JP6334118B2 - 単分子識別方法、装置、及びプログラム - Google Patents

Description

本発明は、単分子識別方法、装置、及びプログラムに関する。

従来、タンパク質を構成するアミノ酸、核酸を構成するヌクレオチド、糖鎖を構成する単糖など、生体分子、特に生体高分子を構成する単分子を識別することが行われている。単分子の識別には、例えば、光、電気等をプローブ信号とする単分子測定を用いた識別法が存在する。単分子測定を用いた識別法では、対象試料に対して、蛍光分子や電気活性を有するプローブ分子を修飾することで、特定の単分子の検出を可能としている。

しかし、上述のプローブ分子を修飾する単分子の検出方法では、化学試薬が必要であることや、修飾効率が問題となる。さらに、特定の化学種のみしか検出できず、多種多様な分子種が混在する生体試料を対象とした単分子の識別には適用することができない、という問題がある。

また、多種多様な単分子を識別するためには、高感度な測定シグナルを得ること、及び測定シグナルの標準化が必要である。

高感度な測定シグナルを得ることができる単分子の識別方法として、電極間距離を１ｎｍ以下に固定したナノギャップ電極を用いて、単分子を流れるトンネル電流を測定することにより、単分子識別を行う技術が提案されている（例えば、特許文献１〜５参照）。トンネル電流を用いた測定では、単分子の電子エネルギー状態を直接測定することができる。

また、測定シグナルの標準化に関連して、サンプルに混合する試薬に被検物質の測定に関与しない別の物質である内部標準物質を入れ、その内部標準物質を測定し、真のサンプルの採取量との誤差を補正することにより、正確な被検物質の定量値を得る電気化学的測定方法が提案されている（例えば、特許文献６及び７参照）。

特開２０１３−３６８６５号公報 米国特許出願公開第２０１２／０３２２０５５号明細書 米国特許出願公開第２０１３／０００１０８２号明細書 米国特許出願公開第２０１２／０１９３２３７号明細書 米国特許出願公開第２０１０／００２５２４９号明細書 特開２０１１−１６３９３４号公報 特開２００８−３２５２９号公報

トンネル電流測定のような、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別では、測定の仕方や状態に応じて、測定結果が左右されるため、測定シグナルを標準化することが必要である。そこで、トンネル電流測定による単分子識別に、特許文献６及び７のような標準化を適用し、試料分子自体を内部標準物質とした相対コンダクタンスを定義することで、間接的な標準化を行うことは可能である。

しかし、内部標準物質を十分に測定するために、測定時間が長時間化するという問題がある。また、上述のような標準化は、未知分子を含む試料には適用することができないため、未知分子を含む試料を測定する場合には、分離及び精製等の手順が必要となる。このように、ギャップ電極デバイスを用いた微量電流測定に、従来の標準化方法を適用するには、限定的な試料や条件下でしか適用することができない、という問題がある。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、未知分子を含む試料に対しても、分離及び精製等の手順を必要とすることなく、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別を行うことができるように標準化した単分子識別方法、装置、及びプログラムを提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明の単分子識別方法は、電極間を通過する際に電極間に流れる微量電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が、前記電極間を通過した際に流れた微量電流に応じたシグナルを測定するステップと、測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別するステップと、を含む。

これにより、ギャップ電極を用いた微量電流測定のように、測定の仕方や状態に応じて、測定結果が左右される場合でも、標準物質を示す安定したシグナルを得ることができるため、未知分子を含む試料に対しても、分離及び精製等の手順を必要とすることなく、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別を行うことができるように標準化することができる。

また、前記標準物質を、電気伝導性を有し、かつ前記識別対象の単分子と結合しない同一形状の物質とすることができる。これにより、識別対象の単分子を示すシグナルとの区別が容易な標準物質を示すシグナルを得ることができる。

また、前記標準物質を、前記電極間を通過する際の前記電極間に対する姿勢が同一となる物質とすることができる。これにより、測定毎の標準物質を示すシグナルの大きさが均一化される。

また、前記標準物質の形状を、球形とすることができる。これにより、電極の構成にかかわらず、測定毎の標準物質を示すシグナルの大きさが均一化される。

また、前記標準物質を、金属ナノ粒子またはフラーレンとすることができる。

また、前記複数のシグナルに対する前記標準物質を示すシグナルの割合が予め定めた割合範囲となるように、前記試料に対する前記標準物質の濃度を最適化することができる。これにより、標準物質を示すシグナルを安定して検出することができると共に、標準物質を示すシグナルがノイズとなることを防止することができる。

また、前記識別するステップで、前記標準物質を示すシグナルに対する前記複数のシグナルの相対値、及び単分子の種類とシグナルの相対値との予め定めた関係に基づいて、前記他のシグナルが示す単分子の種類を識別することができる。

また、前記測定するステップで、異なる複数の電極間距離に対応した異なる複数の標準物質が添加された試料について、電極間距離が異なる複数の状態毎に、前記微量電流に応じたシグナルを測定し、前記識別するステップで、前記状態毎に、測定された複数のシグナルに含まれる該当の状態に対応した標準物質を示すシグナルと、前記他のシグナルとを比較し、各状態における比較結果に基づいて、前記他のシグナルが示す単分子の種類を識別することができる。これにより、より精度の高い識別を行うことができる。

また、本発明の単分子識別装置は、電極間を通過する際に電極間に流れる微量電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料が、前記電極間を通過する際に、微量電流が流れるように配置された電極対と、前記試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が、前記電極間を通過した際に流れた微量電流に応じたシグナルを測定する測定部と、前記測定部により測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別する識別部と、を含んで構成することができる。

また、本発明の単分子識別プログラムは、コンピュータを、電極間を通過する際に電極間に流れる微量電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料が、前記電極間を通過する際に、微量電流が流れるように配置された電極対の電極間を、前記試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が通過した際に流れた微量電流に応じたシグナルを測定するように測定部を制御する測定制御部、及び前記測定部により測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別する識別部として機能させるためのプログラムである。

本発明に係る単分子識別方法、装置、及びプログラムによれば、測定の仕方や状態に応じて、測定結果が左右されるギャップ電極を用いた微量電流測定においても、標準物質による安定したシグナルを得ることができるため、未知分子を含む試料に対しても、分離及び精製等の手順を必要とすることなく、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別を行うことができるように標準化することができる。

第１の実施の形態に係る単分子識別装置の構成を示す概略図である。 第１の実施の形態における制御部の機能的構成を示すブロック図である。 コンダクタンス−時間プロファイルの模式的な一例を示す図である。 第１の実施の形態における相対コンダクタンステーブルの一例を示す図である。 第１の実施の形態における単分子識別を説明するための図である。 コンダクタンスのヒストグラムの一例を示す図である。 コンダクタンスのヒストグラムの一例を示す図である。 標準物質の濃度の最適化を説明するための図である。 第１の実施の形態における単分子識別処理を示すフローチャートである。 第２の実施の形態に係る単分子識別装置の構成を示す概略図である。 第２の実施の形態における制御部の機能的構成を示すブロック図である。 電極間距離毎の各アミノ酸のコンダクタンスの一例を示す図である。 第２の実施の形態における相対コンダクタンステーブルの一例を示す図である。 第２の実施の形態における単分子識別を説明するための図である。 第２の実施の形態における単分子識別処理を示すフローチャートである。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。以下の実施の形態では、微量電流として、電極間を単分子が通過した際に流れるトンネル電流を測定する場合を例に説明する。

＜第１の実施の形態＞
図１に示すように、第１の実施の形態に係る単分子識別装置１０は、ナノギャップ電極対１２、測定用電源１８、電気泳動用電極対２０、電気泳動用電源２２、電流計２４、及び制御部２６を含んで構成されている。以下に、各構成について説明する。

ナノギャップ電極対１２は、一部に絶縁膜１４を設けた対向する２つの電極が、試料５０に含まれる単分子５２及び標準物質５４（詳細は後述）が電極間を通過する際に、トンネル電流が流れるような距離を隔てて配置されている。ナノギャップ電極対１２の具体的な作製方法は特に限定されない。

測定用電源１８は、ナノギャップ電極対１２に対して電圧を印加する。測定用電源１８によってナノギャップ電極対１２に印加する電圧の大きさは特に限定されず、例えば、０．２５Ｖ〜０．７５Ｖとすることができる。測定用電源１８の具体的な構成は特に限定されず、適宜、公知の電源装置を用いることが可能である。

電気泳動用電極対２０は、試料５０に含まれる単分子５２及び標準物質５４の移動方向（図１中のブロック矢印Ａ）に電界を形成するように配置される。電気泳動用電極対２０の電極間に電界が形成されると、単分子５２及び標準物質５４が電気泳動により、電界方向に移動する。すなわち、単分子５２及び標準物質５４がナノギャップ電極対１２の電極間を通過するように移動する。

電気泳動用電源２２は、電気泳動用電極対２０に対して電圧を印加する。電気泳動用電源２２によって電気泳動用電極対２０に印加する電圧の大きさは特に限定されず、ナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２及び標準物質５４が通過する速さを制御することができる電圧を適宜設定することができる。電気泳動用電源２２の具体的な構成は特に限定されず、適宜、公知の電源装置を用いることが可能である。

電流計２４は、測定用電源１８により電圧が印加されたナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２及び標準物質５４が通過した際に生じるトンネル電流を測定する。電流計２４の具体的な構成は特に限定されず、適宜、周知の電流測定装置を用いればよい。

制御部２６は、単分子識別装置１０の各構成を制御すると共に、測定されたトンネル電流に応じたシグナルに基づいて、単分子５２の種類を識別する。

制御部２６は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、及び後述する単分子識別プログラムが格納されたＲＯＭ（Read Only Memory）等を備えたコンピュータで構成することができる。このコンピュータで構成される制御部２６は、機能的には、図２に示すように、電気泳動制御部３０、測定制御部３２、及び識別部３４を含んだ構成で表すことができる。以下、各部について詳述する。

電気泳動制御部３０は、単分子５２及び標準物質５４が、ナノギャップ電極対１２の電極間を通過するように、電気泳動用電源２２による電圧の印加を制御する。

測定制御部３２は、ナノギャップ電極対１２の電極間に流れるトンネル電流を測定するように電流計２４を制御する。トンネル電流の測定時間は限定されないが、例えば、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、１時間とすることができる。また、測定制御部３２は、電流計２４で測定されたトンネル電流の電流値を取得し、取得した電流値からコンダクタンスを計算し、コンダクタンス−時間プロファイルを作成する。コンダクタンスは、トンネル電流を測定した際にナノギャップ電極対１２に印可されていた電圧Ｖで、トンネル電流の電流値を除することにより、計算することができる。コンダクタンスを用いることにより、ナノギャップ電極対１２間に印加する電圧値が測定毎に異なる場合でも、統一された基準のプロファイルを得ることができる。なお、測定毎にナノギャップ電極対１２間に印加する電圧値を一定とした場合には、トンネル電流の電流値とコンダクタンスとは、同等に扱うことができる。

また、測定制御部３２は、電流計２４で測定されたトンネル電流を、電流増幅器を用いて一旦増幅してから取得するようにしてもよい。電流増幅器を用いることによって、微弱なトンネル電流の値を増幅することができるため、トンネル電流を高感度に測定することが可能となる。電流増幅器としては、例えば、市販の可変高速電流アンプ(Femto社製、カタログ番号：ＤＨＰＣＡ−１００）を用いることができる。

識別部３４は、測定制御部３２により作成されたコンダクタンス−時間プロファイルに表れる複数のシグナルに含まれる標準物質５４を示すシグナルを基準にして、他のシグナルが示す単分子の種類を識別する。

図３に、コンダクタンス−時間プロファイルの模式的な一例を示す。コンダクタンス−時間プロファイルに表れる複数のシグナルとは、図３に示すように、ピーク値を有する部分であり、ピーク毎に１つのシグナルに対応する。従って、図３の例では、Ａに示す部分には、１つのシグナルが存在し、Ｂに示す部分には、４つのシグナルが存在することを示している。

また、図３の例で、Ａに示す部分のシグナルは、標準物質５４を示すシグナルであり、Ｂに示す部分のシグナル群に含まれる各シグナルは、単分子５２を示すシグナルである。この場合、標準物質５４を示すシグナルのコンダクタンス、及び標準物質５４を示すシグナルのコンダクタンスに対する識別対象の単分子５２の種類毎の相対コンダクタンスが既知であれば、各シグナルが示す単分子の種類を識別することができる。

具体的には、標準物質５４の固有コンダクタンスに対する識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを、相対コンダクタンステーブル３６に予め記憶しておく。図４に、相対コンダクタンステーブル３６の一例を示す。そして、識別部３４は、図５に示すように、得られたコンダクタンス−時間プロファイルに表れた標準物質５４を示すシグナル以外のシグナルのコンダクタンスと、相対コンダクタンステーブル３６に記憶された識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスとを比較し、相対コンダクタンスが一致する単分子の種類を、そのシグナルが示す単分子の種類として識別する。なお、相対コンダクタンスが一致するとは、完全に一致する場合に限らず、両者の差が所定の閾値以下となる場合も含む。

ここで、上記のように、相対コンダクタンス値を用いて、各シグナルが示す単分子５２の種類を識別するために、どのような標準物質５４を用いることが好ましいかについて説明する。

トンネル電流等のギャップ電極を用いた微量電流測定では、電極と、電極間を通過する分子との距離が、測定される微量電流の大きさに影響を与える。従って、電極間を通過する際の電極間に対する姿勢が均一とならない分子の場合、測定毎にコンダクタンス（シグナルの大きさ）にばらつきが生じてしまう。例えば図６に示すように、複数回の測定により得られたコンダクタンスのヒストグラムを作成した際に、ヒストグラムの分散が大きい物質は、標準物質５４として用いることに適さない。そこで、標準物質５４として、測定毎のコンダクタンスの変動が少ない物質を用いる。例えば図７に示すように、複数回の測定により得られたコンダクタンスのヒストグラムの分散が小さい物質が、標準物質５４として用いることに適している。

このように、測定毎のコンダクタンスの変動を少なくするためには、電極間を通過する際の電極間に対する姿勢が同一となる物質を標準物質５４として用いる。例えば、電極間と物質の形状との関係で電極間を通過する際の姿勢が一意に定まる物質や、電気泳動等により、電極間を通過する際の姿勢が同一になるように制御できる物質などが挙げられる。また、物質の形状が球形であれば、電極との関係を考慮したり、電気泳動等の制御を行ったりすることなく、電極間を通過する際の姿勢が同一になる。

また、標準物質５４を示すシグナルは、基準として用いるため、識別対象の単分子５２を示すシグナルとは明確に区別可能なシグナルとなることが好ましい。このため、標準物質５４としては、電気伝導性を有し、識別対象の単分子と結合しない物質であることが好ましい。また、基準として安定したシグナルとするために、試料５０内に含まれる標準物質は同一形状であることが好ましい。さらに、図３に示すように、単分子５２を示すシグナルとの差が大きいことが望ましいため、識別対象の単分子５２と比較して、大きな固有コンダクタンスを有する物質が好ましい。

上記の条件を考慮して、標準物質５４として、金属ナノ粒子またはフラーレンを用いることができる。金属ナノ粒子としては、例えば金ナノ粒子、銀ナノ粒子、銅ナノ粒子、アルミナノ粒子等が挙げられる。なお、識別対象の単分子５２の大きさが０．５〜２ｎｍ程度の場合には、標準物質５４としてフラーレンを用いることが適している。また、識別対象の単分子５２の大きさが２ｎｍ以上の場合には、標準物質５４として金ナノ粒子を用いることが適している。

次に、第１の実施の形態に係る単分子識別装置１０を用いて行われる単分子識別方法について説明する。

まず、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子５２を溶液に溶解させる。溶液は、特に限定されない。例えば、超純水を用いることができる。超純水は、例えば、ミリポア社のMilli-Q Integral 3 （装置名）（Milli-Q Integral 3/5/10/15 （カタログ番号））を用いることによって作製することができる。溶液中の単分子５２の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１〜１．０μＭである。

次に、単分子５２を溶解させた溶液に、上述したような標準物質５４を添加する。溶液中の標準物質５４の濃度は、コンダクタンス−時間プロファイルに表れる複数のシグナルに対する標準物質５４を示すシグナルの割合が、所定範囲となるように最適化する。図８に示すように、標準物質５４の濃度が低い場合には、コンダクタンス−時間プロファイルにおける標準物質５４を示すシグナル（図８中のＡ）が少なくなるため、標準物質５４を示すシグナルを安定して検出することができない。一方、標準物質５４の濃度が高い場合には、コンダクタンス−時間プロファイルにおける標準物質５４を示すシグナルが多くなり、そのシグナルがノイズとなる。そこで、識別の安定性とノイズの低減とのバランスを考慮した最適なシグナル数となるように、上記の所定範囲を定めておく。

そして、試料５０中にナノギャップ電極対１２を配置し、測定用電源１８により、ナノギャップ電極対１２に電圧を印加すると共に、電気泳動用電源２２により、電気泳動用電極対２０に電圧を印加する。そして、制御部２６を構成するコンピュータのＣＰＵが、ＲＯＭに格納された単分子識別プログラムを読み出して実行することにより、単分子識別装置１０により、図９に示す単分子識別処理が行われる。

図９に示す単分子識別処理のステップＳ１０で、測定制御部３２が、電流計２４を制御し、ナノギャップ電極対１２の電極間を単分子５２及び標準物質５４が通過する際に生じたトンネル電流を、所定時間測定させる。

次に、ステップＳ１２で、測定制御部３２が、測定されたトンネル電流の電流値を取得し、測定点毎にコンダクタンスを計算し、例えば図３に示すようなコンダクタンス−時間プロファイルを作成する。次に、ステップＳ１４で、識別部３４が、相対コンダクタンステーブル３６から、識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを取得する。

次に、ステップＳ１６で、識別部が、上記ステップＳ１２で作成されたコンダクタンス−時間プロファイルと、上記ステップＳ１４で取得した相対コンダクタンスとを比較して、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。次に、ステップＳ１８で、識別部３４が、識別結果を出力して、単分子識別処理を終了する。

以上説明したように、第１の実施の形態に係る単分子識別装置及び方法によれば、標準物質として、ナノギャップ電極間に流れるトンネル電流から作成したコンダクタンス−時間プロファイルにおけるコンダクタンスの変動が小さい物質を用いる。そして、コンダクタンス−時間プロファイルにおける標準物質を示すシグナルのコンダクタンスを基準にして、他のシグナルが示す単分子の種類を識別する。これにより、未知分子を含む試料に対しても、分離及び精製等の手順を必要とすることなく、ギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別を行うことができるように標準化することができる。

＜第２の実施の形態＞
次に、第２の実施の形態について説明する。なお、第１の実施の形態に係る単分子識別装置１０と同一の部分については、同一符号を付して詳細な説明を省略する。

図１０に示すように、第２の実施の形態に係る単分子識別装置２１０は、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、測定用電源１８、電気泳動用電極対２０、電気泳動用電源２２、電流計２４、及び制御部２２６を含んで構成されている。

ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の構成は、第１の実施の形態におけるナノギャップ電極対１２と同様である。ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々は、各電極間の中心が同一軸上に並ぶように、絶縁膜１４を介して積層されている。すなわち、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間により、単分子５２及び標準物質５４が通過する一つの通路を形成している。ナノギャップ電極対１２Ａの電極間距離はｄ１、ナノギャップ電極対１２Ｂの電極間距離はｄ２、ナノギャップ電極対１２Ｃの電極間距離はｄ３で各々異なる。図１０の例では、ｄ１＞ｄ２＞ｄ３である。例えば、ｄ１＝１．０ｎｍ、ｄ２＝０．７ｎｍ、ｄ３＝０．５ｎｍとすることができる。

制御部２２６は、図１１に示すように、電気泳動制御部３０、測定制御部２３２、及び識別部２３４を備えた構成で表すことができる。

測定制御部２３２は、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間で生じたトンネル電流を、各々測定するように電流計２４を制御する。また、測定制御部２３２は、電流計２４で測定された電極間距離毎のトンネル電流の電流値を取得してコンダクタンスを計算し、電極間距離毎のコンダクタンス−時間プロファイルを作成する。

識別部２３４は、電極間距離毎のコンダクタンス−時間プロファイルに表れる複数のシグナルに含まれる、その電極間距離に対応した標準物質５４を示すシグナルと、他のシグナルとを比較する。そして、識別部２３４は、電極間距離毎の比較結果に基づいて、他のシグナルが示す単分子の種類を識別する。

ここで、図１２に、複数種類の単分子（図１２の例ではアミノ酸）について、電極間距離ｄ毎の相対コンダクタンスを示す。ここでの相対コンダクタンスとは、図１２内のアミノ酸のうち、コンダクタンスが最大のものを１としたときの各アミノ酸のコンダクタンスである。図１２の例では、電極間距離ｄは、ｄ１＝１．０ｎｍ、ｄ２＝０．７ｎｍ、及びｄ３＝０．４ｎｍである。図１２に示すように、電極間距離ｄが０．４ｎｍの場合には、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐの相対コンダクタンスが近似している。同様に、電極間距離ｄが０．７ｎｍの場合には、ＣｙｓとＰｒｏ、及びＴｙｒとＴｒｐの相対コンダクタンスが近似している。同様に、電極間距離ｄが１．０ｎｍの場合には、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、及びＰｈｅの相対コンダクタンスが近似している。このように、相対コンダクタンスが近似している場合には、単分子の種類を識別する際の識別精度が低下する恐れがある。

そこで、電極間距離毎に識別可能な単分子を予め定めておく。また、電極間距離毎に、その電極間距離に対応した標準物質５４を選択しておく。そして、電極間距離に対応した標準物質５４の固有コンダクタンスに対する、その電極間距離で識別可能な識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを、相対コンダクタンステーブル２３６に予め記憶しておく。図１３に、相対コンダクタンステーブル２３６の一例を示す。

図１４に、識別部２３４による識別処理を模式的に示す。識別部２３４は、図１４に示すように、得られた電極間距離毎のコンダクタンス−時間プロファイルに表れた、その電極間距離に対応した標準物質５４を示すシグナル以外のシグナルのコンダクタンスと、相対コンダクタンステーブル２３６に記憶された、その電極間距離で識別可能な識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスとを比較することにより、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。識別部２３４は、その電極間距離のコンダクタンス−時間プロファイルからは識別することができなかったシグナル（図中「Ｘ」で示すシグナル）については、異なる電極間距離のコンダクタンス−時間プロファイルにおいて、単分子の種類を識別する。

次に、第２の実施の形態に係る単分子識別装置２１０を用いて行われる単分子識別方法について説明する。

まず、第１の実施の形態と同様に、少なくとも１種類以上の識別対象の単分子５２を溶液に溶解させる。次に、単分子５２を溶解させた溶液に、上述したような標準物質５４を添加する。第２の実施の形態では、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間距離（ｄ１、ｄ２、ｄ３）に対応した標準物質５４をそれぞれ添加する。

そして、試料５０中にナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃを配置し、測定用電源１８により、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々に電圧を印加すると共に、電気泳動用電源２２により、電気泳動用電極対２０に電圧を印加する。そして、制御部２２６を構成するコンピュータのＣＰＵが、ＲＯＭに格納された単分子識別プログラムを読み出して実行することにより、単分子識別装置２１０により、図１５に示す単分子識別処理が行われる。

図１５に示す単分子識別処理のステップＳ２０で、測定制御部２３２が、電流計２４を制御し、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間により形成された一つの通路を、単分子５２及び標準物質５４が通過する際に生じたトンネル電流を、所定時間測定させる。

次に、ステップＳ２２で、測定制御部２３２が、測定されたトンネル電流の電流値を取得し、測定点毎にコンダクタンスを計算し、例えば図３に示すようなコンダクタンス−時間プロファイルを、電極間距離毎に作成する。次に、ステップＳ２４で、識別部２３４が、変数ｉに１を設定する。

次に、ステップＳ２６で、識別部２３４が、相対コンダクタンステーブル２３６から、電極間距離ｄｉに対応した単分子５２の相対コンダクタンス、すなわち、電極間距離ｄｉで識別可能な識別対象の単分子５２の相対コンダクタンスを取得する。

次に、ステップＳ２８で、識別部２３４が、上記ステップＳ２２で作成された電極間距離ｄｉのコンダクタンス−時間プロファイルと、上記ステップＳ２６で取得した相対コンダクタンスとを比較して、各シグナルが示す単分子の種類を識別する。

次に、ステップＳ３０で、識別部２３４が、全ての電極間距離ｄｉについて処理を終了したか否かを判定する。未処理の電極間距離ｄｉが存在する場合には、ステップＳ３２へ移行して、ｉを１インクリメントして、ステップＳ２６へ戻る。全ての電極間距離ｄｉについて処理が終了した場合には、ステップＳ３４へ移行して、識別部２３４が、識別結果を出力して、単分子識別処理を終了する。

以上説明したように、第２の実施の形態に係る単分子識別装置及び方法によれば、複数の電極間距離のナノギャップ電極間で生じたトンネル電流から得られたコンダクタンスを用いることで、第１の実施の形態の効果に加え、より精度の高い識別を行うことができる。

なお、第２の実施の形態では、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々を、各電極間の中心が同一軸上に並ぶように積層する構成について説明したが、これに限定されない。例えば、同一平面上に、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々を配置してもよい。この場合、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々に対応して電気泳動用電極を設けるなどして、単分子５２及び標準物質５４が、ナノギャップ電極対１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃの各々の電極間を順次通過するように制御すればよい。

また、第２の実施の形態では、電極間距離が異なる複数のナノギャップ電極対を設ける場合について説明したが、１つのナノギャップ電極対の電極間距離を変更する機構を設けた構成としてもよい。例えば、てこの原理を利用して、力点、支点、及び作用点の幾何学的配置を調整することで、電極間距離を変更する構成とすることができる。より具体的には、ピエゾ素子によりナノギャップ電極対の一部を押し上げることにより、作用点となる電極端部を移動させて、電極間距離を変更する構成とすることができる。この場合、ピエゾ素子の押し上げ距離と電極間距離との対応関係に基づいて、所望の電極間距離に設定することができる。

また、上記各実施の形態では、トンネル電流を測定する場合について説明したが、本発明は、あらゆるギャップ電極を用いた微量電流測定による単分子識別法の標準化として適用することができる。本発明の適用により、測定前の分離及び精製等の前処理が必要なくなり、高精度な単分子識別を、高選択的かつ広範囲にわたる実験条件で行うことができる。例えば、代表的なバイオ高分子核酸塩基鎖の測定に使用した場合、遺伝子シーケンサー及び遺伝子発現解析法の高精度化及び選択性向上が見込まれる。また、公衆衛生、安全、安心、環境分野で使われる高速、高感度、及び低コストなアレルゲン検査、疾病診断等へ応用することもできる。

本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施の形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施の形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本願明細書中において、プログラムが予めインストールされている実施の形態として説明したが、外部の記憶装置や記録媒体等に格納されたプログラムを随時読み込んで、またインターネットを介してダウンロードして実行するようにしてもよい。また、当該プログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納して提供することも可能である。

１０、２１０ 単分子識別装置
１２ ナノギャップ電極対
２４ 電流計
２６、２２６ 制御部
３２、２３２ 測定制御部
３４、２３４ 識別部
３６、２３６ 相対コンダクタンステーブル
５２ 単分子
５４ 標準物質

Claims (11)

1. 電極間を通過する際に電極間で流れるトンネル電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、生体高分子を構成する少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が、前記電極間を通過した際に前記単分子の各々を流れたトンネル電流に応じたシグナルを測定するステップと、
   測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別するステップと、
   を含む単分子識別方法。
2. 前記標準物質を、電気伝導性を有し、かつ前記識別対象の単分子と結合しない同一形状の物質とした請求項１記載の単分子識別方法。
3. 前記標準物質を、前記電極間を通過する際の前記電極間に対する姿勢が同一となる物質とした請求項１または請求項２記載の単分子識別方法。
4. 前記標準物質の形状を、球形とした請求項３記載の単分子識別方法。
5. 前記標準物質を、金属ナノ粒子またはフラーレンとした請求項４記載の単分子識別方法。
6. 前記複数のシグナルに対する前記標準物質を示すシグナルの割合が予め定めた割合範囲となるように、前記試料に対する前記標準物質の濃度を最適化した請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の単分子識別方法。
7. 前記識別するステップで、前記標準物質を示すシグナルに対する前記複数のシグナルの相対値、及び単分子の種類とシグナルの相対値との予め定めた関係に基づいて、前記他のシグナルが示す単分子の種類を識別する請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の単分子識別方法。
8. 前記測定するステップで、異なる複数の電極間距離に対応した異なる複数の標準物質が添加された試料について、電極間距離が異なる複数の状態毎に、前記トンネル電流に応じたシグナルを測定し、
   前記識別するステップで、前記状態毎に、測定された複数のシグナルに含まれる該当の状態に対応した標準物質を示すシグナルと、前記他のシグナルとを比較し、各状態における比較結果に基づいて、前記他のシグナルが示す単分子の種類を識別する請求項１〜請求項７のいずれか１項記載の単分子識別方法。
9. 前記単分子は、アミノ酸、ヌクレオチド又は単糖である、請求項１〜請求項８のいずれか１項記載の単分子識別方法。
10. 電極間を通過する際に電極間で流れるトンネル電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、生体高分子を構成する少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料が、前記電極間を通過する際に、トンネル電流が流れるように配置された電極対と、
    前記試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が、前記電極間を通過した際に流れたトンネル電流に応じたシグナルを測定する測定部と、
    前記測定部により測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別する識別部と、
    を含む単分子識別装置。
11. コンピュータを、
    電極間を通過する際に電極間で流れるトンネル電流に応じたシグナルの大きさが既知で、かつ前記シグナルの大きさの変動が予め定めた変動範囲内となる標準物質が添加されると共に、生体高分子を構成する少なくとも１種類以上の識別対象の単分子が含まれる試料が、前記電極間を通過する際に、トンネル電流が流れるように配置された電極対の電極間を、前記試料に含まれる前記標準物質及び前記識別対象の単分子の各々が通過した際に流れたトンネル電流に応じたシグナルを測定するように測定部を制御する測定制御部、及び
    前記測定部により測定された複数のシグナルに含まれる前記標準物質を示すシグナルを基準にして、前記複数のシグナルに含まれる他のシグナルが示す単分子の種類を識別する識別部
    として機能させるための単分子識別プログラム。