CN103014176B - 用于猪流感病毒实时荧光定量pcr检测的引物集 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组用于猪流感病毒SYBGREEN I Real‑time PCR检测法的引物集，包括猪流感病毒通用型M基因、H1亚型、N1亚型、H3亚型和N2亚型引物。本发明提供了一组用于猪流感病毒检测及分型的Real‑time PCR引物，该引物适用于SYBR Green I染料法，以降低SIV的检测成本，并实现对SIV的快速分型检测，为临床监测SIV疫情动态和流行趋势提供技术支撑。

Description

用于猪流感病毒实时荧光定量PCR检测的引物集

技术领域

本发明涉及H1和H3亚型猪流感病毒的核苷酸片段扩增引物，用于猪流感病毒的Real-time PCR检测及分型，属于生物技术领域。

背景技术

猪流感（Swine Influenza，SI）是由猪流感病毒（Swine influenzavirus，SIV）引起的一种急性、传染性的猪呼吸道疾病，该病的主要病征为突发、咳嗽、呼吸困难、发热、衰竭，还可导致怀孕母猪繁殖障碍。SIV属正粘病毒科A型流感病毒属，囊膜上有放射状排列的突起糖蛋白，分别为血凝素（Hemagglutinin，HA）、神精氨酸酶(Neuraminidase，NA)和M2蛋白（Matrix 2protein）。根据病毒血凝素（Hemagglutinins,HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）抗原性的差异，可将A型流感病毒分为16种不同的HA亚型（H1~H16）和10种NA亚型（N1~N9）。

由于猪体内既存在α2,6唾液酸受体，又存在α2,3唾液酸受体，因而可被人源、禽源及猪源的流感病毒同时感染，是导致新型流感毒株产生的重要中间宿主，被称为“基因混合器”，而流感病毒又具有抗原漂移和重组特性，从而大大增加了猪体内产生新型流感病毒的几率，成为公共卫生的重大隐患。从1918年的西班牙大流感到2009年H1N1流感的全球性大爆发，流感一直危害着全人类。除此之外，猪流感还可常常引发猪群并发或继发其他病毒或细菌的感染，给畜牧业造成巨大的经济损失。因而，猪流感病毒的监控显得尤为重要。SIV的亚型达11种之多，古典猪H1N1和类人H3N2亚型为目前在猪群中广泛流行的主要亚型。因此针对这两种亚型SIV建立快速、灵敏的检测方法，对于监测SIV的流行和亚型分布是非常必要的。

目前猪流感病毒的检测方法主要包括：（1）血清学检测：主要有酶联免疫吸附实验（ELISA）、微量血凝抑制实验（HI）等，这些方法需要高免单因子血清，对实验材料要求较高，且操作步骤较为繁琐；（2）核酸检测：主要有RT-PCR、全基因组测序及芯片检测等。RT-PCR检测方法灵敏度高，特异性好，需要的时间短。全基因组测序和芯片检测可获得信息量大，但是花费高，费时长，不适用于猪流感病毒的早期快速检测。

Real-time PCR（实时荧光定量PCR）是在普通PCR技术基础上发展起来的一种新型PCR技术，通过荧光染料对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算获得待测样品模板的初始浓度。根据实验材料不同，可分为TaqMan探针法和SYBR Green I染料法。TaqMan探针法中的引物包括一对寡核酸引物和一条荧光标记的特异性探针，荧光标记的探针设计及合成都较普通引物要繁琐，且价格较普通引物高。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一组用于猪流感病毒SYBGREEN I Real-time PCR（实时荧光定量PCR）检测法的引物集，包括猪流感病毒通用型M基因、H1亚型、N1亚型、H3亚型和N2亚型引物。引物序列见表1。

表1 SIV Real-time PCR引物表

本发明提供的引物适用于SYBGREEN I Real-time PCR，可对猪源鼻拭子、猪气管、猪肺脏及猪肺脏灌洗液中的猪流感病毒进行快速监测及亚型分析。

本发明提供的引物集可与常规的Real-time PCR试剂组装成试剂盒，因此，本发明还提供含有所述引物集的猪流感病毒SYBGREEN IReal-time PCR检测试剂盒。

本发明提供了一组用于猪流感病毒检测及分型的Real-time PCR引物，该引物适用于SYBR Green I染料法，以降低SIV的检测成本，并实现对SIV的快速分型检测，为临床监测SIV疫情动态和流行趋势提供技术支撑。

本发明提供的引物灵敏度与已知的用于TaqMan探针法的引物灵敏度相当，但引物的合成成本较TaqMan探针法低。

本发明提供的猪流感病毒亚型鉴定引物特异性好，与其它禽流感病毒和普通季节性流感无交叉反应。

将本发明提供的引物用于检测疑似感染猪流感病毒的猪肺脏组织，结果表明SIV通用型M基因引物与SIV分型引物所获得检测结果一致，可将该引物用于猪流感病毒的临床检测及分型鉴定。

附图说明

图1为SIV-H1引物的特异性检测结果。利用本发明提供的SIV-H1引物对普通季节性H1N1流感病毒、2009大流行H1N1流感病毒、H9N2禽流感病毒、H3N2SIV进行特异性检测。H1N1SIV为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照。横坐标表示循环次数，纵坐标表示校正后报告荧光强度。阳性对照在20个循环后出现明显的指数增长，曲线成明显的“S”形；其余样本均未有Ct值，可判定结果为阴性。

图2为SIV-N1引物的特异性检测结果。利用本发明提供的SIV-N1引物对普通季节性H1N1流感病毒、2009大流行H1N1流感病毒、H9N2禽流感病毒、H3N2 SIV进行特异性检测。H1N1SIV为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照。横坐标表示循环次数，纵坐标表示校正后报告荧光强度。阳性对照在20个循环后出现明显的指数增长，曲线成明显的“S”形；其余样本均未有Ct值，可判定结果为阴性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本发明的实验操作步骤如下：

1.病毒RNA的提取：选用Invitrogen公司的Trizol试剂，按该试剂说明书提取病毒RNA。

2.cDNA的制备：利用步骤1中提取的RNA，选用天根公司的TIANScript cDNA第一链合成试剂盒制备cDNA。

3.Real-time PCR：选用的Real-time PCR试剂盒为TAKARA公司的PremixEx Taq^TM II(Perfect Real Time)，每个样品设3个重复。反应体系及其组分见表2。

表2 Real-time PCR反应体系及其组分

扩增条件采用Premix Ex Taq^TM II(Perfect Real Time)试剂盒提供的标准扩增条件，如95°C，30秒；95°C，15秒，60°C，30秒，40个循环；融解。

进行Real-time PCR检测时，当CT值在15≤CT值≤36范围内时，表明所测CT值有效。

所述的Real-time PCR方法适用于ABI Real-Time PCR系统（7300、7500、7500FAST、7900），Thermal Cycler Dice Real Time系统和LightCycler Real Time PCR扩增仪。

实施例2引物灵敏度检测

1.样品：H1N1SIV（10⁸EID₅₀/ml）或H3N2SIV（10⁸EID₅₀/ml）作为参考品，无核酸酶水作为阴性对照。H1N1 SIV用于检测SIV-M、SIV-H1及SIV-N1引物的灵敏度。H3N2 SIV用于检测SIV-M、SIV-H3及SIV-N2引物的灵敏度。H1N1 SIV和H3N2 SIV均分离自临床上表现出感染SIV主要症状的猪，通过目前通用的RT-PCR分型检测法确定其所属亚型。

SIV-Taq引物见《一种实时荧光RT-PCR检测猪流感病毒的试剂盒》（专利号：200910039407），为检测猪流感病毒的通用引物，为本实施例中通用引物SIV-M的对照引物，用于比较本发明中提供的通用引物与已有发明中通用引物灵敏度的差异。

2.操作步骤：

1）病毒RNA的提取。

2）cDNA的制备：首先利用步骤1中提取的病毒RNA制备cDNA，然后将参考品cDNA进行10倍稀释，稀释度从10^-10-10^-1，然后用该系列稀释品作为模板，检测本发明提供引物对的灵敏度。可根据参考品（H1N1 SIV或H3N2 SIV）的初始滴度（EID₅₀/ml）及参考品cDNA的稀释度，计算各模板对应的病毒滴度（EID₅₀/ml）。

3）Real-time PCR。

3.检测结果：

表3 H1N1亚型猪流感病毒检测用引物灵敏度检测结果

注：“—”表示未检测到CT值。

表4 H3N2亚型猪流感病毒检测用引物灵敏度检测结果

注：“—”表示未检测到CT值。

以H1N1 SIV和H3N2 SIV参考品的cDNA为模板，SIV-M和SIV-Taq引物灵敏度检测结果均为的0.1 EID₅₀/ml。SIV-H1、SIV-N1和SIV-N2引物灵敏度检测结果为1EID₅₀/ml。SIV-H3引物灵敏度检测结果为10EID₅₀/ml。Real-time PCR结果表明，本发明设计的通用引物SIV-M的灵敏度与已知的TaqMan探针法中的通用引物灵敏度相当。

实施例3引物特异性检测

1.样品：H9N2禽流感病毒；普通季节性H1N1流感病毒cDNA；2009大流行H1N1流感病毒cDNA。上述流感病毒样品的亚型均通过目前通用的RT-PCR分型检测法确定其所属亚型。H1N1 SIV和H3N2SIV同实施例2。

H1N1 SIV为SIV-H1和SIV-N1引物特异性检测的阳性对照；H3N2 SIV为SIV-H3和SIV-N2引物特异性检测的阳性对照。阴性对照为无核酸酶水。

2.操作步骤：

1）病毒RNA的提取。

2）cDNA的制备。

3）Real-time PCR。

3.检测结果

利用本发明提供的SIV-H1和SIV-N1引物，以普通季节性H1N1流感病毒、2009大流行H1N1流感病毒、H9N2禽流感病毒及H3N2SIV的cDNA为模板，进行引物的特异性检测。H1N1SIV的cDNA为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照。结果表明，SIV-H1引物仅能特异性扩增H1亚型猪流感病毒，与其他亚型的流感病毒无反应（图1）；SIV-N1引物仅可特异性扩增N1亚型猪流感病毒，特异性良好（图2）。

以普通季节性H1N1流感病毒、2009大流行H1N1流感病毒、H9N2禽流感病毒及H1N1SIV的cDNA为模板，进行SIV-H3和SIV-N2引物的特异性检测。H3N2 SIV的cDNA为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照。SIV-H3和SIV-N2引物同样均仅可扩增对应亚型的SIV，与其他亚型的流感病毒无交叉反应。

实施例4对可疑待测样品的检测

1.样品：疑似感染猪流感病毒的猪肺脏组织6份。

2.操作步骤：

1）病毒RNA的提取。

2）cDNA的制备。

3）Real-time PCR：根据实施例1中的引物灵敏度，将H1N1 SIVcDNA和H3N2 SIVcDNA稀释至各引物可检测到的临界滴度，并以此稀释物作为各引物相应的阳性对照模板。阴性对照为无核酸酶水。

3.检测结果

表5可疑待测样品的检测结果

注：“—”表示未检测到CT值；“/”表示无此项检测。

从表5结果可以看出所测6份样品中：H1N1亚型阳性的样品有5份；H3N2亚型阳性的样品仅有1份；H1N1和H3N2亚型均为阳性的样品有1份。利用SIV-M引物进行检测获得的阳性样品数为H1N1亚型阳性样品数和H3N2亚型阳性样品数的总和，表明SIV通用型M基因引物与SIV分型引物所获得检测结果一致。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一组用于猪流感病毒SYBGREEN I Real-time PCR检测法的引物集，其特征在于，包括猪流感病毒通用型M基因、H1亚型、N1亚型、H3亚型和N2亚型引物，所述通用型M基因引物序列如SEQID No.1和2所示；所述H1亚型引物序列如SEQ ID No.3和4所示；所述N1亚型引物序列如SEQ ID No.5和6所示，所述H3亚型引物如SEQ ID No.7和8所示，所述N2亚型引物序列如SEQ ID No.9和10所示。

2.权利要求1所述的引物集在制备猪流感病毒检测试剂中的应用。

3.含有权利要求1所述引物集的猪流感病毒SYBGREEN IReal-time PCR检测试剂盒。