JP5740392B2 - インフルエンザウイルスを検出するための一般的なアッセイ - Google Patents

Description

この特許出願は、２００９年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／２１５，７０４号および２００９年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／２１７，０４５号（これらの両方の完全な内容は、参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。

技術分野
本発明は、インフルエンザウイルスの検出および定量のための新規の一般的方法に関する。本発明は、好ましくは、インフルエンザＡ株またはＢ株内の保存された領域を増幅する逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）リアルタイム（ｑ−ＰＣＲ）アッセイを使用する。本発明のアッセイは、特定のウイルス株（たとえば、ヒト、トリ、ブタインフルエンザ）とは関係なく、インフルエンザウイルスＲＮＡ分子または全ウイルス粒子の定量を可能にする。本発明の方法は、診断アッセイとして、またはワクチン製造プロセスのモニタリングにおいて特に適用可能である。

発明の背景
様々な形態のインフルエンザワクチンが現在入手可能である。ワクチンは、一般に生ウイルスまたは不活化ウイルスのどちらかに基づいている。不活化ワクチンは、全ビリオン、「分割された」ビリオンまたは精製された表面抗原に基づいていてよい（詳細は明白に言及されている特許文献１参照）。インフルエンザワクチンは典型的には、三価であり２種類のインフルエンザＡ株および１種類のインフルエンザＢ株を含有している。インフルエンザワクチンのための従来の卵ベースの製造方法に加えて、異なる細胞培養ベースの製造法が最近になって記載されている（たとえば、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｐｌｏｔｋｉｎ ＆ Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ編；第４版、２００４年、ＩＳＢＮ： ０−７２１６−９６８８−０の１７章および１８章；Ｗｉｌｓｃｈｕｔ、Ｍｃ Ｅｌｈａｎｅｙ、Ｐａｌａｃｈｅ、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ」、第２版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ２００６年、ＩＳＢＮ ０−７２３４−３４３３−６の９章を参照のこと）。

国際公開第２００８／０６８６３１号

インフルエンザワクチン製造プロセス内における（たとえば、品質管理プロセスのための）核酸ベースの検出方法の適用はこれまで限定されてきた。これは、ワクチン製造において使用されるインフルエンザ株が季節によって変化し、したがって、季節ごとに新しい株特異的検出アッセイを開発する必要がある事実のためである。本発明は、（起源、たとえば、ヒト、トリ、ブタインフルエンザとは関係なく）インフルエンザＡ株またはインフルエンザＢ株のゲノム内の保存された領域を分析する新規の核酸アッセイを提供する。したがって、これらのアッセイは種々のインフルエンザ株を分析するのに適している。

発明の開示
本発明は、インフルエンザウイルスＲＮＡを検出するための新規の方法を記載している。本発明の方法は、インフルエンザＡまたはインフルエンザＢウイルスゲノム内の保存された領域、好ましくは、マトリックス（Ｍ）タンパク質をコードする領域を分析する。インフルエンザＡ Ｍ遺伝子およびインフルエンザＢ Ｍ遺伝子のアラインメントのために使用されたジェンバンクからのＭ遺伝子ヌクレオチド配列は、それぞれ表３および表４に示されている。

前記分析のために、核酸アッセイが行われる。好ましいアッセイは逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である。しかし、当業者には公知のように、同等のＲＮＡ増幅方法も適用可能である（ＵＳ−５４０９８１８のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎまたはＮＡＳＢＡ（商標）；３ＳＲ（商標）；ＵＳ−５３９９４９１のＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎまたはＴＭＡ（商標）など）。核酸アッセイは、好ましくは、リアルタイムアッセイとして実行される（たとえば、「ｑＰＣＲ」；Ｔａｑｍａｎ（商標）、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標）、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）など）。

好ましい「１ステップＲＴ−リアルタイムＰＣＲ」の詳細な説明
特に好ましい実施形態では、１ステップＲＴ−リアルタイムＰＣＲアッセイが使用される（「１ステップＲＴ−ｑＰＣＲ」）。当業者であれば、そのような「１ステップＲＴ ｑＰＣＲ」アッセイを行うことに精通している。当業者であれば、そのような増幅のための詳細な反応条件を見出す方法を承知している。したがって、逆転写反応（ＲＴ）および増幅反応（ｑＰＣＲ）は、別々の容器ではなく同一容器で（たとえば、単一のチューブまたはバイアルにおいて）実施され得る。

好ましくは、市販のＲＴ−ＰＣＲキット、たとえば、Ｑｉａｇｅｎ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）ウイルスキットまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）キットが使用される。発生した蛍光シグナルは、当技術分野で公知のように、それぞれのリアルタイムサイクラーソフトウェアを使用して分析することが可能である。

本発明の核酸アッセイは、当技術分野で公知のように、発生した蛍光シグナルと標準核酸のそれぞれのシグナルを比較することにより定量することが可能である。そのような標準として、好ましくは、それぞれのウイルス領域のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写物（ＩＶＴ）の希釈系列が適用される。適切なＩＶＴは、必要に応じて作製しても、市販のものでもよく、たとえば、Ｐａｎｏｍｉｃｓ（商標）は１０ｎｇ／ｍｌで「Ｉｆｎ−Ａ」（２８２ヌクレオチド）および「Ｉｆｎ−Ｂ」（２７６ヌクレオチド）一本鎖ＲＮＡ分子を供給している。

好ましくは、ＲＴ−ｑＰＣＲは、下の表１に示されるプライマーとプローブ配列を使用して実施される。しかし、当業者であれば、Ｍタンパク質をコードするウイルスゲノムまたはインフルエンザゲノム内の他の保存された領域に対する追加の同等のプライマーとプローブの設計の仕方を承知している。当業者であれば、下の表に示されるＴａｑｍａｎプローブは、同等のＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒプローブまたは他のリアルタイムプローブシステムにより置き換えることが可能であることを承知している。

特定の好ましい実施形態では、インフルエンザウイルスＡの検出のために、配列番号４および配列番号７のプライマーは、配列番号３のプローブと組み合わされる。別の好ましい実施形態では、インフルエンザＢウイルスの検出のために、配列番号１１および配列番号１のプライマーは、配列番号９のプローブと組み合わされる。

実施例（下参照）は、本発明の１ステップＲＴ ｑＰＣＲアッセイが異なる起源由来のインフルエンザウイルスを検出することができることを示している。

好ましい実施形態：インタクトなウイルスの検出
特定の好ましい実施形態では、本発明のアッセイを使用して、試料中のインタクトなウイルス粒子の量を決定する。これは、ワクチン製造プロセスをモニタリングするのに特に有用である（詳細は下を参照）。ウイルス粒子内の遊離のウイルスＲＮＡまたは核タンパク質に結合したＲＮＡとＲＮＡとの区別は、増幅に先立って試料から遊離のＲＮＡを取り除くことにより実現することが可能である。これは、たとえば、当技術分野で公知のように、リボヌクレアーゼ処理により行うことが可能である。好ましいプロセスは以下の通りである：
（ａ）ビリオン、ウイルスＲＮＡおよび核タンパク質の試料を採取する（たとえば、２１μｌ容量）。
（ｂ）リボヌクレアーゼと一緒にインキュベートする。たとえば、１時間、リボヌクレアーゼＡ／Ｔ１（１５Ｕ／７．５Ｕ）の混合物を使用する。
（ｃ）試料を希釈する。たとえば、ｑＰＣＲの線形範囲（Ｃ_ｔ １５〜３３）における信頼し得る定量結果を得るためにピペッティングロボットを使用して、試料の前希釈（１：１００〜１：１００００）が実施される。
（ｄ）核酸を抽出する。たとえば、磁気ビーズを使用することによる完全自動化ｖＲＮＡ抽出。
（ｅ）ｑＰＣＲ。ｑＰＣＲはピペッティングロボットによりセットアップする（ｓｅｔ ｕｐ）ことが可能である。試料におけるコピー／ｍＬの計算はＵＶ定量されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ）の標準曲線と関連している。

したがって、本発明は、試料中のインタクトなウイルス粒子の量を定量するための方法であって、（ａ）非ビリオン被包性ＲＮＡを試料から（たとえば、リボヌクレアーゼ消化により）除去するステップ；（ｂ）試料中の残存ＲＮＡを（たとえば、本明細書に開示されるように）増幅し、定量するステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）の結果を使用して試料中のインタクトなウイルス粒子の量を計算するステップを含む方法を提供する。この方法は、特にワクチン製造中の、インフルエンザＡおよびＢウイルスに特に有用である。

ステップ（ｂ）は定量的ＰＣＲ（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ）を含み得る。ステップ（ｂ）の結果は、ステップ（ｃ）計算の一部として標準ＲＮＡにより発生したシグナルと比較し得る。ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の間では、ビリオンを処理してそのＲＮＡを放出し得る、またはこの放出はＰＣＲプロセスが実施されるときに固有に起こり得る。

インフルエンザワクチン製造における本発明の好ましい適用
本発明のアッセイは、卵ベースのまたは細胞培養ベースのインフルエンザワクチン製造に特に有用である（概説については、Ｗｉｌｓｃｈｕｔ、Ｍｃ Ｅｌｈａｎｅｙ、Ｐａｌａｃｈｅ、「Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ」、第２版、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ２００６年、ＩＳＢＮ ０−７２３４−３４３３−６の９章を参照のこと）。本発明は、特に初期のプロセス段階においてウイルス収量をモニタリングし定量するために、ワクチン製造中の異なるステップにおいて使用することが可能である。本発明のプロセスは、様々な形態のインフルエンザワクチン（たとえば、生ウイルス、不活化全ビリオン、「分割された」ビリオン、精製された表面抗原；詳細は出願人が明白に言及しているＷＯ２００８／０６８６３１参照）の製造に原則として適している。これらの製造方法では、ビリオンは、ウイルス含有流体、たとえば、尿膜腔液または細胞培養上清において増殖され、そこから収穫される。ビリオンの精製のためには、異なる方法、たとえば、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む線形ショ糖勾配溶液を使用するゾーン遠心分離が適用可能である。次に、抗原は、任意選択の希釈後、ダイアフィルトレーションにより精製し得る。分割されたビリオンは、「Ｔｗｅｅｎエーテル」分割処理を含む、サブビリオン調製物を作製するために洗浄剤（たとえば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、トリトンＸ−１００、トリトンＮ−１０１、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、タージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）ＮＰ９、等）を用いて精製されたビリオンを処理することにより得られる。たとえば、インフルエンザウイルスを分割する方法は、当技術分野では周知である（概説については、ＷＯ２００８／０６８６３１参照）。分割インフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣ（商標）、ＦＬＵＡＲＩＸ（商標）、ＦＬＵＺＯＮＥ（商標）およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ（商標）製品である。本発明の方法は生ワクチンの製造にも使用し得る。これらのワクチン中のウイルスは弱毒化され得る。生ウイルスワクチンには、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ’ｓ ＦＬＵＭＩＳＴ（商標）製品（三価生ウイルスワクチン）が挙げられる。精製されたインフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは、表面抗原赤血球凝集素および典型的にはノイラミニダーゼも含む。これらのタンパク質を精製された形で調製するためのプロセスは当技術分野では周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ（商標）、ＡＧＲＩＰＰＡＬ（商標）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ（商標）製品はインフルエンザサブユニットワクチンである。別の形態の不活化抗原はビロソーム（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）である。ビロソームは、洗浄剤を用いてウイルスを可溶化し、続いてヌクレオカプシドを取り除きウイルス糖タンパク質を含有する膜を再構成することにより調製することが可能である。ビロソームを調製するための代わりの方法は、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加してその膜にウイルスタンパク質を有するリポソームを得ることを含む。

細胞培養ベースのインフルエンザワクチン製造における本発明の特に好ましい適用
特に好ましい実施形態では、本発明は細胞培養ベースのインフルエンザワクチン製造において使用される。適切な細胞系統は、たとえば、ＷＯ２００８／０６８６３１に記載されている。インフルエンザウイルスを増殖するのにもっとも好ましい細胞系統はＭＤＣＫ細胞系統である。本来のＭＤＣＫ細胞系統はＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞系統の派生物および他のＭＤＣＫ細胞系統も使用し得る。たとえば、ＷＯ９７／３７０００では、懸濁培養における増殖に適応されたＭＤＣＫ細胞系統が開示されている（「ＭＤＣＫ３３０１６」、ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９として寄託されている）。同様に、ＷＯ０１／６４８４６は、無血清培養での懸濁において増殖するＭＤＣＫ由来細胞系統を開示している（「Ｂ−７０２」、ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託されている）。ＷＯ２００６／０７１５６３は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む、非腫瘍形成ＭＤＣＫ細胞を開示している。ＷＯ２００５／１１３７５８は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む、感染に対する感受性の高いＭＤＣＫ細胞系統を開示している。これらのＭＤＣＫ細胞系統のいずれでも使用することが可能である。

細胞培養ベースのワクチン製造プロセスは通常以下のステップを含む：各一価バルクのための出発原料は、単一バイアルのＭＤＣＫワーキングセルバンク（ＷＣＢ）である。細胞は、製造中に細胞増殖を最適化するために合成培地において増殖される。ＷＣＢはスピナーフラスコ内での連続継代に続いてさらに大きな発酵容器中でのスケールアップにより拡大される。種ウイルスが添加され、発酵槽でのウイルス増殖が２〜４日の期間をかけて実施される。感染サイクルの終わりに、ウイルス懸濁液は遠心分離され濾過されて、培養収穫物から残留するインタクトな細胞が取り除かれる。浄化されたウイルス収穫物と呼ばれる遠心分離され濾過されたバルクは、発酵プロセスの終わりである。浄化されたウイルス収穫物は、最長２４時間ステンレス鋼の貯蔵容器において室温（１６〜２５℃）で貯蔵し得る。インフルエンザウイルスを、クロマトグラフィーおよび限外濾過／ダイアフィルトレーションステップにより精製し、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）により不活化し、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）により破壊して、ウイルス表面抗原ＨＡおよびＮＡを可溶化する。原薬（ｄｒｕｇ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）製造プロセスは、一価バルクを得るために濃縮物を最終バルク容器内へ濾過することで終結する。最後に、一価バルクは多価バルク（典型的には三価バルク）にブレンドし、その最終容器（ｆｉｎａｌ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、たとえば、注射器に充填することが可能である。ＤＮＡのいかなる発癌活性も最小限にするために最終ワクチン内の残留細胞系統ＤＮＡの量を最小限にするのが標準的技法である（詳細はＷＯ２００８／０６８６３１参照）。

本発明は、このプロセス内の異なる点で適用することが可能である。しかし、本発明の方法は、初期のプロセス段階（発酵、収穫、不活化まで）におけるウイルス収量をモニタリングおよび／または定量するために使用されるのが特に好ましい。本発明のアッセイは、最先端の方法（一元放射拡散法（ＳＲＤ））の補助的または代わりの方法として適用することが可能である。本発明の方法は迅速であり（結果は約４時間以内；ＳＲＤは約３日）、大量試料処理（ｈｉｇｈ ｓａｍｐｌｅ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）での適用を可能にする。前記方法は、特定の試薬（たとえば、株特異的抗体）とは無関係である。本発明のアッセイは、ＳＲＤの感度があまりに低い（精製／濃縮前に）またはＳＲＤ結果が信頼性のない（収穫時に／ウイルス粒子関連ＨＡが測定されない）場合に特に適用可能である。

特に好ましい実施形態では、ウイルスを収穫するための最適時間を決定するために、本発明を使用して発酵中のウイルス負荷を定量する。

さらに特に好ましい実施形態では、ウイルス試料のリボヌクレアーゼ消化が核酸分析に先行する。遊離のウイルスＲＮＡとインタクトなウイルス粒子とを区別し、したがってインタクトなウイルス粒子を定量することが同様に可能である。

ワクチン組成物およびワクチン投与
本発明は、上記の本発明の製造プロセスにより作製されるワクチンも提供する。そのようなワクチンは典型的には主要な免疫原としてＨＡを含有し、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＤにより測定されるＨＡレベルを参考にして標準化される。既存のワクチンは、典型的には、１株あたり約１５μｇのＨＡを含有するが、たとえば、小児用、または汎流行性の状況では、またはアジュバントを使用する場合、より少ない用量を使用することが可能である。より多い用量（たとえば、３倍または９倍用量）が使用されてきたように、１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇ ＨＡ）、１／４および１／８などの分割量が使用されてきた。したがって、ワクチンは、インフルエンザ１株あたり０．１〜１５０μｇの間のＨＡ、好ましくは０．１〜５０μｇの間、たとえば、０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇ、等を含み得る。特定の用量は、たとえば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５、等を含む。生ワクチンでは、投薬は、ＨＡ含有量ではなく５０％組織培養感染量（ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）により測定され、１株あたり１０^６〜１０^８の間（好ましくは、１０^６．５〜１０^７．５の間）のＴＣＩＤ５０が典型的である。

本発明を用いて作製されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスにおいて見出される天然ＨＡまたは改変ＨＡを有し得る。たとえば、ＨＡを改変してウイルスをトリ種において高病原性にする決定基（たとえば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位周辺の高塩基性領域）を取り除くことは公知である。いわゆる「逆遺伝学」を使用すれば、そのような改変は促進される。

ワクチンにおいて使用するためのインフルエンザウイルス株は季節によって変化する。大流行間期（ｉｎｔｅｒｐａｎｄｅｍｉｃ）の期間、ワクチンは典型的には２種類のインフルエンザＡ株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）ならびに１種類のインフルエンザＢ株を含み、三価ワクチンが典型的である。本発明は、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株およびＨ１サブタイプ株もなどのパンデミックウイルス株（すなわち、ワクチンレシピエントおよび一般的ヒト集団が免疫学的にナイーブな株、特にインフルエンザＡウイルス）に対するワクチン製造においても使用し得、パンデミック株に対するインフルエンザワクチンは一価でもよく、またはパンデミック株を補充された通常の三価ワクチンに基づいていてもよい。しかし、季節とワクチンに含まれる抗原の性質に応じて、本発明は、ＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５もしくはＨ１６および／またはＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８もしくはＮ９のうちの１つまたは複数に対するワクチン製造においても使用し得る。

大流行間期株に対するワクチンの製造に適しているだけではなく、本発明の組成物はパンデミック株に対するワクチンの製造に特に有用である。インフルエンザ株に大流行の発生を引き起こす可能性を与えるインフルエンザ株の特徴は、（ａ）そのインフルエンザ株が、現在循環しているヒト株における赤血球凝集素と比べて新しい赤血球凝集素を含有している、すなわち、１０年を超える間ヒト集団において明らかになっていなかったインフルエンザ株（たとえば、Ｈ２）、またはヒト集団において以前まったく見られなかったインフルエンザ株（たとえば、一般にはトリ集団においてのみ見出されてきたＨ５、Ｈ６もしくはＨ９）であり、ヒト集団は前記株の赤血球凝集素に免疫学的にナイーブである；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平に伝染することができる；ならびに（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに病原性である。Ｈ５赤血球凝集素タイプを有するウイルスは、Ｈ５Ｎ１株などのパンデミックインフルエンザに対して免疫化するのに好ましい。他の可能な株には、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７ならびに他のどんな新生の潜在的なパンデミック株でもおよびＨ１Ｎ１株も挙げられる。

本発明の組成物は、インフルエンザＡウイルスおよび／またはインフルエンザＢウイルスを含む、１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４またはそれより多く）のインフルエンザウイルス株由来の抗原（複数可）を含み得る。ワクチンがインフルエンザの１つを超える株を含む場合、異なる株を典型的には別々に増殖し、ウイルスを収穫し抗原を調製した後に混合する。したがって、本発明のプロセスは、１つを超えるインフルエンザ株由来の抗原を混合するステップを含み得る。２種類のインフルエンザＡウイルス株および１種類のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、三価ワクチンが典型的である。２種類のインフルエンザＡウイルス株および２種類のインフルエンザＢウイルス株または３種類のインフルエンザＡウイルス株および１種類のインフルエンザＢウイルス株由来の抗原を含む、四価ワクチンも有用である可能性がある（ＷＯ２００８／０６８６３１）。

本発明に従って製造されるワクチン組成物は、薬学的に許容される。前記組成物は、通常、抗原に加えて成分を含み、たとえば、前記組成物は典型的には、１つまたは複数の薬学的な担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）を含む。下記のように、アジュバントも含み得る。そのような成分についての徹底的な議論は参考文献において入手可能である（明白に言及されているＷＯ２００８／０６８６３１）。本発明の組成物は、前記組成物を受ける患者において誘発される免疫応答（体液性および／または細胞性）を増強するように機能することが可能なアジュバントを都合よく含み得る。好ましいアジュバントは、水中油型乳剤を含む。様々なそのようなアジュバントが公知であり、前記アジュバントは典型的には、少なくとも１種類の油および少なくとも１種類の界面活性剤を含み、前記油（複数可）および前記界面活性剤（複数可）は生分解性（代謝可能な）であり生体適合性である。前記油はスクアレンを含み得る。前記乳剤中の油滴は、一般に直径が５μｍ未満であり、理想的にはサブミクロンの直径を有し、これらの小さなサイズは安定な乳剤を提供するマイクロフリューダイザ（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）を用いて達成される。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴は、濾過滅菌にかけることが可能なので好ましい。潜在的アジュバントはＷＯ２００８／０６８６３１に詳細に記載されている（１４頁に続く；明白に言及されている；たとえば、ＭＦ５９（商標））。本発明の組成物（またはキット成分）に適した容器には、無菌バイアル、注射器（たとえば、使い捨て注射器）、鼻内噴霧器、等が挙げられる。そのような容器はＷＯ２００８／０６８６３１に詳細に記載されている（３１頁、明白に言及されている）。

本発明は、本発明に従って製造されるワクチンを提供する。これらのワクチン組成物はヒト患者への投与に適しており、本発明は、本発明の組成物を患者へ投与するステップを含む、患者において免疫応答を惹起する方法を提供する（ＷＯ２００８／０６８６３１に詳細に記載されている；３２頁以下、明白に言及されている）。

配列およびキット
表１に概要を述べられているプライマーとプローブ配列（配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１）も本発明の一部である。配列番号８は、２つの縮重塩基を含んでいるので、４つの別々の独立したオリゴヌクレオチド配列として存在し得る。

インフルエンザＡでは：フォワードプライマーには配列番号５、２および７が挙げられ、リバースプライマーは配列番号４であり；有用なプローブは配列番号３である。インフルエンザＢでは：リバースプライマーには配列番号８、１０および１が挙げられ；フォワードプライマーは配列番号１１であり；有用なプローブは配列番号９である。配列番号６は、インフルエンザＡのための追加のフォワードプライマーである。用語「フォワード」は、便宜上使用されているだけであり、マトリックスタンパク質についてのＡＴＧ含有コード鎖と同じセンス（ｓｅｎｓｅ）を有するプライマーのことである。インフルエンザウイルスはマイナス鎖ゲノムを有するので、用語のフォワードおよびリバースは、ウイルスゲノムＲＮＡセグメントへのハイブリダイゼーションに言及する場合は反対にしてもよい。

本発明の追加の実施形態は、特にキットという形態での、配列番号４および７のプライマーと配列番号３のプローブとの特定の組合せ（インフルエンザＡ）、ならびに配列番号１１および１のプライマーと配列番号９のプローブとの特定の組合せ（インフルエンザＢ）である。前記キットは、追加の成分、たとえば、緩衝液、ポリメラーゼおよび増幅のための追加の反応成分を含有してもよい。本発明の追加の部分は、インフルエンザウイルスの検出のための、ならびに特に診断的適用のためのワクチン製造プロセス内でのウイルスの定量のための前記配列、組合せおよびキットの使用である。

追加の有用なプライマーは配列番号１２、１３、１４および１５である。追加の有用なプローブは配列番号１６および１７である。配列番号１４および１５は、配列番号１６と組み合わせて使用することが可能である。配列番号１７は、配列番号４および７と組み合わせて使用することが可能である。

本発明のプローブ（たとえば、配列番号３および９）は、たとえば、５’６−カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ）標識および／または３’「ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ」（ＢＢＱ）標識を用いて標識し得る。

本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。これらの核酸は、長さが８０ヌクレオチド未満、たとえば、５０ヌクレオチド未満または３０ヌクレオチド未満の一本鎖であるべきである。前記核酸は、インフルエンザウイルスを検出するためのプライマーおよび／またはプローブとして有用であることが可能である。前記核酸は、関連する配列番号と同じ３’残基を有し得る、すなわち前記核酸は配列５’−Ｘ−Ｙ−３’（Ｙは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される配列であり、Ｘは１つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列である）を含み得る。配列５’−Ｘ−Ｙ−３’を有する核酸は、インフルエンザウイルスマトリックス核酸にハイブリダイズすることが可能である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
インフルエンザウイルスＲＮＡを検出するための方法であって、インフルエンザゲノム内の保存された領域を増幅することを特徴とする方法。
（項目２）
前記保存された領域がＭタンパク質を部分的にまたは完全にコードしている、項目１に記載の方法。
（項目３）
配列番号３または配列番号９を含むアンプリコンを提供する、項目１に記載の方法。
（項目４）
１ステップＲＴ−ｑＰＣＲを実施することを特徴とする、前記項目の一項に記載の方法。
（項目５）
表１のプライマーまたはプローブ（配列番号１〜１１）のうちの少なくとも１つを使用することを特徴とする、項目４に記載の方法。
（項目６）
インフルエンザウイルスＲＮＡの量を定量するための方法であって、
ａ）項目１から５の一項に記載の方法を適用するステップ、
ｂ）発生したシグナルを標準ＲＮＡにより発生したシグナルと比較するステップ、
ｃ）ウイルスＲＮＡの量を決定するステップ
を実施することを特徴とする方法。
（項目７）
試料中のインタクトなウイルス粒子の量を定量するための方法であって、
ａ）遊離のウイルスＲＮＡを前記試料から除去するステップ、
ｂ）項目１から５の一項に記載の方法を適用するステップ、
ｃ）発生したシグナルを標準ＲＮＡにより発生したシグナルと比較するステップ、
ｄ）インタクトなウイルス粒子の量を決定するステップ
を実施することを特徴とする方法。
（項目８）
ステップ（ａ）におけるＲＮＡをリボヌクレアーゼ処理によって除去する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記項目の一項に記載の方法が適用される、インフルエンザワクチンを製造するための方法。
（項目１０）
細胞培養ベースの製造プロセスの発酵ステップ内で前記方法が適用され、ウイルスを収穫するための最適時間を決定するためにウイルス粒子の量を定量することを特徴とする、項目９に記載の方法。
（項目１１）
インフルエンザワクチンの細胞培養ベースの製造のための方法であって、
・細胞を発酵容器において増殖するステップ；
・種ウイルスを添加するステップ；
・前記ウイルスの増殖を項目７に記載の方法を使用してモニタリングするステップ；
・前記ウイルスの懸濁液を遠心分離し、濾過するステップ；
・前記ウイルスをクロマトグラフィーおよび限外濾過／ダイアフィルトレーションステップにより精製し、不活化し、破壊して、ウイルス表面抗原ＨＡおよびＮＡを可溶化するステップ；
・前記抗原を濾過して一価バルクを得るステップ；ならびに
・任意選択で、前記一価バルクを多価バルク（典型的には三価バルク）にブレンドし、最終容器に充填するステップ
を実施することを特徴とする方法。
（項目１２）
項目９または１０に記載の方法により製造されるインフルエンザワクチン。
（項目１３）
項目１から６の一項に記載の方法を適用することを特徴とする、インフルエンザの診断のための方法。
（項目１４）
表１に示されるプライマーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチド（配列番号１〜１１）。
（項目１５）
項目１４に記載のプライマーまたはプローブのうちの少なくとも１つを含み、任意選択で、追加の成分、たとえば、核酸増幅を行うための試薬および前記増幅を行うための使用説明書を含有するキット。
（項目１６）
インフルエンザワクチン製造またはインフルエンザ診断のための、項目１３に記載のオリゴヌクレオチドおよび項目１４に記載のキットの使用。

図１は、感染中に測定された、ｑＰＣＲウイルス粒子測定値と公知の感染性ウイルス動態の相関関係を示している。ｘ軸は感染後の時間を示している。ｙ軸は、対数目盛でｑＰＣＲにより評価される１ｍＬあたりのコピー数を示している。前記図は、ｑＰＣＲ曲線が低感染多重度で標準感染性ウイルス力価動態に一致していることを例証している。特に、ウイルス子孫は１６〜２４時間後上清中で測定可能であり、最大感染性は４８時間後に見られる。各線は異なる実験を示している。 図２は、透過型電子顕微鏡により評価されるウイルス粒子対本発明に従ったｑＰＣＲにより評価されるウイルス粒子数の相関関係を示している。ｘ軸は、１ｍＬあたりのＴＥＭウイルス粒子カウント数を示しており、ｙ軸は、ｑＰＣＲにより評価される１ｍＬあたりのコピー数を示している。

異なるインフルエンザサブタイプの検出
インフルエンザウイルス株は、ドイツ国家動物インフルエンザリファレンスセンター（Ｇｅｒｍａｎ ｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ａｎｉｍａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）（Ｆｒｉｅｒｉｃｈ Ｌｏｅｆｆｌｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｒｉｅｍｓ）から入手される。前記株はＭＤＣＫ ３３０１６ＰＦ細胞上で培養され、継代１および２の上清は、Ｑｉａｇｅｎ ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）ウイルスキットまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（ＴＭ）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）キットのどちらかを使用する本発明のＲＴ−ＰＣＲ法を使用して分析される。使用されるプライマーとプローブは表１に示されるプライマーとプローブである。

ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）ウイルスキットが使用される場合、以下の温度プロファイルが実行される。
蛍光シグナルの測定：６０℃
ランプ速度２℃／秒
ＲＴステップ：５０℃で２０分間
Ｔａｑ活性化：９５℃で５分間
主要ラン：４５サイクル：９４℃で１５秒間；６０℃で４５秒間（２ステッププロセス）または４５サイクル：９４℃で１５秒間；６０℃で３０秒間；７２℃で３０秒間（３ステッププロセス） 。

Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（ｔｍ）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）キットが使用される場合、以下の温度プロファイルが実行される。
蛍光シグナルの測定：６０℃
ランプ速度２℃／秒
ＲＴステップ：５０℃で１５分間
Ｔａｑ活性化：９５℃で２分間
主要ラン：４５サイクル：９４℃で１５秒間；６０℃で４５秒間 。

蛍光シグナルはそれぞれのリアルタイムソフトウェアを使用して分析される。前記シグナルは、発生した蛍光シグナルとＩＶＴの希釈系列のそれぞれのシグナルとを比較することにより定量される。表２に示されている結果は、試験されたインフルエンザウイルスサブタイプのすべてが同一組のプライマーとプローブを用いて同定することが可能であることを実証している。これは、本発明の方法が、いくつかの異なるインフルエンザサブタイプを検出することができることを示している。本発明者らは、表７に示されているインフルエンザ株も試験した。

本発明の方法の感度を評価するために、Ａ／Ｂａｙｅｒｎ／７／９５インフルエンザ株またはＢ／Ｂａｄｅｎ Ｗｕｅｒｔｔｅｍｂｅｒｇ／３／０６インフルエンザ株のどちらかを含有する試料の系列希釈が行われる。前記試料は、本発明の方法（上記の通りに）に従ってＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（商標）ウイルスキットもしくはＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ（ｔｍ）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）キットのどちらか、または製造業者のプロトコールに従ってＣｅｐｈｅｉｄ（商標）インフルエンザウイルスＡ／Ｂプライマーおよびプローブセットを使用するｑＰＣＲにかけられる。蛍光シグナルはそれぞれのリアルタイムソフトウェアを使用して分析される。前記シグナルは、発生した蛍光シグナルとＩＶＴの希釈系列のそれぞれのシグナルを比較することにより定量される。結果は表５および６に示されている。インフルエンザＡ株では、ウイルス粒子が、本発明の方法を使用した場合には、希釈度１：１００００００まで依然として検出可能であるが、Ｃｅｐｈｅｉｄキットは希釈度１：１０００００までしかウイルス粒子を検出することができないことを示す。インフルエンザＢ株では、ウイルス粒子は、希釈度１：１００００００まで依然として検出可能であるが、Ｃｅｐｈｅｉｄキットは希釈度１：１００００までしかウイルス粒子を検出することができない。したがって、本発明の方法は、従来技術の方法よりもはるかに感度がよい。

試料中のインフルエンザウイルス粒子の定量
図１に概要が述べられているように、インフルエンザウイルス粒子は試料において測定される。手短に言えば、２１μｌ試料は、１５ＵのリボヌクレアーゼＡと７．５ＵのＴ１の混合物を使用してリボヌクレアーゼにかけられる。前記試料は１時間前記リボヌクレアーゼ混合物と一緒にインキュベートされる。前処理された試料は、ｑＰＣＲが線形範囲をもたらす希釈度を得るように、１：１００〜１：１００００の比で希釈される。前記試料は本発明の方法に従ってｑＰＣＲにかけられる。結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ）を使用して標準曲線と比較される。結果（図１に例示されている）は、得られるｑＰＣＲコピー数の曲線が低感染多重度で標準感染性ウイルス力価動態に一致していることを示している。特に、ウイルス子孫は１６〜２４時間後上清中で測定可能であり、最大感染価は４８時間後に観察される。

透過型電子顕微鏡により評価されるウイルス粒子と本発明に従ったｑＰＣＲにより評価されるウイルス粒子の相関関係
得られるインフルエンザ株は、Ａ／Ｂａｙｅｒｎ／７／９５、Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／８／６８、Ｂ／Ｌｅｅ／４０であり、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４はＡＢＩオンラインから得られる。ウイルス粒子の数は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により評価される。この目的を達成するために、ウイルス粒子は、被膜された銅グリッドに適用され、風乾される。次に、前記材料は２．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドを用いて固定され、洗浄され、２％（ｗ／ｖ）水性酢酸ウラニルおよび２％（ｗ／ｖ）リンタングステン酸（ＰＴＡ）ｐＨ６．５を用いて染色される。試料中のウイルス粒子の数はＴＥＭにより決定される。ＴＥＭにより計数されるウイルス粒子の数は、本発明に従ってｑＰＣＲにより評価されるウイルス粒子の数と比較される。結果（図２参照）は、本発明の方法が、様々な異なるインフルエンザ株について試料中のウイルス粒子の数を正確に決定することを示している。

本発明は単なる例示として記載したにすぎず、本発明の範囲と精神の範囲内にとどまりつつ改変を行い得ることは理解されるであろう。

Claims (12)

1. 試料中のインタクトなウイルス粒子の量を定量するための方法であって、以下のステップ：
   ａ）遊離のウイルスＲＮＡを前記試料から除去するステップ、
   ｂ）前記試料中の残存インフルエンザウイルスＲＮＡを検出するための方法を適用するステップであって、インフルエンザゲノム内の保存された領域を増幅することを特徴とするステップ、
   ｃ）ステップｂ）によって発生したシグナルを標準ＲＮＡにより発生したシグナルと比較するステップ、
   ｄ）インタクトなウイルス粒子の量を決定するステップ
   を実施することを特徴とする方法。
2. 前記保存された領域がＭタンパク質を部分的にまたは完全にコードしている、請求項１に記載の方法。
3. 配列番号３または配列番号９を含むアンプリコンを提供する、請求項１に記載の方法。
4. １ステップＲＴ−ｑＰＣＲを実施することを特徴とする、請求項１〜３のうちの一項に記載の方法。
5. 配列番号１〜１７からなる群より選択される配列を有するプライマーまたはプローブのうちの少なくとも１つを使用することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. ステップ（ａ）におけるＲＮＡをリボヌクレアーゼ処理によって除去する、請求項１に記載の方法。
7. インフルエンザワクチンの製造の間にインフルエンザウイルスの収量をモニタリングするための方法であって、
   ａ）遊離のウイルスＲＮＡを試料から除去するステップ、
   ｂ）前記試料中の残存インフルエンザウイルスＲＮＡを検出するための方法を適用するステップであって、インフルエンザゲノム内の保存された領域を増幅することを特徴とするステップ、
   ｃ）ステップｂ）によって発生したシグナルを標準ＲＮＡにより発生したシグナルと比較するステップ、
   ｄ）インタクトなウイルス粒子の量を決定するステップ
   を包含する、方法。
8. 細胞培養ベースの製造プロセスの発酵ステップ内で前記方法が適用され、ウイルスを収穫するための最適時間を決定するためにウイルス粒子の量を定量することをさらに特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. インフルエンザワクチンの細胞培養ベースの製造のための方法であって、以下のステップ：
   ・細胞を発酵容器において増殖するステップ；
   ・種ウイルスを添加するステップ；
   ・前記ウイルスの増殖を請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を使用してモニタリングするステップ；
   ・前記ウイルスの懸濁液を遠心分離し、濾過するステップ；
   ・前記ウイルスをクロマトグラフィーおよび限外濾過／ダイアフィルトレーションステップにより精製し、不活化し、破壊して、ウイルス表面抗原ＨＡおよびＮＡを可溶化するステップ；
   ・前記抗原を濾過して一価バルクを得るステップ；ならびに
   ・任意選択で、前記一価バルクを多価バルク（典型的には三価バルク）にブレンドし、最終容器に充填するステップ
   を実施することを特徴とする方法。
10. 以下：
    （１）配列番号５、２および７、および、インフルエンザウイルスのマトリックス核酸にハイブリダイズし得る配列５’−Ｘ１−Ｙ１−３’からなる群より選択される配列からなるフォワードプライマーであって、Ｙ１が配列番号５、２および７から選択される配列であり、そして、Ｘ１が１以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列である、フォワードプライマーと、
    配列番号４、および、インフルエンザウイルスのマトリックス核酸にハイブリダイズし得る配列５’−Ｘ２−Ｙ２−３’からなる群より選択される配列からなるリバースプライマーであって、Ｙ２が配列番号４の配列であり、そして、Ｘ２が１以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列である、リバースプライマーと、
    配列番号３、および、インフルエンザウイルスのマトリックス核酸にハイブリダイズし得る配列５’−Ｘ３−Ｙ３−３’からなる群より選択される配列からなるプローブであって、Ｙ３が配列番号３の配列であり、そして、Ｘ３が１以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列である、プローブ；ならびに
    （２）配列番号８、１０および１、および、インフルエンザウイルスのマトリックス核酸にハイブリダイズし得る配列５’−Ｘ４−Ｙ４−３’からなる群より選択される配列からなるリバースプライマーであって、Ｙ４が配列番号８、１０および１から選択される配列であり、そして、Ｘ４が１以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列である、リバースプライマーと、
    配列番号１１、および、インフルエンザウイルスのマトリックス核酸にハイブリダイズし得る配列５’−Ｘ５−Ｙ５−３’からなる群より選択される配列からなるフォワードプライマーであって、Ｙ５が配列番号１１の配列であり、そして、Ｘ５が１以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列である、フォワードプライマーと、
    配列番号９、および、インフルエンザウイルスのマトリックス核酸にハイブリダイズし得る配列５’−Ｘ６−Ｙ６−３’からなる群より選択される配列からなるプローブであって、Ｙ６が配列番号９の配列であり、そして、Ｘ６が１以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列である、プローブ
    からなる群より選択されるプライマーとプローブのセットを含む、キット。
11. 核酸増幅を行うための試薬をさらに含有する、請求項１０に記載のキット。
12. インフルエンザワクチン製造またはインフルエンザ診断のための、請求項１０または１１に記載のキット。