JP6003072B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、試料に励起光を照射して蛍光させて、この蛍光を検出して試料の画像を生成する顕微鏡装置に関するものである。

蛍光色素や蛍光タンパク等を導入した試料に対してレーザ光を照射して励起して、試料から放出された蛍光に基づいて試料の画像取得を行う顕微鏡装置が従来から用いられている。試料の画像は高解像度化が要求されており、このため複数のレーザ光を用いたＳＴＥＤ顕微鏡が用いられる。このＳＴＥＤ顕微鏡の一例が特許文献１に開示されている。

この文献に示されるＳＴＥＤ顕微鏡は、励起光と抑制光（ＳＴＥＤ光）との２つのレーザ光を用いる。励起光は試料を励起させる波長を持つレーザ光である。抑制光は試料の蛍光発生を抑制する波長を持つレーザ光である。試料の焦点において励起光の周囲に抑制光を近接させることで、励起光が蛍光する領域を実質的に狭小化している。この蛍光する領域を狭くすることで、試料の画像の高解像度化を図っている。

米国特許第５，７３１，５８８号明細書

特許文献１のＳＴＥＤ顕微鏡は、試料の画像取得を高分解能にするために、励起光と抑制光との２つのレーザ光を用いる必要がある。従って、それぞれ異なる波長を発振する２台のレーザ光源を顕微鏡に備えなくてはならない。これにより、顕微鏡装置全体が大型化する。

また、２台のレーザ光源のレーザ光は組み合せの波長が限定されている。試料の蛍光色素は様々な色があり、各蛍光色素に２つのレーザ光の波長を組み合せて対応させることが難しくなる。さらに、試料の焦点において励起光の周囲に抑制光を近接させなくてはならない。このために、励起光と抑制光との光軸を厳格に調整する必要があり、この光軸調整作業が煩雑になる。

そこで、本発明は、１つのレーザ光を使用して高解像度の試料の画像取得を行うことを目的とする。

以上の課題を解決するため、本発明の顕微鏡装置は、
試料を励起させる励起光を発振する光源と、
前記試料における同じ焦点位置に対して前記励起光を少なくとも２回照射させる制御を前記光源に対して行う光源制御部と、
前記試料に前記励起光を照射することにより発生する蛍光を戻り光として検出する検出部と、
少なくとも２回の前記戻り光に対して演算を行う演算部と、
この演算部の演算結果に基づいて、前記試料の画像を生成する画像生成部と、
を備え、
前記光源制御部は、前記試料の一部に退色を生じさせる同一の強度の励起光強度を持つ前記励起光を少なくとも２回発振するように前記光源を制御し、
前記演算部は、１回目に前記励起光を照射したときの戻り光と２回目に前記励起光を照射したときの戻り光の光量の差分を演算して演算結果を算出し、
前記画像生成部は、前記演算結果に基づいて前記試料の画像を生成することを特徴とする。

この顕微鏡装置によれば、試料における同じ焦点位置に対して少なくとも２回の励起光を照射している。当該励起光を試料に照射することにより、少なくとも２回の戻り光を検出することができ、当該戻り光に対して演算を行う。これにより、試料の焦点における情報を高い分解能とすることができる。
そして、１回目の励起光の照射により試料の一部が退色した戻り光を取得でき、２回目の励起光の照射により退色後の戻り光を取得できることから、その差分を演算することにより、試料の焦点における情報を高い分解能とすることができる。

また、前記光源制御部は、それぞれ異なる励起光強度を持つ前記励起光を少なくとも２回発振するように前記光源を制御し、前記演算部は、少なくとも２つの前記戻り光に基づいて前記試料の蛍光分子の飽和情報を演算して演算結果を算出し、前記画像生成部は、前記演算結果に基づいて前記試料の画像を生成することを特徴とする。

光源から異なる励起光強度の励起光を試料に照射したときに、励起光強度が飽和強度になると、試料の一部が飽和する。このときの飽和情報を演算することで、試料の焦点における情報を高い分解能とすることができる。なお、飽和情報には飽和量の情報の他に飽和点の情報も含まれる。

また、前記光源は前記試料の蛍光色素に対応した波長の前記励起光を発振することを特徴とする。

これにより、試料の蛍光色素に対応した波長の励起光を照射することができ、試料の種類によらず、蛍光色素を励起させて画像生成を行うことができる。

また、前記励起光を前記試料に走査させる走査部と、この走査部が走査したときの焦点位置に関連付けて前記演算結果を記憶する演算結果記憶部と、を備え、前記画像生成部は、前記焦点位置に関連付けた前記演算結果に基づいて前記試料の画像化を行うこと、を備えたことを特徴とする。

これにより、試料の所定領域（走査した領域）の画像生成を行うことができ、生成される試料の画像を高分解能に生成することができる。

また、前記戻り光の光路にピンホールを配置したことを特徴とする。

戻り光の光路にピンホールを配置することで、焦点の範囲内の光のみが通過するため、光軸方向に分解能が高い共焦点画像を生成することができる。

また、複数のマイクロレンズを螺旋的に多条に配列したマイクロレンズディスクと、このマイクロレンズディスクと離間した位置に設けられ、前記マイクロレンズと同じパターンで複数のピンホールを配列したピンホールディスクと、前記マイクロレンズディスクと前記ピンホールディスクとを一体的に回転させる回転部からなる走査部と、を備え、前記画像生成部は、前記走査部で走査されることによって撮影された複数の画像から、退色および飽和した蛍光分子の位置情報を求めて、前記試料の画像化を行うことを特徴とする。

マイクロレンズディスクとピンホールディスクとを一体的に回転させることで、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡として用いることができ、高分解能の画像を高速に生成することができる。

本発明は、試料における同じ焦点位置に対して少なくとも２回の励起光を照射し、当該励起光により蛍光した少なくとも２つの戻り光に対して演算を行うことにより、高分解能の試料の画像生成を行うことができる。

顕微鏡装置の概略構成図である。 コントローラの構成を示すブロック図である。 実施形態におけるＸＹ方向の光量分布を示す図である。 実施形態におけるＺ方向の光量分布を示す図である。 変形例１における焦点をシフトさせる状態を説明した図である。 変形例２における焦点をシフトさせる状態を説明した図である。 変形例３における顕微鏡装置の構成を示した構成図である。 変形例３における顕微鏡装置の概念図である。 変形例３におけるＸＹ方向の光量分布を示す図である。 変形例３における焦点と退色領域とを示す図である。 変形例４における励起光強度と蛍光強度との関係を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。図１は顕微鏡装置１を示している。顕微鏡装置１はレーザ光源２とシャッタ３とダイクロイックミラー４と光走査ユニット５と瞳リレーレンズ６とミラー７と結像レンズ８と対物レンズ９とステージ１０と蛍光フィルタ１１と集束レンズ１２とピンホール１３と検出器１４とコントローラ１５とディスプレイ１６とを備えて構成している。ステージ１０には蛍光指示薬（蛍光色素）が導入された試料Ｓが載置されている。

レーザ光源２は励起光となるレーザ光Ｌを発振出力する光源である。このレーザ光Ｌの波長としては、試料Ｓに導入した蛍光色素を励起させる波長を用いる。レーザ光源２から発振出力されるレーザ光Ｌは図示しないコリメートレンズにより平行光にされて、シャッタ３に導かれる。シャッタ３は所定のタイミングで開放制御することでレーザ光Ｌを通過させる。シャッタ３を通過したレーザ光Ｌはダイクロイックミラー４に入射する。

ダイクロイックミラー４はレーザ光源２からのレーザ光Ｌを反射し、試料Ｓからの戻り光（蛍光）Ｒを透過させる特性を持つ光学素子である。よって、レーザ光源２が発振出力するレーザ光Ｌはダイクロイックミラー４で反射し、光走査ユニット５に導かれる。光走査ユニット５は第１の可変ミラー５ａと第２の可変ミラー５ｂとを有する走査部である。

第１の可変ミラー５ａと第２の可変ミラー５ｂとは１本の軸の周りに回転可能に構成している。これにより、レーザ光Ｌの反射角を制御して、レーザ光Ｌの焦点をステージ１０に載置した試料ＳのＸＹ方向（水平面方向）に走査する。

光走査ユニット５から出力されるレーザ光Ｌは瞳リレーレンズ６に入射され、その後にミラー７で反射される。そして、レーザ光Ｌは対物レンズ９によりステージ１０に載置された試料Ｓに焦点を結ぶ。対物レンズ９の瞳は瞳リレーレンズ６により光走査ユニット５の位置にリレーされるので、光走査ユニット５により走査されるレーザ光は対物レンズ９の瞳位置で走査されることになり、対物レンズ９による焦点が試料Ｓを走査する。

試料Ｓには蛍光色素が導入されており、レーザ光Ｌを照射することによって試料Ｓの蛍光色素が励起される。これにより、戻り光（蛍光）Ｒが発生する。発生した戻り光Ｒは対物レンズ９に入射して、レーザ光Ｌとは逆方向に進行する。そして、対物レンズ９、結像レンズ８、ミラー７、瞳リレーレンズ６、光走査ユニット５を経て、ダイクロイックミラー４に入射する。

ダイクロイックミラー４は、試料Ｓの蛍光の波長を透過させる特性を有している。よって、戻り光Ｒはダイクロイックミラー４を透過して蛍光フィルタ１１に入射する。蛍光フィルタ１１は特定の波長成分、つまり蛍光の波長の光を選択的に透過させるフィルタである。

これにより、戻り光Ｒは、蛍光フィルタ１１により蛍光の波長成分の光が選択的に透過されて、集束レンズ１２により検出器１４に集束される。戻り光Ｒの光路、特に検出器１４の前段にはピンホール１３を配置している。戻り光Ｒがピンホール１３を通過することにより、焦点の範囲の光のみを通過させ、それ以外の光を除去する。このピンホール１３により生成される画像は光軸方向に分解能が高い共焦点画像となる。

ピンホール１３を通過した戻り光Ｒは検出器１４に入力される。検出器１４は戻り光Ｒを検出する検出部である。つまり、受光した戻り光Ｒの光量を電気信号に光電変換する。この変換した電気信号は戻り光Ｒの光量のデジタルデータ（光量データ）になる。検出器１４が変換した光量データは、コントローラ１５に入力される。図２はコントローラ１５の構成を示している。このコントローラ１５は、システム制御部２１と光源制御部２２とシャッタ制御部２３と光走査ユニット制御部２４と入力部２５と演算部２６と演算結果記憶部２７と画像生成部２８とで構成されている。

システム制御部２１はコントローラ１５の全体的な制御を行う。光源制御部２２はレーザ光源２の制御を行っている。レーザ光源２は、光源制御部２２の制御によりレーザ光Ｌを発振させる。シャッタ制御部２３はシャッタ３の開閉制御を行っている。光走査ユニット制御部２４は光走査ユニット５の制御を行っており、この制御を行うことでレーザ光Ｌの焦点を試料Ｓにて走査させている。

入力部２５は検出器１４から光量データを入力する。演算部２６は入力した光量データに基づいて所定の演算を行う。ここでは、１回目のレーザ光Ｌの照射により蛍光した戻り光Ｒと２回目のレーザ光Ｌの照射により蛍光した戻り光Ｒとの光量データの差分（差分値）を演算結果として算出する。

演算部２６が演算した演算結果は演算結果記憶部２７に記憶される。演算結果記憶部２７はレーザ光Ｌを照射したときの焦点位置に関連付けて演算結果を記憶する。レーザ光Ｌの焦点位置は光走査ユニット５により制御されており、このためシステム制御部２１が焦点位置を把握している。よって、システム制御部２１の制御により、演算結果記憶部２７はレーザ光Ｌの焦点位置に関連付けて演算結果を記憶する。

画像生成部２８は演算結果記憶部２７が焦点位置と関連付けて記憶している演算結果（差分値）に基づき試料Ｓの画像を生成する。なお、生成した画像データは図示しない内部メモリに記憶してもよい。ディスプレイ１６はコントローラ１５に接続される画像表示手段である。ディスプレイ１６は画像生成部２８が生成した画像を表示する。これにより、ディスプレイ１６には試料Ｓの画像が表示されるようになる。

次に、本実施形態の動作について説明する。本実施形態では、試料Ｓにおける同じ焦点位置に同一の励起光強度を持つレーザ光Ｌを２回照射する。このため、試料Ｓの焦点を固定して２回のレーザ光Ｌの照射を行う。つまり、試料Ｓの同一箇所に１回目の照射と２回目の照射とを行う。まず、１回目の照射について説明する。

レーザ光Ｌを試料Ｓに照射する時間は、予め定められた所定時間（単位照射時間）とする。よって、この単位照射時間の間に試料Ｓに焦点を結んだレーザ光Ｌにより蛍光色素が励起される。この励起により蛍光が発生する。発生した蛍光は戻り光Ｒとして検出器１４にまで導かれる。

このとき、光源制御部２２はレーザ光源２がレーザ光Ｌを発振するときの発振強度（励起光強度）を調整する。図３は試料ＳにおけるＸＹ方向（水平面方向）におけるレーザ光Ｌの強度分布（曲線３１）を示しており、図４はＺ方向（垂直方向）におけるレーザ光Ｌの強度分布（曲線４１）を示している。図３および図４に示すように、レーザ光Ｌの強度分布は光軸中心の強度が高く、周辺の強度が低くなるガウシアン分布になっている。

ここで、試料Ｓに照射するレーザ光Ｌの強度が所定値よりも高くなると、試料Ｓの蛍光色素に退色を生じる。このときの閾値が図３の閾値３２、図４の閾値４２になる。つまり、ＸＹ方向においては閾値３２よりも高い強度になると退色を生じ、退色領域３３が発生する。Ｚ方向においては閾値４２よりも高い強度になると退色を生じ、退色領域４３が発生する。

そこで、レーザ光源２が発振するレーザ光Ｌの強度は試料Ｓの一部に退色を生じさせる強度、つまり閾値３２、４２よりも高い強度となるように強度調整を行う。この強度調整は光源制御部２２が行う。この１回目のレーザ光Ｌを試料Ｓに照射すると、試料Ｓの一部に退色を生じる。

次に、レーザ光Ｌの焦点を固定した状態で単位照射時間の間だけ２回目のレーザ光Ｌを照射する。２回目のレーザ光Ｌの強度は１回目のレーザ光Ｌの強度と同じである。１回目の照射では図３および図４の強度分布で示す全ての光量を検出する。ただし、このときには試料Ｓの一部領域に退色を生じる。一方、２回目の照射では、図３および図４の強度分布で示す光量のうち退色領域３３、４３を除いた領域の光量を検出する。

つまり、１回目の照射により得られる光量データが示す光量よりも２回目の照射により得られる光量データが示す光量は退色した分だけ減少している。演算部２６は１回目の照射の光量データと２回目の照射の光量データとの差分を演算している。この演算結果を差分値としている。また、このときの退色量は元の蛍光分子の量に比例するため、演算した差分値は試料Ｓの退色した領域の蛍光分子の量、すなわち蛍光強度を示している。

図３および図４に示すように、レーザ光Ｌを試料Ｓに１回だけ照射したときには、強度分布の全ての領域の光量が検出される。つまり、図３に示すＸＹ方向においては幅３４で示す領域の光量が検出され、図４に示すＺ方向においては幅４４で示す領域の光量が検出される。

一方、焦点を固定してレーザ光Ｌを試料Ｓに２回照射して差分を検出すると、差分値は退色した領域の光量として検出される。つまり、図３に示すＸＹ方向においては幅３５で示す領域の光量が検出され、図４に示すＺ方向においては幅４５で示す領域の光量が検出される。

ＸＹ方向の幅３５は幅３４よりも狭い限定された領域となる。また、Ｚ方向の幅４５は幅４４よりも狭い限定された領域となっている。つまり、１回のみのレーザ光Ｌの照射により検出される領域よりも狭い限定された領域の光量が検出される。光量を検出する領域を狭い領域とすることができるため、レーザ光Ｌの焦点位置の試料Ｓの光量データは高い分解能とすることができる。つまり、レーザ光Ｌの焦点を固定した状態で、試料Ｓの一部を退色させるような励起光強度を持つレーザ光Ｌを２回照射して、戻り光Ｒの光量データの差分を検出することで、当該焦点位置について高い分解能の情報を得ることができるようになる。なお、レーザ光Ｌの照射は３回以上であってもよい。

そして、光走査ユニット制御部２４の制御により光走査ユニット５を制御させて、レーザ光Ｌの焦点位置を変化させる。これにより、ステージ１０に載置されている試料Ｓにおけるレーザ光Ｌの焦点をＸＹ方向に走査させている。演算結果記憶部２７はレーザ光Ｌの焦点位置に関連付けて差分値を記憶していることは既に述べたとおりである。

よって、画像生成部２８は、焦点位置に対応する差分値に基づいて、試料Ｓの画像を生成している。このときの差分値は高分解能になるため、生成される試料Ｓの画像も高分解能になる。このため、高い分解能の詳細な試料Ｓの画像を得ることができる。

しかも、焦点を固定して２回のレーザ光Ｌの照射を行っているだけであるため、レーザ光源２の必要台数は１台になる。よって、複数台のレーザ光源２を用いる必要がなく、顕微鏡装置１の全体の構成をコンパクトにすることができる。且つ、励起光と抑制光といった２つの光を使用することがないため、光軸の調整といった煩雑な処理を行う必要がなくなる。また、１つのレーザ光Ｌを使用するため、試料Ｓによって２つの波長のレーザ光Ｌを組み合わせることの困難性がなくなる。

以上において、レーザ光源２は複数の波長のレーザ光Ｌを発振出力できるように構成してもよい。試料Ｓの蛍光色素（の色）によっては励起させるレーザ光Ｌの波長が異なる。よって、レーザ光源２は試料Ｓの蛍光色素に応じて、当該蛍光色素を励起するようなレーザ光Ｌを発振するように複数種類の波長のレーザ光Ｌを発振可能にすることができる。

また、ステージ１０をＺ方向に移動させて、試料ＳのＺ方向における他の面の画像化を行うようにしてもよい。そして、図１の例では、ピンホール１３を検出器１４の前段に配置している。これにより、戻り光Ｒの焦点面以外からの光を除去している。このため、高い分解能の共焦点画像を得ることができる。ただし、前述したように退色した領域は狭い領域に限定されるため、ピンホール１３を配置しないようにしてもよい。または、ピンホール１３の開口径を大きくしてもよい。

また、レーザ光源２からは試料の一部に退色を生じさせる励起光強度を持つレーザ光Ｌを発振させれば、その励起光強度は任意に設定してもよい。レーザ光Ｌの励起光強度によって退色領域３３、４３が変化するため、レーザ光Ｌの励起光強度を変化させて、図３の幅３５、図４の幅４５をコントロールして、画像生成を行ってもよい。

また、レーザ光源２から発振するレーザ光Ｌとして、近赤外光のパルスレーザを用いるようにしてもよい。レーザ光Ｌとして近赤外光を用いる場合は、ダイクロイックミラー４等の光学系もそれに対応したものを用いる。これにより、顕微鏡装置１を２光子励起顕微鏡として用いることができる。２光子励起顕微鏡としているため、焦点近傍でのみ２光子励起が生じる。このため、深部観察等において光路の途中で発生する蛍光やそれによって生じる退色の影響を極めて少ないものとすることができ、より高い分解能の画像を得ることができる。

次に、変形例１について説明する。変形例１では、レーザ光ＬのＸＹ方向における走査について説明する。図５は試料Ｓにおけるレーザ光Ｌの焦点Ｆ（Ｆａ、Ｆｂ、・・・）の領域を示している。この焦点Ｆは、図３で示した幅３４のＸＹ方向における領域となる。光走査ユニット５は以下に示す焦点Ｆの走査を行う。

まず、焦点Ｆａにおいて、レーザ光Ｌの１回目の照射を行う。これにより、焦点Ｆａよりも狭い中心の領域（退色領域Ｇａ）が退色する。前述した実施形態では、レーザ光Ｌの焦点を固定して２回目の照射を行うが、本変形例では、１回目の照射でＸＹ方向のうち１方向（Ｘ方向）に焦点Ｆａと重複しないように且つ近接するような焦点Ｆｄを走査する。

これにより、焦点Ｆｄの中心の退色領域Ｇｄが退色する。そして、Ｘ方向に前回の焦点Ｆと重複しないように且つ近接するように焦点Ｆを順次走査する。この走査を光走査ユニット５が行う。Ｘ方向に１列の走査が終了した後に再びレーザ光Ｌを焦点Ｆａに戻す。そして、再び焦点Ｆａから焦点Ｆが重複しないように且つ近接するように順次走査させる。

つまり、同じ焦点Ｆにおいて２回のレーザ光Ｌの照射を行っている。これにより、各焦点Ｆにおける１回目の照射と２回目の照射との差分値を生成している。次に、光走査ユニット５はレーザ光Ｌの焦点をＦｂの位置に設定する。焦点Ｆｂは、この焦点Ｆｂにレーザ光Ｌを照射したときに退色する退色領域Ｇｂと既に照射が終了した焦点Ｆａにおける退色領域Ｇａとが重複しないように且つ近接するような位置に設定する。

そして、Ｘ方向に焦点Ｆが重複しないように且つ近接するように焦点Ｆを順次走査していく。Ｘ方向の１列の走査が終了した後には、再び焦点Ｆｂから２回目のレーザ光Ｌの照射を行って、差分値を検出する。同様に、図５の焦点Ｆｃから開始してＸ方向に走査を行って、１回目のレーザ光Ｌの照射と２回目のレーザ光Ｌの照射との差分値を検出する。

これにより、離散的な走査が行われ、図５に示すような退色した退色領域Ｇ（Ｇａ、Ｇｂ、・・・）が形成される。各退色領域Ｇは焦点Ｆの領域よりも狭小な領域になっており、各退色領域Ｇが重複しないように且つ近接して配列される。この狭小な退色領域Ｇが差分値として検出され、画像化に供される。よって、Ｘ方向における分解能を高いものとすることができる。

Ｘ方向の走査が終了した後に、Ｙ方向に走査する列をシフトさせて、再び同様の走査を行う。これにより、Ｙ方向にも退色領域Ｇを近接して配列することができ、Ｙ方向における分解能も高くできる。つまり、焦点Ｆよりも狭小な退色領域Ｇを狭い間隔で配列して、当該退色領域Ｇの光量を差分値として検出しているが、この退色量を示す差分値は元の蛍光分子の量に比例するため、ＸＹ方向における蛍光分子の量、すなわち蛍光強度を示す。これにより、ＸＹ方向に高い分解能を得ることができる。

勿論、Ｚ方向においては、ＸＹ方向の走査とは無関係に、退色した領域を差分値として検出しているため、高分解能を得ることができる。従って、ＸＹ方向およびＺ方向の３次元に高い分解能の試料Ｓの画像を得ることができる。

次に、図６を用いて変形例２について説明する。変形例１において焦点Ｆａの次に走査する部位は、この焦点Ｆａと重複しないように且つ近接するような焦点Ｆｄであったが、本変形例では焦点Ｆａの次は焦点Ｆｂにレーザ光Ｌを走査させる。つまり、焦点Ｆａの退色領域Ｇａと焦点Ｆｂの退色領域Ｇｂとが重複しないように且つ近接するような焦点Ｆでレーザ光Ｌを走査させる。

Ｘ方向におけるレーザ光Ｌの走査は、退色領域Ｇが重複しないように且つ近接するように行うものであり、Ｘ方向に順次連続的にシフトさせて行う。Ｘ方向に１列の走査が終了した後に、Ｙ方向に１列シフトさせて再びＸ方向に走査を行う。これにより、ＸＹ方向にレーザ光Ｌの１回目の照射を行う。

次に、再びレーザ光Ｌを焦点Ｆａに設定して、２回目のレーザ光Ｌの照射を行う。そして、Ｘ方向に１列に走査を行い、Ｙ方向に走査する列を順次シフトさせることで、ＸＹ方向に２回目の走査を行う。従って、１回目の照射と２回目の照射との差分値を検出することができ、変形例１と同様にＸＹ方向およびＺ方向に高い分解能の画像を得ることができる。

変形例１では、焦点Ｆを重複しないように且つ近接するように走査していたため、Ｘ方向において焦点Ｆの位置を繰り返し往復させる必要がある。この点、この変形例２では、Ｘ方向に順次シフトさせていくだけであり、往復させる必要がなくなる。よって、レーザ光Ｌの往復回数を低減できるため、本変形例では走査時間を高速化できる。これにより、画像生成の速度も高速化する。ただし、生成される画像の正確性は変形例１の方が高くなる。

図６に示すように、２回目の照射のときには、焦点Ｆａの領域には他の焦点Ｆｂ、Ｆｇ、Ｆｈの退色領域Ｇｂ、Ｇｇ、Ｇｈ（の一部）が含まれる。よって、焦点Ｆａの１回目の照射のときの光量データと２回目の照射のときの光量データとの差分を検出するときには、前記の退色領域Ｇｂ、Ｇｇ、Ｇｈの分も光量が減少する。

よって、焦点Ｆａの退色領域Ｇａの正確な光量が検出されない。これにより、画像の正確性が僅かに低下する。変形例１では、ある焦点Ｆには他の焦点Ｆの退色領域Ｇが含まれることがないため、変形例１よりは画像の正確性が低下する。

ただし、図３および図４にも示したように、レーザ光Ｌの強度分布はガウシアン分布になっており、光軸中心以外の領域の光量は僅かなものになっている。よって、この領域において他の退色領域Ｇが含まれても、その影響は非常に低いものとなる。この点、画像の正確性に僅かな影響はあるものの、画像生成の高速性を重視する変形例２を採用してもよい。

また、焦点Ｆにおいて他の退色領域Ｇの影響を排除するような補正をしてもよい。焦点Ｆに含まれる他の退色領域Ｇは予め認識することができるため、認識した他の退色領域Ｇの光量に所定の係数（ガウシアン分布の光量に応じた係数）を乗じて、これを減じることで、他の退色領域Ｇの影響を排除する補正を行うことができる。これにより、画像の正確性を向上しつつ、画像生成の高速性を図ることができる。

次に、変形例３について説明する。図７および図８は本変形例の顕微鏡装置１を示している。この顕微鏡装置１はニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置であり、レーザ光源２とスキャニングユニット５０と顕微鏡６０とカメラ７０とで構成されている。

レーザ光源２は既に説明したレーザ光源であり、レーザ光Ｌを発振出力する。レーザ光源２が発振したレーザ光Ｌは光ファイバ２Ｆによってスキャニングユニット５０にまで伝達される。スキャニングユニット５０は、マイクロレンズディスク５１とピンホールディスク５２と回転ドラム５３とモータ５４とコリメートレンズ５５とダイクロイックミラー５６とリレーレンズ５７とで構成されている。

マイクロレンズディスク５１は、図８に示すように４条の螺旋状パターンの複数のマイクロレンズ５１Ｍを配列した回転ディスクである。なお、螺旋状パターンは４条でなくても、さらに多条の螺旋状パターンであってもよい。ピンホールディスク５２は、マイクロレンズディスク５１のマイクロレンズ５１Ｍのパターンと同じパターンで複数のピンホール５２Ｐを配列した回転ディスクである。

マイクロレンズディスク５１とピンホールディスク５２との間は所定の間隔が設けられている。回転ドラム５３はマイクロレンズディスク５１とピンホールディスク５２とを一体的に回転させる。モータ５４は回転ドラム５３に回転力を付与する回転手段である。回転ドラム５３とモータ５４とで回転部を構成する。コリメートレンズ５５は光ファイバ２Ｆによって導かれたレーザ光Ｌを平行光に変換する。このレーザ光Ｌは複数のマイクロレンズ５１Ｍによって複数のピンホール５２Ｐで焦点を結ぶようになっている。

マイクロレンズ５１Ｍとピンホール５２Ｐとの間にはダイクロイックミラー５６が配置されている。ダイクロイックミラー５６はレーザ光源２が発振するレーザ光Ｌの波長の光を透過させ、試料Ｓの蛍光（戻り光Ｒ）の波長の光を反射させる特性を持つ光学素子である。よって、マイクロレンズ５１Ｍからピンホール５２Ｐにレーザ光Ｌは透過する。

各マイクロレンズ５１Ｍからピンホール５２Ｐに向けてレーザ光Ｌが入射する。ピンホール５２Ｐを通過したレーザ光Ｌは顕微鏡６０に入射する。顕微鏡６０は結像レンズ６１と対物レンズ６２とを有して構成している。ピンホール５２Ｐを通過したレーザ光Ｌは結像レンズ６１によって所定傾きの平行光に変換される。この平行光が対物レンズ６２に入射する。

対物レンズ６２に入射したレーザ光Ｌはステージ１０の試料Ｓで焦点を結ぶ。試料Ｓはレーザ光Ｌにより蛍光色素が励起されて蛍光が発生する。この蛍光は戻り光Ｒとなって顕微鏡６０、そしてピンホール５２Ｐを通過してダイクロイックミラー５６で反射する。この反射した戻り光Ｒはリレーレンズ５７によってカメラ７０の撮像素子で結像をする。カメラ７０の前段には図示しない蛍光フィルタが設けられており、試料Ｓの蛍光だけが選択的にカメラ７０に結像される。

なお、図７において、レーザ光Ｌの光路を実線と破線で２つ示しているが、このうち実線で示す光路と破線で示す光路とは異なるマイクロレンズ５１Ｍを通過する光であることを示している。つまり、レーザ光Ｌの光軸中心のレーザ光Ｌと光軸中心からずれたレーザ光Ｌを示している。また、図８において、顕微鏡６０は１枚のレンズとして模式的に表している。

本変形例の動作を説明する。本動作では、画像取得動作を２回行う。まず、１回目の画像取得動作について説明する。モータ５４が回転ドラム５３を回転させることで、マイクロレンズディスク５１とピンホールディスク５２とが一体的に回転する。

レーザ光源２からレーザ光Ｌを発振させることにより、レーザ光Ｌはマイクロレンズ５１Ｍからピンホール５２Ｐを通過する。マイクロレンズディスク５１とピンホールディスク５２とは一体的に回転している。これにより、レーザ光Ｌがステージ１０の試料Ｓにて高速に走査される。試料Ｓにレーザ光Ｌの焦点が結ばれることにより、試料Ｓの蛍光色素が発光する。

この蛍光が戻り光Ｒとなって、カメラ７０に結像する。戻り光Ｒのうち焦点面以外の光はピンホール５２Ｐを殆ど通過できないため、カメラ７０に到達しない。これによって、カメラ７０は焦点の範囲のみの共焦点画像を撮影することになる。レーザ光Ｌが試料Ｓにて走査されるため、カメラ７０の受光面に戻り光Ｒが走査される。

カメラ７０には各画素がＸＹ（縦横）方向に配列して形成されており、戻り光Ｒが各画素に走査される。これにより、各画素の光量データが得られ、試料Ｓの１枚の画像が取得される。本変形例では、図２で示した入力部２５には検出器１４ではなく、カメラ７０が取得した画像のデータ（画像データ）が入力され、演算部２６はこの画像データを保持する。

図９は、本ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡装置を用いてレーザ光Ｌを試料Ｓに照射した際の焦点近傍におけるＸＹ方向の強度分布（曲線７１）を示している。図９に示すように幅７２の範囲で広がりを示す。

図１０は、カメラ７０を構成するＸＹ方向に配列された各画素Ｐを模式的に示したものである。戻り光Ｒはカメラ７０の各画素Ｐの上を走査される。焦点の頂点７３において、微小な蛍光分子があった場合、戻り光は所定の広がりを有するために、カメラ上でＨａの範囲に広がって投影される。ここで、範囲Ｈａはその点像分布関数に従って中心部ほど強度が強くなるように投影される。また、これらの範囲はピンホールディスクの走査に伴って、複数の図示しない焦点がＸ方向に走査されている。

前述した実施形態で説明したように、レーザ光源２から１回目のレーザ光Ｌの走査を行う。レーザ光Ｌを試料Ｓに走査することにより、試料Ｓが蛍光して戻り光Ｒが発生する。このときの１回目のレーザ光Ｌの励起光強度は試料Ｓの一部が退色する強度としている。これにより１回目の試料Ｓの画像データを取得する。

次にレーザ光源２からのレーザ光Ｌの２回目の発振を行う。そして、試料２の走査を行うことにより、２回目の試料Ｓの画像データを取得する。１回目のレーザ光によって焦点の頂点７３に存在する蛍光分子が退色して、蛍光を発しなくなる。これにより、２回目の画像データにはこの蛍光分子からの蛍光は記録されない。演算部２６は１回目と２回目の画像データの差分を演算して、演算結果記憶部２７に記憶させる。これにより、図１０の退色した領域Ｈａの強度分布が記憶される。

さらに、ここで演算部２６は前記の領域Ｈａの強度分布を２次元ガウス関数とフィットさせることにより、その中心位置Ｇａを算出するとともに、この中心位置を蛍光分子の位置として演算結果記憶部２７に記憶させる。

また、これら蛍光色素の退色は確立的に発生するため、１回の走査で退色する色素は極わずかである。そこで上記の画像取得を繰り返し、画像間の差分の演算を繰り返し行うことにより、個々の蛍光分子の位置を算出し、これを元に画像生成部２８が高分解能な蛍光画像を構築して、ディスプレイ１６に表示する。また、励起光強度を少しずつ強くしながら上記の画像取得を繰り返すことによって、高分解能な蛍光画像を構築してもよい。

また、本構成はニポウディスク方式の共焦点顕微鏡であるため、Ｚ分解能に優れているうえに極めて高速に画像生成を行うことができる。

レーザ光Ｌの照射によって生じる退色量は元の蛍光分子の量に比例するため、演算部２６が演算した差分値は試料Ｓの退色した領域の蛍光分子の量を示している。これにより、画像生成部２８が生成する画像は高分解能の画像になる。且つ、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に適用していることにより、極めて高速に画像生成を行うことができる。

次に、変形例４を説明する。この変形例４では、図１で示した構成の顕微鏡装置を使用する。レーザ光源２からレーザ光Ｌが発振出力されるが、実施形態と同様に、レーザ光Ｌの焦点を固定した状態で、異なる強度で少なくとも２回のレーザ光Ｌの発振を行う。図１１はその例を示している。

ここでは、試料Ｓの同一の焦点位置に対して励起光強度がＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４回のレーザ光Ｌの発振を行っている。励起光強度Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤはＡ＜Ｂ＜Ｃ＜Ｄの関係にあり、最初に励起光強度Ａのレーザ光Ｌを発振する。このレーザ光Ｌは試料Ｓに照射されることにより励起して、蛍光強度ａの戻り光Ｒを発生する。この戻り光Ｒは検出器１４で検出される。これが、図１１で示す点９０になる。

そして、焦点を固定したまま、２回目の励起光強度Ｂのレーザ光Ｌを発振する。これにより、蛍光強度ｂの戻り光Ｒを検出する。これが図１１で示す点９１になる。同様に、３回目の励起光強度Ｃのレーザ光Ｌを発振する。これにより、蛍光強度ｃの戻り光Ｒを検出する。これが図１１で示す点９２になる。最後に、４回目の励起光強度Ｄのレーザ光Ｌを発振する。これにより、蛍光強度ｄの戻り光Ｒを検出する。これが図１１で示す点９３になる。

光源制御部２２は、同一の焦点位置について、レーザ光源２から発振されるレーザ光Ｌの励起光強度をＡからＤまで段階的に強くしている。図１１に示すように、励起光強度と蛍光強度は励起光強度Ｅまでは比例関係（つまり、線形関係）になっているが、励起光強度Ｅを境界として、励起光強度と蛍光強度との関係は非線形関係に変化する。この励起光強度Ｅは試料Ｓの蛍光分子を飽和させる励起光強度（飽和強度Ｅ）となる。

試料Ｓの蛍光分子が飽和すると、試料Ｓに照射されたレーザ光Ｌの中心で飽和励起が発生する。これは、焦点にある蛍光分子の数が有限であることと、分子が励起されて蛍光を発生するまでに蛍光寿命と呼ばれる遅延があることによって蛍光量が抑制されることに起因する。

従って、試料Ｓの蛍光分子が飽和する飽和強度Ｅでレーザ光Ｌを試料Ｓに照射することにより、試料Ｓに照射されたレーザ光Ｌの中心の極めて狭小な領域が飽和する。この飽和する領域は、例えば図３で示したＸＹ方向の幅３５の領域、図４で示した幅４５の領域に相当する。これら幅３５および幅４５の領域は焦点の範囲内の狭小な領域であって、飽和した蛍光分子の量を反映している。

コントローラ１５の演算部２６には、励起光強度Ａ〜Ｄのレーザ光Ｌを照射したときの戻り光Ｒの強度（蛍光強度）ａ〜ｄが得られている。これら励起光強度Ａ〜Ｄおよび蛍光強度ａ〜ｄに基づいて、蛍光分子が飽和する励起光強度Ｅ（飽和強度Ｅ）を演算部２６は演算する。つまり、励起光強度と蛍光強度とが線形関係から非線形関係になっている点９４を推定する演算を行う。

演算部２６は励起光強度Ａ〜Ｄおよび蛍光強度ａ〜ｄに基づいて、線形関係（比例関係）にある直線Ｌ１と非線形関係にある曲線Ｃ１とを演算する。そして、演算部２６は飽和強度Ｅよりも高い強度（励起光強度Ｆ）に対応する蛍光強度ｆを曲線Ｃ１に基づいて算出する。図１１では、この励起光強度Ｆと蛍光強度ｆとが点９５になる。

図１１にも示すように、励起光強度Ｆでは飽和が発生しているため、直線Ｌ１と曲線Ｃ１との間に差分を生じている。この差分が非線形成分ＮＬとなる。この非線形成分ＮＬは飽和した蛍光分子の量（飽和量）を示しており、図３で示したＸＹ方向の幅３５および図４で示した幅４５と対応している。

従って、演算部２６が演算した結果（非線形成分ＮＬ：飽和量）を演算結果記憶部２７に記憶させる。このときの飽和量は１つの焦点位置についての値であって、光走査ユニット制御部２４が光走査ユニット５を制御することで、試料ＳのＸＹ方向の走査を行う。このとき、光走査ユニット制御部２４は飽和した領域（図３の幅３５）が重ならないように走査を行う。

従って、走査した焦点位置と飽和量（非線形成分ＮＬ）とを対応付けて演算結果記憶部２７に記憶させることで、画像生成部２８は試料Ｓの画像生成を行う。このとき、飽和量（図３の幅３５および図４の幅４５）に基づいて画像生成を行う。飽和量は試料Ｓの焦点の領域の中心の狭小な領域となるため、試料Ｓの高分解能の画像を生成できる。

ここでは、飽和強度Ｅよりも高い励起光強度Ｆを試料Ｓに照射したときの蛍光強度ｆを所得している。これにより、所定領域の飽和量（非線形成分ＮＬ）が発生する。この飽和量に基づいて画像生成を行うことで、高分解能の画像生成を行うことができる。

また、ここで、飽和強度Ｅにおいては焦点および蛍光分子の蛍光がちょうど飽和に達したことを意味する。これは、図３の幅３５および幅４５の限界まで小さくした場合と同等で、図３および図４の曲線の頂点が飽和に達したことを意味する。すなわち、この飽和点９４の情報は、焦点の中心における蛍光分子の蛍光がちょうど飽和していることを意味する。従って、飽和点９４の飽和強度Ｅや飽和強度Ｅにおける蛍光強度ｅ等の情報は、焦点の中心における蛍光分子の量と相関があるため、これらの飽和点の情報を用いても、高分解能の画像生成を行うことができる。このように飽和量だけではなく、飽和点の情報を用いて画像化を行ってもよい。

以上において、本変形例では、励起光強度を４段階に変化（Ａ〜Ｄ）させたが、４段階以外であってもよい。また、レーザ光源２から発振されるレーザ光Ｌの励起光強度を段階的に大きくしていったが、段階的に小さくするものであってもよい。また、試料Ｓにレーザ光Ｌを照射することにより発生したときに発生する飽和量をコントロールするために、戻り光Ｒの光路に減光フィルタを挿入してもよい。この場合には、演算部２６はその効果も考慮に入れて演算を行って、飽和量を演算するようにしてもよい。

また、図１１の例では、レーザ光Ｌを試料Ｓに複数回照射するときに、均等に励起光強度を上昇させていたが、１回目の励起光強度Ａは同じであるが、２回目以降の励起光強度を変化させてもよい。つまり、励起光強度Ａの点９０に応じて２回目以降の励起光強度Ｂ〜Ｄを変化させてもよい。例えば励起光強度Ａにおける点９０の蛍光強度ａが大きい場合、直線Ｌ１の傾きが大きくなる。直線Ｌ１の傾きが大きい場合は蛍光分子の密度が高く、蛍光分子が飽和する蛍光強度Ｅが大きいことが類推されるので、２回目以降のレーザ光Ｌの照射の励起光強度Ｂ〜Ｄを変化させるようにしてもよい。また、１回目の励起光強度Ａにおける点９０の蛍光強度ａが所定の値より小さい場合には、この領域に蛍光分子がないことが推察されるので演算値を０として記憶させてもよい。

また、本変形例では、焦点を固定して励起光強度Ａ〜Ｄの４回のレーザ光Ｌの照射を行って、戻り光Ｒを検出した後に走査を行っていたが、まず励起光強度Ａで試料Ｓを走査した後に、励起光強度Ｂで試料Ｓを走査し、次に励起光強度Ｃで試料Ｓを走査し、最後に励起光強度Ｄで試料Ｓを走査するようにしてもよい。

従って、試料Ｓの同じ焦点に対してレーザ光Ｌの励起光強度を異なる複数の強度で発振させることにより、焦点の中心に蛍光の飽和を生じさせる。画像生成を行うときは、このときの飽和量に基づいて画像生成を行うため、高分解能の画像生成を行うことができる。

次に、変形例５について説明する。変形例４では図１の構成の顕微鏡装置で試料Ｓの蛍光分子に飽和を生じさせて高分解能の画像生成を行っていたが、変形例３で示したようなニポウディスク方式の共焦点顕微鏡においても、試料Ｓの蛍光分子に飽和を生じさせて、高分解能の画像生成を行う。

本変形例では、レーザ光源２からは励起光強度をＡのレーザ光Ｌを発振させて、マイクロレンズディスク５１及びピンホールディスク５２を回転させることにより、試料Ｓの走査を高速に行う。これにより、励起光強度Ａにおける各焦点の戻り光Ｒに基づく１回目の画像データを生成する。

次にレーザ光Ｌの励起光強度をＦにして発振させて、マイクロレンズディスク５１およびピンホールディスク５２を回転させることにより、試料Ｓの走査を高速に行って、２回目の画像データを生成する。

このときに、２枚の画像データの各画素における蛍光の飽和量（非線形成分ＮＬ）を演算部２６が算出する。ここで、焦点に存在する一つの蛍光分子が飽和すると、この蛍光分子の飽和量の分布は図１０の範囲Ｈａの領域に反映される。ここで、範囲Ｈａはその点像分布関数に従って中心部ほど飽和量が強くなるように投影される。

さらに、ここで演算部２６は前記の領域Ｈａの強度分布を２次元ガウス関数とフィットさせることにより、その中心位置Ｇａを算出するとともに、この中心位置を蛍光分子の位置として演算結果記憶部２７に記憶させる。
また、これら蛍光色素の飽和はレーザ光強度によって発生するため、レーザ光強度を徐々に変化させながら上記の画像取得を繰り返し、画像間の飽和量の演算を繰り返し行うことにより、個々の蛍光分子の位置を算出し、これを元に画像生成部２８が高分解能な蛍光画像を構築して、ディスプレイ１６に表示する。これにより、ＸＹ方向に高分解能な試料Ｓの画像を生成することができる。

且つ、図７及び図８で示したニポウディスク方式の共焦点顕微鏡を用いているため、走査速度を高速にすることができ、高速に画像生成を行うことができる。

１ 顕微鏡装置
２ レーザ光源
３ シャッタ
４ ダイクロイックミラー
５ 光走査ユニット
６ 瞳リレーレンズ
７ ミラー
８ 結像レンズ
９ 対物レンズ
１０ ステージ
１１ 蛍光フィルタ
１２ 集束レンズ
１３ ピンホール
１４ 検出器
１５ コントローラ
１６ ディスプレイ
２１ システム制御部
２２ 光源制御部
２３ シャッタ制御部
２４ 光走査ユニット制御部
２５ 入力部
２６ 演算部
２７ 演算結果記憶部
２８ 画像生成部
５０ スキャニングユニット
５１ マイクロレンズディスク
５２ ピンホールディスク
５３ 回転ドラム
５４ モータ
５６ ダイクロイックミラー
６０ 顕微鏡
６１ 結像レンズ
６２ 対物レンズ
７０ カメラ

Claims (6)

1. 試料を励起させる励起光を発振する光源と、
   前記試料における同じ焦点位置に対して前記励起光を少なくとも２回照射させる制御を前記光源に対して行う光源制御部と、
   前記試料に前記励起光を照射することにより発生する蛍光を戻り光として検出する検出部と、
   少なくとも２回の前記戻り光に対して演算を行う演算部と、
   この演算部の演算結果に基づいて、前記試料の画像を生成する画像生成部と、
   を備え、
   前記光源制御部は、前記試料の一部に退色を生じさせる同一の強度の励起光強度を持つ前記励起光を少なくとも２回発振するように前記光源を制御し、
   前記演算部は、１回目に前記励起光を照射したときの戻り光と２回目に前記励起光を照射したときの戻り光の光量の差分を演算して演算結果を算出し、
   前記画像生成部は、前記演算結果に基づいて前記試料の画像を生成すること
   を特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記光源制御部は、それぞれ異なる励起光強度を持つ前記励起光を少なくとも２回発振するように前記光源を制御し、
   前記演算部は、少なくとも２つの前記戻り光に基づいて前記試料の蛍光分子の飽和情報を演算して演算結果を算出し、
   前記画像生成部は、前記演算結果に基づいて前記試料の画像を生成すること
   を特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
3. 前記光源は前記試料の蛍光色素に対応した波長の前記励起光を発振すること
   を特徴とする請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
4. 前記励起光を前記試料に走査させる走査部と、
   この走査部が走査したときの焦点位置に関連付けて前記演算結果を記憶する演算結果記憶部と、を備え、
   前記画像生成部は、前記焦点位置に関連付けた前記演算結果に基づいて前記試料の画像化を行うこと、
   を特徴とする請求項３記載の顕微鏡装置。
5. 前記戻り光の光路にピンホールを配置したこと
   を特徴とする請求項４記載の顕微鏡装置。
6. 複数のマイクロレンズを螺旋的に多条に配列したマイクロレンズディスクと、
   このマイクロレンズディスクと離間した位置に設けられ、前記マイクロレンズと同じパターンで複数のピンホールを配列したピンホールディスクと、
   前記マイクロレンズディスクと前記ピンホールディスクとを一体的に回転させる回転部からなる走査部と、を備え、
   前記画像生成部は、前記走査部で走査されることによって撮影された複数の画像から、退色および飽和した蛍光分子の位置情報を求めて、前記試料の画像化を行い、
   前記光源は前記試料の蛍光色素に対応した波長の前記励起光を発振する
   ことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。

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