液（ｐＨ６．５）の１ｍｌを調製した。各溶液は７０ｍＭＮａＣｌも含有した。各溶液の４００μｌをＭｉｃｒｏｓｅｐ（登録商標）−１０スピンカラム（Ｐａｌｌ社、１カラムにつき１溶液）に入れた。前記カラムを１８℃で３５分間、４０００×ｇで回転させた。回転後、前記クエン酸塩のいくらかに結合したＩＬ−１ｒａは残物中に残り、一方、結合していないクエン酸を含有する緩衝液のいくらかはフィルターをろ液として通過する。回転後、前記溶液の約半分は前記フィルターをろ液として通過した。

前記残物及びろ液の各々におけるクエン酸塩の量を以下のとおり決定した。ろ液若しくは残物の２０μｌを逆相ＨＰＬＣカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ（登録商標）ＬＣ−１８カラム、１５ｃｍ×４．６ｍｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号５８９８５）へ負荷した。前記流速は１分間あたり１ｍｌであり、０．１Ｍリン酸を実施用緩衝液として使用した（均一濃度の溶出）。前記溶出を室温で実施した。前記カラムから溶出したクエン酸の量を２１５ｎｍで測定した。次に、アッセイされる試料（前記残物若しくはろ液）中のクエン酸塩濃度を前記測定結果から算出した（前記系を０ないし１０ｍＭクエン酸塩溶液標準（ｐＨ６．５）を使用して較正した）。

図２０は、ＩＬ−１ｒａに結合したクエン酸塩の濃度（残物中のクエン酸塩の濃度からろ液中のクエン酸塩の濃度を差し引いたものとして決定される。）対溶液中の総クエン酸塩濃度のプロットを示す。結合したクエン酸塩の最大濃度Ｂ_ｍａｘを前記データから外挿して、１．８２１８ｍＭとした。ＩＬ−１ｒａへのクエン酸塩結合についてのＫ_ｄを決定するために、図２０からのデータを使用してスキャッチャードプロットを作成した。前記Ｋ_ｄは前記実験から３．８４６ｍＭと算出した（データを示していない）。さらに、ＩＬ−１ｒａ上へのクエン酸塩の結合部位の数を、スキャッチャードプロットに関するｘ切片から決定した。結合部位の数はこの実験について０．９４であった（データは示していない）。これらのデータはＩＬ−１ｒａにおいて１個のクエン酸塩結合部位があることを示唆している。

ＩＬ−１ｒａ陰イオン結合部位に対する競合。
ピロリン酸塩によるＩＬ−１ｒａ上のクエン酸塩結合部位に対する競合を以下のとおり決定した。１ｍＭＩＬ−１ｒａ、１０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６．５）、７０ｍＭＮａＣｌ及びピロリン酸塩の検査濃度を含有する溶液の４００μｌをＭｉｃｒｏｓｅｐ（登録商標）−１０スピンカラム（Ｐａｌｌ社）に入れ、１８℃で３５分間、４０００×ｇで回転させた。検査したピロリン酸塩の濃度は、０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ及び２０ｍＭであった。回転後、前記溶液の約半分がろ液として通過した一方、残りの溶液は残物としてフィルター上に残った。前記クエン酸塩及び／又はピロリン酸塩のいくらかへ結合したＩＬ−１ｒａは残物中に留まるのに対し、結合していないクエン酸塩及びピロリン酸塩を含有する緩衝液のいくらかはフィルターをろ液として通過する。残物及びろ液の両者中のクエン酸塩濃度を、実施例９において論議したようにして決定した。リン酸塩によるＩＬ−１ｒａ上の前記クエン酸塩結合部位に対する競合を、ピロリン酸塩について前述したように決定した。

図２１は、［ＩＬ−１ｒａによって結合したクエン酸塩の濃度］対［前記溶液中のクエン酸塩の総濃度に対する競合する陰イオン（ピロリン酸塩又はリン酸塩）の総濃度の比］のプロットを示す。前記データは、ピロリン酸塩が、リン酸塩よりも、ＩＬ−１ｒａ上のクエン酸塩結合部位に対するクエン酸塩による競合において、より効果的であることを示唆する。ピロリン酸塩及びリン酸塩の両者がＩＬ−１ｒａ結合部位について競合できるようであり（すなわち、前記部位はクエン酸塩に特異的ではない）、我々はＩＬ−１ｒａ部位上のクエン酸塩結合を陰イオン結合部位と呼ぶ。

図２１に示されたデータから、ＩＬ−１ｒａ上の陰イオン結合部位へのピロリン酸塩結合についてのＫ_ｄを以下の計算を使用して決定した。例えば、Ｓｔｉｎｓｏｎ及びＨｏｌｂｒｏｏｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． （１９７３） １３１： ７１９−７２８を参照してほしい。クエン酸塩結合とピロリン酸塩の結合との間の競合は２つの別個の式として表せる。

式中、Ｐはタンパク質であり、この場合はＩＬ−１ｒａであり、Ｌはリガンドであり、この場合はクエン酸塩であり、Ｘは競合する陰イオンであり、この場合はピロリン酸塩である。Ｋ^ｄ _Ｌはタンパク質へのリガンド結合についてのＫ_ｄであり、Ｐ（遊離タンパク質）の濃度×Ｌ（遊離リガンド）の濃度／ＰＬ（リガンドに結合したタンパク質）の濃度に等しい。Ｋ^ｄ _Ｘはタンパク質への競合する陰イオン結合についてのＫ_ｄであり、Ｐ（遊離タンパク質）の濃度×Ｘ（競合する遊離陰イオン）の濃度／ＰＸ（競合する陰イオンに結合したタンパク質）の濃度に等しい。

クエン酸塩の見かけの若しくは観察されたＫ_ｄ（Ｋ^ｄ _Ｌａｐｐ）は次のように表せる。

式中、Ｌ_ｆｒｅｅは遊離リガンド（クエン酸塩）の濃度であり、Ｐ_ｆｒｅｅは遊離タンパク質（ＩＬ−１ｒａ）の濃度であり、ＰＸは競合する陰イオン（ピロリン酸塩）に結合したタンパク質の濃度であり、及びＰＬはリガンドに結合したタンパク質の濃度である。前記項（ＰＸ）を前述の平衡式から得られる（Ｘ_ｆｒｅｅ）（Ｐ_ｆｒｅｅ）／Ｋ^ｄ _Ｘと置換することによって、Ｋ^ｄ _Ｌａｐｐについての式は以下の式に簡単にできる。

したがって、Ｋ^ｄ _ＬａｐｐをＸ_ｆｒｅｅに対してプロットすると、ｙ切片はＫ^ｄ _Ｌに等しく、傾斜はＫ^ｄ _Ｌ／Ｋ^ｄ _Ｘに等しいことになる。再整理すると、Ｋ^ｄ _Ｘは前記傾斜によって除されたｙ切片に等しい。

クエン酸塩結合についてのＫ^ｄ _Ｌａｐｐは、競合している陰イオンの各濃度において、[遊離タンパク質（ＩＬ−１ｒａ）の濃度×遊離リガンド（クエン酸塩）の濃度／結合したリガンド（ＩＬ−１ｒａへ結合したクエン酸塩）の濃度]として算出される。遊離タンパク質の濃度は、試料中のタンパク質の総濃度から結合したタンパク質の濃度（結合したリガンドの濃度に等しい。）を減じたものであると算出される。競合している遊離陰イオンの濃度であるＸ_ｆｒｅｅは、競合している陰イオンの総濃度が上昇するとき（つまり、クエン酸塩が競合している陰イオンによって前記ＩＬ−１ｒａ陰イオン結合部位において置換されるとき）、競合している陰イオンの総濃度から結合したリガンド（ＩＬ−１ｒａへ結合したクエン酸塩）の濃度の変化を減じたものに等しい。言い換えれば、Ｘ_{ｔｏｔａｌ}が増大するとき、
Ｘ_ｆｒｅｅ＝Ｘ_{ｔｏｔａｌ}−ΔＸ_{ｂｏｕｎｄ}である。

図２２は、図２０からのデータ及び前述で論議した計算式を使用して算出された、クエン酸塩についてのＫ^ｄ _Ｌａｐｐ対遊離ピロリン酸塩の量のプロットを示す。ピロリン酸塩についてのＫ^ｄ _Ｘを、本実験において２．９９４ｍＭと算出した。前述のように、ｙ切片は、クエン酸塩のＫ_ｄであるＫ^ｄ _Ｌに等しくあるべきである。本実験において、前記Ｋ^ｄ _Ｌは３．８９４ｍＭであり、実施例９において論議されたＩＬ−１ｒａに対するクエン酸塩結合についてのＫ_ｄの先行実験結果である３．８４６ｍＭと十分に合致する。

同様のプロット（データは示していない）を、図２１において示されたリン酸塩のデータについて作成した。この実験において、リン酸塩についてのＫ^ｄ _Ｘを、１２．６４１ｍＭであると算出した。本実験についてのプロットのｙ切片から決定されたクエン酸塩についてのＫ^ｄ _Ｌ（データは示していない）は４．９９６ｍＭであった。

これらのデータは、クエン酸塩及びピロリン酸塩がＩＬ−１ｒａの陰イオン結合部位についてより低いＫ_ｄを有することを示唆する。さらに、ピロリン酸塩は、陰イオン結合部位に対して、クエン酸塩よりもわずかに低いＫ_ｄを有しうる。本実験で見られるより低いＫ_ｄは、実施例２及び４に示されるように、ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させるピロリン酸塩及びクエン酸塩のより大きな能力と相関している。

Claims (9)

1. 配列番号２、配列番号３、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の水性組成物における凝集を低下させる方法であって、
   前記ＩＬ−１ｒａを含む水性組成物を、ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させるために十分な濃度の少なくとも１つのアクセサリー分子と２５℃ないし４５℃で少なくとも２時間インキュベートすることにより、水性組成物における前記ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させることを含み、
   ３９℃で２時間インキュベーションした後に光学密度を４０５ｎｍで測定したとき、前記ＩＬ−１ｒａと前記少なくとも１つのアクセサリー分子を含む水性組成物の光学密度が、前記アクセサリー分子がない場合のＩＬ−１ｒａの水性組成物の光学密度の６０％未満であるとき凝集が低下したとされ；
   前記少なくとも１つのアクセサリー分子の少なくとも１つが（ａ）１０から２０ｍＭの濃度のピロリン酸塩、及び（ｂ）グリセロール、ソルビトール及びショ糖から選択される少なくとも１つの糖であって、該糖は３％の濃度である、方法。
2. 配列番号２、配列番号３、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の水性組成物における凝集を低下させることを含むＩＬ−１ｒａ製剤の製造方法であって、
   前記ＩＬ−１ｒａを含む水性組成物を、ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させるために十分な濃度の少なくとも１つのアクセサリー分子と２５℃ないし４５℃で少なくとも２時間インキュベートすることにより、水性組成物における前記ＩＬ−１ｒａの凝集を低下させることを含み；
   ３９℃で２時間インキュベーションした後に光学密度を４０５ｎｍで測定したとき、前記ＩＬ−１ｒａと前記少なくとも１つのアクセサリー分子を含む水性組成物の光学密度が、前記アクセサリー分子がない場合のＩＬ−１ｒａの水性組成物の光学密度の６０％未満であるとき凝集が低下したとされ；
   前記少なくとも１つのアクセサリー分子の少なくとも１つが（ａ）１０から２０ｍＭの濃度のピロリン酸塩、及び（ｂ）グリセロール、ソルビトール及びショ糖から選択される少なくとも１つの糖であって、該糖は３％の濃度である、製造方法。
3. 配列番号２、配列番号３、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）と、水性組成物においてＩＬ−１ｒａの凝集を低下させるために十分な濃度の少なくとも１つのアクセサリー分子とを含む、ＩＬ−１の副作用を有する患者を治療するための水性医薬組成物であって；
   前記水性組成物は、２５℃ないし４５℃で少なくとも２時間保存されており；
   ３９℃で２時間インキュベーションした後に光学密度を４０５ｎｍで測定したとき、前記ＩＬ−１ｒａと前記少なくとも１つのアクセサリー分子を含む水性組成物の光学密度が、前記アクセサリー分子がない場合のＩＬ−１ｒａの水性組成物の光学密度の６０％未満であるとき凝集が低下したとされ；
   前記少なくとも１つのアクセサリー分子の少なくとも１つは、（ａ）１０から２０ｍＭの濃度のピロリン酸塩、及び（ｂ）グリセロール、ソルビトール及びショ糖から選択される少なくとも１つの糖であって、該糖は３％の濃度である、医薬組成物。
4. 前記少なくとも１つのアクセサリー分子が１０ないし２０ｍＭの濃度のピロリン酸塩である、請求項１又は２に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つのアクセサリー分子が１０ないし２０ｍＭのピロリン酸塩である、請求項３に記載の医薬組成物。
6. 前記少なくとも１つのアクセサリー分子が、グリセロール、ソルビトール又はショ糖から選択される少なくとも１つの糖である請求項１又は２に記載の方法。
7. 前記少なくとも１つのアクセサリー分子が、グリセロール、ソルビトールまたはショ糖から選択される少なくとも１つの糖である、請求項３に記載の医薬組成物。
8. 関節リウマチ又は変形性関節症を治療するための医薬の製造における水性組成物の使用であって、前記水性組成物は、
   （ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の治療的有効量；及び
   （ｉｉ）水性組成物中の前記ＩＬ−１ｒａの２５℃ないし４５℃での少なくとも２時間における凝集を低下させるために十分な濃度の少なくとも１つアクセサリー分子を含み、
   ３９℃で２時間インキュベーションした後に光学密度を４０５ｎｍで測定したとき、前記ＩＬ−１ｒａと前記少なくとも１つのアクセサリー分子を含む水性組成物の光学密度が、アクセサリー分子がない場合のＩＬ−１ｒａの水性組成物の光学密度の６０％未満であるときに凝集が低下したとされ；
   前記少なくとも１つのアクセサリー分子の少なくとも１つが（ａ）１０から２０ｍＭの濃度のピロリン酸塩、及び（ｂ）グリセロール、ソルビトール及びショ糖から選択される少なくとも１つの糖であって、該糖は３％の濃度である、使用。
9. 関節リウマチ又は変形性関節症を治療するための医薬組成物であって、
   （ｉ）配列番号２、配列番号３、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列からなる凝集性インターロイキン−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の治療的有効量；及び
   （ｉｉ）水性組成物中の前記ＩＬ−１ｒａの２５℃ないし４５℃での少なくとも２時間における凝集を低下させるために十分な濃度の少なくとも１つアクセサリー分子を含み、
   ３９℃で２時間インキュベーションした後に光学密度を４０５ｎｍで測定したとき、前記ＩＬ−１ｒａと前記少なくとも１つのアクセサリー分子を含む水性組成物の光学密度が、アクセサリー分子がない場合のＩＬ−１ｒａの水性組成物の光学密度の６０％未満であるときに凝集が低下したとされ；
   前記少なくとも１つのアクセサリー分子の少なくとも１つが（ａ）１０から２０ｍＭの濃度のピロリン酸塩、及び（ｂ）グリセロール、ソルビトール及びショ糖から選択される少なくとも１つの糖であって、該糖は３％の濃度である、医薬組成物。

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