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JP5956109B2 - 突然変異ｉｎｄｅｈｉｓｃｅｎｔ対立遺伝子を含むブラシカ植物 - Google Patents

突然変異ｉｎｄｅｈｉｓｃｅｎｔ対立遺伝子を含むブラシカ植物 Download PDF

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JP5956109B2 JP2010535299A JP2010535299A JP5956109B2 JP 5956109 B2 JP5956109 B2 JP 5956109B2 JP 2010535299 A JP2010535299 A JP 2010535299A JP 2010535299 A JP2010535299 A JP 2010535299A JP 5956109 B2 JP5956109 B2 JP 5956109B2
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Description

発明の属する技術分野
本発明は、果実の裂開（dehiscence）特性を変調させた、農産物、特に作物植物、特にブラシカ科、特にブラシカ種の作物植物の分野に関する。より具体的には、本発明は、植物、例えばブラシカ科植物、特に種子産生のために生育されたブラシカ科植物などにおいて、種子脱粒（shattering）を低下させる、又は、種子脱粒を収穫後まで遅延させ、同時に農学的に関連する鞘の脱穀性が維持するための改善された方法及び手段に関する。ブラシカＩＮＤＥＨＩＳＣＥＮＴタンパク質（ＩＮＤ）及びそのようなタンパク質をコードする野生型及び突然変異の核酸分子の両方を提供する。また、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物、特にブラシカ・ナパス植物、ならびにその細胞、種子、及び後代（それらが３つの完全ノックアウト突然変異ｉｎｄ対立遺伝子をそれらのゲノム中に含み、果実の裂開特性が有意に変化していることを特徴とする）を提供する。また、種子脱粒が低下され、又は、種子脱粒が収穫後まで遅延され、同時に農学的に関連する鞘の脱穀性が好ましく維持されるブラシカ植物を生成するための方法を、そのような植物から入手可能な種子鞘及び種子と同様に本明細書において提供する。さらに、１つ又は複数の突然変異ｉｎｄ及び／又は野生型ＩＮＤ対立遺伝子の生物学的サンプル中での存在を検出するための検出ツール（キット）及び方法、ならびに１つ又は複数の突然変異ｉｎｄ及び／又は野生型ＩＮＤ対立遺伝子を他の植物に移すための方法、ならびに異なるｉｎｄ及び／又はＩＮＤ対立遺伝子を植物において組み合わせるための方法を提供する。特に、非機能的又は非ＩＮＤタンパク質及び／又はインビボで有意に低下した活性を有するＩＮＤタンパク質をコードする適した数の突然変異ｉｎｄ対立遺伝子を組み合わせるための方法であり、種子脱粒を有意に低下させ、種子脱粒を収穫後まで遅延させ、同時に農学的に関連する鞘の脱穀性を維持する。また、本発明の植物、又はその部分、及び／又はその後代、種子及び種子油、ならびに方法及び／又はキットの使用を提供する。また、収率、特に穀物及び種子の収率を増加させるための方法及び手段を提供する。収率増加の表現型は、低下又は遅延された種子脱粒表現型とは別々でありうる。
発明の背景
ブラシカ植物からの長角果又は鞘は、果実裂開と呼ばれるプロセスを通してそれらの種子を放出する。長角果は、縁と縁が連結された２つの心皮からなる 縁の間の縫合は、レプルムと呼ばれる太い葉脈を形成する。鞘の成熟が近づくにつれ、２つの弁が進行的にレプルムから、鞘の脆弱な指定線に沿い別れ、最終的にレプルムに付着した種子脱粒をもたらす。裂開部は、弁解離の正確な位置を規定する。
作物の収穫前又は収穫中での成熟鞘による種子の脱落（「種子脱粒」又は「鞘脱粒」とも呼ばれる）は、乾燥した裂開果実を発生する作物での普遍的な現象である。成熟前の種子脱粒は、種子回収の低下をもたらし、主に種子のための生育させた作物（例えば油産生ブラシカ植物、特に菜種）における問題を表わす。成熟前の種子脱粒に関する別の問題は、その後の作物年度における自発的生育における増加である。菜種において、鞘脱粒に関する収率損失は平均２０%（Child et al., 1998, J Exp Bot 49: 829-838）であるが、しかし、気象条件に応じて、最高５０%に達しうる（MacLeod, 1981, Harvesting in Oilseed Rape, pp.107-120 Cambridge Agricultural Publishing, Cambridge）。
現在市販の菜種品種は、脱粒に対して極めて感受性が高い。Ｂ．ナパス（Ｂ． ｎａｐｕｓ）の既存の育種プログラム内に、脱粒に対する耐性についての変動はほとんど存在せず、しかし、耐性系統が、Ｂ．ナパス（Ｂ．オレラセア（Ｂ． ｏｌｅｒａｃｅａ）及びＢ．ラパ（Ｂ． ｒａｐａ））の二倍体親内ならびにブラシカ属の他のメンバー、顕著に、Ｂ．ジュンセア（Ｂ． ｊｕｎｃｅａ）、Ｂ．カリナタ（Ｂ． ｃａｒｉｎａｔａ）、及びＢ．ニグラ（Ｂ． ｎｉｇｒａ）内で見出されている。Kadkol et al.（1986, Aust. J. Botany 34 (5): 595-601）は、レプルムへの長角果弁の付着領域における離層の非存在に関連したＢ．カンペストリス（Ｂ． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の特定の受入における脱粒に対する耐性増加を報告する。Prakash及びChopra（1988, Plant breeding 101: 167-168）は、ブラシカ・ジュンセアからのブラシカ・ナパスにおける非相同組換えを通じた脱粒に対する耐性の遺伝子移入を記載する。Spence et al.（1996, J of Microscopy 181: 195-203）は、ブラシカ・ジュンセアの一部の系統が、ブラシカ・ナパス系統と比較し、脱粒傾向の低下を示すことを記載する。Morgan et al., 1998（Fields Crop Research 58, 153-165）は、合成Ｂ．ナパスから発生した菜種の系統の間での鞘脱粒耐性についての遺伝的変動を記載し、それらの鞘を開くために多くのエネルギーを必要とした系統が、裂開部において維管束化の増加を有し、裂開部内での細胞壁分解の低下を有すると思われると結論付けている。彼らは、鞘のくちばし（ｐｏｄ ｂｅａｋ）の長さと鞘脱粒を起こすために必要とされる力の間の有意にネガティブな相関を見出した。Child及びHuttly（1999, Proc 10th Int. Rapeseed Congress）は、放射線照射誘発性の突然変異Ｂ．ナパス及びその親栽培品種Ｊｅｔ Ｎｅｕｆの集団での鞘成熟における変動を記載しており、ここで最も耐性である野生型及び突然変異の植物は、裂開部の全体にわたり細胞群の多量の木化を示し、及び、ここで突然変異体における裂開部の内端近くに位置する維管束跡が記載され、弁の確保の助けとなった。Child et al.（2003, J Exp Botany 54 (389): 1919-1930）は、さらに、再合成されたブラシカ・ナパス系統の鞘における鞘脱粒耐性と維管束構造における変化の間の関連を記載する。しかし、育種のための伝統的な方法では、他の所望の形質（例えば早期開花、成熟、及び黒脚病耐性など）との干渉なく、ナタネ栽培品種中に脱粒耐性を導入することに失敗してきた（Prakash and Chopra, 1990, Genetical Research 56: 1-2）。
いくつかの遺伝子（鞘の裂開を促進又は阻害する）が、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）において突然変異解析を通じて同定されてきた：ＳＨＡＴＴＥＲＰＲＯＯＦ１（ＳＨＰ１；当初はＡＧＬ１と呼ばれた）及びＳＨＡＴＴＥＲＰＲＯＯＦ２（ＳＨＰ２；当初はＡＧＬ５と呼ばれた）における組み合わせ突然変異体は、非裂開性の長角果（即ち、アラビドプシス・サリアナにおける成熟時に閉じたままである長角果）をもたらす（Liljegren et al., 2000, Nature 404, 766-770）。同様に、アラビドプシス・サリアナにおけるＩＮＤＥＨＩＳＣＥＮＴ遺伝子（ＩＮＤ１と呼ばれる）（Liljegren et al., 2004, Cell 116: 843-853；ＰＣＴ刊行物ＷＯ ０１／７９５１７）、ならびにＡＬＣＡＴＲＡＺ（ＡＬＣと呼ばれる；Rajani et al. 2001, Current Biology 11, 1914-1922）における突然変異が、鞘脱粒耐性を導く鞘裂開と干渉する。アラビドプシス・サリアナにおけるＦＲＵＩＴＦＵＬ（ＦＵＬ）（ＳＨＰ及びＩＮＤのリプレッサー）の構成的発現は、また、非裂開性の長角果をもたらした（Ferrandiz et al., 2000, Science, 289, 436-438）。これらの転写因子は、弁縁の同一性及び鞘脱粒を制御する非線形の転写ネットワークを形成すると考えられる。Liljegren et al.（2004, Cell 116: 843-853）は、さらに、ＩＮＤ（非定型ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）遺伝子）が、アラビドプシス・サリアナにおいて弁縁の離層及び木化層への分化に向けることを記載する。内果皮ｂ層に沿った離層に隣接する木化細胞の層（各弁中の単一の木化細胞層）は、乾燥果実内のバネ様張力を産生し、その開口に寄与する。弁内果皮ｂ層の木化には、ＩＮＤ、ＳＨＰ、ＡＬＣ、及びＦＵＬ（弁全体にわたり発現されるＭＡＤＳドメイン転写因子）の活性が必要とされる（Liljegren et al., 2004, 上記；Mandel and Yanofsky, 1995, Plant Cell 7, 1763-1771）。ＦＵＬ及びＲＥＰＬＵＭＬＥＳＳ（ＲＰＬ）（レプルムにおいて発現されるホメオドメイン転写因子（Roeder et al., 2003, Curr Biol 13, 1630-1635)）が見出されており、弁縁の同一性を付与する遺伝子の境界を設定する（Gu et al., 1998, Development 125, 1509-1517；Ferrandiz et al., 2000, Science, 289, 436-438；Roeder et al., 2003，上記）。最後に、ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ ＦＬＯＷＥＲ（ＦＩＬ）及びＹＡＢＢＹ３（ＹＡＢ３）（２つのＹＡＢＢＹファミリー転写因子（Sawa et al., 1999, Genes Dev 13, 1079-1088；Siegfried et al., 1999, Development 126, 4117-4128)）、ならびにＪＡＧＧＥＤ（ＪＡＧ）（Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー転写因子（Dinneny et al., 2004, Development 131, 1101-1110；Ohno et al., 2004, Development 131, 1111-1122)）が同定され、領域特異的な様式でＦＵＬ及びＳＨＰの発現を促進させることにより弁及び弁縁の適切な発生に重複して寄与した（Dinneny et al., 2005, Development 132, 4687-4696）。多くの加水分解酵素（例えばエンドポリガラクツロナーゼなど、ブラシカ植物からの鞘における裂開部のプログラムされた分解において、鞘の裂開中に役割を果たす）の遺伝子も同定されてきた（例、ＷＯ ９７／１３８６５；Petersen et al., Plant. Mol. Biol., 1996, 31:517-527を参照のこと）。
Liljegren et al.（2004, Cell 116: 843-853）は、アラビドプシスＩＮＤの５つの突然変異対立遺伝子を記載する。裂開部中の木化細胞は、突然変異の重度に応じて、これらの突然変異対立遺伝子を含む植物において非存在又は存在するが（重度のｉｎｄ突然変異体は、野生型植物における弁縁の内部に対応する領域中に木化細胞を含まない）、しかし、全ての場合において、長角果は非裂開性である。Wu et al. (2006), Planta 224, 971-979）は、アラビドプシスＩＮＤの６つの突然変異対立遺伝子を記載する。この突然変異対立遺伝子を含む植物は、弁縁及びレプルムの接合部に木化細胞を示さず、細胞の７層の領域においてわずかな細胞しか含まず、それらは野生型植物において一般的に公知の裂開部を包含するように見え、この層における不完全な細胞質分裂を呈する。
ＵＳ ２００５／０１２０４１７及びＵＳ ２００７／０００６３３６は、ブラシカ・ナパスからの２つのＩＮＤ１オルソログの同定及び単離を記載する。
ＷＯ９９／００５０３、ＷＯ０１／７９５１７、及びＷＯ０１５９１２２は、遺伝子サイレンシング技術（例えばアンチセンス抑制又は同時抑制）及び突然変異生成を使用した、アラビドプシスＡＬＣ、ＩＮＤ、ＡＧＬ１、及びＡＧＬ５遺伝子ならびにそのオルソログの発現の下方制御を記載する。
Vancanneyt et al., 2002（XIII International Conference on Arabidopsis Research, Sevilla, Spain June 28-July 2; 2002）は、菜種におけるＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの制御下でのＡ．サリアナからのＦＵＬの発現が、多くの鞘脱粒耐性の形質転換体をもたらすことを報告した。そのような鞘脱粒耐性系統の鞘は、裂開部を有さず、鞘の開口が、かなりの圧力を適用することによる弁の無作為な破砕によってのみ達成できた。
Vancanneyt et al., 2002（XIII International Conference on Arabidopsis Research, Sevilla, Spain June 28-July 2; 2002）は、また、いわゆるｄｓＲＮＡサイレンシング技術を使用したアラビドプシス・サリアナにおけるＩＮＤ遺伝子のサイレンシングが、ほぼ完全な鞘脱粒耐性をもたらすことを報告した。トランスジェニックのアラビドプシス系統の９８%が長角果を発生し、それは弁抱合に沿って開かず、かなりの圧力を弁に適用することによってのみ開くことができた。
種子脱粒は菜種培養における重要な問題（鞘脱粒耐性系統を発生させることにより解決されうる）を構成し、最終的に、鞘からの種子の分離が依然として必要とされることを認識することが重要である。通常の農業実施において、これは、コンバインハーベスターによる鞘の脱穀により達成される。コンバインハーベスターによる鞘の脱穀は、完全でなければならず、種子へ最小限の損傷を起こし、このようにして放出される。しかし、鞘の強度が増加するにつれ、それらを脱穀するために必要とされるより重度の作用が、種子に許容不可能なレベルの損傷を起こす。鞘脱粒耐性ブラシカ科植物の鞘は、このように、それらがコンバインハーベスター中で脱穀できないほど強くはないはずである（Bruce et al. 2001, J. Agric. Engng Res. 80, 343-350）。
ＷＯ ２００４／１１３５４２には、ブラシカ科植物における鞘の裂開部及び弁縁の発生に関与する遺伝子の中程度のｄｓＲＮＡ遺伝子サイレンシングによって、鞘脱粒耐性の増加及び種子脱粒の低下を伴うトランスジェニック系統の単離が可能になり、その鞘は、しかし、限られた物理的力を適用することにより裂開部に沿って依然として開かれうることが記載されている。
特定のＩＮＤ遺伝子の配列及びその突然変異配列、特にアラビドプシス及びブラシカ・ナパスＩＮＤ遺伝子配列及び突然変異アラビドプシスＩＮＤ遺伝子配列が、当技術分野において利用可能であるとの事実にもかかわらず、例えば、植物（例えばブラシカ・ナパス植物など）における種子脱粒の特異的な所望の改変を可能にするために、さらなるＩＮＤ遺伝子配列の必要性が残る。経済的に重要なブラシカ科植物（例えば菜種など）におけるｉｎｄに対応する突然変異対立遺伝子の単離は、骨の折れる時間のかかる作業である。さらに、そのような単離は、菜種における複２倍体及び対応する遺伝子の結果的な機能的重複性により複雑化されうる。
これら及び他の目的が、本発明により達成され、本発明の要約、図面、詳細な説明、実施例、及び特許請求の範囲において記載される種々の実施態様により示される通りである。
発明の概要
本発明者らは、ブラシカ植物における果実の裂開特性は、種子鞘において「機能的に発現される」、即ち、機能的な（生物学的に活性化）ＩＮＤタンパク質をもたらすＩＮＤ遺伝子／対立遺伝子の数を制御することにより制御できることを見出している。多くの完全ノックアウト突然変異ＩＮＤ対立遺伝子（「ｉｎｄ対立遺伝子」）を組み合わせ、最小数の野生型ＩＮＤ対立遺伝子を維持し、最小レベルの機能的ＩＮＤタンパク質をもたらすことにより、種子鞘の裂開特性を改変することができ、より具体的には鞘脱粒耐性を増加させることができ、及び、種子脱粒を低下させることができ、または、種子脱粒を収穫後まで遅延させることができ、同時に農学的に関連する鞘の脱穀性を維持し、鞘が、依然として、限られた物理的力を適用することにより裂開部に沿って開かれうる。最小数の野生型ＩＮＤ対立遺伝子が、特にコンバインハーベスターによる鞘の脱穀により、鞘からの種子の分離を依然として可能にするために必要とされ、鞘の脱穀は完全であり、最小限の損傷を種子に起こし、このようにして放出されると考えられる。
このように、第１の局面において、本発明は、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物、特にブラシカ・ナパス植物（ならびにその部分、例えば種子鞘及び種子など）（そのゲノム中に３つの完全ノックアウト突然変異ＩＮＤ対立遺伝子、特にＩＮＤ−Ａ１及び／又はＩＮＤ−Ｃ１遺伝子を含み、そして植物の鞘脱粒耐性が、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含まない植物の鞘脱粒耐性と比較し、有意に増加されるが、しかし、植物は農学的に関連する鞘の脱穀性を維持する）を提供する。
別の局面において、本発明は、野生型及び／又は突然変異ＩＮＤタンパク質、ならびにそのフラグメントをコードする（単離された）核酸配列、ならびに植物の果実の裂開特性を改変するためのこれらの核酸配列を使用する方法を提供する。また、タンパク質自体及びそれらの使用を提供する。
本発明は、さらに、少なくとも１つの完全ノックアウト突然変異ＩＮＤ対立遺伝子、そしてそのため、対応する機能的ＩＮＤタンパク質をコードするＩＮＤ対立遺伝子を含む植物、ならびにその細胞、部分、種子、及び後代と比較し、低下量の機能的ＩＮＤタンパク質を含む、植物、ならびのその細胞、部分、種子、及び後代に関する。そのような植物、ならびにその細胞、部分、種子、及び後代を、改変された果実の裂開特性を伴う植物を得るために、特に、農学的に関連する鞘の脱穀性を維持する、有意に低下した種子裂開を伴うブラシカ植物を得るために使用することができる。本明細書において使用する「植物部分」は、本発明の植物に由来するすべてのもの（植物部分、例えば細胞、組織、器官、種子、種子鞘、種子ミール（ｓｅｅｄ ｍｅａｌ）、油粕（ｓｅｅｄ ｃａｋｅ）、種子油脂又は油などを含む）を含む。
さらなる局面において、本発明は、改変された脱粒耐性を伴う種子鞘（本発明の植物から得ることができる）、及び、例えば植物からの後代を植えて生育させるための種子鞘の使用に関する。
本発明のさらに別の局面において、少なくとも１つの完全ノックアウト突然変異ｉｎｄ対立遺伝子を含む、植物、ならびにその細胞、部分、種子、及び後代を生成及び選択するための方法を提供する。特に、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物、特に、ゲノム中に少なくとも２つの異なるＩＮＤ遺伝子座の少なくとも１つ、例えばブラシカＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の２つの異なる遺伝子座の少なくとも１つに存在する少なくとも１つの完全ノックアウト突然変異ｉｎｄ対立遺伝子を含むブラシカ・ナパス植物、ならびにその細胞、部分、種子、及び後代を生成及び選択するため、ならびに植物又は植物部分において突然変異ｉｎｄ対立遺伝子と野生型ＩＮＤ対立遺伝子の存在を識別するための方法を提供する。このように、ｉｎｄ対立遺伝子又はそのような対立遺伝子を含む植物もしくは植物部分を生成及び／又は同定するため、及び、適した数のｉｎｄ対立遺伝子及び／又は異なる型のｉｎｄ対立遺伝子を単一の植物において組み合わせるため（それによりこの植物の果実の裂開特性が有意に改変される）の方法（例えば突然変異生成及び／又はマーカー利用選択（ｍａｒｋｅｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ））を提供する。
本発明の別の実施態様において、本発明の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を使用し、ブラシカ植物からの収穫された種子又は穀物の収率を増加させる。増加した収率は、種子脱粒を低下又は遅延させることの結果でありうるが、しかし、また、種子脱粒の低下又は遅延に非依存的でありうる。特に、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物、又はその細胞、部分、種子、もしくは後代（これらの植物が、それらのゲノム中に、本明細書に記載する２つの突然変異ホモ接合性ＩＮＤ対立遺伝子を含むことを特徴とする）を提供する。
ブラシカ・ナパスからの野生型ＩＮＤ−Ａ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ａ１遺伝子の略図（配列番号５）。 ブラシカ・ナパスからの野生型ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の略図（配列番号７）。 図１及び２では、実施例において記載する突然変異の位置（実施例に記載するそれらのそれぞれの「ｉｎｄ−ｘ１−ＥＭＳｘｘ」名に従って「ＥＭＳｘｘ」と名付けられる）を、垂直線を用いて示す；ＩＮＤ特定のプローブの長さ及び位置（それらのそれぞれの配列番号ｘｘに従って「ＩＤ ｘｘ」と名付けられる）をＩＮＤ遺伝子の略図の下に水平線により示す；ＩＮＤ特異的プライマーの位置（それらのそれぞれの配列番号ｘｘに従って「ＩＤ ｘｘ」と名付けられる）を矢印により示す。
一般的な定義
「鞘脱粒耐性の増加」及び「種子脱粒の低下」は、本明細書において使用する通り、ブラシカ植物（その果実は通常、同調して成熟せず、しかし、連続的に成熟し、一部の鞘が破裂して開き、収穫前又は収穫中にそれらの種子を脱粒する）の減少した種子脱粒傾向及び／又は種子脱粒のタイミングにおける遅延（特に収穫後まで）を指す。鞘脱粒に対する耐性レベルは、例えば、「引張分離テスト（ｔｅｎｓｉｌｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）」において鞘を破壊するために必要とされる力（Davies and Bruce, 1997, J Mat Sci 32: 5895-5899；Morgan et al., 1998, Fields Crop Research 58, 153-165）、「無作為影響テスト（ｒａｎｄｏｍ ｉｍｐａｃｔ ｔｅｓｔ）」において例えば２０秒（「ＩＰ２０」；Morgan et al., 1998、上記）、９．７秒、又は１７秒（Bruce et al., 2002, Biosystems Eng 81(2): 179-184）後に残るインタクトな鞘の数、無作為影響テストにおける鞘のサンプル半減期（「ＬＤ５０」）、即ち、テストされた鞘サンプルにおいて５０%の鞘の開口を起こすために必要とされる処理時間、及び「脱粒についての野外スコア」（Morgan et al., 1998、上記）とポジティブな相関し、例えば、これらを決定することにより測定することができる。無作為影響テスト（ＲＩＴ）及びそのようなＲＩＴにおいて鞘サンプルの半減期を定義するためのアルゴリズムが、Bruce et al., 2002（上記）、Morgan et al., 1998（上記）、及び以下の実施例において記載されている。両方の刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。簡単に説明すると、インタクトな成熟鞘のサンプルを密封ドラム中に鉄球と一緒に置き、ドラムを次に漸増時間（例、１０秒、２０秒、４０秒、８０秒）にわたりはげしく撹拌する。各時間後、ドラムを開け、破壊及び損傷された鞘の数をカウントする。各系統についての脱粒耐性のレベルの最も正確な評価は、線形曲線×線形曲線を全ての利用可能なデータに適合させて、サンプル内の鞘の半分が破壊さるために必要な時間（「鞘サンプル半減期」又は「ＬＤ５０」）を評価することにより算出される。しかし、鞘が主に裂開部に沿って開き、簡単に微粉砕されないことが重要である（非裂開性の鞘で起こりうるとの同様である）。
「農学的に関連する鞘脱粒耐性の増加」は、本明細書において使用する通り、野外においてその植物について通常観察されるもの未満である、野外（収穫前）において鞘脱粒に関連する収率損失をもたらす植物における鞘脱粒耐性の増加を指す。菜種について、野外における鞘脱粒に関連する収率損失は、平均して良好な生育条件を伴う季節について約１１%、そして平均して不良な生育条件を伴う季節について約２５%であると報告されている。ポジティブな相関が、Bruce et al., 2002（Biosystems Eng 81(2): 179-184）により記載される無作為影響テストにおいて、これらのレベルの種子損失と９．７秒及び１７秒の処理時間での種子損失レベルの間にそれぞれ見出されている。あるいは、植物における鞘脱粒に対する耐性レベルが農学的に関連するか否かを判断するために、植物の鞘サンプル半減期（「ＬＤ５０」、上記を参照のこと）を、平均レベルの鞘脱粒耐性を有することが公知である植物（例えば菜種、全ての現在市販されている菜種品種など）の鞘サンプル半減期と比較することができる。
本明細書において使用する「鞘又は種子脱粒」又は「果実又は鞘裂開」は、種子の成熟後に果実において起こるプロセスを指し、それにより弁が中心の隔壁から脱離して、種子を遊離する。破壊される領域（即ち、「裂開部」）は、弁とレプルム（外部隔壁）の間の果実の全長に走る。成熟時、「裂開部」は、本質的に、弁中の木化細胞の領域とレプルムの間の細胞の非木化層である。脱粒は、裂開部における細胞壁の緩みと、長角果における乾燥細胞の機械的特性の差異により確立される張力の組み合わせに起因して起こる。
ブラシカ「果実」は、本明細書において使用する通り、融合した心皮から構成される雌しべから発生するブラシカ植物の器官を指し、受精時、生育して、発生中の種子を含む「（種子）鞘」又は「長角果」になる。ブラシカ「（種子）鞘」又は「長角果」は、隔壁により分離された２つの房を封入する果実壁（心皮）からなる。「裂開部」は、隔壁に隣接する心皮縁で発生し、長角果の全長に走る。裂開部の細胞は、最終的に、分解し始め、これは心皮壁又は弁と隔壁の間の接触を弱める。細胞接着の喪失は、裂開部の細胞に限局し、中葉の分解に起因する（Meakin and Roberts, 1990, J Exp Bot 41, 995-1011）。
「裂開部」は、本明細書において使用する通り、単純な実質細胞の層を指し、植物、特にブラシカ植物の二重弁鞘の両側に位置する縫合中に含まれる。裂開部は、鞘の弁端と、柄又は小花柄への主な維管束を含む中心のレプルムの間に位置する。裂開部における細胞の解離が、鞘の老化中に起こり、鞘が完全な成熟に達する時間までには完全である（Meakin and Roberts, 1990、上記）。弁分離が次に起こりうる。裂開部は維管束跡を含み、それは鞘壁から小花柄（柄）及びレプルムまで通過する。鞘脱粒のプロセスは、外力が繊細な維管束筋を破砕した後にだけ起こり、弁を分離させ、種子を地面に落とすことを可能にする。これは、草冠の撹乱中、例えば収穫中でのコンバインとの接触により起こる。維管束組織は肥厚した木化細胞を含み、厚角細胞群を形成し、伝導性細胞（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）に隣接して見出される（Meakin and Roberts, 1990、上記）。これは、組織への硬性、恐らくは、破砕に対するいくらかの耐性を提供する。
本明細書において使用する「農学的に関連する脱穀性」は、例えばコンバインハーベスター中で使用された際、種子への損傷を防ぎつつ鞘の完全な開口を可能にする物理的力の適用時での、鞘、特に菜種の鞘の、鞘の裂開部に沿った開口（種子の同時放出を伴う）に対する耐性を指す。ポジティブな相関が、無作為影響テストにおける鞘サンプル半減期（「ＬＤ５０」）とそれらの脱穀の間に見出されている。菜種鞘サンプルの半減期は、実施例に記載される通りにＲＩＴにおいて測定され、農学的に関連する脱穀性に対応し、８０秒を超えないはずである。市販の菜種品種のコントロール系統についての典型的なサンプル半減期の値は、約１０秒である。このように、有意に増加した鞘脱粒耐性を伴う、農学的に関連する脱穀性を伴う系統は、ＲＩＴにおいて、約１０〜約８０秒の間、約１０〜約６０秒の間、約１０〜約５０秒の間、約２０〜約６０秒の間、約２０〜約５０秒の間、約４０〜約６０秒の間、約５７秒の鞘サンプル半減期を有する。
詳細な説明
「作物植物」は、作物として栽培される植物種を指す（例えばブラシカ・ナパス、（ＡＡＣＣ、２ｎ＝３８）、ブラシカ・ジュンセア（ＡＡＢＢ、２ｎ＝３６）、ブラシカ・カリナタ（ＢＢＣＣ、２ｎ＝３４）、ブラシカ・ラパ（ｓｙｎ． Ｂ． カンペストリス（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））（ＡＡ、２ｎ＝２０）、ブラシカ・オレラセア（ＣＣ、２ｎ＝１８）、又はブラシカ・ニグラ（ＢＢ、２ｎ＝１６）など）。定義は草、例えばアラビドプシス・サリアナなどを包含しない。
「核酸配列」（又は核酸分子）という用語は、一本又は二本鎖形態のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、特に本発明のタンパク質又はタンパク質フラグメントをコードするＤＮＡを指す。「内因性核酸配列」は、植物細胞内の核酸配列（例、ブラシカ細胞の核ゲノム内に存在するＩＮＤ遺伝子の内因性対立遺伝子）を指す。「単離された核酸配列」を使用して、もはやその自然環境中、例えばインビトロ又は組換え細菌もしくは植物の宿主細胞中にない核酸配列を指す。
「遺伝子」という用語は、細胞においてＲＮＡ分子に転写され（例、イントロン配列を含むプレｍＲＮＡに、それは次に成熟ｍＲＮＡに、又は、直接的にイントロン配列を伴わないｍＲＮＡにスプライシングされる）、調節領域（例、プロモーター）に機能的に連結された領域（転写領域）を含むＤＮＡ配列を意味する。遺伝子は、このように、いくつかの機能的に連結された配列、例えばプロモーター、例えば翻訳開始に関与する配列を含む５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、及び例えば転写終結部位を含む３’非翻訳配列などを含みうる。「内因性遺伝子」を使用して、「外来遺伝子」、「トランスジーン」、又は「キメラ遺伝子」から区別し、特定の植物属、種、又は品種の植物からの遺伝子を指し、それは形質転換によりその植物中に導入されていない（即ち、それは「トランスジーン」ではない）が、しかし、それは通常、その属、種、又は品種の植物中に存在する、あるいは、別の植物の属、種、又は品種の植物からその植物に導入され、それにおいては通常、通常の育種技術により又は体細胞交雑により（例、プロトプラスト融合により）存在する。同様に、遺伝子の「内因性対立遺伝子」は、植物の形質転換により植物又は植物組織に導入されず、しかし、例えば、植物の突然変異生成及び／又は選択により生成され、又は、植物の自然集団をスクリーニングすることにより得られる。
「遺伝子の発現」又は「遺伝子発現」は、適切な調節領域、特にプロモーターに機能的に連結されたＤＮＡ領域がＲＮＡ分子に転写されるプロセスを指す。ＲＮＡ分子は、次に、（翻訳後プロセスにより）細胞内で、例えば、ＲＮＡスプライシング及び翻訳開始及びアミノ酸鎖（ポリペプチド）への翻訳、ならびに翻訳終止コドンによる翻訳終結によりさらにプロセシングされる。「機能的に発現される」という用語を本明細書において使用して、機能的タンパク質が産生されることを示す；「非機能的に発現される」という用語は、有意に低下した機能性又は無機能性（生物学的活性）を伴うタンパク質が産生されること、又は、タンパク質が産生されないことを示す（さらに以下を参照のこと）。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」という用語は互換的に使用され、アミノ酸の鎖からなる分子を指し、特定の作用機序、サイズ、３次元構造、又は由来を参照しない。ＩＮＤタンパク質の「フラグメント」又は「部分」は、このように、依然として「タンパク質」と呼ばれる。「単離されたタンパク質」を使用して、もはやその自然環境中、例えばインビトロ又は組換え細菌もしくは植物の宿主細胞中にないタンパク質を指す。「転写因子」という用語を使用して、一緒に機能して標的遺伝子プロモーターからの転写開始速度を変調する少なくとも２つの分離したドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン及び活性化又は抑制ドメイン）からなるタンパク質を指す（Ptashne, 1988, Nature 335, 683-689）。「ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）ドメイン転写因子」という用語を使用して、ｂＨＬＨ ＤＮＡ結合ドメイン（Heim et al., 2003, Mol Biol Evol 20, 735-747；Toledo-Ortiz et al., 2003, Plant Cell 15, 1749-1770）とは別に、異なる種からの関連するタンパク質においてアミノ酸レベルで保存されうる遺伝子発現の調節のために重要であることが公知であるドメイン（Quong et al., 1993, Mol Cell Biol 13, 792-800）を含む転写因子を指す。ｂＨＬＨドメインを含む転写調節因子は、塩基性領域中の残基を通じてＤＮＡに結合し、ヘリックス・ループ・ヘリックス・ドメインが二量体化を促進し、ファミリーのメンバーがヘテロ二量体又はホモ二量体を形成することを可能にする（Murre et al., 1989, Cell 56, 777-783）。
「ＩＮＤ遺伝子」は、本明細書において、ＩＮＤＥＨＩＳＣＥＮＴ（ＩＮＤ）タンパク質（種子の飛散のために必要とされるｂＨＬＨドメイン転写因子である）をコードする核酸配列を指す（Liljegren et al., 2004, Cell 116: 843-853）。
本明細書において使用する「対立遺伝子」という用語は、特定の遺伝子座での遺伝子の１つ又は複数の代替形態のいずれかを意味する。生物の二倍体（又は複二倍体）細胞において、所定の遺伝子の対立遺伝子が、染色体上の特定の位置又は遺伝子座に位置する。１つの対立遺伝子が、相同染色体の対の各染色体上に存在する。
本明細書において使用する「相同染色体」という用語は、同じ生物学的特性のための情報を含み、同じ遺伝子座での同じ遺伝子、しかし、恐らくはそれらの遺伝子の異なる対立遺伝子を含む染色体を意味する。相同染色体は、減数分裂中に対を形成する染色体である。「非相同染色体」は、生物の全ての生物学的特性を表わし、セットを形成し、細胞中のセットの数は倍数性と呼ばれる。二倍体生物は２セットの非相同染色体を含み、それにおいて各相同染色体は異なる親から遺伝される。複二倍体の種において、本質的に２セットの二倍体ゲノムが存在し、それにより２つのゲノムの染色体は「類似相同（ホメオロガス）染色体」と呼ばれる（そして同様に、２つのゲノムの遺伝子座又は遺伝子は類似相同遺伝子座又は遺伝子と呼ばれる）。二倍体、又は複二倍体の植物種は、特定の遺伝子座に多数の異なる対立遺伝子を含みうる。
本明細書において使用する「ヘテロ接合性」という用語は、２つの異なる対立遺伝子が特定の遺伝子座に存在するが、しかし、細胞中の相同染色体の対応する対に個々に位置づけられる場合に存在する遺伝的条件を意味する。逆に、本明細書において使用する「ホモ接合性」という用語は、２つの同一の対立遺伝子が特定の遺伝子座に存在するが、しかし、細胞中の相同染色体の対応する対に個々に位置づけられる場合に存在する遺伝的条件を意味する。
本明細書において使用する「遺伝子座」（遺伝子座（複数形））は、例えば遺伝子又は遺伝子マーカーが見出される染色体上の特定の場所又は部位を意味する。例えば、「ＩＮＤ−Ａ１遺伝子座」は、ＩＮＤ−Ａ１遺伝子（及び２つのＩＮＤ−Ａ１対立遺伝子）が見出されうるＡゲノムの染色体上の部位を指し、「ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子座」は、ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子（及び２つのＩＮＤ−Ｃ１対立遺伝子）が見出されうるＣゲノムの染色体上の部位を指す。
本発明の「植物」を参照する場合はいつでも、植物部分（細胞、組織又は器官、種子鞘、種子、切断部分、例えば根、葉、花、花粉など）、親の識別特徴（特に果実の裂開特性）を保持する植物の後代、例えば自家受粉又は交雑により得られる種子、例えば雑種種子（２つの自殖の親系統を交雑することにより得られる）、雑種植物、及びそれに由来する植物部分も、特に示さない限り、本明細書に包含されることも理解される。
「分子アッセイ」（又はテスト）は、本明細書において、１つ又は両方のＩＮＤ遺伝子座での（例、ＩＮＤ−Ａ１又はＩＮＤ−Ｃ１遺伝子座の１つ又は両方での）１つ又は複数の特定のＩＮＤ対立遺伝子の存在又は非存在を（直接的又は間接的に）示すアッセイを指す。一実施態様において、それによって、特定の（野生型又は突然変異）対立遺伝子が、任意の個々の植物中の遺伝子座でホモ接合性又はヘテロ接合性であるのかを決定することが可能になる。
「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）」（「ｗｉｌｄｔｙｐｅ」又は「ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ」とも書く）は、本明細書において使用する通り、それが最も共通して自然において生じる植物又は遺伝子の典型的な形態を指す。「野生型植物」は、自然集団においてそのような植物の最も共通する表現型を伴う植物を指す。「野生型対立遺伝子」は、野生型表現型を産生するために必要とされる遺伝子の対立遺伝子を指す。対照的に、「突然変異植物」は、自然集団においてそのような植物の異なる稀な表現型を伴う植物、又は、ヒトの介入により、例えば、突然変異生成により産生される植物を指し、そして「突然変異対立遺伝子」は、突然変異表現型を産生するために必要とされる遺伝子の対立遺伝子を指す。
本明細書において使用する「野生型ＩＮＤ」（例、野生型ＩＮＤ−Ａ１又はＩＮＤ−Ｃ１）という用語は、植物、特にブラシカ科植物、特にブラシカ植物内で見出される自然発生ＩＮＤ対立遺伝子を意味し、機能的ＩＮＤタンパク質（例、それぞれ機能的ＩＮＤ−Ａ１又はＩＮＤ−Ｃ１）をコードする。対照的に、「突然変異ＩＮＤ」（例、突然変異ＩＮＤ−Ａ１又はＩＮＤ−Ｃ１）という用語は、本明細書において使用する通り、機能的ＩＮＤタンパク質をコードしないＩＮＤ対立遺伝子を指し、即ち、非機能的ＩＮＤタンパク質（例、それぞれ非機能的ＩＮＤ−Ａ１又はＩＮＤ−Ｃ１）（本明細書において使用する通り、対応する野生型の機能的ＩＮＤタンパク質と比較し、無生物学的活性もしくは有意に低下した生物学的活性を有する、又は、ＩＮＤタンパク質を全くコードしないＩＮＤタンパク質）をコードするＩＮＤ対立遺伝子を指す。そのような「突然変異ＩＮＤ対立遺伝子」（「完全ノックアウト」又は「ヌル」対立遺伝子とも呼ぶ）は野生型ＩＮＤ対立遺伝子であり、その核酸配列中に１つ又は複数の突然変異を含み、それにより突然変異は好ましくは細胞においてインビボで有意に低下した（絶対又は相対）量の機能的ＩＮＤタンパク質をもたらす。本明細書において使用する「完全ノックアウトＩＮＤ対立遺伝子」は、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子であり、その存在は、ホモ接合状態において、植物（例、２つの完全ノックアウトＩＮＤ−Ａ１対立遺伝子及び２つの完全ノックアウトＩＮＤ−Ｃ１対立遺伝子を伴うブラシカ・ナパス植物）中の各ＩＮＤ遺伝子座で、その植物において鞘脱粒耐性の増加をもたらし、それは依然として農学的に関連するには高すぎる。ＩＮＤタンパク質をコードする核酸配列の突然変異対立遺伝子は、本明細書において「ｉｎｄ」（例、それぞれｉｎｄ−ａ１又はｉｎｄ−ｃ１）と命名される。突然変異対立遺伝子は、「自然突然変異」対立遺伝子（自然において見出される（例、突然変異原のヒトの適用なしに自発的に産生される）突然変異対立遺伝子）又は「誘発突然変異」対立遺伝子（ヒトの介入により、例えば、突然変異生成により誘発される）のいずれかでありうる。
「有意に低下した量の機能的ＩＮＤタンパク質」（例、機能的ＩＮＤ−Ａ１又はＩＮＤ−Ｃ１タンパク質）は、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含まない細胞により産生される機能的ＩＮＤタンパク質の量と比較し、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む細胞により産生される機能的ＩＮＤタンパク質の量における少なくとも３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、９５%、又は１００%（即ち、機能的ＩＮＤタンパク質が細胞により産生されない）の低下を指す。この定義は、インビボで無生物学的活性を有する「非機能的」ＩＮＤタンパク質（例、切断ＩＮＤタンパク質）の産生、機能的ＩＮＤタンパク質の絶対量における低下（例、ＩＮＤ遺伝子における突然変異のため機能的ＩＮＤタンパク質が作られない）、及び／又は、機能的な野生型ＩＮＤタンパク質の活性と比較し、有意に低下した生物学的活性を伴うＩＮＤタンパク質の産生を包含する（コードされるＩＮＤタンパク質の生物学的活性のために決定的である１つ又は複数のアミノ酸残基が、以下に例示する通り、別のアミノ酸残基について置換されるＩＮＤタンパク質など）。「突然変異ＩＮＤタンパク質」という用語は、本明細書において使用する通り、突然変異ＩＮＤ核酸配列（「ｉｎｄ」対立遺伝子）によりコードされるＩＮＤタンパク質を指し、それにより突然変異は、非突然変異の野生型ＩＮＤ配列（「ＩＮＤ対立遺伝子」）によりコードされるＩＮＤタンパク質の活性と比較し、インビボで有意に低下したＩＮＤ活性及び／又は無ＩＮＤ活性をもたらす。
「突然変異生成」は、本明細書において使用する通り、植物細胞（例、複数のブラシカ種子又は他の部分、例えば花粉など）を、細胞のＤＮＡにおいて突然変異を誘発する技術、例えば変異原性薬剤、例えば化学物質（例えばエチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）など）又は電離放射線（例えば中性子（例えば高速中性子突然変異生成など）、アルファ線、ガンマ線（例えばコバルト６０供給源により供給されるものなど）、Ｘ線、ＵＶ照射など、あるいはこれらの２つ又はそれ以上の組み合わせに供するプロセスを指す。このように、１つ又は複数のＩＮＤ対立遺伝子の所望の突然変異生成は、化学的手段、例えば、１つ又は複数の植物組織とエチルメチルスルホネート（ＥＭＳ）、エチルニトロソ尿素（ＥＮＵ）などとの接触により、物理的手段（例えばｘ線など）の使用により、又はガンマ照射（例えばコバルト６０供給源により供給されるものなど）により達成されうる。放射線照射により引き起こされる突然変異はしばしば大きな欠失又は他の甚だしい損傷、例えば転座又は複雑な再配列であり、化学的突然変異原により引き起こされる突然変異はしばしばより分離した損傷、例えば点突然変異などである。例えば、ＥＭＳはグアニン塩基をアルキル化し、それは塩基の誤対合をもたらす：アルキル化されたグアニンはチミン塩基と対合し、主にＧ／ＣからＡ／Ｔ転位をもたらす。突然変異生成に続き、ブラシカ植物が、処置された細胞から公知の技術を使用して再生される。例えば、結果として得られるブラシカ種子を、従来の生育手順に従って植えることができ、そして続く自家授粉種子が植物に形成される。あるいは、例えばCoventry et al.（1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada）により記載される通りに、倍加半数体小植物が抽出されて、迅速にホモ接合性植物を形成しうる。この世代又はその後の世代におけるそのような自家受粉の結果として形成される追加の種子を収穫して、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在についてスクリーニングしてよい。特定の突然変異対立遺伝子をスクリーニングするためのいくつかの技術が公知であり、例えば、Deleteagene（商標）（Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242）ではポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）アッセイを使用して、高速中性子突然変異生成により生成される欠失突然変異体についてスクリーニングし、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化誘発局所的損傷（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｏｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｅｓ）；McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18: 455-457）によってＥＭＳ誘発性点突然変異などを同定する。特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在についてスクリーニングするための追加の技術が、以下の実施例において記載される。
本明細書において使用する「非自然発生」という用語は、植物を参照して使用される場合、人間により改変されているゲノムを伴う植物を意味する。トランスジェニック植物は、例えば、外因性の核酸分子、例えば、転写された場合、内因性遺伝子の発現を低下させることができる生物学的に活性なＲＮＡ分子を生じる転写領域を含むキメラ遺伝子を含み、従って、人間により遺伝子改変されている非自然発生植物である。また、内因性遺伝子における突然変異、例えば、変異原性薬剤への暴露の結果としての内因性ＩＮＤ遺伝子における（例、調節エレメントにおける又はコード配列における）突然変異を含む植物も非自然植物と見なす。なぜならそれは人間により遺伝的に改変されているからである。さらに、特定の種、例えばブラシカ・ナパスなどの植物は、内因性遺伝子において、例えば内因性ＩＮＤ遺伝子において突然変異を含み、それは自然において、その特定の植物種において、例えば、同じ又は別の種、例えばブラシカ・ジュンセア又はラパなどの植物を用いた、指導された育種プロセス、例えばマーカー利用育種及び選択又は遺伝子移入などの結果として生じることはなく、そのような植物も非自然発生植物と見なされる。対照的に、自発的な又は自然発生の突然変異だけ含む植物、即ち、人間により遺伝的に改変されていない植物は、本明細書において定義する「非自然発生植物」ではなく、従って、本発明内に包含されない。当業者は、非自然発生植物が、典型的に、自然発生植物と比較し、変化したヌクレオチド配列を有し、非自然発生植物は、そのヌクレオチド配列を変えることなく、例えば、そのメチル化パターンを改変することにより人間により遺伝的に改変することもできることを理解する。
遺伝子又はタンパク質の「オルソログ」という用語は、本明細書において、別の種において見出される相同遺伝子又はタンパク質を指し、それはその遺伝子又はタンパク質と同じ機能を有するが、しかし、その遺伝子を持つ種が分岐した（即ち、遺伝子が共通の祖先から種分化により進化した）時点から配列において（通常）分岐している。ブラシカ・ナパスＩＮＤ遺伝子のオルソログは、このように、他の植物種（例、ブラシカ・ジュンセアなど）において、配列比較（例、全配列にわたる又は特定のドメインにわたるパーセント配列同一性に基づく）及び／又は機能解析の両方に基づき同定されうる。
「品種」を本明細書においてＵＰＯＶ条約に準拠して使用し、最低の公知のランクの単一植物分類群内での植物グループ化を指し、そのグループ化は、所定の遺伝子型又は遺伝子型の組み合わせに起因する特徴の発現により定義することができ、特徴の少なくとも１つの発現により任意の他の植物グループ化から識別することができ、そして不変のまま（安定に）増殖させるためのその安定性に関する単位と見なされる。
「含む」という用語は、記載した部分、工程、又は構成要素の存在を特定することと解釈すべきであるが、しかし、１つ又は複数の追加の部分、工程、又は構成要素の存在を除外しない。特定の形質を含む植物は、このように、追加の特質を含みうる。
単数形の単語（例、「ｐｌａｎｔ」又は「ｒｏｏｔ」）を指す場合、複数形（例、複数形「ｐｌａｎｔｓ」、複数形「ｒｏｏｔｓ」）も本明細書において含まれることが理解される。このように、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」によるエレメントの参照は、文脈が明らかに１つ又は１つだけの要素が存在することを必要としない場合、１を超える要素が存在する可能性を除外しない。不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、このように通常は「少なくとも１つ」を意味する。
本発明の目的のために、２つの関連するヌクレオチド又はアミノ酸配列の「配列同一性」は、パーセントで表わし、比較される位置の数により割った同一の残基（×１００）を有する２つの最適に整列化した配列における位置の数を指す。ギャップ、即ち、残基が１つの配列において存在するが、しかし、他においては存在しないアラインメント中の位置を、非同一残基を伴う位置と見なす。２つの配列の「最適なアラインメント」が、The European Molecular Biology Open Software Suite（EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277；例、http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.htmlを参照のこと）におけるNeedleman及びWunschのグローバルアラインメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3): 443-53）に従って、デフォルト設定（ギャップ開始ペナルティ＝１０（ヌクレオチドについて）／１０（タンパク質について）及びギャップ伸長ペナルティ＝０．５（ヌクレオチドについて）／０．５（タンパク質について））に従い、２つの配列を全長にわたり整列することにより見出される。ヌクレオチドについて、使用するデフォルトスコアリングマトリクスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質について、デフォルトスコアリングマトリクスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
「実質的に同一の」又は「本質的に同様の」は、本明細書において使用する通り、配列を指し、それは、上記の通りに最適に配列化された場合、少なくとも特定の最小パーセントの配列同一性（以下でさらに定義する）を共有する。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」を使用して、所定のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定できる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境において異なりうる。一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びｐＨで特定の配列について熱融点よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０%が、完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下）である。典型的に、塩濃度がｐＨ ７で０．０２モル、及び、温度が少なくとも６０℃であるストリンジェントな条件が選ばれうる。塩濃度を低下させること及び／又は温度を増加させることによって、ストリンジェンシーが増加する。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（プローブ（例、１００ｎｔ）を使用したノーザンブロット）のためのストリンジェントな条件は、例えば、６３℃の０．２×ＳＳＣにおける２０分間の少なくとも１回の洗浄を含むもの、又は等価の条件である。
「高ストリンジェンシー条件」を、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０M ＮａＣｌ、０．３M Ｎａクエン酸（ｐＨ ７．０））、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ（１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓは２% Ｆｉｃｏｌｌ、２% ポリビニル・ピロリドン、２%ウシ血清アルブミン）、０．５%ドデシル硫酸ナトリウ（ＳＤＳ）、及び非特異的コンペティターＤＮＡとしての２０μg/ml未変性キャリアＤＮＡ（一本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長１２０〜３０００ヌクレオチド）を含む水溶液における６５℃でのハイブリダイゼーションにより提供することができる。ハイブリダイゼーションに続き、高ストリンジェンシー洗浄をいくつかの工程において行うことができ、０．２〜０．１×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション温度での最終洗浄（約３０分）を伴う。
「中程度のストリンジェンシー条件」は、上記の溶液におけるハイブリダイゼーションと等価であるが、しかし、約６０〜６２℃の条件を指す。中程度のストリンジェンシー洗浄は、１×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション温度で行ってよい。
「低ストリンジェンシー」は、上記の溶液におけるハイブリダイゼーションと等価で、約５０〜５２℃の条件を指す。低ストリンジェンシー洗浄は、２×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション温度で行ってよい。Sambrook et al.（1989）及びSambrook and Russell（2001）も参照のこと。
「収穫収率の増加」又は「種子又は穀物収率の増加」は、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を伴わない同様の数の同質遺伝子植物から収穫された種子又は穀物の量と比較し、複数の植物から収穫されたより大量の種子又は穀物を指し、各々が本発明の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む。収率は、典型的に、表面単位当たりの収穫された種子の容積単位（例えばブッシェル／エーカー又はKg/ha）で表わされる。収率増加は典型的にパーセントで表わされ、それにより参照植物又はコントロール植物の収率を１００%として参照し、本発明の植物の収率はコントロール植物の収率と比べた%で表わされる。本発明のブラシカ植物における観察された収率増加は、少なくとも１０１%から少なくとも１２４%に及び、より高い収率増加が実行可能であることが期待される。収率増加は、また、１０４%〜１０８%又は１０５%〜１１０%に及びうる。
詳細な説明
ブラシカ・ナパス（ゲノムＡＡＣＣ、２ｎ＝４ｘ＝３８）は、二倍体祖先からのその由来のため、本質的に２つの二倍体ゲノム（Ａ及びＣゲノム）を含む異質四倍体（複二倍体）種であり、そのゲノム中に２つのＩＮＤ遺伝子を含む。１つのＩＮＤ遺伝子がＡゲノム上に位置し（本明細書において「ＩＮＤ−Ａ１」と呼ぶ）、１つがＣゲノム上に位置する（本明細書において「ＩＮＤ−Ｃ１」と呼ぶ）ことが本発明者らにより見出された。ＩＮＤ−Ａ１遺伝子は、ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子と「類似相同」であると言われ、即ち、「Ａ遺伝子」はＡゲノム上に見出され、二倍体祖先Ｂ．ラパ（ＡＡ）に由来し、「Ｃ遺伝子」はＢ．ナパスのＣゲノム上に見出され、二倍体祖先Ｂ．オレラセア（ＣＣ）に由来する。
任意の二倍体ゲノムにおいてと同様に、２つの「対立遺伝子」が、インビボで、各々のＩＮＤ遺伝子について、ゲノム中の各々のＩＮＤ遺伝子座に存在しうる（１つの対立遺伝子が１つの染色体上で、そして他が相同染色体上で見出される遺伝子配列である）。これらの２つの対立遺伝子のヌクレオチド配列は、任意の所定の植物において、同一でありうる（ホモ接合性植物）又は異なりうるが（ヘテロ接合性植物）、各々のＩＮＤ遺伝子について存在する異なる可能な対立遺伝子の数は、種集団において、全体として２よりもずっと大きくなりうる。
さらに、ブラシカ・ナパス植物は、２つのＩＮＤ遺伝子の１つだけにおいて、即ち、ＩＮＤ−Ａ１又はＩＮＤ−Ｃ１において、完全ノックアウトｉｎｄ対立遺伝子についてホモ接合性であり、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含まないブラシカ・ナパス植物と比較し、鞘脱粒耐性における有意な増加を示さず、ブラシカ・ナパス植物においては、両方のＩＮＤ遺伝子において完全ノックアウトｉｎｄ対立遺伝子についてホモ接合性であり、鞘脱粒耐性が有意に増加しているが、しかし、鞘脱粒耐性のレベルは農学的に関連する脱穀性を維持するには高すぎることが見出された。対照的に、鞘脱粒耐性は、２つのブラシカ・ナパスＩＮＤ遺伝子の３つの完全ノックアウトｉｎｄ対立遺伝子を含むブラシカ・ナパス植物において、植物が農学的に関連する鞘の脱穀性を維持するレベルにまで有意に増加する。少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物における、特にＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１遺伝子を含むブラシカ・ナパス植物における３つの完全ノックアウトｉｎｄ対立遺伝子の存在が、増加した鞘脱粒耐性を示し、農学的に関連する鞘の脱穀性を維持する植物を得るために必要とされうることが考えられる。
このように、本発明の一実施態様において、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物、特にＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１遺伝子を含み、３つのｉｎｄ対立遺伝子を含むブラシカ・ナパス植物を本明細書において提供し、それによりｉｎｄ対立遺伝子は、有意に低下した量の、これらの突然変異対立遺伝子の野生型等価物によりコードされる型の機能的ＩＮＤタンパク質、そしてそのため、植物細胞において、具体的には発生中の種子鞘において、インビボで産生される全体的に有意に低下した量の機能的ＩＮＤタンパク質をもたらす。
さらに、十分なコピーの特定（突然変異）ｉｎｄ対立遺伝子を十分なコピーの特定（野生型）ＩＮＤ対立遺伝子と１つの植物、特にブラシカ植物において組み合わせることにより、作られる機能的ＩＮＤタンパク質の量及び／又は型を微調節し、次に、植物の果実の裂開特性に影響を及ぼすことが可能であると考えられる。ＩＮＤタンパク質の絶対量及び相対量をこのように調節して、農学的に関連する種子鞘の脱穀性を可能にし、収穫前又は収穫中に種子脱粒を低下させるための十分なＩＮＤタンパク質を産生することができる。
このように、本発明の一実施態様において、少なくとも１つの機能的に発現されるＩＮＤ対立遺伝子（完全に機能的なＩＮＤタンパク質をコードし、残りの対立遺伝子は（突然変異）ｉｎｄ対立遺伝子でありうる）を含む植物、特にブラシカ植物を提供する。
本発明の一局面において、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物、特に、そのブラシカ植物において少なくとも２つの異なるＩＮＤ遺伝子、特にＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１遺伝子のｎ組（ｎ−ｔｕｐｌｅ）のｉｎｄ対立遺伝子を含む（それによりｎ≦３（例、ｎ＝１、２、又は３）であり、少なくとも１つの対立遺伝子が機能的ＩＮＤタンパク質を産生する）ブラシカ・ナパス植物を提供する。
本発明のさらなる局面において、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ種、特にブラシカ属の植物のホモ接合性ＩＮＤ単一突然変異（ｎ＝２、即ち、１つのＩＮＤ遺伝子の突然変異対立遺伝子についてホモ接合性）、及び／又はホモ接合性ＩＮＤ二重突然変異（ｎ＝４、即ち、２つのＩＮＤ遺伝子の突然変異対立遺伝子についてホモ接合性）植物を提供し、それにより、突然変異対立遺伝子は、そのブラシカ植物における２つの異なるＩＮＤ遺伝子、特にＩＮＤ−Ａ１及び／又はＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の突然変異対立遺伝子である。そのような突然変異植物は、本発明に従い、育種目的のために使用してよい。このように、本発明の一実施態様において、ホモ接合性ＩＮＤ単一突然変異ブラシカ・ナパス植物を本明細書において提供し、それにおいて植物の遺伝子型をｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１、又はＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１と記載することができる。本発明の別の実施態様において、ホモ接合性ＩＮＤ二重突然変異ブラシカ・ナパス植物を本明細書において提供し、それにおいて植物の遺伝子型をｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１と記載することができる。
本発明のさらなる局面において、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ種、特にブラシカ・ナパスのホモ接合性ＩＮＤ単一（ｎ＝２）突然変異植物は、さらなる突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含み、それにおいて突然変異植物は、追加の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子（即ち、ｎ＝３）についてヘテロ接合性であり、及び、それにおいて突然変異対立遺伝子は、そのブラシカ植物における残りの野生型ＩＮＤ遺伝子、特にＩＮＤ−Ａ１又はＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の突然変異対立遺伝子である。このように、本発明のさらなる実施態様において、１つのさらなる突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むホモ接合性ＩＮＤ単一突然変異ブラシカ・ナパス植物を本明細書において提供し、それにおいて植物の遺伝子型をｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１、又はＩＮＤ−Ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１と記載することができる。
さらに、本明細書において、ブラシカ種からの野生型及び突然変異ＩＮＤ遺伝子／対立遺伝子の核酸配列、ならびに野生型及び突然変異ＩＮＤタンパク質を提供する。また、ブラシカ植物、ならびにそれらのゲノム中の野生型及び突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の特定の組み合わせを含み、それにより種子脱粒がこれらの植物において低下したブラシカ植物及び植物部分において突然変異及び野生型ＩＮＤ対立遺伝子を生成及び組み合わせる方法を提供する。突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を他の植物に移すためのこれらの植物の使用も本発明の実施態様であり、記載される植物のいずれかの植物産物であるのと同様である。また、ＩＮＤ遺伝子及び／又は対立遺伝子を組み合わせる又は検出するためのマーカー利用選択（ＭＡＳ）のためのキット及び方法を提供する。本発明の実施態様の各々が、本明細書において以下に詳細に記載される。
低下又は遅延した種子脱粒を呈する、本明細書において記載するブラシカ植物は、収穫された種子の収率における増加を有する。しかし、予想外に、２つの突然変異ＩＮＤ対立遺伝子だけをホモ接合状態で含むブラシカ植物からの収穫される種子の収率（即ち、ここにおいて植物の遺伝子型がｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１、又はＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１として記載することができる）も、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むブラシカ植物において観察可能な低下又は遅延した種子脱粒表現型の非存在にもかかわらず、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含まない同質遺伝子ブラシカ植物と比較される場合、有意に増加することが観察された。本発明は、このように、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物も提供し、ここにおいて少なくとも２つの対立遺伝子は機能的ＩＮＤタンパク質を産生し、その植物はより高い種子収率を有する。ＩＮＤ−Ａ遺伝子座又はＩＮＤ−Ｃ遺伝子座での２つの突然変異対立遺伝子は、同じ突然変異対立遺伝子又は異なる突然変異対立遺伝子でありうることが明らかである。
本発明の核酸配列
ブラシカ科から、特にブラシカ種から、特にブラシカ・ナパスから、しかし、また他のブラシカ作物種からの、機能的ＩＮＤタンパク質をコードする野生型ＩＮＤ核酸配列及びＩＮＤ遺伝子の突然変異ｉｎｄ核酸配列（１つ又は複数の突然変異、好ましくはコードされるＩＮＤタンパク質の無生物学的活性又は有意に低下した生物学的活性をもたらす、あるいは、無ＩＮＤタンパク質の産生をもたらす突然変異を含む）の両方を提供する。例えば、Ａ及び／又はＣゲノムを含むブラシカ種は、ＩＮＤ−Ａ又はＩＮＤ−Ｃ遺伝子の異なる対立遺伝子を含みうるが、それらは本発明の単一の植物において同定して、組み合わせることができる。また、突然変異生成方法を使用して、野生型ＩＮＤ対立遺伝子において突然変異を生成することができ、それにより本発明の使用のために突然変異ｉｎｄ対立遺伝子を生成する。特定のＩＮＤ対立遺伝子は、好ましくは、植物において交雑及び選択により組み合わせるため、一実施態様において、ＩＮＤ及びｉｎｄの核酸配列を植物内で（即ち、内因的に）、例えばブラシカ植物、好ましくはブラシカ・ナパスと交雑できる又は「合成」ブラシカ・ナパス植物を作るために使用できるブラシカ植物内で提供する。異なるブラシカ種の間でのハイブリダイゼーションが、当技術分野において記載され、例えば、Snowdon（2007, Chromosome research 15: 85-95）を参照のこと。種間ハイブリダイゼーションを例えば使用して、遺伝子を、例えば、Ｂ．ナパス（ＡＡＣＣ）中のＣゲノムからＢ．カリナタ（ＢＢＣＣ）中のＣゲノムへ、又はさらに、例えば、Ｂ．ナパス（ＡＡＣＣ）中のＣゲノムからＢ．ジュンセア（ＡＡＢＢ）中のＢゲノムへ（それらのＣゲノムとＢゲノムの間の非正統的組換えの散発性事象により）移すことができる。「再合成された」又は「合成」ブラシカ・ナパス系統を、元の祖先、Ｂ．オレラセア（ＣＣ）及びＢ．ラパ（ＡＡ）を交雑することにより産生することができる。種間、及びまた属間の不適合性バリヤーは、ブラシカ作物種とそれらの近縁種の間での交雑において、例えば、胚救出技術又はプロトプラスト融合により上手く克服することができる（例、Snowdon、上記を参照のこと）。
しかし、単離されたＩＮＤ及びｉｎｄの核酸配列（例、植物からクローニングにより単離される又はＤＮＡ合成により合成的に作られる）、ならびにその変異体及びこれらのいずれかのフラグメントも本明細書において提供する。なぜなら、これらは、機能的及び突然変異対立遺伝子の所望の組み合わせを有する植物を生成するために、いずれの配列が植物又は植物部分において内因的に存在するのか、いずれの配列が機能的もしくは非機能的なタンパク質をコードするのか又はタンパク質をコードしないのか（例、下に記載する組換え宿主細胞における発現による）を判断するために、及び、特定の対立遺伝子の植物から別の植物への選択及び移入のために使用することができるからである。
ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１の核酸配列がブラシカ・ナパスから単離されており、配列一覧表において描写する通りである。野生型ＩＮＤ配列を描写しており、これらの配列、及びこれらと本質的に類似の配列の突然変異ｉｎｄ配列が、本明細書において以下に、及び実施例において、野生型ＩＮＤ配列を参照して記載されている。ブラシカ・ナパスからのゲノムＩＮＤタンパク質コードＤＮＡは、イントロンを含まない。
本発明の「ＩＮＤ−Ａ１核酸配列」又は「ＩＮＤ−Ａ１変異体核酸配列」は、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列番号２との配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、又は、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列番号１又は配列番号５との配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である。これらの核酸配列は、また、配列一覧表において提供するＩＮＤ配列と「本質的に類似する」又は「本質的に同一である」と呼んでよい。
本発明の「ＩＮＤ−Ｃ１核酸配列」又は「ＩＮＤ−Ｃ１変異体核酸配列」は、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列番号４（ＩＮＤ−Ｃ１−長（ｌｏｎｇ））又は配列番号４（アミノ酸位置１６からアミノ酸位置２１０まで）（ＩＮＤ−Ｃ１−短（ｓｈｏｒｔ））との配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列、又は、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列番号３（ＩＮＤ−Ｃ１−長（ｌｏｎｇ））、配列番号３（ヌクレオチド位置４６からヌクレオチド位置６３３まで）（ＩＮＤ−Ｃ１−短（ｓｈｏｒｔ））、又は配列番号７との配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である。これらの核酸配列は、配列一覧表において提供するＩＮＤ配列と「本質的に類似」又は「本質的に同一」であると呼んでもよい。
このように、本発明は、野生型の機能的ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１タンパク質（その変異体及びフラグメント（以下でさらに定義する）を含む）をコードする核酸配列、ならびにこれらのいずれかの突然変異核酸配列の両方を提供し、それにより核酸配列中の突然変異は、好ましくは、野生型ＩＮＤタンパク質と比較し、１つ又は複数のアミノ酸が挿入、欠失、又は置換される。好ましくは、核酸配列中の突然変異は、１つ又は複数のアミノ酸変化をもたらし（即ち、野生型アミノ酸配列との関連で、１つ又は複数のアミノ酸が挿入、欠失、及び／又は置換される）、それによりＩＮＤタンパク質の生物学的活性が有意に低下する又は完全に消失する。ＩＮＤタンパク質の生物学的活性の有意な低下又は完全な消失は、本明細書において、ＩＮＤタンパク質のＤＮＡ結合活性、二量体化能力、及び／又は転写調節活性の低下又は消失を指し、突然変異ＩＮＤタンパク質を発現する植物の鞘脱粒耐性が、対応する野生型ＩＮＤタンパク質を発現する植物と比較して増加する。
植物において、特にブラシカ植物において特定のＩＮＤ対立遺伝子／タンパク質の機能性を判断するために、植物における鞘脱粒に対する耐性レベルを、巨視的、微視的、及び組織学的なアッセイ（Liljegren et al.（２００４、上記）により記載される通りに、又は、以下の実施例において記載される通りにアラビドプシスの果実及び花で実施されるアッセイと類似である）を、特定のＩＮＤ対立遺伝子／タンパク質を含む植物及び対応する野生型植物の果実及び花で実施することにより決定することができる。簡単に説明すると、鞘脱粒耐性における変化は、巨視的テスト、例えば、弁縁の存在又は非存在、鞘のくちばしの長さなどを評価するための肉眼での種子鞘の検査などにより評価及び／又は測定することができる；異なる突然変異ＩＮＤ系統と対応する野生型系統の間の鞘脱粒耐性レベルを、鞘を軽くねじった際の鞘開口の容易さを評価することにより比較するための手動影響テスト（ＭＩＴ）；それぞれ異なる突然変異ＩＮＤ系統及び対応する野生型系統からの植物からの種子鞘の脱穀性を、これらの系統の鞘サンプルの半減期を測定することにより比較するための無作為影響テスト（ＲＩＴ）；及び／又は、例えば、弁縁の細胞及び種子鞘の裂開部がＩＮＤにおける突然変異によりどのように影響を受けるか、及び、影響を受けるか否かを検証するための微視的テストによる。ひとたびＩＮＤタンパク質の二量体化パートナー（例、その機能がホモ二量体の形成に依存する場合にはＩＮＤタンパク質自体、又は、その機能がヘテロ二量体の形成に依存する場合には別のタンパク質）及び／又はその転写がＩＮＤタンパク質により調節される遺伝子が同定及び特性付けされた場合、特定のＩＮＤ対立遺伝子／タンパク質の機能性が、代わりに、例えば、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術により二量体の両方のパートナーを宿主細胞（例、細菌、例えば大腸菌など）において同時発現させ、二量体を依然として形成することができるか、二量体が調節される遺伝子のｂＨＬＨ結合部位に依然として結合することができるか、及び／又はこれらの遺伝子の転写が依然としてこの結合により調節されるかを評価することにより評価することができる。
内因性の核酸配列及び単離された核酸配列の両方を本明細書において提供する。また、プライマー又はプローブとして及び本発明の別の局面のキットの及び構成要素としての使用のために、上で定義するＩＮＤ配列及びＩＮＤ変異体核酸配列のフラグメントを提供する（以下をさらに参照のこと）。ＩＮＤ核酸配列もしくはｉｎｄ核酸配列又はその変異体（定義する通り）の「フラグメント」は、種々の長さ、例えば、ＩＮＤ配列又はｉｎｄ配列の（又は変異体配列の）少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、２００、５００、６００の連続ヌクレオチドなどでよい。
機能的ＩＮＤタンパク質をコードする核酸配列
配列一覧表において描写する核酸配列は、ブラシカ・ナパスからの野生型の機能的ＩＮＤタンパク質をコードする。このように、これらの配列は、それらが単離されたブラシカ・ナパス植物に対して内因性である。他のブラシカ作物の種、品種、育種系統、又は野生受入を、同じＩＮＤタンパク質又はその変異体をコードする、他のＩＮＤ対立遺伝子についてスクリーニングしてよい。例えば、核酸ハイブリダイゼーション技術（例、サザンブロット解析、例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する）又はＰＣＲベースの技術を使用して、他のブラシカ植物、例えば種々のブラシカ・ナパスの品種、系統、又は受入など、しかし、また、ブラシカ・ジュンセア（特にＡゲノム上のＩＮＤ対立遺伝子）、ブラシカ・カリナタ（特にＣゲノム上のＩＮＤ対立遺伝子）、ならびにブラシカ・ラパ（Ａゲノム）及びブラシカ・オレラセア（Ｃゲノム）植物に対して内因性であるＩＮＤ対立遺伝子を同定することができ、器官及び組織を他の野生型ＩＮＤ対立遺伝子についてスクリーニングすることができる。そのような植物、植物の器官又は組織をＩＮＤ対立遺伝子についてスクリーニングするために、配列一覧表において提供するＩＮＤ核酸配列、又はこれらのいずれかの変異体もしくはフラグメントを使用してよい。例えば、全配列又はフラグメントをプローブ又はプライマーとして使用してよい。例えば、特異的プライマー又は縮重プライマーを使用して、植物、植物の器官又は組織のゲノムＤＮＡからＩＮＤタンパク質をコードする核酸配列を増幅してよい。これらのＩＮＤ核酸配列を単離して、標準的な分子生物学的技術を使用して配列決定してよい。バイオインフォマティクス解析を次に使用して、例えば、いずれのＩＮＤ対立遺伝子に配列が対応するか、及び、いずれのＩＮＤタンパク質又はタンパク質変異体が配列によりコードされるかを決定するために、対立遺伝子を特性付けしてよい。
核酸配列が機能的ＩＮＤタンパク質をコードするか否かは、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術により（例、遺伝子相補テストにより）、例えばアラビドプシス植物（完全ノックアウトｉｎｄ突然変異対立遺伝子についてホモ接合性である）又はブラシカ・ナパス植物（ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１遺伝子の両方の完全ノックアウトｉｎｄ突然変異対立遺伝子についてホモ接合性である）を使用して分析することができる。
また、ＩＮＤ核酸配列及びその変異体（又はこれらのいずれかのフラグメント）はコンピュータ内で、本質的に類似の配列について核酸データベースをスクリーニングすることにより同定してよいことが理解される。同様に、核酸配列を化学的に合成してよい。本発明の核酸分子のフラグメントも提供し、それらは以下でさらに記載される。フラグメントは、ｂＨＬＨドメインだけをコードする核酸配列、又はｂＨＬＨドメインの部分、例えば塩基性ドメインもしくはＨＬＨドメインなどを含むより小さなフラグメントを含む。
突然変異ＩＮＤタンパク質をコードする核酸配列
野生型核酸配列と比べ、１つ又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含む核酸配列は、本発明の別の実施態様であり、そのような突然変異核酸分子のフラグメントと同様である。そのような突然変異核酸配列（ｉｎｄ配列と呼ばれる）は、以下でさらに記載される種々の公知の方法を使用して生成及び／又は同定することができる。この場合でも、そのような核酸分子は、内因性形態及び単離形態の両方で提供される。一実施態様において、突然変異は、コードされるＩＮＤタンパク質のアミノ酸配列におて１つ又は複数の変化（欠失、挿入、及び／又は置換）をもたらす（即ち、それは「サイレント突然変異」ではない）。別の実施態様において、核酸配列における突然変異は、野生型タンパク質と比べて、コードされるＩＮＤタンパク質の有意に低下した、又は、完全に消失した生物学的活性をもたらす。
核酸分子は、このように、１つ又は複数の突然変異、例えば：
（ａ）「ミスセンス突然変異」（アミノ酸の別のアミノ酸での置換をもたらす核酸配列における変化）；
（ｂ）「ナンセンス突然変異」又は「終止コドン突然変異」は、成熟前の終止コドンの導入、そしてそのため、翻訳の終結をもたらす（切断タンパク質をもたらす）核酸配列における変化である；植物遺伝子は翻訳終止コドン「ＴＧＡ」（ＲＮＡ中のＵＧＡ）、「ＴＡＡ」（ＲＮＡ中のＵＡＡ）、及び「ＴＡＧ」（ＲＮＡ中のＵＡＧ）を含む；このように、翻訳される（リーディングフレーム中の）成熟ｍＲＮＡ中にあるはずのこれらのコドンの１つをもたらす任意のヌクレオチドの置換、挿入、欠失は、翻訳を終結させる；
（ｃ）１つ又は複数のアミノ酸の「挿入突然変異」（核酸のコード配列において加えられた１つ又は複数のコドンによる）；
（ｄ）１つ又は複数のアミノ酸の「欠失突然変異」（核酸のコード配列において欠失させられた１つ又は複数のコドンによる）；
（ｅ）「フレームシフト突然変異」（突然変異の下流で異なるフレームにおいて翻訳される核酸配列をもたらす）
を含みうる。フレームシフト突然変異は、種々の原因、例えば、１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失、又は重複などを有しうる。
既に言及した通り、核酸配列における突然変異は、好ましくは、インビボで有意に低下した生物学的活性又は無生物学的活性を含む突然変異タンパク質、又は、無タンパク質の産生をもたらす。基本的に、野生型タンパク質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含むタンパク質をもたらす任意の突然変異は、有意に低下した生物学的活性又は無生物学的活性を導きうる。しかし、タンパク質の特定の部分における突然変異は、突然変異ＩＮＤタンパク質の低下した機能をもたらす可能性がより高い（例えば、切断タンパク質を導く突然変異などで、それにより機能的ドメインの有意な部分、例えばＤＮＡ結合ドメイン（「ｂ」）、二量体化ドメイン（「ＨＬＨ」）、及び／又は転写調節ドメインなどを欠く）ことが理解される。
Arabidopsis Information Resource（TAIR）データベース（http://www.arabidopsis.org/）に従い、アラビドプシスＩＮＤＥＨＩＳＣＥＮＴタンパク質（ｌｏｃｕｓ Ａｔ４ｇ００１２０．１；配列番号１０）は１９８アミノ酸長であり、アミノ酸位置１２１と１６８の間（ｐｆａｍドメインＰＦ０００１０）、アミノ酸位置１２４と１７３の間（ｓｍａｒｔドメインＳＭ００３５３）、又はアミノ酸位置１１２と１６８の間（ｐｒｏｓｉｔｅドメインＰＳ５０８８８）に位置する「ベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）二量体化」ドメイン及び配列番号１０のアミノ酸位置１１４と１９６又は１９８の間（それぞれｓｕｐｅｒｆａｍドメインＧ３Ｄ．４．１０．２８０．１０又はＳＳＦ４７４５９）の「ヘリックス・ループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）ＤＮＡ結合」ドメインを含む。
本明細書において記載するブラシカのＩＮＤ−Ａ１タンパク質は、約１８５アミノ酸長（配列番号２）であり、ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質は約１９５（配列番号４、アミノ酸位置１６〜２１０）又は２１０（配列番号４）アミノ酸であり、それらは配列番号２におけるアミノ酸位置１２０と１６７の間及び配列番号４における位置１３３と１８０の間（ｐｆａｍドメインＰＦ０００１０）、配列番号２におけるアミノ酸位置１２３と１７２の間及び配列番号４における位置１３６と１８５の間（ｓｍａｒｔドメインＳＭ００３５３）、又は配列番号２におけるアミノ酸位置１１１と１６７の間及び配列番号４における位置１２４と１８０の間（ｐｒｏｓｉｔｅドメインＰＳ５０８８８）に位置する「ベーシックｂＨＬＨ二量体化」ドメイン、ならびに配列番号４におけるアミノ酸位置１２７と２０８又は２１０の間（それぞれｓｕｐｅｒｆａｍドメインＧ３Ｄ．４．１０．２８０．１０又はＳＳＦ４７４５９）の「ＨＬＨ ＤＮＡ結合」ドメイン（ブラシカ及びアラビドプシスＩＮＤタンパク質を最適に整列化させ、ＴＡＩＲデータベースにおける注釈情報に基づき決定される）を含む。
Heim et al.（2003, Mol Biol Evol 20, 735-747）により記載される通り、１３３のアラビドプシスｂＨＬＨ転写因子遺伝子のコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列は、約５６のアミノ酸からなる（Heim et al.、図１；配列番号１０における位置１１９〜１７４に対応する）。この二分ドメインは、（１）塩基性領域（ドメインのＮ末端に位置して、ＤＮＡ結合に関与し、約１３のアミノ酸からなり、多くの塩基性残基を伴う（「ｂ」；配列番号１０における位置１１９〜１３１に対応する））、及び（２）ヘリックス・ループ・ヘリックス領域、Ｃ末端に位置して、二量体化ドメインとして機能し、約４３の主に疎水性アミノ酸残基（配列番号１０における位置１３２〜１７４に対応する）で構成され、それぞれ約１５のアミノ酸（「Ｈ１」；配列番号１０における位置１３２〜１４６に対応する）及び２２のアミノ酸（「Ｈ２」；配列番号１０における位置１５３〜１７４に対応する）の２つの両親媒性アルファ‐ヘリックスをそれぞれ形成し、約６及び約１４までのアミノ酸（「Ｌ」；配列番号１０における位置１４７〜１５２に対応する）のループ領域により分離され、それはサイズ及びアミノ酸組成の観点からｂＨＬＨドメインの最も分岐した領域である。２つのアルファ‐ヘリックスは二量体化を促進させ、異なるファミリーメンバーの間でホモ二量体及び／又はヘテロ二量体の形成を可能にする（Toledo-Ortiz et al., 2003, Plant Cell 15: 1749-1770）。ｂＨＬＨドメインは進化的に保存されており（Atchley and Fitch, 1997, PNAS 94: 5172-5176）、異なるｂＨＬＨファミリーメンバーの間で、このドメインを越えてほとんど配列類似性は存在しない（Morgenstern and Atchley, 1999, Mol Biol Evol 16: 1654-1663）。
ＤＮＡに結合する証明された能力を伴うそれらのｂＨＬＨタンパク質内で、Heim et al.（上記）により定義されたコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列のアミノ酸位置５、９、及び１３が最も決定的である。非植物ｂＨＬＨタンパク質について、位置５のＨｉｓ（Ｈ）残基、位置９のＧｌｕ（Ｅ）残基、及び位置１３のＡｒｇ（Ｒ）残基（全てが塩基性領域内）が、ＤＮＡ結合のために決定的であることが示された（Brownlie et al., 1997, Structure 5, 509-520；Atchley et al., 1999, J Mol Evol 48, 501-516；Ledent and Vervoort, 2001, Genome Res 11, 754-770）。しかし、一部の植物タンパク質は、Ｈ−Ｅ−Ｒ配置の変動を有する。例えば、Heim et al.（上記）に従い、アラビドプシス遺伝子Ａｔ４ｇ００１２０（配列番号９において表わすアラビドプシスＩＮＤ遺伝子に対応する）によりコードされるｂＨＬＨドメインの５−９−１３モチーフは、アミノ酸残基Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｌａ（Ａ）、及びＡｒｇ（Ｒ）（それぞれ配列番号１０における位置１２３、１２７、及び１３１に対応する）からそれぞれなる（Heim et al.（上記）の図４）。そのような植物タンパク質は、Ｈ−Ｅ−Ｒ配置の変動を有し、塩基性領域（例、グループＶＩＩＩ及びＸのメンバー）においてヘリックス破壊プロリンをさらに含みうるが、ＤＮＡへの親和性と干渉しうる特徴である。これらの変動によって、これらのタンパク質がネガティブな調節因子として作用することが可能となり、他のｂＨＬＨタンパク質と二量体化する能力は保持するが、ＤＮＡに結合する能力は欠きうる。５−９−１３モチーフがＤＮＡ結合のために重要であるが、ＤＮＡ骨格は位置１０及び１２（両方ともコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列におけるＡｒｇ（Ｒ））の塩基性残基により接触され、それらはまた大半の植物タンパク質において保存されている（配列番号１０における位置１２８及び１３０に対応する）。
さらに、Heim et al.（上記）は、ヘリックス１における位置１６、２０、２３、２７（配列番号１０における位置１３４、１３８、１４１、１４５に対応する）及びヘリックス２における位置３６、３９、４３、４９、５３、及び５６（配列番号１０における位置１５４、１５７、１６１、１６７、１７１、１７４に対応する）の高度に保存された疎水性残基、例えば、ヘリックス１ドメイン内の位置２３（配列番号１０における位置１４１に対応する）のロイシン残基及びヘリックス２における保存された疎水性残基が、ヘリックスの片側に位置して、二量体化又は二量体形成の安定化のために必要であることを記載する。
最後に、Heim et al.（上記；図４）は、ＤＮＡ結合ドメインの外側の保存されたアミノ酸配列が、その一部が活性化ドメインとして作用する、又は、転写複合体の他のモジュールとの相互作用のために重要である、又は、シグナル伝達鎖の標的となると考えられることを示す。
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同様に、Toledo-Ortiz et al.（2003, Plant Cell 15: 1749-1770；図１）により記載される通り、アラビドプシスｂＨＬＨ転写因子ファミリーのｂＨＬＨドメインは、約５６のアミノ酸からなる（Toledo-Ortiz et al.；配列番号１０における位置１１５〜１６７に対応する）。この二分ドメインは、（１）塩基性領域（ドメインのＮ末端に位置して、ＤＮＡ結合に関与し、約１７のアミノ酸からなり、多くの塩基性残基を伴う（「ｂ」；配列番号１０における位置１１５〜１３１に対応する））、及び（２）ＨＬＨ領域、Ｃ末端に位置して、二量体化ドメインとして機能し、約３９の主に疎水性アミノ酸残基（配列番号１０における位置１３２〜１６７に対応する）で構成され、それぞれ約１５のアミノ酸（「Ｈ１」；配列番号１０における位置１３２〜１４６に対応する、及び、「Ｈ２」；配列番号１０における位置１５２〜１６７に対応する）の２つの両親媒性アルファ‐ヘリックスを形成し、約９のアミノ酸（「Ｌ」；配列番号１０における位置１４７〜１５１に対応する）のループ領域により分離され、それはサイズ及びアミノ酸組成の観点からｂＨＬＨドメインの最も分岐した領域である。
配列保存のパターンに基づき、ｂＨＬＨ領域において最も保存されたアミノ酸を表わす仮説上のコンセンサスモチーフ（ｂＨＬＨドメインにわたり分散した１９のアミノ酸を含む（ｂからの１８、Ｈ１及びＨ２；Ｌからの１））が、Atchley et al.（1999）により生成された。同定された保存アミノ酸は、Toledo-Ortiz et al.（２００３、上記）により定義されるアラビドプシスｂＨＬＨドメインのアミノ酸位置１、２、１３、１４、１６（ｂにおける）；２０、２１、２４、２７、２８（Ｈ１における）；３９（Ｌにおける）；４２、４５、４６、４９、５０、５２、５３、及び５６（Ｈ２における）に対応し、それらは配列番号１０のアミノ酸位置１１５、１１６、１２７、１２８、１３０（ｂにおける）；１３４、１３５、１３８、１４１、１４２（Ｈ１における）；１５０（Ｌにおける）；１５３、１５６、１５７、１６０、１６１、１６３、１６４、及び１６７（Ｈ２における）に対応する。
Liljegren et al.（2004, Cell, 116, 843-853）によると、アラビドプシスＩＮＤ遺伝子のｂＨＬＨドメインは、１３のアミノ酸の塩基性領域（配列番号１０、アミノ酸位置１１９〜１３１）及び１４及び１５のアミノ酸の２つのアルファ‐ヘリックス（配列番号１０、それぞれアミノ酸位置１３２〜１４５から及びアミノ酸位置１５３〜１６７）からそれぞれなり、７つのアミノ酸の可変ループ領域により分離されている（配列番号１０、アミノ酸位置１４６〜１５２）。
アラビドプシスＩＮＤ核酸（配列番号９）及びアミノ酸（配列番号１０）配列（ＩＮＤ核酸配列を伴う）、特に本発明のブラシカＩＮＤ核酸（配列番号１及び３）及びアミノ酸（配列番号２及び４）配列の最適アラインメントによって、これらのブラシカ配列における対応する保存されたドメイン及びアミノ酸の位置を決定することが可能になる（配列番号１〜４のブラシカＩＮＤ配列については表１を参照のこと）。
このように、一実施態様において、上に記載する突然変異の型のいずれかの１つ又は複数を含む核酸配列を提供する。別の実施態様において、１つ又は複数の終止コドン（ナンセンス）突然変異、１つ又は複数のミスセンス突然変異、及び／又は１つ又は複数のフレームシフト突然変異を含むｉｎｄ配列を提供する。上の突然変異核酸配列のいずれかをそれ自体で（単離形態で）提供し、そのような配列を内因的に含む植物及び植物部分と同様である。本明細書中の以下の表において、最も好ましいｉｎｄ対立遺伝子が記載され、１つ又は複数のｉｎｄ対立遺伝子を含むブラシカ・ナパス種子の種子沈着物が示される通りに沈着している。
ＩＮＤ対立遺伝子におけるナンセンス突然変異は、本明細書において使用する通り、ＩＮＤ対立遺伝子における突然変異であり、それにより１つ又は複数の翻訳終止コドンが対応する野生型ＩＮＤ対立遺伝子のコードＤＮＡ及び対応するｍＲＮＡ配列中に導入される。翻訳終止コドンは、ＴＧＡ（ｍＲＮＡ中のＵＧＡ）、ＴＡＡ（ＵＡＡ）、及びＴＡＧ（ＵＡＧ）である。このように、コード配列においてインフレームの終止コドンの生成を導く任意の突然変異（欠失、挿入、又は置換）は、翻訳の終結及びアミノ酸鎖の切断をもたらしうる。一実施態様において、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、インフレーム終止コドンが、ＩＮＤコドン配列中に、単一ヌクレオチド置換、例えばＣＡＧからＴＡＧ、ＴＧＧからＴＡＧ、ＴＧＧからＴＧＡ、又はＣＡＡからＴＡＡの突然変異などにより導入されるＩＮＤ対立遺伝子である。別の実施態様において、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、インフレーム終止コドンが、ＩＮＤコドン配列中に、二重ヌクレオチド置換、例えばＣＡＧからＴＡＡ、ＴＧＧからＴＡＡ、又はＣＧＧからＴＡＧもしくはＴＧＡの突然変異などにより導入されるＩＮＤ対立遺伝子である。さらに別の実施態様において、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、インフレーム終止コドンが、ＩＮＤコドン配列中に、三重ヌクレオチド置換、例えばＣＧＧからＴＡＡの突然変異などにより導入されるＩＮＤ対立遺伝子である。切断タンパク質は、突然変異の下流のコードＤＮＡによりコードされるアミノ酸（即ち、ＩＮＤタンパク質のＣ末端部分）を欠き、突然変異の上流のコードＤＮＡによりコードされるアミノ酸（即ち、ＩＮＤタンパク質のＮ末端部分）を保持する。一実施態様において、ナンセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、ナンセンス突然変異がＨ２ドメインの保存されたＬｅｕ残基の前のどこか（Heim et al., 2003により記載されるコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列における位置（上を参照のこと））に存在し、少なくとも保存されたＬｅｕ残基を欠く、ＩＮＤ対立遺伝子である。突然変異ＩＮＤタンパク質が、野生型ＩＮＤタンパク質と比較してより多く切断されるほど、切断によってＩＮＤタンパク質の有意に低下した活性又は無活性がより多くもたらされうる。このように、別の実施態様において、約１７０未満のアミノ酸（保存されたＬｅｕを欠く）、約１５０未満のアミノ酸（Ｈ２ドメインを欠く）、約１４５未満のアミノ酸（Ｌ及びＨ２ドメインを欠く）、約１３０未満のアミノ酸（ＨＬＨドメインを欠く）、約１１５未満のアミノ酸（ｂＨＬＨドメインを欠く）、又はさらに長さのより少ないアミノ酸の切断タンパク質をもたらすナンセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子、例えばアラビドプシスｉｎｄ−４又はｉｎｄ−５（Liljegren et al., 2004、上記）対立遺伝子に対応する突然変異ＩＮＤ対立遺伝子などを提供する（表１を参照のこと）。
本明細書における以下の表は、本明細書において提供するブラシカ・ナパスＩＮＤ配列における一連の起こりうるナンセンス突然変異を記載する：
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（１）このナンセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ−Ａ１対立遺伝子を含む種子（以下、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０１と呼ぶ）は、American Type Culture Collection（ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, US）に、２００７年１１月２０日に受入番号ＰＴＡ−８７９６の下で寄託されている。
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（２）このナンセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ−Ｃ１対立遺伝子を含む種子（以下、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０１と呼ぶ）は、ＡＴＣＣに２００７年１１月２０日に受入番号ＰＴＡ−８７９６の下で寄託されている。
（３）このナンセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ−Ｃ１対立遺伝子を含む種子（以下、ｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０３と呼ぶ）は、ＡＴＣＣに２００７年１１月２０日に受入番号ＰＴＡ−８７９５の下で寄託されている。
明らかに、突然変異は上の表において示すものに限定されず、配列一覧表において描写し、上の表において言及するもの以外の類似の終止突然変異がｉｎｄ対立遺伝子において存在することが理解される。
ＩＮＤ対立遺伝子におけるミスセンス突然変異は、本明細書において使用する通り、ＩＮＤ対立遺伝子における任意の突然変異（欠失、挿入、又は置換）であり、それにより１つ又は複数のコドンが、対応する野生型ＩＮＤ対立遺伝子のコードＤＮＡ及び対応するｍＲＮＡ配列に変化して、野生型ＩＮＤタンパク質中の１つ又は複数のアミノ酸での突然変異ＩＮＤタンパク質中の１つ又は複数のアミノ酸の置換をもたらす。一実施態様において、ミスセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、上に示した又は表１における保存されたアミノ酸の１つ又は複数が置換されたＩＮＤ対立遺伝子である。上に示す通り、保存されたアミノ酸の一部は、他よりも、ＩＮＤタンパク質の生物学的活性のためにより決定的である。このように、例えば、Heim et al.（上記）により定義されるコンセンサスｂＨＬＨドメインのアミノ酸位置５、９、及び１３又は位置１０及び１２の置換をもたらすミスセンス突然変異は、ＩＮＤタンパク質の、標的ＤＮＡへ結合する能力の低下のため、有意に低下した活性又は無活性をもたらす可能性がより高い。同様に、例えば、Heim et al．（上記）により定義されるコンセンサスｂＨＬＨドメインのヘリックス１におけるアミノ酸位置１６、２０、２３、２７又はヘリックス２における位置３６、３９、４３、４９、５３、及び５６の置換をもたらすミスセンス突然変異は、ＩＮＤタンパク質の二量体化能力の低下のため、有意に低下した活性又は無活性をもたらす可能性がより高い。Heim et al．（上記）により定義されるコンセンサスｂＨＬＨドメインの位置１０のＡｒｇ残基でのＨｉｓ残基の置換を起こすミスセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ−Ａ１対立遺伝子を含む種子（以下、ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０５と呼ばれる）が、ＡＴＣＣに２００７年１１月２０日に受入番号ＰＴＡ−８７９５の下で寄託されている。別の実施態様において、ミスセンス突然変異を含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、アラビドプシスｉｎｄ−１又はｉｎｄ−３（Liljegren et al., 2004、上記）対立遺伝子におけるミスセンス突然変異に対応するミスセンス突然変異を含むＩＮＤ対立遺伝子である（表１を参照のこと）。
ＩＮＤ対立遺伝子におけるフレームシフト突然変異は、本明細書において使用する通り、突然変異の下流で異なるフレームにおいて翻訳される核酸配列をもたらすＩＮＤ対立遺伝子における突然変異（欠失、挿入、重複など）である。一実施態様において、フレームシフト突然変異を含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、アラビドプシスｉｎｄ−２（Liljegren et al., 2004、上記）対立遺伝子におけるフレームシフト突然変異に対応するフレームシフト突然変異を含むＩＮＤ対立遺伝子であり、それにおいて、単一ヌクレオチドがコドン２６内で欠失しており、フレームシフト及び３５のアミノ酸の切断タンパク質の産生をもたらす（Liljegren et al., 2004による、上記）。別の実施態様において、フレームシフト突然変異を含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、アラビドプシスｉｎｄ−６（Wu et al., 2006、上記）対立遺伝子におけるフレームシフト突然変異に対応するフレームシフト突然変異を含むＩＮＤ対立遺伝子であり、それにおいて、Ｄｓトランスポゾンがヌクレオチド１８３の後に挿入され、挿入部位で８ヌクレオチドの重複を起こす（又は、対応するリバータントアラビドプシスｉｎｄ対立遺伝子）（Wu et al., 2006、上記、図１ａを参照のこと）。
本発明のアミノ酸配列
ブラシカ科、特にブラシカ種、特にブラシカ・ナパス、しかし、また他のブラシカ作物種からの野生型（機能的）ＩＮＤアミノ酸配列及び突然変異ＩＮＤアミノ酸配列（１つ又は複数の突然変異、好ましくはＩＮＤタンパク質の有意に低下した生物学的活性又は無生物学的活性をもたらす突然変異を含む）の両方を提供する。例えば、Ａ及び／又はＣゲノムを含むブラシカ種は、異なるＩＮＤ−Ａアミノ酸又はＩＮＤ−Ｃアミノ酸をコードしうる。また、突然変異生成方法を使用して、野生型ＩＮＤ対立遺伝子において突然変異を生成することができ、それにより、さらなる突然変異ＩＮＤタンパク質をコードすることができる突然変異対立遺伝子を生成する。一実施態様において、野生型及び／又は突然変異ＩＮＤアミノ酸配列を、ブラシカ植物内で（即ち、内因的に）提供する。しかし、単離されたＩＮＤアミノ酸配列（植物から単離された又は合成的に作られた）、ならびにその変異対及びこれらのいずれかのフラグメントも本明細書において提供する。
ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列一覧表において描写されるブラシカ・ナパスから単離されている。野生型ＩＮＤ配列を描写し、これらの配列の、及びこれらと本質的に類似の配列の突然変異ＩＮＤ配列を、本明細書において以下に、野生型ＩＮＤ配列を参照して記載する。
上に記載の通り、本明細書において記載するブラシカのＩＮＤタンパク質は、約１８５〜２１０のアミノ酸長であり、多くの構造的ドメイン及び機能的ドメインを含む。
本発明の「ＩＮＤ−Ａ１アミノ酸配列」又は「ＩＮＤ−Ａ１変異体アミノ酸配列」は、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９８%、９９%、又は１００%の配列番号２との配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、配列一覧表において提供するＩＮＤ配列と「本質的に類似する」又は「本質的に同一である」と呼んでもよい。
本発明の「ＩＮＤ−Ｃ１アミノ酸配列」又は「ＩＮＤ−Ｃ１変異体アミノ酸配列」は、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%、少なくとも９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列番号４（ＩＮＤ−Ｃ１−長（ｌｏｎｇ））との又はアミノ酸位置１６からアミノ酸位置２１０までの配列番号４との配列同一性を有するアミノ酸配列である。これらのアミノ酸配列は、配列一覧表において提供するＩＮＤ配列と「本質的に類似する」又は「本質的に同一である」と呼んでもよい。
このように、本発明は、野生型の機能的ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１タンパク質（その変異体及びフラグメント（以下でさらに定義する）を含む）のアミノ酸配列、ならびにこれらのいずれかの突然変異アミノ酸配列の両方を提供し、それにより、アミノ酸配列中の突然変異は、好ましくは、対応する野生型ＩＮＤタンパク質の生物学的活性と比較し、ＩＮＤタンパク質の生物学的活性の有意な低下又は完全な消失をもたらす。ＩＮＤタンパク質の生物学的活性の有意な低下又は完全な消失は、本明細書において、ＩＮＤタンパク質のＤＮＡ結合活性、二量体化能力、及び／又は転写調節活性の低下又は消失を指し、突然変異ＩＮＤタンパク質を発現する植物の鞘脱粒耐性が、対応する野生型ＩＮＤタンパク質を発現する植物と比較し、対応する野生型植物の鞘脱粒耐性と比較して増加する。
内因性の核酸配列及び単離された核酸配列の両方を本明細書において提供する。また、上で定義するＩＮＤアミノ酸配列及びＩＮＤ変異体アミノ酸配列のフラグメントを提供する。ＩＮＤアミノ酸配列又はその変異体（定義する通り）の「フラグメント」は、種々の長さ、例えば、ＩＮＤ配列の（又は変異体配列の）少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、５０、１００、１５０、１７５、１８０の連続アミノ酸などでよい。
機能的ＩＮＤタンパク質のアミノ酸配列
配列一覧表において描写するアミノ酸配列は、ブラシカ・ナパスからの野生型の機能的ＩＮＤタンパク質である。このように、これらの配列は、それらが単離されたブラシカ・ナパス植物に対して内因性である。他のブラシカ作物の種、品種、育種系統、又は野生受入を、同じアミノ酸配列又はその変異体を伴う他のＩＮＤタンパク質についてスクリーニングしてよい（上に記載の通り）。
また、ＩＮＤアミノ酸配列及びその変異体（又はこれらのいずれかのフラグメント）はコンピュータ内で、本質的に類似の配列についてアミノ酸データベースをスクリーニングすることにより同定してよいことが理解される。本発明のアミノ酸分子のフラグメントも提供する。フラグメントは、ｂＨＬＨドメインのアミノ酸配列、又はｂＨＬＨドメインの部分、例えば塩基性ドメインもしくはＨＬＨドメインなどを含むより小さなフラグメントを含む。
突然変異ＩＮＤタンパク質のアミノ酸配列
野生型アミノ酸配列と比べ、１つ又は複数のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換を含むアミノ酸配列は、本発明の別の実施態様であり、そのような突然変異アミノ酸分子のフラグメントと同様である。そのような突然変異アミノ酸配列は、上で記載される種々の公知の方法を使用して生成及び／又は同定することができる。この場合でも、そのようなアミノ酸分子は、内因性形態及び単離形態の両方で提供される。
一実施態様において、アミノ酸配列における突然変異は、野生型タンパク質と比べて、ＩＮＤタンパク質の有意に低下した、又は、完全に消失した生物学的活性をもたらす。上に記載した通り、基本的に、野生型タンパク質と比べて、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は置換を含むタンパク質をもたらす任意の突然変異は、有意に低下した生物学的活性又は無生物学的活性を導きうる。しかし、タンパク質の特定の部分における突然変異は、突然変異ＩＮＤタンパク質の低下した機能をもたらす可能性がより高い（例えば、切断タンパク質を導く突然変異などで、それにより機能的ドメインの有意な部分、例えばＤＮＡ結合ドメイン（「ｂ」）、二量体化ドメイン（「ＨＬＨ」）、及び／又は転写の調節において重要であるアミノ酸（表１を参照のこと）などを欠く、又は、置換されている）ことが理解される。
このように、一実施態様において、１つ又は複数の欠失又は挿入突然変異を含む突然変異ＩＮＤタンパク質を提供し、それにより欠失又は挿入は有意に低下した活性又は無活性をインビボで有する突然変異タンパク質をもたらす。そのような突然変異ＩＮＤタンパク質は、少なくとも１、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００、１００、１５０、１７５、１８０又はそれ以上のアミノ酸が、野生型ＩＮＤタンパク質と比較して欠失又は挿入されたＩＮＤタンパク質であり、それにより欠失又は挿入は有意に低下した活性又は無活性をインビボで有する突然変異タンパク質をもたらす。
別の実施態様において、切断された突然変異ＩＮＤタンパク質を提供し、それにより切断は有意に低下した活性又は無活性をインビボで有する突然変異タンパク質をもたらす。そのような切断されたＩＮＤタンパク質は、対応する野生型ＩＮＤタンパク質のＣ末端部分において機能的ドメインを欠き、対応する野生型ＩＮＤタンパク質のＮ末端部分を保持するＩＮＤタンパク質である。このように、一実施態様において、対応する野生型ＩＮＤタンパク質のＮ末端部分、Ｈ２ドメインの保存されたＬｅｕ残基まで（しかし、それを含まない）（Heim et al., 2003により記載されるコンセンサスｂＨＬＨドメイン配列中の位置５６、上を参照のこと）を含む切断されたＩＮＤタンパク質を提供する。突然変異ＩＮＤタンパク質が、野生型ＩＮＤタンパク質と比較してより多く切断されるほど、切断によってＩＮＤタンパク質の有意に低下した活性又は無活性がより多くもたらされうる。このように、一実施態様において、対応する野生型ＩＮＤタンパク質のＮ末端部分（第２のＨドメインの部分又は全てを欠き、及び／又はＬドメインの部分又は全てを欠き、及び／又は第１のＨドメインの部分又は全てを欠き、塩基性ドメイン（上に記載する）の部分又は全てを欠く）、又はさらに多くのアミノ酸を含む切断ＩＮＤタンパク質を提供する（上の表を参照のこと）。
さらに別の実施態様において、１つ又は複数の置換突然変異を含み、それにより置換が有意に低下した活性又は無活性をインビボで有する突然変異タンパク質をもたらす突然変異ＩＮＤタンパク質を提供する。そのような突然変異ＩＮＤタンパク質は、特定の機能、例えばＤＮＡ結合、二量体化、又は転写調節における機能などを有する保存されたアミノ酸残基が置換されたＩＮＤタンパク質である。このように、一実施態様において、生物学的機能を有する保存されたアミノ酸残基、例えば上の表１に示す塩基性ドメイン、又はＨ１、Ｌ、もしくはＨ２ドメインの保存されたアミノ酸などの置換を含む突然変異ＩＮＤタンパク質を提供する。
本発明の方法
突然変異ｉｎｄ対立遺伝子は、一連の方法（当技術分野において従来法である）を使用して、例えば、ｉｎｄゲノム又はｃＤＮＡの部分又は全てを増幅するためのＰＣＲベースの方法を使用して生成（例えば、突然変異生成により誘発する）及び／又は同定してよい。
突然変異生成に続き、植物を処理された種子から生育させ、又は、公知の技術を使用して処置された細胞から再生される。例えば、突然変異誘発された種子を、従来の生育手順に従って植えることができ、そして続く自家受粉種子が植物に形成される。あるいは、例えばCoventry et al.（1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada）により記載される通りに、倍加半数体小植物が処理された小胞子又は花粉細胞から抽出されて、迅速にホモ接合性植物を形成しうる。この世代又はその後の世代におけるそのような自家受粉の結果として形成される追加の種子を収穫して、当技術分野において従来法である技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの技術（ｉｎｄ対立遺伝子の増幅）又はハイブリダイゼーションベースの技術（例、サザンブロット解析、ＢＡＣライブラリースクリーニングなど）及び／又はｉｎｄ対立遺伝子の直接配列決定を使用して、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在についてスクリーニングしてよい。突然変異ＩＮＤ対立遺伝子における点突然変異（いわゆる一塩基多型又はＳＮＰ）の存在についてスクリーニングするために、当技術分野において従来法であるＳＮＰ検出方法を使用することができる（例えばオリゴライゲーション（ｏｌｉｇｏｌｉｇａｔｉｏｎ）ベースの技術、単一塩基伸長ベースの技術、又は制限酵素部位における差異に基づく技術（例えばＴＩＬＬＩＮＧなど））。
上に記載の通り、特定の野生型ＩＮＤ対立遺伝子の突然変異誘発（自発的ならびに誘発的）は、結果として得られる突然変異ＩＮＤ対立遺伝子において１つ又は複数の欠失、挿入、又は置換されたヌクレオチド（以下、「突然変異領域」と呼ぶ）の存在をもたらす。突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、このように、野生型ＩＮＤ対立遺伝子における１つ又は複数の欠失、挿入、又は置換されたヌクレオチドの位置及び配置により特徴付けることができる。１つ又は複数のヌクレオチドがそれぞれ挿入、欠失、又は置換された野生型ＩＮＤ対立遺伝子における部位を、本明細書において、「突然変異領域又は配列」とも呼ぶ。本明細書において使用する「５’又は３’隣接領域又は配列」は、突然変異（又は対応する野生型）ＩＮＤ対立遺伝子におけるＤＮＡ領域又は配列であり、少なくとも２０bp、好ましくは少なくとも５０bp、少なくとも７５０bp、少なくとも１５００bp、及び５０００bpまでのＤＮＡであり、１つ又は複数の欠失、挿入、又は置換されたヌクレオチドを含むＤＮＡ、好ましくは突然変異ＩＮＤ対立遺伝子における（又は対応する野生型ＩＮＤ対立遺伝子における）突然変異領域の直ぐ上流及び近接して（５’隣接領域又は配列）又は直ぐ下流及び近接して（３’隣接領域又は配列）位置する突然変異（又は対応する野生型）ＩＮＤ対立遺伝子からのＤＮＡとは異なる。本明細書において使用する「連結領域」は、突然変異（又は対応する野生型）ＩＮＤ対立遺伝子におけるＤＮＡ領域を指し、ここで突然変異領域及び５’又は３’隣接領域が互いに連結される。「突然変異領域と５’又は３’隣接領域の間の連結領域に及ぶ配列」は、このように、突然変異配列ならびにそれと近接する隣接配列を含む。
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子又は特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む植物もしくは植物材料、又は特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む植物材料を含む産物を同定するために開発されたツールは、対応する野生型ＩＮＤ対立遺伝子のゲノム特徴と比較した、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の特定のゲノム特徴、例えば、突然変異領域を含むゲノム領域の特定の制限酵素地図、分子マーカー、又は隣接領域及び／又は突然変異領域の配列などに基づく。
ひとたび特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子が配列決定されれば、プライマー及びプローブを開発でき、それらは分子生物学的技術としてサンプルの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）における突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の５’隣接、３’隣接、及び／又は突然変異領域内の配列を特異的に認識する。例えば、ＰＣＲ方法を開発して、生物学的サンプル（植物、植物材料、又は植物材料を含む産物など）において突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を同定することができる、そのようなＰＣＲは少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づく：１つは突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域内の配列を認識し、他は突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の３’又は５’隣接領域内の配列をそれぞれ認識する；あるいは１つは突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域内の配列を認識し、他は突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の突然変異領域内の配列を認識する；あるいは１つは突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域内の配列を認識し、他は特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の３’又は５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列（以下でさらに記載する）をそれぞれ認識する。
プライマーは、好ましくは、最適化されたＰＣＲ条件下で、５’又は３’隣接領域内の配列、突然変異領域内の配列、又は特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の３’又は５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列を「特異的に認識する」１５〜３５の間のヌクレオチドの配列を有し、特定のフラグメント（「突然変異ＩＮＤ特異的フラグメント」又は識別アンプリコン）が特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む核酸サンプルから増幅される。これは、標的とされる突然変異ＩＮＤ対立遺伝子だけが最適化されたＰＣＲ条件下で増幅される（植物ゲノム中の他の配列はされない）ことを意味する。
本発明のために適したＰＣＲプライマーは以下：
− 長さ１７ｎｔ〜約２００ｎｔに及び、少なくとも１７の連続ヌクレオチド、好ましくは２０の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子又はその相補体の５’又は３’隣接配列から選択されるオリゴヌクレオチド（即ち、例えば、本発明の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子において欠失、挿入、又は置換された１つ又は複数のヌクレオチドの５’又は３’に隣接する配列、例えば上に記載するナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の５’又は３’に隣接する配列、あるいは上の表において示す終止コドン突然変異又は上に示す置換突然変異の５’又は３’に隣接する配列、あるいはその相補体など）（５’隣接配列を認識するプライマー）；又は
− 長さ１７ｎｔ〜約２００ｎｔに及び、少なくとも１７の連続ヌクレオチド、好ましくは２０のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子又はその相補体の突然変異領域の配列から選択されるオリゴヌクレオチド（即ち、例えば、本発明のＩＮＤ遺伝子において挿入又は置換されたヌクレオチドの配列あるいはその相補体など）（突然変異配列を認識するプライマー）
でありうる。
プライマーは、無論、言及した１７の連続ヌクレオチドより長くなりうる（例えば、１８、１９、２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ｎｔ又はさらに長くなりうる）。プライマーは、全体的に、隣接配列及び突然変異配列の言及したヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列からなりうる。しかし、プライマーのそれらの５’末端の（即ち、３’に位置する１７の連続ヌクレオチドの外側の）ヌクレオチド配列はそれほど決定的ではない。このように、プライマーの５’配列は、適宜、隣接配列又は突然変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなりうるが、しかし、いくつかの（例、１、２、５、１０）ミスマッチを含みうる。プライマーの５’配列は、さらに全体的に、隣接配列又は突然変異配列と無関係のヌクレオチド配列、例えば制限酵素認識部位を表わすヌクレオチド配列などからなりうる。ミスマッチを伴うそのような無関係の配列又は隣接ＤＮＡ配列は、好ましくは、１００より長くならず、より好ましくは５０又はさらに２５ヌクレオチドより長くならない。
さらに、適したプライマーは、隣接配列と突然変異配列の間の連結領域（即ち、例えば、本発明の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子において欠失、挿入、又は置換された１つ又は複数のヌクレオチドの５’又は３’に隣接する配列と挿入又は置換された１つ又は複数のヌクレオチドの配列あるいは欠失された１つ又は複数のヌクレオチドの３’又は５’にそれぞれ隣接する配列の連結領域、例えば上に記載する本発明のＩＮＤ遺伝子におけるナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の５’又は３’に隣接する配列と、ナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の間の連結領域、あるいは上の表において示す潜在的な終止コドン突然変異又は上に示す置換突然変異の５’又は３’に隣接する配列と、潜在的な終止コドン突然変異又は置換突然変異の配列の間のそれぞれ連結領域）に及ぶヌクレオチド配列を含みうる、又は、それからなりうる（ただしヌクレオチド配列が突然変異領域又は隣接領域のいずれかにもっぱら由来しないことを条件とする）。
適切に選択されたＰＣＲプライマー対が、また、互いに相補的な配列を含んではならないことも当業者に直ぐに明らかである。
本発明の目的のために、「配列番号Ｘにおいて表わされるヌクレオチド配列の相補体」は、それらの相補ヌクレオチドを通じてシャルガフ則（Ａ→Ｔ；Ｇ→Ｃ）に従ってヌクレオチドを交換すること、及び、５’から３’の方向において（即ち、表わしたヌクレオチド配列の逆方向において）配列を読むことにより表わしたヌクレオチド配列から由来されるヌクレオチド配列である。
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を同定するために適したプライマーの例を、実施例において記載する。
本明細書において使用する「配列番号Ｚの位置Ｘから位置Ｙまでのヌクレオチド配列」は、両方のヌクレオチドのエンドポイントを含むヌクレオチド配列を示す。
好ましくは、増幅されたフラグメントは、５０と１０００の間のヌクレオチドの長さ、例えば５０と５００の間のヌクレオチドの長さ、又は１００と３５０の間のヌクレオチドの長さなどを有する。特異的プライマーは、５’又は３’隣接領域内の配列、突然変異領域内の配列、又は特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の３’又は５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列と８０と１００%の間で同一である配列を有しうる（ただしミスマッチによって、依然として、これらのプライマーを用いた特異的突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の特異的な同定が最適化されたＰＣＲ条件下で可能になることを条件とする）。許容可能なミスマッチの範囲は、しかし、実験的に容易に決定することができ、当業者に公知である。
「突然変異ＩＮＤ特異的フラグメント」の検出及び／又は同定は、種々の方法で（例、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後のサイズ推定を通じて又は蛍光ベースの検出方法を通じて）起こりうる。突然変異ＩＮＤ特異的フラグメントは、また、直接配列決定してよい。増幅されたＤＮＡフラグメントの検出のための他の配列特異的方法も当技術分野において公知である。
標準的なＰＣＲプロトコールが当技術分野において記載されている（例えば、「PCR Applications Manual」（Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999）及び他の参考文献）。ＰＣＲのための最適な条件（特異的プライマーの配列を含む）が、各々の特異的な突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についての「PCR identification protocol」において特定される。しかし、ＰＣＲ同定プロトコールにおける多くのパラメーターを調整して、実験室条件を特定する必要がありうるが、わずかに改変して、類似の結果を得てよいことが理解される。例えば、ＤＮＡの調製のための異なる方法の使用では、例えば、プライマーの量、ポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２濃度、又は使用するアニーリング条件の調整が必要になりうる。同様に、他のプライマーの選択は、ＰＣＲ同定プロトコールのための他の最適条件を指示しうる。これらの調整は、しかし、当業者に明らかであり、現行のＰＣＲ適用手動（例えば上で引用するものなど）においてさらに詳述される。
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を同定するためのＰＣＲ同定プロトコールの例を、実施例において記載する。
あるいは、特異的プライマーを使用して、生物学的サンプル中の特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を同定するための「特定のプローブ」として使用することができる突然変異ＩＮＤ特異的フラグメントを増幅することができる。生物学的サンプルの核酸を、プローブと、プローブとその対応する核酸中のフラグメントとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させることによって、核酸／プローブハイブリッドの生成をもたらす。このハイブリッドの形成を検出することができ（例、核酸又はプローブの標識）、それによりこのハイブリッドの形成は特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在を示す。特定のプローブとのハイブリダイゼーションに基づく（固相担体上又は溶液中のいずれかでの）そのような同定方法が、当技術分野において記載されている。特定のプローブは、好ましくは、最適化された条件下で、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域内及び／又は突然変異領域内の領域（以下、「突然変異ＩＮＤ特異的領域」と呼ぶ）に特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特定のプローブは、１０〜１０００bp、５０〜６００bpの間、１００〜５００bpの間、１５０〜３５０bpの間、少なくとも８０%、好ましくは８０〜８５%の間、より好ましくは８５〜９０%の間、特に好ましくは９０〜９５%の間、最も好ましくは９５%〜１００%の間で特定の領域のヌクレオチド配列と同一である（又は相補的である）配列を含む。好ましくは、特定のプローブは、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の特定の領域と同一である（又は相補的である）約１３〜約１００の連続ヌクレオチドの配列を含む。
本発明のために適した特定のプローブは以下：
− 長さ１３ｎｔ〜約１０００ｎｔに及び、少なくとも１３の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子又はその相補体の５’又は３’隣接配列から選択されるオリゴヌクレオチド（即ち、例えば、本発明の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子において欠失、挿入、又は置換された１つ又は複数のヌクレオチドの５’又は３’に隣接する配列、例えば上に記載するナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の５’又は３’に隣接する配列、あるいは上の表において示す潜在的な終止コドン突然変異又は上に示す置換突然変異の５’又は３’に隣接する配列）、又はそれと少なくとも８０%の配列同一性を有する配列（５’隣接配列を認識するプローブ）；又は
− 長さ１３ｎｔ〜約１０００ｎｔに及び、少なくとも１３の連続ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子又はその相補体の突然変異配列から選択されるオリゴヌクレオチド（即ち、例えば、本発明のＩＮＤ遺伝子において挿入又は置換されたヌクレオチドの配列あるいはその相補体）、又はそれと少なくとも８０%の配列同一性を有する配列（突然変異配列を認識するプローブ）
でありうる。
プローブは、全体的に、隣接配列及び突然変異配列の言及したヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列からなりうる。しかし、プローブのそれらの５’又は３’末端のヌクレオチド配列はそれほど決定的ではない。このように、プローブの５’又は３’配列は、適宜、隣接配列又は突然変異配列から選択されるヌクレオチド配列からなりうるが、しかし、隣接配列又は突然変異配列とは無関係のヌクレオチド配列からなりうる。そのような無関係の配列は、好ましくは、５０より長くならず、より好ましくは２５又はさらに２０又は１５ヌクレオチドより長くならない。
さらに、適したプローブは、隣接配列と突然変異配列の間の連結領域（即ち、例えば、本発明の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子において欠失、挿入、又は置換された１つ又は複数のヌクレオチドの５’又は３’に隣接する配列と挿入又は置換された１つ又は複数のヌクレオチドの配列あるいは欠失された１つ又は複数のヌクレオチドの３’又は５’にそれぞれ隣接する配列の連結領域、例えば上に記載する本発明のＩＮＤ遺伝子におけるナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の５’又は３’に隣接する配列と、ナンセンス、ミスセンス、又はフレームシフト突然変異の間の連結領域、あるいは上の表において示す潜在的な終止コドン突然変異又は上に示す置換突然変異の５’又は３’に隣接する配列と、潜在的な終止コドン又は置換突然変異の配列の間のそれぞれ連結領域）に及ぶヌクレオチド配列を含みうる、又は、それからなりうる（ただし言及したヌクレオチド配列が突然変異領域又は隣接領域のいずれかにもっぱら由来しないことを条件とする）。
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を同定するために適したプローブの例を、実施例において記載する。
特定のプローブにハイブリダイズする「突然変異ＩＮＤ特異的領域」の検出及び／又は同定は、種々の方法で（例、ゲル電気泳動後のサイズ推定を通じて又は蛍光ベースの検出方法を通じて）起こりうる。特定のプローブにハイブリダイズする「突然変異ＩＮＤ特異的領域」の検出のための他の配列特異的方法も当技術分野において公知である。
あるいは、１つ又は複数の突然変異ｉｎｄ対立遺伝子を含む植物又は植物部分を、他の方法を使用して生成及び同定することができる。例えば、「Delete-a-gene（商標）」（ＰＣＲを使用して、高速中性子突然変異生成により生成される欠失突然変異体についてスクリーニングする（Li and Zhang, 2002, Funct Integr Genomics 2:254-258により概説））、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム中の標的化誘発局所的損傷）（変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）を使用してＥＭＳ誘発性点突然変異を同定する）（McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18: 455、及びMcCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442）など。言及した通り、ＴＩＬＬＩＮＧでは突然変異についてのハイスループットスクリーニングを使用する（例、突然変異野生型ＤＮＡヘテロ二本鎖のＣｅｌ１切断、及び、配列決定ゲルシステムを使用した検出を使用する）。このように、１つ又は複数の突然変異ｉｎｄ対立遺伝子を含む植物又は植物部分を同定するためのＴＩＬＬＩＮＧならびにそのような植物、植物器官、組織、及び種子を生成及び同定するための方法の使用が本明細書において包含される。このように、一実施態様において、本発明の方法は、植物種子の突然変異誘発（例、ＥＭＳ突然変異生成）、植物個体又はＤＮＡのプール、目的の領域のＰＣＲ増幅、ヘテロ二本鎖形成及びハイスループット検出、突然変異植物の同定、突然変異ＰＣＲ産物の配列決定の工程を含む。他の突然変異生成及び選択の方法を等しく使用して、そのような突然変異植物を生成してよいことが理解される。
ＩＮＤ対立遺伝子において突然変異を誘発する代わりに、自然（自発的）突然変異対立遺伝子を当技術分野において公知の方法により同定してよい。例えば、ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧを使用して（Henikoff et al. 2004, Plant Physiology 135(2): 630-6）、自然突然変異ｉｎｄ対立遺伝子の存在について複数の植物又は植物部分をスクリーニングしてよい。上の突然変異生成技術に関しては、好ましくはＡ及び／又はＣゲノムを含むブラシカ種をスクリーニングして、同定されたｉｎｄ対立遺伝子をその後に他のブラシカ種、例えばブラシカ・ナパスに、交雑（種間又は種内交雑）及び選択により導入することができる。ＥＣＯＴＩＬＬＩＮＧにおいて、育種系統又は関連種における天然多型を、上に記載のＴＩＬＬＩＮＧ方法論によりスクリーニングし、それにおいて植物の個体又はプールをｉｎｄ標的のＰＣＲ増幅、ヘテロ二量体形成、及びハイスループット分析のために使用する。これには、その後に育種プログラムにおいて所望の突然変異対立遺伝子を取り込むために使用することができる必要とされる突然変異を有する個々の植物の選択が続きうる。
同定された突然変異対立遺伝子を次に配列決定して、配列を野生型対立遺伝子と比較して、突然変異を同定することができる。場合により、機能性を上に示す通りにテストすることができる。このアプローチを使用し、複数の突然変異ｉｎｄ対立遺伝子（及びこれらの１つ又は複数を含むブラシカ植物）を同定することができる。所望の突然変異対立遺伝子を、次に、以下でさらに記載する交雑及び選択の方法により、所望の野生型対立遺伝子と組み合わせることができる。最後に、所望の数の突然変異ｉｎｄ及び所望の数の野生型ＩＮＤ対立遺伝子を含む単一の植物を生成する。
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の検出のためのＰＣＲプライマー又は特定のプローブとして適するオリゴヌクレオチドを使用して、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定するための方法を開発することもできる。
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定するために、ＰＣＲベースのアッセイを開発して、突然変異及び／又は対応する野生型ＩＮＤ特異的対立遺伝子の存在を決定することができる。
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＩＮＤ対立遺伝子を特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いに向き合い、プライマーの間に位置する突然変異領域を有するように設計することができる。これらのプライマーは、５’及び３’隣接配列をそれぞれ特異的に認識するプライマーでよい。このセットのプライマーは、突然変異体、ならびに対応する野生型ＩＮＤ対立遺伝子の同時診断的ＰＣＲ増幅を可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＩＮＤ対立遺伝子を特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いに向き合い、それらの１つが突然変異領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプライマーは、野生型ＩＮＤ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域の配列及び突然変異領域をそれぞれ特異的に認識するプライマーでよい。このセットのプライマーは、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子における突然変異領域の配列を特異的に認識する第３のプライマーと一緒に、突然変異ＩＮＤ遺伝子、ならびに野生型ＩＮＤ遺伝子の同時診断的ＰＣＲ増幅を可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＩＮＤ対立遺伝子を特異的に認識する２つのプライマーを、それらが互いに向き合い、それらの１つが５’又は３’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプライマーは、５’又は３’隣接配列及び野生型ＩＮＤ対立遺伝子の突然変異領域と３’又は５’隣接領域の間の連結領域をそれぞれ特異的に認識するプライマーでよい。このセットのプライマーは、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の突然変異領域と３’又は５’隣接領域の間の連結領域をそれぞれ特異的に認識する第３のプライマーと一緒に、突然変異ＩＮＤ遺伝子、ならびに野生型ＩＮＤ遺伝子の同時診断的ＰＣＲ増幅を可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を、突然変異及び野生型ＩＮＤ対立遺伝子を特異的に認識する代替プライマーセットを使用することにより決定することができる。
植物が突然変異ＩＮＤ遺伝子又は対応する野生型ＩＮＤ遺伝子についてホモ接合性である場合、上に記載する診断的ＰＣＲアッセイは、突然変異又は野生型ＩＮＤ対立遺伝子のいずれかについて、典型的な、好ましくは長さが典型的な単一のＰＣＲ産物を生じる。植物が突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合、２つの特定のＰＣＲ産物が現れ、突然変異体及び野生型ＩＮＤ対立遺伝子の両方の増幅を反映する。
野生型及び突然変異ＩＮＤ特異的ＰＣＲ産物の同定は、例えば、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後のサイズ推定により（例、野生型及び突然変異ＩＮＤ対立遺伝子から増幅されるフラグメントの間でサイズの差異をもたらす多くの挿入又は欠失したヌクレオチドを含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子について、フラグメントは可視的にゲル上で分離することができる）；ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後に２つの異なるフラグメントの存在又は非存在を評価することにより（それにより突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の診断的ＰＣＲ増幅が、場合により、野生型ＩＮＤ対立遺伝子の診断的ＰＣＲ増幅とは別々に実施することができる）；増幅されたフラグメントの直接配列決定により；又は蛍光ベースの検出方法により起こりうる。
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合性を決定するために適したプライマーの例を実施例において記載する。
あるいは、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定するために、ハイブリダイゼーションベースのアッセイを開発して、突然変異及び／又は対応する野生型ＩＮＤ特異的対立遺伝子の存在を決定することができる：
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＩＮＤ対立遺伝子を認識する２つの特定のプローブを、各々のプローブがＩＮＤ野生型ＩＮＤ対立遺伝子内の配列を特異的に認識し、突然変異領域がプローブにより認識される配列間に位置するように設計することができる。これらのプローブは、５’及び３’隣接配列をそれぞれ特異的に認識するプローブでよい。これらのプローブの１つ又は、好ましくは両方の使用によって、突然変異体、ならびに対応する野生型ＩＮＤ対立遺伝子の同時診断的ハイブリダイゼーションが可能になる。
あるいは、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＩＮＤ対立遺伝子を認識する２つの特定のプローブを、それらの１つがＩＮＤ野生型対立遺伝子内の配列を突然変異領域の上流又は下流で、好ましくは突然変異領域の上流で特異的に認識し、それらの１つが突然変異領域を特異的に認識するように設計することができる。これらのプローブは、野生型ＩＮＤ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域、及び突然変異領域の配列をそれぞれ特異的に認識するプローブでよい。これらのプローブの１つ又は、好ましくは両方の使用によって、場合により、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子における突然変異領域の配列を特異的に認識する第３のプローブと一緒に、突然変異体及び野生型ＩＮＤ遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションが可能になる。
あるいは、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定するために、野生型ＩＮＤ対立遺伝子を認識する特定のプローブを、プローブが野生型ＩＮＤ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域を特異的に認識するように設計することができる。このプローブは、場合により、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の５’又は３’隣接領域、好ましくは５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域を特異的に認識する第２のプローブと一一緒に、突然変異体及び野生型ＩＮＤ遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションを可能にする。
あるいは、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を、突然変異体及び野生型ＩＮＤ対立遺伝子を特異的に認識する代替セットのプローブを使用することにより決定することができる。
植物が突然変異ＩＮＤ遺伝子又は対応する野生型ＩＮＤ遺伝子についてホモ接合性である場合、上に記載する診断的ハイブリダイゼーションアッセイは、突然変異又は野生型ＩＮＤ対立遺伝子のいずれかについて、典型的な、好ましくは長さが典型的な単一の特定のハイブリダイゼーション産物、例えば１つ又は複数のハイブリダイズするＤＮＡ（制限）フラグメントなどを生じる。植物が突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合、２つの特定のハイブリダイゼーション産物が現れ、突然変異体及び野生型ＩＮＤ対立遺伝子の両方のハイブリダイゼーションを反映する。
野生型及び突然変異ＩＮＤ特異的ハイブリダイゼーション産物の同定は、例えば、ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後のサイズ推定により（例、野生型及び突然変異ＩＮＤ対立遺伝子からのハイブリダイズするＤＮＡ（制限）フラグメントの間でサイズの差異をもたらす多くの挿入又は欠失したヌクレオチドを含む突然変異ＩＮＤ対立遺伝子について、フラグメントは可視的にゲル上で分離することができる）；ゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動後に２つの異なる特定のハイブリダイゼーション産物の存在又は非存在を評価することにより（それにより突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションが、場合により、野生型ＩＮＤ対立遺伝子の診断的ハイブリダイゼーションとは別々に実施することができる）；ハイブリダイズするＤＮＡ（制限）フラグメントの直接配列決定により；又は蛍光ベースの検出方法により起こりうる。
特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合性を決定するために適したプローブの例を実施例において記載する。
さらに、ＰＣＲベース又はハイブリダイゼーションベースの増幅方法とは異なる特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子に特異的な検出方法を、本明細書において提供する特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子に特異的な配列情報を使用して開発することもできる。そのような代替の検出方法は、特定の核酸構造の侵襲的切断に基づく線形シグナル増幅検出方法（Invader（商標）技術としても公知）（例、米国特許５，９８５，５５７「Invasive Cleavage of Nucleic Acids」、６，００１，５６７「Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage」において記載され、それらは参照により本明細書において組み入れられる）、ＲＴ−ＰＣＲベースの検出方法（例えばTaqmanなど）、又は他の検出方法（例えばSNPlexなど）を含む。簡単に説明すると、Invader（商標）技術において、標的突然変異配列は、例えば、突然変異配列又は５’隣接領域と突然変異領域の間の連結領域に及ぶ配列のヌクレオチド配列を含む標識した第１の核酸オリゴヌクレオチドと、及び、突然変異配列の直ぐ下流及び近接する３’隣接配列を含む第２のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせてよく、ここにおいて第１及び第２のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのヌクレオチドにより重なる。このハイブリダイゼーションにより産生される二本鎖構造又は三本鎖構造によって、酵素（Cleavase（登録商標））を用いた選択的なプローブ切断が可能になり、標的配列をインタクトなままにする。切断された標識プローブは、その後に、さらなるシグナル増幅をもたらす中間工程を潜在的に通じて検出される。
「キット」は、本明細書において使用する通り、本発明の方法を実施する目的のため、特に、生物学的サンプル中での特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の同定又は特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む植物材料の接合状態の決定のための試薬セットを指す。特に、本発明のキットの好ましい実施態様は、上に記載する、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の同定のための少なくとも２つの特異的プライマー、又は接合状態の決定のための少なくとも２つもしくは３つの特異的プライマーを含む。場合により、キットは、さらに、本明細書において記載する、ＰＣＲ同定プロトコールにおける任意の他の試薬を含みうる。あるいは、本発明の別の実施態様によると、キットは、少なくとも１つの特定のプローブ（生物学的サンプルの核酸と特異的にハイブリダイズさせて（上に記載の通り）、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の同定のためにその中の特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在を同定する）あるいは接合状態の決定のための少なくとも２つ又は３つの特定のプローブを含む。場合により、キットは、特定のプローブを使用した、生物学的サンプル中の特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の同定のための任意の他の試薬（例えば、限定はされないが、ハイブリダイズバッファー、標識など）をさらに含みうる。
本発明のキットを使用することができ、その構成要素は、品質管理（例、種子ロットの純度）、植物材料又は植物材料を含むもしくはそれに由来する材料（例えば、限定はされないが、食物又は飼料産物など）における特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在又は非存在の検出の目的のために特異的に調整することができる。
本明細書において使用する「プライマー」という用語は、鋳型依存的プロセス（例えばＰＣＲなど）における新生核酸の合成を刺激することができる任意の核酸を包含する。典型的に、プライマーは、１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、しかし、より長い配列を用いることができる。プライマーは、二本鎖形態で提供してよく、一本鎖形態が好ましい。プローブはプライマーとして使用することができ、しかし、標的ＤＮＡ又はＲＮＡに結合するように設計され、増幅プロセスにおいて使用する必要はない。
本明細書において使用する「認識する」という用語は、特異的プライマーを指す場合、特異的プライマーが、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子において、方法において先に設定した条件（例えばＰＣＲ同定プロトコールの条件など）下で核酸に特異的にハイブリダイズするとの事実を指し、それにより特異性は、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールの存在により決定される。
「ハイブリダイズする」という用語は、特定のプローブを指す場合に本明細書において使用する通り、プローブが特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の核酸配列中の特定の領域に、標準的なストリンジェンシー条件下で結合するとの事実を指す。本明細書において使用する標準的なストリンジェンシー条件は、本明細書において記載するハイブリダイゼーションのための条件又はSambrook et al., 1989（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY）により記載される従来のハイブリダイズ条件を指し、例えば、以下の工程を含みうる：１）植物ゲノムＤＮＡフラグメント又はＢＡＣライブラリーＤＮＡをフィルター上に固定すること、２）フィルターを１〜２時間６５℃で６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、０．５% ＳＤＳ、及び２０μg/ml変性キャリアＤＮＡ中でプレハイブリダイズすること、３）標識されたハイブリダイゼーションプローブを加えること、４）１６〜２４時間インキュベートすること、５）フィルターを３０分間６８℃で６×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳ中で１回洗浄すること、６）フィルターを３回（３０分間３０ml中で２回及び１０分間５００ml中で１回）６８℃で２×ＳＳＣ、０．１% ＳＤＳ中で洗浄すること、及び７）フィルターを４〜４８時間Ｘ線フィルムに−７０℃で暴露すること。
本明細書において使用する「生物学的サンプル」は、植物、植物材料、又は植物材料を含む産物のサンプルである。「植物」という用語は、任意の成熟段階にある植物組織、ならびに任意のそのような植物から採取された又はそれに由来する任意の細胞、組織、又は器官、限定はされないが、任意の種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物、又はプロトプラストなどを包含することを意図する。「植物材料」は、本明細書において使用する通り、植物から得られる又は植物に由来する材料を指す。植物材料を含む産物は、植物材料を使用して産生される食品、飼料、もしくは他の産物に関し、又は、植物材料が混入しうる。本発明に関連して、そのような生物学的サンプルを、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子に特異的な核酸の存在についてテストし、サンプル中の核酸の存在を意味すると理解される。このように、本明細書において指す、生物学的サンプルにおいて特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を同定するための方法は、特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む核酸の生物学的サンプルにおける同定に関連する。
本発明は、また、１つの植物における特定のＩＮＤ対立遺伝子の組み合わせ、１つの植物から別の植物への１つ又は複数の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の移入、１つ又は複数の特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む植物、これらの植物から得られた後代、ならびにこれらの植物に由来する植物細胞、植物部分、及び植物種子に関する。
このように、一実施態様において、１つの植物において２つ又はそれ以上の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を組み合わせるための方法を提供し、以下の工程：
（ａ）１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を各々含む２つ又はそれ以上の植物を生成及び／又は同定すること（上に記載の通り）、
（ｂ）１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む第１の植物と１つ又は複数の他の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む第２の植物とを交雑し、交雑からＦ１種子を回収し、そして、場合により、第２の植物からの１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を伴う第１の植物から１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むＦ１植物を同定すること（上に記載の通り）、
（ｃ）場合により、全ての選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むＦ１植物が得られるまで工程（ｂ）を繰り返すこと、
（ｄ）場合により、
‐ 突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の接合状態を決定することにより、Ｆ１植物（選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてホモ接合性又はヘテロ接合性である）を同定すること（上に記載の通り）、又は
− 選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の１つ又は複数についてホモ接合性である植物を、以下の工程を実施することにより生成すること：
− １つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むＦ１植物の処理された小胞子又は花粉細胞から倍加半数体植物を抽出すること（上に記載の通り）、
− １つ又は複数の世代（ｙ）について１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むＦ１植物を自家受粉し、自家受粉からのＦ１ Ｓｙ種子を回収し、そして、Ｆ１ Ｓｙ植物（１つ又は複数の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてホモ接合性である）を同定すること（上に記載の通り）
を含む。
本発明の別の実施態様において、１つ又は複数の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を１つの植物から別の植物に移すための方法を提供し、以下の工程：
（ａ）１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む第１の植物を生成及び／又は同定すること（上に記載の通り）、又は、１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を１つの植物において組み合わせることにより第１の植物を生成すること（上に記載の通り）（それにおいて第１の植物は、１つ又は複数の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてホモ接合性又はヘテロ接合性である）、
（ｂ）１つ又は複数の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む第１の植物と１つ又は複数の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含まない第２の植物とを交雑し、交雑からＦ１種子を回収し（それにおいて種子は突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてヘテロ接合性であり（第１の植物がその突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてホモ接合性である場合）、及び、それにおいて種子の半分が、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてヘテロ接合性であり、種子の半分が不対性である、即ち、それを含まず（第１の植物はその突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてヘテロ接合性である場合）、そして、場合により、１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むＦ１植物を同定すること（上に記載の通り）、
（ｃ）１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むＦ１植物を、１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含まない第２の植物と、１つ又は複数の世代（ｘ）にわたり戻し交雑し、交雑からのＢＣｘ種子を回収し、そして、各世代において、１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むＢＣｘ植物を同定すること（上に記載の通り）、
（ｄ）場合により、１つ又は複数の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてホモ接合性であるＢＣｘ植物を、以下の工程の１つを実施することにより生成すること：
− １つ又は複数の所望の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むＢＣｘ植物の処理された小胞子又は花粉細胞から倍加半数体植物を抽出すること（上に記載の通り）、
− １つ又は複数の世代（ｙ）について１つ又は複数の所望の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むＢＣｘ植物を自家受粉し、自家受粉からのＢＣｘ Ｓｙ種子を回収し、そして、ＢＣｘ Ｓｙ植物（１つ又は複数の所望の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてホモ接合性である）を同定すること（上に記載の通り）
を含む。
本発明の一局面において、第１及び第２の植物は、ブラシカ科植物、特にブラシカ植物、特にブラシカ・ナパス植物、又は別のブラシカ作物種からの植物である。本発明の別の局面において、第１の植物は、ブラシカ科植物、特にブラシカ植物、特にブラシカ・ナパス植物、又は別のブラシカ作物種からの植物であり、第２の植物は、ブラシカ科育種系統、特にブラシカ育種系統、特にブラシカ・ナパス育種系統、又は別のブラシカ作物種からの育種系統からの植物である。「育種系統」は、本明細書において使用する通り、好ましくは、雑種子孫を産生するために使用される好ましい遺伝子型及び／又は表現型により他の植物系統から識別可能であるホモ接合性植物系統である。
本発明のさらに別の実施態様において、植物、特にブラシカ作物植物、例えばブラシカ・ナパス植物など（その鞘脱粒耐性が増加されているが、しかし、好ましくは農学的に関連する鞘の脱穀性を保持している）を作るための方法を提供し、本発明の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子をブラシカ植物において又はそれへ組み合わせる及び／又は移入させることを含む（上に記載の通り）。
本発明の一局面において、植物は、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物であり、それにおいて、鞘脱粒耐性が増加され、農学的に関連する鞘の脱穀性が保持される（本発明の３つの突然変異ＩＮＤ対立遺伝子をブラシカ植物において又はそれへ組み合わせる及び／又は移入させることによる）（上に記載の通り）。
本発明のさらに別の実施態様において、少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含む雑種ブラシカ作物種子又は植物、特に雑種ブラシカ・ナパス種子又は植物（鞘脱粒耐性が増加されているが、しかし、農学的に関連する鞘の脱穀性が保持される）を作るための方法を提供し、以下の工程：
（ａ）ホモ接合状態の第１及び第２の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む第１の植物ならびにホモ接合状態の第３の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む第２の植物を生成及び／又は同定すること（上に記載の通り）、
（ｂ）第１及び第２の植物を交雑して、そして交雑からＦ１雑種種子を回収すること
を含む。
本発明の一局面において、第１又は第２の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子が、第３の選択された突然変異ＩＮＤ対立遺伝子と同じ突然変異ＩＮＤ対立遺伝子であり、Ｆ１雑種種子が、１つの突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてホモ接合性であり、他についてヘテロ接合性である。本発明の別の局面において、第１の植物を雄親植物として使用し、第２の植物を雌親植物として使用する。本発明の一実施態様において、第１の植物は完全に鞘脱粒耐性である。そのような植物は、植物を自家受粉させることにより得られる完全に非裂開性の種子鞘を播種して、種子鞘を脱穀して種子を収穫する代わりに完全な種子鞘を収穫することにより得てよい。
配列
ＩＮＤ遺伝子
配列番号１：ブラシカ・ナパスからの野生型ＩＮＤ−Ａ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ａ１遺伝子のコードＤＮＡ。
配列番号２：配列番号１によりコードされる野生型ＩＮＤ−Ａ１タンパク質。
配列番号３：ブラシカ・ナパスからの野生型ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ｃ１遺伝子のコードＤＮＡ。
配列番号４：配列番号３によりコードされる野生型ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質。
配列番号５：ブラシカ・ナパスからの野生型ＩＮＤ−Ａ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ａ１遺伝子のゲノムＤＮＡ。
配列番号６：配列番号５によりコードされる野生型ＩＮＤ−Ａ１タンパク質。
配列番号７：ブラシカ・ナパスからの野生型ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質をコードするＩＮＤ−Ｃ１遺伝子のゲノムＤＮＡ。
配列番号８：配列番号７によりコードされる野生型ＩＮＤ−Ｃ１タンパク質。
配列番号９：アラビドプシスＩＮＤ１遺伝子のコードＤＮＡ。
配列番号１０：配列番号９によりコードされるアラビドプシスＩＮＤ１タンパク質。
配列番号１１：ブラシカ・ナパスからのＩＮＤホモログのヌクレオチド配列（ＢＮ１−ＩＮＤ − ＷＯ０４／１１３５４２の配列番号２）。
配列番号１２：ブラシカ・ナパスからのＩＮＤホモログの第２のヌクレオチド配列（ＢＮ２−ＩＮＤ − ＷＯ０４／１１３５４２の配列番号３）。
プライマー及びプローブ
配列番号１３：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ＩＮＤ−Ａ１−ＷＴの検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号１５：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１及び−ＷＴの検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号１６：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０５の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号１７：ＩＮＤ−Ａ１−ＷＴの検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号１８：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０５及び−ＷＴの検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号１９：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。配列番号２０：ＩＮＤ−Ｃ１−ＷＴの検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号２１：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０１及び−ＷＴの検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号２２：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０３の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。配列番号２３：ＩＮＤ−Ｃ１−ＷＴの検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号２４：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０３及び−ＷＴの検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号２５：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１及び−ＷＴの検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号２６：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号２７：ＩＮＤ−Ａ１−ＷＴの検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号２８：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０５及び−ＷＴの検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号２９：ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０５の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号３０：ＩＮＤ−Ａ１−ＷＴの検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号３１：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０１及び−ＷＴの検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号３２：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０１の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号３３：ＩＮＤ−Ｃ１−ＷＴの検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号３４：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０３及び−ＷＴの検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号３５：ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０３の検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号３６：ＩＮＤ−Ｃ１−ＷＴの検出のためのオリゴヌクレオチド。
配列番号３７：ＩＮＤ−Ａ１の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号３８：ＩＮＤ−Ａ１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
配列番号３９：ＩＮＤ−Ｃ１の検出のためのフォワードオリゴヌクレオチド。
配列番号４０：ＩＮＤ−Ｃ１の検出のためのリバースオリゴヌクレオチド。
実施例において特に記載のない限り、全ての組換えＤＮＡ技術は、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, in Volumes 1 and 2 of Ausubel et al.(1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA and in Volumes I and II of Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Second Edition, Academic Press (UK)において記載される標準的な分子生物学的技術に従って行われる。植物分子操作のための標準的な材料及び方法が、R. D. D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax（1993）において記載されており、BIOS Scientific Publications Ltd (UK)及びBlackwell Scientific Publications, UKにより共同公開されている。ポリメラーゼ連鎖反応のための標準的な材料及び方法は、Dieffenbach and Dveksler (1995) PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、及びMcPherson at al.(2000) PCR - Basics: From Background to Bench, First Edition, Springer Verlag, Germanyにおいて見出すことができる。ＡＦＬＰ分析のための標準的な手順が、Vos et al. (1995, NAR 23:4407-4414)及び公開されたＥＰ特許出願ＥＰ ５３４８５８において記載されている。
実施例
実施例１ − ＩＮＤ遺伝子のＤＮＡ配列の単離
優良春菜種の育種系統のＩＮＤ遺伝子の配列を決定するために、系統のバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを以下の通りにスクリーニングした：
１．１． ＩＮＤ配列を含むＢＡＣクローンの単離
優良春菜種の育種系統のＩＮＤ配列を含むＢＡＣクローンを含む大腸菌コロニーを同定するために、個々の２重クローンとして高密度ナイロンフィルター上に整列させた系統のＢＡＣライブラリー（平均クローンサイズ１２０ｋｂ超）を、標準的なサザンハイブリダイゼーション手順によりスクリーニングした：
− ＷＯ０４／１１３５４２の配列番号２（“Ｂｎ１−ＩＮＤ”）及びＷＯ０４／１１３５４２の配列番号３（“ＢＮ２−ＩＮＤ”）（それぞれ配列番号１１及び１２）の配列を伴い、標準的な手順に従って標識された２つのプローブの混合物を、ナイロンメンブレン上のＤＮＡへのハイブリダイズのために使用した。
− プレハイブリダイゼーションを６５℃で、３０mlの以下のハイブリダイゼーションバッファー中で２時間実施した：６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３．０M ＮａＣｌ、０．３Mクエン酸、ｐＨ ７．０を含む）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ（１００×は２% Ｆｉｃｏｌｌ、２%ポリビニル・ピロリドン、２%ウシ血清アルブミン）、０．５% ＳＤＳ、及び２０μg/ml変性キャリアＤＮＡ（一本鎖魚精子ＤＮＡ、平均長１２０〜３０００ヌクレオチド）。
− ハイブリダイゼーションを以下の条件下で実施した：
− 標識したプローブ（２０ngの各々の配列）を９５℃で５分間加熱し、５分間氷上で冷却し、１５mlのハイブリダイゼーションバッファー（プレハイブリダイゼーションのためのものと同じバッファー）に加えた。
− ハイブリダイゼーションを６５℃で一晩実施した。
− ブロットをハイブリダイゼーションチューブ中で、６５℃で３回（０．１% ＳＤＳを伴う３０ml ６×ＳＳＣで１回及び０．１% ＳＤＳを伴う３０ml ２×ＳＳＣで２回）、箱中で、６５℃で０．１% ＳＤＳを伴う５００ml ２×ＳＳＣで１０分間洗浄した。
− Kodak X-OMAT ARフィルムを放射活性のあるブロットに４時間−７０℃で暴露した。
− ポジティブなシグナルに基づき、ＩＮＤ配列を含むＢＡＣクローンを含む１４の大腸菌コロニーを、優良春菜種の育種系統からＢＡＣライブラリーをスクリーニングすることにより選択した（ポジティブの総数：６５）（以下、「ポジティブなコロニー」と呼ぶ）。
１．２． 全長ＩＮＤ配列を含むＢＡＣクローンの単離
ＩＮＤ遺伝子の１つの全長ゲノムＤＮＡ配列を伴うＢＡＣクローンを含むポジティブなコロニーを同定するために、サザンブロット分析を、ポジティブコロニーから単離したＢＡＣクローンＤＮＡ及びブラシカ・ナパスから単離したゲノムＤＮＡで実施した：
− ＢＡＣクローンＤＮＡを、２５μg/mlクロラムフェニコールを含む２５ｍｌのＬＢ培地中で生育させたポジティブなコロニーから、当技術分野において記載の通りに、アルカリ溶解を通じて単離した。
− ゲノムＤＮＡを、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）方法に従って、Ｂ．ナパスの葉組織から単離した（Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15）。
− 各々の調製物のＤＮＡ濃度を、１μlの各々のサンプルでのバンド強度を、２５ng/μlラムダＤＮＡ（Life Technologies（登録商標））を含む１、２、４、８、及び２０μlの溶液でのバンド強度と、エチジウムブロマイド（ICN Biochemicals（登録商標））を含む１% ＴＢＥ（Invitrogen（登録商標））アガロースゲル（Roche（登録商標））上で比較することにより推定した。
− １００〜２００ngのＢＡＣクローンＤＮＡ及び１．７μgゲノムＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いて、最終反応容積２０μl中で、製造者（New England Biolabs）により提示された条件を適用して消化した。制限酵素の消化時間及び／又は量を調整して、非特異的な分解なくゲノムＤＮＡサンプルの完全消化を保証した。
− 消化後、ＲＮａｓｅを含む２μlの添加色素（１２．５ml １% キシレンシアノールＦＦ；１２．５ml １%ブロモフェノールブルー水溶性指示薬；２５mlグリセロール；１００μl ０．５M ＥＤＴＡ ｐＨ８；１μl ＲＮａｓｅ（１０mg/ml））を消化したＤＮＡサンプルに加えて、サンプルを３７℃で３０分間インキュベートした。
− サンプルを１% ＴＡＥアガロースゲル上に添加した。
− ＰｓｔＩを用いて消化したファージラムダＤＮＡ（Fermentas（登録商標））又は１kbpのＤＮＡラダー（Life Technologies）をサイズスタンダードとして含めた。
− 電気泳動後、ＤＮＡサンプル（消化したＢＡＣクローン及びゲノムＤＮＡ）をナイロンメンブレン（Hybond-N+ Amersham Pharmacia Biotech（登録商標））に乾燥アルカリキャピラリーブロッティングによりトランスファーした。
− 消化したＢＡＣクローン及びゲノムＤＮＡを伴うナイロンメンブレンを、標準的なサザンブロットハイブリダイゼーション手順（上に記載の通り）により、ＢＡＣライブラリースクリーニングのためにスクリーニングした（ゲノムＤＮＡについて、Kodak XOMAT ARフィルムを放射活性のあるブロットに２日間−７０℃で暴露したことを除く）。
− 同定したポジティブなコロニーのＢＡＣクローンＤＮＡ及びブラシカ・ナパスから単離したゲノムＤＮＡの制限酵素ＥｃｏＲＩを用いた消化及びプローブを用いたハイブリダイゼーション後に得られるハイブリダイゼーションパターンの間の比較に基づき、ＢＡＣクローンを２つのグループにグループ化し、２グループの各々について、完全長ＩＮＤ配列（ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１と名付けた）を含むＢＡＣクローンを選択した。
− 選択したポジティブなコロニーのＢＡＣクローン中に含まれるＩＮＤ配列を、標準的な配列決定技術（Agowa）により決定した。
Figure 0005956109
実施例２ − ブラシカ・ナパスからのＩＮＤ遺伝子配列の特性付け
ゲノムＤＮＡフラグメント（それぞれ配列番号５及び７）の配列決定後、ＩＮＤ配列のコード領域をＦｇｅｎｅＳＨ（Softberry, Inc. Mount Kisco, NY, USA）及びｅｓｔ２ｇｅｎｏｍｅ（Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16 (6): 276-277；Mott, 1997, Comput. Applic. 13: 477-478）を用いて決定し、配列一覧表に描写する通りである。
Ｂ．ラパ（ＡＡ）、Ｂ．オレラセア（ＣＣ）、及びＢ．ナパス（ＡＡＣＣ）から単離されたゲノムＤＮＡ及び実施例１において同定されたポジティブなコロニーから単離されたＢＡＣクローンＤＮＡでのサザンブロット解析（ＥｃｏＲＩを用いて制限酵素処理し、プローブにハイブリダイズした（実施例１において記載の通り））において生成されたハイブリダイズするバンドの比較は、ＩＮＤ−Ａ１配列がＡゲノムに、ＩＮＤ−Ｃ１配列がＣゲノムに由来することを示した。
優良春菜種の育種系統でのＩＮＤ遺伝子のタンパク質コード領域を、配列番号１（ＩＮＤ−Ａ１）、配列番号３（ヌクレオチド位置４６からヌクレオチド位置６３３まで）（ＩＮＤ−Ｃ１−短（ｓｈｏｒｔ））、及び配列番号３（ＩＮＤ−Ｃ１−長（ｌｏｎｇ））においてそれぞれ表わす。次に、コードされるこれらの核酸配列により、ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１タンパク質配列を、配列番号２（ＩＮＤ−Ａ１）、配列番号４（アミノ酸位置１６からアミノ酸位置２１０まで（ＩＮＤ−Ｃ１−短（ｓｈｏｒｔ）））、及び配列番号４（ＩＮＤ−Ｃ１−長（ｌｏｎｇ））においてそれぞれ描写する。
ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１−長（ｌｏｎｇ）の完全コード領域の間のパーセント（ヌクレオチド）配列同一性は８１%であり、ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１−短（ｓｈｏｒｔ）の完全コード領域の間は８７%であり、ＩＮＤ−Ａ１ならびにＩＮＤ−Ｃ１−長（ｌｏｎｇ）及び−短（ｓｈｏｒｔ）のｂＨＬＨドメインをコードする領域の間のパーセント（ヌクレオチド）配列同一性（Toledo-Ortiz et al., 2003, Plant Cell 15, 1749-1770に従って決定される）は９８%である。これらのパーセントは、ＩＮＤ遺伝子が、ｂＨＬＨドメインをコードする領域において、コード領域の残りの部分においてよりも保存されていることを示す。
同様に、完全ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１−長（ｌｏｎｇ）タンパク質の間のパーセント（アミノ酸）配列同一性は７５%であり、完全ＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１−短（ｓｈｏｒｔ）タンパク質の間は８０%であり、ＩＮＤ−Ａ１ならびにＩＮＤ−Ｃ１−長（ｌｏｎｇ）及び−短（ｓｈｏｒｔ）のｂＨＬＨドメインの間のパーセント（アミノ酸）配列同一性（Toledo-Ortiz et al., 2003, Plant Cell 15, 1749-1770に従って決定される）は９８%である。これらのパーセントは、ＩＮＤタンパク質が、ｂＨＬＨドメインおいて、ＩＮＤタンパク質の残りの部分においてよりも保存されていることを示す。
実施例３ − ブラシカＩＮＤ遺伝子の発現
異なる組織において異なるＩＮＤ遺伝子の発現を分析するために、各々のＩＮＤ遺伝子に特異的なＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ブラシカ・ナパスの葉、鞘壁、裂開部組織、及び種子から単離された全ＲＮＡで、以下のプライマーを使用して実施した：
Figure 0005956109
（ＩＮＤ−Ａ１遺伝子について）、及び
Figure 0005956109
（ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子について）
結果は、両方のＩＮＤ遺伝子、即ちＩＮＤ−Ａ１及びＩＮＤ−Ｃ１が葉組織及び種子において発現されず、しかし、裂開部組織において発現されること、及び、ＩＮＤ−Ａ１遺伝子が鞘壁において発現され、ＩＮＤ−Ｃ１遺伝子が鞘壁において発現されないことを示した。
実施例４ − 突然変異ＩＮＤ対立遺伝子（ｉｎｄ）の生成及び単離
実施例１において同定されたＩＮＤ遺伝子における突然変異を、以下の通りに生成及び同定した：
− 優良春菜種の育種系統からの３０，０００の種子（Ｍ０種子）を、２時間にわたり脱イオン水又は蒸留水中の湿ったフィルターペーパー上で事前に浸した。種子の半分を０．８% ＥＭＳに、半分を１% ＥＭＳ（Sigma: M0880）に暴露させて、４時間にわたりインキュベートした。
− 突然変異誘発させた種子（Ｍ１種子）を３回リンスして、ドラフトにおいて一晩乾燥させた。３０，０００のＭ１植物を土壌中で生育させて、自家受粉させてＭ２種子を生成した。Ｍ２種子を、各々の個々のＭ１植物について収穫した。
− ２回、４８００のＭ２植物（異なるＭ１植物に由来する）を生育させて、ＤＮＡサンプルを各々の個々のＭ２植物の葉サンプルからＣＴＡＢ方法に従って調製した（Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15）。
− ＤＮＡサンプルをＩＮＤ遺伝子における点突然変異（ＩＮＤ遺伝子のタンパク質コード領域における終止コドンの導入、又は、ＩＮＤタンパク質中の、特にＩＮＤタンパク質のｂＨＬＨドメイン中のアミノ酸の置換を起こす）の存在について、標準的な配列決定技術（Agowa）による直接配列決定及びにより、NovoSNPソフトウェア（VIB Antwerp）を使用した点突然変異の存在についての配列解析によりスクリーニングした。
− 以下の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子（ｉｎｄ）をこのようにして同定した：
Figure 0005956109
Figure 0005956109
対立遺伝子ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０１及びｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０１をホモ接合状態で含む植物の参照種子が、American Type Culture Collection（ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, US）に、２００７年１１月２０日に受入番号ＰＴＡ−８７９６（株の記号表示０７ＭＢＢＮ００１１７１）の下で寄託されており、対立遺伝子ｉｎｄ−ａ１−ＥＭＳ０５及びｉｎｄ−ｃ１−ＥＭＳ０３をホモ接合状態で含む植物の参照種子が、ＡＴＣＣに２００７年１１月２０日に受入番号ＰＴＡ−８７９５（株の記号表示０７ＭＢＢＮ０００５３０）の下で寄託されている。結論として、上の実施例は、どのように突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を生成及び単離することができるかを示す。また、そのような突然変異対立遺伝子を含む植物材料を使用して、選択された突然変異対立遺伝子及び／又は野生型対立遺伝子を植物において組み合わせることができる（以下の実施例において記載する）。
実施例５ − 突然変異ブラシカＩＮＤ対立遺伝子を含むブラシカ植物の同定
実施例４において同定されたＩＮＤ遺伝子中に突然変異を含むブラシカ植物を、以下：
− Ｍ２植物のＤＮＡサンプルにおいて同定された各々の突然変異ＩＮＤ遺伝子について、ＩＮＤ突然変異を含むＭ２植物と同じＭ１植物に由来する少なくとも５０のＭ２植物を生育させて、ＤＮＡサンプルを各々の個々のＭ２植物の葉サンプルから調製した。
− ＤＮＡサンプルを、実施例４において上に記載する通りに、同定された点ＩＮＤ突然変異の存在についてスクリーニングした。
− 同じ突然変異を含むヘテロ接合性又はホモ接合性（電気泳動図に基づき決定）Ｍ２植物を自家受粉させて、Ｍ３種子を収穫した
の通りに同定した。
実施例６ − 突然変異ブラシカＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物の果実の裂開特性の分析
ブラシカ植物における突然変異ＩＮＤ遺伝子の存在とブラシカ植物の果実の裂開特性の間の相関を決定するために、突然変異ＩＮＤ遺伝子を含むブラシカ植物の果実の裂開特性を温室及び野外において以下：
− 果実弁縁及び種子鞘の裂開特性が、ＩＮＤにおける突然変異によりどのように影響を受けるのか、及び、影響を受けるか否かを検証するために、ｉｎｄ果実を、以下の巨視的テストを使用して、野生型果実と比較した：
（ａ）特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在により起こる鞘及び植物の表現型における差異を決定するための一般的な肉眼での種子鞘及び植物の検査。鞘の表現型の決定：鞘を完全に生育させ、満たし、黄色になる直前に、弁を描く帯と帯のくちばし（ここで、５つの無作為鞘（１系統当たり複数の植物が利用可能な場合には異なる植物から）の両方の弁がもはや（鞘の遠位端で）触れない）の鮮明さの程度を評価し、スコア１〜５に帰した：明らかな圧入と弁とくちばしを分離する微細な鮮明帯に対して１；いくらかの圧入及び弁をくちばしから分離する明らかだが、より不明瞭な帯に対して２；依然として２つの異なる組織として十分に観察可能であるが、しかし、その間に非常に円滑な移行を伴う弁とくちばしに対して３；異なる組織としてほとんど観察可能ではない弁とくちばしに対して４；両方の組織型の間に明らかな区別を伴わない弁とくちばしの間の完全に円滑化された移行に対して５、即ち、鞘の遠位端の弁とくちばしの間の圧入が少ないほど、スコアは高い。スコア１（弁とくちばしの間の鮮明な圧入）は、鞘の野生型表現型、より具体的には鞘の鞘脱粒感受性の表現型に対応する；スコア２〜４（弁とくちばしの間のより漸進的な移行）は、鞘の鞘脱粒耐性の表現型に対応し、それにおいて種子脱粒は有意に低下又は遅延され、農学的に関連する鞘の脱穀性が維持され、鞘は依然として、限定的な物理的力を適用することにより裂開部に沿って開きうる；及びスコア５（弁とくちばしの間の圧入なし）は、鞘の鞘脱粒耐性の表現型に対応し、それにおいて種子脱粒は農学的に関連する鞘の脱穀性がもはや可能にならない程度まで低下又は遅延され、鞘は、限定的な物理的力を適用することにより裂開部に沿って開くことができない。
（ｂ）特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在により起こる鞘脱粒耐性における増加を決定するための手動影響テスト（ＭＩＴ）：突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むブラシカ系統及び対応する野生型ＩＮＤ対立遺伝子を含むブラシカ系統の鞘脱粒耐性レベルを、閉じた成熟鞘を手動で鞘にねじれを適用することにより開くために必要とされる物理的力を決定することにより半定量的な方法で比較した。以下の通りに区別した：最もわずかなねじりで裂開部に沿って完全に開く鞘、裂開部の底部でだけ開き、完全に開くためにより強い力が必要である鞘、及び破砕することだけでき、裂開部に沿って開かない鞘。鞘の鞘脱粒耐性は、この物理的力に基づきスコア１〜５に帰する：最もわずかなねじりで裂開部に沿って完全に開く鞘に対して１、裂開部の底部でだけ開き、完全に開くためにより強い力が必要である鞘に対して２〜４、及び破砕することだけでき、裂開部に沿って開かない鞘に対して５。
（ｃ）特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在により起こる鞘脱粒耐性における増加を決定するための無作為化影響テスト（ＲＩＴ）：突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むブラシカ系統及び対応する野生型ＩＮＤ対立遺伝子を含むブラシカ系統の鞘脱粒耐性レベルを、両方の系統からの鞘のサンプルの半減期をBruce et al.（２００２、上記）に従って決定することにより半定量的な方法で比較した。より具体的には、各々の系統からの２０個のインタクトな成熟鞘の２つの複製サンプルをＲＩＴに供した。２０個の鞘を、６個の鉄球（１２．５mm直径）と一緒に、円筒容器（直径２０cm）中にその軸を垂直にして置いた。容器を、次に、水平プレートにおいて単振動（振動数４．９８Hz及びストローク５１mm）に供した。鞘をテスト前の健全性についてチェックし、累積時間１０、２０、４０、及び、５０%超の鞘がインタクトなままである場合、８０秒にわたり振盪させた。ドラムを各々の期間後に開き、閉じた鞘の数をカウントした。鞘を検証し、両方の弁の裂開部が依然として閉じている場合、「閉じている」として分類した。このように、鞘を、１つ又は両方の弁が脱離した場合、「開いている」として分類し、種子が放出されていた。大半の鞘が、裂開部の開口を伴わず破壊又は損傷された場合、サンプルを「カウント不可能」とマークした。各々のポイントに等しい加重を与えるために、データを、１を加えて、ｌｏｇ１０を取ることにより、独立変数、時間において均等に間隔をあけた。開いた鞘のパーセントｐを、ロジット変換により変換した（即ち、ロジットｐ ＝ ｌｏｇｅ（ｐ／１００−ｐ））。線形モデルを、次に、変換した時間及びパーセントデータに適合し、半減期を推定するために使用した。
（ｄ）鞘脱粒耐性、脱穀性、及び収率の間の関係ならびに植物における特定の突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在を決定するための野外テスト：突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含むブラシカ系統及び対応する野生型ＩＮＤ対立遺伝子を含むブラシカ系統の鞘脱粒耐性、脱穀性及び収率レベルを、種子脱粒（ＳＨＡＴ）のレベル、コンバイナ収穫能力（ＣＨＡ１）及び脱穀能力（ＣＨＡ２）を定量的な方法で決定及び比較すること、ならびに、組み合わせ後の区画当たりの種子収率（ＹＬＤＰ）及びわらの脱穀後の種子収率（ＹＬＤＳ）を野外で、ｉｎｄ植物を伴う区画と野生型植物を伴う区画の間で決定及び比較することにより半定量的な方法で比較した。区画はスコア１〜９に帰し、収穫前での区画での種子脱粒レベルを示す：スコア１は、区画上の実際的に全ての植物が収穫前に脱粒したことを示し、スコア９は、区画上の実際的に全ての植物が収穫前に脱粒しなかったことを示す。区画はスコア１〜５に帰し、区画でのコンバイナ収穫能力レベルを示す：スコア１まで、３まで、又は５までは、コンバイナを用いて区画収穫することが、困難、実行可能、又は容易であることをそれぞれ示す。区画はスコア１〜５に帰し、区画の脱穀能力レベルを示す：スコア１まで、３まで、又は５までは、コンバイナ収穫後のわらに残る種子を手動で収穫することが、困難、実行可能、又は容易であることをそれぞれ示す。組み合わせ後の区画当たりの種子収率（ＹＬＤＰ：区画当たりのグラムで表わす）を、コンバインハーベスターを用いて区画当たりの種子を収穫し、種子を秤量することにより決定し、わらの脱穀後の種子収率（ＹＬＤＳ；わらの重量%で表わす）を、コンバインハーベスターを用いた種子収穫後にわらに残る種子を手動で収穫することにより決定した。
− 種子鞘の弁縁の細胞がＩＮＤにおける突然変異によりどのように影響を受けるか、及び、影響を受けるか否かをより厳密に検証するために、ｉｎｄ果実の切片を、種子鞘の微視的評価により、野生型果実の切片と比較した。
− 外植片：同様の発生段階（開花後約３５日（ＤＡＡ）、可視的な果皮の黄変の開始と厳密に対応する発生段階）及びサイズの鞘の近位端及び遠位端から採取された外植片（約３ｍｍ）を、植物生育室（各々の遺伝子型について２つの鞘）及び／又は野外で生育させた植物から収穫した。両方の裂開部を鞘から切開した。
− 固定：固定は、１０%ホルマリン及び０．２５%グルタルアルデヒドを伴う１００mM Ｋリン酸バッファー（ｐＨ７）中で合計４時間行った。減圧浸潤を１及び２時間後に１５分間にわたり行った。固定液を各々の減圧浸潤後に新しくした。
− 脱水：試料を２回３０分間、１００mM Ｋリン酸バッファー（ｐＨ７）を用いてリンスした。脱水を、０．８５% ＮａＣｌ水で希釈した技術的エタノールを用いて行った：６０分（‘）（５０%エタノール中）、９０’（７０%エタノール中）、 ９０’（８０%エタノール中）、９０’（９０%エタノール中）、９０’（エタノール中）、９５%（エタノール中）、９０’（１００%エタノール中）、室温。
− 包埋：包埋は、The Leica 7022-31731 Historesin又はKulzer Histo-Technik 7100(Heraeus)包埋キットを用いて行い、それらは３つの構成樹脂（塩基性樹脂、賦活剤、及び硬化剤）キットである。３つの構成要素を、製造者によるアドバイスの通りに、以下の通りに使用した：試料を４時間にわたり５０%エタノール／５０%塩基性樹脂中で、一晩３０%エタノール／７０%塩基性樹脂中で（場合により：４℃で）、２〜４時間にわたり１００%塩基性樹脂中で、１日１００%塩基性樹脂中で（塩基性樹脂を新しくし、２０分間の減圧浸潤後（場合により４℃で））、１日塩基性樹脂＋賦活剤（１%）（「浸潤媒体」）中で（この媒体中での２０分間の減圧浸潤後）インキュベートした。試料を、塩基性樹脂＋賦活剤（１%）＋硬化剤（１５ml中１ml）（「包埋媒体」）を用いて洗浄した。包埋を、平面包埋型中で行った（約３００μlの空洞を伴うＡＧＡＲ平面包埋型Ｇ３５３１：１４mm長×６mm幅×４mm底）：１００〜１２５μlの包埋媒体／空洞を加えて、包埋媒体を５５℃で約１時間にわたり重合して、組織を重合させた包埋媒体上に置き（１外植片／空洞）、空洞を包埋媒体で満たし、包埋媒体を３〜５時間５５℃で重合させ、型を冷まし、プラスチックブロックを型から外し、室温で、密封容器（例、エッペンドルフチューブ）中で保存した。
− 切片作製：プラスチックブロックを、その平面を１cm3のPerspexブロック上において接着して、試料の周囲に四角に切り取った。４μmの切片（３〜４個の外植片／遺伝子型、約２５個の切片／外植片）を、Ralphガラスナイフを用いて（Reichert-Jungのhistoknifemakerの−１位置で６mm厚のガラスロッドを使用して、切断角度約６ｏの下で作った）ミクロトーム上で切った。切片を、Vectabond（Vector laboratories）で処理したガラススライド上に付着させた。
− リグニンの実証：Eukitt中に乗せた未染色切片を、備えられた顕微鏡を使用して蛍光について検証した（Ｚｅｉｓｓフィルターセットを用いて）。リグニンは明らかな青みを帯びた蛍光を発する。
− 組織像の評価：未染色切片を、DIC-Normaski又は自己蛍光を使用することにより可視化した（Zeissフィルターセット１８を用いて −− 励起 BP390-420；放射 LP450）
の通りに分析した。
６．１． ブラシカ植物における１つ又は２つの突然変異ブラシカＩＮＤ対立遺伝子の存在とそれらのブラシカ植物の果実裂開特性の間の相関。
ブラシカ植物におけるホモ接合状態（遺伝子型：ＩＮＤ−Ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１；又はＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）又はヘテロ接合状態（遺伝子型：ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１又はＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）の１つのｉｎｄの存在と、ブラシカ植物の果実裂開特性の間の相関を決定するために、実施例５において同定されたブラシカ植物（特にホモ接合性Ｍ２植物Ｎｏ．ＰＯＳＨ１０１、ＰＯＳＨ１０３、ＰＯＳＨ１０４、ＰＯＳＨ１０５、及びＰＯＳＨ１０６及びヘテロ接合性Ｍ２植物Ｎｏ．ＰＯＳＨ１０５；対応するｉｎｄ対立遺伝子については表４ａ及びｂを参照のこと）の果実裂開特性を温室中で生育させて、上に記載の通りに分析した。表現型及び果実裂開特性における有意な差異は、野生型植物とこれらのヘテロ接合性及びホモ接合性の単一突然変異植物の間で観察されなかった。
分離戻し交雑３（ＢＣ３）からのホモ接合性の単一ｉｎｄ突然変異体（遺伝子型： ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１又はＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）及び野生型植物（遺伝子型：ＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１）を用いた野外テストは、しかし、ホモ接合性の単一ｉｎｄ突然変異植物での種子収率の増加を示した（以下の表を参照のこと）。
Figure 0005956109
６．２． ブラシカ植物における少なくとも３つの突然変異ブラシカＩＮＤ対立遺伝子の存在とそれらのブラシカ植物の果実裂開特性の間の相関。
ブラシカ植物における少なくとも３つの突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の存在とブラシカ植物の果実裂開特性の間の相関を決定するために、実施例５において同定されたブラシカ植物、及び／又はその後代（突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む）を互いに戻し交雑して、後代ブラシカ植物の果実裂開特性を上に記載の通りに分析した。
植物材料
系統５１、系統４５、系統１７６、及び系統４８の後代（即ち、遺伝子型ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１を伴うホモ接合性二重突然変異植物；ホモ接合性の単一及びヘテロ接合性の単一、即ち、遺伝子型ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１及びＩＮＤ−Ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１を伴う三重突然変異植物；及び遺伝子型ＩＮＤ−Ａ１／ＩＮＤ−Ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ＩＮＤ−Ｃ１を伴う野生型植物）は、それ自体が対立遺伝子ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１及びＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０１（系統５１）、対立遺伝子ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１及びＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０３（系統４５）、対立遺伝子ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０５及びＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０１（系統１７６）、及び対立遺伝子ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０５及びＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０３（系統４８）についてそれぞれヘテロ接合性である。
巨視的評価
ａ）肉眼での種子鞘及び植物の検査
− 系統５１、４５、１７６、及び４８に由来する二重ホモ接合性突然変異ＩＮＤ同胞植物（遺伝子型：ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）からの鞘は、既に未熟段階で、野生型ＩＮＤ同胞植物からの鞘と比較して、変化した鞘形態を示した。より具体的には、二重ホモ接合性の突然変異ＩＮＤ同胞植物の鞘は、野生型ＩＮＤ同胞植物からの鞘（明らかに明確な縁を示す）と比較して、適切な弁縁の明確さの欠如（特に果実の近位端及び遠位端の両方で明白である）を示した。さらに、野生型同胞植物における鞘の遠位端の弁とくちばしの間の鮮明な圧入は、二重ホモ接合性ｉｎｄ同胞植物（弁とくちばし組織の間のより漸進的な移行を示す）において大部分が存在しなかった。系統５１の二重ホモ接合性の突然変異ＩＮＤ同胞植物の花は、時々、温室の条件下で変形した花弁を呈した。さらに、系統４５に由来する植物からの鞘は、一般的に、他の系統に由来する植物からの鞘よりも小さかった。このサイズ差異は、系統４５に由来する野生型及び突然変異ｉｎｄ同胞植物の両方において起こるため、それは恐らくはこの系統におけるバックグラウンド突然変異により起こされる。
− ホモ接合状態の１つのｉｎｄ対立遺伝子及びヘテロ接合状態の１つのｉｎｄ対立遺伝子を含む植物からの鞘（遺伝子型：ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１又はＩＮＤ−Ａ１／ ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）は中間の表現型を示した。より具体的には、これらの突然変異ＩＮＤ同胞植物の鞘の弁縁は、一般的に、二重ホモ接合性の突然変異ＩＮＤ同胞植物においてよりも良く定義されたが、しかし、野生型同胞植物における弁と鞘の遠位端のくちばしの間の鮮明な圧入は依然として大部分がこれらの突然変異植物において存在しなかった。
− 表５ａは、野外において生育させた植物からの鞘の表現型に帰せられる視覚的な鞘スコアを示す（上に記載の通り）。
Figure 0005956109
ｂ）手動影響テスト（ＭＩＴ）：
− 系統５１、４５、１７６、及び４８に由来するホモ接合状態の２つの突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む植物からの鞘（遺伝子型：ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）は、完全に鞘脱粒耐性であった（鞘は、強いねじりを適用した後でさえ、裂開部に沿って開かなかった）。
− ホモ接合状態の１つのｉｎｄ対立遺伝子及びヘテロ接合状態の１つのｉｎｄ対立遺伝子を含む植物からの鞘の鞘脱粒耐性（遺伝子型：ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１又はＩＮＤ−Ａ１／ ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）が、それらの野生型同胞植物からの鞘の鞘脱粒耐性と比較して増加していたが、しかし、鞘は、依然として、限られた物理的力を適用することにより裂開部に沿って開くことができた。
− 表５ｂは、野外において生育させた植物からの鞘に帰せられるスコアを示す（上に記載の通りに手動で鞘にねじりを適用することにより閉じた成熟鞘を開くために必要とされる物理的力に基づく）：
Figure 0005956109
ｃ）無作為影響テスト：
− 表５ｃにおいて示す通り、鞘サンプルの半減期（「ＬＤ５０」）は、系統５１に由来するホモ接合性の二重突然変異体からの鞘（遺伝子型ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）において、系統４５に由来するホモ接合性の二重突然変異体よりも有意に高かったが、ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０１対立遺伝子を含むホモ接合性の二重突然変異植物（系統５１）が、ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子を含むホモ接合性の二重突然変異植物（系統４５）よりも鞘脱粒耐性であったことを示す。
− 表５ｃは、さらに、ＬＤ５０値が、一般的に、ホモ接合状態の１つのｉｎｄ−ｃ１対立遺伝子及びヘテロ接合状態の１つのｉｎｄ−ａ１対立遺伝子を含む植物からの鞘（遺伝子型：ＩＮＤ−Ａ１／ ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）において、ホモ接合状態の１つのｉｎｄ−ａ１対立遺伝子及びヘテロ接合状態の１つのｉｎｄ−ｃ１対立遺伝子を含む植物からの鞘（遺伝子型：ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）よりも高かったことを示し、ＩＮＤ−Ｃ１対立遺伝子における突然変異が、ＩＮＤ−Ａ１対立遺伝子における突然変異よりも鞘脱粒耐性に対してより強い効果を有しうることを示す。
Figure 0005956109
ｄ）野外テスト
表５ｄは、種子脱粒（ＳＨＡＴ）のレベル、コンバイナ収穫能力（ＣＨＡ１）、脱穀能力（ＣＨＡ２）、組み合わせ後の区画当たりの種子収率（ＹＬＤＰ）、及びわらの脱穀後の種子収率（ＹＬＤＳ）（示したｉｎｄ植物を伴う野外区画と野生型植物を伴う野外区画について上に記載の通りに決定した）を示す。ＹｉｅｌｄＷＴＳｅｇ%値は、１系統内、即ち、系統５１、４５、１７６、又は４８内の野生型分離個体のパーセントとしてのＹＬＤＰをそれぞれ表わす。
Figure 0005956109
微視的評価：
− 温室条件下で生育させた系統４５に由来するホモ接合状態の２つのｉｎｄ対立遺伝子を含む植物からの鞘（遺伝子型ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）は、完全な裂開部の全体にわたる木化及び周辺の細胞型からの裂開部に属する細胞の不良な分化を示す（例えば維管束組織細胞及び内部鞘壁に通常見出される細胞の木化層（即ち、ｅｎｂ細胞）（「強い形態学的表現型」）など）。同様の鞘表現型が、野外条件下で生育されたこれらの植物について観察された。対照的に、裂開部は依然として十分に分化しており、温室条件下で生育された系統５１に由来するホモ接合状態の２つのｉｎｄ対立遺伝子を含む植物からの鞘（遺伝子型ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１）において大部分が木化していなかったが、しかし、裂開部は余分な木化を示した（そこでは鞘壁が一緒になる）（より弱い形態学的表現型）。野外条件下で生育させたこれらの植物からの鞘は、以下に記載する系統４５に由来する遺伝子型ＩＮＤ−Ａ１／ｉｎｄ−ａ１， ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１を伴う植物からの鞘のもとの同様の木化パターンを示した。ＲＩＴから得られたデータと組み合わせた場合、これらのデータは、これらの植物が「より弱い形態学的表現型」とより高い鞘脱粒耐性とを組み合わせることを示しうる。
− 温室条件下で成育させた系統４５及び５１に由来する、ホモ接合状態の１つのｉｎｄ対立遺伝子及びヘテロ接合状態の１つのｉｎｄ対立遺伝子を含む植物からの鞘（遺伝子型：ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１又はＩＮＤ−Ａ１／ ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１ ／ｉｎｄ−ｃ１）は、顕著な表現型を示さなかった。野外条件下で、系統４５に由来する、遺伝子型ＩＮＤ−Ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１ ／ｉｎｄ−ｃ１を伴う植物からの鞘は、それらのホモ接合性の二重突然変異同胞の植物からの鞘よりも、より微妙な形態学的表現型を呈した（上を参照のこと）。より具体的には、木化は完全な裂開部の全体にわたり起こらず、しかし、これらの植物の鞘が、数個の余分な木化細胞の層を呈するだけであった（そこでは内部鞘壁が、隔壁の両側で対照的に又は片側だけ隔壁に付着する）。同様の鞘表現型が、野外条件下で生育された、系統５１に由来する遺伝子型ＩＮＤ−Ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ｉｎｄ−ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１を伴う植物からの鞘について観察された。系統４５及び５１に由来する遺伝子型ｉｎｄ−ａ１／ｉｎｄ−ａ１、ＩＮＤ−Ｃ１／ｉｎｄ−ｃ１を伴う植物からの鞘は、野外条件下で顕著な表現型を示さなかった。
実施例７ − 突然変異ＩＮＤ遺伝子の検出及び／又は（優良）ブラシカ系統への移入。
突然変異ＩＮＤ遺伝子を（優良）ブラシカ育種系統中に以下の方法により移入する：突然変異ＩＮＤ遺伝子を含む植物（ドナー植物）を、（優良）ブラシカ系統（優良親／反復親）又は突然変異ＩＮＤ遺伝子を欠く品種と交雑する。以下の遺伝子移入計画を使用する（突然変異ＩＮＤ遺伝子はｉｎｄと省略し、野生型はＩＮＤと描写する）：
初回交雑：ｉｎｄ／ｉｎｄ（ドナー植物）×ＩＮＤ／ＩＮＤ（優良親）
Ｆ１植物：ＩＮＤ／ｉｎｄ
ＢＣ１交雑：ＩＮＤ／ｉｎｄ×ＩＮＤ／ＩＮＤ（反復親）
ＢＣ１植物：５０% ＩＮＤ／ｉｎｄ及び５０% ＩＮＤ／ＩＮＤ
５０% ＩＮＤ／ｉｎｄを、分子マーカー（例、ＡＦＬＰ、ＰＣＲ、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）など；以下も参照のこと）を使用して突然変異ＩＮＤ対立遺伝子（ｉｎｄ）について選択する。
ＢＣ２交雑：ＩＮＤ／ｉｎｄ（ＢＣ１植物）×ＩＮＤ／ＩＮＤ（反復親）
ＢＣ２植物：５０% ＩＮＤ／ｉｎｄ及び５０% ＩＮＤ／ＩＮＤ
５０% ＩＮＤ／ｉｎｄを、分子マーカーを使用して突然変異ＩＮＤ対立遺伝子（ｉｎｄ）について選択する。
戻し交雑をＢＣ３からＢＣ６まで繰り返す。
ＢＣ３−６植物：５０% ＩＮＤ／ｉｎｄ及び５０% ＩＮＤ／ＩＮＤ
５０% ＩＮＤ／ｉｎｄを、分子マーカーを使用して突然変異ＩＮＤ対立遺伝子（ｉｎｄ）について選択する。戻し交雑（例、ＢＣ６の代わりにＢＣ３まで）の数を低下させるために、優良親の遺伝的バックグラウンドに特異的な分子マーカーを使用することができる。
ＢＣ３−６ Ｓ１交雑：ＩＮＤ／ｉｎｄ×ＩＮＤ／ｉｎｄ
ＢＣ３−６ Ｓ１植物：２５% ＩＮＤ／ＩＮＤ及び５０% ＩＮＤ／ｉｎｄ及び２５% ｉｎｄ／ｉｎｄ
ｉｎｄを含む植物を、分子マーカーを使用して突然変異ＩＮＤ対立遺伝子（ｉｎｄ）について選択する。突然変異ＩＮＤ対立遺伝子についてホモ接合性である個々のＢＣ３−６ Ｓ１植物（ｉｎｄ／ｉｎｄ）を、分子マーカーを使用して突然変異及び野生型ＩＮＤ対立遺伝子について選択する。これらの植物を次に種子産生のために使用する。
ＩＮＤ対立遺伝子において点突然変異を含む植物を選択するために、当技術分野において公知の標準的な配列決定技術（例えば実施例４において記載するものなど）による直接配列決定を使用することができる。あるいは、ＰＣＲアッセイを開発して、ＩＮＤ対立遺伝子において特定の点突然変異を含む植物をその特定の点突然変異を含まない植物から識別することができる。以下の識別ＰＣＲアッセイをこのように開発して、実施例４において同定した突然変異対立遺伝子の有無及び接合状態を検出した（表４を参照のこと）：
− 鋳型ＤＮＡ：
− ホモ接合性又はヘテロ接合性の突然変異ブラシカ植物（突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含む。以下「ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ」と呼ぶ）の葉材料から単離されたゲノムＤＮＡ。
− 野生型ＤＮＡコントロール：野生型ブラシカ植物（突然変異ＩＮＤ対立遺伝子の野生型等価物を含む。以下「ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ」と呼ぶ）の葉材料から単離されたゲノムＤＮＡ。
− ポジティブＤＮＡコントロール：ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸを含むことが公知であるホモ接合性の突然変異ブラシカ植物の葉材料から単離されたゲノムＤＮＡ。
− 突然変異及び対応する野生型標的ＩＮＤ遺伝子から増幅されたフラグメントのプライマー及び長さを、表６において示す。一般的に、各プライマーは、突然変異及び野生型標的遺伝子に特異的な１つのプライマー（例、プライマーＰＯＳＨ１０１Ｒ２はＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１及びＩＮＤ−Ａ１−ＷＴに特異的である）及びヌクレオチド差異について特異的な１つのプライマー（例、プライマーＰＯＳＨ１０１ＭＦ１はＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１に特異的であり、プライマーＰＯＳＨ１０１ＷＦ１はＩＮＤ−Ａ１−ＷＴに特異的である）。通常、後者のプライマーの最後のヌクレオチドは、ヌクレオチド差異と一致するが（表６における下線を引いたヌクレオチド）、しかし、１つ（又はそれ以上の）追加の標的特異的ヌクレオチドを追加して、プライマーとその標的配列の間のアニーリングを改善してよい（例、プライマーＰＯＳＨ １０８ＭＲ１’中の太字のヌクレオチドを参照のこと。それは、プライマーＰＯＳＨ １０８ＷＲ１’（ＩＮＤ−Ｃ１−ＷＴ対立遺伝子に特異的である）と比較して、ＩＮＤ−Ｃ１−ＥＭＳ０３対立遺伝子に特異的である）。− ＰＣＲミックス：２．５μl １０×ＰＣＲバッファー（１５mM ＭｇＣｌ２）、０．２５μl ｄＮＴＰｓ（２０mM）、１μlフォワードプライマー（１０μM）、１μlリバースプライマー（１０μM）、０．２５μl Ｔａｑポリメラーゼ（５U/μl）、１９．５μl Ｍｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏ、０．５μl ＤＮＡ（２０〜５０ng/μl）＝全容積２５μl；
− サーモサイクリングプロファイル：９５℃で４分間；３０×［９５℃で１分間（変性）そして表６において特定するアニーリング温度で１分間そして７２℃で２分間（伸長）］；７２℃で５分間；４℃に冷却する。最適なアニーリング温度は温度勾配ＰＣＲにより決定したが、それにおいてアニーリング温度は５７℃〜７０℃の間でMJ Research thermocycler PTC-200（Biozym）で変動した。野生型ＩＮＤ特異的プライマーのための最適なアニーリング温度は、予測サイズの明確なＰＣＲフラグメントを、野生型ブラシカ植物からのＤＮＡサンプルについて検出することができるが（以下に記載の通り）、突然変異ブラシカ植物からのＤＮＡサンプルについては検出することができない温度である。突然変異ＩＮＤ特異的プライマーのための最適なアニーリング温度は、予測サイズの明確なＰＣＲフラグメントを、突然変異ブラシカ植物からのＤＮＡサンプルについて検出することができるが（以下に記載の通り）、野生型ブラシカ植物からのＤＮＡサンプルについては検出することができない温度である。
− 増幅後、５μlの添加色素（オレンジ色素）を１５μlのＰＣＲサンプルに加えて、サンプルを１．５%アガロースゲルに添加した。
− 突然変異ブラシカ植物のゲノムＤＮＡの増幅後に得られるバンドパターンを、以下の通りに評価する：
− 単一のＰＣＲ実行及び単一のＰＣＲミックス内での突然変異ブラシカ植物の葉材料から単離されるＤＮＡサンプルからのデータは、以下でない場合、許容すべきではない：
− 野生型ＤＮＡコントロールが、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイにおいて予測サイズのＰＣＲフラグメントを示し、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイにおいて予測サイズのＰＣＲフラグメントを示さない。
− ポジティブなＤＮＡコントロールが、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイにおいて予測サイズのＰＣＲフラグメントを示し、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイにおいて予測サイズのＰＣＲフラグメントを示さない。
− ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイにおいて予測サイズのＰＣＲ産物を示さず、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイにおいて予測サイズのＰＣＲフラグメントを示すレーンが、ゲノム鋳型ＤＮＡが調製された対応する植物が、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸについてホモ接合性突然変異体であることを示す。
− ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイ及びＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイにおいて予測サイズのＰＣＲフラグメントを示すレーンが、ゲノム鋳型ＤＮＡが調製された対応する植物が、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸについてヘテロ接合性突然変異体であることを示す。
− ＩＮＤ−Ｘｘ−ＷＴ特異的ＰＣＲアッセイにおいて予測サイズのＰＣＲフラグメントを示し、ＩＮＤ−Ｘｘ−ＥＭＳＸＸ特異的ＰＣＲアッセイにおいて予測サイズのＰＣＲ産物を示さないレーンが、ゲノム鋳型ＤＮＡが調製された対応する植物が、野生型植物であることを示す。
Figure 0005956109
あるいは、Invader（商標）技術（Third Wave Agbio）を使用して、ＩＮＤ対立遺伝子において特定の点突然変異を含む植物を、その特定の点突然変異を含まない植物から識別することができる。以下の識別Invader（商標）はこのように開発されて、実施例４において同定された突然変異対立遺伝子の有無及び接合状態を検出した（表７を参照のこと：
− 突然変異又は対応する野生型標的ＩＮＤ遺伝子（「５’ｆｌａｐ１−ｘ」及び「５’ｆｌａｐ２−ｘ」とそれぞれ示す）及びそれらの組み合わせで使用することができる「侵入」プローブを表７において示す。一般的に、各々のプローブセットは、５’ｆｌａｐ配列の後の第１ヌクレオチドがヌクレオチド差異に一致する突然変異又は野生型標的遺伝子に特異的な１つのプローブ（表７において下線を引いたヌクレオチド）（いわゆる「一次プローブ」；例、配列番号２６を伴うプローブはＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１に特異的であり、配列番号２７を伴うプローブはＩＮＤ−Ａ１−ＷＴに特異的である）及びヌクレオチド差異の上流のヌクレオチドに特異的な１つのプローブ（いわゆる「invader（登録商標）oligo」；例、配列番号２５を伴うプローブは、ＩＮＤ−Ａ１−ＥＭＳ０１とＩＮＤ−Ａ１−ＷＴの間のヌクレオチド差異の上流のヌクレオチドに特異的である）からなる。後者のプライマーの最後のヌクレオチドは、突然変異体におけるヌクレオチド差異と一致しうるが（表６における太字のヌクレオチドにより示す）、しかし、他のヌクレオチドも、一次プローブ及びinvade（登録商標）oligoが、依然として標的ＤＮＡにハイブリダイズしてCleavase（登録商標）酵素（Third Wave Agbio）により認識される特定の侵入構造を生成する場合に単一塩基重複を形成することができる限り、この最後のヌクレオチドのために使用してよい。
− Invader（商標）アッセイ手順及びデータの解釈を、製造者（Third Wave Agbio）により規定される通りに実施する。簡単に説明すると、表７において「ｆｌａｐ１」及び「ｆｌａｐ２」と示されるヌクレオチド配列は、Invader（商標）アッセイの一次段階において一次プローブから切断され、FRET（商標）カセット１及び２における配列とそれぞれ相補的であり、そして標的突然変異体又は野生型配列と相補的ではない５’「ｆｌａｐｓ」の配列を表わす。一次プローブが一次段階において切断され、ｆｌａｐ１プローブ及び／又はｆｌａｐ２プローブがFRET（商標）カセット１及び２にそれぞれ第二段階においてハイブリダイズする場合、突然変異又は対応する野生型標的ＩＮＤ遺伝子のサンプル中での存在を示唆するシグナルがそれぞれ生成される。
Figure 0005956109

Claims (3)

  1. 少なくとも２つのＩＮＤ遺伝子を含み、そしてそのゲノム中で３つの突然変異ＩＮＤ対立遺伝子および１つの野生型ＩＮＤ対立遺伝子を含み、ここで該突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は
    以下：
    （ａ）配列番号１、配列番号３のヌクレオチド位置４６〜ヌクレオチド位置６３３、配列番号３、配列番号５、又は配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を含む核酸分子；
    （ｂ）配列番号２、配列番号４のアミノ酸位置１６〜アミノ酸位置２１０、又は配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードする核酸分子からなる群より選択された野生型ＩＮＤ遺伝子から生成され、
    ここで、該突然変異ＩＮＤ対立遺伝子は、機能的ＩＮＤタンパク質をコードせず、そして
    植物は、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含まない対応する植物の種子の収率と比較して種子の収率が増加し、
    植物の種子脱粒が、突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を含まない対応する植物の種子脱粒と比較して有意に低下又は遅延し、
    植物は、農学的に関連する鞘の脱穀性を維持している、ブラシカ植物、又は細胞、部分、種子もしくは後代。
  2. 突然変異ＩＮＤ対立遺伝子が、
    （ａ）配列番号２の位置１２２に対応する位置でＧＬＮをコードするコドンが終始コドンに置換されている核酸分子；
    （ｂ）配列番号２の位置１０３に対応する位置でＡＳＰをコードするコドンがＡＳＮコドンに置換されている核酸分子；
    （ｃ）配列番号４の位置５０に対応する位置でＧＬＮをコードするコドンが終始コドンに置換されている核酸分子；および
    （ｄ）配列番号４の位置１３５に対応する位置でＧＬＮをコードするコドンが終始コドンに置換されている核酸分子
    からなる群より選択される、請求項１記載の植物。
  3. 種子鞘の種子が、請求項１又は２に記載する突然変異ＩＮＤ対立遺伝子を３つ含む、請求項１又は２記載の植物から入手可能な種子鞘。
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