JP5713826B2 - 培養観察装置 - Google Patents

Description

本発明は、この発明は、微生物を培養する装置に関し、特に、培地で微生物を培養する場合に、その微生物を正確に観察できる装置に関する。

従来から、微生物を寒天培地で培養して、一定時間経過後の生菌数（以下、コロニー数と記載する場合がある）を検出することにより、食品の微生物汚染を検査することが行われている。この検査方法は、食品の検査試料１ｇまたは１ｍｌ中に生存する生菌数を用いて、食品の微生物汚染の指標としている。このような検査方法における生菌数の計数は、たとえば、混釈法で行われている。混釈法では生菌の試料と標準寒天培地をシャーレでよく混ぜ、培養に適した条件で（３５℃で４８時間）培養した後に、増殖して形成されたコロニー数を計数する。このような計数方法では、長時間の培養の結果、コロニーどうしが重なってしまい、正確な計数が困難であるという問題がある。

特開２００３−８５５３３号公報（特許文献１）は、このような問題を解決する個数計数方法を開示する。この個数計数方法は、測定対象を通過した光をエリアセンサで受け、エリアセンサが所定時間ごとに取得した画像を２値化して順次に２値化画像を得る２値化ステップと、基準となる２値化画像を画像記憶手段に記憶する画像記憶ステップと、基準となる２値化画像を得た後に得た２値化画像の中に所定の画素連結領域をそれぞれ内部に含む判定領域を設定する領域設定ステップと、基準となる２値化画像で判定領域に対応する比較領域の中に存在する画素連結領域の個数を計数する領域内計数ステップと、領域内計数ステップで計数された個数が０または１のとき、比較領域を判定領域で置き換え、領域内計数ステップで計数された個数が２以上のとき、比較領域を維持して、画像記憶手段に記憶された２値化画像を更新する更新ステップと、画像記憶手段に記憶された２値化画像の中の画素連結領域の個数を計数する個数計数ステップとを有する。

特開２００３−８５５３３号公報

上述した特許文献１に開示された個数計数方法においては、生菌数の計数方法として混釈法を採用し、コロニー増殖過程を顕微鏡で逐次拡大計測し、コンピュータで画像処理することによりコロニー数を計数する。この計数方法では、コロニーにレーザー等の光を照射してＣＣＤエリアセンサでコロニーの陰影像を拡大観測する方法、および、培地を入れる容器の結露を防ぐ構造を、採用している。この計数方法では、培養開始時から、試料を顕微鏡で拡大して観測し、一定時間間隔で逐次画像情報をコンピュータに取り込み画像処理を行う。この場合において、増殖して大きくなったコロニーから順次検出され、新たに検出されるコロニーが無くなった時に総生菌数を確定させる。従って、培養開始時間から短時間で生菌数を確定することが可能である。さらに、コロニーが重ならない段階から観測するために、正確な計数が可能である。

この個数計数方法においては、インキュベータ内でコロニーを増殖させる容器に工夫が施されている。混釈法で用いる通常のシャーレの場合、シャーレの上蓋の内側に結露が発生することにより正確な計測が困難になる。この問題を解決するために、この個数計数方法においては、計測する領域の培地表面が空気層に接触しないように密閉するとともに、全ての培地表面を密閉しないで空気層と接触する培地領域をつくった、培地容器を採用している。このような培地容器の構造によると、空気層と接触する培地領域は結露するが、密閉した培地領域は結露することなく連続自動計測が可能である。このようにして、培地の乾燥とシャーレの結露とをともに防ぎ、長時間の連続自動計測を実現している。

しかしながら、この培地容器では、計測領域の培地表面が空気層に接触しないために、シャーレ−の蓋の内側が結露することを防止できても、生菌の増殖に空気を必要とする場合には生菌が増殖しなくなり、正確にコロニー数を計測できない。
その一方、このような特別な形状の培地容器を用いないで２次元画像センサによりシャーレ内の生菌の状態を撮像してコロニー数を計測する場合、特許文献１を含め公知の技術では、シャーレの結露の影響を排除できない。通常のシャーレでこの影響を排除しようとすると、シャーレの上蓋を開けて結露を拭き取ってから培地を撮像するか、シャーレの上蓋を開いて培地を撮像することになる。このように撮像すると撮像の度にシャーレの上蓋を開けなければならず、培養条件が変化して培養の障害になったり、自動計測が困難になったり、上蓋を開けることによりシャーレの位置が変化してしまい正確な計数が困難になったりする。また、結露の影響を排除するためにシャーレの上方から強い照度で照明すると、シャーレの中央部にハレーションが発生して正確な計数が困難になる。その結果、特許文献１に開示された個数計数方法でも公知の技術でも、生菌の増殖と、生菌数の正確な計数とを両立できない。

本発明は、上述の問題に鑑みてなされたものであって、生菌の増殖と、生菌数の正確な計数とを両立できる培養観察装置を提供することを目的とする。

上述した目的を達成するため、本発明は次の技術的手段を講じている。
本発明に係る培養観察装置は、シャーレ内の平板状の培地で微生物を培養する。この培養観察装置は、シャーレを載置する載置台と、シャーレの側方に設けられ、培地の側方から光を培地へ向けて光を照射する照明ユニットと、載置台を通してシャーレの底皿側から培地を撮像する撮像手段と、載置台と照明ユニットと撮像手段とを内蔵し、且つ微生物を培養するに適した環境を内部に形成可能な筐体とを有する。

好ましくは、照明ユニットは、シャーレの周囲に離散的に設けられた照明であるように構成することができる。さらに好ましくは、照明ユニットは、シャーレの外径よりも大きな内径を備えた円筒形状の照明であるように構成することができる。さらに好ましくは、照明ユニットの光源は、培地へ向けて青白色光を照射するＬＥＤであるように構成することができる。

さらに好ましくは、撮像手段は、ＣＭＯＳからなる２次元エリアセンサであるように構成することができる。
さらに好ましくは、筐体内部のシャーレが載置された空間の温度を調整する温度調整ユニットを有するように構成することができる。
さらに好ましくは、筐体は、上方が開口された開口部を備えた本体と、開口部を閉鎖する蓋体とを備えるように構成することができる。この場合、載置台は、開口部に設けられ、撮像手段は、本体の内底部に、上方を撮像するように配備され、照明ユニットは、蓋体を閉じた際にシャーレの側方に位置する蓋体内側に設けられ、蓋体を閉じた際に培地の側方から培地へ向けて光を照射可能に配置されるように構成することができる。

本発明に係る培養観察装置によると、生菌の増殖と、生菌数の正確な計数とを両立することができる。

本発明の第１の実施形態に係る培養観察装置の斜視図である。 図１の培養観察装置の透過斜視図である。 図１（Ａ）に示す矢示Ｃ方向の断面図である。 図１（Ａ）に示す矢示Ａ方向の断面図である。 図１（Ａ）に示す矢示Ｂ方向の断面図である。 本発明の第１の実施形態に係る培養観察装置におけるシャーレと照明装置との詳細な位置関係を側面図である。 本発明の第２の実施形態に係る培養観察装置の斜視図である。 図４に対応する断面図である。 図６に対応する側面図である。

以下、本発明の実施形態を、図に基づいて説明する。
なお、以下の説明では、同一の部品には同一の符号を付してある。それらの名称及び機能も同じである。したがって、それらについての詳細な説明は繰返さない。
＜第１の実施形態＞
［装置構成］
図１に培養観察装置１００の全体斜視図を示す。この培養観察装置１００は、半円筒と直方体とを結合させた立体形状の筐体を有し、大きくは上ケース１０２と下ケース１０４とで構成される。図１（Ａ）に上ケース１０２が閉じられている状態を、図１（Ｂ）に上ケース１０２が開かれている状態を、それぞれ示す。図１（Ｂ）に示すように、上ケース１０２には、その内側に照明ユニット１２０が取り付けられている。その詳細な構成は後述するが、照明ユニット１２０は、透明のガラス板１１０に載置されたシャーレ２００内の寒天培地へ光を照射する。なお、下ケース１０４には、ガラス板１１０上に載置されるシャーレ２００の位置決めガイドを兼ねた第１プレート１０６が備えられている。この第１プレート１０６は、貫通部１０８を備える。下ケース１０４内に設けられた電気ヒータ（たとえば、下ケース１０４内の側面に貼付されたフィルムヒータ）で暖められた空気（培養に適した温度とされた空気）が、シャーレ２００が載置された上ケース１０２内の空間に、この貫通部１０８を通じて流れる。

図２に、培養観察装置１００の透過斜視図を示す。なお、この透過斜視図は図１（Ｂ）に対応する。図２においては、透過斜視図に一部外観図を重ねて示す。図２に示すように、培養観察装置１００の上ケース１０２と下ケース１０４とは、２つのフラットトルクヒンジ１３２により開閉自在に接合され、カフスラッチファスナー１３０により上ケース１０２を閉状態に保持することができる。上ケース１０２を閉状態に保持して微生物が培養される。

さらに、図３に図１（Ａ）に示す矢示Ｃ方向の断面図を、図４に図１（Ａ）に示す矢示Ａ方向の断面図を、図５に図１（Ａ）に示す矢示Ｂ方向の断面図を、それぞれ示す。これらの図１〜図５を用いて培養観察装置１００の内部構造を説明する。
培養観察装置１００の内部には、シャーレ２００を載置する透明のガラス板１１０と、シャーレ２００内の培地を照明する照明ユニット１２０と、シャーレ２００の底皿に設けられた培地を下方から撮像するカメラユニット１５０とを含む。

ガラス板１１０は、シャーレ２００の底皿の直径Ｄ（１）より大きな直径Ｄ（２）を備えた円形状である。このガラス板１１０は、直径Ｄ（２）よりも小さい直径Ｄ（３）の円形穴部を備えた第２プレート１１２に載置されている。このガラス板１１０の上方には、直径Ｄ（１）よりも大きく直径Ｄ（２）よりも小さい直径Ｄ（４）の円形穴部を備えた第１プレート１０６が載置されている。シャーレ２００を第１プレート１０６の円形穴部へ載置することにより、シャーレ２００のガラス板１１０上での位置を規制することができる。このように構成されているので、ガラス板１１０上のシャーレ２００を簡単に位置決めできるとともに、シャーレ２００の底皿に敷き詰められた培地の全体をカメラユニット１５０により撮像することができる。

なお、図１に示したように、第１プレート１０６には、温度調節用の貫通部１０８を備える。第２プレート１１２も第１プレート１０６と同じ位置に同じ形状の貫通部を備える。
照明ユニット１２０は、シャーレ２００を取り囲むように四方に設けられる。それぞれの照明ユニット１２０は、ＬＥＤユニット１２２と、ＬＥＤユニット１２２を保持する保持ユニット１２４とで構成される。ＬＥＤユニット１２２は、白色光〜青色光を発生するＬＥＤを用いている。なお、照明ユニット１２０は、シャーレ２００の培地に向けて側方から白色光〜青色光（以下、まとめて青白色光と記載する）を照射し培地を略均一に照明することができるものであればよく、４ヶ所に限定されるものではない。

照明された培地は、下ケース１０４に設けられたカメラユニット１５０によりガラス板１１０を通して撮像される。このとき、培地上に培養された生菌のコロニーが陰影となってカメラユニット１５０により撮像される。
カメラユニット１５０は、ＣＭＯＳイメージセンサから構成されるカメラセンサ１５２と、カメラセンサ１５２を保持するカメラプレート１５４とを含む。ＣＭＯＳイメージセンサは、２次元エリアセンサの一例である。

計数対象とする生菌の大きさは０．１ｍｍである。ここでは、カメラセンサ１５２の画素数を、１３０万画素とした。シャーレ２００の大きさが直径９０ｍｍであるため、１画素あたり０．０８７２ｍｍとなる。これ以上の分解能であると、培地の表面凹凸等を撮像して、正確な計数を却って阻害する。カメラセンサ１５２からの撮像信号は、ＵＳＢハーネス１４０を経由して、たとえばビデオキャプチャボードへ取り込まれる。このとき、取得画像の画素数は、一例として、６４０×４８０で各画素が８ビットのカラー階調を備える。このような諸元は限定されるものではなく、シャーレ２００の培地で培養された生菌またはコロニーが観察できるものであればよい。なお、カメラセンサ１５２にＣＭＯＳを用いることにより、ＣＣＤに比較して、安価であり、素子が小さいことから消費電力も少なく、原理的にスミアやブルーミングが発生せず、高速読み出しできるという長所がある。

さらに、下ケース１０４には、電気ヒータ１６０が備えられ、下ケース１０４内の空気を暖める。暖まった空気は上昇して貫通部１０８を通って、シャーレ２００が載置された上ケース１０２内の空間へ流れる。シャーレ２００が載置された上ケース１０２内の空間には、図示しない温度センサ（たとえば熱電対）が設けられ、温度センサは温度調整ユニットに接続されている。温度調整ユニットは、設定温度（たとえば３５℃）±２．５℃程度になるように電気ヒータをオンオフ制御したり、設定温度を目標値として電気ヒータをＰＩＤ制御したりする。

さらに、本実施形態に係る培養観察装置１００の特徴的な構成である、照明ユニット１２０とシャーレ２００との詳細な位置関係について図６を用いて説明する。図６は、照明ユニット１２０およびシャーレ２００の拡大図である。図６に示すように、照明ユニット１２０のＬＥＤユニット１２２は、シャーレ２００の底皿２２０に敷き詰められた平板上の培地３００を、そのやや上側の側方またはその側方（これらをまとめて側方と記載する）から青白色光を照射する。培地３００は、たとえば寒天培地であって、生菌増殖のための栄養分を含有する。このため、培養する生菌の種類により培地の種類が異なる。培地３００には様々な種類があるが、ＬＥＤユニット１２２から青白色光を培地３００の側方から照射することにより、導光板の機能を発現する培地３００が多い。４ヶ所のＬＥＤユニット１２２からの青白色光の照射および培地３００が導光板の機能を発現することにより、培地３００を均一に光らせることができる。なお、図３に示すように、シャーレ２００の底皿２２０の直径Ｄ（１）は、第１プレート１０６の円形穴部の直径Ｄ（４）よりも小さく、第１プレート１０６の円形穴部の端部と底皿２２０の底面端部との間には空間があるので、この空間を通ってＬＥＤユニット１２２から照射された光が培地３００へ到達する。

ＬＥＤユニット１２２の位置（培地との相対的な位置）、照射角度、波長および照度は、培地３００が導光板として機能して、培地３００を均一に光らせることができればよい。このように培地３００が導光板として機能するように、ＬＥＤユニット１２２が、シャーレ２００の周囲に設けられ、培地３００の側方から光を培地３００へ向けて光を照射する。すなわち、側方とは、培地３００が導光板として機能する全ての方向を含む。なお、培地の種類によりＬＥＤユニット１２２から照射される光の波長および照度の少なくとも一方を変更するようにしても構わない。

このようにして、ＬＥＤユニット１２２から青白色光が照射された培地３００をガラス板１１０を通してカメラユニット１５０で撮像することにより、シャーレ２００の上蓋２１０の内側に発生する結露の影響を完全に排除できる。このため、培地に増殖したコロニー数の正確な計数が可能となる。特に、シャーレ２００の上蓋を開けて結露を拭き取る必要がないために、シャーレ２００の位置を動かす必要もなく、正確にかつ連続的な自動計数することができる。詳しくは、シャーレ２００の位置を動かす必要がないので、一定時間間隔で観察（計数）しているときに、一定時間前のコロニーの状態と現在のコロニーの状態とを正確に比較することができる。

なお、図６に示すＬＥＤユニット１２２の位置は一例であって、第１プレート１０６に干渉しなければ、ＬＥＤユニット１２２の位置は、図６に示す位置よりも下方であっても構わない。下方にあるとＬＥＤユニット１２２は、培地３００を、より側方から青白色光を照射することができる。
また、微生物等の培養に光の影響がある場合を除いてＬＥＤユニット１２２へ連続的に通電しても構わない。このようにすることにより、ＬＥＤユニット１２２から発生する熱により、電気ヒータの消費電力を低減させることが可能になる。

［作動態様］
上述した本実施形態に係る培養観察装置１００を用いて、微生物の培養を行いつつ、微生物の増加状況を観察（コロニー数の計測）する態様について説明する。
培地３００が敷き詰められたシャーレ２００の底皿２２０に微生物（菌）を塗布する。このときシャーレ２００内で培養する菌に適した培地３００が選択されている。

菌が塗布されたシャーレ２００を培養観察装置１００のガラス板１１０に載置する。このとき、第１プレート１０６の穴部が、シャーレ２００の底皿２２０のガイドとなる。その後、上ケース１０２を閉じて、カフスラッチファスナー１３０により上ケース１０２を閉状態に保持する。
照明ユニット１２０を点灯して、カメラユニット１５０により初期画像を撮像する。電気ヒータ１６０に通電すると、下ケース１０４内の空気が暖められて、暖まった空気は上昇して貫通部１０８を通って、シャーレ２００が載置された上ケース１０２内の空間へ流れ、シャーレ２００の周囲温度が培養に適した温度に維持される。なお、このときに、培養の阻害にならなければ、照明ユニット１２０を点灯していても構わない。

予め設定した時間間隔（たとえば３時間間隔）で、培地３００上で増殖した菌の状態（コロニーの状態）をカメラユニット１５０により撮像する。撮像画像に画像処理を行い、コロニー数を計数する。
このとき、カメラユニット１５０で撮像した画像からコロニー数をカウントする処理（画像処理）は、当業者に定法のものが採用可能である。たとえば、一定の時間間隔で撮像された画像から初期画像を減算して、最初からシャーレ２００についているゴミなどの影響を排除する。減算画像を二値化して、二値化画像で連続した画素領域を連かつ処理して、画素領域をラベリングして、連結した画素領域を１つのコロニーとして計数する。

以上の処理によって、コロニー数を計数可能となる。なお、この計数処理は、培養観察装置１００の外部のパーソナルコンピュータでも実行しても構わないし、培養観察装置１００内に画像処理装置を設けて処理しその画像処理の結果を外部のコンピュータへ転送しても構わない。このように、カメラユニット１５０と外部のコンピュータ等とは、たとえばＵＳＢハーネス１４０を経由したり、ＬＡＮ通信ユニットを経由したりして接続される。

［効果］
以上のようにして、本実施形態に係る培養観察装置によると、シャーレ内で所望の生菌を培養できるとともに、上蓋の内側の結露の影響を受けることなくシャーレ内で培養されたコロニー数を正確に、かつ、連続的に自動計数することができる。このようにすると、オンラインでの連続観察も可能となる。

＜第２の実施形態＞
以下に、図７〜図９を参照して、本発明の第２の実施形態に係る培養観察装置４００について説明する。図７は図１（Ｂ）に対応する培養観察装置４００の斜視図、図８は図４に対応する断面図、図９は図６に対応する側面図である。
これらの図に示すように、本実施形態にかかる培養観察装置４００は、第１の実施形態に係る培養観察装置１００とは異なる照明ユニット４２０を備える。その他の構成は第１の実施形態と同じであるため、ここでの詳細な説明は繰り返さない。

照明ユニット４２０は、培養観察装置４００の上ケース４０２に設けられ、シャーレ２００の周囲を取り囲む中空円筒部４２６と中空円筒部４２６を上ケース４０２内に保持する保持部４２４とを有する。中空円筒部４２６の内部には、シャーレ２００内の培地３００を均一に照明するようにＬＥＤユニット４２２が配置されている。中空円筒部４２６と保持部４２４とは、たとえば一体成型された樹脂で構成される。

中空円筒部４２６は、ポリプロピレンなどで形成され、ＬＥＤユニット４２２からの光を拡散する拡散板の役目を担っている。
ＬＥＤユニット４２２は、第１の実施形態のＬＥＤユニット１２２と同じＬＥＤを用いている。ここでも、照明ユニット４２０は、シャーレ２００の培地に向けて側方から青白色光を照射し、培地を略均一に照明することができるものであればよく、ＬＥＤユニット４２２は図示した１２個に限定されるものではない。

さらに、本実施形態に係る培養観察装置４００の特徴的な構成である、照明ユニット４２０とシャーレ２００との詳細な位置関係について図９を用いて説明する。図９は、照明ユニット４２０およびシャーレ２００の拡大図である。図９に示すように、照明ユニット４２０のＬＥＤユニット４２２は、シャーレ２００の底皿２２０に敷き詰められた培地３００を、その上方または側方から青白色光を照射する。ＬＥＤユニット４２２から青白色光を照射することにより、多くの培地３００が導光板の機能を発現して、ＬＥＤユニット４２２からの青白色光の照射により、培地３００を均一に光らせることができる。

このようにして、ＬＥＤユニット４２２から青白色光が照射された培地３００をガラス板１１０を通してカメラユニット１５０で撮像することにより、シャーレ２００の上蓋２１０の内側に発生する結露の影響を完全に排除できる。
なお、図９に示すＬＥＤユニット４２２の位置は一例であって、第１の実施形態と同様に、第１プレート１０６に干渉しなければ、ＬＥＤユニット４２２の位置は、図９に示す位置よりも下方であっても構わない。下方にあるとＬＥＤユニット４２２は、培地３００を、より側方から青白色光を照射する。ここで、側方の意味は、第１の実施形態と同じである。

本実施形態に係る培養観察装置４００の作動態様は、第１の実施形態に係る培養観察装置１００と同じである。
以上のようにして、本実施形態に係る培養観察装置によると、第１の実施形態と同様に、シャーレ内で所望の生菌を培養できるとともに、上蓋の内側の結露の影響を受けることなくシャーレ内で培養された生菌またはコロニー数を正確に、かつ、連続的に自動計数することができる。

以上、今回開示された実施形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

１００、４００ 培養観察装置
１０２ 上ケース
１０４ 下ケース
１０６ 第１プレート
１０８ 貫通部
１１０ ガラス板
１１２ 第２プレート
１２０、４２０ 照明ユニット
１２２、４２２ ＬＥＤユニット
１２４ 保持ユニット
１３０ カフスラッチファスナー
１３２ フラットトルクヒンジ
１４０ ＵＳＢハーネス
１５０ カメラユニット
１５２ カメラセンサ
１５４ カメラプレート
２００ シャーレ
３００ 培地

Claims (6)

1. シャーレ内の平板状の培地で微生物を培養する培養観察装置であって、
   前記シャーレを載置する載置台と、
   前記シャーレの側方に設けられ、前記培地の側方から光を前記培地へ向けて光を照射する照明ユニットと、
   前記載置台を通して前記シャーレの底皿側から前記培地を撮像する撮像手段と、
   前記載置台と照明ユニットと撮像手段とを内蔵し、且つ微生物を培養するに適した環境を内部に形成可能な筐体と、
   を有し、
   前記筐体は、
   上方が開口された開口部を備えた本体と、前記開口部を閉鎖する蓋体とを備え、
   前記載置台は、前記開口部に設けられ、
   前記撮像手段は、前記本体の内底部に、上方を撮像するように配備され、
   前記照明ユニットは、前記蓋体を閉じた際にシャーレの側方に位置する前記蓋体内側に設けられ、前記蓋体を閉じた際に前記培地の側方から前記培地へ向けて光を照射可能に配置されたことを特徴とする培養観察装置。
2. 前記照明ユニットは、前記シャーレの周囲に離散的に設けられた照明であることを特徴とする請求項１に記載の培養観察装置。
3. 前記照明ユニットは、前記シャーレの外径よりも大きな内径を備えた円筒形状の照明であることを特徴とする請求項１に記載の培養観察装置。
4. 前記照明ユニットの光源は、前記培地へ向けて青白色光を照射するＬＥＤであることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の培養観察装置。
5. 前記撮像手段は、ＣＭＯＳからなる２次元エリアセンサであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれかに記載の培養観察装置。
6. 前記筐体内部の前記シャーレが載置された空間の温度を調整する温度調整ユニットを有することを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載の培養観察装置。

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