CN103898125A - 包含突变indehiscent等位基因的芸苔属植物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及其果实开裂性质经调节的作物植物。更具体地，本发明涉及改进的方法和手段，用于在植物中降低落籽或者延迟落籽直至收获之后，同时保持荚果的农艺相关可脱粒性。
Description
本申请为2008年11月25日提交的、发明名称为“包含突变INDEHISCENT等位基因的芸苔属植物”的PCT申请PCT/EP2008/010147的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2010年7月27日，申请号为200880125655.4。
发明领域
本发明涉及农业产品，尤其是作物植物领域，特别是十字花科(Brassicaceae)，特别是芸苔属的物种，其中，果实开裂性质被调节。更具体地，本发明涉及改进的方法和手段，用于在植物例如十字花科植物，特别是种植来用于种子生产的十字花科植物中，降低落籽(seed shattering)或延迟落籽到收获之后，同时保持荚果的农艺相关的可脱粒性(treshability)。本发明提供了编码芸苔属INDEHISCENT蛋白质(IND)的野生型和突变核酸分子以及此类的蛋白质。本发明还提供了包含至少两种IND基因的芸苔属植物，特别是欧洲油菜(Brassica napus)植物，及其细胞、部分、种子和后代，其特征在于，它们在其基因组中包含三个完全敲除型突变ind等位基因，由此果实开裂性质被显著改变。此外，本发明提供了产生下述芸苔属植物的方法，其中落籽被降低，或者其中，落籽被延迟到收获之后，同时优选保持荚果的农艺相关的可脱粒性，还提供了可从此类植物获得的种荚果和种子。本发明还提供了检测工具(试剂盒)和方法，用于检测生物样品中一个或多个突变ind和/或野生型IND等位基因的存在，以及将一个或多个突变ind和/或野生型IND等位基因转移至其它植物的方法，和在植物中组合不同ind和/或IND等位基因的方法。特别地，组合合适数量的突变ind等位基因(编码无功能IND蛋白质或者不编码IND蛋白质和/或编码具有显著降低的体内活性的IND蛋白质)的方法，所述组合的方式使得显著降低落籽，或者延迟落籽到收获之后，同时保持荚果的农艺相关的可脱粒性。除此之外，本发明还提供了植物或其部分和/或其后代、种子和种子油以及方法和/或试剂盒的用途。本发明还提供了增加产量，特别是谷粒产量和种子产量的方法和手段。产量增加表型可与降低或延迟的落籽表型分离开。
发明背景
来自芸苔属植物的长角果或荚果在被称为果实开裂的过程中释放其种子。长角果由边缘相连的两片心皮构成。边缘之间的缝线形成厚的棱，被称为假隔膜(replum)。随着荚果接近成熟，两片裂爿(valve)沿着荚果中脆弱的指定线，从假隔膜逐渐分离，最终导致与假隔膜相连结种子的落粒(shattering)。开裂区界定了裂爿解离的精确位置。
在作物收获之前或期间，成熟荚果的种子脱落(shedding)(也被称为“落籽”或“荚果掉果”)是发育出干的开裂果实的作物的普遍现象。未成熟的落籽导致降低的种子回收，这对于主要为了种子而种植的作物(例如产油的芸苔属植物，特别是油菜)而言是个问题。与未成熟落籽相关的另一问题是下一作物年中的自生生长(volunteer growth)的增加。在油菜中，荚果掉果相关的产量损失为平均20％(Child等人，1998，J Exp Bot 49：829-838)，但是能够达到50％，这取决于气候条件(MacLeod，1981，Harvesting in Oilseed Rape,pp.107-120 Cambridge AgriculturalPublishing，Cambridge)。目前的商业油菜品种对落粒极其易感。在欧洲油菜(B.napus)的现有育种程序中，对落粒的抵抗性鲜有变化，但是在欧洲油菜的二倍体亲本(甘蓝(B.oleraceae)和芜青(B.rapa)以及芸苔属的其它成员中(明显地芥菜(B.juncea)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)和黑芥(B.nigra))已发现了抗性品系。Kadkol等人(1986，Aust.J.Botany 34(5)：595-601)报道称，在芸苔(B.campestris)的某些登记种中，对落粒的抗性增加，这与长角果裂爿与假隔膜的连结区域中不存在分离层相关。Prakash和Chopra(1988.Plant breeding 101：167-168)描述了欧洲油菜中通过非同源重组来自芥菜(Brassica.juncea)的落粒抗性的渐渗现象。Spence等人(1996。J 0fMicroscopy 181：195-203)描述了芥菜的一些品系显示出较之欧洲油菜品系降低的落粒倾向。Morgan等人，1998(Fields Crop Research58.153-165)描述了从合成的欧洲油菜发展而来的油菜品系间荚果掉果抗 性的遗传变化，并且推断，需要很大能量开启其荚果的品系看起来在开裂区具有增加的维管化，并且在开裂区内具有降低的细胞壁降解。他们还进一步发现了荚果喙(pod beak)长度和导致荚果掉果所需的力之间显著的负相关。Child和Huttly(1999，Proc10th Int.Rapeseed Congress)描述了在放射诱导的突变欧洲油菜及其亲本栽培种Jet Neuf的种群中荚果成熟的变化，其中，最具抗性的野生型和突变植物显示出遍布开裂区的细胞群体的高度木质化，并且其中，定位于接近突变体开裂区内边的维管导管(vascular traces)被描述为有助于保护裂爿。Child等人(2003，J Exp Botany54(389)：1919-1930)还描述了在再合成的欧洲油菜品系的荚果中增加的荚果掉果抗性和维管结构改变之间的关联。但是，传统育种方法未能在不干扰其它想要性状(例如早开花、成熟和黑腿病(blackleg)抗性)的同时向欧洲油菜(rape)栽培种中成功引入落粒抗性(Prakash和Chopra，1990，Genetical Research56：1-2)。
已通过突变体分析在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中鉴定出了促进或抑制荚果开裂的若干基因：在SHATTERPROOF1(SHP1；最初被称为AGL1)和SHATTERPROOF2(SHP2；最初被称为AGL5)二者中的组合突变体导致不开裂的长角果(即，在拟南芥中成熟时保持闭合的长角果)(Liljegren等人，2000，Nature404，766-770)。类似地，在拟南芥中的INDEHISCENT基因(被称为IND1)(Liljegren等人，2004，Cell116：843-853；PCT公开WO01/79517)中以及ALCA TRAZ(被称为ALC；Raiani等人2001，Current Biology11，1914-1922)中的突变干扰了荚果开裂，导致荚果掉果抗性。SHP和IND的阻遏子FRUITFUL(FUL)在拟南芥中的组成型表达也导致不开裂的长角果(Ferrandiz等人，2000，Science，289，436-438)。这些转录因子被认为会形成非线性转录网络，控制裂爿边缘同一性和荚果掉果。Liljegren等人(2004，Cell116：843-853)还描述称，在拟南芥中，非典型的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)基因IND指导裂爿边缘分化成分离层和木质化层。与分离层相邻的木质化细胞沿着内果皮b层的层(每片裂爿中的单木质化细胞层)在干燥果实内产生了弹簧样的张力， 作用于其开口。裂爿内果皮b层的木质化需要IND、SHP、ALC和FUL(在裂爿中到处表达的MADS结构域转录因子)的活性(Liljegren等人，2004，见上；Mandel和Yanofsky，1995，Plant CeII7，1763-1771)。已发现，FUL和REPLUMLESS(RPL)(在假隔膜中表达的同源异型域转录因子)(Roeder等人，2003，Curr BioI13，1630-1635)设置了赋予裂爿边缘同一性的基因的边界(Gu等人，1998，Development125，1509-1517；Ferrandiz等人，2000，Science，289，436-438；上文的Roeder等人，2003)。最后，FILAMENTOUS FLOWER(FIL)和YABBY3(YAB3)——两个YABBY家族的转录因子(Sawa等人，1999，Genes Dev13，1079-1088；Siegfried等人，1999，Development126，4117-4128)和JAGGED(FAG)——C2H2锌指转录因子(Dinneny等人，2004，Development131，1101-1110；Ohno等人2004，Development131，1111-1122)被鉴定为通过促进FUL和SHP以区域特异性方式的表达，冗余性地作用于正确的裂爿和裂爿边缘发育(Dinneny等人，2005，Development132，4687-4696)。还已鉴定出了针对大量水解酶(例如内多聚半乳糖醛酸酶，其在来自芸苔属植物的荚果中开裂区的程序化损坏中，在荚果开裂期间，具有重要作用)的基因(见例如WO97/13865；Petersen等人，Plant.Mol.Biol.，1996，31：517-527)。
Liljegren等人(2004，Cell116：843-853)描述了拟南芥属IND的五种突变等位基因。在包含这些突变等位基因的植物中存在或不存在开裂区中的木质化细胞，这取决于突变的严重程度(严重的ind突变体在对应于野生型植物中裂爿边缘的内部部分的区域中不含木质化细胞)，但是在所有情况下，长角果都是不开裂的。Wu等人(2006)，Planta224，971-979)描述了第六种拟南芥属IND突变等位基因。包含该突变等位基因的植物显示出在裂爿边缘和假隔膜的连接处没有木质化细胞，在七层细胞的区域中含有较少细胞(其看起来包括野生型植物中公知的开裂区和假隔膜边缘)，并且展示出该层中不完全的胞质分裂。
US2005/0120417和US2007/0006336描述了从欧洲油菜中鉴定和分离两种IND1直向同源物。
WO99/00503、WO01/79517和WO0159122描述了使用基因沉默技术(例如反义遏制或共遏制)和诱变对拟南芥属ALC、IND、AGL1和AGL5基因及其直向同源物表达的下调。
Vancanneyt等人，2002(XIII International Conference on ArabidopsisResearch，Sevilla，Spain June28-July2；2002)报道，在油菜中在CaMV35S启动子的控制下表达来自拟南芥的FUL，导致产生多种荚果掉果抗性转化体。此类荚果掉果抗性品系的荚果没有开裂区，荚果的开口仅能通过应用相当大的压力随机破裂裂爿来实现。
Vancanneyt等人，2002(XIII International Conference on ArabidopsisResearch，Sevilla，Spain June28-July2；2002)还报道，使用所谓的dsRNA沉默技术在拟南芥中沉默IND基因，导致几乎完全的荚果掉果抗性。98％的转基因拟南芥属品系发展出不沿着裂爿缝线开口的长角果，其仅能通过向裂爿应用相当大的压力而开口。
重要的是要认识到，尽管落籽在油菜培养中是重要问题，其可通过开发荚果掉果抗性品系来解决，最终仍需要将种子与荚果分离。在正常农业实践中，这是通过组合收割机对荚果脱粒来实现的。通过组合收割机对荚果脱粒必须进行完全，并且应当对由此释放的种子仅造成最小限度的损伤。但是，随着荚果强度的增加，对其脱粒所需的更强的动作导致对种子的损伤水平不可接受。荚果掉果抗性十字花科植物的荚果由此不应强到使其无法在组合收割机中被脱粒的程度(Bruce等人2001，J.Agric.Engng Res.80，343-350)。
WO2004/113542描述了对十字花科植物中涉及荚果开裂区和裂爿边缘发育的基因的中等dsRNA基因沉默允许分离出具有增加的荚果掉果抗性和降低的落籽的转基因品系，但是通过施加有限的物理力，其荚果仍可沿着开裂区开口。
尽管本领域中可获得特定IND基因的序列及其突变序列，特别是拟南芥属和欧洲油菜IND基因序列和突变拟南芥属IND基因序列，但是人们仍需要更多IND基因序列，例如，在植物(例如欧洲油菜植物)中实现特 别想要的对落籽的修饰。在经济重要的十字花科植物(例如油菜)中对对应于ind的突变等位基因的分离是费时费力的任务。此外，油菜中双二倍性以及相应基因随之的功能冗余使得此类分离复杂化。
如发明内容、附图、发明详述、实施例和权利要求中描述的多种实施方式所指出的，通过本发明实现了这些和其它目的。
发明内容
本发明的发明人发现，可通过控制在种子荚果中“功能性表达(即导致产生功能性(生物活性)IND蛋白质)”的IND基因/等位基因的数量，来控制芸苔属植物中的果实开裂性质。通过组合多种完全敲除型突变IND等位基因(“ind等位基因”)，同时保持最小数量的野生型IND等位基因，产生最小水平的功能性IND蛋白质，可对种子荚果的开裂性质加以修饰，更具体地，可增加荚果掉果抗性，可降低落籽，或者可将落籽延迟到收获之后，同时保持荚果的农艺相关的可脱粒性，使得通过应用有限的物理力，荚果仍可沿着开裂区开口。我们认为，需要最小数量的野生型IND等位基因，以使得种子仍能与荚果分离，特别是通过组合收割机对荚果进行脱粒，使得对荚果的脱粒进行完全，并且对由此释放的种子的损伤最小。
因此，在一个方面，本发明提供了包含至少两个IND基因的芸苔属植物，特别是欧洲油菜植物(及其部分，例如种子荚果和种子)，其特征在于，其在其基因组中包含3个完全敲除型突变IND等位基因，特别是IND-A1和/或IND-C1基因的，并且，其中，植物的荚果掉果抗性较之不包含突变IND等位基因的植物的荚果掉果抗性而言显著增加，但是其中，植物优选保持荚果的农艺相关的可脱粒性。
在另一方面，本发明提供了编码野生型和/或突变IND蛋白质的(经分离的)核酸序列及其片段，以及使用这些核酸序列修饰植物的果实开裂性质的方法。本发明还提供了蛋白质本身及其用途。
本发明还涉及植物及其细胞、部分、种子和后代，其中包含至少一个完全敲除型突变IND等位基因，以及由此导致的较之包含编码相应功能性 IND蛋白质的IND等位基因的植物及其细胞、部分、种子和后代而言降低的量的功能性IND蛋白质。此类植物及其细胞、部分、种子和后代可用于获得具有经修饰的果实开裂性质的植物，特别用于获得具有显著降低的落籽并且保持荚果的农艺相关的可脱粒性的芸苔属植物。在本文中使用时，“植物部分”包括源于本发明植物的任何物体，包括植物部分，例如，细胞、组织、器官、种子、种子荚果、种子粗粉(seed meal)、种子饼(seed cake)、种子脂肪或油。
在另一方面，本发明涉及具有经修饰的落粒抗性的种子荚果，其可从根据本发明的植物获得，本发明还涉及所述种子荚果的用途，例如用于栽种和种植来自植物的后代。
在本发明的又一方面，提供了产生和选择含有至少一个完全敲除型ind等位基因的植物及其细胞、部分、种子和后代的方法。特别地，提供了下述方法，用于产生和选择包含至少两个IND基因的芸苔属植物(特别是欧洲油菜植物)及其细胞、部分、种子和后代，其中含有存在于基因组中至少两个不同IND基因座中至少一个处的至少一个完全敲除型突变ind等位基因，例如位于芸苔属IND-A1和IND-C1基因的两个不同基因座中至少一个处，以及用于区分突变ind等位基因和野生型IND等位基因在植物或植物部分中的存在。因此，提供了用于产生和/或鉴定ind等位基因或包含此类等位基因的植物或植物部分，以及用于将合适数量的ind等位基因和/或不同类型的ind等位基因组合于单株植物中由此显著修饰该植物的果实开裂性质的方法(例如诱变和/或标记辅助选择)。
在本发明的另一实施方式中，用本发明的突变IND等位基因增加从芸苔属植物收获的种子或谷粒的产量。增加的产量可以是降低或延迟落籽的结果，但其也可独立于降低或延迟的落籽。特别地，提供了包含至少两个IND基因的芸苔属植物或其细胞、部分、种子或后代，其特征在于这些植物在其基因组中包含如本文所述的两个突变纯合IND等位基因。
图例
图1：编码来自欧洲油菜的野生型IND-A1蛋白质的IND-A1基因的图示(SEQ ID NO：5)
图2：编码来自欧洲油菜的野生型IND-C1蛋白质的IND-C1基因的图示(SEQ ID NO：7)
图1和图2中，实施例中描述的突变的位置(根据实施例中描述的其各自的“ind-xl-EMSxx”名称为“EMSxx”)以垂直线示出；IND特异性探针的长度和位置(根据其各自的SEQ ID NO：xx称为“ID xx”)通过1ND基因图示下的水平线示出；IND特异性引物的位置(根据其各自的SEQ IDNO：xx称为“ID xx”)以箭头示出。
一般性定义
“增加荚果掉果(pod shatter)抗性”和“降低荚果掉果”在本文中使用时指芸苔属植物的减少的落籽趋势和/或落籽时机的延迟，特别是延迟到收获之后，所述植物的果实正常情况下不同步成熟，而是顺序成熟，因此一些荚果爆裂开，在收获之前或期间脱离其种子。对荚果掉果的抗性水平与“张力分离测试”中破坏荚果所需的力(Davies和Bruce，1997，J Mat Sci32：5895-5899；Morgan等人，1998，Fields Crop Research58，153-165)，“随机冲击测试(random impact test)”中例如20秒(“IP20”；上文所述Morgan等人，1998)、9.7或17秒(Bruce等人，2002，Biosystems Eng81(2)：179-184)之后剩下的完整荚果的数量，随机冲击测试中荚果样品的半寿期(“LD50”，即，在测试的荚果样品中使得50％的荚果开口所需的处理时间)和“落粒的田间计分”(上文所述Morgan等人，1998)正相关，并可通过例如测定它们来测量所述水平。随机冲击测试(RITs)和在此类RITs中界定荚果样品半寿期的算法已被描述于Bruce等人，2002(上文)、Morgan等人，1998(上文)和下文实施例中。两份公开文件都通过引用并入本文。简言之，将完整成熟荚果的样品放在有钢球的封闭鼓室中，然后剧烈振荡鼓室，振荡时间逐渐增加(例如10秒、20秒、40秒、80秒)。每段时间后，开启鼓室，对被破坏和损伤的荚果的数量加以计数。通过将线性x线性曲线拟 合至所有可获得的数据，估计样品中一半的荚果被破坏所需的时间(“荚果半寿期”或“LD50”)，来计算每种品系的落粒抗性水平的最为精确的估计。但是重要的是，荚果主要沿着开裂区开口，并不如不开裂的荚果可能发生的那样简单地粉碎。
“荚果掉果抗性的农艺相关的增加”在本文中使用时指植物中荚果掉果抗性的增加，导致田间(收获前)荚果掉果相关产量损失低于针对该植物在田间通常观察到的那样。对于油菜而言，田间荚果掉果相关的产量损失被报道为：对于具有平均良好生长条件的季节而言，大约11％；以及对于具有平均不良生长条件的季节而言，大约25％。如Bruce等人，2002(Biosystems Eng81(2)：179-184)所描述的，在随机冲击测试中，在这些种子损失水平和分别9.7秒及17秒的处理时间时的种子损失水平之间存在正相关。或者，为确定植物中荚果掉果抗性水平是否是农艺相关的，可将植物的荚果样品半寿期(“LD50”，见上文)与已知具有平均荚果掉果抗性水平的植物(例如对油菜而言，所有目前可商业获得的油菜品种)的荚果样品半寿期加以比较。
在本文中使用时，“荚果掉果(pod shattering)或落籽(seed shattering)”或“果实或荚果开裂”指在种子成熟之后发生于果实中的过程，其中，裂爿从中隔膜(septum)分开，释出种子。破坏的区域(即“开裂区”)沿着裂爿和假隔膜(外隔膜)之间的果实全长延伸。成熟时，“开裂区”实质上(essentially)是裂爿和假隔膜中的木质化细胞区域之间的非木质化的层。由于开裂区的细胞壁松弛和长角果中干燥细胞的差异性机械性质建立的张力的组合，导致开裂发生。
在本文中使用时，芸苔属“果实”指芸苔属植物的从融合的心皮构成的雌蕊群发育来的器官，其在受精后生长成为含有发育中的种子的“(种子)荚果”或“长角果”。芸苔属“(种子)荚果”或“长角果”由果实的壁(心皮)构成，其包括由隔膜分开的两个子囊腔(locule)。“开裂区”在与隔膜相邻的心皮边缘发育，并沿着长角果的长度延伸。开裂区的细胞最终开始降解，这削弱了心皮壁或裂爿与隔膜之间的联系。细胞黏着的损失限于开裂区的 细胞，其是中层损坏导致的(Meakin和Roberts，1990，J Exp Bot41，995-1011)。
“开裂区”在本文中使用时指植物(特别是芸苔属植物)的双裂爿荚果两侧上的缝线中含有的简单的薄壁组织细胞层。开裂区位于荚果的裂爿边和中心假隔膜之间(含有通向柄(stalk)或花梗的主维管束)。开裂区中细胞的脱离在荚果衰老期间发生，其在荚果达到完全成熟的时候完成(上文的Meakin和Roberts，1990)。然后可发生裂爿分离。开裂区含有维管导管，其从荚果壁延伸到花梗(柄)和假隔膜。荚果掉果的过程仅在外力破碎易损的维管细导管(vascular thread)之后发生，令裂爿分离，种子落到地面。这在株冠(canopy)干扰期间发生，例如通过将收获期间的接触和联合收割。维管组织含有增厚的木质化细胞，其形成厚角细胞群，它们被发现与传导细胞相邻(上文的Meakin和Roberts，1990)。这向组织提供了刚性，并且假定地，对破碎的一定抗性。
在本文中使用时，“农艺相关的可脱粒性”指荚果，特别是油菜的荚果在允许荚果完全开口的物理力施加时对沿着荚果的开裂区开口同时伴随种子释放的抗性，同时防止对种子的损伤，例如当它们用于联合收割机中时。已经在随机冲击测试中的荚果样品半寿期(“LD50”)与其可脱粒性之间发现了正相关。油菜荚果样品半寿期(按照实施例所述进行的PIT中测定的)(其对应于农艺相关可脱粒性)应当不超过80秒。对于商业可获得的油菜品种的控制品系而言，典型的样品半寿期值为大约10秒。因此，具有显著增加的荚果掉果抗性的具有农艺相关可脱粒性的品系在RIT中具有大约10至大约80秒之间，大约10至大约60秒之间，大约10至大约50秒之间，大约20至大约60秒之间，大约20至大约50秒之间，大约40至大约60秒之间，大约57秒的荚果样品半寿期。
“作物植物”指作为作物栽培的植物物种，例如欧洲油菜(AACC，2n＝38)、芥菜(AABB，2n＝36)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)(BBCC，2n＝34)、芜青(Brassica rapa)(同义词，芸苔)(AA，2n＝20)、甘蓝(Brassica oleracea)(CC，2n＝18)或黑芥(Brassicanigra)(BB，2n＝16)。 该定义并不包括杂草，例如拟南芥。
术语“核酸序列(或核酸分子)”指单链或双链形式的DNA或RNA分子，特别是编码根据本发明的蛋白质或蛋白质片段的DNA。“内源核酸序列”指植物细胞内的核酸序列，例如存在于芸苔属细胞的核基因组中的IND基因的内源等位基因。“经分离的核酸序列”用于表示不再处于其天然环境中的核酸序列，例如，体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。
术语“基因”指细胞中的下述DNA序列，其中包含有被转录为RNA分子(例如前mRNA，包含内含子序列，其再被剪接为成熟的mRNA，或者直接转录为没有内含子序列的mRNA)的区域(被转录的区域)，其与调控区域(例如启动子)有效相连。因此，基因可以包含一些有效的连接的序列，例如启动子、包含例如翻译起始涉及的序列的5’前导序列，(蛋白质)编码区(cDNA或基因组DNA)和包含例如转录终止位点的3’非翻译序列。“内源基因”用于与“外来基因”、“转基因”或“嵌合基因”区分，指来自某植物属、物种或品种的植物的基因，不是通过转化引入植物的(即，不是“转基因”)，而是通常存在于所述植物属、物种或品种的植物中的，或者是从其通常存在的另一种植物属、物种或品种的植物中，通过普通的育种技术或通过体细胞杂交(例如，通过原生质体融合)，引入到植物中的。相似的，基因的“内源等位基因”不是通过植物转化引入到植物或植物组织中的，而是例如通过植物诱变和/或选择产生的，或通过筛选天然的植物群体获得的。
“表达基因”或“基因表达”指这样的过程，其中与合适的调控区(特别是启动子)有效连接的DNA区域，转录成RNA分子。然后，RNA分子在细胞内被进一步加工(通过转录后过程)，例如，通过RNA剪接和翻译起始，翻译成氨基酸链(多肽)，并且通过翻译终止密码子结束翻译。术语“功能性表达”在本文中用于表示生产了功能性蛋白质，术语“非功能性表达”表示生产的蛋白质具有显著降低的或没有功能(生物学活性)，或者未生产蛋白质(也参见下文)。
术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，其表示由氨基酸的链构成的分子， 无关特定作用模式、大小、3维结构或来源。IND蛋白质的“片段”或“部分”因此仍可被称作“蛋白质”。“经分离的蛋白质”用于表示不再处于其天然环境中的蛋白质，例如体外或在重组细菌或植物宿主细胞中。术语“转录因子”用于表示由至少两个不同结构域——DNA结合结构域和活化或阻遏结构域构成的蛋白质，它们一共运作，以调节从靶基因启动子转录起始的速率(Ptashne，1988，Nature335，683-689)。术语“碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域转录因子”用于表示这样的转录因子，其除了包含bHLH DNA结合结构城(Heim等人，2003，Mol Biol Evol20，735-747；Toledo-Ortiz等人，2003，Plant Cell15，1749-1770)之外，还包含已知对于调控基因表达来说重要的结构域，其在氨基酸水平上在来自不同物种的相关蛋白质中可能是保守的(Quong等人，1993，Mol Cell Biol13，792-800)。包含bHLH结构域的转录调控子通过碱性区域中的残基结合DNA，同时螺旋-环-螺旋结构域促进二聚化，允许家族成员形成异源或同源二聚体(Murre等人，1989，Cell56，777-783)。
术语“IND基因”在本文中表示编码INDEHISCENT(IND)蛋白质(其是种子散布所需的bHLH结构域转录因子)的核酸序列(Liljegren等人，2004，Cell116：843-853)。
在本文中使用时，术语“等位基因”表示在特定基因座上的基因的一种或多种备选形式。在生物的二倍体(或双二倍体)细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座上。同源染色体对的每条染色体上存在一个等位基因。
如本文中使用的，术语“同源染色体”意指这样的染色体，所述染色体含有相同生物学特征的信息，在相同基因座上含有相同的基因，但可能是这些基因的不同等位基因。同源染色体是在减数分裂过程中成对的染色体。“非同源染色体，，代表了生物体的所有生物学特征，形成一组，而细胞内的组数被称为倍性。二倍体生物含有两组非同源染色体，其中每组同源染色体继承自不同的亲本。在双二倍体物种中，实质上存在两组二倍体基因组，从而将两组基因组的染色体称为部分同源染色体(相似的，两组基因组的 基因座或基因被称为部分同源基因座或基因)。二倍体或双二倍体的植物品种在特定的基因座可以包含大量的不同等位基因。
在本文中使用时，“杂合”表示这样的遗传条件，此时在特定基因座上存在两种不同的等位基因，它们各自位于细胞中同源染色体的相应的对上。相反，在本文中使用时，术语“纯合”表示这样的遗传条件，此时在特定基因座上存在两个相同的等位基因，它们各自位于细胞中同源染色体的相应的对上。
在本文中使用时术语“基因座”表示染色体上发现了例如基因或遗传标记的特定位置或位点。例如，“IND-A1基因座”表示A基因组的染色体上可发现IND-A1基因(两种IND-A1等位基因)的位置，“IND-C1基因座”表示C基因组的染色体上可发现IND-C1基因(两种IND-C1等位基因)的位置。
根据本发明中无论何时提到“植物”，均应当理解，除非另有指明，此时还包括植物部分(细胞，组织或器官，种子荚果，种子，已分离的部分例如根、叶、花、花粉等等)，保留有亲本的区别性特征(尤其是果实开裂性质)的植物后代，例如，通过自交或杂交获得的种子，例如杂交体种子(通过将两种近交亲本品系杂交获得的)，从其获得的杂交体植物和植物部分。
“分子测定(或测试)”在本文中表示这样的测定，其指示(直接或间接)一种或多种特定IND等位基因是否存在于一个或两个IND基因座(例如，一个或两个IND-A1或IND-C1基因座)上。在一种实施方式中，其允许人们确定任何个体植物中的基因座上特定(野生型或突变)等位基因是纯合还是杂合的。
“野生型”在本文中使用时表示植物或基因在自然界最常出现的典型形式。“野生型植物”指具有此类植物在天然种群中最常见表型的植物。“野生型等位基因”指产生野生型表型所需的基因等位基因。相反，“突变植物”指具有此类植物在天然种群中的不同的稀少表型的植物，或通过人类的干涉，例如通过诱变产生的植物，并且“突变等位基因”表示产生突变表型所 需的基因等位基因。
在本文中使用时，术语“野生型IND”(例如野生型IND-A1或IND-C1)表示在植物(特别是十字花科植物，尤其是芸苔属植物)中发现的天然存在的IND等位基因，其编码功能性IND蛋白质(例如，分别地，功能性IND-A1或IND-C1)。相反，术语“突变IND”(例如突变IND-A1或IND-C1)在本文中使用时表示不编码功能性IND蛋白质的IND等位基因，即，编码非功能性IND蛋白质(即，分别是非功能性的IND-A1或IND-C1)，或者根本不编码lND蛋白质的IND等位基因，非功能性IND蛋白质在本文中使用时指不具有生物活性或较之相应野生型功能性IND蛋白质而言具有显著降低的生物活性的IND蛋白质。此类“突变IND等位基因”(也被称为“完全敲除型”或“无效”等位基因)是野生型IND等位基因，其在其核酸序列中包含一处或多处突变，其中所述突变优选在细胞中体内产生显著降低(绝对或相对)的功能性IND蛋白质的量。在本文中使用时，“完全敲除型IND等位基因”是突变IND等位基因，其在植物(例如具有两个完全敲除型IND-A1等位基因和两个完全敲除型IND-C1等位基因的欧洲油菜植物)中每个IND基因座上以纯合状态的存在导致该植物中的荚果掉果抗性的增加，其高到不能仍然保持农艺相关。编码IND蛋白质的核酸序列的突变等位基因在本文中被命名为“ind”(例如分别为ind-al或ind-cl)。突变等位基因可以是“天然突变”等位基因，这是在自然界发现的突变等位基因(例如没有人应用诱变剂的情况下自发产生的)，或者“诱导的突变”等位基因，这是通过人干涉诱导的，例如通过诱变。
“显著降低的功能性IND蛋白质的量”(例如功能性IND-A1或IND-C1蛋白质)指包含突变IND等位基因的细胞生产的功能性IND蛋白质的量较之不包含突变IND等位基因的细胞生产的功能性IND蛋白质的量而言降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(即，细胞不生产功能性IND蛋白质)。该定义包括：产生不具有体内生物活性的“非功能性”IND蛋白质(例如截短的IND蛋白质)，功能性IND蛋白质绝对量的降低(例如，由于IND基因的突变导致没有功能性IND蛋白 质被制造出来)和/或生产较之功能性野生型IND蛋白质的活性而言具有显著降低的生物活性的IND蛋白质(例如下述IND蛋白质，其中对于被编码的IND蛋白质的生物活性而言关键的一个或多个氨基酸残基(如下文所例示)被另外的氨基酸残基取代)。术语“突变IND蛋白质”在本文中使用时指突变IND核酸序列(“ind等位基因”)编码的下述IND蛋白质，其中所述突变导致较之非突变野生型IND序列(“IND等位基因”)编码的IND蛋白质的活性而言显著降低和/或没有的体内IND活性。
“诱变”在本文中使用时指这样的过程，其中对植物细胞(例如多个芸苔属种子或其它部分例如花粉等等)应用在细胞DNA中诱导突变的技术，例如将其与诱变剂接触，例如与化学物质(例如甲基磺酸乙酯(EMS)、乙基亚硝基脲(ENU)等等)或电离辐射(中子(例如在快中子诱变等等)、α射线、γ射线(例如通过钴60源提供的)、X-射线、UV辐射等等)或上述中两种或多种的组合接触。因此，对一个或多个IND等位基因的想要的诱变可通过使用化学手段(例如通过将一种或多种植物组织与甲基磺酸乙酯(EMS)、乙基亚硝基脲等接触)或通过使用物理手段(例如x射线等等或通过γ辐射，例如钴60源提供的)来进行。通过照射制造的突变通常是大的缺失或者其它明显的损伤，例如易位或复杂重排，而通过化学诱变剂制造的突变通常是更离散的损伤，例如点突变。例如，EMS烷基化鸟嘌呤碱基，其导致碱基错配：烷基化的鸟嘌呤将与胸腺嘧啶碱基配对，主要导致G/C向A/T的转变。诱变之后，使用已知技术从经处理的细胞再生芸苔属植物。例如，可根据传统种植流程，栽种得到的芸苔属种子，自花授粉后，在植物上形成种子。或者，可选出双单倍体小植株，立即形成纯合植物，例如如Coventry等人(1988，Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus.Dep.Crop Sci.Techn.Bull.OAC Publication0489.Univ.of Guelph，Guelph，Ontario，Canada)所述。通过此类自花授粉在这代或后续代中形成的其它种子可被收获，并针对突变IND等位基因的存在对其加以筛选。已知若干技术可用于筛选特定的突变等位基因，例如DeleteageneTM(Delete-a-gene；Li等人，2001，Plant J27： 235-242)使用聚合酶链式反应(PCR)测定，来筛选通过快中子诱变产生的缺失突变，TILLING(基因组中靶向诱导局部损伤；McCallum等人，2000，Nat Biotechnol18：455-457)鉴定EMS诱导的点突变，等等。针对特定突变IND等位基因的存在加以筛选的其它技术被描述于下文实施例中。
在本文中使用时，提到植物使用时，术语“非天然存在”表示具有经过人工修饰的基因组的植物。转基因植物，例如是含有外源核酸分子(例如包含转录区域的嵌合基因，当其转录时，产生能降低内源基因(例如根据本发明的IND基因)表达的生物活性RNA分子)并且因此已经经人工遗传修饰的非天然存在的植物。此外，在内源基因中含有突变(例如内源IND基因中的突变(例如在调控元件或在编码序列中)，由于暴露给诱变试剂导致的)的植物也被认为是非天然植物，因为其已经经人工遗传修饰过。此外，下述特定物种(例如欧洲油菜)的植物也被认为是非天然存在的植物，所述植物在内源基因(例如内源IND基因)中含有天然不存在于该特定植物物种中的突变，这是用该植物相同或不同物种(例如芥菜或芜青)的植物进行的例如定向育种过程，例如标记辅助育种和选择，或者基因渗入的结果。相反，仅含自发或者天然存在的突变的植物，即，没有经过人工遗传修饰的植物，不是本文定义的“非天然存在的植物”并且因此不包括在本发明内。本领域技术人员理解，非天然存在的植物通常具有较之天然存在的植物而言经改变的核苷酸序列，但非天然存在的植物也可以是经过人工遗传修饰但是不改变其核苷酸序列，例如通过修饰其甲基化模式来进行。
术语基因或蛋白质的“直向同源物”在本文中指在另一个物种中发现的同源基因或蛋白质，其具有与基因或蛋白质相同的功能，但(通常)从物种具有偏离的基因(即，通过物种形成从共同的祖先进化的基因)的时间点开始，其序列偏离。因此，可以基于序列比较(例如，基于整个序列或特定结构域的百分比序列同一性)和/或功能分析，在其它的植物物种(例如，芥菜等)中鉴定欧洲油菜IND基因的直向同源物。
本文中使用的“品种”与UPOV规范一致，指在单个已知最低级别的植 物分类单位中的植物分组，所述分组可以通过由给定基因型或基因型的组合所导致的特征的表达来定义，可以通过至少一种所述特征的表达来与任何其它植物分组进行区分，并且在关于它进行无变化(稳定)繁殖的适合性方面可认为是一个单位。
术语“包含”理解为具体说明了所陈述部分、步骤或组分的存在，但不排除存在一种或多种其它的部分、步骤或组分。因此，包含一些性状的植物可以包含其它的性状。
可以理解，当以单数形式(例如，植物或根)指代词时，复数形式(例如，复数的植物，复数的根)也包括在内。因此，通过不定冠词但属性是(“a”或“an”)指代元件时，不排除存在一个以上的元件的可能性，除非上下文明确的要求有且仅有一个元件。因此，不定冠词单数形式(“a”或“an”)通常意指“至少一个”。
出于本发明的目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”表示为百分比，指两条最优比对的序列中具有相同残基的位置数(x100)除以比较的位置数。将空位视为具有不相同残基的位置，所述空位是比对中这样的位置，所述位置上的残基存在于一条序列中，而不存在于另一条序列中。根据European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS，Rice等人，2000，Trends in Genetics16(6)：276-277；参见例如http：//www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中的Needleman和Wunsch总体对比算法(Needleman和Wunsch，1970，J Mol Biol48(3)：443-53)，使用缺省设置(空位开放罚分＝10(对于核苷酸)/10(对于蛋白质)和空位延伸罚分＝0.5(对于核苷酸)/0.5(对于蛋白质))，通过在全长比对两条序列来发现两条序列的“最优比对”。对于核苷酸，使用的缺省评分矩阵是EDNAFULL，而对于蛋白质，缺省的评分矩阵是EBLOSUM62。
如本文中使用的，“基本相同(subtantially identical)”或“实质相似(essentially similar)”指，当如上述进行最优比对时，至少具有某一最小百分比的序列同一性(如下文进一步定义)的序列。
可以使用“严格杂交条件”来鉴定与给定的核苷酸序列基本相同的核苷 酸序列。严格条件是序列依赖性的，在不同环境中可以不同。通常，选择的严格条件是比特定的序列在定义的离子强度和pH下的热解链点(Tm)低约5℃。Tm是(在定义的离子强度和pH下)50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。通常，所选择的严格条件是在pH7和至少60℃的温度下，盐浓度为约0.02摩尔。降低盐浓度和/或增加温度，可增加严格性。用于RNA-DNA杂交的严格条件(Northern印迹，使用探针例如100nt)是，例如包括至少一次在63℃下，在0.2X SSC中洗涤20min的条件，或等价的条件。
“高严格条件”可以例如通过如下提供：在65℃的水溶液中杂交，所述溶液含有6x SSC(20x SSC含有3.0M NaCl，0.3M Na-柠檬酸，pH7.0)，5x Denhardt′s(100X Denhardt’s含有2％Ficoll，2％聚乙烯吡咯烷酮，2％牛血清白蛋白)，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)，和作为非特异性竞争物的20/μg/ml变性的载体DNA(单链鱼精子DNA，具有平均长度为120-3000核苷酸)。在杂交后，可以在若干步骤中进行高严格洗涤，最终洗涤(约30分钟)是在杂交温度下，0.2-0.1X SSC，0.1％SDS中进行。
“中严格条件”指与上述溶液杂交等价的条件，但是在约60-62℃。中等严格洗涤可以在杂交温度下，1X SSC，0.1％SDS中进行。
“低严格性”指与上述溶液杂交等价的条件，但是在约50-52℃。低严格洗涤可以在杂交温度下，2X SSC，0.1％SDS中进行。还参见Sambrook等人，(1989)以及Sambrook和Russell(2001)。
“增加的收获产量”或“增加的种子或谷粒产量”指：较之从相似量的无突变IND等位基因的等基因(isogenic)植物收获的种子或谷粒的量而言，从多株植物(每株包含根据本发明的突变IND等位基因)收获的更大量的种子或谷粒。产量典型地以每表面单位收获的种子的体积单位表示，例如蒲式耳/英亩或Kg/ha。产量增加典型地以百分比表示，其中参照或对照植物的产量计为100％，根据本发明的植物的产量以相对对照植物的产量的％表示。在根据本发明的芸苔属植物中观察到的产量增加范围为至少101％至至少124％，预计可取得更高的产量增加。产量增加还可在104％ 至108％或105％至110％的范围内。
发明详述
欧洲油菜(基因组AACC，2n＝4x＝38)是异源四倍体(双二倍体)物种，由于其来源于双倍体祖先，因此其含有实质上两个双倍体基因组(A和C基因组)，其在基因组中包含两个IND基因。发明人发现，一个IND基因位于A基因组上(本文中称为“IND-AI”)，一个位于C基因组中(本文中称为“IND-CI”)。IND-A1基因被认为与IND-C1基因“部分同源”，即“A基因”被发现于A基因组中，其来自双倍体祖先芜青(AA)，“C基因”被发现于欧洲油菜的C基因组上，其来自双倍体祖先甘蓝(CC)。
如任何双倍体基因组中一样，针对每个IND基因，基因组的每个IND基因座上可体内存在两个“等位基因”(一个等位基因是在一条染色体上发现的基因序列，另一个则在同源染色体上)。在任何给定的植物中，这两个等位基因的核苷酸序列可相同(纯合植物)或不同(杂合植物)，虽然在整个物种种群中，对于每个IND基因而言，存在的不同的可能的等位基因的数量可远大于2。
还发现，在两个IND基因中的仅一个中(即，IND-A1或IND-C1中)，对完全敲除型ind等位基因而言是纯合的欧洲油菜植物较之不包含突变IND等位基因的欧洲油菜植物而言不显示出显著增加的荚果掉果抗性，而在两个IND基因中针对完全敲除型ind等位基因均为纯合的欧洲油菜植物中，荚果掉果抗性显著增加，但是荚果掉果抗性的水平太高以至于无法保持农艺相关的可脱粒性。相反，在包含两个欧洲油菜IND基因的三个完全敲除型ind等位基因的欧洲油菜植物中，荚果掉果抗性显著增加至这样的水平：其中，植物保持荚果的农艺相关可脱粒性。我们认为，为了获得显示出增加的荚果掉果抗性同时保持荚果的农艺相关可脱粒性的植物，可需要在包含至少两个IND基因的芸苔属植物(特别是包含IND-A1和IND-C1基因的欧洲油菜植物)中存在三个完全敲除型ind等位基因。
因此在本发明的一种实施方式中，在本文中提供了包含至少两个IND 基因的芸苔属植物，特别是包含IND-A1和IND-C1基因的欧洲油菜植物，其包含3个ind等位基因，其中ind等位基因导致这些突变等位基因的野生型等同体编码的功能性IND蛋白质类型的量显著降低，以及由此使得植物细胞中(具体而言，在发育中的种子荚果中)体内生产的功能性IND蛋白质的量总体上显著降低。
还认为，通过在一株植物(特别是芸苔属植物)中将足够拷贝的特定(突变)ind等位基因与足够拷贝的特定(野生型)IND等位基因组合，有可能精细调节制造的功能性IND蛋白质的量和/或类型，其进而影响植物的果实开裂性质。因此可以以此类方式调节IND蛋白质的绝对和相对量，以提供产生足够的IND蛋白质从而能实现种子荚果的农艺相关可脱粒性同时降低收获前或收获期间的落籽的植物。
因此，在本发明的一种实施方式中，提供了下述植物(特别是芸苔属植物)，其包含至少一个功能表达的IND等位基因，该等位基因编码完全功能性的IND蛋白质，同时其余等位基因可以是(突变)ind等位基因。
在本发明的一个方面，提供了包含至少两个IND基因的芸苔属植物，特别是欧洲油菜植物，其包含该芸苔属植物中的至少2个不同IND基因(特别是IND-A1和IND-C1基因)的n-重数(n-tuple)ind等位基因，其中，n≤3(例如n＝1、2或3)，从而至少一个等位基因产生功能性的IND蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了芸苔属的物种的纯合IND单突变(n＝2，即，对于一个IND基因的突变等位基因来说是纯合的)和/或纯合IND双突变(n＝4，即，对于两个IND基因的突变等位基因来说是纯合的)植物(特别是欧洲油菜)，其包含至少两个IND基因，其中，在该芸苔属植物中，所述突变等位基因是2个不同IND基因(特别是IND-A1和/或IND-C1基因)的突变等位基因。根据本发明，此类突变植物可用于育种目的。因此，在本发明的一种实施方式中，在本文中提供了纯合IND单突变欧洲油菜植物，其中，植物的基因型可被描述为ind-al/ind-al，IND-C1/IND-C1或IND-A1/IND-A1，ind-cl/ind-cl。在本发明的另一实施方式中，在本文中 提供了纯合IND双突变欧洲油菜植物，其中，植物的基因型可被描述为in d-al/ind-al，ind-cl/ind-cl。
在本发明的另一方面，包含至少两个IND基因的芸苔属的物种(特别是欧洲油菜)的纯合IND单(n＝2)突变植物包含其它突变IND等位基因，其中，所述突变植物对于另外的突变IND等位基因来说是杂合的(即n＝3)，并且其中，突变等位基因是在该芸苔属植物中剩下的野生型IND基因(特别是IND-A1或IND-C1基因)的突变等位基因。因此，在本发明的另一实施方式中，此处提供了包含一个其它突变IND等位基因的纯合IND单突变欧洲油菜植物，其中，植物的基因型可被描述为ind-al/ind-al，IND-C1/ind-cl或IND-A1/ind-a1，ind-cl/ind-cl。
本发明还提供了来自芸苔属的物种的野生型和突变IND基因/等位基因的核酸序列以及野生型和突变IND蛋白质。本发明还提供了在芸苔属植物中产生和组合突变和野生型IND等位基因的方法，以及在其基因组中包含野生型和突变IND等位基因的特定组合的芸苔属植物和植物部分，其中这些植物中落籽被降低。这些植物用于将突变IND等位基因转移到其它植物中的用途也是本发明的一种实施方式，描述的任何植物的植物产品也是。此外，还提供了用于标记辅助选择(MAS)以组合或检测IND基因和/或等位基因的试剂盒和方法。下文中将详细描述本发明的每种实施方式。
本文所述的展示出降低或延迟的落籽的芸苔属植物具有增加的收获的种子产量。但是，出人意料地观察到，来自仅包含两个纯合状态的突变IND等位基因的芸苔属植物(即，其中，植物的基因型可被描述为ind-a1/ind-a1，IND-C1/IND-C1或IND-A1/IND-A1，ind-c1/ind-c1)的收获的种子产量较之不包含突变IND等位基因的等基因芸苔属植物也显著增加，尽管在包含突变IND等位基因的芸苔属植物中没有可观察到的降低或延迟的落籽表型。本发明由此还提供了包含至少两个IND基因的下述芸苔属植物，其中，至少两个等位基因产生功能性IND蛋白质，所述植物具有更高的种子产量。清楚地，在IND-A基因座或IND-C基因座上的两个突变等位基因可以是相同的突变等位基因或不同的突变等位基因。
根据本发明的核酸序列
本发明提供了来自十字花科(特别是来自芸苔属的物种，尤其是来自欧洲油菜，也可来自芸苔属作物物种)的IND基因的野生型IND核酸序列(编码功能性IND蛋白质)和突变ind核酸序列(包含一处或多处突变，优选地，导致编码的IND蛋白质的生物活性显著降低或没有的突变，或者导致不产生IND蛋白质的突变)。例如，包含A和/或C基因组的芸苔属的物种可包含IND-A或IND-C基因的不同等位基因，在根据本发明的单株植物中可鉴定和组合它们。此外，可使用诱变方法来在野生型IND等位基因中产生突变，由此产生根据本发明使用的突变ind等位基因。因为优选通过杂交和选择在植物中组合特定的IND等位基因，因此在一种实施方式中，在植物(例如芸苔属植物，优选是可与欧洲油菜杂交或可用于制造“合成”欧洲油菜植物的芸苔属植物)中提供IND和/或ind核酸序列(即，内源地)。不同芸苔属物种之间的杂交被描述于本领域中，例如参见Snowdon (2007，Chromosome research15：85-95)。物种间杂交可例如用于将基因从例如欧洲油菜(AACC)中的C基因组转移到埃塞俄比亚芥(BBCC)中的C基因组，或者甚至从例如欧洲油菜(AACC)中的C基因组转移到芥菜(AABB)中的B基因组(通过其C和B基因组之间的非常规重组的散发事件进行)。可通过将原始祖先甘蓝(CC)和芜青(AA)杂交来生产“再合成”或“合成”的欧洲油菜品系。在芸苔属作物物种及其亲属物种之间的杂交中，物种间以及属间不相容障碍可被成功克服，例如通过胚胎拯救技术或原声质体融合(见例如上文的Snowdon)。
但是，本发明中还提供了经分离的IND和ind核酸序列(例如通过克隆从植物分离或通过DNA合成来合成制造)及其变体以及它们任何的片段，它们可用于确定植物或植物部分中内源存在哪些序列，所述序列是否编码功能性、非功能性的蛋白质或不编码蛋白质(例如通过按照下文所述在重组宿主细胞中表达)以及用于选择特定等位基因和将其从一种植物转移到另一种，以产生具有想要的功能性和突变等位基因组合的植物。
已经从欧洲油菜分离出了IND-A1和IND-C1的核酸序列，如序列表中所示。描述了野生型IND序列，同时下文和实施例中还参照野生型IND序列描述了这些序列以及与其实质上相似的序列的突变ind序列。来自欧洲油菜的编码IND蛋白质的基因组DNA不包含任何内含子。
根据本发明的“IND-A1核酸序列”或“IND-A1变体核酸序列”是编码与SEQ ID NO：2具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，或是与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：5具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列。这些核酸序列还可被称为与序列表中提供的IND序列“实质相似”或“实质相同”。
根据本发明的“IND-C1核酸序列”或“IND-C1变体核酸序列”是编码与SEQ ID NO：4(IND-Cf-长)或SEQ ID NO：4的第16位氨基酸至第210位氨基酸(IND-C1-短)具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列，或是与SEQ ID NO：3(IND-C1-长)或SEQ ID NO：3的第46位核苷酸至第633位核苷酸(IND-C1-短)或与SEQ ID NO：7具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的核酸序列。这些核酸序列还可被称为与序列表中提供的IND序列“实质相似”或“实质相同”。
因此编码野生型功能性IND-A1和IND-C1蛋白质的核酸序列都被提供于本发明中，这包括其变体和片段(如下文所定义的)以及上述任何的突变核酸序列，其中，核酸序列中的突变优选导致较之野生型IND蛋白质而言一个或多个氨基酸被插入、缺失或取代。优选地，核酸序列中的一个或多个突变导致一处或多处氨基酸改变(即，相对于野生型氨基酸序列而言，一个或多个氨基酸被插入、缺失和/或取代)，由此IND蛋白质的生物活性显著降低或完全消失。IND蛋白质的生物活性显著降低或完全消失在本文中表示IND蛋白质的DNA结合活性、二聚化能力和/或转录调控活性降低或消失，使得表达突变IND蛋白质的植物的荚果掉果抗性较之表达 相应野生型IND蛋白质的植物而言有所增加。
为测定植物(特别是芸苔属植物)中特定IND等位基因/蛋白质的功能性，可通过对包含特定IND等位基因/蛋白质的植物和相应野生型植物的果实和花进行宏观、显微和组织学测定(与Liljegren等人(2004，见上文)所述对拟南芥属的果实和花进行的测定类似，或按照下文实施例中所述)，来测定植物中荚果掉果抗性的水平。简言之，可例如通过宏观测试，例如肉眼检查种子荚果评估例如裂爿边缘是否存在、荚果喙长度等等；人工冲击测试(MIT)以比较不同突变IND品系和相应野生型品系之间的荚果掉果抗性水平(通过评估轻柔扭动荚果时荚果开口的容易程度)；随机冲击测试(RIT)以比较分别来自不同突变IND品系和相应野生型品系的植物的种子荚果的可脱粒性(通过测量这些品系的荚果样品的半寿期)；和/或通过显微测试以检查例如种子荚果的开裂区和裂爿边缘的细胞是否以及如何受到IND中突变的影响，来评估和/或测量荚果掉果抗性的变化。或者，一旦IND蛋白质的二聚化伴侣(例如，当其功能依赖同源二聚体的形成时，是IND蛋白质自身，或者，当其功能依赖异源二聚体的形成时是另外的蛋白质)和/或其转录受到IND蛋白质调控的基因被鉴定和分析出来，可通过本领域已知的重组DNA技术，来评估特定IND等位基因/蛋白质的功能性，例如通过在宿主细胞(例如细菌，例如大肠杆菌)中共表达二聚体的两个伴侣并评估是否仍可形成二聚体、二聚体是否仍可与被调控基因的bHLH结合位点结合和/或这些基因的转录是否仍被这种结合调控来进行。
本文提供了内源和经分离的核酸序列。还提供了IND序列的片段和IND变体核酸序列(如上文定义的)，它们用作为引物或探针以及用作为根据本发明的另一方面(见下文)的试剂盒的组分。IND或ind核酸序列或其变体(如所定义的)的“片段”长度可以变化，例如，IND或ind序列(或变体序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、200、500、600个连续核苷酸。
编码功能性IND蛋白质的核酸序列
序列表中示出的核酸序列编码来自欧洲油菜的野生型功能性IND蛋白质。因此，这些序列是从其中分离出它们的欧洲油菜植物内源的。可对其它芸苔属作物物种、品种、育种品系或野生登记种加以筛选，来筛选其它IND等位基因，其编码相同的IND蛋白质或其变体。例如，可使用核酸杂交技术(例如Southern印迹分析，其中使用例如严格杂交条件)或基于PCR的技术，来鉴定其它芸苔属植物(例如多种欧洲油菜品种、品系或登记种)内源的IND等位基因，以及，可针对其它野生型IND等位基因，来筛选芥菜(尤其是A-基因组上的IND等位基因)、埃塞俄比亚芥(尤其是C-基因组上的IND等位基因)和芜青(A-基因组)和甘蓝(C-基因组)植物、器官和组织。为针对IND等位基因的存在筛选此类植物、植物器官或组织，可使用序列表中提供的IND核酸序列或任何这些的变体或片段。例如，完全序列或片段可用作为探针或引物。例如，可使用特异性的或简并引物，从植物、植物器官或组织的基因组DNA中扩增编码IND蛋白质的核酸序列。可使用标准分子生物学技术，对这些IND核酸序列加以分离和测序。然后可使用生物信息学分析来分析等位基因，例如，以确定哪些IND等位基因对应该序列以及哪些IND蛋白质或蛋白质变体是该序列编码的。
可通过本领域已知的重组DNA技术来分析核酸序列是否编码功能性IND蛋白质，例如通过遗传学互补测试，其中使用例如对于完全敲除型ind突变等位基因来说是纯合的拟南芥属植物，或者对于IND-A1和IND-C1基因二者的完全敲除型ind突变等位基因来说是纯合的欧洲油菜植物。
此外，应当理解，可通过计算机方式，通过针对实质上相似的序列筛选核酸数据库，来鉴定IND核酸序列及其变体(或它们中任何的片段)。类似地，可化学合成核酸序列。还提供了根据本发明的核酸分子的片段，下文中将对其进行进一步描述。片段包括仅编码bHLH结构域或者包含bHLH结构域的部分的更小的片段(例如碱性结构域或者HLH结构域等等)的核酸序列。
编码突变IND蛋白质的核酸序列
相对于野生型核酸序列，包含一个或多个核苷酸缺失、插入或取代的核酸序列是发明的另一个实施方案，同样地此类突变核酸分子的片段也是。如下文进一步描述的，可以利用多种已知的方法产生和/或鉴别此类突变核酸序列(称为ind序列)。此外，以内源性形式和以分离的形式提供了此类核酸分子。在一个实施方案中，突变导致所编码的IND蛋白质的氨基酸序列中的一个或多个改变(缺失、插入和/或取代)(即，不是“沉默突变”)。在另一个实施方案中，核酸序列中的突变导致相对于野生型蛋白质，所编码的IND蛋白质的生物学活性显著降低或完全消失。
因此，核酸分子可以包含一个或多个突变，例如：
(a)“错义突变”，所述突变是核酸序列中的改变，其导致氨基酸取代另一个氨基酸；
(b)“无义突变”或“STOP密码子突变”，所述突变是核酸序列中的改变，其导致引入过早的STOP密码子，从而终止翻译(导致截短的蛋白质)；植物基因包含翻译终止密码子“TGA”(RNA中的UGA)、“TAA”(RNA中的UAA)和“TAG”(RNA中的UAG)；因此，在待翻译的成熟mRNA中(在阅读框中)导致上述密码子之一的任何核苷酸取代、插入、缺失将终止翻译。
(c)一个或多个氨基酸的“插入突变”，原因是在核酸的编码序列中添加一个或多个密码子；
(d)一个或多个氨基酸的“缺失突变”，原因是在核酸的编码序列中缺失一个或多个密码子；
(e)“移码突变”，导致在突变下游以不同的框翻译核酸序列。移码突变可以具有各种原因，例如一个或多个核苷酸的插入、缺失或重复。
如已经提到的，核酸序列中的突变优选导致下述突变蛋白质是想要的，所述蛋白质包含显著降低的或者没有体内生物活性，或者想要导致不生产蛋白质。基本上，导致产生相对于野生型蛋白质而言包含至少一处氨基酸 插入、缺失和/或取代的蛋白质的任何突变可导致显著降低的生物活性或没有生物活性。但是，应当理解，蛋白质某些部分中的突变更易于导致突变的IND蛋白质功能降低，例如导致截短的蛋白质的突变，由此缺乏功能性结构域(例如DNA结合结构域(“b”)、二聚化结构域(“HLH”)和/或转录调控结构域)的显著部分。
根据The Arabidopsis Information Resource(TAIR)数据库(hnp：//www.arabidopsis.org/)，拟南芥属INDEHISCENT蛋白质(基因座At4g00120.1；SEQ ID NO：10)长度为198个氨基酸，其包含位于SEOID NO：10的第121至168位氨基酸之间(pfam结构域PF00010)、第124至173位氨基酸之间(smart结构域SM00353)或第112和168位氨基酸之间(prosite结构域PS50888)的“碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)二聚化”结构域和第114至196或198位的氨基酸之间的“螺旋-环-螺旋(HLH)DNA结合”结构域(分别是superfam结构域G3D.4.10.280.10或SSF47459)。
本文描述的芸苔属的IND-A1蛋白质长度为大约185个氨基酸(SEQID NO：2)，IND-C1蛋白质大约195个氨基酸(SEQ ID NO：4的第16至210位)或210个氨基酸(SEQ ID NO：4)，它们包含位于SEQ ID NO：2的第120至167位和SEQ ID NO：4的第133至180位氨基酸之间(pfam结构域PF00010)、位于SEQ ID NO：2的第123至172位和SEQ ID NO：4的第136至185位氨基酸之间(smart结构域SM00353)或位于SEQ IDNO：2的第111至167位和SEQ ID NO：4的第124至180位氨基酸之间(prosite结构域PS50888)的“碱性bHLH二聚化”结构域和SEQ ID NO：4的第127至208或210位的氨基酸之间(分别为superfam结构域G3D.4.10.280.10或SSF47459)的“HLH DNA结合”结构域，这是通过对芸苔属和拟南芥属的IND蛋白质进行最优比对测定的并且基于TAIR数据库中的注释信息。
如Heim等人(2003，Mol Biol Evol20，735-747)所述，133种拟南芥属bHLH转录因子基因的共有bHLH结构域序列由大约56个氨基酸构成 (Heim等人，图1；对应于SEQ ID NO：10的119-174位)。该二分结构域包含(1)碱性区域，位于结构域的N-末端，其参与DNA结合，由具有高数量碱性残基的大约13个氨基酸构成(“b”；对应于SEQ ID NO：10的119-131位)；和(2)螺旋-环-螺旋区域，位于C-末端，其作为二聚化结构域发挥功能，其由大约43个主要疏水的氨基酸残基构成(对应于SEQ IDNO：10的第132-174位)，它们形成分别为大约15个氨基酸(“H1”；对应于SEQ ID NO：10的第132-146位)和大约22个氨基酸(“H2”；对应于SEQ ID NO：10的第153-174位)的两个两性α-螺旋，它们之间由大约6个至可多达大约14个氨基酸的环区域(“L”；对应于SEQ ID NO：10的第147-152位)分开，该环区域是bHLH结构域中大小和氨基酸组成上最具分歧性的区域。两个α-螺旋促进二聚化，允许在不同家族成员之间形成同源二聚体和/或异源二聚体(Toledo-Ortiz等人，2003，Plant Cell15：1749-1770)。虽然bHLH结构域进化上保守(Atchley和Fitch，1997，PNAS94：5172-5176)，但是不同bHLH家族成员间在该结构域外仅有很少的序列相似性(Morgenstern和Atchley，1999，Mol Biol Evol16：1654-1663)。
在证明具有结合DNA的能力的这些bHLH蛋白质中，Heim等人(见上文)鉴定的共有bHLH结构域序列的第5、9和13位处的氨基酸是最关键的。对于非植物bHLH蛋白质而言，显示，第5位的His(H)残基、第9位的Glu(E)残基和第13位的Arg(R)残基(全部都在碱性区域内)对于DNA结合来说是关键的(Brownlie等人，1997，Structure5，509-520；Atchley等人，1999，J Mol Evol48，501-516；Ledent和Vervoort，2001，Genome Res11，754-770)。但是，一些植物蛋白质具有H-E-R构型变化。例如，根据Heim等人(见上文)，拟南芥属基因At4g00120(对应于SEQ ID NO：9代表的拟南芥属IND基因)编码的bHLH结构域的5-9-13基序分别由氨基酸残基Gln(Q)、Ala(A)和Arg(R)(分别对应于SEQ ID NO：10的第123、127和131位)构成(Heim等人(见上文)的图4)。具有H-E-R构型的变异的此类植物蛋白质可还在碱性区域含有破坏螺旋的脯氨酸，例如，VIII和X组的成员，特征在于可干扰对DNA的 亲和性。这些变异使得这些蛋白质可作为负面调控子(保留了与其他bHLH蛋白质二聚化的能力但是缺乏结合DNA的能力)发挥作用。虽然5-9-13基序对DNA结合来说是重要的，但是DNA主链与第10和12位上的碱性残基(在共有bHLH结构域序列中都是Arg(R))接触，它们在大多数植物蛋白质中也是保守的(对应于SEQ ID NO：10的第128和130位)。
此外，Heim等人(见上文)描述了螺旋1的第16、20、23、27位(对应于SEQ ID NO：10的第134、138、141、145位)和螺旋2的第36、39、43、49、53和56位(对应于SEQ ID NO：10的第154、157、161、167、171、174位)的高度保守的疏水残基，例如，螺旋1结构域中第23位的亮氨酸残基(对应于SEQ ID NO：10的第141位)和螺旋2中位于螺旋一侧的保守疏水残基，对于二聚体形成的二聚化或稳定来说是必要的。
最后，Heim等人(见上文；图4)显示了DNA结合结构域之外的保守氨基酸序列，其中一些被认为作为活化结构域发挥作用，或者对于与转录复合体的其它组件的相互作用来说是重要的，或者是信号转导链的靶。
表1IND蛋白质-氨基酸(AA)区域和位置
Heim等人，H：Heim等人，2003，MolBiol Evol20，735-747；Toledo-Ortiz等人，T：Toledo-Ortiz等人，2003，Plant CeIIl5：1749-1770；Liljegren等人，L：Liljegren等人，2004，Cell，116，843-853；w：wu等人，2006，Planta224，971-979.
类似地，如Toledo-Ortiz等人(2003，Plant Cell15：1749-1770；图1)所述，拟南芥属bHLH转录因子家族的bHLH结构域由大约56个氨基酸构成(Toledo-Ortiz等人；对应于SEQ ID NO：10的第115-167位)。该双分结构域包含(1)碱性区域，位于结构域的N-末端，其参与DNA结合，由具有高数量碱性残基的大约17个氨基酸构成(“b”；对应于SEQIDNO：10的115-131位)；和(2)HLH区域，位于C-末端，其作为二聚化结构域发挥功能，其由大约39个主要疏水的氨基酸残基构成(对应于SEQID NO：10的第132-167位)，它们形成大约15个氨基酸的两个两性α-螺旋(“H1”，对应于SEQ ID NO：10的第132-146位；和“H2”，对应于SEQID NO：10的第152-167位)，它们之间由大约9个氨基酸的环区域(“L”；对应于SEQ ID NO：10的第147-151位)分开，该环区域是bHLH结构域中大小和氨基酸组成上最具分歧性的区域。
基于序列保守的模式，Atchley等人(1999)产生了假定的共有基序，其代表bHLH区域中最保守的氨基酸，包括分散在bHLH结构域的19个氨基酸(18个来自b、H1和H2；1个来自L)。鉴定的保守氨基酸对应于Toledo-Ortiz等人(2003，见上文)鉴定的拟南芥属bHLH结构域的第1、2、13、14、16(b中)；20、21、24、27、28(H1中)；39(L中)；42、45、46、49、50、52、53和56(H2中)位的氨基酸，其对应于SEQID NO：10的第115、116、127、128、130(b中)；134、135、138、141、142(H1中)；150(L中)；153、156、157、160、161、163、164和167 (H2中)位的氨基酸。
根据Liljegren等人(2004，Cell，116，843-853)，拟南芥属IND基因的bHLH结构域包含13个氨基酸的碱性区域(SEQ ID NO：10中第119至131位的氨基酸)和分别14和15个氨基酸的两个α-螺旋(分别是SEQ ID NO：10中第132-145位的氨基酸和第153至167位的氨基酸)，它们之间由7个氨基酸的可变环区域(SEQ ID NO：10中第146至152位的氨基酸)分开。
拟南芥属IND核酸(SEQ ID NO：9)和氨基酸(SEQ ID NO：10)序列与本发明的IND核酸序列，特别是芸苔属IND核酸(SEQ ID NO：1和3)和氨基酸(SEQ ID NO：2和4)序列的最佳比对，允许确定这些芸苔属序列中相应的保守结构域和氨基酸(关于SEQ ID NO：1至4的芸苔属IND序列，见表1)的位置。
因此，在一种实施方式中，提供了包含一种或多种任何类型的上文所述突变的核酸序列。在另一实施方式中，提供了包含一个或多个终止密码子(无义)突变、一个或多个错义突变和/或一个或多个移码突变的ind序列。提供了上述任何突变核酸序列本身(经分离的形式)以及内源包含此类序列的植物和植物部分。在下文的表中，描述了最优选的ind等位基因，如所示的，包含一个或多个ind等位基因的欧洲油菜种子的种子保藏物已被保藏。
在本文中使用时，IND等位基因中的无义突变是IND等位基因中的下述突变，由所述突变向相应野生型IND等位基因的编码DNA和相应mRNA序列中引入一个或多个翻译终止密码子。翻译终止密码子是TGA(mRNA中是UGA)、TAA(UAA)和TAG(UAG)。因此，导致在编码序列中产生框内终止密码子的任何突变(缺失、插入或取代)将导致翻译终止以及氨基酸链的截短。在一种实施方式中，包含无义突变的突变IND等位基因是这样的IND等位基因，其中，通过单核苷酸取代，例如CAG至TAG、TGG至TAG、TGG至TGA或CAA至TAA的突变，在IND密码子序列中引入框内终止密码子。在另一实施方式中，包含无义突变的突变IND等位基因是这样的IND等位基因，其中，通过双核苷酸取 代，例如CAG至TAA、TGG至TAA或CGG至TAG或TGA的突变，在IND密码子序列中引入框内终止密码子。在还一种实施方式中，包含无义突变的突变IND等位基因是这样的IND等位基因，其中，通过三核苷酸取代，例如CGG至TAA的突变，在IND密码子序列中引入框内终止密码子。截短的蛋白质缺乏突变下游的编码DNA编码的氨基酸(即IND蛋白质的C-末端部分)，但保持了突变上游的编码DNA编码的氨基酸(即，IND蛋白质的N-末端部分)。在一种实施方式中，含无义突变的突变IND等位基因是这样的IND等位基因，其中，无义突变在H2结构域的保守Leu残基(在Heim等人，2003(见上文)所述共有bHLH结构域序列的第56位)之前的任何地方存在，使得至少缺乏保守的Leu残基。较之野生型IND蛋白质而言突变IND蛋白质越截短，截短越可能导致显著降低的IND蛋白质活性或者没有活性。因此，在另一实施方式中，提供了包含导致少于大约170个氨基酸(缺乏保守Leu)、少于大约150个氨基酸(缺乏H2结构域)、少于大约145个氨基酸(缺乏L和H2结构域)、少于大约130个氨基酸(缺乏HLH结构域)、少于大约115个氨基酸(缺乏bHLH结构域)或者甚至氨基酸长度更短(例如对应于拟南芥属ind-4或ind-5(Liliegren等人，2004，见上文)等位基因的突变IND等位基因)的截短蛋白质的无义突变的突变IND等位基因(见表1)。
本文下表描述了本文提供的欧洲油菜IND序列中一系列可能的无义突变。
表2a IND-A1(SEQ ID NO：1)中可能的STOP密码子突变
(1)包含含有该无义突变的突变IND-A1等位基因(下文中称为ind-a1-EMS01)的种子已于2007年11月20日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA20110-2209，Us)，登录号为PTA-8796。
表2b IND-C1(SEQ ID NO：3)中可能的STOP密码子突变
(2)包含含有该元义突变的突变IND-C1等位基因(下文中称为ind-cl-EMS01)的种子已于2007年11月20日保藏于ATCC，登录号为PTA-8796。
(3)包含含有该元义突变的突变IND-C1等位基因(下文中称为inf-cl-EMS03)的种子已于2007年11月20日保藏于ATCC，登录号为PTA-8795。
明显地，突变不限于上表中显示的这些，应当理解，除了序列表中所示的和上表中提到的那些之外，其它ind等位基因中也可存在类似的STOP(终止)突变。
在本文中使用时，IND等位基因中的错义突变是IND等位基因中的下述任何突变(缺失、插入或取代)，所述突变使得相应野生型IND等位基因的编码DNA和相应mRNA序列中一个或多个密码子改变，导致野生型 IND蛋白质中的一个或多个氨基酸在突变IND蛋白质中被取代为一个或多个其它氨基酸。在一种实施方式中，包含错义突变的突变IND等位基因是下述IND等位基因，其中，上文示出的或表1中的保守氨基酸中的一个或多个被取代。如所指出的，保守氨基酸中的一些比其它那些对IND蛋白质的生物活性更关键。因此，导致例如Heim等人(见上文)定义的共有bHLH结构域序列中第5、9和13位或第10和12位的氨基酸被取代的错义突变更可能导致IND蛋白质显著降低的活性或者没有活性(由于与靶DNA结合的能力降低)。类似地，导致例如Heim等人(见上文)定义的共有bHLH结构域序列中螺旋1中的第16、20、23、27位或螺旋2中第36、39、43、49、53或56位的氨基酸被取代的错义突变更可能导致IND蛋白质显著降低的活性或者没有活性(由于降低的二聚化能力)。包含含有下述错义突变的突变IND-A1等位基因(下文中称为ind-a1-EMS05)的种子已于2007年11月20日保藏于ATCC，登录号为PTA-8795，所述错义突变导致Heim等人(见上文)定义的共有bHLH结构域序列中第10位的Arg残基被取代为His残基。在另一实施方式中，包含错义突变的突变IND等位基因是这样的IND等位基因，其包含对应于拟南芥属ind-1或ind-3(Liliegren等人，2004，见上文)等位基因中错义突变的错义突变(见表1)。
在本文中使用时，IND等位基因中的移码突变是IND等位基因中的下述突变(缺失、插入、重复等等)，其导致核酸序列在突变下游以不同的框被翻译。在一种实施方式中，包含移码突变的突变IND等位基因是这样的IND等位基因，其包含对应于拟南芥属ind-2(Liljegren等人，2004，见上文)等位基因中移码突变的移码突变，其中在密码子26中缺失单个核苷酸，这导致移码并且产生35个氨基酸的截短的蛋白质(根据Liljegren等人，2004见上文)。在另一实施方式中，包含移码突变的突变IND等位基因是这样的IND等位基因，其包含对应于拟南芥属ind-6(Wu等人，2006，见上文)等位基因中移码突变的移码突变(其中在核苷酸183后插入Ds转座子，导致插入位点处的8核苷酸重复)，或者包含对应于相应回复突变型拟南芥属ind等位基因(见Wu等人，2006，见上文，图1a) 的移码突变。
根据本发明的氨基酸序列
本发明提供了来自十字花科(特别是来自芸苔属的物种，尤其是来自欧洲油菜，也可来自其它芸苔属作物物种)的野生型(功能性)IND氨基酸序列和突变IND氨基酸序列(包含一处或多处突变，优选是导致IND蛋白质的生物活性显著降低或者没有活性的突变)两者。例如，包含A和/或C基因组的芸苔属物种可编码不同的IND-A或IND-C氨基酸。此外，可使用诱变方法来在野生型IND等位基因中产生突变，由此产生可编码其它突变IND蛋白质的突变等位基因。在一种实施方式中，在芸苔属植物中提供了野生型和/或突变IND氨基酸序列(即，内源地)。但是，本发明还提供了经分离的IND氨基酸序列(例如从植物分离的或者合成制造的)以及其变体和它们任何的片段。
已从欧洲油菜分离出了IND-A1和IND-C1蛋白质的氨基酸序列，如序列表所示。示出了野生型IND序列，下文中参照野生型IND序列描述了这些序列的以及与这些实质上相似的序列的突变IND序列。
如上文所述，本文所述的芸苔属的IND蛋白质长度为大约185-210个氨基酸，其包含多个结构和功能结构域。
根据本发明的“IND-A1氨基酸序列”或“IND-A1变体氨基酸序列”是与SEQ ID NO：2具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还被称为与序列表中提供的IND序列“实质上相似”或“实质上相同”。
相据本发明的“IND-C1-氨基酸序列”或“IND-C1变体氨基酸序列”是与SEQ ID NO：4(IND-C1-长)或SEQ ID NO：4的第16位氨基酸至第210位氨基酸(IND-C1-短)具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的氨基酸序列。这些氨基酸序列还被称为与序列表中提供的IND序列“实质上相似”或“实质上相同”。
因此野生型功能性IND-A1和IND-C1蛋白质的氨基酸序列都被提供于本发明中，这包括其变体和片段(如下文所定义的)以及上述任何的突变氨基酸序列，其中，氨基酸序列中的突变优选导致较之相应野生型IND蛋白质的生物活性而言IND蛋白质的生物活性显著降低或完全消失。IND蛋白质的生物活性显著降低或完全消失在本文中表示IND蛋白质的DNA结合活性、二聚化能力和/或转录调控活性的降低或消失，使得相比于相应野生型植物的荚果掉果抗性，表达突变IND蛋白质的植物的荚果掉果抗性较之表达相应野生型IND蛋白质的植物而言有所增加。
内源和经分离的氨基酸序列都被提供于本文中。还提供了IND氨基酸序列和上文定义的IND变体氨基酸序列的片段。IND氨基酸序列或者其变体(如上文所定义的)的“片段”长度可变，例如IND序列(或其变体序列)的至少10、12、15、18、20、50、100、150、175、180个连续氨基酸。
功能性IND蛋白质的氨基酸序列
序列表中示出的氨基酸序列是来自欧洲油菜的野生型功能性IND蛋白质。因此，这些序列是从其中分离出它们的欧洲油菜植物内源的。可按照上文所述，针对具有相同氨基酸序列或其变体的其它功能性IND蛋白质，对其它芸苔属作物物种、品种、育种品系或野生登记种加以筛选。
此外，应当理解，可通过计算机方式，通过针对实质上相似的序列筛选氨基酸数据库，来鉴定IND氨基酸序列及其变体(或它们中任何的片段)。还提供了根据本发明的氨基酸分子的片段。片段包括bHLH结构域或者包含bHLH结构域的部分的更小的片段(例如碱性结构域或者HLH结构域等等)的氨基酸序列。
突变IND蛋白质的氨基酸序列
相对野生型氨基酸序列而言包含一处或多处氨基酸缺失、插入或取代的氨基酸序列也是本发明的另一实施方式，此类突变氨基酸分子的片段也如是。可使用多种已知方法(如上文描述的)来产生和/或鉴定此类突变氨 基酸序列。此外，本文提供了内源形式和经分离形式的此类氨基酸分子。
在一种实施方式中，氨基酸序列中的突变导致IND蛋白质较之野生型蛋白质而言生物活性显著降低或完全消失。如上文所述，基本上，导致蛋白质相对野生型蛋白质而言包含至少一处氨基酸插入、缺失和/或取代的任何突变都可能导致显著降低的生物活性或没有生物活性。但是应当理解，在蛋白质某些部分的突变更可能导致突变IND蛋白质的功能降低，例如，导致截短的蛋白质的突变，由此功能性结构域(例如DNA结合结构域(“b”)、二聚化结构域(“HLH”)和/或在转录调控中重要的氨基酸(见表1))的显著部分缺乏或被取代。
因此，在一种实施方式中，提供了包含一处或多处缺失或插入突变的突变IND蛋白质，其中所述插入或缺失导致产生具有显著降低的体内活性或者没有体内活性的突变蛋白质。此类突变IND蛋白质是这样的IND蛋白质，其中，较之野生型IND蛋白质而言至少1，至少2、3、4、5、10、20、30、50、100、100、150、175、180或更多个氨基酸缺失或插入，其中所述缺失或插入导致产生具有显著降低的体内活性或者没有体内活性的突变蛋白质。
在另一实施方式中，提供了截短的突变IND蛋白质，其中所述截短导致产生具有显著降低的体内活性或者没有体内活性的突变蛋白质。此类截短的IND蛋白质是这样的IND蛋白质，其缺乏相应野生型IND蛋白质C-末端部分的功能性结构域，但是保留相应野生型IND蛋白质的N-末端部分。因此在一种实施方式中，提供了下述截短的IND蛋白质，其包含相应野生型IND蛋白质的N-末端部分直到但是不包括H2结构域的保守Leu残基(位于Heim等人，2003所述的共有bHLH结构域序列的第56位，见上文)。突变蛋白质较之野生型蛋白质越截短，则截短就越可能导致IND蛋白质显著降低的活性或没有活性。因此，在另一实施方式中，提供了下述截短的IND蛋白质，其包含相应野生型IND蛋白质的N-末端部分，但是缺乏全部或部分的第二H结构域，和/或缺乏全部或部分的L结构域，和/或缺乏全部或部分的第一H结构域，和/或缺乏全部或部分的碱性结构 域(如上文所述)或者甚至更多的氨基酸。
在还一实施方式中，提供了包含一处或多处取代突变的突变IND蛋白质，其中所述取代导致产生具有显著降低的体内活性或者没有体内活性的突变蛋白质。此类突变IND蛋白质是这样的IND蛋白质，其中，具有特定功能(例如DNA结合、二聚化或转录调控中的功能)的保守氨基酸残基被取代。因此，在一种实施方式中，提供了包含具有生物功能的保守氨基酸残基(例如上文表1所示的碱性结构域或H1、L或H2结构域的保守氨基酸)取代的突变IND蛋白质。
根据本发明的方法
可使用本领域中传统的多种方法，例如，使用基于PCR的方法扩增ind基因组或cDNA的全部或部分，来产生(例如通过诱变诱导)和/或鉴定突变ind等位基因。
诱变之后，使用已知技术，从经处理的种子种植植物，或者从经处理的细胞再生植物。例如，可按照传统种植流程，种植经诱变的种子，自花授粉之后，在植物上形成种子。或者，可从经处理的小孢子或花粉细胞中提取出双单倍体小植株，立即形成纯合植物，例如如Coventry等人(1988，Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus.Dep.Crop Sci.Techn.Bull.OAC Publication0489.Univ.of Guelph，Guelph，Ontario，Canada)所述。通过此类自花授粉在这次或后续代中形成的其它种子可被收获，并针对突变IND等位基因的存在对其加以筛选，其中使用本领域传统的技术，例如基于聚合酶链式反应(PCR)的技术(扩增ind等位基因)或基于杂交的技术，例如，Southern印迹分析、BAC文库筛选等等，和/或对ind等位基因直接测序。为针对突变IND等位基因中点突变(所谓的单核苷酸多态性或SNPs)的存在加以筛选，可使用本领域中传统的SNP检测方法，例如，基于寡连接(oligoligation)的技术，基于单碱基延伸的技术或者基于限制性位点差异的技术，例如TILLING。
如上文所述，对特定野生型IND等位基因的诱变(自发以及诱导的) 导致在得到的突变IND等位基因中存在一处或多处缺失的、插入的或取代的核苷酸(下文中称为“突变区域”)。因此可通过野生型IND等位基因中一个或多个被缺失、插入或取代的核苷酸的位置和构型来表征突变IND等位基因。其中分别被插入、缺失或取代的一个或多个核苷酸在野生型IND等位基因中的位点在本文中也被称为“突变区域或序列”。“5’或3’侧翼区域或序列”在本文中使用时指突变(或相应野生型)IND等位基因中DNA的至少20bp，优选至少50bp，至少750bp，至少1500bp以及可多至5000bp的与含有一处或多处被缺失、插入或取代的核苷酸的DNA有所不同的DNA区域或序列，优选地，来自突变(或相应野生型)IND等位基因的位于突变IND等位基因(或相应野生型IND等位基因)中突变区域的恰好上游并与其邻接的(5’侧翼区域或序列)或恰好下游并与其邻接的(3’侧翼区域或序列)DNA。“连接区域”在本文中使用时指突变(或相应野生型)IND等位基因中的下述DNA区域，突变区域和5’或3’侧翼区域在此处相互连接。“跨越突变区域和5’或3’侧翼区域之间的连接区域的序列”由此包含突变序列以及与其邻接的侧翼序列。
开发来鉴定特定突变IND等位基因或包含特定突变IND等位基因的植物或植物材料或包含含有特定突变IND等位基因的植物材料的产品的工具基于特定突变IND等位基因较之相应野生型IND等位基因的基因组特征而言的特定基因组特征，例如，包含突变区域的基因组区域的特异性限制性图谱、分子标记或侧翼和/或突变区域的序列。
一旦测序了特定突变IND等位基因，就可以通过分子生物学技术开发引物和探针，所述引物和探针特异性识别样品核酸(DNA或RNA)中突变IND等位基因的5’侧翼、3’侧翼和/或突变区域中的序列。例如，可以开发鉴别生物学样品(例如植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品)中的突变IND等位基因的PCR方法。此类PCR是基于至少两种特异性的“引物“：分别是一种识别突变IND等位基因的5’或3’侧翼区中的序列，另一种识别突变IND等位基因的3’或5’侧翼区中的序列；或者一种识别突变IND等位基因的5’或3’侧翼区中的序列，另一种识别突变IND等位基因的 突变区中的序列；或者分别是一种识别突变IND等位基因的5’或3’侧翼区中的序列，另一种识别跨越特定突变IND等位基因的3’或5’侧翼区和突变区之间的连接区的序列(如下所述)。
优选的引物具有在15至35个核苷酸之间的序列，在优化的PCR条件下“特异性识别”在5’或3’侧翼区中的序列，在突变区中的序列，或者跨越特定突变IND等位基因的3’或5’侧翼区和突变区之间的连接区的序列，从而从包含特定突变IND等位基因的核酸样品中扩增特定的片段(“突变IND特定片段”或鉴别性扩增子)。这意味着在优化的PCR条件下仅靶向突变IND等位基因，而非植物基因组中的其它序列被扩增出来。
适用于本发明的PCR引物可以是下述这些：
-寡核苷酸，长度为17nt至大约200nt，其包含选自特定突变IND等位基因的5’或3’侧翼序列的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列(即，例如，本发明的突变IND等位基因中一个或多个被缺失、插入或取代的核苷酸的5’或3’侧翼的序列，例如，上文所述的无义、错义或移码突变5’或3’侧翼的序列，或者上文表中指出的终止密码子突变或上文指出的取代突变5’或3’侧翼的序列，或其互补序列)(识别5’侧翼序列的引物)；或
-寡核苷酸，长度为17nt至大约200nt，其包含选自特定突变IND等位基因的突变区域的序列的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列(即，例如，本发明IND基因中被插入或取代的核苷酸的序列或其互补序列)(识别突变序列的引物)。
引物理所当然的可以长于所述的17个连续的核苷酸，可以是例如18、19、20、21、30、35、50、75、100、150、200nt长或更长。引物可以完全由选自所述侧翼和突变序列的核苷酸序列的核苷酸序列组成。然而，引物5’末端的核苷酸序列(即，位于3’-的17个连续核苷酸外侧)较不关键。因此，视情况，引物的5’序列可以包括选自侧翼或突变序列的核苷酸序列，但也可以含有一些(例如，1、2、5、10个)错配。引物的5’序列甚至可以完全由侧翼或突变序列不相关的核苷酸序列组成，例如，表示限制性酶 识别位点的核苷酸序列。此类不相关的序列或具有错配的侧翼DNA序列应该优选的不长于100个，更优选的不长于50个或者甚至25个核苷酸。
此外，合适的引物可包含跨越侧翼和突变序列之间的连接区域(即，例如，本发明的突变IND等位基因中一个或多个被缺失、插入或取代的核苷酸5’或3’侧翼的序列和插入或取代的一个或多个核苷酸的序列或分别地在一个或多个缺失的核苷酸3’或5’侧翼的序列之间的连接区域，例如上文所述的本发明的IND基因中无义、错义或移码突变5’或3’侧翼的序列和无义、错义或移码突变的序列之间的连接区域，或者上文表中指出的可能的终止密码子突变或上文指出的取代突变5’或3’侧翼的序列和分别地可能的终止密码子突变或取代突变的序列之间的连接区域)的核苷酸序列或由所述核苷酸序列构成，条件是所述核苷酸序列不仅仅源于突变区域或侧翼区域。
对本领域技术人员也是显而易见的，适当选定的PCR引物对还应当不包含彼此互补的序列。
出于发明的目的，“SEQ ID NO：X代表的核苷酸序列的互补序列”是这样的核苷酸序列，所述序列可以源自将所代表的核苷酸序列，根据沙加夫法则(Chargaff’ s rules)
通过其互补的核苷酸来取代核苷酸，并以5’至3’方向阅读序列，即，与所代表的核苷酸序列相反的方向。
适合鉴别特定突变IND等位基因的引物实例描述在实施例中。
如本文中使用的，“SEQ ID NO：Z从第X至第Y位的核苷酸序列”表示包括两个核苷酸端点的核苷酸序列。
优选的，扩增的片段具有在50和1000核苷酸之间的长度，例如在50和500核苷酸之间的长度，或在100和350核苷酸之间的长度。特定的引物可以具有与以下序列80至100％同一性的序列，所述序列是5’或3’侧翼区中的序列、突变区中的序列或跨越特定突变IND等位基因的3’或5’侧翼和突变区之间的连接区的序列，条件是错配仍然允许用这些引物在优化的PCR条件下特异性鉴别特定的突变IND等位基因。但是，通过实验可以容易的确定可允许的错配范围，这是本领域技术人员已知的。
“突变IND特异性片段”的检测和/或鉴别可以以不同的方式发生，例如，在凝胶或毛细管电泳后通过大小评估，或通过基于荧光的检测方法。还可以直接测序突变IND特异片段。用于检测扩增的DNA片段的其它序列特异性方法也是本领域已知的。
本领域描述了标准的PCR规程，例如“PCR应用手册”(RocheMolecular Biochemicals，第2版，1999)和其他参考文献。对于各个特定的突变IND等位-基因，“PCR应用手册”中详细说明了优化的PCR条件，包括特异性引物的序列。然而，可以理解，需要调整PCR鉴别规程中的多个参数适应特定的实验室条件，并可以轻微调节来获得相似的结果。例如，使用不同的制备DNA的方法可以需要调整例如引物的量、聚合酶、MgCl2浓度或使用的退火条件。相似的，其他引物的选择可以指定用于PCR鉴别规程的其他优化条件。然而，这些调整对本领域技术人员是显而易见的，进一步详述在目前的PCR应用手册中，例如上文引用的。
实施例中描述了用于鉴别特定突变IND等位基因的PCR鉴别规程的实例。
或者，可以使用特定的引物来扩增突变IND特异性片段，所述片段可以用作“特异性探针”，用于鉴别生物学样品中的特定突变IND等位基因。在允许探针与核酸中相应片段杂交的条件下，将生物学样品的核酸与探针接触，导致形成核酸/探针杂合体。可以检测该杂合体的形成(例如，核酸或探针的标记)，从而该杂合体的形成表示特定突变IND等位基因的存在。本领域中已经描述了此类基于特异性探针杂交(在固相载体或溶液中)的鉴别方法。特异性探针优选的是序列，其在优化的条件下，与特定突变IND等位基因的5’或3’侧翼区和/或突变区(后文称为“突变IND特定区”)中的区域特异性杂交。优选的，特异性探针包括10至1000bp、50至600bp、100至500bp、150至350bp之间的序列，其与特定区域的核苷酸序列至少80％，优选的80至85％，更优选的85至90％，特别优选的90至95％，最优选的95％至100％同一(或互补)。优选的，特异性探针可以包括约13至约100个连续的核苷酸的序列，所述序列与特定突变IND等位基因的 特定区相同(或互补)。
适用于本发明的特异性探针可以是下述这些：
-寡核苷酸，长度为13nt至大约1000nt，其包含选自特定突变IND等位基因的5”或3’侧翼序列的至少13个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列(即，例如，本发明的突变IND等位基因中一个或多个被缺失、插入或取代的核苷酸的5’或3’侧翼的序列，例如，上文所述的无义、错义或移码突变5’或3’侧翼的序列，或者上文表中指出的可能的终止密码子突变或上文指出的取代突变5’或3’侧翼的序列)或与其具有至少80％序列同一性的序列(识别5’侧翼序列的探针)；或
-寡核苷酸，长度为13nt至大约1000nt，其包含选自特定突变IND等位基因的突变序列的至少13个连续核苷酸的核苷酸序列或其互补序列(即，例如，本发明IND基因中被插入或取代的核苷酸的序列或其互补序列)或与其具有至少80％序列同一性的序列(识别突变序列的探针)。
探针可以完全由选自所述侧翼和突变序列的核苷酸序列组成。然而，在探针的5’或3’末端的核苷酸序列较不关键。因此，视情况，探针的5’或3’序列可以由选自侧翼或突变序列的核苷酸序列组成，但也可以由与侧翼或突变序列不相关的核苷酸序列组成。此类不相关的序列应该优选的不长于50，更优选的不长于25或者甚至不长于20或15个核苷酸。
此外，合适的探针可包含跨越侧翼和突变序列之间的连接区域(即，例如，本发明的突变IND等位基因中一个或多个被缺失、插入或取代的核苷酸5’或3’侧翼的序列和插入或取代的一个或多个核苷酸的序列或分别在一个或多个缺失的核苷酸3’或5’侧翼的序列之间的连接区域，例如上文所述的本发明的IND基因中无义、错义或移码突变5’或3’侧翼的序列和无义、错义或移码突变的序列之间的连接区域，或者上文表中指出的可能的终止密码子突变或上文指出的取代突变的5’或3’侧翼的序列和分别地可能的终止密码子或取代突变的序列之间的连接区域)的核苷酸序列或由所述核苷酸序列构成，条件是所述核苷酸序列不仅仅源于突变区域或侧翼区域。
实施例中描述了适合鉴别特定突变IND等位基因的特异性探针的实 例。
与特异性探针杂交的“突变IND特异区”的检测和/或鉴别可以以不同的方式进行，例如，在凝胶电泳后通过大小评估，或通过基于荧光的检测方法。其它用于检测与特异性探针杂交的“突变IND特异区”的序列特异性方法也是本领域已知的。
可选的，可以利用其它方法产生和鉴别包含一个或多个突变ind等位基因的植物或植物部分，例如“Delete-a-geneTM”方法，所述方法使用PCR筛选通过快中子诱变(综述见Li和Zhang，2002，Funct Integr Genomics2：254-258)产生的缺失突变，例如鉴别EMS-诱导的点突变的TILLING方法(在基因组中靶向诱导的局部损伤)，其使用变性高效液相色谱(DHPLC)鉴别EMS-诱导的点突变，从而通过异源双链体分析(McCallum等人，2000，Nat Biotech18：455，和McCallum等人，2000，Plant Physiol.123，439-442)检测碱基对改变等。如上所述，TILLING使用高通量筛选突变(例如，使用突变体-野生型DNA异源双链体的Cel1切割，和使用凝胶测序系统检测)。因此，本文涵盖了使用TILLING鉴别包含一个或多个突变ind等位基因的植物或植物部分，以及用于产生和鉴别此类植物、植物器官、组织和种子的方法。因此，在一个实施方案中，根据本发明的方法包括步骤诱变植物种子(例如，EMS诱变)，植物个体或DNA的混合，目标区域的PCR扩增，异源双链体形成和高通量检测，突变植物的鉴别，突变PCR产物的测序。可以理解其它诱变和选择方法可以等价的用于产生此类突变植物。
除了在IND等位基因中诱导突变以外，可以通过本领域已知的方法鉴别天然(自发)突变等位基因。例如，可以使用ECOTILLING(Henikoff等人，2004，Plant Physiology135(2)：630-6)在多种(a pluralityof)的植物或植物部分中筛选天然突变ind等位基因的存在。对于上述诱变技术，优选的筛选包含A和/或C基因组的芸苔属物种，使鉴别的ind等位基因可以通过杂交(种间或种内杂交)和选择，随后引入到其它芸苔属物种中，例如欧洲油菜。在ECOTILLING中，通过上述TILLING方法学，筛选育种 品系或相关物种中的天然多态性，其中，使用单个植物或植物库进行PCR扩增ind靶，异源双链体形成和高通量分析。然后可以选择具有所需突变的单个植物，其随后可以用于育种项目中来掺入所需的突变等位基因。
然后，可以测序所鉴别的突变等位基因，序列可以与野生型等位基因比较，来鉴别突变。任选的，如上文所述来测试功能。利用该方法可以鉴别多种的突变ind等位基因(和含有一个或多个所述基因的芸苔属植物)。然后，如下文所述，可以通过杂交和选择方法，将理想的突变等位基因与理想的野生型等位基因组合。最后，产生包含理想数量的突变ind和理想数量的野生型IND等位基因的单个植物。
适合作为PCR引物或特异性探针，用于检测特定突变IND等位基因的寡核苷酸也可用于开发确定特定突变IND等位基因接合性状态的方法。
为了确定特定突变IND等位基因的接合性状态，可以开发基于PCR的检测，来确定突变和/或相应野生型IND特异性等位基因的存在：
为了确定特定突变IND等位基因的接合性状态，可以以这样的方式设计特异性识别野生型IND等位基因的两种引物，所述方式使所述引物针对彼此，并具有位于引物之间的突变区。这些引物可以是分别特异性识别5’和3’侧翼序列的引物。该套引物允许突变体以及相应的野生型IND等位基因的同时诊断性PCR扩增。
可选的，为了确定特定突变IND等位基因的接合性状态，可以以这样的方式设计特异性识别野生型IND等位基因的两种引物，所述方式使所述引物针对彼此，并且其中之一特异性的识别突变区。这些引物可以是分别特异性识别野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区和突变区序列的引物。该套引物与特异性识别突变IND等位基因中的突变区序列的第三引物一起，允许突变IND基因以及野生型IND基因的同时诊断性PCR扩增。
可选的，为了确定特定突变IND等位基因的接合性状态，可以以这样的方式设计特异性识别野生型IND等位基因的两种引物，所述方式使所述引物针对彼此，并且其中之一特异性的识别在5’或3’侧翼区和突变区之间的连接区。这些引物可以是分别特异性识别野生型IND等位基因的5’或3’ 侧翼序列，和在突变区和3’或5’侧翼区之间的连接区的引物。这套引物与第三引物一起，允许突变IND基因以及野生型IND基因的同时诊断性PCR扩增，所述第三引物特异性的识别突变IND等位基因的在突变区和3’或5’侧翼区之间的连接区。
可选的，可以通过使用替代的引物组，确定特定突变IND等位基因的接合性状态，所述引物组特异性识别突变和野生型IND等位基因。
如果对于突变IND基因或相应的野生型IND基因，植物是纯合的，则不论对于突变或野生型IND等位基因，上述诊断性PCR测定可以产生典型的单PCR产物，优选在长度上具有典型性。如果对于突变IND基因，植物是杂合的，则会出现两种特异的PCR产物，反映了突变和野生型IND等位基因的扩增。
进行野生型和突变IND特异性PCR产物的鉴别，例如可以通过在凝胶或毛细管电泳后的大小评估(例如，对于包含多个插入或缺失的核苷酸的突变IND等位基因，导致从野生型和突变IND等位基因扩增的片段之间的大小差异，从而所述片段可以在凝胶上可视的分离)；通过在凝胶或毛细管电泳后，评估两种不同片段的存在或缺失，从而突变IND等位基因的诊断性PCR扩增可以任选的与野生型IND等位基因的诊断性PCR扩增分别实施；通过扩增片段的直接测序；或通过基于荧光的检测方法。
实施例中描述了适合确定特定突变IND等位基因接合性的引物实例。
可选的，为了确定特定突变IND等位基因的接合性状态，可以开发基于杂交的测定，来确定突变和/或相应野生型IND特定等位基因的存在：
为了确定特定突变IND等位基因的接合性状态，可以以这样的方式设计识别野生型IND等位基因的两种特异性探针，所述方式使每种探针特异性识别IND野生型等位基因中的序列，并且突变区位于探针识别的序列之间。这些探针可以是分别特异性识别5’和3’侧翼序列的探针。一种或，优选的两种上述探针的使用，允许突变以及相应的野生型IND等位基因的同时诊断杂交。
可选的，为了确定特定突变IND等位基因的接合性状态，可以以这样 的方式设计识别野生型IND等位基因的两种特异性探针，所述方式使探针之一特异性识别IND野生型等位基因中在突变区上游或下游的序列，优选的在突变区上游，且探针之一特异性识别突变区。这些探针可以是分别特异性识别野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区序列，优选的5’侧翼区序列，和突变区序列的探针。一种或，优选的两种上述探针，任选的与第三探针一起使用，允许突变以及野生型IND基因的诊断杂交，所述第三探针特异性识别突变IND等位基因的突变区序列。
可选的，为了确定特定突变IND等位基因的接合性状态，可以以这样的方式设计识别野生型IND等位基因的特异性探针，所述方式使探针特异性识别在野生型IND等位基因的5’或3’侧翼区(优选的5’侧翼区)和突变区之间的连接区。该探针任选的与第二探针一起，允许突变以及野生型IND基因的诊断杂交，所述第二探针特异性识别突变IND等位基因的5’或3’侧翼区，优选的5’侧翼区和突变区之间的连接区。
可选的，可以通过使用替代的探针组，来确定特定突变IND等位基因的接合性状态，所述探针组特异性识别突变和野生型IND等位基因。
如果对于突变IND基因或相应的野生型IND基因，植物是纯合的，则无论对于突变或野生型IND基因，上述诊断杂交测定可以产生典型的单特异性杂交产物，例如一种或多种杂交DNA(限制性)片段，优选的在长度上具有典型性。如果对于突变IND等位基因，植物是杂合的，则可以出现两种特异性杂交产物，反映了突变和野生型IND基因的杂交。
进行野生型和突变IND特异性杂交产物的鉴别，例如可以通过在凝胶或毛细管电泳后的大小评估(例如，对于包含多个插入或缺失的核苷酸的突变IND等位基因，导致来自野生型和突变IND等位基因的杂交DNA(限制性)片段之间的大小差异，从而所述片段可以在凝胶上可视的分离)；通过在凝胶或毛细管电泳后，评估两种不同的特异性杂交产物的存在或缺失，从而突变IND等位基因的诊断杂交可以任选的与野生型IND等位基因的诊断杂交分别实施；通过杂交DNA(限制性)片段的直接测序；或通过基于荧光的检测方法。
实施例中描述了适合确定特定突变IND等位基因接合性的探针实例。
此外，还可以利用本文提供的特定突变IND等位基因的特异性序列信息，开发特异性针对特定突变IND等位基因的、不同于基于PCR-或基于杂交扩增方法的检测方法。此类替代的检测方法包括基于特定核酸结构的侵入性切割的线性信号扩增检测方法，也已知为InvaderTM技术(描述在例如美国专利5,985,557“Invasive Cleavage of Nucleic Acids”，6,001,567“Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage”，通过引用整合到本文中)，基于RT-PCR的检测方法，例如Taqman，或其他检测方法，例如SNPIex。简言之，在InvaderTM技术中，靶突变序列可例如与经标记的第一核酸寡核苷酸(包含突变序列或跨越5’侧翼区域和突变区域之间的连接区域的序列的核苷酸序列)和与第二核酸寡核苷酸(包含突变序列相邻的且恰在其下游的3’侧翼序列)杂交，其中所述第一或第二寡核苷酸至少有一个核苷酸重叠。通过该杂交产生的双链体或三链体结构允许用酶
进行选择性探针切割，留下完整的靶序列。切割下来的经标记探针随后被检测，这可能通过中间步骤进行，导致进一步的信号扩增。
如本文中使用的，“试剂盒”指用于实施发明方法的目的的试剂集合，更特别的，用于生物学样品中特定突变IND等位基因的鉴别，或包含特定突变IND等位基因的植物材料的接合性状态的确定等目的。更特别的，发明的试剂盒的优选实施方案包括，如上所述，用于特定突变IND等位基因鉴别的至少两种特异性引物，或者用于接合性状态确定的至少两种或三种特异性引物。任选的，试剂盒还可以包括任何本文中描述的PCR鉴别规程中的其它试剂。可选的，根据本发明的另一个实施方案，试剂盒可以包含至少一种特异性探针，如上所述，所述探针与生物学样品的核酸特异性杂交，来鉴别其中特定突变IND等位基因的存在，用于特定突变IND等位基因的鉴别，或者包含至少两种或三种用于确定接合性状态的特异性探针。任选的，试剂盒还可以包括任何其它试剂(例如但不限于杂交缓冲液，标记)，利用特异性探针，用于生物学样品中特定突变IND等位基因的鉴别。
本发明的试剂盒可以用于质量控制(例如，种子批次的纯度)、检测植物材料或包含或源自植物材料的材料(例如但不限于食品或饲料产品)中特定突变IND等位基因的存在或缺失的目的，并且它的组分可以特异性调节用于上述目的。
如本文中使用的，术语“引物”涵盖了能够在依赖模板的过程，例如PCR中，引发新生核酸合成的任何核酸。通常，引物是10至30个核苷酸的寡核苷酸，但可以使用更长的序列。可以以双链形式提供引物，尽管单链形式是优选的。探针可以作为引物使用，但被设计用于与靶DNA或RNA结合，而不需要在扩增过程中使用。
如本文中使用的，当术语“识别”指特异性引物时，指在方法所述条件下(例如PCR鉴别规程的条件)，特异性引物与特定突变IND等位基因中的核酸序列特异性杂交的事实，从而通过阳性和阴性对照的存在确定特异性。
如本文中使用的，当术语“杂交”指特异性探针时，指在标准严格条件下，探针与特定突变IND等位基因的核酸序列中的特定区域结合的事实。如本文中使用的，标准严格条件指本文描述的用于杂交的条件，或Sambrook等人，1989(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbour Laboratory Press，NY)描述的常规杂交条件，例如可以包括下列步骤：1)在滤膜上固定植物基因组DNA片段或BAC文库DNA，2)在65℃，6X SSC，5X Denhardt氏试剂，0.5％SDS和20μg/ml变性载体DNA中预杂交滤膜1至2小时，3)添加已经标记的杂交探针，4)孵育16至24小时，5)在68℃，6X SSC，0.1％SDS中，洗涤滤膜一次30分钟，6)在68℃，2X SSC，0.1％SDS中，洗涤滤膜三次(在30ml中两次，各30分钟，在500ml中1次，10分钟)，和7)将滤膜在-70℃下暴露于X射线膜4至48小时。
如本文中使用的，“生物学样品”是植物、植物材料或包含植物材料的产品的样品。术语“植物”意在涵盖任何成熟阶段的植物组织，以及来自或衍生自任何此类植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、 叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。如本文中使用的，“植物材料”指从植物获得的或源自植物的材料。包含植物材料的产品涉及食品、饲料或其他产品，所述产品使用植物材料生产或可以被植物材料污染。可以理解，在本发明的上下文中，在此类生物学样品中测试特异性针对特定突变IND等位基因的核酸的存在，提示样品中核酸的存在。因此，本文所指的用于在生物学样品中鉴别特定突变IND等位基因的方法，涉及鉴别生物学样品的核酸，所述核酸包含特定突变IND等位基因。
本发明还涉及在一株植物中特定IND等位基因的组合，涉及将一个或多个特定突变IND等位基因从一株植物转移到另外的植物，涉及包含一个或多个特定突变IND等位基因的植物，从这些植物获得的后代，还涉及源于这些植物的植物细胞、植物部分和植物种子。
因此，在本发明的一种实施方式中，提供了在一株植物中组合两个或多个选择的突变IND等位基因的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)产生和/或鉴定两株或多株植物，它们每株包含一个或多个选择的突变IND等位基因，如上文所述，
(b)将包含一个或多个选择的突变IND等位基因的第一植物与包含一个或多个其它选择的突变IND等位基因的第二植物杂交，从杂交收集F1种子，以及任选地，鉴定出包含来自第一植物的一个或多个选择的突变IND等位基因以及来自第二植物的一个或多个选择的突变IND等位基因的F1植物，如上文所述，
(c)任选地，重复步骤(b)，直到获得包含所有选择的突变IND等位基因的F1植物，
(d)任选地，
-通过测定突变IND等位基因的接合性状态，鉴定对于选择的突变IND等位基因来说纯合或杂合的F1植物，如上文所述，或
-通过进行下述步骤之一，产生对于选择的突变IND等位基因中之一或多种来说纯合的植物：
-从包含一个或多个选择的突变IND等位基因的F1植物的经处理的小孢子或花粉细胞提取双单倍体植物，如上文所述，
-将包含一个或多个选择的突变IND等位基因的F1植物自交一代或多代(y)，从自交中收集F1Sy种子，以及鉴定对于一个或多个突变IND等位基因来说纯合的F1Sy植物，如上文所述。
在本发明的另一实施方式中，提供了将一个或多个突变IND等位基因从一株植物转移到另外的植物的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)产生和/或鉴定包含一个或多个选择的突变IND等位基因的第一植物，如上文所述，或者，通过在一株植物中组合一个或多个选择的突变IND等位基因，产生第一植物，如上文所述(其中，所述第一植物对于一个或多个突变IND等位基因来说是纯合或杂合的)，
(b)将包含一个或多个突变IND等位基因的第一植物与不包含一个或多个突变IND等位基因的第二植物杂交，从杂交收集F1种子(其中，如果第一植物对于该突变IND等位基因来说是纯合的话，所述种子对于突变IND等位基因来说是杂合的；以及其中，如果第一植物对于该突变IND等位基因来说是杂合的话，种子中的一半对突变IND等位基因来说是杂合的，种子中的一半是不成对的(azygous)，即不包含突变IND等位基因)，以及任选地，鉴定包含一个或多个选择的突变IND等位基因的F1植物，如上文所述，
(c)将包含一个或多个选择的突变IND等位基因的F1植物与不包含一个或多个选择的突变IND等位基因的第二植物回交一代或多代(x)，从杂交中收集BCx种子，以及在每代中鉴定包含一个或多个选择的突变IND等位基因的BCx植物，如上文所述，
(d)任选地，产生对一个或多个选择的突变IND等位基因来说纯合的BCx植物，这通过进行下述步骤之一来实现：
-从包含一个或多个想要的突变IND等位基因的BCx植物的经处理的小孢子或花粉细胞提取双单倍体植物，如上文所述，
-将包含一个或多个想要的突变IND等位基因的BCx植物自交一代或 多代(y)，从自交收集BCx Sy种子，以及鉴定出对于一个或多个想要的突变IND等位基因来说纯合的BCx Sy植物，如上文所述。
在本发明的一个方面，第一和第二植物是十字花科植物，特别是芸苔属植物，尤其是欧洲油菜植物或来自另外的芸苔属作物物种的植物。在本发明的另一方面，第一植物是十字花科植物，特别是芸苔属植物，尤其是欧洲油菜植物或来自另外的芸苔属作物物种的植物，并且，第二植物是来自十字花科育种品系，特别是来自芸苔属育种品系，尤其是来自欧洲油菜育种品系或者来自另外的芸苔属作物物种的育种品系的植物。“育种品系”在本文中使用时，是可通过优选的基因型和/或表型与其它植物品系区分开的优选纯合的植物品系，其用于产生杂交体后代。
在本发明的还一实施方式中，提供了一种制造植物(特别是芸苔属作物植物，例如欧洲油菜植物)的方法，所述植物中荚果掉果抗性增加，但是优选保持荚果的农艺相关的可脱粒性，所述方法包括将根据本发明的突变IND等位基因组合和/或转移进或组合和/或转移至一株芸苔属植物，如上文所述。
在本发明的一个方面，植物是包含至少两个IND基因的芸苔属植物，其中荚果掉果抗性增加，同时保持荚果的农艺相关的可脱粒性，这通过将根据本发明的三个突变IND等位基因组合和/或转移进或组合和/或转移至芸苔属植物来实现，如上文所述。
在本发明的又一实施方式中，提供了制造包含至少两个IND基因的杂交体芸苔属作物种子或植物(特别是杂交体欧洲油菜种子或植物)的方法，其中荚果掉果抗性增加，但是其仍保持荚果的农艺相关的可脱粒性，所述方法包括下述步骤：
(a)产生和/或鉴定包含纯合状态的第一和第二选择的突变IND等位基因的第一植物和包含纯合状态的第三选择的突变IND等位基因的第二植物，如上文所述，
(b)杂交第一和第二植物，从杂交收集F1杂交体种子。
在本发明的一个方面，第一或第二选择的突变IND等位基因是与第三 选择的突变IND等位基因相同的突变IND等位基因，从而F1杂交体种子对于一种突变IND等位基因来说是纯合的并且对于另一种是杂合的。在本发明的另一方面，第一植物用作为雄性亲本植物，第二植物用作为雌性亲本植物。在本发明的一种实施方式中，第一植物是完全荚果掉果抗性的。可通过播种由植物自交获得的完全不开裂的种子荚果，收获完整种子荚果，代替对种子荚果打击(thrashing)以收获种子，来获得此类植物。
序列
IND基因
SEQ ID NO：1：IND-A1基因的编码DNA，编码来自欧洲油菜的野生型IND-A1蛋白质。
SEQ ID NO：2：SEQ ID NO：1编码的野生型IND-A1蛋白质。
SEQ ID NO：3：IND-C1基因的编码DNA，编码来自欧洲油菜的野生型IND-C1蛋白质。
SEQ ID NO：4：SEQ ID NO：3编码的野生型IND-C1蛋白质。
SEQ ID NO：5：IND-A1基因的基因组DNA，编码来自欧洲油菜的野生型IND-A1蛋白质。
SEQ ID NO：6：SEQ ID NO：5编码的野生型IND-A1蛋白质。
SEQ ID NO：7：IND-C1基因的基因组DNA，编码来自欧洲油菜的野生型IND-C1蛋白质。
SEQ ID NO：8：SEQ ID NO：7编码的野生型IND-C1蛋白质。
SEQ ID NO：9：拟南芥属IND1基因的编码DNA。
SEQ ID NO：10：SEQ ID NO：9编码的拟南芥属IND1蛋白质。
SEQ ID NO：11：来自欧洲油菜的IND同源物的核苷酸序列(WO04/113542的BN1-IND-SEQ ID NO：2)
SEQ ID NO：12：来自欧洲油菜的第二IND同源物的核苷酸序列(WO04/113542的BN2-IND-SEQ ID NO：3)
引物和探针
SEQ ID NO13：正向寡核苷酸，用于检测IND-A1-EMS01
SEQ ID NO14：正向寡核苷酸，用于检测IND-A1-wT
SEQ ID NO15：反向寡核苷酸，用于检测IND-A1-EMS01和-WT
SEQ ID NO16：正向寡核苷酸，用于检测IND-A1-EMS05
SEQ ID NO17：正向寡核苷酸，用于检测IND-A1-wT
SEQ ID NO18：反向寡核苷酸，用于检测IND-A1-EMS05和-wT
SEQ ID NO19：反向寡核苷酸，用于检测IND-C1-EMS01
SEQ ID NO20：反向寡核苷酸，用于检测IND-C1-wT
SEQ ID NO21：正向寡核苷酸，用于检测IND-C1-EMS01和-wT
SEQ ID NO22：反向寡核苷酸，用于检测IND-C1-EMS03
SEQ ID NO23：反向寡核苷酸，用于检测IND-C1-wT
SEQ ID NO24：正向寡核苷酸，用于检测IND-C1-EMS03和-WT
SEQ ID NO25：寡核苷酸，用于检测IND-A1-EMS01和-WT
SEQ ID NO26：寡核苷酸，用于检测IND-A1-EMS01
SEQ ID NO27：寡核苷酸，用于检测IND-A1-WT
SEQ ID NO28：寡核苷酸，用于检测IND-A1-EMS05和-wT
SEQ ID NO29：寡核苷酸，用于检测IND-A1-EMS05
SEQ ID NO30：寡核苷酸，用于检测IND-A1-wT
SEQIDNO31：寡核苷酸，用于检测IND-C1-EMS01和-WT
SEQ ID NO32：寡核苷酸，用于检测IND-C1-EMS01
SEQ ID NO33：寡核苷酸，用于检测IND-C1-wT
SEQ ID NO34：寡核苷酸，用于检测IND-C1-EMS03和-wT
SEQ ID NO35：寡核苷酸，用于检测IND-C1-EMS03
SEQ ID NO36：寡核苷酸，用于检测IND-C1-wT
SEQ ID NO37：正向寡核苷酸，用于检测IND-A1
SEQ ID NO38：反向寡核苷酸，用于检测IND-A1
SEQ ID NO39：正向寡核苷酸，用于检测IND-C1
SEQ ID NO40：反向寡核苷酸，用于检测IND-C1
除非在实施例中另外陈述，所有重组DNA技术都根据标准分子生物学技术来进行，如Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，Ausubel等人，(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的第1和2卷，以及Brown(1998)Molecular Biology LabFax，第二版，Academic Press(UK)的卷I和II中描述的。用于植物分子工作的标准材料和方法描述在R.D.D.Croy的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)中，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可见于Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和McPherson等人，(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany中。用于AFLP分析的标准程序描述在Vos等人，(1995，NAR23：4407-4414)和公开的EP专利申请EP534858中。
实施例
实施例1-分离IND基因的DNA序列
为测定原种春油菜(spring oilseed rape)育种品系的IND基因的序列，按照下文所述筛选该品系的细菌人工染色体(BAC)文库：
1.1分离包含IND序列的BAC克隆
为鉴定含有包含原种春油菜育种品系的IND序列的BAC克隆的大肠杆菌菌落，通过标准Southern杂交流程，筛选在高密度尼龙滤膜上作为各自一式两份克隆列阵的品系BAC文库(平均克隆大小为超过120kb)：
-将具有WO04/113542的SEQ ID NO：2(“Bn1-IND”)和WO04/113542的SEQ ID NO：3(“BN2-IND”)的序列(分别为SEQ ID NO：11和12)并按照标准流程标记过的两种探针的混合物用于在尼龙膜上与 DNA杂交。
-预杂交于65℃在30ml下述杂交缓冲液中进行2小时：6X SSC(20XSSC含有3.0M NaCI、0.3M柠檬酸钠，pH7.0)、5X Denhardt′s(100XDenhardt’s含有2％Ficoll、2％聚乙烯吡咯烷酮、2％牛血清白蛋白)、0.5％SDS和20μg/ml变性载体DNA(单链鱼精DNA，平均长度为120-3000个核苷酸)
-在下述条件下进行杂交：
-通过在95℃加热5分钟和在冰上冷却5分钟来变性经标记的探针(每条序列20ng)，将其加入到15ml杂交缓冲液(与用于预杂交相同的缓冲液)中，
-杂交在65℃进行过夜。
-在杂交管中于65℃对印迹洗三次30分钟(一次用30ml6x SSC和0.1％SDS，两次用30ml2xSSC和0.1％SDS)，并用500ml2xSSC和0.1％SDS在盒中于65℃洗1次10分钟。
-于-70℃下将Kodak X-OMAT AR膜暴露给放射活性印迹4小时。
-基于阳性信号，通过筛选来自原种春油菜育种品系的BAC文库(总共阳性数：65)，捡出14个含有包含IND序列的BAC克隆的大肠杆菌菌落(下文中称为“阳性菌落”)
1.2分离包含全长IND序列的BAC克隆
为鉴定包含具有IND基因之一的全长基因组DNA序列的BAC克隆的阳性菌落，在从阳性菌落分离的BAC克隆DNA和从欧洲油菜分离的基因组DNA上进行Southern印迹分析：
-按照本领域所述，通过碱裂解，从在含有25μg/ml氯霉素的25mlLuria Broth培养基中生长的阳性菌落分离BAC克隆DNA。
-按照溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)方法，从欧洲油菜的叶组织分离基因组DNA(Doyle和Doyle，1987，Phytochemistry Bulletin19：11-15)。
-通过将含有溴化乙啶
的1％TBE 
琼脂糖凝胶
上每种样品1μl的条带密度与1、2、4、8和20μl含有25ng/μlLambda DNA
的溶液的条带密度才目比较，估计每种制备物的DNA浓度。
-应用厂商(New England Biolabs)建议的条件，用限制性酶EcoRI以20μl的最终反应体积，消化100-200ng BAC克隆DNA和1，7μg基因组DNA。消化时间和/或限制性酶的量被调节，以确保完全消化基因组DNA样品，并且没有非特异性的降解。
-在消化后，向消化的DNA样品中加入2μl含有RNA酶的上样染料(12.5ml1％二甲苯腈蓝FF；12.5ml1％溴酚蓝水溶性指示剂；25ml甘油；100μl0.5M EDTA pH8；1μlRNA酶(10mg/ml))，在37℃孵育样品30min。
-在1％TAE琼脂糖凝胶上上样。
-包括进经PstI消化的噬菌体Lambda DNA
或1kbp的DNA Ladder(Life Technologies)作为大小的标准。
-在电泳后，通过干燥碱性毛细管印迹，将DNA样品(消化的BAC克隆和基因组DNA)转移到尼龙膜上(Hybond-N+Amersham Pharmacia 
-如上所述，通过标准的Southern杂交程序，筛选具有消化的BAC克隆和基因组DNA的尼龙膜，进行BAC文库筛选，除基因组DNA外，在-70℃将Kodak XOMAT AR膜暴露于放射性印迹下2天。
-基于对用限制性酶EcoRI对鉴定的阳性菌落的BAC克隆DNA和从欧洲油菜分离的基因组DNA进行消化并用探针杂交之后获得的杂交模式的比较，将BAC克隆分为2组，对于2组中的每组，选择含有全长IND序列的BAC克隆(即IND-A1和IND-C1)。
-通过标准测序技术，测定选择的阳性菌落的BAC克隆中包含的IND序列(Agowa)。
表3：与Bn1-和Bn2-IND探针杂交的经消化的BAC克隆和基因组DNA 的杂交模式
实施例2-表征来自欧洲油菜的IND基因序列
对基因组DNA片段(分别是SEQ ID NO：5和7)进行测序之后，用FgeneSH(Softberry，Inc.Mount Kisco，NY，USA)和est2genome(Rice等人，2000，Trends in Genetics16(6)：276277；Mott，1997，Comput.Applic.13：477-478)，确定IND序列的编码区域，如序列表所示。
对在从芜青(AA)、甘蓝(CC)和欧洲油菜(AACC)分离的基因组DNA上和从实施例1中鉴定的阳性菌落分离的BAC克隆DNA(用EcoRI进行限制性消化，并与实施例1所述的探针杂交)上进行的Southern印迹分析中产生的杂交条带的比较表明，IND-A1序列来自A基因组，IND-C1序列来自C基因组。
原种春油菜育种品系的IND基因的蛋白质编码区域分别如SEQ IDNO：1(IND-A1)、SEQ ID NO：3的从第46位核苷酸至第633位核苷酸(IND-C1-短)和SEQ ID NO：3(IND-C1-长)所示。被这些核酸序列编码的IND-A1和IND-C1蛋白质序列分别如SEQ ID NO：2(IND-A1)、SEQID NO：4的从第16位氨基酸至第210位氨基酸(IND-C1-短)和SEQ IDNO：4(IND-C1-长)所示。
IND-A1和IND-C1-长的完全编码区域之间的百分比(核苷酸)序列同一性为81％，IND-AI和IND-C1-短的完全编码区域之间为87％，而编码IND-A1和IND-C1-长和-短bHLH结构域的区域之间的百分比(核苷酸)序列同一性(如根据Toledo-Ortiz等人，2003，Plant Cell15，1749-1770所确定的)为98％。这些百分比表明，IND基因在编码bHLH结构域的区 域中比编码区域其余部分中更保守。
类似地，完全IND-A1和IND-C1-长蛋白质之间的百分比(氨基酸)序列同一性为75％，完全IND-A1和IND-C1-短蛋白质之间为80％，而IND-A1和IND-C1-长和IND-C1-短的bHLH结构域之间的百分比(氨基酸)序列同一性(根据Toledo-Ortiz等人，2003，Plant Cell15，1749-1770所测定的)为98％。这些百分比表明IND蛋白质在bHLH结构域中要比IND蛋白质的其余部分中更保守。
实施例3-芸苔属IND基因的表达
为分析不同IND基因在不同组织中的表达，在从欧洲油菜叶、荚果壁、开裂区组织和种子分离的总RNA上，进行针对每种IND基因特异的RT-PCR测定，其中使用下述引物：
INDA1F15′AGGAGAGGAAGAGATGGATCC3′(SEQ ID No.37)
INDA1R15′TGAGTGTGAGGCTGAAGAAGC3′(SEQ ID No.38)用于IND-A1基因，以及
INDC1F15′CCTCATCATCTCCTTATGAAC3′(SEQ ID No.39)
INDC1R5′CGTATTGCATCTCCTTCATCT3′.(SEQ ID No.4o)
用于IND-C1基因。
结果显示，两种IND基因，即，IND-A1和IND-C1在叶组织和种子中都不表达，但在开裂区组织中表达，IND-A1基因在荚果壁中表达，IND-C1基因在荚果壁中不表达。
实施例4-产生和分离突变IND等位基因(ind)
按照下文所述，产生和鉴定实施例1中鉴定的IND基因中的突变：
-将来自原种春油菜育种品系的30，000颗种子(M0种子)在去离子或蒸馏水中于湿滤纸上预吸收2小时。将一半种子暴露给0.8％EMS，一半暴露给1％EMS(Sigma：M0880)并孵育4小时。
-将经诱变的种子(M1种子)漂洗3次，在通风橱中干燥过夜。在土 壤中种植30,000株M1植物，自交产生M2种子。针对每株各M1植物收获M2种子。
-种植从不同M1植物获得的二倍的4800株M2植物(two times4800M2pIants)，按照CTAB方法，从每株单个M2植物的叶样品制备DNA样品(Doyle和Doyle，1987，Phytochemistry Bulletin19：11-15)。
-通过按照标准测序技术(Agowa)进行直接测序，以及使用NovoSNP软件(VIB Antwerp)针对点突变的存在来分析序列，针对IND基因中导致在IND基因的蛋白质编码区域引入终止密码子或IND蛋白质中氨基酸取代(特别是在IND蛋白质的bHLH结构域中)点突变的存在，筛选DNA样品。
-由此鉴定出了下述突变IND等位基因(ind)：
表4a：IND-A1中的终止密码子和取代突变
表4b：IND-C1中的终止密码子突变
包含纯合状态的等位基因ind-a1-EMS01和ind-c1-EMS01的植物的参照种子已于2007年11月20日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA20110-2209，US)，登录号为 PTA-8796(株系名称07MBBN001171)，包含纯合状态的等位基因ind-a1-EMS05和ind-c1-EMS03的植物的参照种子已于2007年11月20日保藏于ATCC，登录号为PTA-8795(株系名称07MBBN000530)。
总之，上述实施例显示了如何产生和分离突变IND等位基因。此外，包含此类突变等位基因的植物材料可用于在植物中组合选择的突变和/或野生型等位基因，如下述实施例中所述。
实施例5-鉴定包含突变芸苔属IND等位基因的芸苔属植物
按照下文所述，鉴定包含实施例4中鉴定的IND基因中突变的芸苔属植物：
-对于M2植物的DNA样品中鉴定的每种突变IND基因，种植至少50株M2植物(包含IND突变，从与M2植物相同的M1植物获得)，从每种各M2植物的叶样品制备DNA样品。
-针对按照实施例4中所述鉴定的点IND突变的存在，筛选DNA样品。
-将包含相同突变的杂合和纯合(基于电泳图测定的)M2植物自交，收获M3种子。
实施例6-分析包含突变芸苔属IND基因的芸苔属植物的果实开裂性质
为测定芸苔属植物中突变IND基因存在与芸苔属植物果实开裂性质之间的相关性，在温室中和田间分析包含突变IND基因的芸苔属植物的果实开裂性质，这按照下文所述来进行：
-为检测果实裂爿边缘和种子荚果的开裂性质是否以及如何受到IND中突变的影响，将ind果实与野生型果实相比较，其中使用下述宏观测试：
(a)肉眼一般性地检查种子荚果和植物，测定某些突变IND等位基因的存在导致的荚果和植物表型的区别。测定荚果的表型：当荚果完整生长并被填充，恰在变黄之前，评估5个随机荚果(如果每种品系可获得多 株植物的话，则来自不同植物)中两片裂爿均不再能触及(在荚果的远端)的区域中描绘该区域的裂爿和喙的区域锐利程度，对其评定为1至5的分数：1表示分开裂爿和喙的区域呈清晰锯齿状(indentation)并且精细锐利；2表示分开裂爿和喙的区域一定程度上呈锯齿状且清晰，虽然较为模糊；3表示裂爿和喙仍可作为两个不同组织被观察到，但是在它们之间的过渡非常平滑；4表示裂爿和喙几乎就要不能作为不同组织被观察到；5表示裂爿和喙之间完全平滑过渡，两种组织类型之间没有任何清楚的区分，即，在荚果的远端裂爿和喙之间锯齿状越少，则分数越高。分数为1(裂爿和喙之间锐利锯齿状)对应于荚果的野生型表型，更具体地，荚果的荚果掉果敏感表型；2至4的分数(在裂爿和喙之间更逐步的过渡)对应于荚果的荚果掉果抗性表型，其中荚果掉果被显著降低或延迟，而同时保持荚果的农艺相关可脱粒性，使得仍可通过施加有限的物理力使荚果沿着开裂区开口；分数为5(裂爿和喙之间没有锯齿状)对应于荚果的荚果掉果抗性表型，其中落籽被降低或延迟到不再允许荚果的农艺相关可脱粒性的程度，从而施加有限的物理力不能使得荚果沿着开裂区开口。
(b)人工冲击测试(MIT)，以测定存在某些突变IND等位基因导致的荚果掉果抗性的增加：通过测定人工对荚果施加扭转使得闭合的成熟荚果开口所需的物理力，以半定量方式，比较包含突变IND等位基因的芸苔属品系和包含相应野生型IND等位基因的芸苔属品系的荚果掉果抗性的水平。在以最轻的扭转下即沿着开裂区完全开口的荚果、仅在开裂区基底开口并且需要更强的扭转来完全开口的荚果和仅被压碎但是不沿着开裂区开口的荚果之间存在区别。基于该物理力，对荚果的荚果掉果抗性计1至5分：1表示在最轻的扭转下荚果沿着开裂区完全开口，2-4表示荚果仅在开裂区基底开口并且需要更强的扭转来完全开口，5表示仅被压碎但是不沿着开裂区开口的荚果。
(c)随机冲击测试(RIT)，以测定某些突变IND等位基因的存在导致的荚果掉果抗性的增加：通过按照Bruce等人(2002，见上文)所述测定来自两种品系的荚果样品的半寿期，以定量方式，比较包含突变IND等位 基因的芸苔属品系和包含相应野生型IND等位基因的芸苔属品系的荚果掉果抗性的水平。更具体地，对来自每种品系的20个完整成熟荚果的两份重复样品进行RIT。将20个荚果与12.5mm直径的6个钢球放到一起，放在直径20cm并且其轴垂直的圆柱形容器中。然后在水平平面上对容器进行简单谐振运动，频率为4.98Hz，冲程51mm。在测试前确认为坚固的荚果被振荡10秒、20秒、40秒以及如果超过50％的荚果保持完整的话，80秒的累积时间。每段时间后开启鼓室，对闭合的荚果的数量加以计数。检查荚果，如果两片裂爿的开裂区均仍闭合的话，荚果被归类为“闭合”。因此如果一片或两片裂爿解离使得种子释放出来的话，荚果被归类为“开口”。如果大多数荚果在开裂区没有开口的情况下被破坏或损伤，样品被标记为“不可计数”。为给每个点相等的权重，通过加1和取log10，将数据均匀地间隔于独立变量-时间中。对开口的荚果的百分比p通过logit转化进行转化，即logitp＝loge(p/100-p)。然后用线性模型拟合转化时间和百分比数据，用其估计半寿期。
(d)田间测试，以测定荚果掉果抗性、可脱粒性和产量与植物中某些突变IND等位基因的存在之间的关系：在田间，在ind植物的土地块和野生型植物的土地块之间，通过测定和比较落籽(SHAT)的水平、联合收割机收获能力(CHA1)和脱粒能力(CHA2)以半定量方式，以及通过测定和比较联合收割后每块土地块的种子产量(YLDP)和对禾杆脱粒之后的种子产量(YLDS)以定量方式，比较包含突变IND等位基因的芸苔属品系和包含相应野生型IND等位基因的芸苔属品系的荚果掉果抗性、可脱粒性和产量的水平。对土地块计1-9的分数，以指示收获前土地块上的落籽水平：分数为1表示实践中土地块上的所有植物在收获前落粒，至分数为9表示实践中土地决上没有植物在收获前落粒。对土地块计1-5的分数来指示土地块上的联合收割机收获能力的水平，分数为1、至3或至5分别表示难于、可以或易于用联合收割机收获土地块。对土地块计1-5的分数来指示土地块的脱粒能力的水平：分数为1、至3或至5分别表示难于、可以或易于在联合收割机收获之后人工收获禾秆上剩下的种子。通过用联 合收割机收获每块土地块的种子并对种子加以称重，来测定联合收割之后每块土地块的种子产量(YLDP：表示为每块土地块的克)，通过在用联合收割机进行种子收获之后人工收获禾秆上剩下的种子，来测定禾秆脱粒后的种子产量(YLDS；表示为禾秆的重量％)。
-为更接近地检测种子荚果的裂爿边缘的细胞是否以及如何受到IND中突变的影响，通过显微评估种子荚果，将ind果实的切片与野生型果实的切片加以比较：
-外植体：从种植于植物生长室(每种基因型两个荚果)和/或田间的植物收获取自相似发育阶段(开花后大约35天(DAA)，近似对应于可见果皮开始变黄的发育阶段)和大小的荚果的近端和远端的大约3mm的外植体。从荚果上切出两个开裂区。
-固定：固定在具有10％福尔马林和0.25％戊二醛的100mM磷酸钾缓冲液(pH7)中进行总共4个小时。在1和2小时后进行15分钟的真空渗入(vacuum infiltration)。每次真空渗入后对固定剂加以再生。
-脱水：用100mM磷酸钾缓冲液(pH7)对标本进行2次30分钟的冲洗。室温下，用经0.85％的NaCI水溶液稀释的技术用乙醇进行脱水：50％乙醇中60分钟，70％乙醇中90分钟，80％乙醇中90分钟，90％乙醇中90分钟，95％乙醇中90分钟，100％乙醇中90分钟。
-包埋：用Leica7022-31731Historesin或Kulzer Histo-Technik7100(Heraeus)包埋试剂盒(三组分树脂(碱性(basic)树脂、活化剂和硬化剂)试剂盒)来进行包埋。按照下文所述，按厂商建议的比例使用三种组分：在50％乙醇/50％碱性树脂中对标本孵育4小时，在30％乙醇/70％碱性树脂(任选：4C进行)孵育过夜，在100％碱性树脂中孵育2至4小时，在碱性树脂再生和真空渗入20分钟(任选：4C进行)之后在100％碱性树脂中孵育1天，在碱性树脂+活化剂(1％)(“渗入介质”)中孵育1天(在该介质中真空渗入20分钟后)。用碱性树脂+活化剂(1％)+硬化剂(1ml，处于15ml中)(“包埋介质”) 洗涤标本。包埋在扁平包埋模具(AGAR扁平包埋模具G3531，腔为大约300μl：14mm长x6mm宽x4mm深)中进行：加入100-125μl包埋介质/腔，在55C对包埋介质进行大约1小时的聚合，将组织放到经聚合的包埋介质上(1个外植体/腔)，用包埋介质填充腔，在55C对包埋介质进行3至5小时的聚合，冷却模具，从模具上移走塑料块，在密封容器(例如eppendorf管)中于室温下贮藏。
-切片：将塑料块粘在1cm3perpex块的扁平侧，将其修剪为方形环绕标本。在显微镜用薄片切片机上，用ralph玻璃刀(在大约6的切割角度下，使用6mm厚的玻璃棒，在Reichert-Jung的组织刀制造器(histoknifemaker)的-1位上进行)切4μtm切片(每种基因型3至4个外植体，每个外植体大约25片)。将切片附到经Vectabond(Vectorlaboratories)处理的载玻片上。
-展示木质素：使用针对荧光进行了装备(采用Zeiss滤镜组02)的显微镜，观察放置在Eukitt中的未经染色的切片。木质素发出清楚的蓝色荧光。
-组织学评估：通过使用DIC-Normaski或自身荧光(采用Zeiss滤镜组18-激发BP390-420；发射LP450)，观察未经染色的切片。
6.1芸苔属植物中一个或两个突变芸苔属IND等位基因的存在和这些芸苔属植物果实开裂性质之间的关联
为测定芸苔属植物中杂合状态(基因型：IND-A1/ind-a1，IND-C1/IND-C1；或IND-A1/IND-A1，IND-C1/ind-c1)或纯合状态(基因型：ind-a1/ind-a1，IND-C1/IND-C1或IND-A1/IND-A1，ind-c1/ind-c1)的一个ind的存在和芸苔属植物的果实开裂性质之间的关联，在温室中种植实施例5鉴定的芸苔属植物(特别是纯合M2植物No.POSH101、POSH103、POSH104、POSH105和POSH106和杂合M2植物No.POSH105；关于相应的ind等位基因见表4a和b)，按照上文所述分析果实开裂性质。在野生型植物和这些杂合和纯合单突变植物之间没有观察到表型和果实开裂性 质的显著不同。
然而，用来自分离回交3(BC3)种群的纯合单ind突变(基因型：ind-a1/ind-a1，IND-C1/IND-C1或IND-A1/IND-A1，ind-c1/ind-c1)和野生型植物(基因型：IND-A1/IND-A1，IND-C1/IND-C1)进行的田间测试显示：纯合单ind突变植物有种子产量增加(见下表)。
6.2芸苔属植物中至少三个芸苔属IND等位基因的存在和这些芸苔属植物的果实开裂性质之间的关联
为测定芸苔属植物中至少三个突变IND等位基因的存在和芸苔属植物的果实开裂性质之间的关联，将实施例5中鉴定的包含突变IND等位基因的芸苔属植物和/或其后代互相杂交，按照上文所述分析后代芸苔属植物的果实开裂性质。
植物材料
品系51、品系45、品系176和品系48的后代(即具有基因型ind-a1/ind-a1， ind-c1/ind-c1的纯合双突变植物；具有基因型ind-a1/ind-a1， IND-C1/ind-c1和IND-A1/ind-a1，ind-c1/ind-c1的纯合单和杂合单——即三-突变植物以及具-有基因型IND-A1/IND-A1，IND-C1/IND-C1的野生型植物)，所述品系自身分别对等位基因IND-A1-EMS01和IND-C1-EMS01(品系51)、等位基因IND-A1-EMS01和IND-C1-EMS03(品系45)、等位基因IND-A1-EMS05和IND-C1-EMS01(品系176)和等位基因IND-A1-EMS05和IND-C1-EMS03(品系48)来说是杂合的(基因型：IND-A1/ind-a1，IND-C1/ind-c1)。
宏观评估：
a)肉眼观察种子荚果和植物。
-较之来自野生型IND同胞植物的荚果而言，来自双纯合突变IND同胞植物(基因型：ind-a1/ind-a1，ind-c1/ind-c1)(源于品系51、45、176和48)的荚果在未成熟阶段已经显示出改变的荚果形态。更具体地，较之来自野生型IND同胞植物的荚果(其显示出清晰界限的边缘)，双纯合突变IND同胞植物的荚果显示缺乏适当的裂爿边缘界限，特别是在果实的远端和近端处很明显。此外，在野生型同胞植物中荚果的远端处的裂爿和喙之间的锐利锯齿状在双同源ind同胞植物中很大程度上不存在，其显示出裂爿和喙组织之间更逐步的过渡。温室条件下，品系51的双纯合突变IND同胞植物的花有时显示出畸形的花瓣。此外，来自源于品系45的植物的荚果通常要比来自源于其它品系的植物的荚果更小。鉴于源于品系45的野生型和突变ind同胞植物中都有这种大小差异，这可能是该品系的背景突变导致的。
-来自以纯合状态包含一个ind等位基因和以杂合状态包含一个ind等位基因的植物(基因型：ind-a1/ind-a1，IND-C1/ind-c1或IND-A1/ ind-a1，ind-c1/ind-c1)的荚果显示出中间状态的表型。更具体地，较之双纯合突变IND同胞植物，这些突变IND同胞植物的荚果的裂爿边缘通常有更好的界限，但是野生型同胞植物中荚果远端的裂爿和喙之间的锐利锯齿状在这些突变植物中仍很大程度上不存在。
-表5a显示了按照上文所述对田间生长的植物的荚果的表型给的可视荚果分数：
表5a
b)人工冲击测试(MIT)：
-来自源于品系51、45、176和48的包含纯合状态的两个突变IND等位基因的植物(基因型：ind-a1/ind-a1，ind-c1/ind-cl)的荚果是完全荚果掉果抗性的(即使应用强烈扭转，荚果仍然不沿开裂区开口)。
-来自包含纯合状态的一个ind等位基因和杂合状态的一个ind等位基因的植物(基因型：ind-a1/ind-a1，IND-C1/ind-c1或IND-A1/ind-a1，ind-cl/ind-cl)的荚果的荚果掉果抗性较之来自其野生型同胞植物的荚果的荚果掉果抗性有所增加。但是应用有限的物理力之后荚果仍可沿着开裂区开口。
-表5b显示了按照上文所述，基于通过人工应用扭转使得闭合的成熟的荚果开口所需的物理力，对田间种植的植物的荚果的评分。
表5b
ND：未测定
c)随机冲击测试：
-如表5c所示，源于品系51的纯合双突变体(基因型ind-al/ind-al，ind-cl/ind-cl)的荚果的荚果样品的半寿期(“LD50”)显著高于源于品系45的纯合双突变体的荚果，这表示，包含IND-C1-EMS01等位基因(品系51)的纯合双突变植物要比包含IND-C1-EMS03等位基因(品系45)的纯合双突变植物更具荚果掉果抗性。
-表5c还显示：来自包含纯合状态的一个ind-cl等位基因和杂合状态的一个ind-al等位基因的植物(基因型：IND-A1/ind-al，ind-cl/ind-cl)的荚果的LD50值通常要高于来自包含纯合状态的一个ind-al等位基因和杂合状态的一个ind-cl等位基因的植物(基因型：ind-a1/ind-a1， IND-C1/ind-cl)的荚果，这表明，IND-C1等位基因中的突变对荚果掉果抗性的影响要比IND-A1等位基因中的突变更大。
表5c
*用于估计LD50高限和低限的数据不足
d)田间测试
表5d显示了按照上文所述针对指出的有/nd植物和野生型植物的田间土地块测定的落籽水平(SHAT)、联合收割机收获能力(CHA1)、脱粒能力(CHA2)、联合收割后每块土地块的种子产量(YLDP)和禾秆脱粒后的种子产量(YLDS)。产量WTSeg％值代表作为一种品系内(即，分 别是品系51、45、176或48)野生型分离子的百分比的YLDP。
表5d
显微评估：
-来自温室条件下生长的源于品系45的包含两个纯合状态的ind等位基因的植物(基因型：ind-al/ind-al，ind-cl/ind-cl)的荚果显示在整个完全开裂区中的木质化以及属于开裂区的细胞和相邻的细胞类型(例如维管组织细胞和正常情况下在内荚果壁发现的木质化细胞层(即enb细胞))的较少区别化(“强烈形态表型”)。对于在田间条件下生长的这些植物观察到了类似的荚果表型。相反，在来自温室条件下生长的源于品系51的包含两个纯合状态的ind等位基因的植物(基因型ind-al/ind-al，ind-cl/ind-cl)的荚果中，开裂区仍良好分化，并且大部分非木质化，但是开裂区却显示出额外的木质化，荚果壁在此处长到一起(“较弱的形态表型”)。在田间条件下生长的这些植物的荚果显示出与下文所述源于品系45的具有基因型IND-A1/ind-al，ind-cl/ind-cl的植物的荚果相似的木质化模式。当与从RIT获得的数据组合，这些数据可表明这些植物组合有“较 弱的形态表型”与较高的荚果掉果抗性。
-在温室条件下生长的源于品系45和51的包含一个纯合状态的ind等位基因和一个杂合状态的ind等位基因的植物(基因型：ind-al/ind-al，IND-C1/ind-cl或IND-A1/ind-al，ind-cl/ind-c1)的荚果不显示明显的表型。在田间条件下，来自源于品系45的具有基因型IND-A1/ind-al，ind-cl/ind-cl的植物的荚果较之来自其纯合双突变同胞(见上文)的植物的荚果显示出较不明显的形态表型。更具体地，在整个完全开裂区并不发生木质化，但这些植物的荚果仅显示数个额外的木质化细胞层，在此处内荚果壁与假隔膜相连(假隔膜两侧对称或仅单侧)。针对来自田间条件下生长的具有基因型IND-A1/ind-a1，ind-cl/ind-cl的源于品系51的植物荚果，观察到了类似的荚果表型。来自源于品系45和51的具有基因型ind-al/ind-al，IND-C1/ind-cl的植物的荚果在田间条件下不显示明显的表型。
实施例7-检测突变IND基因和/或将其转移进(原种)芸苔属品系
通过下述方法将突变IND基因转移进(原种)芸苔属育种品系：将含有突变IND基因的植物(供体植物)与(原种)芸苔属品系(原种亲本/回归亲本)或缺乏该突变IND基因的品种杂交。使用下述渐渗流程(突变IND基因被缩写为ind，野生型表示为IND)：
最初的杂交：ind/ind（供体植物)X IND/IND(原种亲本)
F1植物：IND/ind
BC1杂交：IND/ind X IND/IND(回归亲本)
BC1植物：50％IND/ind和50％IND/IND
使用分子标记(例如AFLP、PCR、InvaderTM等，还见下文)针对突变IND等位基因(ind)选择50％IND/ind。
BC2杂交：IND/ind(BC1植物)X IND/IND(回归亲本)
BC2植物：50％IND/ind和50％IND/IND
使用分子标记针对突变IND等位基因(ind)选择50％IND/ind。
重复回交直到BC3-BC6
BC3-6植物：50％IND/ind和50％IND/IND
使用分子标记针对突变IND等位基因(ind)选择50％IND/ind。为降低回交的数量(例如，进行到BC3而非BC6)，可使用特异于原种亲本遗传背景的分子标记：
BC3-6S1杂交：IND/ind X IND/ind
BC3-6S1植物：25％IND/IND和50％IND/ind和25％ind/ind
使用分子标记针对突变IND等位基因(ind)选择含有ind的植物。使用针对突变和野生型IND等位基因的分子标记，选择对于突变IND等位基因纯合的各BC3-6S1植物(ind/ind)。然后用这些植物进行种子生产。
为选择在IND等位基因中包含点突变的植物，可使用通过本领域已知的标准测序技术，例如，实施例4描述的那些的直接测序。或者，可开发PCR测定，来区别在IND等位基因中包含特定点突变的植物和不包含该特定点突变的植物。因此开发了下述区别性PCR测定，来检测实施例4中鉴定的突变等位基因(见表4)的存在与否和接合状态：
-模板DNA：
-分离自纯合或杂合突变芸苔属植物(包含突变IND等位基因，下文中被称为“IND-Xx-EMSXX”)的叶材料的基因组DNA
-野生型DNA对照：分离自野生型芸苔属植物(包含突变IND等位基因野生型等同物，下文中被称为“IND-Xx-WT”)的叶材料的基因组DNA
-阳性DNA对照：分离自已知包含IND-Xx-EMSXX的纯合突变芸苔属植物的叶材料的基因组DNA
-引物和从突变和相应野生型靶IND基因扩增的片段的长度示于表6中。通常，每个引物组由针对突变和野生型靶基因特异的一条引物(例如，引物POSH101R2对IND-A1-EMS01和IND-A1-wT特异)和针对核苷酸差异特异的一条引物(例如，引物POSH101MF1对IND-A1-EMS01特异，引物POSH101WF1对IND-A1-WT特异)构成。通常，后一引物的最后一个核苷酸匹配核苷酸差异(表6中下划线的核苷酸)，但是可加入一个(或多个)另外的靶特异性核苷酸，以改善引物及其靶序列之间的退火(见例如引物POSH108MR1”中的粗体表示的核苷酸，其特异于IND-C1-EMS03等位基因，这是较之引物POSH108WR1’(其特异于IND-C1-WT等位基因)而言)。
-PCR混合物：2.5μl10x PCR缓冲液(15mM MgC12)、0.25μldNTP’s(20mM)、1μl正向引物(10μM)、1μl反向引物(10μM)、0.25μlTaq-聚合酶(5U/μl)、19.5μlMilli-Q H2O、0.5μlDNA(20-50ng/μl）＝总体积25μl；
-热循环模式：95℃4分钟；30x[95C1分钟(变性)，在表6指出的退火温度进行1分钟，72℃2分钟(延伸)]；72℃5分钟；冷却至4℃。在MJ Research热循环仪PTC-200(Biozym)上，通过温度梯度PCR来确定最佳退火温度，其中，退火温度在57℃至70℃之间变化。对于野生型IND特异性引物来说的最佳退火温度是这样的温度，在该温度，可针对来自野生型芸苔属植物的DNA样品检测到预计大小的清晰PCR片段(如下文所述)而不能针对来自突变芸苔属植物的DNA样品检测到。对于突变IND特异性引物来说的最佳退火温度是这样的温度，在该温度，可针对来自突变芸苔属植物的DNA样品检测到预计大小的清晰PCR片段(见下文)而不能针对来自野生型芸苔属植物的DNA样品检测到。
-扩增之后，向15μlPCR样品中加入5μμl上样染料(橙色染料)，将样品上样到1.5％琼脂糖凝胶上。
-按照下文所述，评估对突变芸苔属植物的基因组DNA扩增之后获得的条带模式：
-在单次PCR运行和单份PCR混合物中，来自分离自突变芸苔属植物的叶组织的DNA样品的数据不应被接受，除非以下情况：
-野生型DNA对照显示出针对IND-Xx-WT特异性PCR测定的预计大小的PCR片段，而没有针对IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定的预计大小的PCR片段
-阳性DNA对照显示出针对IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定的预计大小的PCR片段，而没有针对IND-Xx-WT特异性PCR测定的预计大小的PCR片段
-没有显示出针对IND-Xx-WT特异性PCR测定的预计大小的PCR产物但是显示出针对IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定的预计大小的PCR片段的泳道表示，从其中制备基因组模板DNA的相应植物是IND-Xx-EMSXX的纯合突变体。
-显示出针对IND-Xx-WT特异性PCR测定和IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定的预计大小的PCR片段的泳道表示，从其中制备基因组模板DNA的相应植物是IND-Xx-EMSXX的杂合突变体。
-显示出针对IND-Xx-WT特异性PCR测定的预计大小的PCR片段但没有显示出针对IND-Xx-EMSXX特异性PCR测定的预计大小的PCR产物的泳道表示，从其中制备基因组模板DNA的相应植物是野生型植物。
表6：
或者，可使用InvaderTM技术(Third Wave Agbio)，来区分在IND等位基因中包含特定点突变的植物和不包含该特定点突变的植物。因此开发了下述区分性的InvaderTM探针，来检测实施例4中鉴定出的突变等位基因的存在与否和接合状态(见表7)：
-特异于突变或相应野生型靶IND基因的探针(分别被表示为“5’flap1-x”和“5’flap2-X”)和可与其组合使用的“侵入”探针示于表7中。通常，每个探针组由特异于突变或野生型靶基因的一个探针(其中5’flap序列后的第一个核苷酸匹配核苷酸差异(表7中下划线的核苷酸))(所谓的“基础探针(primary probe)”，例如，具有SEQ ID NO：26的探针特异于IND-A1-EMS01，具有SEQ ID NO：27的探针特异于IND-A1-WT)和特 异于核苷酸差异上游的核苷酸的一个探针(所谓的“
寡核苷酸”，例如，具有SEQ ID NO：25的探针特异于IND-A1-EMS01和IND-A1-WT之间的核苷酸差异上游的核苷酸)构成。后一引物的最后一个核苷酸可匹配突变中的核苷酸差异(如表6中粗体核苷酸所示)，但是也可使用其它核苷酸作为该最后一个核苷酸，只要满足下述条件即可：与靶DNA杂交时，基础探针t-和
寡核苷酸仍能形成单碱基重叠，产生
酶(Third Wave Agbio)识别的特异性的侵入结构。
-InvaderTM测定流程和数据解释按照厂商(Third Wave Agbio)所述来进行。简言之，表7中标示为“flap1”和“flap2”的核苷酸序列代表5’”flap”的序列，其在InvaderTM测定的基础阶段从基础探针上被切下，并且分别与FRETTM盒1和2中的序列互补，但是不与靶突变或野生型序列互补。如果在基础阶段切下基础探针，在第二阶段，flap1和/或flap2-探针分别与FRETTM盒1和2杂交，则产生信号，分别指示样品中突变或相应野生型靶IND基因的存在。
表7
Claims (13)
1.IND-C1基因的突变等位基因，其中，所述IND-C1基因包含选自下述的核酸分子：
(a)核酸分子，其由SEQ ID NO：3的序列或SEQ ID NO：7的序列组成；
(b)核酸分子，其编码下述蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列由SEQID NO：4的序列组成；
其中所述突变等位基因编码下述蛋白质，所述蛋白质在H2结构域的保守Leu残基之前的位置上的氨基酸被取代为终止密码子。
2.根据权利要求1的突变等位基因，其中所述突变等位基因编码下述蛋白质，所述蛋白质的对应于SEQ ID NO：2的第50位的氨基酸密码子被取代为终止密码子，或其中所述突变等位基因编码下述蛋白质，所述蛋白质的对应于SEQ ID NO：4的第135位的氨基酸密码子被取代为终止密码子。
3.根据权利要求1或2所述的突变等位基因编码的突变IND蛋白质。
4.在两个基因座包含至少两个IND基因的芸苔属植物细胞，其特征在于，其包含至少两个根据权利要求1或2的突变IND等位基因。
5.权利要求4的芸苔属植物细胞，其是从保藏在ATCC的登录号为PTA-8796的种子或从保藏在ATCC的登录号为PTA-8795的种子可获得的。
6.在生物样品中鉴别根据权利要求1或2的突变IND等位基因的方法，包括确定生物样品中存在的核酸中的突变IND等位基因的突变的DNA区域的存在，包括使用包含引物或探针的组的试剂盒，对所述生物样品进行聚合酶链式反应测定，所述组选自：
a.引物或探针的组，其中，所述引物或探针之一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域的5’侧翼的DNA区域，所述引物或探针之另一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域的3’侧翼的DNA区域，
b.引物或探针的组，其中，所述引物或探针之一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域的5’或3’侧翼的DNA区域，且所述引物或探针之另一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域，
c.引物或探针的组，其中，分别地，所述引物或探针之一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域的5’或3’侧翼的DNA区域，且所述引物或探针之另一特异性识别所述突变IND等位基因的突变DNA区域和3’或5’侧翼区域之间的连接区域；
d.探针，其特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域和突变的DNA区域的5’或3’侧翼的DNA区域之间的连接区域。
7.在生物样品中鉴定根据权利要求1或2所述的突变IND等位基因的试剂盒，所述试剂盒包含引物或探针的组，所述组选自：
-引物或探针的组，其中，所述引物或探针之一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域的5’侧翼的DNA区域，且所述引物或探针之另一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域的3’侧翼的DNA区域，
-引物或探针的组，其中，所述引物或探针之一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域的5’或3’侧翼的DNA区域，且所述引物或探针之另一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域，
-引物或探针的组，其中，分别地，所述引物或探针之一特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域的5’或3’侧翼的DNA区域，且所述引物或探针之另一特异性识别所述突变IND等位基因的突变DNA区域和3’或5’侧翼区域之间的连接区域；
-探针，其特异性识别所述突变IND等位基因的突变的DNA区域和突变的DNA区域的5’或3’侧翼的DNA区域之间的连接区域。
8.根据权利要求5的方法或根据权利要求6的试剂盒，其中所述引物或探针的组选自下述：
-引物组，其包含在其最3’末端由SEQ ID NO：19的序列组成的一条引物和/或在其最3’末端由SEQ ID NO：21的序列组成的一条引物，
-引物组，其包含在其最3’末端由SEQ ID NO：22的序列组成的一条引物和/或在其最3’末端由SEQ ID NO：24的序列组成的一条引物，
-探针组，其包含在其最3’末端由SEQ ID NO：31的序列组成的一条探针和/或由SEQ ID NO：32的序列组成的一条探针，
-探针组，其包含在其最3’末端由SEQ ID NO：34的序列组成的一条探针和/或由SEQ ID NO：35的序列组成的一条探针。
9.增加包含至少两个IND基因的芸苔属植物的种子产量的方法，所述方法包括在所述芸苔属植物的基因组中引入所述至少两个IND基因之一的两个完全敲除的突变纯合IND等位基因，其中所述完全敲除的突变等位基因选自根据权利要求1或2的突变等位基因。
10.在其基因组中包含至少两个IND基因的芸苔属植物用于育种具有增加的种子产量的植物的用途，其特征在于所述至少两个IND基因的至少两个IND等位基因是根据权利要求1或2的突变等位基因。
11.从在其基因组中在两个基因座包含至少两个IND基因的芸苔属植物可获得的种子荚果用于栽种和生长来自所述植物的后代的用途，其特征在于所述至少两个IND基因的至少两个IND等位基因是根据权利要求1或2的突变等位基因。
12.从保藏在ATCC的保藏号为PTA-8796的种子或从保藏在ATCC的保藏号为PTA-8795的种子可获得的植物用于育种具有增加的种子产量的植物的用途，所述植物在其基因组在两个基因座包含至少两个IND基因，其特征在于所述至少两个IND基因的至少两个IND等位基因是根据权利要求2的突变等位基因。
13.根据权利要求1或2的突变等位基因用于在芸苔属植物中增加种子产量的用途。
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