JP5911365B2

JP5911365B2 - 複合型顕微鏡

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Publication number: JP5911365B2
Application number: JP2012096668A
Authority: JP
Inventors: 酒井　信明; 信明酒井; 良嗣植草
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: JP2013224850A; WO2013157419A1; EP2840399A4; EP2840399A1; US9347969B2; US20150040273A1

Description

本発明は、光学顕微鏡と走査型プローブ顕微鏡の複合型顕微鏡に関する。

走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）は、走査機構によって機械的プローブを機械的に走査して試料表面の情報を得る走査型顕微鏡であって、走査型トンネリング顕微鏡（ＳＴＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型磁気力顕微鏡（ＭＦＭ）、走査型近接場光顕微鏡（ＳＮＯＭ）などの総称である。走査型プローブ顕微鏡は、機械的プローブと試料とを相対的にＸＹ方向にラスター走査し、機械的プローブを介して所望の試料領域の表面情報を得て、モニターＴＶ上にマッピング表示する。

なかでもＡＦＭは最も広く使用されている装置であって、機械的プローブをその自由端にもつカンチレバーと、カンチレバーの変位を検出する光学式変位センサーと、機械的プローブと試料を相対的に走査する走査機構を主要な機械機構として備えている。その光学式変位センサーとしては、構成が簡単でありかつ高い変位検出感度を有することから、光てこ式の光学式変位センサーが最も広く使われている。カンチレバー上に直径数μｍから数十μｍの光束を照射し、その反射光の反射方向がレバーの反りに応じて変化するのを二分割光ディテクタなどによりとらえて、カンチレバーの自由端にある機械的プローブの動作をとらえ電気信号として出力する。この出力が一定になるように走査機構をＺ方向に制御しながら、同じく走査機構をＸＹ方向に走査することにより、コンピュータのモニター上に試料表面の凹凸の状態をマッピング表示する。

このようなＡＦＭでは、液体中の生物試料を観察する場合、倒立型光学顕微鏡と組み合わせて観察することが一般的である。倒立型光学顕微鏡観察は、試料の知見を得るだけでなく、試料の特定部位にカンチレバーを位置決めするときにも有効だからである。

生物試料の動く様子を観察しようとしたとき、ＡＦＭに求められるのは観察速度である。この用途では１秒以内、望ましくは０．１秒以内に一画面を得られると良い。このようなＡＦＭの高速化を行おうとしたとき、ＡＦＭ装置の電気回路周りについては現在市販されている装置でも可能なレベルに達しており、課題となるところは機械機構にある。特に、走査速度の速い走査機構や、柔らかくかつ共振周波数の高いカンチレバーや、そのカンチレバーの変位を検出できる光てこ式の光学式変位センサーが挙げられる。

例えば、Ｘ方向１００画素、Ｙ方向１００画素の画像を０．１秒で取り込むとき、走査機構に求められるＸ方向の走査周波数は１ｋＨｚ、Ｙ方向の走査周波数は１０Ｈｚ、Ｚ方向の走査周波数は１００ｋＨｚ以上に達する。

そして生物試料の観察に適した高い周波数のカンチレバーとしては、バネ定数が１Ｎ／ｍ以下であって、共振周波数は３００ｋＨｚ以上が望ましい。このようなカンチレバーの寸法は現在市販されているカンチレバーに比べて１０分の１程度と極めて小さいものとなり、例えば窒化シリコン製のカンチレバーで、長さ１０μｍ、幅２μｍ、厚さ０．１μｍとなる。そのバネ定数は０．１Ｎ／ｍ、大気中の共振周波数は１．２ＭＨｚ、液体中での共振周波数は４００ｋＨｚ前後となる。

さらに光学式変位センサーとしては、極めて小さいカンチレバーの変位を検出するために収束光のスポット径が数μｍ以下となる集光光学系が要求される。

以上に説明したように、生物試料のＡＦＭによる高速観察には、柔らかくて共振周波数の高い小さなカンチレバーが使用可能であるとともに、高速走査をする走査機構を備えていることが望ましい。

特開２００２−８２０３６号公報は、このような要望に応える倒立型光学顕微鏡観察とＡＦＭを組み合わせた複合型顕微鏡を開示している。

特開２００２−８２０３６号公報

特開２００２−８２０３６号公報に開示された複合型顕微鏡におけるＡＦＭは、カンチレバーに対して試料をＸＹＺに走査する試料スキャンタイプである。試料スキャンタイプのＡＦＭでは、試料とその走査機構がステージを間に挟んで対物レンズの反対側に設けられるため、光学観察のための照明光を対物レンズの反対側から照射することは難しい。試料スキャンタイプのＡＦＭでは、一般に、光学観察のための照明は、対物レンズ側からの照明すなわち落射明視野照明によっておこなわれる。この落射明視野照明は、高コントラストの試料には適しているが、生物試料などの低コントラストの試料には適していない。

ＡＦＭには、試料スキャンタイプとは反対に、試料に対してカンチレバーをＸＹＺに走査するレバースキャンタイプのものもある。このレバースキャンタイプのＡＦＭは、試料や試料基板に対する制約が少ないものの、走査対象物が重くなる傾向があり、その場合には観察速度の制約がある。

本発明の目的は、このような現状を鑑みて成されたものであり、低コントラストの試料を好適に照明し得る光学顕微鏡とレバースキャンタイプのＡＦＭを組み合わせた複合型顕微鏡を提供することである。

本発明は、倒立型光学顕微鏡と走査型プローブ顕微鏡の複合型顕微鏡であって、試料を保持した試料基板が載置される試料基板載置面を有するステージと、サブストレートと、前記サブストレートに支持されたカンチレバーと、前記カンチレバーの自由端に設けられたプローブを備えたカンチレバーチップと、前記プローブを前記試料基板載置面に対向させ、かつ、前記サブストレートを前記試料基板載置面に対して傾斜させて保持するとともに、前記プローブを前記試料基板載置面に対して三次元的に走査するスキャナと、前記カンチレバーの変位を光学的に検出する光学式変位センサーと、前記倒立型光学顕微鏡による観察のための照明光を、前記サブストレートを基準にして前記カンチレバーの反対側に位置する前記サブストレートの後方から、前記サブストレートと前記試料基板載置面の間を通して、前記試料基板載置面に載置された試料に照射する照明光源とを備えている。

本発明によれば、低コントラストの試料を好適に照明し得る光学顕微鏡とレバースキャンタイプのＡＦＭを組み合わせた複合型顕微鏡が提供される。

第一実施形態による複合型顕微鏡を示している。図１に示されたカンチレバーチップの斜視図である。図１に示されたカンチレバーチップと集光レンズを別の方向から見た拡大図である。図１に示されたカンチレバーチップと集光レンズと照明光源の拡大図である。図１に示されたカンチレバーチップと照明光源と照明光の経路を示している。図１に示されたカンチレバーチップと照明光源と照明光の経路を示している。第一実施形態による複合型顕微鏡の変形例を示している。第一実施形態による複合型顕微鏡の別の変形例を示している。第二実施形態による複合型顕微鏡を示している。図９に示されたカンチレバーチップと集光レンズと照明光源を拡大して示している。第一実施形態と第二実施形態の照明光源に代替可能な別の構成を示している。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

＜第一実施形態＞
本実施形態の複合型顕微鏡の構成を図１に示す。

図１に示すように、本実施形態の複合型顕微鏡は、光学顕微鏡である倒立型光学顕微鏡と、走査型プローブ顕微鏡である原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を備えている。

倒立型光学顕微鏡は、顕微鏡鏡体２０、顕微鏡ステージ２１、対物レンズ２２、レボルバー２３、ハーフミラー２４、ミラー２５、ＣＣＤカメラ２６、テレビモニター２７、落射照明光源２８を備えている。顕微鏡ステージ２１上には、スライドガラス等の試料基板２が支持され、試料基板２には試料１と溶液４が保持される。倒立型光学顕微鏡は、主に、試料１の液中光学観察に用いられる。

ＡＦＭは、カンチレバーチップ３、ＸＹＺスキャナ６、光てこ式変位センサー１０、ＸＹＺスキャナ６と光てこ式変位センサー１０を保持した筐体３０、筐体３０を顕微鏡ステージ２１の上方に支持するための支柱３１、コントローラ１４、コンピュータ１５を備えている。

カンチレバーチップ３は、図２に示すように、サブストレート３ａと、サブストレート３ａに支持されたカンチレバー３ｂと、カンチレバー３ｂの自由端に設けられたプローブ３ｃを備えている。

サブストレート３ａとカンチレバー３ｂの大きさの比は、図２と図３に示したものが実際のものに近く、図１のカンチレバーチップ３は、説明のためにカンチレバー３ｂを大きく描いている。

ＸＹＺスキャナ６は、カンチレバーチップホルダ７とＺスキャナ８とＸＹスキャナ９を備えている。カンチレバーチップホルダ７は、プローブ３ｃを試料基板２に対向させ、かつ、サブストレート３ａを試料基板２に対して傾斜させて保持する。カンチレバーチップホルダ７はＺスキャナ８の自由端に保持されている。Ｚスキャナ８はＸＹスキャナ９に保持されている。Ｚスキャナ８とＸＹスキャナ９は共働してカンチレバーチップ３を試料基板２に対して三次元的に走査する。

カンチレバーチップ３は、図３と図４に示すように、試料基板２に対するサブストレート３ａの傾斜角は、５度ないし１５度、望ましくは１０度ないし１５度になるように設計されている。本実施形態では、例えば１５度であるとして説明する。

ここで、「試料基板２に対する傾斜」や「試料基板２に対して傾斜」するなどは、「顕微鏡ステージ２１に対する傾斜」や「顕微鏡ステージ２１に対して傾斜」するなどと同義である。つまり、これらは互いに置き換え可能である。また、例えば、試料基板２に対するサブストレート３ａの傾斜は、より正確には、顕微鏡ステージ２１の試料基板載置面に対するサブストレート３ａの主面の傾斜を意味している。またサブストレート３ａの主面は、サブストレート３ａの最も大きい平面である、プローブ３ｃが突出している側の平面を指している。

光てこ式変位センサー１０は、レーザ光源１１と集光レンズ１２と光ディテクタ１３を備えている。レーザ光源１１は、検出光を射出し、集光レンズ１２は、レーザ光源１１から射出された検出光を収束させ、プローブ３ｃを備えたカンチレバー３ｂの面の反対側の面の自由端近くに収束光を照射し、光ディテクタ１３は、カンチレバー３ｂからの反射光を受光して、カンチレバー３ｂの自由端すなわちプローブ３ｃの変位を検出する。

筐体３０は、光てこ式変位センサー１０を溶液４から保護するための窓ガラス５を備えている。

Ｚスキャナ８は、ＸＹスキャナ９に保持されており、ＸＹ走査される。また集光レンズ１２も、ＸＹスキャナ９に保持されており、Ｚスキャナ８とともにＸＹ走査される。従って、集光レンズ１２とカンチレバーチップ３は、ＸＹスキャナ９により同時に同変位だけＸＹ走査される。このようにして、ＸＹスキャナ９とＺスキャナ８とカンチレバーチップホルダ７とカンチレバーチップ３と集光レンズ１２により検出光追従型のレバースキャン機構を構成している。

ＸＹＺスキャナ６と光てこ式変位センサー１０は、コントローラ１４に接続され、コンピュータ１５により制御される。また観察結果はコンピュータ１５で処理されモニターＴＶ上に表示することができる。

このように構成されたＡＦＭにおいては、観察速度を高速にするために、カンチレバー３ｂと集光レンズ１２は、以下に述べるように構成されている。

カンチレバー３ｂは、例えば窒化シリコン製のカンチレバーで、長さ１０μｍ、幅２μｍ、厚さ０．１μｍと極めて小さい形状をしている。

集光レンズ１２は、極めて小さいカンチレバー３ｂの変位を検出するために、収束光のスポット径が数μｍ以下となるようＮＡ＝０．４以上の光学特性を備えている。

さらに集光レンズ１２は、高速走査を可能にするために、径が１０ｍｍ以下、望ましくは５ｍｍ以下の小型軽量のものが使用される。

図３と図４は、カンチレバーチップ３や集光レンズ１２等の概略レイアウトを示している。図３と図４において、例えば、サブストレート３ａの長さは約３ｍｍ、幅は約１．６ｍｍである。また集光レンズ１２は、ＮＡ≒０．４、直径は約５ｍｍであり、その焦点距離は約５ｍｍである。サブストレート３ａは試料基板２に対して約１５度の角度で保持されている。

筐体３０は、図４に示すように、カンチレバーチップ３のサブストレート３ａの後方（サブストレート３ａを基準にしてカンチレバー３ｂの反対側）に、試料基板２に対して傾斜した傾斜面３０ａを有している。試料基板２に対する傾斜面３０ａの傾斜角は、試料基板２に対するサブストレート３ａの傾斜角以上であり、すなわち１５度以上である。例えば、傾斜面３０ａは、サブストレート３ａにほぼ平行である。すなわち、この傾斜面３０ａは、試料基板２に対して約１５度の角度を成している。傾斜面３０ａには、照明光源３２が保持されている。照明光源３２は、倒立型光学顕微鏡による観察のための照明光を射出する。照明光源３２は、光源ランプ３３とコンデンサレンズ３４を備えている。

このように構成された本実施形態の複合型顕微鏡においては、ＡＦＭがレバースキャンタイプで構成されているので、試料１や試料基板２に対する制約が少ない。

また、図５に示すように、照明光源３２は、顕微鏡ステージ２１を基準にして対物レンズ２２の反対側から、特に、カンチレバーチップ３のサブストレート３ａの後方から、サブストレート３ａと試料基板２の間を通して試料１を照明する。

このような照明は、試料１に対してカンチレバーチップ３の方向から、主に斜めに照明するものであり、暗視野照明や偏斜照明が含まれる。暗視野照明や偏斜照明は、低コントラストの試料に対して有効な照明方法であり、微細構造の観察に適している。つまり、試料１は、低コントラストの試料に好適な照明方によって照明される。

また試料１を直接照明するだけでなく、図６に示すように、サブストレート３ａやカンチレバー３ｂからの反射照明光も試料１に照射されるため、効率よく照明できる。そのような反射照明光によって、明視野照明で観察できる場合もある。

また、照明光源３２の光源ランプ３３には、小型の高輝度白色ＬＥＤを用いることが望ましい。これは、高輝度白色ＬＥＤの発光効率が高く、発熱が小さいこと、さらには小型であること等の理由による。

また、照明光源３２は、図７に示すように、例えば小型の高輝度白色ＬＥＤ３５に置き換えられてもよい。高輝度白色ＬＥＤ３５の照明光は、コンデンサレンズ等により収束光を生成することなく、試料に直接照射される。

さらに図８に示すように、照明光源３２（あるいは高輝度白色ＬＥＤ３５）は、傾斜面３０ａに保持される代わりに、例えば顕微鏡ステージ２１に設けられた保持部材３６に保持されてもよい。

加えて、照明光源３２は、図１１に示すように、複数の発光素子（高輝度白色ＬＥＤ）５０，５１，５２を有する別の照明光源に置き換えられてもよい。複数の発光素子５０，５１，５２は、それらの光軸が試料１から広がって延びるように、サブストレート３ａの後方に配置されている。これにより照明光量を増やすことができる。これは、試料基板２や顕微鏡ステージ２１と筐体３０の間の距離が短い複合型顕微鏡においては、非常に有効な方法である。

＜第二実施形態＞
本実施形態の複合型顕微鏡の構成を図９に示す。図９に示すように、本実施形態の複合型顕微鏡は、筐体と照明光源が異なるほかは、図１に示す第一実施形態の複合型顕微鏡と同じである。

筐体４０は、カンチレバーチップ３のサブストレート３ａの後方に、試料基板２に対して傾斜した傾斜面４０ａを有している。試料基板２に対する傾斜面４０ａの傾斜角は、試料基板２に対するサブストレート３ａの傾斜角以下であり、すなわち１５度以下であり、例えば約７〜８度である。この傾斜面４０ａは、鏡面処理されている。つまり、傾斜面４０ａは鏡面である。

さらに筐体４０は、傾斜面４０ａの後方に、試料基板２に平行な面４０ｂを有している。この面４０ｂには、照明光源４１が保持されている。照明光源４１は、図１０に示すように、光源ランプ４２とコンデンサレンズ４３を備えている。

このように構成された本実施形態の複合型顕微鏡においては、照明光源４１から出射された照明光を、傾斜面４０ａで反射させ、試料１に導くことができる。その結果、照明光源４１は、カンチレバーチップ３のサブストレート３ａの後方から、サブストレート３ａと試料基板２の間を通して試料１を照明する。従って、第一実施形態と同様の効果を得ることができる。

さらに、本実施形態の複合型顕微鏡においては、照明光源４１を試料１やサブストレート３ａから比較的遠くに離すことができる。これにより、照明光源４１の大きさや配置設計の自由度が増す。さらに照明光源４１が発する熱の影響も低減できる。

本実施形態では、第一実施形態と同様に、光源ランプ４２は、小型の高輝度白色ＬＥＤを用いることが望ましい。また、照明光源４１を高輝度白色ＬＥＤに置き換え、コンデンサレンズ等により収束光を生成することなく、試料に直接照射してもよい。さらに、照明光源４１（または高輝度白色ＬＥＤ）は、面４０ｂに保持される代わりに、例えば顕微鏡ステージ２１等に設けられた保持部材に保持されてもよい。加えて、照明光源４１は、図１１に示すように、複数の発光素子（高輝度白色ＬＥＤ）５０，５１，５２を有する別の照明光源に置き換えられてもよい。複数の発光素子５０，５１，５２は、それらの光軸が試料１から広がって延びるように、サブストレート３ａ後方に配置されている。これにより照明光量を増やすことができる。これは、試料基板２や顕微鏡ステージ２１と筐体４０の間の距離が短い複合型顕微鏡においては、非常に有効な方法である。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。ここにいう様々な変形や変更は、上述した実施形態を適当に組み合わせた実施も含む。

１…試料、２…試料基板、３…カンチレバーチップ、３ａ…サブストレート、３ｂ…カンチレバー、３ｃ…プローブ、４…溶液、５…窓ガラス、６…ＸＹＺスキャナ、７…カンチレバーチップホルダ、８…Ｚスキャナ、９…ＸＹスキャナ、１０…式変位センサー、１１…レーザ光源、１２…集光レンズ、１３…光ディテクタ、１４…コントローラ、１５…コンピュータ、２０…顕微鏡鏡体、２１…顕微鏡ステージ、２２…対物レンズ、２３…レボルバー、２４…ハーフミラー、２５…ミラー、２６…ＣＣＤカメラ、２７…テレビモニター、２８…落射照明光源、３０…筐体、３０ａ…傾斜面、３１…支柱、３２…照明光源、３３…光源ランプ、３４…コンデンサレンズ、３５…高輝度白色ＬＥＤ、３６…保持部材、４０…筐体、４０ａ…傾斜面、４０ｂ…面、４１…照明光源、４２…光源ランプ、４３…コンデンサレンズ、５０，５１，５２…照明光源。

Claims

倒立型光学顕微鏡と走査型プローブ顕微鏡の複合型顕微鏡であって、
試料を保持した試料基板が載置される試料基板載置面を有するステージと、
サブストレートと、前記サブストレートに支持されたカンチレバーと、前記カンチレバーの自由端に設けられたプローブを備えたカンチレバーチップと、
前記プローブを前記試料基板載置面に対向させ、かつ、前記サブストレートを前記試料基板載置面に対して傾斜させて前記カンチレバーチップを保持するとともに、前記カンチレバーチップを前記試料基板載置面に対して三次元的に走査するスキャナと、
前記カンチレバーの変位を光学的に検出する光学式変位センサーと、
前記倒立型光学顕微鏡による観察のための照明光を、前記サブストレートを基準にして前記カンチレバーの反対側に位置する前記サブストレートの後方から、前記サブストレートと前記試料基板載置面の間を通して、前記試料基板載置面に載置された試料に照射する照明光源とを備えている、複合型顕微鏡。
前記スキャナと前記光学式変位センサーを保持した筐体を有し、
前記筐体は、前記試料基板載置面に対して傾斜した傾斜面を備え、前記試料基板載置面に対する前記傾斜面の傾斜角は前記試料基板載置面に対する前記サブストレートの傾斜角以上であり、
前記照明光源は、前記傾斜面と前記ステージの間を通して前記照明光を前記試料に照射する、請求項１に記載の複合型顕微鏡。
前記照明光源は、前記傾斜面に保持されている、請求項２に記載の複合型顕微鏡。
前記スキャナと前記光学式変位センサーを保持した筐体を有し、
前記筐体は、前記試料基板載置面に対して傾斜した鏡面を備え、前記試料基板載置面に対する前記鏡面の傾斜角は前記試料基板載置面に対する前記サブストレートの傾斜角以下であり、
前記照明光源は、前記照明光を前記鏡面による反射を経て前記試料に照射する、請求項１に記載の複合型顕微鏡。
前記照明光源は複数の発光素子を含み、前記複数の発光素子は、それらの光軸が前記試料から広がって延びるように配置されている、請求項１〜請求項４のいずれかひとつに記載の複合型顕微鏡。
前記試料基板載置面に対する前記サブストレートの傾斜角は５度ないし１５度である、請求項１〜請求項５のいずれかひとつに記載の複合型顕微鏡。
前記照明光源は、前記照明光の少なくとも一部が前記サブストレートと前記カンチレバーの少なくとも一方で反射された後に前記試料基板載置面に載置された試料に照射されるように配置されている、請求項１〜請求項６のいずれかひとつに記載の複合型顕微鏡。