JP5746161B2 - 顕微鏡画像における蛍光の評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、複数の画素を含み、１種または複数種の蛍光体によりマーキングされた試料の蛍光事象の強度分布を有する複数の顕微鏡画像の評価方法、およびこの方法を実施する顕微鏡に関する。

量的モデルにより生物学的システムを記述するシステム生物学のような研究分野は、量的データに頼っている。そのようなデータはこれまで蛍光顕微鏡により、たとえば「フライング・スポット」顕微鏡（非特許文献１）またはカルシウム画像形成（英語：「Ｃａｌｃｉｕｍ Ｉｍａｇｉｎｇ」）（非特許文献２）によっては不十分な精度でしか求めることができなかった。なぜなら多数のエラー源およびノイズ源が強度変動を引き起こすからである。たとえばエラー源は、蛍光事象に対するポアソン分布の大きな分散、顕微鏡検知体積の大きさの不確定性、検出器ノイズ、量子効果、励起スペクトルおよび効果スペクトルのような光物理的特性、そして蛍光体の脱色特性である。さらなる不確定性は、種々の蛍光体種間の相違、照明不均一性、そして試料の背景蛍光と自己蛍光である。これらのエラーは、被検体積ひいては被検分子の数が小さければ小さいほど、そして顕微鏡の空間的分解能が大きければ大きいほど大きくなる（またはより重要になる）。

しかし使用される顕微鏡の分解能が高いことが、高い空間的精度のために必要である。分解能は、顕微鏡対物レンズのいわゆる点伝達関数（英語：「Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」；ＰＳＦ）に依存する。この点伝達関数は、試料により吸収される光が顕微鏡対物レンズ内で回折するので、常に有限の幅（空間的：有限体積）を有し、そのため蛍光分子のような点状の光源が有限の面に光学的に結像する。したがって顕微鏡の分解能は原理的に制限されている（アッベ（Ａｂｂｅ）１８７３年）。しかし従来技術では、この原理的限界が許容するより高く分解された画像を形成するために、複数のアプローチが公知である（以下、「高分解能」とよぶ）。

たとえば試料を複数の異なる位相状態で構造的に照明することにより（英語：「ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」；ＳＩＭ）、横方向および軸方向の最大分解能を、非線形励起（英語：「ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｐａｔｔｅｒｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」；ＳＰＥＭ）と関連してほぼ係数２もしくはそれ以上に改善することができる。この目的のためには、位相状態で連続記録された個別画像から、対応する高分解能の結果画像を計算で復元しなければならない。ＳＩＭはたとえば特許文献１に、ＳＰＥＭはたとえば特許文献２に開示されている。

特許文献３から、分解能を高めるために光切換可能な蛍光色素を使用することが公知である（英語：「Ｐｈｏｔｏ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」；ＰＡＬＭ、ＰＡＬ−Ｍとも）。活性化波長においては非常に強度の弱い光により、ランダムに分布した極めて少数の蛍光色素分子（蛍光体）が励起可能な状態に変換され（活性化され）、引き続き公知のように励起波長の光によって蛍光が励起される。残りの非活性化蛍光体は、励起波長によって蛍光が励起されない。ランダムに分布しているので、活性化され、励起された蛍光体は、通例、蛍光事象から発生して、回折限界で広がった点光源結像の強度分布が互いに重ならないように空間的に離れて存在する。このことはとりわけ、回折広がりのため強度分布が必然的に複数の画素（英語：「ｐｉｃｔｕｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔ」；ピクセル）にわたって伸長する２次元画像への投影にも当てはまる。ＰＡＬ顕微鏡では、通例は重ならないそれぞれ少数の蛍光事象を備える多数の個別画像が記録される。ここで蛍光体の小さな群の活性化は、最後の活性化された蛍光体が脱色して初めて繰り返される。個々の蛍光事象の起源は、回折広がりした強度分布に基づき、個別の画像においてサブピクセル分解能の補償計算により位置特定され、高分解能の結果画像に登録される。

個別化のための措置が異なる個別の蛍光体位置特定のさらなる変形例も公知である。いわゆるＳＴＯＲ顕微鏡（英語：「Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」（確率的光学再構築顕微鏡法）；ＳＴＯＲＭ）では、十分な光子が個別の画像に記録されると直ちに、蛍光体がたとえば第２の光源によりその出発状態に戻される（非活性化される）。その他に、ＰＡＬＭＩＲＡ法（「ＰＡＬＭ ｗｉｔｈ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｒｕｎｎｉｎｇ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（独立画像取得型ＰＡＬＭ）」）、ＦＰＡＬＭ法（「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＰＡＬＭ」（蛍光ＰＡＬＭ））、ｄＳＴＯＲＭ法（「ｄｉｒｅｃｔ ＳＴＯＲＭ」）およびＧＳＤＩＭ法（「Ｇｒｏｕｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｒｅｔｕｒｎ」）がある。

多くの公知の高分解法は、高分解能の結果画像を、連続記録された通常の分解能の個別画像の連続から極端な計算コストを掛けて、ひいては時間を費やして求めるという欠点を有する。とりわけ、形成された結果画像の評価は、通例、人間の観察者によって視覚的に行われる。ここでは主観的影響により、物理学的、生物学的または化学的パラメータの検出の際に広いばらつきが生じ得る。

米国特許第５６７１０８５号明細書 米国特許第６９０９１０５号明細書 国際公開第２００６／１２７６９２Ａ２号パンフレット

ポーレイ（Ｐａｗｌｅｙ）：「生物学的共焦点顕微鏡法（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，３．Ａｕｆｌａｇｅ ２００６，Ｓ．６ ポーレイ（Ｐａｗｌｅｙ），Ｓ．５２９

本発明の基礎とする課題は、顕微鏡で記録された画像の量的評価を小さなエラーで可能にする冒頭に述べた形式の方法および装置を提供することである。ここで量的評価が、とりわけ高速で可能であるようにする。

この課題は、請求項１に記載の特徴を有する方法によって、および請求項１４に記載の特徴を有する顕微鏡によって解決される。
本発明の有利な構成は、従属請求項に記載されている。

本発明はとりわけ、しかしそれだけではないが、高分解能画像形成方法とともに使用するために構成されている。
本発明によれば、試料の蛍光事象の強度分布を含む顕微鏡画像を評価する方法に対して、蛍光事象の強度分布がそれぞれ回折に起因する広がりであって、顕微鏡の点伝達関数の広がりに相当する広がりを有し、かつ空間的な重ならずに、または少なくとも概ね空間的に重ならずに配置された顕微鏡画像の評価が次の工程で実施される：
ａ）少なくとも１つのカウンタを、顕微鏡画像の評価すべき所定の領域ごとに初期化する工程、
ｂ）顕微鏡画像の評価すべき領域内において少なくとも１つの蛍光事象を同定する工程、
ｃ）該当する領域に対応するカウンタを、当該領域内で同定された蛍光事象ごとにカウントアップする工程。

本発明の核心は、評価すべき画像内で重なっていない個々の蛍光事象を、時間を掛けて蛍光強度を計算して高分解能の結果画像にするのではなく、位置分解して計数することであり、本発明はその点においてＰＡＬＭとは異なる。これは、１つまたは複数の領域の大きさによって規定された空間的分解能により顕微鏡画像をデジタル化することであるとみなすことができ、ここではＰＡＬＭと比較して有意に少数の蛍光事象しか必要ない。この演算は高速に実施することができる。したがって、評価すべき領域が最大で１つの個々のピクセルの精度によって規定されていれば、サブピクセル精度での位置特定のための補償計算を省略することができる。比較的高い精度で規定された領域であって、とりわけ１つのピクセルより小さい領域に対しては、サブピクセル精度での位置特定が必要であるが、面倒な計算によって結果画像にする必要はない。これはむしろ、たった１ビットの値分解能による単なるデジタル化であり、この場合も、空間的分解能も引き続き計数する評価すべき１つまたは複数の領域の大きさに対応する。結果として、領域ごとの少なくとも１つのカウンタが、蛍光体もしくは蛍光体によりマーキングされた試料分子の数についての高精度なスカラーとなる。

領域はたとえば幾何学的記述の形で、たとえば評価すべき画像のピクセル座標内に設定することができ、試料の対象領域（英語：「Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」；ＲＯＩ）に相当することができる。とりわけ領域は、試料の画像の、１つまたは複数の関連するピクセルからなることができる。設定はたとえば、該当する領域に含まれるピクセル（ピクセルリスト）の座標を指示して、または該当する領域を包囲するピクセル（境界ピクセル）の座標を指示して行われる。ユーザによる領域の選択は、とりわけ高分解能の結果画像で行われることができる（この結果画像はたとえば前もって個別の画像から計算され、表示される）。これにより通例、個別の画像のピクセルとしてより高精度に規定された領域境界が得られる。

蛍光事象または分子の（デジタル）計数を本発明によって導入することにより、Ｓ／Ｎ比の劇的な改善が得られる。この技術のために使用される２進尺度（蛍光事象／分子が存在するか否か）は、その原因が多様であり得る（ポアソン分布の分散、検出体積の大きさの不確定性、検出器ノイズ、光物理学的蛍光体特性、種々の蛍光体種間の変動、照明不均一性、試料の背景蛍光および自己蛍光）強度変動に対して格段に頑強な新規の「画像」を発生させる。（デジタル）計数は、強度情報を濃度情報から鋭敏に分離する。

これにより濃度分布についての情報（蛍光事象／蛍光体／分子の数から導出することができる）が、異なる蛍光体種の間で発生する蛍光の変動性、および局所的な化学環境に対する蛍光体の感度にほとんど依存しなくなる。ただ１つの基準は、たとえば、（決定すべき）閾への到達、およびこれによる蛍光事象および／または分子としての記録を許容する、放出された光子数に達することである。

蛍光体の濃度分布が多数のオーダーに及ぶと、真の光検出器のダイナミックレンジが制限されているので、非常に暗い構造を非常に明るい構造と同時に結像するのが困難である。ここに記述する方法により、分子が連続して結像され、計数される。したがって濃度分布のダイナミックレンジは、検出システムのダイナミックレンジに依存せず、これにより検出システムのダイナミックレンジを、個々の分子の検知のために非常に高感度に選択することができる。したがい典型的には、ＥＭＣＣＤカメラは全増幅率において１０００未満のダイナミックレンジを有する。本発明により得られるカウンタは、検出システムのダイナミックレンジが同じでも有意に高いダイナミックレンジを有する。これにより本方法の感度も、不可欠な蛍光強度測定に比べて上昇する。それどころかＰＡＬＭと比べても、本発明は、蛍光体密度が非常に高い試料の部分において高いダイナミックレンジを可能にする。高分解能のＰＡＬＭ結果画像においては、このような高い密度を分解することはできず、そのため量的評価が除外される。

本発明では、少なくとも１つのカウンタが、該当する領域の分子、蛍光体または事象の数または濃度として出力される。または少なくとも２つのカウンタに基づいて擬似カラー画像が出力される。領域が複数ある場合、試料内の分子、蛍光体または事象の局所的数もしくは局所的濃度を量的に記述する画像が発生する。本発明のカウンタの値は、たとえば、生物学的システムにおける量的モデルを記述するのに使用することができ、とりわけシステム生物学または量的データを微視的に求める必要のある他のすべての適用分野で使用することができる。本発明の方法の高いダイナミックレンジは、あらかじめ規定すべきピクセルサイズで局所的に求められた数または濃度を擬似カラー画像に変換することにより、画像形成にも使用することができる。このような擬似カラー画像は、理論的には任意の大きさのダイナミックレンジを捕捉することができ、このダイナミックレンジは試料によってのみ制限され、検出システムによってはもはや制限されない。

本発明は評価すべき顕微鏡画像に対して、試料に含まれる１種のすべての蛍光体の、確率論的に十分に小さい部分集合だけの蛍光が変換されることを前提にする。このことはたとえば、試料を少なくとも１種の変換可能な蛍光体により、工程ｂ）の前に、とりわけ工程ａ）の前にマーキングし、まず変換可能な蛍光体の部分集合を（たとえば活性化波長の光により照射して）励起可能な状態に変換し、その際に変換された励起可能な蛍光体が、回折に起因する分解不能な体積の逆数より低い密度を有するように変換し（言い替えると、変換された励起可能な蛍光体間の間隔が、顕微鏡の点伝達関数の広がりより、概ね大きくなるようにし）、引き続き、光源により試料に少なくとも部分的に励起光を照射することで顕微鏡により顕微鏡画像を記録し、このとき試料から放射される蛍光光線が顕微鏡対物レンズにより、かつ光受信器により回折広がりして結像されることよって達成される。変換は化学的または光学的に行うことができる。光学的切換方法は、たとえばＰＡＬ顕微鏡で使用される。顕微鏡画像（またはさらなる顕微鏡画像）の記録後に、活性化された蛍光体を、たとえばブリーチングにより非活性化することができる（すなわち励起不能な状態に変換することができる）。そしてさらなる記録サイクルで、変換可能な蛍光体の（確率論的な）部分集合を、十分に小さい密度で新たに活性化し、励起することができる。

有利には追加で、相関分光的測定および／またはフェルスター（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）による共振エネルギー変換測定（英語：「Ｆｏｅｒｓｔｅｒ Ｒｅｓｏｎａｎｔ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ」；ＦＲＥＴ）を試料で実施することができる。工程ｂ）とｃ）は、個々の分子特性を測定するのに適する別の蛍光分光的方法と組み合わせることができる。蛍光相関分光学（英語：「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」；ＦＣＳ）またはラスタ画像相関分光学（英語：「Ｒａｓｔｅｒ Ｉｍａｇｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」；ＲＩＣＳ）との組合せで、蛍光体が結合された種々のシステム（たとえばタンパク質）を拡散定数により同定し、または結合を検証することができる。変換、励起および検出のためにパラメータを適合すれば（変換および／または励起の際の出力の低減、検出の際の「時間の」閾値の上昇）、ＦＣＳ／ＲＩＣＳと組合せで、結合されセル内を自由に拡散する対象物間を区別することができ、それぞれの濃度を決定することができる。これにより、局所的結合バランスを求めることができる。

好ましくは、蛍光事象が異なる蛍光体種から由来する場合、評価すべき領域ごとに工程ａ）で評価すべきとあらかじめ規定された各蛍光体種に対してそれぞれのカウンタを初期化し、工程ｂ）で蛍光事象が評価すべき蛍光体種に対応することを追加で同定し、そして工程ｃ）で該当する領域および該当する蛍光体種と関連するカウンタをカウントアップする。これにより、異なる蛍光体の数および／または濃度を直接比較することができる。

好ましい構成では、（少なくとも２つの評価すべき領域および／または少なくとも２つの評価すべき蛍光体種に対して）少なくとも２つのカウンタが使用され、２つのカウンタ間の比率が形成され、（同じ蛍光体種についての２つの異なる領域間、または同じ試料領域における２つの異なる蛍光体種間、または２つの異なる試料領域における２つの異なる蛍光体種間の）化学量論的関係として出力される。とりわけ高分解能の結果画像において領域を手動で前もって選択することと関連して、ＰＡＬＭ、ＳＩＭ／ＳＰＥＭまたは他の高分解能法により、たとえばタンパク質複合体の組成分析のように化学量論的測定が可能になる。ＰＡＬＭの場合に発生する少数の分子により、Ｓ／Ｎ比の改善が有利には顕著である。とりわけ複数の種による局所的な化学量論的測定の場合、相対的および絶対的濃度の蛍光強度測定による量的決定が、異なる波長に対して異なっており、通常は正確には既知でない光学システムの伝達関数（フィルタ効率、色彩効果等）によって困難になる。本発明の方法は、この問題点も、計数の離散的過程により回避する。評価すべき領域は、たとえばストックセル（Ｓｔｏｅｘｅｌ）またはストイクセル（Ｓｔｏｉｘｅｌ）と称される（化学量論的要素）。

一般的に、有利には（たとえば２つのカウンタに対して蛍光体種が同じ場合）、第１のカウンタが第１の領域に対して、第２のカウンタが、第１の領域とは異なる第２の領域に対して使用され得る。または（たとえば２つのカウンタに対して領域が同じ場合）、第１のカウンタが第１の蛍光体種に対して、第２のカウンタが第１の蛍光体種とは異なる第２の蛍光体種に対して使用され得る。これにより、２つの領域または蛍光体種を高精度で量的に比較することができる。

ＦＲＥＴとの組合せでＦＲＥＴチャネルの観察により、（異なる蛍光体種によりマーキングされた）２つまたはそれ以上の種の化学量論に加えて、これらの種の間の個別的な化学結合事象を観察し、計数し、高精度で位置特定することもできる。

有利な実施形態では、励起可能な状態への変換のために、レーザ走査顕微鏡が使用される。これにより局所的にたとえばＲＯＩ選択性に活性化し、すなわち励起可能な状態に変換することができ、求められた計数率を介してフィードバックの形で、フィードバックに基づき安定した化学量論的結果が求められるまで続行することができる。

好ましくは、試料の蛍光事象の強度分布を含む顕微鏡画像の時間順序を評価するために、工程ｂ）とｃ）が各顕微鏡画像に対して繰り返される。ここで、強度分布は回折に起因して、顕微鏡の点伝達関数の広がりに相当するそれぞれの広がりを有しており、それぞれの顕微鏡画像内に、ほとんど重ならずにまたは少なくともほとんど重ならずに配置されている。ここでは複数の順次連続する顕微鏡画像にわたって同じ個所を照射する蛍光体の放射が、光線が該当する個所に最初に衝突することに基づいて、したがって蛍光強度信号の正のエッジで、または該当する個所での照射の終了後に、したがって蛍光強度信号の負のエッジで個別の蛍光事象として同定される。したがってカウントアップは、（正の蛍光エッジまたは負の蛍光エッジで）同定が行われた１つの顕微鏡画像内でだけ行われる。複数の順次連続する顕微鏡画像を評価することにより検査される無作為試料が大きくなり、したがって量的評価の精度が改善される。

本方法の有利な構成では、所定の数の顕微鏡画像がそれぞれ評価された後に、カウンタの状態を記録し、カウンタを初期化することができる。このことはとりわけすべてのカウンタに対して当てはまる。このような構成により、量的な評価を時間分解して高精度で行うことができる。たとえば局所的な濃度比の時間的変化を、位置分解して測定し、表示することができる。

空間的に高分解能に量的評価を行うため（評価すべき領域が顕微鏡画像の画素より小さい、または評価すべき領域の境界が画素の縁部だけでない）、工程ｂ）に対して、蛍光事象の強度分布の重心位置を補償計算により、サブ回折限界の精度で求めることができる。通常のまたは粗い空間的分解能の場合（評価すべき領域が顕微鏡画像の１つまたは複数の関連する画素に対応する）、少なくとも１つの画素について所定の強度閾値を上回っていることだけを同定することで、工程ｂ）での同定が高速に行われる。次いで、蛍光事象の位置として、たとえば該当する画素の中心または角が使用される。

可逆的に切り替わる蛍光体を使用する場合、化学量論が制限される。なぜなら限界事例では、同じ分子がスイッチオフおよびスイッチオン後に新たに計数されるのか、またはごく近傍にある別の分子であるのかを一義的に決定することができないからである。変換可能な蛍光体は、通例、放射波長の異なる蛍光状態の間で切り替わる。好ましくは、蛍光体種の蛍光が２色で切り替わることができる場合、工程ｃ）では、顕微鏡画像の時間的順序で同じ場所で、２つの蛍光色が交番する連続顕微鏡画像が同定される場合だけカウントアップが実行される。２つの波長を同時に検出し、上のように本発明の計数により同定することにより、２つのチャネルにおけるオン／オフ過程が相関しており、同じ分子である場合には、可逆的に切り替わる蛍光体を最終的に脱色した蛍光体から区別することができる。その代わりにまたはそれに加えて、可逆的に切り替わる蛍光体種の種々のサンプルを、所定の最小位置偏差に基づいて同定することができる。

複数の種による化学量論の場合、異なる蛍光体の可逆的切換特性が場合により異なることにより別の困難性が生じる。これは可逆性をブリーチングによりまたは化学的やり方で所期のようにスイッチオフすることによって起ることがある（ハイルマンら（Ｈｅｉｌｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，６１７２およびそこに引用された文献）。このことはもちろん、１種の蛍光体種だけを備える試料に対しても当てはまる。

本発明はまた、制御ユニットと本発明の方法を実施するように作成されたコンピュータプログラムを含むものであり、さらに、試料中の少なくとも１種の蛍光色素を励起するための光源を備える照明光線路と、顕微鏡対物レンズを備える検出光線路と、この顕微鏡対物レンズに後置された光受信器と、光源および光受信器と接続された前記制御ユニットとを有する顕微鏡、とりわけレーザ走査顕微鏡を含むものである。好ましくは顕微鏡は、蛍光色素を光切換するための光源を有し、この光源も同様に制御ユニットと接続されている。

とりわけ本発明は制御ユニットを含み、ならびに顕微鏡画像の評価すべき所定の領域ごとに少なくとも１つのカウンタを初期化するためのソフトウエアモジュール、顕微鏡画像の評価すべき領域における少なくとも１つの蛍光事象を同定するためのソフトウエアモジュール、および該当する領域に対応するカウンタを、当該領域で蛍光事象が同定されるたびにカウントアップするためのソフトウエアモジュールを備えるコンピュータプログラムを含む。

以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。

顕微鏡画像を記録し、量的に評価するための顕微鏡の概略図である。 顕微鏡画像、とりわけそのような画像を記録し、量的に評価するための方法のフローチャートである。 複数の試料領域についての量的評価の結果を例として概略的に示す図である。 一の試料領域についてだけの量的評価の結果を例として概略的に示す図である。 時間的に分解した量的評価の概略図である。

すべての図面中、一致する部分は同じ参照符号を有する。
図１には、顕微鏡１が概略的に示されており、その制御装置３４は本発明の方法を実施するように構成されている。顕微鏡１は、それぞれ２次元画像の広視野照明および広視野記録のための光源１１およびカメラ１２の他に、レーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ）を装備している。ＬＳＭは、レーザ２３を備える照明モジュールＬと、走査モジュールＳ（英語：「ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ」）と、検出モジュールＤと、顕微鏡対物レンズ３１を備える顕微鏡ユニットＭとからモジュール型に統合されている。レーザ２３の光は、光導体ファイバおよび結合光学系２０を介して走査ユニットＳに供給されて１つにまとめられる前に、光フラップ２４および減衰器２５を通して制御ユニット３４によって調節することができる。メインビームスプリッタ３３と、２つのガルバノメータミラー（図示せず）を有するＸ−Ｙ走査ユニット３０（英語：「ｓｃａｎｎｅｒ」）を介して、光が顕微鏡対物レンズ２１を通り、試料２２に達し、そこで焦点体積（図示せず）を照明する。試料から反射された光、または放射された蛍光光は顕微鏡対物レンズ２１を通ってカメラ１２に達するか、または走査ユニット３０を介しメインビームスプリッタ３３を通って検出モジュールＤに達する。メインビームスプリッタ３３はたとえば、２色カラースプリッタとして構成することができる。検出モジュールＤは、それぞれホール絞り３１、フィルタ２８およびフォトマルチプライヤ３２を備える複数の検出チャネルを有し、これらはカラースプリッタ２９によって分離されている。ホール絞り３１の代わりに、たとえば線形照明の場合にはスリット絞り（図示せず）を使用することもできる。共焦点ホール絞り３１は、焦点体積から発しない試料光を弁別するのに用いられる。したがってフォトマルチプライヤ３２は、もっぱら焦点体積からの光だけを検出する。共焦点照明され、記録された試料２２の焦点体積は、ピクセルごとに画像を記録するため走査ユニット３０を用い、この走査ユニット３０のガルバノメータミラーが所期のように回転することにより試料２２上を移動することができる。ガルバノメータミラーの運動も、光フラップ２４または減衰器２５による照明の切り換えも、制御ユニット３４によって直接制御される。フォトマルチプライヤ３２のデータ記録も同様に、端末インタフェース４を介して行われる。光源１１とカメラ１２による画像記録は、走査ユニット３０の調節には関係しない。光源１１は、制御ユニット３４により切り換え可能な２つの部分光源からなることができ、第１の部分光源は蛍光体を活性化波長により活性化（励起可能な状態への変換）し、第２の部分光源はこの蛍光体に蛍光を励起する。

本発明を実現するためには（存在する顕微鏡画像の評価）、たとえば図示の制御ユニット３４の形の評価ユニットが１つだけ必然的に必要である。とりわけ顕微鏡画像が前もって記録されているべき場合には、光源１１（または複数の光源）とカメラ１２を備える顕微鏡ユニットＭ、ならびに制御ユニット３４が必要である。ＬＳＭ要素、Ｌ，ＳおよびＤは不要であるが、たとえば領域Ｒ１，Ｒ２のような個々の試料領域を活性化および励起するために有利であり得る。対応して制御ユニット３４は、たとえばそのような要素のためのインタフェースなしで簡単に構成することができる。たとえば評価ユニット／制御ユニット３４は、市販の電子計算機（英語：「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ」）であってよい。

図２は、たとえば制御ユニット３４によって実施される１つまたは複数の顕微鏡画像の量的評価が、記録の直後に行われる本発明の方法のフローチャートを示す。たとえば正確に１種の蛍光体種によりマーキングされた評価すべき試料２２が対物レンズ２１の下方に配置されており、試料２２のたとえば２つの領域Ｒ１，Ｒ２（図３参照）が評価すべきものとして設定されていることが前提である。別の実施形態では、１種超の蛍光体種と、１つだけの領域または３つもしくはそれ以上の領域とを評価することができる。ここでは純粋に例としての円板形の領域Ｒ１，Ｒ２を、たとえばそれらの中心および半径の形でそれぞれ設定することができる。まず、工程Ｓ１でそれぞれのカウンタが評価すべき領域Ｒ１，Ｒ２ごとに、すなわち全部で２つのカウンタが０に初期化される。

蛍光事象の密度が十分に低い顕微鏡画像を記録するために、工程Ｓ２ではまず少数の蛍光体だけが光源１１により、または位置に依存してレーザ２３の１つにより、活性化波長を備える弱い光フラッシュによって励起可能な状態に変換される。ここで、それぞれ照明野にあるすべての蛍光体の全体量から、実際に活性化される蛍光体の部分集合を選択することは、純粋に化学量論的に行われる。ここでは活性化された蛍光体の密度は、回折に起因して対物レンズ２１により分解することのできない体積の逆数よりこの密度が小さい場合に「十分に小さい」。その結果、活性化された蛍光体は、顕微鏡対物レンズのＰＳＦの広がりより概ね大きい間隔を互いに有する。活性化波長とは異なる励起波長により、このように変換された蛍光体が引き続き励起される。このことも光源１１により、または位置に依存してレーザ２３の１つにより行うことができる。

これに続いて、励起された蛍光体から放射される蛍光光線が工程Ｓ３で、カメラ１２によって２次元顕微鏡画像に記録される。この２次元顕微鏡画像は好ましくは、量的評価の前に記憶される。入射する光が顕微鏡対物レンズ２１内で回折するので、各蛍光事象は、広がりが顕微鏡対物レンズ２１の点伝達関数の広がりに相当する強度分布、すなわち２次元投影ではアレイディスクの直径にほぼ相当する強度分布で該当する顕微鏡画像に結像される。活性化された蛍光体の間隔（顕微鏡対物レンズのＰＳＦの広がりより概ね大きい）のため、蛍光事象の強度分布が顕微鏡画像で重なることがない。

工程Ｓ４では、個々の蛍光事象が顕微鏡画像中で同定される。この目的のために、顕微鏡画像はたとえばまず公知のようにガウスフィルタにより、引き続きラプラスフィルタにより処理される。これらのフィルタは、たとえば、顕微鏡画像上をピクセルごとに案内されるブロックオペレータ（オペレータ母型）として実現することができる。ブロックオペレータは、フィルタリングされたピクセルの強度を求めるために周囲のピクセルの強度も取り入れる。すなわちたとえば５×５ピクセルのブロックをガウスフィルタのために、そして３×３ピクセルのブロックも一緒にしてラプラスフィルタのために取り入れる。ガウスフィルタはスクラッチノイズを除去し、ラプラスフィルタは大きな関連領域を除去する。一般的な場合同定のためには、１つの領域における蛍光事象の存在だけが求められ、必然ではないが領域内の位置も求められる。これはたとえば、所定の同定閾値より大きい強度値を備えるピクセルまたはピクセル群をセクタごとに探索することにより行われる。たとえば該当するピクセルの記録された強度値が、５０の光子の等価より大きい場合、１つのピクセルにおいて蛍光事象の存在が識別される。

評価すべき領域が、顕微鏡画像のピクセルの大きさに対応するより高い精度で規定された場合だけ、蛍光事象の存在を検出した後に、各蛍光事象の強度分布のそれぞれ重心が、該当する蛍光事象の位置としてサブピクセル精度で求められる（位置特定される）。このことは、モデル関数、たとえばＰＳＦの正規分布を補償関数によりそれぞれの強度分布に適合することによって行われる。評価すべき領域が顕微鏡画像のピクセルの大きさに対応する精度でしか規定されないか、またはそれより粗い精度で規定された場合には、位置特定が不要である。したがって同定は、量的評価の分解能に依存して１段階（存在の検出のみ）または２段階（存在の検出と位置特定）とすることができる。各評価すべき領域について、同定された蛍光事象のいずれが該当する領域に存在するのかが検査される。その代わりに、最初から評価すべき領域内にだけ存在する蛍光事象を探索するように同定を行うことができる。たとえば同定の結果として、領域Ｒ１では９の蛍光事象が、領域Ｒ２では１７の蛍光事象が検出される。

それに応じて工程Ｓ５では、領域Ｒ１に対するカウンタが９回、領域Ｒ２に対するカウンタは１７回、たとえば同定の直後に増分される。典型的には、カウンタはいずれかの自然数を取ることができ、増分の際にはそれぞれ自然数１だけカウントアップされる。もちろんカウンタに対して、別のいずれかの値領域と特別の１エレメントをカウントアップのために使用することができる。

顕微鏡画像の評価が終了すると、工程Ｓ６で、さらなる顕微鏡画像を記録すべきか否かが検査される。記録すべき場合には本方法が工程Ｓ２に進み、それ以外の場合は工程Ｓ７に進む。この場合カウンタは、さらなる蛍光事象を累積することができるようにするため、再初期化はされない。その代わりの実施形態では（破線により示されている）、目下のカウンタ状態を記録し（記憶し）、カウンタを初期化することができる。これにより任意の部分シーケンスのカウンタ状態を（カウンタ状態の対応する部分シーケンスをまとめることにより）、または画像シーケンス全体のカウンタ状態を、後でわずかな計算コストにより復元することができる。任意選択で、蛍光体の部分集合を新たに活性化する前に、これまで活性化されていた蛍光体を、たとえばフォトブリーチングまたは化学的ブリーチングによって不活性化することができる。

工程Ｓ７では、カウンタ状態、または存在する場合にはカウンタ状態の記録が、たとえばデジタルまたはアナログインタフェースを介して出力される。本例では、とりわけ領域Ｒ１と領域Ｒ２に対するカウンタ状態の比率（９／１７）が計算され出力される。カウンタ状態が連続画像記録の経過中に記録されていれば、たとえば個別の顕微鏡画像の記録登録ごとに比率を計算し、出力することができる。カウンタ状態は出力の前に、たとえばそれぞれの領域の面積または体積に基づいて濃度記述に換算することができる。

任意選択の工程Ｓ８では、出力されたカウンタ状態をさらに処理することができる。たとえば評価された領域が十分に多数ある場合、擬似カラー画像を、基本的に任意の大きさのダイナミックレンジで形成し出力することができる。この場合、カウンタ状態のそれぞれのインターバルに擬似色が割り当てられ、各領域が該当する擬似色により、この領域に対して求められたカウンタ状態に従って満たされる。

本方法は、すでに早期に工程Ｓ２／Ｓ３（Ｓ６）に従って記録された顕微鏡画像にも適用することができ、この場合、工程Ｓ２とＳ３は評価の際に省略される。
図３は、上記方法による量的評価の結果の例を示す。部分画像Ａ）には、ノイズのある蛍光信号を伴う領域Ｒ１とＲ２が、顕微鏡生画像で拡大された部分に示されている。部分画像Ｂ）には、顕微鏡画像をフィルタリングした後に領域Ｒ１とＲ２で同定された個々の蛍光事象が、顕微鏡生画像で拡大された部分に示されている。部分画像Ｃ）には、生じたカウンタ状態がこれらの領域に示されている。本発明により、たとえば所定の領域の間および／または所定の領域内の局所的化学量論の決定が可能になる。部分画像Ｄ）には、比較的微細に分解された領域を備える別の試料に対してはカウンタ状態がどのように生じ得るかが示されている。たとえば１００の正方形領域Ｒ_１，１〜Ｒ_{１０，１０}が、直接互いに接している。本発明により、蛍光体の局所的濃度を画像として高コントラストで、いわば求めることができる。

図４には、２つの異なる蛍光体種によりマーキングされた、ただ１つの試料領域Ｒだけを評価すべき場合に対する結果が例として示されている。領域Ｒに対しては、蛍光体種ごとに別個のカウンタ、すなわち全部で２つのカウンタが使用された。対応して領域Ｒについては、２つのカウンタ状態および／または比率（９／１７）が出力される。本発明により、たとえば所定の領域内の局所的化学量論の決定も可能になる。

使用すべきカウンタの数は、一般的に、評価すべき領域の数と評価すべき蛍光体種の数との積である。
図５は、たとえば個々の顕微鏡画像間のカウンタ状態の記録により、量的データの時間経過を求めることを示すものである。ここで時間分解能は、記録されたカウンタ状態の個々の部分シーケンスをまとめることによって後で減少することがある。ここでは、ユーザが量的評価の時間分解能をフレキシブルに可変調整できるようにするため、元のカウンタ順序が変化しないままであるのが望ましい。

すべての実施形態で、領域をまとめることにより（該当するカウンタ状態の加算）空間的分解能が減少することがある。ここでは、ユーザが量的評価の空間的分解能をフレキシブルに可変調整できるようにするため、最大に分解された元の領域のカウンタ状態は変化しないままであるのが望ましい。

１ 顕微鏡
２ 顕微鏡画像
１１ 光源
１２ カメラ
２０ 視準光学系
２１ 顕微鏡対物レンズ
２２ 試料
２３ レーザ
２４ 光フラップ
２５ 減衰器
２６ ファイバカップラ
２７ チューブレンズ
２８ フィルタ
２９ ２色ビームスプリッタ
３０ 走査ミラー
３１ ホール絞り
３２ フォトマルチプライヤ
３３ メインビームスプリッタ
３４ 制御ユニット
Ｄ 検出モジュール
Ｍ 顕微鏡
Ｌ 照明モジュール
Ｓ 走査モジュール
Ｒ（ｍ，ｎ）試料領域

Claims (16)

1. 試料（２２）の蛍光の強度分布を含む顕微鏡画像（２）の評価方法であって、当該方法は、
   ａ）少なくとも１つのカウンタを、顕微鏡画像（２）の所定の評価すべき領域（Ｒ，Ｒ１，Ｒ２）ごとに初期化する工程と、
   ｂ）顕微鏡画像（２）の評価すべき領域（Ｒ，Ｒ１，Ｒ２）内において少なくとも１つの蛍光を同定する工程と、
   ｃ）該当する領域（Ｒ，Ｒ１，Ｒ２）に対応するカウンタを、当該領域（Ｒ，Ｒ１，Ｒ２）内で同定された蛍光ごとにカウントアップする工程と
   を含み、
   試料（２２）を少なくとも１種の励起可能な状態に変換可能な蛍光体により、前記工程ｂ）の前にマーキングし、励起可能な状態に変換された蛍光体が回折に起因して分解不能な体積の逆数より小さい密度を有するように、蛍光体の部分集合をまず励起可能な状態に変換し、引き続き光源（１１，２３）により試料（２２）を少なくとも部分的に励起光によって照射することにより、顕微鏡（１）によって顕微鏡画像を記録し、このとき該試料（２２）から放射される蛍光光線が顕微鏡対物レンズ（２１）により、かつ光受信器（１２，２８）により回折広がりして結像され、前記強度分布は、回折に起因する広がりであって顕微鏡（１）の点伝達関数の広がりに相当する広がりをそれぞれ有しており、かつ少なくとも概ね重ならずに配置されている、方法。
2. 少なくとも１つのカウンタが、該当する領域（Ｒ，Ｒ１，Ｒ２）の分子、蛍光体または蛍光の数または濃度として出力されるか、または少なくとも２つのカウンタに基づいて擬似カラー画像が出力される、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも２つのカウンタが使用され、当該カウンタ間の比率が形成され、化学量論的関係として出力される、請求項１または２に記載の方法。
4. 蛍光が異なる蛍光体種から由来し、評価すべき領域（Ｒ，Ｒ１，Ｒ２）ごとに、
   前記工程ａ）で、評価すべき所定の各蛍光体種に対して、それぞれのカウンタを初期化し、
   前記工程ｂ）で、前記蛍光が評価すべき蛍光体種に対応することを追加で同定し、
   前記工程ｃ）で、前記該当する領域（Ｒ，Ｒ１，Ｒ２）および該当する蛍光体種に対応するカウンタをカウントアップする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つのカウンタは、第１のカウンタと第２のカウンタとを含み、
   前記第１のカウンタが第１の領域（Ｒ１）に対して、前記第２のカウンタが第１の領域とは異なる第２の領域（Ｒ２）に対して使用される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
6. 試料（２２）を少なくとも１種の励起可能な状態に変換可能な蛍光体により、前記工程ｂ）の前にマーキングすることは、前記工程ａ）の前に行われる、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 追加で、相関分光測定、またはフェルスターによる共振エネルギー変換測定を前記試料（２２）で実行する、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
8. 励起可能な状態への変換のために、レーザ走査顕微鏡が使用される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
9. 試料（２２）の蛍光の強度分布を含む顕微鏡画像を時間的順序で評価するための請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法であって、
   前記強度分布は、回折に起因して顕微鏡（１）の点伝達関数の広がりに相当するそれぞれの広がりを有しており、かつそれぞれ顕微鏡画像内に少なくとも概ね重ならずに配置されており、前記工程ｂ）とｃ）が顕微鏡画像ごとに繰り返される、方法。
10. それぞれ所定数の顕微鏡画像が評価された後に、カウンタの状態が記録され、カウンタが初期化される、請求項９に記載の方法。
11. 前記工程ｂ）のために、蛍光の強度分布の重心の位置を、補償計算によりサブ回折限界の精度で求めるか、または所定の強度閾値を上回る少なくとも画素について同定する、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 蛍光体種の蛍光が２色で切り替わることができる場合、前記工程ｃ）では、顕微鏡画像の時間的順序で同じ場所で、２つの蛍光色が交番する連続顕微鏡画像が同定される場合だけカウントアップが実行される、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法を実施するように構成された制御ユニット（３４）。
14. 試料（２２）中の少なくとも１種の蛍光色素を励起するための光源（１１，２３）を備える照明光路と、顕微鏡対物レンズ（２１）およびこれに後置された光受信器（１２，２８）を備える検出光線路と、該光源（１１，２３）および該光受信器（１２，２８）と接続された、請求項１３に記載された制御ユニット（３４）とを有する顕微鏡（１）。
15. 前記制御ユニット（３４）と接続されており、かつ活性化波長を用いた光切換により蛍光色素を励起可能な状態に変換するための光源（１１）を備える、請求項１４に記載の顕微鏡。
16. 前記顕微鏡は、レーザ走査顕微鏡である、請求項１４に記載の顕微鏡。