JP5951527B2

JP5951527B2 - 検体検出装置及び検出方法

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Publication number: JP5951527B2
Application number: JP2013045394A
Authority: JP
Inventors: 本郷　禎人; 禎人本郷; 賢太郎小林; 古山　英人; 英人古山
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Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2013-03-07
Filing date: 2013-03-07
Publication date: 2016-07-13
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Description

本発明の実施形態は、ウイルスや細菌等を検出するための検体検出装置及び検出方法に関する。

近年、インフルエンザウイルスの検査のために、金コロイド粒子を修飾した抗体を利用してウイルスの検出及びＡ型Ｂ型の型判別を行う、簡易検査キットが病院や診療所等で用いられている。ところが、現状用いられている簡易検査キットでは、最低検出感度が低く、インフルエンザ感染から数時間では、未だ体内でのウイルス増殖が充分ではなく陽性との判定が出ない、と云ういわゆるウインドウピリオドの問題がある。

なお、遺伝子検査を行えば、最低検出感度不足に伴う不検出の課題は解決されると考えられるが、遺伝子検査は高額であり、しかも検査時間がかかるという問題がある。また、微細孔を通過する微粒子の形状やサイズを１個ずつ検出する装置はあるが、形状やサイズが同等のウイルスについて判別することはできていない。従って、短時間で簡便に、しかも高感度でウイルスや細菌を検出できる装置は存在していないのが現状である。

特表２０１１−５０１８０６号公報

発明が解決しようとする課題は、ウイルスや細菌等を短時間で、且つ高感度に検出することのできる検体検出装置及び検出方法を提供することである。

実施形態の検体検出方法は、第１の領域と第２の領域を区画する絶縁性の隔壁と、前記隔壁に開口され前記第１の領域と前記第２の領域を連通する微細孔と、前記第１の領域に配置された第１の電極と、前記第２の領域に配置された第２の電極と、を具備した検体検出装置を用い、前記第１の領域に検体を導入すると共に、被検出物の第１の部位に特異的に結合する第１の抗体、前記被検出物よりもサイズが大きく前記第１の抗体に結合している第１のタグ粒子、前記被検出物の第２の部位に特異的に結合する第２の抗体、及び前記被検出物よりもサイズが大きく前記第２の抗体に結合している第２のタグ粒子を含む試薬を導入し、且つ、前記第２の領域に通電可能な液体を充填し、前記第１の電極と前記第２の電極との間に前記微細孔を通した通電を行い、前記第１の領域内の被検出物が前記微細孔を通過するときの前記第１の電極と前記第２の電極の間の通電状態の変化を観測し、前記第１のタグ粒子通過に伴う通電状態の変化と前記第２のタグ粒子通過に伴う通電状態の変化とが連続若しくは複合的に検出される場合に前記検体液に前記被検出物が存在していると判定する。

第１の実施形態に係わるバイオ分子検出装置に用いた検出部の概略構成を示す図。粒子サイズによって電流信号が異なることを示す図。第１の実施形態に用いる試薬の例を示す図。第１の実施形態で検出される電流信号を示す図。第２の実施形態に用いる試薬の例を示す図。第２の実施形態で検出される電流信号を示す図。第３の実施形態に用いる試薬の例を示す図。第３の実施形態で検出される電流信号を示す図。第４の実施形態に用いる試薬の例を示す図。第４の実施形態で検出される電流信号を示す図。第５の実施形態を説明するためのもので、第１〜第４の実施形態において被検出物が多量にある場合の結合状態を示す図。第６の実施形態に係わるバイオ分子検出装置に用いた検出部の概略構成を示す図。第６の実施形態の変形例を示す図。

以下、実施形態の検体検出装置及び検出方法を、図面を参照して説明する。

（第１の実施形態）
（検出部の構成）
図１は、第１の実施形態に係わるバイオ分子検出装置に用いた検出部の概略構成を示す断面図である。

図１に示すように、バイオ分子検出装置における検出部は、液体を充填可能な測定容器１０を備えている。この容器１０は、絶縁性の隔壁２１により第１のチャンバ（第１の領域）１１と第２のチャンバ（第２の領域）１２とに区画されている。隔壁２１には、前記第１のチャンバ１１と前記第２のチャンバ１２とを連通するように微細孔２２が開口されている。微細孔２２は、検出対象物としての微粒子の径よりも僅かに大きいものである。隔壁２１は、微細孔２２の周辺部を除いて、十分な厚さを有する基板２３により支持されている。

容器１０の壁には、第１の電極３１と第２の電極３２が設けられている。第１の電極３１は、一部が第１のチャンバ１１内に露出するように設けられている。第２の電極３２は、一部が第２のチャンバ１２内に露出するように設けられている。そして、第１及び第２の電極３１，３２は、直流電源３５及び計測回路３６に直列に接続されている。

容器１０は、全体又は第１のチャンバ１１の内部、第２のチャンバ１２の内部、第１の電極３１との接触部分、第２の電極３２との接触部分が電気的及び化学的に不活性な材質により構成されていればよい。例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ₂、ＳｉＮ、Ａｌ₂Ｏ₃などから形成すればよい。

隔壁２１は、電気的及び化学的に不活性であり、且つ絶縁性の材質、例えば、ガラス、サファイア、セラミック、樹脂、ゴム、エラストマー、ＳｉＯ₂、ＳｉＮ、Ａｌ₂Ｏ₃などにより形成すればよい。

（計測方法）
図１の装置を用いて、微粒子の大きさ及び形状を測定する方法を、以下に説明する。

第１のチャンバ１１内及び第２のチャンバ１２内に通電可能な液体を充填する。このとき、第１のチャンバ１１内と第２のチャンバ１２内との間には、微細孔２２を介して液絡が取れている。第１のチャンバ１１内には、測定対象物である被検出物（バイオ分子）と後述する試薬が含まれる。第１の電極３１の一部及び第２の電極３２の一部は、それぞれ第１のチャンバ１１及び第２のチャンバ１２内に挿入されて液体に浸漬されている。

第１のチャンバ１１及び第２のチャンバ１２に含まれる液体は、第１の電極３１と第２の電極３２との間に通電可能な液体であればよい。通電可能な液体としては、例えばＫＣｌ水溶液などの電解質溶液、ＴＥ（Tris Ethylene diamine tetra acetic acid）緩衝溶液やＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）緩衝溶液などの緩衝溶液などを用いることができる。

第１のチャンバ１１内と第２のチャンバ１２内に、通電可能な溶液が満たされた状態で、第１の電極３１と第２の電極３２との間に通電する。そして、この通電により発生する電流値を経時的に測定する。このとき、第１のチャンバ１１内の被検出物４０は、電場により微細孔２２を通り第２のチャンバ１２内に移動する。

被検出物４０が微細孔２２を通過するときの電流値は、図２に模式的に示したように被検出物４０の大きさ及び性状に依存して変化する。図２の場合、被検出物４０が小さい場合は小さい電流変化ピークＡとなり、被検出物４０が大きくなるに伴い電流変化ピークはＢ，Ｃと大きくなる。被検出物４０が微細孔２２を通過するときに現れる電流変化は、被検出物４０の性状により変化し、被検出物４０が前記した通電可能な液体を流れる電流を遮蔽するように機能する場合は電流値が低下し、逆に被検出物４０が電流を流れ易くする場合は電流値が増加する。

（試薬の構成と検出信号)
本実施形態では、検体内に存在している可能性がある検出対象物（バイオ分子）が１種類である場合を考える。図３（ａ）に示すように、検出対象物に特異的に結合する捕捉物質４２（例えば抗体）及び該捕捉物質４２が結合しているタグ粒子４３を、試薬とする。この試薬を検体内に導入することにより、検出対象物４１が検体内に存在する場合、図３（ｂ）に示すように、タグ粒子４３が捕捉物質４２を介して検出対象物４１に結合することになる。タグ粒子４３としては、例えば負に帯電した球状のポリスチレン微粒子を用いることができる。

次に、検体と上記の試薬を第１のチャンバ１１内に充填する。このとき、第２のチャンバ１２内には、通電可能な液体を充填しておく。なお、検体は、被検出物が含まれている可能性のある液体であり、更に通電可能な液体である。検体が通電可能な液体でない場合、又は検体だけでは第１のチャンバ１１内に十分に液体が供給されない場合は、検体を通電可能な液体に溶かし込んで第１のチャンバ１１内に導入すればよい。

この状態で、第１の電極３１と第２の電極３２との間に電圧を印加し通電させる。すると、第１のチャンバ１１内の微粒子は、微細孔２２を通り、第２のチャンバ１２内に移動する。そして、その際に電流値がパルス的に変化する。

電流値の変化量は、図４に示すように、通過粒子のサイズや形状に応じて変化する。即ち、検出対象物４１単独の場合（Ａ）、検出対象物４１ではない粒子単独の場合（Ｂ）、タグ粒子４３単独の場合（Ｃ）では、微粒子の大きさに応じた離散的な検出信号、即ち単峰のパルス状信号となる。

これに対し、検出対象物４１とタグ粒子４３が捕捉物質４２を介して結合している場合（Ｄ、Ｅ）、信号変化量がＡ〜Ｃとは大きく異なったものとなる。即ち、検出対象物４１とタグ粒子４３が微細孔２２に対して直列に通過、即ち順次時系列で通過する場合（Ｄ）は、検出対象物４１の通過に伴う電流とタグ粒子４３の通過に伴う電流とが連続して測定される。つまり、連続した２つの検出信号が双峰のパルス状信号として得られる。一方、検出対象物４１とタグ粒子４３が微細孔２２に対して並列的に通過、即ち並行に横並び状態で通過する場合（Ｅ）は、検出対象物４１の通過に伴う電流とタグ粒子４３の通過に伴う電流とが複合的に測定される。つまり、検出信号がピークの大きな単峰のパルス状信号として得られる。さらに、検出対象物４１とタグ粒子４３が微細孔２２に対してＤとＥの中間状態、即ち、斜めに並んで通過する場合、ＤとＥの中間的な応答信号が得られることは述べるまでもないことである。

従って、計測回路３６の検出信号を識別することにより、検出対象物４１が捕捉物質４２と結合した状態であるかどうかを判別することが可能となる。よって、検出対象物４１と同様のサイズ、形状を持ったバイオ分子でも、捕捉物質４２が結合する型であるか、結合しない型であるのかを判別することが可能である。

また、一定時間のモニタにより図４中のＤ、Ｅの信号をカウントすることによって、検出対象物の濃度を測定することも可能である。

なお、上記の方法によって判別可能であるのは、検出対象物４１とタグ粒子４３とが同等のサイズである場合である。検出対象物４１のサイズが、１００ｎｍ以上である場合が現実的であり、好ましくは３００ｎｍ以上、より好ましくは５００ｎｍ以上の場合である。タグ粒子４３のサイズも検出対象物４１のサイズに合わせて、同等サイズの微粒子にすることが好ましい。

また、図１の装置では、微粒子が１個ずつ微細孔２２を通過する信号を検出することが可能である。従って、検出対象物４１が１個でもあれば、それを捕捉する捕捉物質２２及びタグ粒子４３との結合粒子として検出することが可能である。

このように本実施形態によれば、検体と共に、検出対象物４１に結合する捕捉物質４２及びこの捕捉物質４２に結合しているタグ粒子４３からなる試薬を導入し、微細孔２２を微粒子が通過するときの電流値を測定することにより、捕捉物質４２と結合する検出対象物４１の有無を判定することができる。従って、抗原抗体反応の特異性を利用して、同等のサイズや形状を持つウイルスや細菌等の中から、特定のウイルスや細菌等を短時間で、且つ高感度に検出・識別することができる。

ここでは、検出対象物４１に対して、１箇所でのみ捕捉物質４２が結合する単純な場合について記述したが、その限りではない。検出対象物４１に対して、捕捉物質４２が複数の部位で結合する場合でも、同様に考えることができる。なお、捕捉物質４２が複数の部位で結合する場合、タグ粒子と検出対象物のサイズは必ずしも同等である必要はなく、本実施形態の主旨通り他の単体粒子信号との識別が可能であればよい。

（第２の実施形態）
本実施形態に用いるバイオ分子検出装置の構成は、第１の実施形態で説明した図１と同様とする。

本実施形態では、検体内に存在している可能性がある検出対象物（バイオ分子）が１種類であり、しかも微細であり単独での電流検出信号強度が小さい場合を考える。

第１の実施形態と同様に、その検出対象物に特異的に結合する捕捉物質（抗体）が結合しているタグ粒子のみを試薬とした場合、検出対象物が小さいために、検出対象物とタグ粒子との結合状態とタグ粒子単独とのサイズの差が小さいものとなる。即ち、検出対象物とタグ粒子との結合状態と、タグ粒子単独での電流検出信号強度を比較しても、電流信号強度に明確な差異を得ることは困難である。

そこで、図５（ａ）に示すような検出対象物４１の第１の部位に特異的に結合する第１の捕捉物質４２が結合している第１のタグ粒子４３と、図５（ｂ）に示すような検出対象物４１の第２の部位に特異的に結合する第２の捕捉物質４４が結合している第２のタグ粒子４５とを、試薬とする。この場合、検出対象物４１が検体内に存在する場合、図５（ｃ）に示すように、第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子４５が、それぞれ第１の捕捉物質４２及び第２の捕捉物質４４を介して結合する。

第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子４５が結合した複合粒子のサイズは、第１のタグ粒子４３及び第２のタグ粒子４５の単独の場合よりも格段に大きいものとなり、複合粒子による電流検出信号は他とは大きく異なることになる。このため、第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子４５が結合した複合粒子による電流検出信号を観測した場合、検出対象物４１が存在していることの証左となる。

即ち、検出対象物４１のサイズが微細であっても、第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子４５を観測可能なサイズとすることによって、充分に検出可能となる。タグ粒子のサイズとしては、１００ｎｍ以上で好ましくは３００ｎｍ以上、より好ましくは５００ｎｍ以上とすれば良い。また、第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子４５のサイズは、等しくても良いし、異なっていても良い。

また、捕捉物質４２と捕捉物質４４とが同一の種類であり、検出対象物の別の部位に結合する場合でも、同等である。即ち、タグ粒子が検出対象物を介して結合した複合粒子の形態になっていることが電流信号から観測されれば、検出対象物の存在が示される訳である。更には、捕捉物質４２と捕捉物質４４とが同一の種類であり、検出対象物の別の部位に複数結合する場合でも、同等である。これにより、ウィルスなどの非常に小さな粒子でも高感度に検出することが可能になる。

図６には、様々な状態の電流検出信号を模式的に示してある。電流値の変化量は、第１の実施形態の場合と同様に、通過粒子のサイズや形状に応じて異なる。即ち、検出対象物が単独の場合、検出対象物が微細のため電流信号強度が極めて小さく（Ａ、Ｂ）、殆ど検出されない。一方、検出対象物に結合していないタグ粒子単独の場合、信号変化量は少し大きくなるものの、単純な単独粒子を示す信号波形（Ｃ、Ｄ）となる。

これらに対し、検出対象物４１を介して第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子４５が結合している場合（Ｅ、Ｆ）、信号変化量又は信号波形がＡ〜Ｄとは大きく異なったものとなる。即ち、複合粒子が縦に連なって微細孔２２を通過した際には、連続した双峰のパルス状信号（ダブルピーク波形）（Ｅ）が観測され、複合粒子が横並びになって微細孔２２を通過した際には、大きな単峰のパルス状信号（シングルピーク信号）（Ｆ）が観測される。また、第１の実施形態同様、ＥとＦの中間状態、即ち、斜めに並んで通過する場合、ＥとＦの中間的な応答信号が得られる。何れもＡ〜Ｄに対して異なる信号となり、検出対象物４１が存在していることを判別可能となる。

このように本実施形態によれば、試薬として、検出対象物４１の第１の部位に特異的に結合する第１の捕捉物質４２が結合している第１のタグ粒子４３と、検出対象物４１の第２の部位に特異的に結合する第２の捕捉物質４４が結合している第２のタグ粒子４５とを用いることにより、検体内に存在している可能性がある検出対象物４１が極めて微細であっても検出することが可能となる。従って、先の第１の実施形態と同様の効果が得られるのは勿論のこと、極めて微細なウイルスや細菌等であっても抗原抗体反応の特異性を利用して、同等のサイズや形状を持つウイルスや細菌等の中から、高感度に検出・識別できる利点がある。

ここでは、単純化のため、検出対象物４１に対して、第１の部位と、第２の部位の２箇所にタグ粒子が捕捉物質を介して結合する場合について記述したが、その限りにあらず、もっと多くの部位に結合する場合であっても、同等に考えることが可能である。即ち、タグ粒子が検出対象物を介して結合した複合粒子の形態になっていることが電流信号から観測されれば、検出対象物の存在が示される訳である。

（第３の実施形態）
本実施形態に用いるバイオ分子検出装置の構成は、第１の実施形態で説明した図１と同様とする。

本実施形態では、検体内に存在している可能性がある検出対象物（バイオ分子）が２種類である場合を考える。

図７（ａ）に示すような、第１の検出対象物４１に特異的に結合する第１の捕捉物質（第１の抗体）４２が結合している第１のタグ粒子４３と、図７（ｂ）に示すような、第２の検出対象物５１に特異的に結合する第２の捕捉物質（第２の抗体）５２が結合している第２のタグ粒子５３を、試薬とする。ここで、第１のタグ粒子４３と、第２のタグ粒子５３とのサイズとが異なるようにしておく。この試薬を検体内に導入することにより、図７（ｃ）に示すように、タグ粒子４３が捕捉物質４２を介して検出対象物４１に結合し、図７（ｄ）に示すように、タグ粒子５３が捕捉物質５２を介して検出対象物５１に結合することになる。

次に、検体と上記の試薬を第１のチャンバ１１内に充填する。第２のチャンバ１２内には通電可能な液体が充填されているものとする。この状態で、第１の電極３１と第２の電極３２との間に電圧を印加し通電させる。すると、第１のチャンバ１１内の微粒子は、微細孔２２を通り、第２のチャンバ１２に移動する。そして、その際に電流値がパルス的に変化する。

電流値の変化量は、図８に示すように、通過粒子のサイズや形状に応じて異なる。即ち、第１の検出対象物４１単独の場合（Ａ）、第２の検出対象物５１単独の場合（Ｂ）、第１のタグ粒子４３単独の場合（Ｃ）、第２のタグ粒子５３単独の場合（Ｄ）では、微粒子の大きさに応じた離散的な検出信号となる。

これに対し、第１の検出対象物４１と第１のタグ粒子４３が第１の捕捉物質４２を介して結合している場合（Ｅ、Ｇ）、第２の検出対象物５１と第２のタグ粒子５３が第２の捕捉物質５２を介して結合している場合（Ｆ、Ｈ）では、信号変化量がＡ〜Ｄとは大きく異なったものとなる。即ち、第１の検出対象物４１と第１のタグ粒子４３との結合粒子が縦に連なって微細孔２２を通過する場合（Ｅ）、第２の検出対象物５１と第２のタグ粒子５３との結合粒子が縦に連なって微細孔２２を通過する場合（Ｆ）では、連続した２つのピークを持つ検出信号が双峰のパルス状信号として得られる。さらに、第１の検出対象物４１と第１のタグ粒子４３との結合粒子が横並びになって微細孔２２を通過する場合（Ｇ）、第２の検出対象物５１と第２のタグ粒子５３との結合粒子が横並びになって微細孔２２を通過する場合（Ｈ）は、信号変化量の大きな単峰のパルス状検出信号が得られる。また、前述の実施形態同様、それぞれの検出対象物とタグ粒子が斜めに並んで通過する場合、ＥとＧ又はＦとＨの中間的な応答信号が得られる。

ここで、第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子５３の大きさを異ならせておくことによって、第１の検出対象物４１と第１のタグ粒子４３との結合粒子が通過する場合と、第２の検出対象物５１と第２のタグ粒子５３との結合粒子が通過する場合とを区別することができる。

従って、第１の検出対象物４１と第２の検出対象物５１がそれぞれ単独では、サイズの違いが殆どなく、単独での電流信号の差異が認められない場合でも、第１の検出対象物４１と第１のタグ粒子４３が結合した状態の電流信号であるか、第２の検出対象物５１と第２のタグ粒子５３とが結合した状態の電流信号であるかどうかを判別することが可能となる。よって、検体中に存在する検出対象物が、第１の検出対象物４１であるのか、第２の検出対象物５１であるのかを、若しくは両方であるのか、又は何れも存在しないのかを判別することが可能となる。

この構成によって判別可能であるのは、検出対象物とタグ粒子とが同等のサイズである場合である。検出対象物のサイズが、１００ｎｍ以上である場合が現実的である。好ましくは３００ｎｍ以上、より好ましくは５００ｎｍ以上の場合である。ここで、第１の検出対象物４１と第２の検出対象物５１のサイズがほぼ同等である場合、第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子５３とで、１０％以上サイズを違えることにより、識別が容易となる。

なお、上記の例では、２種類の検出対象物を識別する場合について記載したが、３種類以上であっても、同様の考え方で、タグ粒子を増やせば識別可能となる。

このように本実施形態によれば、試薬として、検出対象物４１に特異的に結合する第１の捕捉物質４２が結合している第１のタグ粒子４３と、検出対象物５１に特異的に結合する第２の捕捉物質５２が結合している第２のタグ粒子５３とを用いることにより、検体内に存在している可能性がある複数種の検出対象物４１，５１を独立して検出することが可能となる。従って、先の第１の実施形態と同様の効果が得られるのは勿論のこと、検体内に存在している可能性があるウイルスや細菌等が複数種であっても、抗原抗体反応の特異性を利用して、同等のサイズや形状を持つウイルスや細菌等の中から、高感度に検出・識別できる利点がある。

ここでは、検出対象物に対して、１箇所でのみ捕捉物質が結合する単純な場合について記述したが、その限りではない。検出対象物に対して、捕捉物質が複数の部位で結合する場合でも、同様に考えることができる。

（第４の実施形態）
本実施形態に用いるバイオ分子検出装置の構成は、第１の実施形態で説明した図１と同様とする。

本実施形態では、検体内に存在している可能性がある検出対象物（バイオ分子）が２種類であり、しかも微細であり単独での電流検出信号が小さい場合を考える。

第３の実施形態と同様に、検出対象物に特異的に結合する捕捉物質（抗体）が結合しているタグ粒子を試薬として、検出対象物とタグ粒子との結合状態と、タグ粒子単独での電流検出信号強度を比較しても、検出対象物が小さい場合には、サイズの差が小さいため、電流信号強度に明確な差異を得ることが困難である。

そこで本実施形態では、図９に示すように、第１の検出対象物に結合する２つのタグ粒子と、第２の検出対象物に結合する２つのタグ粒子を、試薬として用いる。図９（ａ）は、第１の検出対象物４１の第１の部位に特異的に結合する第１の捕捉物質４２が結合している第１のタグ粒子４３である。図９（ｂ）は、第１の検出対象物４１の第２の部位に特異的に結合する第２の捕捉物質４４が結合している第２のタグ粒子４５である。さらに、図９（ｃ）は、第２の検出対象物５１の第１の部位に特異的に結合する第３の捕捉物質５２が結合している第３のタグ粒子５３である。図９（ｄ）は、第２の検出対象物５１の第２の部位に特異的に結合する第４の捕捉物質５４が結合している第４のタグ粒子５５である。

この試薬を検体内に導入することにより、図９（ｅ）に示すように、タグ粒子４３，４５が捕捉物質４２，４４を介して検出対象物４１に結合することになる。さらに、図９（ｆ）に示すように、タグ粒子５３，５５が捕捉物質５２，５４を介して検出対象物５１に結合することになる。ここで、第１及び第２のタグ粒子４３，４５と、第３及び第４のタグ粒子５３，５５とのサイズは異なるようにしておく。

次に、検体と上記の試薬を第１のチャンバ１１内に充填して、先の実施形態と同様に検査を行う。第１〜第３の実施形態と同様に、電流値の変化量は、図１０に示すように、検出対象物単独、タグ粒子単独、複合粒子であるかに応じて異なる。

本実施形態の場合、第１の検出対象物４１が検体内に存在する場合には、第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子４５が、第１の検出対象物４１を介して結合する。さらに、第２の検出対象物５１が検体内に存在する場合には、第３のタグ粒子５３と第４のタグ粒子５５が、第２の検出対象物５１を介して結合する。即ち、第１のタグ粒子４３と第２のタグ粒子４５が結合した複合粒子による電流検出信号を観測した場合、第１の検出対象物４１が存在していることを示している。さらに、第３のタグ粒子５３と第４のタグ粒子５５が結合した複合粒子による電流検出信号を観測した場合、第２の検出対象物５１が存在していることを示していることになる。これにより、単独では微細で識別が困難な検出対象物であっても、タグ粒子による信号を計測することにより、識別が可能になる。

即ち、検出対象物サイズが微細であっても、タグ粒子を観測可能なサイズとすることによって、充分に検出可能となる。タグ粒子のサイズとしては、１００ｎｍ以上で好ましくは３００ｎｍ以上、より好ましくは５００ｎｍ以上とすれば良い。また、第１のタグ粒子４３のサイズと第２のタグ粒子４５のサイズとは、等しくても異なっていても良い。同様に、第３のタグ粒子５３のサイズと第４のタグ粒子５５のサイズとは、等しくても異なっていても良い。但し、第１及び第２のタグ粒子４３，４５と第３及び第４のタグ粒子５３，５５とで識別できるように設定し、識別すべきタグ粒子間で１０％以上サイズを違えることにより識別が容易となる。

このように本実施形態によれば、検体内に単独では微細で識別が困難な複数種の検出対象物が存在する場合でも、タグ粒子による信号を計測することによって、識別が可能になる。従って、先の第１の実施形態と同様の効果が得られるのは勿論のこと、検体内に存在している可能性があるウイルスや細菌等が複数種であり、更に極めて微細であっても、抗原抗体反応の特異性を利用して、同等のサイズや形状を持つウイルスや細菌等の中から、高感度に検出・識別できる利点がある。

（第５の実施形態）
第１〜第４の実施形態では、一つのタグ粒子に対して検出対象物が一つ結合している場合について述べてきた。これは、検体中に検出対象物が少量しか存在していない場合に成り立つ場合が多い。この場合には、捕捉物質が結合したタグ粒子の方が検出対象物と比較して圧倒的に多量にあり、タグ粒子１個に対して、複数の検出対象物が結合した状態は殆ど見られず、せいぜい１個の検出対象物が結合した状態になる。従って、この場合には、検出対象物単体とタグ粒子との複合信号が得られる。

また、１つの検出対象物に対して、第１の部位と第２の部位にそれぞれ結合する２種類のタグ粒子を試薬として用いた場合、検出対象物と第１のタグ粒子とを混合した後に、第２のタグ粒子と混合すると、検出対象物と第１のタグ粒子と第２のタグ粒子とが１個ずつ結合した状態の複合粒子か、全く結合していない粒子かの何れかが存在した状態となる。この場合には、第１のタグ粒子、検出対象物単体、第２のタグ粒子の複合信号が得られる。

これらに対し、検体中に検出対象物が多量に存在する場合、図１１（ａ）、（ｂ）に示すように、一つのタグ粒子に対して検出対象物が複数結合する場合がある。この場合には、タグ粒子サイズよりも、結合している複数の検出対象物サイズだけ大きな複合粒子が生成され、これが微細孔２２を通過した際には更に大きな電流信号変化が計測されることになる。

また、検出対象物の異なる部位に結合する第１のタグ粒子と第２のタグ粒子とを試薬として用いた場合、検出対象物と第１のタグ粒子とを混合した後に、第２のタグ粒子を混合すると、図１１（ｃ）、（ｄ）に示すように、第１のタグ粒子のまわりに検出対象物が複数結合し、更に、第２のタグ粒子がそれぞれの検出対象物に結合することになる。この場合には、第１のタグ粒子と、複数の検出対象物と、複数の第２のタグ粒子を加えたサイズの複合粒子が生成され、これが微細孔２２を通過した際も、より大きな電流信号変化が計測されることになる。

なお、図１１には、タグ粒子の全ての捕捉物質に検出対象物が結合した場合のみを図示しているが、必ずしもその限りではない。一部だけに結合している場合でも、タグ粒子単独の信号や、別の検出対象物にタグ粒子が結合している場合の信号と、波形や強度が異なるため、識別可能であることは言うまでもない。

また、検出対象物が複数存在する場合、それぞれに対応するタグ粒子のサイズが異なるものを選択することになるため、複合粒子のサイズも異なることになる。その結果、得られる電流信号の強度も異なるため、検出対象物の種類を識別することが可能となる。

今まで、様々な実施形態について記述してきたが、何れにせよ、検出対象物の種類を識別するためには、検出対象物に特異的に結合する捕捉物質が結合しているタグ粒子が単独ではなく、複合粒子の状態で存在していることが検出できれば良いものである。

（第６の実施形態）
図１２は、第６の実施形態に係わるバイオ分子検出装置に用いた検出部の断面構成を示す図である。

Ｓｉ基板６１上にＳｉＯ₂等の絶縁膜６２が設けられている。Ｓｉ基板６１には貫通穴６３が形成されている。絶縁膜６２には、貫通穴６３に連通する微細孔６４が形成されている。絶縁膜６２上には、微細孔６４と同軸的に円板状の第１の電極７１が形成されている。そして、Ｓｉ基板１１の裏面には絶縁膜６５が設けられ、この絶縁膜を介して、貫通穴６３と同軸的に円板状の第２の電極７２が形成されている。

また、電極としては第１及び第２の電極７１，７２があればよいが、図１３に示すようにこれに加えて、絶縁膜６２中に微細孔６４を挟んで左右に対向する第３の電極７３と第４の電極７４とを埋め込み形成しても良い。

上記図１２の構成は、通常の半導体製造プロセスにより作製することができる。例えば、Ｓｉ基板６１の表面上に熱酸化やＣＶＤ等でＳｉＯ₂絶縁膜６２を形成し、その上に第１の電極７１となる導電膜を形成し、裏面側にＳｉＯ₂絶縁膜６５を形成し、その上に第２の電極７２となる導電膜を形成する。そして、パターンエッチングにより表面側の導電膜を第１の電極パターンに加工し、絶縁膜６２に微細孔６４を開口する。さらに、裏面側の導電膜を第２の電極パターンに加工し、Ｓｉ基板６１に貫通穴６３を形成すればよい。

また、図１３の構成は、例えば、Ｓｉ基板６１の表面上に熱酸化やＣＶＤ等でＳｉＯ₂絶縁膜６２を形成し、その上に第３、第４の電極７３、７４となる導電膜を形成し、微細孔６４の開口部分で微細孔６４の開口径より僅かに狭い幅のストライプパターンにエッチングし、熱酸化やＣＶＤ等でＳｉＯ₂絶縁膜６２を追加積層し、その上に第１の電極７１となる導電膜を形成し、裏面側にＳｉＯ₂絶縁膜６５を形成し、その上に第２の電極７２となる導電膜を形成する。そして、パターンエッチングにより表面側の導電膜を第１の電極パターンに加工し、絶縁膜６２に上記ストライプパターンを分断するように微細孔６４を開口する。さらに、裏面側の導電膜を第２の電極パターンに加工し、Ｓｉ基板６１に貫通穴６３を形成すればよい。

上記構成の検出部に、上側に通電可能な溶液と試薬を充填可能な第１のチャンバ（液体を充填可能にするキャップ容器）を付加し、下側に通電可能な溶液を充填可能な第２のチャンバを付加する。そして電極７１，７２間に流れる電流を測定することにより、第１〜第５の実施形態に適用して被検出物を検出することが可能となる。

また、図１３に示した例により電極７３，７４間に流れる電流を測定することによっても、微細孔６４を通過する微粒子を検出することができる。具体的には、被検出物が微細孔６４を通過する際の電極７３，７４間のインピーダンス変化を観測することにより検出する。インピーダンス変化は、交流インピーダンスの変化、抵抗値の変化（電流変化又は電圧変化）などを観測すればよく、微細孔６４と被検出物との間隙がｎｍオーダーになればトンネル電流での観測も可能になる。図１３の例の場合、電極７３，７４間の距離が短いことから、微粒子の通過による電気信号の変化を高い感度で測定することが可能となり、微粒子の検出精度をより高めることが可能となる。

このように本実施形態によれば、半導体材料を用い、通常の半導体プロセスを用いるのみで、バイオ分子検出装置の検出部を作製することができる。これにより、検出部を極めて小さく、且つ低コストに作製することができる。

（変形例）
なお、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではない。

実施形態に用いた検出部の構成は、前記図１、図１２又は図１３に何ら限定されるものではなく、２つのチャンバ間に微細孔を有し、各チャンバ間で電極により通電できる構成であればよい。さらに、必ずしも検出部自体に第１，第２の電極が固定されている必要はなく、使用の際に第１の電極を第１のチャンバ内の液体に接触させ、第２の電極を第２のチャンバ内の液体に接触させる構成とすれば良い。あるいは、開放型の容器等を用いて、第１の領域及び第２の領域間に微細孔を設け、第１の領域に第１の電極を配置し、第２の領域に第２の電極を配置し、第１の電極と第２の電極の間を通電できるような構成であってもよい。

また、タグ粒子としては、ポリスチレンに限らず、他のビーズでも良く、石英ビーズや磁気ビーズ、更には金属微粒子を用いることも可能である。タグ粒子の形状は、球形が識別しやすいため好ましいが、必ずしもその限りではない。また、タグ粒子の帯電状態についても、負電荷に限らず、正電荷に帯電していても良いが、複数の種類のタグ粒子を混合した試薬を用いるときには、負電荷、正電荷の何れかに揃えておくことが好ましい。さらに、磁気ビーズを用いる際には、磁場によって、粒子を移動させるため、必ずしも表面電荷にはこだわらなくても良い。勿論、検出電流の変化は粒子通過により減少することでも増加することでも良く、通電する液体と検出する粒子の材質等の組合せで設定すればよい。

また、複数種のタグ粒子を用いる場合、必ずしもその大きさを異ならせることに限らず、形状、帯電電位、導電率、電子親和力、又は質量を異ならせるようにしても良い。これらの違いによっても、微細孔を通過する際の電流値の変化の違いを測定することができる。さらに、実施形態では被検出物が微細孔を通過するときの電流値を測定したが、必ずしも電流値に限らず、電圧値や交流インピーダンス等の他の信号変化を測定することでも可能である。

また、検出対象物としては、必ずしもウイルスや細菌等のバイオ分子に限るものではなく、粒子通過により液体に流れる電流（イオン電流、トンネル電流など）の値が変化する微粒子であれば検出することが可能である。

本発明の幾つかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

１０…測定容器
１１…第１のチャンバ（第１の領域）
１２…第２のチャンバ（第２の領域）
２１…隔壁
２２，６４…微細孔
２３…基板
３１，７１…第１の電極
３２，７２…第２の電極
３５…直流電源
３６…計測回路
４０…被検出物
４１，５１…検出対象物（バイオ分子）
４２，４４，５２，５４…捕捉物質（抗体）
４３，４５，５３，５５…タグ粒子
６１…Ｓｉ基板
６２，６５…絶縁膜
６３…貫通穴
７３…第３の電極
７４…第４の電極

Claims

第１の領域と第２の領域を区画する絶縁性の隔壁と、前記隔壁に開口され前記第１の領域と前記第２の領域を連通する微細孔と、前記第１の領域に配置された第１の電極と、前記第２の領域に配置された第２の電極と、を具備した検体検出装置を用い、
前記第１の領域に検体を導入すると共に、被検出物の第１の部位に特異的に結合する第１の抗体、前記被検出物よりもサイズが大きく前記第１の抗体に結合している第１のタグ粒子、前記被検出物の第２の部位に特異的に結合する第２の抗体、及び前記被検出物よりもサイズが大きく前記第２の抗体に結合している第２のタグ粒子を含む試薬を導入し、且つ、前記第２の領域に通電可能な液体を充填し、
前記第１の電極と前記第２の電極との間に前記微細孔を通した通電を行い、前記第１の領域内の被検出物が前記微細孔を通過するときの前記第１の電極と前記第２の電極の間の通電状態の変化を観測し、
前記第１のタグ粒子通過に伴う通電状態の変化と前記第２のタグ粒子通過に伴う通電状態の変化とが連続若しくは複合的に検出される場合に前記検体液に前記被検出物が存在していると判定することを特徴とする検体検出方法。
前記被検出物は、微粒子であることを特徴とする請求項１記載の検体検出方法。