JP5596902B2 - 有用な代謝産物を製造するためのホスホケトラーゼの使用 - Google Patents

Description

［発明の背景］
発明の分野
本発明は、有用な代謝産物、特にアセチル−コエンザイムＡ（アセチル−ＣｏＡ）に由来する有用な代謝産物を製造する方法に関する。本発明は、該製造方法において使用される新規の細菌にも関する。

関連技術の簡単な説明
慣用的には、Ｌ−アミノ酸、それらの中間体、及び細菌代謝のその他の化学物質のような有用な代謝産物は、天然源から単離される細菌株又はその変異体がそれらの生産性を増強するよう改変される方法により製造される。

糖は、発酵に適している微生物における炭素の主要供給源である。エムデン・マイエルホーフ経路及びペントースリン酸（ペントース−Ｐ）経路は、微生物における中間糖代謝の２つの予備経路である。第三の経路であるエントナー・ドゥードロフ経路も、カルボン酸経路と多少の関係があるとして知られている。解糖経路で、グルコースは、Ｌ−アミノ酸、プリン及びピリミジン、ビタミン等の多くの細胞化合物の生成における構成成分として用いられる、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸及びアセチル−コエンザイムＡなどの主要中間化合物に代謝される。また、エネルギー（ＡＴＰ及びＮＡＤＨ）の発生が解糖反応中に起こる。解糖後に生成するピルビン酸は、しばしば、ｐｐｓ遺伝子によりコードされるホスホエノールピルビン酸シンターゼによりホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に、或いは、ｐｄｈ遺伝子によりコードされるピルビン酸デヒドロゲナーゼによりアセチル−ＣｏＡ等に変換される。上記の化合物の１つであるアセチル−ＣｏＡは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによりピルビン酸から生成され、ＣＯ₂の放出を伴う。一炭素原子のこの損失は、アセチル−ＣｏＡ由来の有用な化合物の生成収率の低減を生じる。

ビフィズス経路の２つの酵素、即ちＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ（「ホスホケトラーゼ」としても知られている）及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼが報告されている。Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ ４．１．２．９）は、キシルロース−５−リン酸のグリセルアルデヒド−３−リン酸及びアセチルリン酸へのリン酸の消費を伴う変換を触媒し、１分子の水の放出を伴う。フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ ４．１．２．２２）は、フルクトース−６−リン酸のエリスロース−４−リン酸及びアセチルリン酸へのリン酸の消費を伴う変換を触媒し、１分子の水の放出を伴う。両酵素は、ＣＯ₂による炭素の損失を伴わずに、アセチル−ＣｏＡの前駆体であるアセチルリン酸を生成する。Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ ４．１．２．９）は、アセトバクター属（Schramm, M. et al, J, Biol, Chem., 233(6), 1283-8 (1958)）、ビフィドバクテリウム属（Sgorbati, B. et al, Antonie Van Leeuwenhoek. 42(1-2), 49-57 (1976); Grill, J. P. et al Curr Microbiol., 31(1), 49-54 (1995)）、ラクトバチルス属（Posthuma, C. C. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002)）、チオバチルス属（Greenley, D.E. and Smith, D. W., Arch. Microbiol., 122, 257-261 (1979)）に属する細菌、カンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、ピキア属、ヤロウイア属、ハンセヌラ属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、トリコスポロン属、ウィンゲア属に属する酵母（Evans, C.T. and Ratledge, C., Arch. Microbiol., 139, 48-52 (1984); Ratledge, C. and Holdsworth, J.E., Appl. Microbiol. Biotechnol., 22, 217-221 (1985)）で報告されている。フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ（ＥＣ ４．１．２．２２）は、アセトバクター・キシリヌス（Schramm, M. et al, J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)）、ビフィドバクテリウム・グロボスム及びビフィドバクテリウム・デンチウム（Sgorbath, B. et al, Antonie Leeuwenhoek, 42, 49-57 (1976)）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ガードネレラ・バギナリス（Gavini, F. et al, Anaerobe, 2, 191-193 (1996)）などの細菌、並びにロドトルラ・グラミニス、ロドトルラ・グルチニス、カンジダ種、カンジダ・トロピカリス、サッカロミセス・パストリアヌス（Whitworth, D.A. and Ratledge, C., J. Gen. Microbiol., 102, 397-401 (1977)）などの酵母で報告されている。幾つかの生物体では、両活性は、１つの酵素により保持されるということも報告されている（例えばSchramm, M. et al（J. Biol. Chem., 233(6), 1283-8 (1958)）; Sgorbati, B. et al（Antonie Van Leeuwenhoek. 42(1-2), 49-57(1976)）; Meile, L. et al（J. Bacteriol., 183(9), 2929-36(2001)））。

２つの種からホスホケトラーゼ遺伝子がクローン化され、それらの配列が決定されている。これらは、ビフィドバクテリウム・ラクティスからのＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ／フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをコードするｘｆｐ遺伝子（Meile, L. et al, J. Bacteriol., 183(9), 2929-36(2001)）並びにラクトバチルス・ペントススからのＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼをコードするｘｐｋＡ遺伝子（Posthuma, C.C. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7(2002)）である。アメリカ国立バイオテクノロジー情報センターにより提供される微生物ゲノムデータベースの検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=&DB=genome）は、推定ホスホケトラーゼをコードする幾つかの遺伝子を示した。

キシロースレダクターゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ及び付加的にホスホケトラーゼに関する遺伝子を導入することによりキシロースからエタノールを生産する酵母の能力を向上させるための方法は知られている（ＷＯ２００３０７８６４３）。しかしながら、二酸化炭素の排除のためのホスホケトラーゼ遺伝子の使用の効果は報告されたことがなかった。

［発明の概要］
本発明の目的は、有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌の菌株による有用な代謝産物の生産を増大させること、及びこの菌株を用いた代謝産物の製造方法を提供することである。

本発明の目的は、有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌であって、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変された細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、有用な代謝産物がアセチル−コエンザイムＡに由来する上記の細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、有用な代謝産物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、コハク酸及びポリヒドロキシブチレートからなる群から選択される上記の細菌を提供することである。

本発明の目的は、有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌であって、本来的にＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性を有さず、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをコードするＤＮＡ断片で形質転換された細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、有用な代謝産物がアセチル−コエンザイムＡに由来する上記の細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、有用な代謝産物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、コハク酸及びポリヒドロキシブチレートからなる群から選択される上記の細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、腸内細菌科属細菌、コリネ型細菌及びバチルス属細菌からなる群から選択される上記の細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、エシェリヒア属又はパントエア属に属する上記の細菌を提供することである。

本発明のさらなる目的は、有用な代謝産物の製造方法であって、培地中で細菌を培養すること、及び、培地から有用な代謝産物を採取することを含む方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、有用な代謝産物がアセチル−コエンザイムＡに由来する、上記の有用な代謝産物の製造方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、有用な代謝産物が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、コハク酸及びポリヒドロキシブチレートからなる群から選択される、上記の有用な代謝産物の製造方法を提供することである。

これらの目的は、有用な代謝産物、特にアセチル−ＣｏＡ由来の有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌におけるＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性を増強することにより達成され、これにより、炭素をより効率的に利用するとともに、細菌による有用な代謝産物の生産を増大することが可能になった。したがって、本発明が完成した。

本発明を以下で詳細に説明する。

本発明の細菌は、有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌であって、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するよう改変された細菌を包含する。

本発明の細菌は、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性を本来的に有さない細菌、並びにＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性を本来的に有する細菌の両方を含む。このような細菌中にＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをコードする遺伝子を導入することにより、アセチル−ＣｏＡの生産性が細菌中で増強されて、有用な代謝産物の生産増強をもたらす。

本発明の細菌においては、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼのいずれか又は両方の活性が増強される。

本発明において、「ホスホケトラーゼ」という用語は、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの両方を含む。

本発明において、「Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼの活性」という語句は、１分子の水の放出を伴う、キシルロース−５−リン酸の、グリセルアルデヒド−３−リン酸及びアセチルリン酸への、リン酸消費性変換反応を触媒する活性を意味する。この活性は、Goldberg, M. et al（Methods Enzymol., 9, 515-520 (1966)）又はL. Meile（J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936）により記載された方法により測定され得る。

本発明において、「フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性」という語句は、１分子の水の放出を伴う、フルクトース−６−リン酸の、エリスロース−４−リン酸及びアセチルリン酸への、リン酸消費性変換反応を触媒する活性を意味する。フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性は、Racker, E.（Methods Enzymol., 5, 276-280 (1962)）又はL. Meile（J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936）により記載された方法により測定され得る。

ホスホケトラーゼ活性を本来的に有する細菌におけるホスホケトラーゼの活性は、野生株又は非改変株のものよりも、好ましくは野生株又は非改変株の１．５倍以上、さらに好ましくは２倍以上、最も好ましくは３倍以上に増強される。さらに本発明では、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性を本来的に有さない細菌も、親株として用いられ得る。ホスホケトラーゼ活性を本来的に有さない細菌におけるホスホケトラーゼの活性は、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをコードするＤＮＡ断片を用いて細菌を形質転換することにより増強され得る。親細菌がホスホケトラーゼ活性を本来的に有するか否かは、上記と同一の方法により測定され得る。

ホスホケトラーゼ活性が導入されたか否かは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）欠損株を用いて確認され得る。ＰＤＨ欠損株は、酢酸に対して栄養要求性である。一方、ホスホケトラーゼが導入された場合、ＰＤＨ欠損株は、酢酸に対して栄養要求性でなくなる。したがって、ホスホケトラーゼをコードする遺伝子の導入は、宿主株の酢酸栄養要求性の相補作用に基づいて確認され得る。ＰＤＨ欠損株として、実施例に記載されるようなΔａｃｅＥ株が用いられる。

「Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ」は、乳酸菌、メタノール資化細菌、メタン資化細菌、ストレプトコッカス細菌を含む、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する細菌、特に、アセトバクター属、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、チオバチルス属、ストレプトコッカス属、メチロコッカス属、ブチリビブリオ属、もしくはフィブロバクター属に属する細菌、および／又はカンジダ属、ロドトルラ属、ロドスポリジウム属、ピキア属、ヤロウイア属、ハンセヌラ属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、トリコスポロン属、もしくはウィンゲア属に属する酵母等に由来する酵素であり得る。

「フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ」とは、アセトバクター属、ビフィドバクテリウム属、クロロビウム属、ブルセラ属、メチロコッカス属、ガードネレラ属に属する、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性を有する細菌、及び／又はロドトルラ属、カンジダ属、サッカロミセス属等に属する酵母由来の酵素であり得る。

両活性が、１つの酵素（Ｄ−キシルロース−５−リン酸／フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ）によって保持される場合もありうる。

ラクトバチルス・ペントススＭＤ３６３のＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼをコードするｘｐｋＡ遺伝子の塩基配列は、アクセス番号ＡＪ３０９０１１でＥＭＢＬ／GenBankデータベースに登録されていて(Posthuma, C.C. et al, Appl. Environ. Microbiol., 68(2), 831-7 (2002))、配列番号１に示される。ラクトバチルス・プランタラムのＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼをコードするｘｐｋ１遺伝子の塩基配列は、アクセス番号ＮＣ＿００４５６７の領域：相補体（２３６２９３６．．２３６５３０２）でＥＭＢＬ／GenBankデータベースに登録されていて（Kleerebezem, M., et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(4), 1990-1995 (2003)）、配列番号３に示される。ｘｐｋ遺伝子及びｘｐｋ相同遺伝子の塩基配列は、表１及び配列表に示される。配列番号２及び４のアミノ酸配列のアラインメントは、図１に示される。

ビフィドバクテリウム・ラクティスのＤ−キシルロース−５−リン酸／フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをコードするｘｆｐ遺伝子の塩基配列は、アクセス番号ＡＪ２９３９４６でＥＭＢＬ／GenBankデータベースに登録されていて(Meile, L. et al, J. Bacteriol., 183(9), 2929-36 (2001))、配列番号５に示される。ｘｆｐ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号６に示される。ｘｆｐ遺伝子及びｘｆｐ相同遺伝子の塩基配列は、表２及び配列表で示される。

ｘｐｋＡ、ｘｐｋ１、及びｘｆｐ遺伝子は、いずれも既知の遺伝子の塩基配列に基づいて設計されたプライマーを用い、ＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照)によって得ることができる。ホスホケトラーゼのモチーフを含む遺伝子は、ｐｆａｍ及びモチーフを用いて得ることができる(http://pfam.wustl.edu/、http://www.genome.jp/dbget-bin/www_bget?pfam+XFP)。ラクトバチルスからのｘｐｋ１遺伝子は、配列番号７及び８で示されるプライマーを用いることによって得ることができる。ビフィドバクテリウムからのｘｆｐ遺伝子は、配列番号１１及び１２で示されるプライマーを用いることによって得ることができる。ラクトバチルスからのｘｐｋＡ遺伝子は、配列番号１９及び２４で示されるプライマーを用いることによって得ることができる。

ホスホケトラーゼの活性は、ホスホケトラーゼをコードするＤＮＡで親株を形質転換することにより増強され得る。ホスホケトラーゼをコードするＤＮＡによる細菌の形質転換は、上記のようなホスホケトラーゼをコードするＤＮＡを用いて慣用的方法により実施され得る。

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼをコードするＤＮＡは、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼの誘導体をコードするＤＮＡであってもよく、これは天然多様性によって、細菌の異なる株に見出され得る。このような誘導体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｘｐｋＡ遺伝子（例えば配列番号１又は３）又はその一部とハイブリダイズするとともに、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得られる。「ストリンジェントな条件」という用語は、本明細書中で用いる場合、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、そして非特異的ハイブリッドが形成されない条件を含む。例えばストリンジェントな条件は、高相同性を有するＤＮＡ、例えば互いに７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件を含み得る。或いはストリンジェントな条件は、サザンハイブリダイゼーションにおける通常の洗浄条件、例えば６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む条件により例示される。洗浄の持続時間は、ブロッティングのために用いられる膜の型に依存し、一般に、メーカーにより推奨される。例えばストリンジェントな条件下でのハイボンド（商標）Ｎ＋ナイロン膜（Amersham）の洗浄の推奨持続時間は、１５分である。誘導体ｘｐｋＡ遺伝子をスクリーニングするためのプローブとして、表１に開示された塩基配列の部分配列が用いられ得る。このようなプローブは、プライマーとして表１に開示された塩基配列に基づいたオリゴヌクレオチドを、並びに鋳型として表１に開示された塩基配列を含有するＤＮＡ断片を用いるＰＣＲにより調製され得る。約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡ断片がプローブとして用いられる場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、以下の条件下で実施され得る：５０℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで少なくとも２回。

フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼをコードするＤＮＡは、プローブとして表２に開示された塩基配列を用いて上記と類似の手法により得られる。

同義コドンの多少の分布の偏りがｍＲＮＡ分子の集団内に見出される６１個のアミノ酸コドンの間に存在し、そして同種ｔＲＮＡのレベルはコドンの使用頻度に直接比例すると考えられるということが知られている（例えばKane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500 (1995)参照）。この見地から、余分量のまれなｔＲＮＡコドンを含有する豊富なｍＲＮＡ種を用いたときの翻訳の問題を予測することは容易である。このような状況は、例えばエシェリヒア・コリ宿主におけるクローン化異種遺伝子の転写の開始後に生じ得る。ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＧＡ又はＣＣＣコドンのクラスターは合成タンパク質の量及び質の両方を低減し得るということを近年の研究は示唆している。さらに、余分量のこれらのコドンのいずれかは、クラスターを伴わない場合でも、翻訳の問題を生じ得る、と考えられる。したがって当該タンパク質をコードする異種ＤＮＡが細菌に導入される場合、これらの翻訳問題を回避するために、より高頻度に用いられるコドンでまれなコドンを置き換えることが望ましい。１１，０００より多い生物体におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に示されている。

さらに、本発明のホスホケトラーゼをコードする遺伝子は、野生型遺伝子に限定されず、変異体又は表１及び表２で示される塩基配列での改変を有する人工的に改変された遺伝子であり得る。コードされるホスホケトラーゼタンパク質の機能が維持される限り、コードされるタンパク質は、表１及び表２で示されるアミノ酸配列中の１つ又は複数の位置での１つ又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、或いは挿入を含んでもよい。本明細書中で記載される「数個」というアミノ酸残基の数は、アミノ酸残基の三次元構造での位置又は種類によって異なるが、その数は、２〜２０、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５であり得る。このようなアミノ酸の置換は、機能的ニュートラルセンス(neutral sense)変異体を含み、好ましくは保存的置換である。芳香族アミノ酸の場合、保存的置換は、ｐｈｅ、ｔｒｐ、及びｔｙｒの間の置換を含む。疎水性アミノ酸の場合、保存的置換は、ｌｅｕ、ｉｌｅ、及びｖａｌの間の置換を含む。極性アミノ酸の場合、保存的置換は、ｇｌｎ及びａｓｎの間の置換を含む。塩基性アミノ酸の場合、保存的置換は、ａｒｇ、ｌｙｓ及びｈｉｓの間の置換を含む。酸性アミノ酸の場合、保存的置換は、ａｓｐ及びｇｌｕの間の置換を含む。ヒドロキシル基含有アミノ酸の場合、保存的置換は、ｓｅｒ及びｔｈｒの間の置換を含む。保存的置換としては、ａｌａからｓｅｒ又はｔｈｒへの置換、ａｒｇからｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換、ａｓｎからｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ又はａｓｐへの置換、ａｓｐからａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換、ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｇｌｎからａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換、ｇｌｕからｇｌｙ、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換、ｇｌｙからｐｒｏへの置換、ｈｉｓからａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ又はｔｙｒへの置換、ｉｌｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｅｕからｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｙｓからａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ又はａｒｇへの置換、ｍｅｔからｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｐｈｅからｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換、ｓｅｒからｔｈｒ又はａｌａへの置換、ｔｈｒからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｔｒｐからｐｈｅ又はｔｙｒへの置換、ｔｙｒからｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換、及び、ｖａｌからｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換が挙げられる。上記の１つ又は数個のアミノ酸のこのような置換、欠失、又は挿入を引き起こす変異体としてはまた、個体差及びホスホケトラーゼ遺伝子を保持する微生物の種の違いから生じる自然発生的な変異体も挙げられる（変異体又は誘導体）。置換される領域は、モチーフ及びＰｆａｍを用いてＰＫＴ中で保存的領域（モチーフ）を探すことによって、選択することができる。

このような遺伝子は、1つ又は複数の置換、欠失又は挿入が遺伝子によりコードされるタンパク質の特定部位に導入されるよう、例えば部位特異的変異誘発により、表１又は表２に示された塩基配列を改変することにより得ることができる。

さらにこのような遺伝子は、例えば下記のような慣用的変異誘発処理によっても得ることができる。変異誘発処理の例としては、表１又は表２に示された塩基配列、或いは配列番号１における塩基番号４９〜９４８の塩基配列を有する遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏでヒドロキシルアミンで処理すること、及び、当該遺伝子を保有するエシェリヒア属細菌のような細菌を、紫外線照射により、或いは典型的変異処理に用いられる変異誘発剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）又はＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）により処理することが挙げられる。

ホスホケトラーゼ遺伝子（以後、ｐｋｔ遺伝子（ｘｐｋ又はｘｆｐ遺伝子を含む）と呼ぶ）の発現は、例えば遺伝子組換え技術を用いて、細胞中のｐｋｔ遺伝子のコピー数を増大することにより増強され得る。例えば組換えＤＮＡは、ｐｋｔ遺伝子を含有する遺伝子断片を、宿主細菌中で複製し得るベクター、好ましくはマルチコピーベクターと結合し、そしてその結果生じるベクターを宿主細菌中に導入することにより調製され得る。

ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子が用いられる場合、それは、ビフィドバクテリウム・アニマリス（配列番号９又は１１）のｘｆｐ遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプライマー、例えば配列番号１３又は１４の塩基配列を各々有するプライマーを用いて、そして鋳型としてビフィドバクテリウム・アニマリスの染色体ＤＮＡを用いて、例えばＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得られる。他の微生物からのｐｋｔ遺伝子も用いることができ、そしてｐｋｔ遺伝子の配列又はその相同配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲにより、或いは表１又は表２に示されたこのような配列情報に基づいて調製されるオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションにより、それらの染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから得ることができる。ＤＮＡ供与体として用いられる染色体ＤＮＡは、例えばSaito and Miura（H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp. 97-98, Baifukan, 1992を参照）の方法により、微生物から調製され得る。

次にｐｋｔ遺伝子は、組換えＤＮＡを調製するために宿主細菌中で操作可能なベクターＤＮＡに結合される。好ましくは、宿主細菌中で自律的に複製可能なベクターが用いられる。

エシェリヒア・コリ中で自律的に複製可能なベクターの例として、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＡＣＹＣ１８４（ｐＨＳＧ及びｐＡＣＹＣは、Takara Bioから入手可能である）、ＲＳＦ１０１０、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９（ｐＭＷは、株式会社ニッポンジーン(Nippon Gene)から入手可能である）等が挙げられる。１１０５９、ＩＢＦ１０１、Ｍ１３ｍｐ９等のファージベクターも用いることができる。

コリネ型細菌中で自律的に複製可能なベクターの例として、ｐＡＭ３３０（ＥＰ００７７５４８Ｂ）、ｐＨＭ１５１９（ＥＰ００７８５３７）、ｐＧＡ１（ＥＰ１０９７７９９８）、及びｐＹＭ２（ＵＳ６，９０５，８１９）が挙げられる。

エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律的に複製可能ないわゆるシャトルベ
クター、例えば、ｐＶＫ９、ｐＶＫ７（ＵＳ２００３−０１７５９１２）、ｐＳＦＫ６（特開２０００−２６２２８８号公報）、及びｐＨＫ４（特開平５−００７４９１号公報）も用いることができる。

ｐＶＫ９は、ｐＨＫ４（特開平５−００７４９１号公報）からの複製起点を含むＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片を切り出し、ｐＨＳＧ２９９（Takara-Bioの製品）のＡｖａＩＩ部位にそれを導入することによって得られるエシェリヒア・コリ−コリネ型細菌シャトルベクターである。

ｐｋｔ遺伝子及び上記のベクターのいずれかを連結することにより組換えＤＮＡを調製するために、ベクター及びｐｋｔ遺伝子を含有する断片は、通常はＴ４ ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼを用いることにより連結される。

細菌中に上記のように調製された組換えＤＮＡを導入するために、これまで報告された任意の既知の形質転換方法が用いられ得る。例えば、エシェリヒア・コリに関して報告された、ＤＮＡの浸透性を増大するよう塩化カルシウムでレシピエント細胞を処理する方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）、及び、バチルス・ズブチリスに関して報告された、ＤＮＡを導入するために増殖中の細胞から調製されるコンピテント細胞を用いる方法（Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153
(1977)）が用いられ得る。これらの方法のほかに、バチルス・ズブチリス、放線菌及び酵母に適用可能であると報告された、プロトプラスト様又はスフェロプラスト様レシピエント細胞中に組換えＤＮＡを導入する方法（Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979)；Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978)；Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci., USA, 75, 1929 (1978)）が用いられ得る。さらにコリネ型細菌の形質転換も、電気パルス法により実施され得る（Sugimoto et al., 特開平２−２０７７９１号公報）。

ｐｋｔ遺伝子は、細菌の染色体ＤＮＡ中に当該遺伝子の単一コピー又は多コピーを組み込むことにより導入され得る。さらにｐｋｔ遺伝子のコピー数も、細菌の染色体ＤＮＡ中に遺伝子の多コピーを組み込むことにより増大され得る。細菌の染色体ＤＮＡ上にｐｋｔ遺伝子の１つ又は複数のコピーを組み込むために、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列をターゲッティングすることにより、相同組換えが実施され得る。トランスポゾンの末端の反復ＤＮＡ及び逆方向反復（inverted repeat）は、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列として用いられ得る。或いは特開平２−１０９９８５号公報に開示されたように、トランスポゾンにｐｋｔ遺伝子を組み入れて、そして遺伝子が染色体ＤＮＡ中に組み込まれるよう、それを転移させることもできる。さらに遺伝子発現の増強は、Ｍｕ組込みのような転位によっても実施され得る。例えば第一回目のＭｕ組込みは、遺伝子の３つまでのコピーの細菌染色体中への導入を可能にする。Ｍｕ、Ｔｎ１０及びＴｎ５のようなトランスポゾンが用いられ得る。染色体中へのｐｋｔ遺伝子の組込みは、ｐｋｔ遺伝子の部分配列を有するプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションにより確認され得る。

ｐｋｔ遺伝子の発現増強は、ＷＯ００／１８９３５に記載されたように、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のｐｋｔ遺伝子のプロモーターを含めた発現調節配列をより強力なものに置き換えること、ｐｋｔ遺伝子の発現を増大する調節因子を増幅すること、或いはｐｋｔ遺伝子の発現を低減する調節因子を欠失又は減じることによっても達成され得る。さらに、プロモーターをより強力にするためにｐｋｔ遺伝子のプロモーター領域中に数個のヌクレオチド置換を導入することも可能である。プロモーターの強度の評価方法及び強力なプロモーターの例は、Goldstein et al.（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）に開示されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）及び翻訳開始コドン間のスペーサー配列、特に開始コドンのすぐ上流の
数個のヌクレオチドは翻訳効率に大きな影響を及ぼすことが既知であるため、この配列を改変してもよい。ｐｋｔ遺伝子の発現調節配列は、プロモーター同定のためのベクター又はＧＥＮＥＴＹＸのような遺伝子分析ソフトウエアを用いて同定され得る。

このような強力なプロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｐ_Rプロモーター、λファージのｐ_Lプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が挙げられる。コリネバクテリウムのための強力なプロモーターの一例としては、ＰＳ２プロモーター（Appl Environ Microbiol. 2003 Jan; 69(1): 358-66；Mol Microbiol. 1993 Jul; 9(1): 97-109；ＷＯ９３／０３１５８）、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーターが挙げられる。プロモーター強度は、ＲＮＡ合成開始の反応の頻度として定義される。プロモーターの強度の評価方法は、例えばDeuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H.（Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J., 5, 2987-2994 (1986)）により記載されている。

ｐｋｔ遺伝子の発現は、プロモーターのこのような置換又は改変により増強される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いることによっても達成され得る。コリネ型細菌のための温度感受性プラスミドの例としては、ｐ４８Ｋ及びｐＳＦＫＴ２（特開２０００−２６２２８８号公報）、ｐＨＳＣ４（仏国特許公開公報第２６６７８７５号（１９９２年）及び特開５−７４９１号公報を参照）、ｐＢＳ５Ｔ等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌においては少なくとも２５℃の温度で自律的に複製するが、３７℃の温度では自律的に複製し得ない。発現調節配列の改変は、ｐｋｔ遺伝子のコピー数の増大と組み合わせてもよい。

相同的組換えのマーカーとしてコリネバクテリウムにとって致死的であるレバンシュークラーゼを用いる方法も適切である。レバンシュークラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子は、ベクターが染色体から欠失された株を選択するために有効に用いられる（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）。下記のｓａｃＢ遺伝子及びｓａｃＢの相同遺伝子が用いられ得る。
バチルス・スブチリス：ｓａｃＢ、GenBankアクセス番号Ｘ０２７３０（配列番号４０）
バチルス・アミロリクファシエンス：ｓａｃＢ、GenBankアクセス番号Ｘ５２９８８
ザイモモナス・モビリス：ｓａｃＢ、GenBankアクセス番号Ｌ３３４０２
バチルス・ステアロサーモフィルス：ｓｕｒＢ、GenBankアクセス番号Ｕ３４８７４
ラクトバチルス・サンフランシセンシス：ｆｒｆＡ、GenBankアクセス番号ＡＪ５０８３９１
アセトバクター・キシリヌス：ｌｓｘＡ、GenBankアクセス番号ＡＢ０３４１５２
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス：ｌｓｄＡ、GenBankアクセス番号Ｌ４１７３２

プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及び結合、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等は、当業者に既知の通常方法により実施され得る。このような方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。

本発明の細菌は、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性を本来的に有さない細菌だけでなく、これらのタンパク質の活性を本来的に有し、それらの活性が増強されるよう改変された細菌も含む。前者
が好ましくは用いられる。

本発明で用いられる細菌の具体例としては、エシェリヒア属細菌やパントエア属細菌などの腸内細菌科属細菌、コリネバクテリウム・グルタミカムなどのコリネ型細菌、バチルス・ズブチリスなどのバチルス属細菌等が挙げられる。しかしながら本発明の細菌はこれらの例に限定されない。

腸内細菌科属細菌としては、エンテロバクター属、エルビニア属、エシェリヒア属、クレブシエラ属、パントエア属、プロビデンシア属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、モルガネラ属等に属する細菌が挙げられる。特にＮＣＢＩ（アメリカ国立バイオテクノロジー情報センター）データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&1v1=3&keep=1&srchmode=1&unlock）で用いられる分類学に従って腸内細菌科属細菌に分類されるものが用いられ得る。エシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌が好ましい。

Neidhardt他（Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Table 1）で報告されたエシェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリが利用され得る。エシェリヒア・コリの野生型株の例としては、Ｋ１２株及びその誘導体、ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ番号４７０７６）及びＷ３１１０株（ＡＴＣＣ番号２７３２５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの株は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、住所：アメリカ合衆国ＶＡ２０１０８マナサス私書箱１５４９）から入手可能である。

「パントエア属に属する細菌」という用語は、細菌が、微生物業界の当業者に既知の分類によりパントエア属として分類される、ということを意味し、１６ＳｒＲＮＡ等の塩基配列分析に基づいてパントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス，パントエア・ステワルティイ等に近年再分類されたエンテロバクター・アグロメランスの幾つかの種も含む。

本発明において、コリネ型細菌としては、微生物業界の当業者に既知の分類によりコリネ型細菌として分類される細菌、今までブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在はコリネバクテリウム属に再分類されている細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1991)）、そしてコリネバクテリウム属に近い類縁菌であるブレビバクテリウム属に属する細菌も挙げられる。このようなコリネ型細菌の例を以下に列挙する。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
特に、以下の菌株を包含する。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７、ＡＪ１２４１８（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２０５）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ＡＴＣＣ１３８６９
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス ＡＴＣＣ６８７１、ＡＴＣＣ６８７２
ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４

これらの株は、例えばAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、住所：アメリカ合衆国ＶＡ２０１０８マナサス私書箱１５４９）から入手可能である。各菌株は登録番号を割り当てられ、そしてその登録番号により各菌株の提供を依頼することができる。各菌株に関する登録番号は、American Type Culture Collectionのカタログに示される。ＡＪ１２３４０株は、ブダペスト条約の条項下で、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−５４６６日本国茨城県つくば市東１丁目１−１つくば中央第６））で、１９８７年１０月２７日に寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９の寄託番号を付与された。ＡＪ１２４１８株は、１９８９年１月５日に、ブダペスト条約の条項下で、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、ＦＥＲＭ ＢＰ−２２０５の寄託番号を付与された。

「バチルス属細菌」という用語は、微生物業界の当業者に既知の分類によりバチルス属として分類される細菌を意味する。本発明において、バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス１６８マールブルグ株（ＡＴＣＣ６０５１）、バチルス・ズブチリスＰＹ７９株（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が挙げられるが、これらに限定されず、そして、バチルス・アミロリクファシエンスとしては、バチルス・アミロリクファシエンスＴ株（ＡＴＣＣ２３８４２）、バチルス・アミロリクファシエンスＮ株（ＡＴＣＣ２３８４５）等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の細菌は、有用な代謝産物を生産する能力をすでに有する細菌中に上記のＤＮＡ（ｐｋｔ遺伝子）を導入することにより得ることができる。或いは本発明の細菌は、ｐｋ
ｔ遺伝子が導入されている細菌に対して有用な代謝産物を生産する能力を付与することにより得ることができる。後者の場合、ｐｋｔ遺伝子の導入及び有用な代謝産物を生産する能力の付与は、任意の順序で実施され得る。

「有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌」という語句は、本発明の細菌が培地中で培養される場合、有用な代謝産物を生産し、培地中にそれを蓄積させる能力を有する細菌を意味する。代謝産物を生産する能力は、変異誘発処理及び遺伝子改変を含む品種改良により、付与され又は増強され得る。「細菌が有用な代謝産物を生産する能力を有する」という語句は、細菌が、野生株又は非改変株より多い量で代謝産物を生産し、培地中に代謝産物を蓄積させ得る、ということを意味する。「細菌が有用な代謝産物を生産する能力を有する」という語句は、本明細書中で用いる場合、０．５ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の目的代謝産物の量を生産し、培地中に蓄積し得る細菌も意味する。

「有用な代謝産物」とは、Ｌ−アミノ酸、有機酸、ビタミン、サッカリド並びに／又はエムデン・マイエルホーフ経路、ペントースリン酸（ペントース−Ｐ）経路、エントナー・ドゥードロフ経路、クエン酸回路、及びアミノ酸生合成の中間体等の主な代謝産物を意味する。本発明で生産されるＬ−アミノ酸は特に限定されないが、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、及びＬ−アスパラギンが挙げられる。さらに好ましくは、本発明の細菌は、アセチル−ＣｏＡ由来の代謝産物を生産する能力を有する細菌である。このような代謝産物は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−システイン、コハク酸塩、及びポリヒドロキシブチレートからなる群から選択される。

以下に、有用な代謝産物を生産する能力を付与された菌株の例、及びこのような能力を付与する方法を、詳細に説明する。

以下に、上記のような親株に有用な代謝産物を生産する能力を付与する方法を説明する。

有用な代謝産物を生産する能力を付与するために、エシェリヒア属細菌又はコリネ型細菌等の有用代謝産物生産細菌を品種改良するために慣用的に用いられる方法が用いられ得る。例えば栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は有用代謝産物を生産する能力を有する代謝調節変異株の取得方法、及び有用代謝産物生合成酵素の活性が増強した組換え株の作製方法が用いられ得る（"Amino Acid Fermentation", the Japan Scientific Societies Press [Gakkai Shuppan Center], 1^st Edition, published on May 30, 1986, pp.77-100）。これらの方法を用いて有用代謝産物生産細菌を品種改良する場合、栄養要求性、アナログ耐性及び代謝調節変異等の1つ又は複数の特性が付与され得る。

組換え株が作製される場合、単一の又は多数の有用代謝産物生合成酵素の活性が増強され得る。さらに、栄養要求性、アナログ耐性及び代謝調節変異の特性を付与する方法は、有用代謝産物生合成酵素の活性の増強方法と組み合わされ得る。

有用代謝産物生産能力を有する、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸などの有用代謝産物アナログ耐性菌、又は代謝調節変異株は、親株又は野生株をＸ線又は紫外線照射、変異誘発剤、例えばＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による処理などの典型的変異誘発処理に付すことにより取得される。次に、有用代謝産物を生産する
能力を有する、栄養要求性株、アナログ耐性株又は代謝調節変異株が、変異株から選択される。

上記の細菌にＬ−グルタミン酸生産能を細菌に付与する方法は、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大及び／又は過剰発現するように改変することを含む。Ｌ−グルタミン酸生合成酵素の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＤＨ」とも示す）、グルタミンシンセターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以下、「ＣＳ」とも示す）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」とも示す）、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース−２−リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素のうち、ＣＳ、ＰＥＰＣ、及びＧＤＨの１つ又は複数の活性が増大することが好ましく、これらの酵素の３つ全ての活性を増強させることがより好ましい。

上記のような方法により、ＣＳ遺伝子、ＰＥＰＣ遺伝子及び／又はＧＤＨ遺伝子の発現が増強されるように改変された細菌の例としては、ＵＳ６，１９７，５５９、ＵＳ６，３３１，４１９及び欧州特許公開公報第０９９９２８２号及び第１０７８９８９号に開示された細菌が挙げられる。

Ｌ−グルタミン酸生産能を付与するための細菌の改変は、Ｌ−グルタミン酸生合成経路から分岐し、Ｌ−グルタミン酸以外の化合物を生産する反応を触媒する酵素の活性を低減させるか又は不活性化させることにより実施され得る。Ｌ−グルタミン酸生合成経路から分岐する反応を触媒し、Ｌ−グルタミン酸以外の化合物を生産する酵素の例としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。これらの酵素に関して、２−オキソグルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性を低減させるか又は消失させることが好ましい。

上記の酵素の活性を低減するか又は不活性化するために、酵素の細胞内活性を低減するか又は不活性化するための変異が、通常の変異誘発処理又は遺伝子工学処理により導入され得る。変異誘発処理の例としては、Ｘ線又は紫外線照射、変異誘発剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによる処理等が挙げられる。酵素の細胞内活性を低減させるか又は消失させるための方法の例としては、細胞内活性が非変異株と比較して低減されるか又は消失されるよう、微生物の細胞中の酵素をコードする遺伝子を変異導入するか又は欠失させることが挙げられる。遺伝子を変異させるか又は欠失するための方法の例としては、プロモーター及びシャイン・ダルガルノ（ＳＤ）配列などの発現調節配列の改変、オープンリーディングフレーム中へのミスセンス変異、ナンセンス変異又はフレームシフト変異の導入、並びに遺伝子の一部分の欠失が挙げられる（J Biol Chem. 1997, 272 (13): 8611-7）。変異遺伝子は、染色体上の野生型遺伝子が変異遺伝子に置き換えられる相同組換え法を用いることにより、或いはトランスポゾン又はＩＳ因子を用いることにより、微生物中に導入され得る。相同組換え法としては、線状ＤＮＡ、温度感受性プラスミド及び非複製プラスミドを用いる方法が挙げられる。これらの方法は、Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6; 97(12): 6640-5、米国特許第６３０３３８３号、特開平０５−００７４９１号公報等に記載されている。

標的酵素の細胞内活性及び活性の減少の程度は、候補菌株から得られる細胞抽出物又はその精製分画を用いて酵素活性を測定し、それを野生株又は非改変株の活性と比較するこ
とにより確認され得る。例えば２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性は、Reed他（Reed L.J. and Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, pp.55-61, 1969）の方法により測定され得る。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損するか又はα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低減したエシェリヒア属細菌の例、及びそれらの取得方法は、米国特許第５，３７８，６１６号及び第５，５７３，９４５号に記載されている。具体的には、これらの菌株としては以下のものが挙げられる：
エシェリヒア・コリ Ｗ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍｒ
エシェリヒア・コリ ＡＪ１２６２４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５３）
エシェリヒア・コリ ＡＪ１２６２８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８５４）
エシェリヒア・コリ ＡＪ１２９４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−４８８１）

エシェリヒア・コリＷ３１１０ｓｕｃＡ：：Ｋｍ^rは、エシェリヒア・コリＷ３１１０中のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（以後、「ｓｕｃＡ遺伝子」と呼ぶ）を破壊することにより得られた。この菌株は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼを完全に欠いている。

相同的再組換えを用いてｓｕｃＡ遺伝子が破壊されたコリネ型細菌は、ＷＯ９５／３４６７２及び米国特許第５，９７７，３３１号に詳細に説明されている。

Ｌ−グルタミン酸生産細菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン代謝拮抗剤に対する耐性を有するものが挙げられる。これらの菌株は、アルファ−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性も欠くことがあり、例としては、例えばＡＦ１３１９９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５８０７）（米国特許第５，９０８，７６８号）又はＦＦＲＭ Ｐ−１２３７９株（これはさらにＬ−グルタミン酸分解能が低下するように改変されている）（米国特許第５，３９３，６７１号）；エシェリヒア・コリＡＪ１３１３８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５６５）（米国特許第６，１１０，７１４号）等が挙げられる。

パントエア属に属するＬ−グルタミン酸生産細菌の例としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く、或いはα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低減した変異株が挙げられ、そしてこれらは上記のようにして得られる。このような菌株としては、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６又はＡＪ１３６０１（米国特許第６，３３１，４１９号）が挙げられる。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１−１つくば中央第６））に、１９９８年２月１９日に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−１６６４５の寄託番号を付与された。次にそれは、１９９９年１月１１日にブダペスト条約の条項下で国際寄託に移管されて、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１５の寄託番号を付与された。パントエア・アナナティスＡＪ１３６０１は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１−１つくば中央第６））に、１９９９年８月１８日に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−１７５１６の寄託番号を付与された。次にそれは、２０００年７月６日にブダペスト条約の条項下で国際寄託に移管されて、ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７の寄託番号を付与された。パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６及びＡＪ１３６０１は、αＫＧＤＨのＥ１サブユニットをコードする遺伝子（ｓｕｃＡ遺伝子）の破壊の結果としてα−ＫＧＤＨ活性を欠いている。上記菌株は、それらが単離されたときは、エンテロバクター・アグロメランスとして同定され、それぞれエンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５６株及びＡＪ１３６０１株として寄託された。しかしながらそれらは近年、１６ＳｒＲＮＡ等の塩基配列に基づいて、パントエア・アナナティスとして再分類された。ＡＪ１３３５６、ＡＪ１３６０１及びそれらの親株ＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６１４）はすべてエンテロバクター・アグロメランスとして上記の受託機関に寄託されたが、し
かしそれらは本明細書の目的のためにパントエア・アナナティスとして記載される。

Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌のさらなる例としては、有機酸アナログ耐性変異株及びエスクレチン耐性変異株が挙げられる（特開昭５６−１８８９号公報、特開昭５６−１４０８９５号公報、特開昭５７−０２６８９号公報、ＪＰ８８９９４Ａ）。

アナログ耐性Ｌ−グルタミン酸生産コリネ型細菌の例として、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１１３５５（ＦＥＲＭ Ｐ−５００７、特開昭５６−１８８９号公報）
ブレビバクテリウム・グルタミカム ＡＪ１１３６８（ＦＥＲＭ Ｐ−５０２０、特開昭５６−１８８９号公報）
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１１２１７（ＦＥＲＭ Ｐ−４３１８、特開昭５７−２６８９号公報）
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１１２１８（ＦＥＲＭ Ｐ−４３１９、特開昭５７−２６８９号公報）
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１１５６４（ＦＥＲＭ Ｐ−５４７２、特開昭５６−１４０８９５号公報）
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１１４３９（ＦＥＲＭ Ｐ−５３１６、特開昭５６−３５９８１号公報）
コリネバクテリウム・グルタミカム Ｈ７６８４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３００４、特開昭５６−１５１４９５号公報）

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性増大を有するために改変される親株として用いられるＬ−グルタミン生産細菌の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性、およびグルタミンシンターゼ活性の増強を示すよう（ＥＰ １２２９１２１Ａ）、或いはグルタミナーゼ活性が低減するよう（ＥＰ１４２４３９７Ａ）改変されたＬ−グルタミン生産コリネ型細菌が挙げられる。また、野生型グルタミンシンターゼにおける３９７位に対応するチロシン残基が任意のアミノ酸残基で置換された変異体グルタミンシンセターゼを保有するエシェリヒア属細菌が用いられ得る。

６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン耐性（特開平３−２３２４９７号公報）、プリンアナログ耐性、メチオニンスルホキシド耐性（特開昭６１−２０２６９４号公報）、α−ケトマロン酸耐性（特開昭５６−１５１４９５号公報）を付与する方法は、育種によりＬ−グルタミン生産能を付与するか又は増強するために用いられ得る。Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１１５７３（ＦＥＲＭ Ｐ−５４９２、特開昭５６−１６１４９５号公報）
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１１５７６（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３８１、特開昭５６−１６１４９５号公報）
ブレビバクテリウム・フラバム ＡＪ１２２１２（ＦＥＲＭ Ｐ−８１２３、特開昭６１−２０２６９４号公報）

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変される親株として有用なＬ−プロリン生産菌の例としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害に脱感作されたγ−グルタミルキナーゼを保有する及び／又はＬ−プロリン分解系が破壊されたエシェリヒア属に属するＬ−プロリン生産菌が挙げられる。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害に脱感作され
たγ−グルタミルキナーゼを有する細菌の育種方法は、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害に脱感作されたγ−グルタミルキナーゼをコードするＤＮＡを細胞中に導入する方法が例示される（Dandekar, A.M., Uratsu, S.L., J. Bacteriol., 170, 12, 5943-5 (1988)）。Ｌ−プロリン分解系を破壊する方法は、活性プロリンデヒドロゲナーゼが発現しないよう、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に変異を導入する方法が例示される。さらにまた、Ｌ−プロリン分解系が破壊された細菌は、Ｌ−プロリン−資化能を欠く株を得て、そしてＬ−プロリン栄養要求性を指標にすることにより細胞外にＬ−プロリンを過剰生産する株を選択することにより取得され得る。エシェリヒア属に属するＬ−プロリン生産菌としては、エシェリヒア・コリＮＲＲＬ Ｂ−１２４０３株及びＮＲＲＬ Ｂ−１２４０４株（英国特許第２０７５０５６号）、ＶＫＰＭ Ｂ−８０１２（米国特許公開２００２−００５８３１５号）が挙げられ、そして西独国特許第３１２７３６１号に記載されたプラスミド変異体、Bloom F.R.他（The 15^th Miami winter symposium, 1983, p. 34）により記載されたプラスミド変異体等がこのような菌株を取得するために用いられ得る。

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変される親株として用いられるＬ−アルギニン生産菌の例としては、変異Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼを有するエシェリヒア属に属するＬ−アルギニン生産細菌、例えばエシェリヒア・コリ２３７株（ＶＫＰＭ Ｂ−７９２５）及びその誘導株（米国特許公開公報２００２−００３４７９３号）、Ｎ−アセチルグルタメートシンターゼをコードするａｒｇＡ遺伝子が導入されたアルギニン生産株（特開昭５７−５６９３号公報）等が挙げられる。

Ｌ−アルギニン生産細菌の別の例としては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（ａｒｇＡ）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸還元酵素（ａｒｇＣ）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＪ）、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ（ａｒｇＢ）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（ａｒｇＤ）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（ａｒｇＥ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ａｒｇＦ）、アルギニノスクシネートシンターゼ（ａｒｇＧ）、アルギニノスクシネートリアーゼ（ａｒｇＨ）、及びカルバモイル−リン酸シンターゼ（ｃａｒＡＢ）等のＬ−アルギニン生合成酵素をコードする複製遺伝子を有する菌株である。これらの酵素をコードする遺伝子の名称は、それぞれ、酵素の名称の後の括弧内に示される。

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変される親株として用いられるＬ−ロイシン生産菌の例としては、エシェリヒア属に属するＬ−ロイシン生産細菌、例えば４−アザロイシン又は５，５，５−トリフルオロロイシンに耐性であるエシェリヒア・コリＨ−９０６８株（ＡＴＣＣ２１５３０）、Ｈ−９０７０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７０４）及びＨ−９０７２株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７０６）（米国特許第５，７４４，３３１号）、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が脱感作されたイソプロピルマレートシンターゼを保持するエシェリヒア・コリ株（ＥＰ１０６７１９１Ｂ）、β−２−チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性であるエシェリヒア・コリＡＪ１１４７８株（米国特許第５，７６３，２３１号）、エシェリヒア・コリ５７株（ＶＫＰＭ Ｂ−７３８６、ロシア特許第２１４０４５０号）等が挙げられる。

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変される親株として用いられるＬ−システイン生産菌の例としては、エシェリヒア属に属するＬ−システイン生産細菌、例えばフィードバック耐性セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるｃｙｓＥ対立遺伝子で形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１５株（米国特許第６，２１８，１６８号）；細胞毒性物質を分泌するのに適したタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するエシェ
リヒア・コリＷ３１１０株（米国特許第５，９７２，６６３号）；システインデスルホヒドラーゼ活性が低下したエシェリヒア・コリ株（特開平１１−１５５５７１号公報）；ｃｙｓＢ遺伝子によりコードされるシステインレギュロンに関する正の転写レギュレーターの活性が増大されたエシェリヒア・コリＷ３１１０株（ＷＯ０１／２７３０７Ａ１）等が挙げられる。

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変される親株として用いられるコハク酸生産菌の例としては、エシェリヒア属に属するコハク酸生産細菌、並びにコリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３Δ１ｄｈ株（特開平１１−２０６３８５号公報）及びブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ｐＰＣＰＹＣ株（ＷＯ０１／２７２５８）が挙げられる。

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変される親株として用いることができるＬ−リジン生産菌の例としては、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタムＡＪ１１０８２（ＮＲＲＬ Ｂ−１１４７０）のＳ−（２−アミノエチル）システイン（以下、「ＡＥＣ」）耐性変異株（特公昭５６−１９１４号公報、特公昭５６−１９１５号公報、特公昭５７−１４１５７号公報、特公昭５７−１４１５８号公報、特公昭５７−３０４７４号公報、特公昭５８−１００７５号公報、特公昭５９−４９９３号公報、特公昭６１−３５８４０号公報、特公昭６２−２４０７４号公報、特公昭６２−３６６７３号公報、特公平５−１１９５８号公報、特公平７−１１２４３７号公報及び特公平７−１１２４３８号公報に記載）、Ｌ−ホモセリン等のアミノ酸に対して栄養要求性である変異株（特公昭４８−２８０７８号公報及び特公昭５６−６４９９号公報）、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、及びＬ−バリン等のアミノ酸に対して栄養要求性であり、且つＡＥＣに耐性の変異株（米国特許第３，７０８，３９５号及び同第３，８２５，４７２号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸類似体、サルファ剤、キノイド、並びにＮ−ラウロイルロイシンに耐性のＬ−リジン生産変異株、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ阻害剤又は呼吸鎖酵素阻害剤に耐性のＬ−リジン生産変異株（特開昭５０−５３５８８号公報、特開昭５０−３１０９３号公報、特開昭５２−１０２４９８号公報、特開昭５３−９３９４号公報、特開昭５３−８６０８９号公報、特開昭５５−９７８３号公報、特開昭５５−９７５９号公報、特開昭５６−３２９９５号公報、特開昭５６−３９７７８号公報、特公昭５３−４３５９１号公報及び特公昭５３−１８３３号公報）、イノシトール又は酢酸に対して栄養要求性であるＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８４号公報及び特開昭５６−８６９２号公報）、３４℃より高い温度で、フルオロピルビン酸に感受性のＬ−リジン生産変異株（特開昭５５−９７８３号公報及び特開昭５３−８６０９０号公報）、エチレングリコール耐性ブレビバクテリウム細菌又はコリネバクテリウム細菌のＬ−リジン生産変異株（米国特許番号第４，４１１，９９７号）等が挙げられる。

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変される親株として用いられるＬ−リジン生産細菌のさらなる例としては、エシェリヒア・コリＷＣ１９６（ＷＯ９６／１７９３０）のＳ−（２−アミノエチル）システイン（以後、「ＡＥＣ」）耐性変異株が挙げられる。ＷＣ１９６株はエシェリヒア・コリＡＪ１３０６９と呼ばれ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１−１つくば中央第６））で、１９９４年１２月６日に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−１４６９０の寄託番号を付与された。次に当該寄託物は、１９９５年９月２９日に、ブダペスト条約の条項下で国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ−５２５２の寄託番号を付与された。

Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物の例としては、６−ジメチルアミノプリン耐性変異体（特開平５−３０４９６９号公報）、酵素活性を増強する変異を有するスレオニン生合成酵素に関する遺伝子がプラスミドで増幅された株（特公平１−２９５５９号公報、特開平０５−２２７９７７号公報）、スレオニンオペロンがプラスミドで増幅された株（特開平２−１０９９８５号公報）、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子及びニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が増幅された株（特開２００２−５１７８７号公報）等が挙げられる。

エシェリヒア・コリＶＫＰＭ Ｂ−３９９６株（米国特許第５，１７５，１０７号）もＬ−スレオニン生産株として用いられ得る。ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６は、１９８７年１１月１９日に、ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６の登録番号で、ロシア国立微生物受託機関（ＶＫＰＭ）、GNII Genetikaに寄託された。ＶＫＰＭ Ｂ−３９９６株はプラスミドｐＶＩＣ４０を保有し（ＷＯ９０／０４６３６）、これはストレプトマイシン耐性マーカー遺伝子を有するプラスミドｐＡＹＣ３２にスレオニンオペロン（ｔｈｒＡＢＣ）を挿入することにより得られる（Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, 16, 161-167）。ｐＶＩＣ４０中に含有される変異ｔｈｒＡ遺伝子によりコードされるアスパルトキナーゼＩ−ホモセリンデヒドロゲナーゼＩは、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害が解除されている。

エシェリヒア・コリＶＫＰＭ Ｂ−５３１８株（ＥＰ ０５９３７９２Ｂ）もＬ−スレオニン生産株として用いられ得る。ＶＫＰＭ Ｂ−５３１８は、１９８７年１１月１９日に、ＶＫＰＭ Ｂ−５３１８の登録番号で、ロシア国立微生物受託機関（ＶＫＰＭ）に寄託された。ＶＫＰＭ Ｂ−５３１８はＬ−イソロイシンに対して栄養要求性であり、スレオニン生合成酵素をコードするスレオニンオペロンはλファージ由来のＣ１温度感受性レプレッサー、ＰＲ−プロモーター及びＣｒｏタンパク質のＮ末端の下流に位置する。さらにこの菌株は、スレオニン生合成遺伝子の発現がλファージからのプロモーター及びレプレッサーにより調節されるよう構築されたプラスミドＤＮＡを含有する。

さらにエシェリヒア・コリＭＧ４４２株（米国特許第４，２７８，７６５号）も、Ｌ−スレオニン生産株として用いられ得る。ＭＧ４４２株は、ＣＭＩＭＢ−１６２８としてロシア国立微生物受託機関（ＶＫＰＭ）に寄託された。

Ｌ−フェニルアラニン生産能を有するエシェリヒア属細菌の例としては、ｔｙｒＡ遺伝子及びｔｙｒＲ遺伝子が破壊されたエシェリヒア・コリＡＪ１２７３９（ｔｙｒＡ：：Ｔｎ１０、ＴｙｒＲ；ＶＫＰＭ Ｂ−８１９７）、変異ｐｈｅＡが導入されたエシェリヒア・コリＨＷ１０８９（米国特許第５，３５４，６７２号）、及びｙｄｄＧ遺伝子及びｙｅｄＡ遺伝子が増幅されたエシェリヒア・コリ株（ＷＯ０３／０４４１９２）が挙げられる。Ｌ−フェニルアラニンを生産能を有するコリネ型細菌の例としては、チロシンに対して栄養要求性であり、そしてＬ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシンに耐性である株が挙げられる（特開平５−４９４８９号公報）。

Ｌ−トリプトファン生産能を有する細菌は、Ｌ−トリプトファン生合成酵素、例えばホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ及びアントラニレートシンターゼの活性を増強することにより取得され得る。これらの酵素は、Ｌ−トリプトファン又はＬ−セリンによるフィードバック阻害に耐性であってもよい。例えば、これらのフィードバック耐性酵素を有する細菌は、Ｌ−セリン耐性アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を保有するエシェリヒア・コリＳＶ１６４株中にＬ−トリプトファン耐性ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異ｓｅｒＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＧＨ５を導入することにより取得され得る（ＷＯ９４／０８０３１）。

Ｌ−トリプトファン生産能を有する細菌は、トリプトファンオペロンによりコードされるＬ−トリプトファン生合成酵素の活性を増強することによっても取得され得る。Ｌ−トリプトファンオペロンにおけるこのような酵素としては、トリプトファンシンターゼ及びアントラニレートシンターゼが挙げられる。これらの細菌の例としては、Ｌ−セリン耐性アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含有するトリプトファンオペロンが導入されたエシェリヒア・コリ株が挙げられる（特開昭５７−７１３９７号公報、特開昭６２−２４４３８２号公報及び米国特許第４，３７１，６１４号）。

さらに、Ｌ−トリプトファン生産能を有する細菌の例としては、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンに対して栄養要求性であるエシェリヒア・コリＡＧＸ１７（ｐＧＸ４４）［ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６３］、並びにトリプトファンオペロンを含有するプラスミドｐＧＸ５０を保有するＡＧＸ６（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ［ＮＲＲＬ Ｂ−１２２６４］が挙げられる（米国特許第４，３７１，６１４号）。

Ｌ−イソロイシン生産能を有するエシェリヒア属細菌の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性である変異株（特開平５−３０４９６９号公報）、Ｌ−イソロイシンヒドロキサメート、チアイソロイシン、ＤＬ−エチオニン又はアルギニンヒドロキサメートに耐性である変異株（特開平５−１３０８８２号公報）、並びにスレオニンデアミナーゼ及びアセトヒドロキシル酸シンターゼをコードする遺伝子がプラスミドで増幅された組換え株が挙げられる（特開平２−４５８号公報、特開平２−４２９８８号公報及び特開平８−４７３９７号公報）。

Ｌ−バリン生産能を有する細菌は、Ｌ−バリン生合成酵素、例えばｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンによりコードされるもの、特にｉｌｖＧ遺伝子によりコードされるアセトヒドロキシレートシンターゼの活性を増強することにより取得され得る（特公平０２−７４８４１８号公報）。これらの酵素は、Ｌ−バリンによるフィードバック阻害に耐性であってもよい。

Ｌ−バリン生産能を有する細菌としては、アセトラクテートシンターゼＩＩＩ遺伝子（ｉｌｖＩＨ遺伝子）の発現が低減されたものが挙げられる。

Ｌ−バリン生産能を有する細菌は、アミノ酸アナログに耐性であり得る。このような細菌の例としては、Ｌ−イソロイシン及びＬ−メチオニンに対して栄養要求性であり、そしてＤ−リボース、プリンヌクレオシド又はピリミジンリボヌクレオシドに耐性である変異株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８４１、Ｐ−５５５６；特開昭５３−０２５０３４号公報）、並びにポリケトノイドに耐性である変異株（ＦＥＲＭ Ｐ−９３２５；特公平０４−０４５３１４号公報）が挙げられる。

Ｌ−アラニン生産能を有する細菌の例としては、Ｈ⁺−ＡＴＰアーゼ活性を欠くコリネ型細菌株（Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov; 57(4): 534-40）、又はアスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ遺伝子が増幅されたコリネ型細菌株（特開平０７−１６３３８３号公報）が挙げられる。

本発明の細菌は、６−ホスホフルクトキナーゼの活性が低減するようにさらに改変されるのが好ましい。６−ホスホフルクトキナーゼ活性は、例えばDenise Kotlars and Henri
Buc（Methods in Enzymology (1982) 90: 60-70）により記載された方法により測定され得る。本発明の細菌中の６−ホスホフルクトキナーゼの活性は、野生株又は非改変株のものより低く、好ましくは野生株又は非改変株の９０％未満、さらに好ましくは７０％未満、最も好ましくは５０％未満に低減される。６−ホスホフルクトキナーゼの活性は、この
酵素をコードする遺伝子に変異導入するか又は破壊することにより低減され得るが、この場合、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低減するために用いられる方法と同様の方法を使用しうる。

本発明において、有用な代謝産物は、培地中で上記の細菌を培養し、培地及び／又は菌体中に有用な代謝産物を蓄積させて、培地及び／又は菌体から上記の有用な代謝産物を採取することにより、生産される。

培地からの有用な代謝産物の培養、採取及び精製は、有用な代謝産物が細菌を用いて生産される慣用的発酵方法にしたがって実施される。培地は、炭素源、窒素源および無機物を、そして必要な場合には、細菌が増殖のために必要とする適量の栄養素を含有する限り、合成培地と天然培地のいずれであってもよい。炭素源としては、種々の炭水化物、例えばグルコース及びスクロース、並びに種々の有機酸が挙げられる。選定細菌の資化様式によって、エタノール及びグリセロールなどのアルコールが用いられ得る。窒素源として、アンモニア、硫酸アンモニウム、アミンなどのその他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、及び消化発酵微生物などの天然窒素源が用いられ得る。無機物として、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が用いられ得る。本発明においては、培地中に塩酸チアミン（ビタミンＢ１）を添加するのがより望ましい。塩酸チアミンの濃度は、１０μｇ／Ｌより高く、好ましくは１０ｍｇ／Ｌより高く、さらに好ましくは１００ｍｇ／Ｌ未満である。

培養は、好ましくは振盪培養下のような好気性条件下、通気を伴う撹拌培養下で、２０℃〜４２℃、好ましくは３７℃〜４０℃の温度で実施される。培地のｐＨは、通常は５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基及び緩衝剤で調整され得る。通常は、液体培地中の標的有用代謝産物の蓄積のためには１〜５日培養で十分である。

培養後、細胞などの固体は、遠心分離又は膜濾過により液体培地から除去され、次に標的有用代謝産物が採取され、イオン交換、濃縮及び結晶化法等により精製され得る。

以下の非限定的な実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明する。
略語：Ｐｙｒ − ピルビン酸、ＰＥＰ − ホスホエノールピルビン酸、ＧＡ−３Ｐ − グルセルアルデヒド−３−リン酸、ＡｃｅＣｏＡ − アセチル−ＣｏＡ。
理論的重量収率（Ｙ）は、以下のように算定する：
Ｙ＝（生成物の分子量×モル）／（基質の分子量×モル）。
方程式は簡略化され、炭素化合物及びエネルギー分子のみを示す。

［実施例１］
ホスホケトラーゼ活性を有するか又は有さない細菌によるアセチル−ＣｏＡ生成の算定

１．ホスホケトラーゼ活性を包含しないアセチル−ＣｏＡ生合成経路の反応
解糖作用に続くＰＴＳシステムは、以下の式で与えられる。
グルコース ＝ ＰＥＰ ＋ Ｐｙｒ ＋ ＡＴＰ ＋ ２ＮＡＤＨ

ｐｐｃ遺伝子でコードされるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、以下の反応を触媒する。
ＰＥＰ ＋ ＣＯ₂ ＝ オキサロ酢酸

ｐｄｈ遺伝子でコードされるピルビン酸デヒドロゲナーゼは、以下の反応を触媒する。
Ｐｙｒ ＝ アセチル−ＣｏＡ ＋ ＣＯ₂ ＋ ＮＡＤＨ

そして、最終式は、
グルコース＝アセチル−ＣｏＡ＋オキサロ酢酸＋ＡＴＰ＋３ＮＡＤＨ （Ａ）
である。

２．ホスホケトラーゼ活性を包含するアセチル−ＣｏＡ生合成経路の反応

解糖作用に続くＰＴＳシステムは、以下の式によって与えられる。
グルコース ＋ ＰＥＰ ＝ フルクトース−６−リン酸 ＋ Ｐｙｒ

ホスホエノールピルビン酸シンターゼは、以下の反応を触媒する。
Ｐｙｒ ＋ ＡＴＰ ＝ ＰＥＰ

ｐｐｃ遺伝子でコードされるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、以下の反応を触媒する。
ＰＥＰ ＋ ＣＯ₂ ＝ オキサロ酢酸

フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ：
リン酸＋フルクトース−６−リン酸＝Ｈ₂Ｏ＋エリスロース−４−リン酸＋アセチルリン酸

トランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼ：
フルクトース−６−リン酸＋エリスロース−４−リン酸＝２キシルロース−５−リン酸

Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ：
リン酸＋キシルロース−５−リン酸＝グリセルアルデヒド−３−リン酸＋アセチルリン酸

解糖作用：
グリセルアルデヒド−３−リン酸 ＝ ＰＥＰ ＋ ２ＡＴＰ ＋ ２ＮＡＤＨ

ｐｔａ遺伝子でコードされるリン酸アセチルトランスフェラーゼ
アセチルリン酸 ＝ アセチル−ＣｏＡ

そして、最終式は、
２グルコース＋２ＣＯ₂＝３アセチル−ＣｏＡ＋２オキサロ酢酸＋ＮＡＤＨ （Ｂ）

方程式（Ａ）及び（Ｂ）の比較は、ホスホケトラーゼの活性を用いると、１分子のグルコースから１．５分子のアセチル−ＣｏＡが生じて、ホスホケトラーゼの活性を用いない場合にグルコース代謝で１分子のグルコースから１分子のアセチル−ＣｏＡが得られるのに対して１分子のＣＯ₂が節約される、ということを示す。

［実施例２］
ホスホケトラーゼ活性を有する又は有さない細菌を用いたＬ−グルタミン酸生産の理論的収率の算定
１．ＰＴＳ、解糖作用及びＴＣＡサイクルを包含するＬ−グルタミン酸生合成経路の反応

ＰＴＳ ＋ 解糖作用：
グルコース＝アセチル−ＣｏＡ＋オキサロ酢酸＋ＡＴＰ＋３ＮＡＤＨ （Ａ）

ＴＣＡ回路：
アセチル−ＣｏＡ＋オキサロ酢酸＝２−オキソグルタル酸＋ＮＡＤＰＨ＋ＣＯ₂

グルタミン酸デヒドロゲナーゼ：
２−オキソグルタル酸 ＋ ＮＨ₃ ＋ ＮＡＤＰＨ ＝ グルタミン酸

最終式：
グルコース ＝ グルタミン酸 ＋ ＡＴＰ ＋ ３ＮＡＤＨ ＋ ＣＯ₂ （Ｃ）

Ｌ−グルタミン酸の理論的収率は、８１．７％である。

２．解糖作用、非酸化型ＰＰＣ、及びＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼのみを伴うＬ−グルタミン酸生合成経路の反応

解糖作用及び非酸化型ＰＰＣ：
５グルコース ＋ ５ＰＥＰ ＝ ５フルクトース−６−リン酸 ＋ ５Ｐｙｒ、ここで
フルクトース−６−リン酸 ＋ ＡＴＰ ＝ ２ＧＡ−３Ｐ
２フルクトース−６−リン酸 ＋ ２ＧＡ−３Ｐ ＝ ２キシルロース−５−リン酸
＋ ２エリスロース−４−リン酸
２フルクトース−６−リン酸 ＋ ２エリスロース−４−リン酸 ＝ ４キシルロース−５−リン酸

要約した式：
５グルコース＋５ＰＥＰ＋ＡＴＰ＝６キシルロース−５−リン酸＋５Ｐｙｒ

その後、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ：
キシルロース−５−リン酸 ＋ リン酸 ＝ ＧＡ−３Ｐ ＋ アセチルリン酸

解糖作用及びリン酸アセチルトランスフェラーゼ：
ＧＡ−３Ｐ ＝ ＰＥＰ ＋ ＡＴＰ ＋ ＮＡＤＨ
アセチルリン酸 ＝ アセチル−ＣｏＡ

要約した式：
５グルコース＝６アセチル−ＣｏＡ＋ＰＥＰ＋５ＡＴＰ＋６ＮＡＤＨ＋５ＰＹＲ （１）
ホスホエノールピルビン酸シンターゼ
ＰＹＲ ＋ ２ＡＴＰ ＝ ＰＥＰ ＋ リン酸
（ＮＡＤＨ ＝ ２ＡＴＰと仮定する）

要約した式：
５グルコース ＝ ６アセチル−ＣｏＡ ＋ ６ＰＥＰ ＋ ７ＡＴＰ

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）：
ＰＥＰ ＋ ＣＯ₂ ＝ オキサロ酢酸

要約した式：
５グルコース＋６ＣＯ₂＝６アセチル−ＣｏＡ＋６オキサロ酢酸＋７ＡＴＰ （２）

ＴＣＡ回路：
オキサロ酢酸＋アセチル−ＣｏＡ＝オキソグルタル酸＋ＣＯ₂＋ＮＡＤＰＨ

要約した式：
５グルコース ＝ ６オキソグルタル酸 ＋ ６ＮＡＤＰＨ ＋ ７ＡＴＰ

グルタミン酸デヒドロゲナーゼ：
オキソグルタル酸 ＋ ＮＡＤＰＨ ＝ グルタミン酸

最終式：
５グルコース ＝ ６グルタミン酸 ＋ ７ＡＴＰ （Ｄ）
Ｌ−グルタミン酸の理論的収率は、９８％である。

３．解糖作用、非酸化型ＰＰＣ、２種のホスホケトラーゼ及びグリオキシル酸バイパスを伴うＬ−グルタミン酸生合成経路の反応

ＰＴＳ ＋ 解糖作用：
２グルコース ＋ ２ＰＥＰ ＝ ２フルクトース−６−リン酸 ＋ ２ＰＹＲ

フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ２：
フルクトース−６−リン酸＋リン酸＝エリスロース−４−リン酸＋アセチルリン酸

トランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼ：
フルクトース−６−リン酸＋エリスロース−４−リン酸＝２キシルロース−５−リン酸

キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ：
２キシルロース−５−リン酸＋２リン酸＝２ＧＡ−３Ｐ＋２アセチルリン酸

要約した式：
２グルコース＋２ＰＥＰ＝２ＧＡ−３Ｐ＋３アセチルリン酸＋２ＰＹＲ

解糖作用：
ＧＡ−３Ｐ ＝ ＰＥＰ ＋ ＡＴＰ ＋ ＮＡＤＨ

要約した式：
２グルコース＝３アセチルリン酸＋２ＰＹＲ＋２ＡＴＰ＋２ＮＡＤＨ （３）

ホスホエノールピルビン酸シンターゼ：
ＰＹＲ ＋ ２ＡＴＰ ＝ ＰＥＰ

リン酸アセチルトランスフェラーゼ：
アセチルリン酸 ＝ アセチル−ＣｏＡ

要約した式：
２グルコース ＝ ３アセチル−ＣｏＡ ＋ ２ＰＥＰ ＋ ＮＡＤＨ

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ：
ＰＥＰ ＋ ＣＯ₂ ＝ オキサロ酢酸

要約した式：
２グルコース＋２ＣＯ₂＝３アセチル−ＣｏＡ＋２オキサロ酢酸＋ＮＡＤＨ又は（４）
６グルコース＋６ＣＯ₂＝９アセチル−ＣｏＡ＋６オキサロ酢酸＋３ＮＡＤＨ

グリオキシル酸バイパス：
２アセチル−ＣｏＡ ＝ コハク酸 ＋ ＮＡＤＨ

ＴＣＡ回路：
コハク酸 ＝ オキサロ酢酸 ＋ ＡＴＰ ＋ ＮＡＤＨ

要約した式：
６グルコース＋６ＣＯ₂＝７アセチル−ＣｏＡ＋７オキサロ酢酸＋ＡＴＰ＋５ＮＡＤＨ

ＴＣＡ回路：
アセチル−ＣｏＡ＋オキサロ酢酸＝２−オキソグルタル酸＋ＮＡＤＰＨ＋ＣＯ₂

グルタミン酸デヒドロゲナーゼ：
２−オキソグルタル酸 ＋ ＮＨ₃ ＋ ＮＡＤＰＨ ＝ グルタミン酸

最終式：
６グルコース＝７グルタミン酸＋ＡＴＰ＋５ＮＡＤＨ＋ＣＯ₂ 又は
６グルコース ＝ ７グルタミン酸 ＋ １１ＡＴＰ ＋ＣＯ₂ （Ｅ）
Ｌ−グルタミン酸の理論的収率は、９５．３％である。

方程式（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）の比較は、ホスホケトラーゼの活性を用いると、Ｌ−グルタミン酸生合成の理論的収率が有意に増大し、そしてホスホケトラーゼを用いない場合にグルコース代謝で１分子のグルコースから１分子のＬ−グルタミン酸が得られるのに対して、利用されるグルコースの分子より１分子多いＬ−グルタミン酸を生じ、ＣＯ₂放出を防止することが可能である、ということを示す。

［実施例３］
ホスホケトラーゼ活性を有する又は有さない細菌を用いたコハク酸生産の理論的収率の算定
１． ＰＴＳ、解糖作用及びＴＣＡサイクルを包含するコハク酸生合成経路の反応

ＰＴＳ＋解糖作用：
グルコース ＝ ＰＥＰ ＋ ＰＹＲ ＋ ＡＴＰ ＋ ２ＮＡＤＨ

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ：
ＰＥＰ ＋ ＣＯ₂ ＝ オキサロ酢酸

ピルビン酸デヒドロゲナーゼ：
ＰＹＲ ＝ アセチル−ＣｏＡ ＋ ＣＯ₂ ＋ ＮＡＤＨ

要約した式：
グルコース＝オキサロ酢酸＋アセチル−ＣｏＡ＋ＡＴＰ＋３ＮＡＤＨ

ＴＣＡ回路：
オキサロ酢酸＋アセチル−ＣｏＡ＝コハク酸＋ＮＡＤＰＨ＋ＮＡＤＨ＋ＡＴＰ＋２ＣＯ₂

最終式：
グルコース＝コハク酸＋ＮＡＤＰＨ＋４ＮＡＤＨ＋２ＡＴＰ＋２ＣＯ₂
又は ＮＡＤＨ ＝ ＮＡＤＰＨ ＝ ２ＡＴＰと仮定して
グルコース ＝ コハク酸 ＋ １２ＡＴＰ ＋ ２ＣＯ₂ （Ｆ）
コハク酸の理論的収率は、６５％である。

２．解糖作用、非酸化型ＰＰＣ、及びＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼのみを伴うコハク酸生合成経路の反応

解糖作用、非酸化型ＰＰＣ、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが、要約した式を与える（実施例２、式２を参照のこと）。
５グルコース＋６ＣＯ₂＝６アセチル−ＣｏＡ＋６オキサロ酢酸＋７ＡＴＰ

ＴＣＡ回路：
オキサロ酢酸 ＋ アセチル−ＣｏＡ ＝ コハク酸 ＋ ＮＡＤＰＨ ＋ ＮＡＤＨ ＋ ＡＴＰ ＋ ２ＣＯ₂

最終式：
５グルコース ＝ ６コハク酸 ＋ ６ＣＯ₂ ＋ ６ＮＡＤＰＨ ＋ ２５ＡＴＰ
又は ＮＡＤＨ ＝ ＮＡＤＰＨ ＝ ２ＡＴＰと仮定して
５グルコース ＝ ６コハク酸 ＋ ６ＣＯ₂ ＋ ３７ＡＴＰ （Ｇ）
コハク酸の理論的収率は、７９％である。

３．解糖作用、非酸化型ＰＰＣ、２種のホスホケトラーゼ及びグリオキシル酸バイパスを伴うコハク酸生合成経路の反応

解糖作用、非酸化型ＰＰＣ、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが、要約した式を与える（実施例２、式４を参照のこと）。
２グルコース＋２ＣＯ₂＝３アセチル−ＣｏＡ＋２オキサロ酢酸＋ＮＡＤＨ 又は
４グルコース＋４ＣＯ₂＝６アセチル−ＣｏＡ＋４オキサロ酢酸＋２ＮＡＤＨ

ＴＣＡ回路：
オキサロ酢酸＋アセチル−ＣｏＡ＝コハク酸＋ＮＡＤＰＨ＋ＮＡＤＨ＋ＡＴＰ＋２ＣＯ₂

要約した式：
４グルコース＝４コハク酸＋２アセチル−ＣｏＡ＋４ＣＯ₂＋４ＮＡＤＰＨ＋６ＮＡＤＨ

グリオキシル酸バイパス：
２アセチル−ＣｏＡ ＝ コハク酸 ＋ ＮＡＤＨ

最終式：
４グルコース ＝ ５コハク酸 ＋ ４ＣＯ₂ ＋ ４ＮＡＤＰＨ ＋ ７ＮＡＤＨ
又は ＮＡＤＨ ＝ ＮＡＤＰＨ ＝ ２ＡＴＰと仮定して
４グルコース ＝ ５コハク酸 ＋ ４ＣＯ₂ ＋ ２２ＡＴＰ （Ｈ）
コハク酸の理論的収率は、Ｙ＝８２％である。

方程式（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ）の比較は、ホスホケトラーゼの活性を用いると、コハク酸生合成の理論的収率が有意に増大し、そしてホスホケトラーゼを用いない場合にグルコース代謝で１分子のグルコースから１分子のコハク酸が得られるのに対して、利用されるグルコースの分子より１分子多いコハク酸を生じ、ＣＯ₂放出を防止することが可能で
ある、ということを示す。

［実施例４］
ホスホケトラーゼ活性を有する又は有さない細菌を用いたＬ−ロイシン生産の理論的収率の算定
１． ＰＴＳ及び解糖作用を包含するＬ−ロイシン生合成経路の反応

解糖作用：
グルコース ＝ ２ＰＹＲ ＋ ２ＡＴＰ ＋ ２ＮＡＤＨ

Ｌ−ロイシン生合成：
２ＰＹＲ＋ＮＡＤＰＨ＝２−ケト−イソ吉草酸＋ＣＯ₂
２−ケト−イソ吉草酸＋アセチル−ＣｏＡ＋Ｌ−グルタミン酸＝ロイシン＋ＮＡＤＨ＋２−オキソグルタル酸＋ＣＯ₂ 又は
２−ケト−イソ吉草酸＋アセチル−ＣｏＡ＝ロイシン＋ＮＡＤＨ−ＮＡＤＰＨ＋ＣＯ₂
（式中、ＮＡＤＰＨは、Ｌ−グルタミン酸の再生に用いられる）
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ
ＰＹＲ＝アセチル−ＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋ＣＯ₂

要約した式：
３ＰＹＲ＝ロイシン＋２ＮＡＤＨ−２ＮＡＤＰＨ＋３ＣＯ₂

最終式：
３グルコース＝２ロイシン＋４ＮＡＤＨ−４ＮＡＤＰＨ＋６ＣＯ₂＋６ＡＴＰ＋６ＮＡＤＨ
又は ＮＡＤＨ＝ＮＡＤＰＨ＝２ＡＴＰと仮定して
３グルコース＝２ロイシン＋１８ＡＴＰ＋６ＣＯ₂ （Ｉ）
Ｌ−ロイシンの理論的収率は、Ｙ＝４８％である。

２．解糖作用、非酸化型ＰＰＣ、及びＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼのみを伴うＬ−ロイシン生合成経路の反応

解糖作用、非酸化型ＰＰＣ、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ、及びリン酸アセチルトランスフェラーゼが要約した式を与える（実施例２、式１を参照のこと）。
５グルコース＝６アセチル−ＣｏＡ＋ＰＥＰ＋５ＡＴＰ＋６ＮＡＤＨ＋５ＰＹＲ

ピルビン酸キナーゼ：
ＰＥＰ＝ＰＹＲ＋ＡＴＰ

要約した式：
５グルコース＝６アセチル−ＣｏＡ＋６ＰＹＲ＋６ＡＴＰ＋６ＮＡＤＨ

Ｌ−ロイシン生合成：
２ＰＹＲ＋アセチル−ＣｏＡ＝ロイシン＋ＮＡＤＨ−２ＮＡＤＰＨ＋２ＣＯ₂

要約した式：
５グルコース＝３ロイシン＋３アセチル−ＣｏＡ＋６ＡＴＰ＋９ＮＡＤＨ−６ＮＡＤＰＨ＋６ＣＯ₂ （５）

解糖作用の他の作用は、
３グルコース＝６ＰＹＲ＋１８ＡＴＰ （６）
を与える。

式５及び式６を加えると：
３グルコース＝６ＰＹＲ＋１８ＡＴＰ
＋
５グルコース＝３ロイシン＋３アセチル−ＣｏＡ＋６ＡＴＰ＋９ＮＡＤＨ−６ＮＡＤＰＨ＋６ＣＯ₂
＝
８グルコース＝３ロイシン＋（６ＰＹＲ＋３Ａｃｅ−ＣｏＡ）＋９ＮＡＤＨ−６ＮＡＤＰＨ＋２４ＡＴＰ＋６ＣＯ₂

最終式：
８グルコース＝６ロイシン＋２４ＡＴＰ＋１２ＮＡＤＨ−１２ＮＡＤＰＨ＋１２ＣＯ₂
又は ＮＡＤＨ＝ＮＡＤＰＨと仮定して
８グルコース＝６ロイシン＋１２ＣＯ₂＋２４ＡＴＰ （Ｊ）
Ｌ−ロイシンの理論的収率は、Ｙ＝５５％である。

３． 解糖作用、非酸化的ＰＰＣ及び両ホスホケトラーゼを包含するＬ−ロイシン生合成経路の反応

解糖作用、非酸化型ＰＰＣ、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼが要約した式を与える（実施例２、式３を参照のこと）。
２グルコース＝３アセチルリン酸＋２ＰＹＲ＋２ＡＴＰ＋２ＮＡＤＨ

リン酸アセチルトランスフェラーゼ：
アセチルリン酸 ＝ アセチル−ＣｏＡ

要約した式：
２グルコース＝３アセチル−ＣｏＡ＋２ＰＹＲ＋２ＡＴＰ＋２ＮＡＤＨ

Ｌ−ロイシン生合成：
２ＰＹＲ＋アセチル−ＣｏＡ＝ロイシン＋ＮＡＤＨ−２ＮＡＤＰＨ＋２ＣＯ₂

要約した式：
２グルコース＝ロイシン＋２アセチル−ＣｏＡ＋２ＡＴＰ＋３ＮＡＤＨ−２ＮＡＤＰＨ＋２ＣＯ₂ （７）

解糖作用の他の作用は、
２グルコース＝３ＰＹＲ＋１２ＡＴＰ （８）
を与える。

式７及び式８を加えると：
２グルコース＝ロイシン＋２アセチル−ＣｏＡ＋２ＡＴＰ＋３ＮＡＤＨ−２ＮＡＤＰＨ＋２ＣＯ₂
＋
２グルコース＝４ＰＹＲ＋１２ＡＴＰ
＝
４グルコース＝ロイシン＋（４ＰＹＲ＋２アセチル−ＣｏＡ）＋１４ＡＴＰ＋３ＮＡＤＨ−２ＮＡＤＰＨ＋２ＣＯ₂

Ｌ−ロイシン生合成：
４ＰＹＲ＋２アセチル−ＣｏＡ＝２ロイシン＋２ＮＡＤＨ−４ＮＡＤＰＨ＋４ＣＯ₂

最終式：
４グルコース＝３ロイシン＋１４ＡＴＰ＋５ＮＡＤＨ−６ＮＡＤＰＨ＋６ＣＯ₂
又は ＮＡＤＨ＝ＮＡＤＰＨ＝２ＡＴＰと仮定して
４グルコース＝３ロイシン＋６ＣＯ₂＋１２ＡＴＰ （Ｋ）
Ｌ−ロイシンの理論的収率は、Ｙ＝５５％である。

方程式（Ｉ）、（Ｊ）及び（Ｋ）の比較は、ホスホケトラーゼの活性を用いると、Ｌ−ロイシン生合成の理論的収率が有意に増大される、ということを示す。

［実施例５］
ラクトバチルス・プランタラムからのホスホケトラーゼ遺伝子（ｘｐｋ１）のクローニング並びにエシェリヒア・コリによる有用な代謝産物の生産に及ぼすｘｐｋ１遺伝子増幅効果の評価
ｘｐｋ１遺伝子を、ラクトバチルス・プランタラム８ＰＡ３株（ＶＫＰＭ Ｂ−７４９５）の染色体ＤＮＡからクローン化する。報告された塩基配列に基づいて、ｘｐｋ１遺伝子の増幅のために配列番号７（プライマー１）及び８（プライマー２）で示されるプライマーを合成する。プライマー１は、その５’末端に導入されたＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含有する。プライマー２は、その５’末端に導入されたＥｃｏＲＩ認識部位を含有する。

ラクトバチルス・プランタラム８ＰＡ３株の染色体ＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として用い、通常方法により調製する。ＰＣＲは、以下の条件で「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ系２４００」を用いて実行する：Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｔａｑポリメラーゼ（Fermentas, Lithuania）を用い、９５℃で５分の初期ＤＮＡ変性；次に９５℃で３０秒の変性、５５℃で６０秒のアニーリング、及び７２℃で１２０秒の伸長を３０サイクル、７２℃で７分の最終重合を行う。それ自体のＳＤ配列とともに、プロモーター配列を伴わずにｘｐｋ１遺伝子を含有する得られたＰＣＲ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで処理し、そして同一酵素で予め処理されたベクターｐＭＷ１１９中に挿入する。このようにしてプラスミドｐＭＷ−ｘｐｋ１が得られる。

ｐＭＷ−ｘｐｋ１プラスミドを用いた有用代謝産物生産株の形質転換を通常の方法により実施し、ｘｐｋ１遺伝子が増幅された菌株を取得することができる。

エシェリヒア・コリＶＬ３３４ｔｈｒＣ⁺−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株によるＬ−グルタミン酸の生産
ｐＭＷ−ｘｐｋ１プラスミドを用いたエシェリヒア・コリＬ−グルタミン酸生産株ＶＬ３３４ｔｈｒＣ⁺（欧州特許公開第１１７２４３３号）の形質転換を通常の方法により実施し、ＶＬ３３４ｔｈｒＣ⁺−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株を取得することができる。

両菌株、即ちＶＬ３３４ｔｈｒＣ⁺及びＶＬ３３４ｔｈｒＣ⁺−ｐＭＷ−ｘｐｋ１を、Ｌ−寒天プレート上、３７℃で１８〜２４時間、増殖させる。次に細胞の１ループ分を、発酵培地２ｍｌを含有する試験管中に移入する。発酵培地は、６０ｇ／ｌのグルコース、２５ｇ／ｌの硫酸アンモニウム、２ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄、１ｇ／ｌのＭｇＳＯ₄、０．１ｍｇ／ｍｌのチアミン、７０μｇ／ｍｌのＬ−イソロイシン及び２５ｇ／ｌの石灰（ｐＨ７
．２）を含有する。グルコース及び石灰は、別々に滅菌する。培養は、振盪しながら３０℃で３日間実行する。培養後、ペーパークロマトグラフィー（液相組成：ブタノール−酢酸−水＝４：１：１）と、その後のニンヒドリン（アセトン中１％溶液）による染色及びさらに０．５％ＣｄＣｌ₂を含む５０％エタノール中での化合物の溶離により、蓄積したＬ−グルタミン酸の蓄積量を決定することができる。

エシェリヒア・コリ７０２ｉｌｖＡ−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株によるＬ−プロリンの生産
ｐＭＷ−ｘｐｋ１プラスミドを用いたエシェリヒア・コリＬ−プロリン生産株７０２ｉｌｖＡ（ＶＫＰＭ Ｂ−８０１２、ロシア特許出願第２０００１２４２９５号、欧州特許公開第１１７２４３３号）の形質転換を通常の方法により実施し、７０２ｉｌｖＡ−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株を取得することができる。

両エシェリヒア・コリ株、即ち７０２ｉｌｖＡ及び７０２ｉｌｖＡ−ｐＭＷ−ｘｐｋ１を、Ｌ−寒天プレート上、３７℃で１８〜２４時間、増殖させる。次にこれらの菌株を、上記と同一条件で培養する。

エシェリヒア・コリ５７−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株によるＬ−ロイシンの生産
ｐＭＷ−ｘｐｋ１プラスミドを用いたエシェリヒア・コリＬ−ロイシン生産株５７株（ＶＫＰＭ Ｂ−７３８６、米国特許第６，１２４，１２１号）の形質転換を通常の方法により実施し、５７−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株を取得することができる。

両エシェリヒア・コリ株、即ち５７株及び５７−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株を、Ｌ−寒天プレート上、３７℃で１８〜２４時間、増殖させる。次にこれらの菌株を、培地にイソロイシンを加えずに上記と同一条件で培養する。

エシェリヒア・コリＪＭ１５（ｙｄｅＤ）−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株によるＬ−システインの生産
ｐＭＷ−ｘｐｋ１プラスミドを用いたエシェリヒア・コリＬ−システイン生産株ＪＭ１５（ｙｄｅＤ）の形質転換を通常の方法により実施し、ＪＭ１５（ｙｄｅＤ）−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株を取得することができる。

エシェリヒア・コリＪＭ１５（ｙｄｅＤ）株は、任意のＬ−アミノ酸の生合成経路（米国特許第５，９７２，６６３号）に関与しない膜タンパク質をコードするｙｄｅＤ遺伝子を有するＤＮＡで形質転換された、エシェリヒア・コリＪＭ１５株の誘導体である（米国特許第６，２１８，１６８号）。

Ｌ−システイン生産の評価のための発酵条件は、米国特許第６，２１８，１６８号の実施例６に詳細に記載されている。

パントエア・アナナティスＡＪ１３３５６−ｘｐｋ１株によるＬ−グルタミン酸の生産
ｐＭＷ−ｘｐｋ１プラスミドを用いたＬ−グルタミン酸生産エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５６株（米国特許第６，３３１，４１９号）（近年、パントエア・アナナティスとして再分類された）の形質転換を通常の方法により実施し、ＡＪ１３３５５６−ｐＭＷ−ｘｐｋ１株を取得することができる。

４０ｇ／Ｌのグルコース、２０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム・七水和物、２ｇ／Ｌのジヒドロリン酸カリウム、０．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２５ｇ／Ｌの塩化カルシウム・七水和物、０．０２ｇ／Ｌの硫酸第一鉄・七水和物、０．０２ｇ／Ｌの硫酸マンガン・四水和物、０．７２ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛・二水和物、０．６４ｍｇ／Ｌの硫酸銅・五水和物、０．７２ｍｇ／Ｌの塩化コバルト・六水和物、０
．４ｍｇ／Ｌのホウ酸、１．２ｍｇ／Ｌのモリブデン酸ナトリウム・二水和物、２ｇ／Ｌの酵母エキス、３０ｇ／Ｌの炭酸カルシウム、２００ｍｇ／ＬのＬ−リジン一塩酸塩、２００ｍｇ／ＬのＬ−メチオニン及び２００ｍｇ／ＬのＤＬ−α，ε−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含む培地２０ｍｌを含有する５００ｍｌ容積フラスコ中に、ＡＪ１３３５６株及びＡＪ１３３５６−ｘｐｋ１株を各々、接種し、培地中に含有されるグルコースが完全に消費されるまで、振盪しながら３７℃で培養する。培養終了後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸を上記と同様に測定することができる。

［実施例６］
コリネ型細菌を用いたホスホケトラーゼ遺伝子の生理学的活性の確認
（６−１）ホスホケトラーゼ遺伝子のクローニング及び発現プラスミドの構築
（１）ｐＶＫ９−ｘｆｐの構築
ビフィドバクテリウム・アニマリスＪＣＭ１１９０株の染色体ＤＮＡから、ｘｆｐ遺伝子をクローン化した。ビフィドバクテリウム・アニマリスＡＴＣＣ２７６７４（GenBankアクセス番号ＡＹ５１８２１３：配列番号９）のｘｆｐ遺伝子の報告された塩基配列に基づいて、配列番号１３及び１４で示されるプライマーを合成し、ｘｆｐ遺伝子の増幅のために用いる。Japan Collection of Microorganisms（ＪＣＭ）から、ビフィドバクテリウム・アニマリスＪＣＭ１１９０を得ることができる。

ビフィドバクテリウム・アニマリスＪＣＭ１１９０のｘｆｐ遺伝子のＤＮＡ配列は、配列番号１１で示される。

ビフィドバクテリウム・アニマリスＪＣＭ１１９０のｘｆｐ遺伝子（配列番号１１）を増幅し、それをｐＶＫ９エシェリヒア・コリ−コリネ型細菌シャトルベクター中にクローン化するために、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ精製キット（Promega）を用いて、ビフィドバクテリウム・アニマリスＪＣＭ１１９０の染色体ＤＮＡを抽出した。ｐＶＫ９は、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩでｐＨＫ４（特開平５−００７４９１号公報）を消化してその複製領域を含む領域を得、ｐＨＳＧ２９９（Takara Bio Inc.の製品）のＡｖａＩＩ部位中にその領域を導入することにより得られるエシェリヒア・コリ−コリネ型細菌シャトルベクターである。鋳型としてビフィドバクテリウム・アニマリスの染色体ＤＮＡを用い、プライマーとして配列番号１３及び１４で示されたプライマーを用いて、プロモーター領域を含むｘｆｐ遺伝子断片をＰＣＲにより増幅した。慣用的方法により、ＰＣＲを実行した。

その結果生じたＰＣＲ産物を、慣用的方法で精製し、ＸｂａＩで消化した。消化ＰＣＲ産物を、ライゲーションキット（Takara Bio Incの製品）を用いて、ＸｂａＩで消化されたｐＶＫ９に連結した。ライゲーション混合物を用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテント細胞（Takara Bio Inc.の製品）を形質転換した。１００μＭのＩＰＴＧ、４０ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ及び２５ｍｇ／ｍｌのＫｍを含有するＬＢ培地（１Ｌ中に１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇのバクト−酵母エキス及び１０ｇのＮａＣｌ）上に細胞をプレーティングして、一晩培養した。次に、出現した白色コロニーを選択し、単一コロニーに分離して、形質転換体を得た。ｘｆｐ遺伝子を含有する標的プラスミドｐＶＫ９−ｘｆｐを、形質転換体から単離した。

（２）ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐの構築
ビフィドバクテリウム・アニマリスｘｆｐ遺伝子のネイティブプロモーター領域がＰＳ２プロモーター（Peyret JL, Mol Microbiol. 1993 Jul; 9(1): 97-109、ＷＯ９３／０３１５８）で置換されたＤＮＡ断片を、オーバーラップＰＣＲ法（R.M. Horton, H.D. Hunts, S.N. Ho, J.K. Pullen, and L.R. Pease, Gene, 77, 61-68 (1989)）に従って得た。本方法は、以下で具体的に記載する。

鋳型としてＰＳ２プロモーターを含有するｐＰＳＴＧ１（Y. Kikuchi, M. Date, K. Yokoyama, Y. Umezawa and H. Matsui, Appl. Environ. Microbiol. Appl. Environ. Microbiol 69, 358-366 (2003)）を、プライマーとして配列番号１５及び１６の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施して、ＰＳ２プロモーターの増幅産物を得た。次に、ｘｆｐ遺伝子の配列の増幅産物（コード領域）を得るために、鋳型としてｐＶＫ９−ｘｆｐを、そしてプライマーとして配列番号１７及び１８の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施した。配列番号１６及び１８は、互いに相補的である。

次に、ＰＳ２プロモーター及びビフィドバクテリウム・アニマリスｘｆｐ遺伝子を含有する断片を得るために、ＰＳ２プロモーターの上記の遺伝子断片及びビフィドバクテリウム・アニマリスｘｆｐ遺伝子を実質的に等モル量で混合し、鋳型としてこの混合物を、またプライマーとして配列番号１４及び１９の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施した。

その結果生じたＰＣＲ産物を、慣用的方法で精製し、ＸｂａＩで消化した。消化ＰＣＲ産物を、ライゲーションキット（Takara Bio Incの製品）を用いて、ＸｂａＩで消化されたｐＶＫ９に連結した。ライゲーション混合物を用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテント細胞（Takara Bio Inc.の製品）を形質転換した。１００μＭのＩＰＴＧ、４０ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ及び２５ｍｇ／ｍｌのＫｍを含有するＬＢ培地（１Ｌ中に１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇのバクト−酵母エキス及び１０ｇのＮａＣｌ）上に細胞をプレーティングして、一晩培養した。次に、出現した白色コロニーを選択し、単一コロニーに分離して形質転換体を得た。ＰＳ２プロモーター及びｘｆｐ遺伝子を含有する標的プラスミドｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐを形質転換体から単離した。

（３）ｐＶＫ９−ｔａｃ＿ｘｆｐの構築
ビフィドバクテリウム・アニマリスｘｆｐ遺伝子のネイティブプロモーター領域がｔａｃプロモーターで置換されたＤＮＡ断片を、オーバーラップＰＣＲ法（R.M. Horton, H.D. Hunt, S.N. Ho, J.K. Pullen, and L.R. Pease, Gene, 77, 61-68 (1989)）に従って得た。本方法は、以下で具体的に記載する。

鋳型としてｐＫＫ２２３−３（Pharmacia）を、プライマーとして配列番号２０及び２１の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施して、ｔａｃプロモーターの増幅産物を得た。次に、ｘｆｐ遺伝子の配列の増幅産物（コード領域）を得るために、鋳型としてビフィドバクテリウム・アニマリスＪＣＭ１１９０の染色体ＤＮＡを、プライマーとして配列番号１４及び２２の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施した。配列番号２０及び２２のヌクレチオド配列は、互いに相補的である。

次に、ｔａｃプロモーター及びビフィドバクテリウム・アニマリスｘｆｐ遺伝子を含有する断片を得るために、ｔａｃプロモーターの上記の遺伝子断片及びビフィドバクテリウム・アニマリスｘｆｐ遺伝子を実質的に等モル量で混合し、鋳型としてこの混合物を、またプライマーとして配列番号１４及び２１の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施した。

その結果生じたＰＣＲ産物を、慣用的方法で精製し、ＸｂａＩで消化した。消化ＰＣＲ産物を、ライゲーションキット（Takara Bio Incの製品）を用いて、ＸｂａＩで消化されたｐＶＫ９に連結した。ライゲーション混合物を用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテント細胞（Takara Bio Inc.の製品）を形質転換した。１００μＭのＩＰＴＧ、４０ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ及び２５ｍｇ／ｍｌのＫｍを含有するＬＢ培地（１Ｌ中に１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇのバクト−酵母エキス及び１０ｇのＮａＣｌ）上に細胞をプレーティングして、一晩培養した。次に、出現した白色コロニーを選択し、単一コロニーに分離して形質転換体を得た。ｘｆｐ遺伝子及びｔａｃプロモーターを含有する標的
プラスミドｐＶＫ９−ｔａｃ＿ｘｆｐを形質転換体から単離した。

（４）ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｐｋＡの構築
ラクトバチルス・ペントススＪＣＭ１５５８株の染色体ＤＮＡから、ｘｐｋＡ遺伝子をクローン化した。ラクトバチルス・ペントススＪＣＭ１５５８は、Japan Collection of Microorganisms（ＪＣＭ）から得られる。ラクトバチルス・ペントススＪＣＭ１５５８からホスホケトラーゼをコードするｘｐｋＡ遺伝子（配列番号１；ＡＪ３０９０１１：ｇｉ：１６６０５５１３）を増幅し、それをｐＶＫ９シャトルベクター中にクローン化するために、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ精製キット（Promega）を用いてラクトバチルス・ペントススＪＣＭ１５５８の染色体ＤＮＡを抽出した。

オーバーラップＰＣＲ法に従って、ホスホケトラーゼをコードするラクトバチルス・ペントススｘｐｋＡ遺伝子のプロモーター領域をＰＳ２プロモーターで置き換えることにより、ＤＮＡ断片を得た。本方法は、本明細書中で具体的に記載される。

先ず、鋳型としてＰＳ２プロモーターを含有するｐＰＳＴＧ１（Y. Kikuchi, M. Date,
K. Yokoyama, Y. Umezawa and H. Matsui, Appl. Environ. Microbiol. Appl. Environ.
Microbiol 69, 358-366 (2003)）を、プライマーとして配列番号１５及び２３の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施して、ＰＳ２プロモーターの増幅産物を得た。次に、ｘｐｋＡ遺伝子配列の増幅産物（コード領域）を得るために、鋳型としてラクトバチルス・ペントススＪＣＭ１５５８の染色体ＤＮＡを、プライマーとして配列番号２４及び２５の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施した。配列番号２３及び２５のヌクレチオド配列は、互いに相補的である。

次に、ＰＳ２プロモーター及びラクトバチルス・ペントススｘｐｋＡ遺伝子を含有する断片を得るために、ＰＳ２プロモーターの上記の遺伝子断片及びラクトバチルス・ペントススｘｐｋＡ遺伝子を実質的に等モル量で混合し、鋳型としてこの混合物を、またプライマーとして配列番号１９及び２４の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。

その結果生じたＰＣＲ産物を、慣用的方法で精製し、ＸｂａＩで消化した。消化ＰＣＲ産物を、ライゲーションキット（Takara Bio Inc.の製品）を用いて、ＸｂａＩで消化されたｐＶＫ９に連結した。ライゲーション混合物を用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテント細胞（Takara Bio Inc.の製品）を形質転換した。１００μＭのＩＰＴＧ、４０ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ及び２５ｍｇ／ｍｌのＫｍを含有するＬＢ培地（１Ｌ中に１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇのバクト−酵母エキス及び１０ｇのＮａＣｌ）上に細胞をプレーティングして、一晩培養した。次に、出現した白色コロニーを選択し、単一コロニーに分離して形質転換体を得た。ＰＳ２プロモーター及びｘｐｋＡを含有する標的プラスミドｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｐｋＡを形質転換体から単離した。

（６−２）ホスホケトラーゼのｉｎ ｖｉｖｏ生理学的活性の確認
（１）ＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥ株の構築
ＰＤＨ欠損株は、酢酸に対して栄養要求性である。他方で、ホスホケトラーゼ遺伝子が導入されたＰＤＨ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ）欠損株は、酢酸に対してもはや栄養要求性でない。したがってｘｆｐ又はｘｐｋＡ遺伝子の導入の効果が確認された。

遺伝子破壊ベクターの構築
（Ａ）ｐＢＳ３の構築
ＰＣＲのための鋳型としてバチルス・ズブチリスの染色体ＤＮＡを、プライマーとして配列番号４２及び４３の合成ＤＮＡを用いて、ｓａｃＢ遺伝子（配列番号４０）をＰＣＲにより得た。ＬＡｔａｑ（TaKaRa Bio）を用いて、９４℃に５分間保持する１サイクルの
後、９４℃で３０秒、４９℃で３０秒及び７２℃で２分間のサイクルを２５回反復して、ＰＣＲを実行した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで消化して、通常方法による精製後に平滑末端化した。その結果生じたＰＣＲ産物をＡｖａＩＩで消化し、平滑末端化しておいたｐＨＳＧ２９９と結合した。プラスミドを用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテント細胞（Takara Bio Inc.）を形質転換して、次に２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地中に形質転換体を懸濁し一晩培養した。コロニーをピックアップし、単一コロニーにして、形質転換体を得た。ｓａｃＢ遺伝子を含有する標的プラスミドｐＢＳ３を、形質転換体から単離した。

ｐＢＳ３の構築手法を、図２に示す。

（Ｂ）ｐＢＳ４Ｓの構築
オーバーラップＰＣＲにより、プラスミドｐＢＳ３中のカナマイシン耐性遺伝子のコード領域においてＳｍａＩ部位を破壊することにより、プラスミドを得た。先ず、鋳型としてｐＢＳ３を、プライマーとして配列番号４４及び４５の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施し、カナマイシン耐性遺伝子のＮ末端領域を含有するＰＣＲ産物を得た。他方で、カナマイシン耐性遺伝子のＣ末端領域を含有するＰＣＲ産物を得るために、鋳型としてｐＢＳ３を、プライマーとして配列番号４６及び４７の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施した。ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Takara Bio Inc.）を用いて、９８℃で５分間の１サイクルの熱処理後、９８℃で１０秒、５７℃で３０秒及び７２℃で１分間のサイクルを２５回反復して、ＰＣＲ産物を得ることができる。配列番号４５及び４６の塩基配列は、互いに部分的に相補的である。

アミノ酸置換を生じることなく変異を導入することにより、この配列のＳｍａＩ部位を破壊した。ＳｍａＩ部位が破壊された変異カナマイシン耐性遺伝子断片を得るために、カナマイシン耐性遺伝子のＮ末端領域遺伝子産物及びＣ末端領域遺伝子産物を混合して、ほぼ等モル混合物を形成した。混合物をＰＣＲのための鋳型として、プライマーとして配列番号４４及び４７の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施し、カナマイシン耐性遺伝子に変異を有するＰＣＲ産物を得た。ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ（Takara Bio Inc.）を用いて、９８℃で５分間の１サイクルの熱処理後、９８℃で１０秒、５７℃で３０秒及び７２℃で１．５分間のサイクルを２５回反復して、標的ＰＣＲ産物を得た。

精製後にＰＣＲ産物をＢａｎＩＩで消化し、上記のｐＢＳ３のＢａｎＩＩ部位に挿入した。得られたＤＮＡを用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９（Takara Bio Inc.）のコンピテント細胞を形質転換して、２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地に懸濁し、一晩培養した。コロニーを取り、単一コロニーにして形質転換体を得た。標的プラスミドｐＢＳ４Ｓを形質転換体から単離した。ｐＢＳ４Ｓの構築手法を図３に示す。

（Ｃ）ｐＢＳ５Ｔの構築
コリネ型細菌からの温度感受性複製起点を有するプラスミドｐＢＳ５Ｔを、以下の手法により構築した。

ＢａｍＨＩ及びＳｍａＩでｐＨＳＣ４（米国特許第５６１６４８０Ａ号）を消化するとともに、該消化断片を平滑末端化することにより、温度感受性複製領域を得て、次に、この領域をｐＢＳ４Ｓの平滑末端化ＮｄｅＩ部位に連結した。得られたＤＮＡを用いて、エシェリヒア・コリＪＭ１０９のコンピテント細胞（Takara Bio Inc.の製品）を形質転換し、２５ｍｇ／ｍｌのＫｍを含有するＬＢ培地中に形質転換体を懸濁し、一晩培養した。コロニーをピックアップし、単一コロニーにして形質転換体を得た。ｓａｃＢ断片及び温度感受性複製起点を含有する標的プラスミドｐＢＳ５Ｔを形質転換体から単離した。ｐＢＳ５Ｔの構築スキームを図４に示す。

（２）ａｃｅＥ遺伝子破壊のための断片のクローニング
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のａｃｅＥ遺伝子の報告された塩基配列（GenBankデータベースアクセス番号ＮＣ００３４５０；配列番号３８）に基づいて、プライマーとして合成ＤＮＡを用いてオーバーラップＰＣＲ法により、ＡＴＣＣ１３８６９から、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１構成成分）をコードするａｃｅＥ遺伝子を破壊するためのＤＮＡ断片を得た。

先ず、鋳型としてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを、プライマーとして配列番号２６及び２７の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施して、ａｃｅＥ遺伝子のＮ末端側の増幅産物を得た。次に、ａｃｅＥ遺伝子のＣ末端側の増幅産物（コード領域）を得るために、鋳型としてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを、プライマーとして配列番号２８及び２９の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。配列番号２６及び２８の配列は、互いに相補的である。

次に、内部配列が欠損したａｃｅＥ断片を得るために、Ｎ末端及びＣ末端の上記の遺伝子断片を実質的に等モル量で混合し、鋳型としてこの混合物を、プライマーとして配列番号３０及び３１の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。

その結果生じたＰＣＲ産物を慣用的方法で精製し、ＳｍａＩで消化した。消化ＰＣＲ産物をライゲーションキット（Takara Bio Incの製品）を用いて、ＳｍａＩで消化された上記のｐＢＳ５Ｔに連結した。ライゲーション混合物を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテント細胞（Takara Bio Inc.の製品）を形質転換した。１００μＭのＩＰＴＧ、４０ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ及び２５ｍｇ／ｍｌのＫｍを含有するＬＢ培地（１Ｌ中に１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇのバクト−酵母エキス及び１０ｇのＮａＣｌ）上に細胞をプレーティングして一晩培養した。次に、出現した白色コロニーを選択し、単一コロニーに分離して形質転換体を得た。標的プラスミドｐＢＳ５Ｔ−ΔａｃｅＥを、形質転換体から単離した。

（３）ａｃｅＥ破壊株の構築
ａｃｅＥ遺伝子はピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１構成成分をコードする。

先ず、電気パルス法により高濃度のプラスミドｐＢＳ５Ｔ−ΔａｃｅＥを用いてＡＴＣＣ１３８６９株を形質転換して、２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＣＭ−Ｄｅｘ培地（５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、３ｇ／Ｌの尿素、１．２ｇ／Ｌの大豆加水分解物及び１０μｇ／Ｌのビオチン、ｐＨ７．５（ＮａＯＨ））上にプレーティングして２５℃で約６０時間培養し、出現したコロニーを形質転換体として単離した。次に、形質転換体を、３４℃で一晩、ＣＭ−Ｄｅｘ液体培地上で培養した。適切な希釈後、培養形質転換体を２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＣＭ−Ｄｅｘ培地に懸濁し、３４℃で約３０時間培養した。プラスミド上の破壊型ａｃｅＥ遺伝子（ΔａｃｅＥ）及び染色体上のネイティブａｃｅＥ遺伝子間の単一交差相同的組換えの結果として、この培地中で増殖し得る、染色体上にプラスミド由来のカナマイシン耐性遺伝子及びｓａｃＢ遺伝子の両方を有するΔａｃｅＥ株を得た。

次に、単一交差相同的組換えにより得られたΔａｃｅＥ株を、３１．５℃で一晩、ＣＭ−Ｄｅｘ液体培地上で培養した。適切な希釈後、単一交差相同的組換えΔａｃｅＥ株を、カナマイシンを含有せず１０％スクロースを含有するＤｅｘ−Ｓ１０培地（１０ｇ／Ｌのスクロース、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／ＬのＫＨ₂Ｐ
Ｏ₄、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ、３ｇ／Ｌの尿素、１．２ｇ／Ｌの大豆加水分解物、１０μｇ／Ｌのビオチン、及び２ｇ／ｌの酢酸ナトリウム、ＫＯＨでｐＨ７．５に調整）中に懸濁した。培養を、３４℃で約３０時間実施した。二次交差相補的組換えの結果として、染色体上にＳａｃＢ遺伝子を有さず且つスクロースに対して感受性でない菌株を得た。

この方法で得られる菌株としては、破壊型のａｃｅＥ遺伝子を有するもの及び野生型のａｃｅＥ遺伝子を有するものが挙げられる。ａｃｅＥ遺伝子が破壊型であるか又は野生型であるかを、Ｄｅｘ−Ｓ１０寒天培地上で培養することにより得られる細胞を用いて直接ＰＣＲにより確認した。破壊型のａｃｅＥ遺伝子を含有する菌株を選択し、ＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥと名づけた。

（４）ΔａｃｅＥ株中のホスホケトラーゼの生理学的活性の評価
ｐＶＫ９（対照のためのプラスミド）、ｐＶＫ９−ｘｆｐ（ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子を増幅するためのプラスミド）、ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ（ネイティブプロモーターがＰＳ２プロモーターに置き換えられたビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子を増幅するためのプラスミド）及びｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｐｋＡ（ネイティブプロモーターがＰＳ２プロモーターに置き換えられたラクトバチルス・ペントススのｘｐｋＡ遺伝子を増幅するためのプラスミド）を各々、ＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥ株に導入して、ホスホケトラーゼ発現株を取得し、そしてｐＶＫ９を対照としてＡＴＣＣ１３８６９株中に導入した。具体的には、ＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥ株及びＡＴＣＣ１３８６９株を各々、電気パルス法により形質転換して、２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＣＭ−Ｄｅｘ培地（５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ、３ｇ／Ｌの尿素、１．２ｇ／Ｌの大豆加水分解物及び１０μｇ／Ｌのビオチン、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整）上にプレーティングし、３１．５℃で約３０時間培養した。出現したコロニーを形質転換体として単離し、そしてそれぞれＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥ（ｐＶＫ９）、ＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥ（ｐＶＫ９−ｘｆｐ）、ＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥ（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ）、ＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥ（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｐｋＡ）及びＡＴＣＣ１８６９（ｐＶＫ９）と名づけた。

これらの菌株を、経時的にＯＤを測定しながら、微小振盪器（「ＢｉｏｐｈｏｔｏｒｅｃｏｒｄｅｒＴＮ−１５０６」、ADVANTEC製）中で培養した。ここでは、２種類の培地を用いる：即ち、２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する最少液体培地（１０ｇ／Ｌのグルコース、２．５ｇ／Ｌの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．５ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．２５ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２ｇ／Ｌの尿素、５０μｇ／Ｌのビオチン、１００ｍＬのＶＢ１−ＨＣｌ、１５ｍｇ／Ｌのプロトカテク酸、０．０２ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ₄、１０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ₂及び４０ｇ／ＬのＭＯＰＳ（ＫＯＨでｐＨ７．０に調整）からなる）及び酢酸（２ｇ／Ｌの酢酸ナトリウム）を含有する最少液体培地である。最少培地上での培養の結果並びに酢酸を含有する最少培地上での培養の結果を、それぞれ図６及び図５に示す。ＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥ（ｐＶＫ９）株は、酢酸を含有する最少培地上では増殖したが、最少培地上では増殖せず、酢酸栄養要求性を示した。それぞれｐｖＫ９−ｘｆｐ、ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ及びｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｐｋＡを有するＡＴＣＣ１３８６９ΔａｃｅＥ株は最少培地上でも増殖したが、これは、ｘｆｐ又はｘｐｋＡの導入がＰＤＨ欠損
株の酢酸栄養要求性を相補するということを示す。このようにしてコリネバクテリウム・グルタミカム中に導入されたホスホケトラーゼの生理学的活性を確認した。

［実施例７］
ホスホケトラーゼの酵素活性の確認
コリネ型細菌は、ビオチンが制限されるか、或いはペニシリン又は界面活性剤が培地中に添加される条件下でＬ−グルタミン酸を生産し得る（ＷＯ９５／３４６７２）。他方、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１．２．４．２ ｓｕｃＡ；２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ）活性が低減するよう改変された菌株は、このような条件化でなくてもＬ−グルタミン酸を生産し得る（Kimura E., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 79,
37-57 (2003), "Metabolic engineering of glutamic acid production"）ということが知られている。したがって、ｓｕｃＡ欠損コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を用いたホスホケトラーゼ遺伝子の導入によるＬ−グルタミン酸の発酵収率における改善を試験した。

（７−１）ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ株の構築
（１）ｓｕｃＡ遺伝子の破壊のための断片のクローニング
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のｓｕｃＡ遺伝子の塩基配列（GenBankデータベースアクセス番号ＮＣ＿００３４５０；配列番号４８）に基づいて設計されたプライマー合成ＤＮＡを用いたオーバーラップＰＣＲ法により、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９株由来の欠失型ｓｕｃＡ断片を得た。

先ず、鋳型としてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを、プライマーとして配列番号３２及び３３の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施して、ｓｕｃＡ遺伝子のＮ末端の増幅産物を得た。次に、ｓｕｃＡ遺伝子のＣ末端の増幅産物（コード領域）を得るために、鋳型としてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡを、プライマーとして配列番号３４及び３５の合成ＤＮＡを用いて、ＰＣＲを実施した。配列番号３３及び３４の配列は互いに相補的である。

次に、内部配列が欠損したｓｕｃＡ断片を得るために、Ｎ末端及びＣ末端の上記の遺伝子断片を実質的に等モル量で混合し、鋳型としてこの混合物を、プライマーとして配列番号３６及び３７の合成ＤＮＡを用いてＰＣＲを実施した。

その結果生じたＰＣＲ産物を、慣用的方法で精製し、ＢａｍＨＩで消化した。消化ＰＣＲ産物を、ライゲーションキット（Takara Bio Incの製品）を用いて、ＢａｍＨＩで消化された上記のｐＢＳ３に連結した。ライゲーション混合物を用いて、エシェリヒア・コリＤＨ５αのコンピテント細胞（Takara Bio Incの製品）を形質転換した。１００μＭのＩＰＴＧ、４０ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ及び２５ｍｇ／ｍｌのＫｍを含有するＬＢ培地（１Ｌ中、１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇのバクト−酵母エキス及び１０ｇのＮａＣｌ）上に細胞をプレーティングして、一晩培養した。次に、出現した白色コロニーを選択し、単一コロニーに分離して、形質転換体を得た。ＰＳ２プロモーター及びｘｆｐ遺伝子を含有する標的プラスミドｐＢＳ３ΔｓｕｃＡを形質転換体から単離した。

（２）ｓｕｃＡ破壊株の調製
（Ａ）で調製されたｐＢＳ３ΔｓｕｃＡは、コリネ型細菌の細胞中で自律的に複製可能な領域を含有しない。したがってコリネバクテリウムがこのプラスミドで形質転換される場合、かなり低頻度であるが、相同的組換えによりこのプラスミドが染色体中に組み込まれた株が形質転換体として出現する。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を電気パルス法により高濃度のプラスミドｐＢＳ３ΔｓｕｃＡで形質転換し、２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＣＭ−Ｄｅｘ培地（５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、３ｇ／Ｌの尿素、１．２ｇ／Ｌの大豆加水分解物及び１０μｇ／Ｌのビオチン、ＮａＯＨによりｐＨ７．５に調整）上にプレーティングし、３１．５℃で約３０時間培養し、出現したコロニーを形質転換体として単離した。これらの形質転換体は、プラスミド上のｓｕｃＡ遺伝子断片と染色体上のネイティブ遺伝子との間の相同的組換えの結果
として、カナマイシン耐性遺伝子及びプラスミド由来のＳａｃＢ遺伝子の両方を有する。

次に、得られた一次組換え株を、３１．５℃で一晩、カナマイシンを含まないＣＭ−Ｄｅｘ液体培地上で培養した。適切に希釈した後、培養組換え体を、１０％スクロースを含有するカナマイシンを含まないＤｅｘ−Ｓ１０培地（１０ｇ／Ｌのスクロース、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ、３ｇ／Ｌの尿素、１．２ｇ／Ｌの大豆加水分解物及び１０μｇ／Ｌのビオチン、ＫＯＨでｐＨ７．５に調整）上にプレーティングし、３１．５℃で約３０時間培養し、出現したコロニーを形質転換体として単離した。二次交差相補的組換えの結果として、染色体からＳａｃＢ遺伝子が消失し、スクロース非感受性の株を得た。

この方法で得られる菌株としては、破壊型のｓｕｃＡ遺伝子を有するもの及び野生型ｓｕｃＡ遺伝子を有するものが挙げられる。ｓｕｃＡ遺伝子が破壊型であるか又は野生型であるかを、Ｄｅｘ−Ｓ１０寒天培地上で培養することにより得られる細胞を用いて直接ＰＣＲにより確かめた。そして、破壊型のｓｕｃＡ遺伝子を有する菌株を選択した。

ｓｕｃＡ破壊株によるＬ−グルタミン酸の生産を、以下の方法で評価した。ＣＭ２Ｂプレート培地上で培養することにより得られるｓｕｃＡ破壊株の細胞を、純水１Ｌ中に８０ｇのグルコース、１ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇのＭｇＳＯ₄、３０ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．０１ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇのＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１５ｍｌの大豆加水分解溶液、２００ｍｇの塩酸チアミン、６０μｇのビオチン及び５０ｇのＣａＣＯ₃（ＫＯＨでｐＨ８．０に調整）を含有するフラスコ中に接種し、糖が完全に消費されるまで、振盪しながら３１．５℃で培養した。培養終了後、培養ブロス中の蓄積Ｌ−グルタミン酸の量を測定した。ＡＴＣＣ１３８６９より多くの発酵収率のＬ−グルタミン酸を生産し得るｓｕｃＡ破壊株をＡＴＣＣ１３８６９のｓｕｃＡ破壊株として選択し、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡと名づけた。

（７−２）ｓｕｃＡ破壊ＡＴＣＣ１３８６９株中のホスホケトラーゼ遺伝子発現及び酵素活性の確認
ホスホケトラーゼの発現が増強するよう改変された菌株を用いて、ホスホケトラーゼ遺伝子の発現及びその酵素活性を調べた。

ｐＶＫ９（対照のためのプラスミド）、ｐＶＫ９−ｘｆｐ（ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子を増幅するためのプラスミド）、ｐＶＫ９−ｔａｃ＿ｘｆｐ（ネ
イティブプロモーターがｔａｃプロモーターに置き換えられたビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子を増幅するためのプラスミド）、ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ（ネイティブプロモーターがＰＳ２プロモーターに置き換えられたビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子を増幅するためのプラスミド）及びｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｐｋＡ（ネイティブプロモーターがＰＳ２プロモーターに置き換えられたラクトバチルス・ペントススのｘｐｋＡ遺伝子を増幅するためのプラスミド）を各々、上記のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ株に導入して、ホスホケトラーゼ発現菌株を得た。具体的には、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ株を、電気パルス法により各々のプラスミドで形質転換して、２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＣＭ−Ｄｅｘ培地（５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、１ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇ／ＬのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、３ｇ／Ｌの尿素、１．２ｇ／Ｌの大豆加水分解物及び１０μｇ／Ｌのビオチン、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整）上にプレーティングし、３１．５℃で約３０時間培養した。出現したコロニーを形質転換体として単離し、そしてそれぞれＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９）、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ｘｆｐ）、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ｔａｃ＿ｘｆｐ）、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ）及びＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｐｋＡ）と名づけた。

粗酵素液を得るために、ＣＭ−Ｄｅｘプレート培地上で各菌株を培養することにより得られる上記の菌株の細胞を、純水１Ｌ中に３０ｇのグルコース、１ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇのＭｇＳＯ₄、１５ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．０１ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇのＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１３．７ｍｌの大豆加水分解溶液、２００ｍｇの塩酸チアミン、３００μｇのビオチン及び５０ｇのＣａＣＯ₃（ＫＯＨでｐＨ８．０に調整）を含有するフラスコ中に接種し、振盪しながら３１．５℃で培養した。「日立分光分析計Ｕ−２０００Ａ」で測定して、細胞濃度のＯＤ６２０が１５になったときに培養を終了した。３，０００ｒｐｍで３０秒間での適度な遠心分離による炭酸カルシウムの除去後、細胞を回収した。以下の手法を、０〜４℃で実行した。回収細胞を０．８５ＮのＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、４ｍｌ／ｇ（湿重量）の緩衝液Ａ（１００ｍＭのＫＰＯ₄（ｐＨ６．５）、３０ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、２ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁した。超音波細胞破砕機（「Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ」）により細胞を破砕した。非破砕細胞を遠心分離（１５，０００ｇ、６０分）により除去して、粗酵素液を得た。標準試料としてウシ血清アルブミンを用いて、ＣＢＢ溶液（タンパク質検定ＣＢＢ溶液、Nacalai Tesqueの製品）を使用することにより、粗酵素液中のタンパク質濃度を定量した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、粗酵素液中のタンパク質を分離した。分離の具体的な手法を次に記載する。濃度調整後に、粗酵素液を試料緩衝液（「Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液」、BIORADの製品）と１：１に混合した。９５℃で２分間加熱後、得られた混合物を、適用タンパク質量が１０μｇとなるよう、「Ｒｅａｄｙ Ｇｅｌ Ｊ１０％」（BIORADの製品）に適用し、その後、２００Ｖの一定電圧で、ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ ＩＩＩ細胞泳動タンク（BIORADの製品）中で４０分間電気泳動した。電気泳動緩衝液として、トリス／グリシン／ＳＤＳ（BIORAD）を用いた。染色には、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ
Ｂｌｕｅ（「Ｂｉｏ Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｅｉ」、BIORAD）を用いた。結果を、図７で以下に示す（マーカー：BIORADの製品、Precision plus protein standard（＃１６１−０３６３））。

図７のレーン１〜５は、それぞれＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９）、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ｘｆｐ）、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ｔａｃ＿ｘｆｐ）、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ）及びＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｐｋＡ）を示す。対照バンド（ｐＶＫ９）と比較して、ホスホケトラーゼ遺伝子産物に対応する約９０ｋＤバンドが、ホスホケトラーゼの活性が増強するよう改変された菌株において密になる。これは、ホスホケトラーゼ遺伝子の十分量の発現がコリネ型細菌において起こる、ということを明確に示す。

Meileらの方法（L. Meile、L.M. Rohr、T. A. Geissmann、M. Herensperger及びM. Teuber（J. Bacteriol. 183, 2929-2936 (2001)））に従って、ホスホケトラーゼ遺伝子の酵素活性を測定した。０．０７５ｍｌの粗酵素液（３３．３ｍＭのＫＰＯ₄（ｐＨ６．５）、１．９ｍＭの塩酸Ｌ−システイン、２３ｍＭのフッ化ナトリウム、８ｍＭのヨード酢酸ナトリウム及び２７ｍＭのＤ−フルクトース−６−リン酸）を用いた３７℃で３０分間の反応後、０．０７５ｍｌの塩酸ヒドロキシルアミン（２Ｍ、ｐＨ６．５）を添加した。混合物を室温で１０分間反応させた後、０．０５ｍｌの１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリクロロ
酢酸、０．０５ｍｌの４Ｍ ＨＣｌ及び０．０５ｍｌのＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ（０．１ｍ ＨＣｌ中、５％ ｗｔ／ｖｏｌ）で染色した。遠心分離による結晶の除去後、酵素活性リーダー（「Ｓｐｅｃｔｒａ ｍａｘ １９０」、Molecular Devicesの製品）を用いてＯＤ５０５を測定した。

結果を、表３に示す。対照（ｐＶＫ９）では酵素活性は検出されなかったが、一方、ホスホケトラーゼ活性が増強された菌株では酵素活性が検出された。

［実施例８］
ホスホケトラーゼ活性が増強された細菌のＬ−グルタミン酸生産能の評価
（８−１）十分量のビオチンを含有する条件下での評価
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ株を用いることによ
り、Ｌ−グルタミン酸の発酵収率に及ぼすホスホケトラーゼ遺伝子の導入の効果を評価した。ＣＭ−Ｄｅｘプレート培地上で培養することにより得られるＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９）株、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ｘｆｐ）株、ＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ）株及びＡＴＣＣ１３８６９ΔｓｕｃＡ（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｐｋＡ）株の細胞を、純水１Ｌ中に３０ｇのグルコース、１ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇのＭｇＳＯ₄、１５ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．０１ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．０１ｇのＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、１３．７ｍｌの大豆加水分解溶液、２００ｍｇの塩酸チアミン、３００μｇのビオチン及び５０ｇのＣａＣＯ₃（ＫＯＨでｐＨ８．０に調整）を含有するフラスコ中に接種し、糖が完全に消費されるまで、振盪しながら３１．５℃で培養した。培養終了後、培養ブロス中の蓄積Ｌ−グルタミン酸の量及びＯＤを測定した。結果を図８に示す。その結果、ｘｆｐ遺伝子が増幅された菌株すべてが対照と比較して高いＬ−グルタミン酸収率を示すということがわかる。

（８−２）ペニシリンが添加される場合の評価
等しい最終ＯＤのもとで評価するために、ペニシリンＧを添加することにより細胞の増殖を停止した。培養開始後にＯＤが１０〜１４の範囲内になった場合、その最終濃度が複数の増殖点で４Ｕ／ｍｌであるよう、上記（１）に記載したように培地にペニシリンＧを添加することにより、Ｌ−グルタミン酸の収率を比較した。結果を図９に示す。これらの結果は、それらの最終細胞数が等しくなった時点でＬ−グルタミン酸の収率をそれらの間で比較した場合でも、Ｌ−グルタミン酸収率は、対照株と比較して、ｘｆｐ遺伝子増幅株又はｘｐｋ遺伝子増幅株においてより高かった、ということを示す。上記の結果は、ホスホケトラーゼの導入がＬ−グルタミン酸発酵収率を改善するために有効である、ということを示す。

［実施例９］
パントエア・アナナティス株によるＬ−グルタミン酸蓄積に及ぼすビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子の発現の効果
ビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子を発現するｐＶＫ９−ＰＳ２−ｘｆｐプラスミド及び対照ｐＶＫ９シャトルベクターを、Ｂｉｏ−Ｒａｄマイクロパルサーを用いて電気穿孔により、ＮＰ１０６／ＲＳＦＣＰＧ Ｌ−グルタミン酸生産株に導入した。なお、ＮＰ１０６／ＲＳＦＣＰＧ株は、選択マーカーとしてクロラムフェニコールを含有しない培地上でＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７２０７；欧州特許公開第１０７８９８９号）をプレーティングすることにより、ＡＪ１３６０１株からｐＳＴＶＣＢプラスミドを除去して得られた。

ｐＶＫ９−ＰＳ２−ｘｆｐプラスミド又はｐＶＫ９ベクターでＮＰ１０６／ＲＳＦＣＰＧ株を形質転換し、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢＧ−Ｍ９培地（トリプトン（１０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、グルコース（５ｇ／Ｌ）、０．５×Ｍ９塩溶液）上で一晩培養することにより得られた細胞を、新鮮なＬＢＧ−Ｍ９培地により１：１００に希釈し、ＯＤ₅₉₅＝０．６になるまで通気しながら３４℃でインキュベートした。１０ｍｌの培養からの細胞を遠心分離により回収し、氷冷脱イオン水で及び氷冷１０％グリセロールで３回洗浄し、１０％グリセロール中に再懸濁した。１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液に添加し、電気パルス（Ｅ＝２０ｋＶ／ｃｍ、ｔ＝５ｍｓｅｃ）を適用した。１ｍｌのＬＢＧ−Ｍ９培地を、電気穿孔直後に添加した。細胞を２時間通気下で３４℃でインキュベートし、４０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する固体ＬＢＧ−Ｍ９培地上にプレーティングした。プレートを、３４℃で４８時間インキュベートした。増殖したクローンを、４０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢＧ−ＭＥＳ培地（トリプトン（１０ｇ／Ｌ）、酵母エキス（５ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、グルコース（５ｇ／Ｌ）、ＭＥＳ０．１Ｍ、ｐＨ７．０）２ｍｌ中に接種し、通気下で一晩、３４℃でインキュベートした。菌体を含有する一晩培養培地８０μｌを、試験管中の発酵培地（グルコース（４０ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．５ｇ／Ｌ）、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（１６ｇ／Ｌ）、ＫＨ₂ＰＯ₄（０．３ｇ／Ｌ）、ＫＣｌ（１．０ｇ／Ｌ）、ＭＥＳ（１０ｇ／Ｌ）、ベタイン（１．０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（１０ｍｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ（１０ｍｇ／Ｌ）、リジン、メチオニン及びＤＡＰ、各々１００ｍｇ／Ｌ、トリプトン（１ｇ／Ｌ）、酵母エキス（１ｇ／Ｌ）、パントテン酸カルシウム（１０ｍｇ／Ｌ）、ＣａＣＯ₃（３０ｇ／Ｌ））２ｍｌ中に接種し、通気しながら２６時間インキュベートした。蓄積Ｌ−グルタミン酸の量を、ＴＬＣ法により決定した。４つの個々の実験の平均データを表４に示す。

表４から分かるように、ｐＶＫ９−ＰＳ２−ｘｆｐプラスミドを保有する菌株は、ベクターｐＶＫ９で形質転換された対照株より約２．６ｇ／Ｌ高いＬ−グルタミン酸蓄積を示した。これは収率の少なくとも６％増加に相当する。

［実施例１０］
ホスホケトラーゼ活性向上と６−ホスホフルクトキナーゼ（PFK）活性弱化の組み合わせによるグルタミン酸発酵収率の向上
１０−１. sucA及びPFKの2重欠損株の作成
（１）pfk遺伝子欠損用プラスミドの構築
ATCC13869株由来のpfkのORFを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032 （GenBank Database Accession No.NC#003450：配列番号61）の該遺伝子の塩基配列を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたオーバーラップPCR 法で取得した。具体的にはC.glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号50、51の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いpfk遺伝子N末端側の増幅産物を得た。一方、pfk遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ATCC13869株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号52、53の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行った。配列番号51、53は互いに相補的である。
次に内部配列を欠失したpfk遺伝子断片を得るために、上記pfk N末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号54、55の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い遺伝子増幅産物を得た。PCR産物を常法により精製後BamH Iで消化し、上述のpBS5T のBamHI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS5T-Δpfkと命名した。

（２）欠損株の作成
まず、上述のATCC13869ΔsucA株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS5T-Δpfkを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄・7H₂O 0.4g/L、FeSO₄・7H₂O 0.01g/L、MnSO₄・7H₂O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、biotin 10 ug/L、pH7.5(NaOH)）に塗布し、25℃で約60時間培養した。得られた形質転換体をCM-Dex液体培地で34℃で1晩振とう培養し、適当に希釈した後、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、34℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのpfk遺伝子断片とATCC13869株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている株である。
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10培地（ショ糖 10g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄・7H₂O 0.4g/L、FeSO₄・7H₂O 0.01g/L、MnSO₄・4H₂O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ビオチン 10μg/L、酢酸ナトリウム2g/l pH7.5(KOH)）に塗布にし、34℃にて約30時間培養した。その結果、2回目の相同組み換えによりSacB遺伝子が脱落しシュークロース非感受性となったと考えられる株を得た。
この様にして得られた株の中には、そのpfk遺伝子がpBS5T-Δpfkに由来する欠損型pfk遺伝子に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。pfk遺伝子が欠損型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応にておこなった。欠損型pfk遺伝子のみを有する株を選抜しATCC13869ΔsucAΔpfkと命名した。

１０−２. 活性弱化PFKをコードする変異pfk遺伝子の取得
（１）活性の弱化した変異型PFK
活性の弱化したPFKとして、PFK*1(配列番号５７)及びPFK*2(配列番号５９)を得た。PFK*1は野生型PFK(配列番号６１)の171番目のグルタミン酸がリシンに置換されたものである。PFK*２は野生型PFK(配列番号６１)の171番目のグルタミン酸がアルギニンに置換されたものである。これらの配列は野生型PFK鋳型とし、変異導入した合成DNAをプライマーとしたクロスオーバーPCRにより取得することが出来る。

（２）変異pfk遺伝子およびホスホケトラーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
PFK発現ベクターを構築するため、C.glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、配列番号54、55の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いpfk遺伝子増幅産物を得た。PCR産物を常法により精製後Xba I及びKpn Iで消化しpfkを含む遺伝子断片を、上述のpVK9 のXba I及びKpn I部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/m
lおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の遺伝子が挿入されていたものをpVK9-PFKと命名した。
次にPFK及びホスホケトラーゼを同時に発現するプラスミドを構築するため、上述のpVK9-PS2_xfpをXbaIで消化後、PS2_xfpを含む断片を常法により精製し、上述のpVK9-PFKのXbaI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリDH5αのコンピテントセル（宝バイオ社製）に形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、PS2_xfpが挿入されていたものをpVK9-PS2_xfp_PFKと命名した。
変異型pfk遺伝子及びホスホケトラーゼ遺伝子を同時発現するプラスミドを構築するため、pVK9-PS2_xfp_PFK 構築と同様の手順で、pVK9-PS2_xfp_PFK*1及び pVK9-PS2_xfp_PFK*2を作成した。

（３）活性測定
上述のPFK及びホスホケトラーゼ発現プラスミド（pVK9-PS2_xfp_PFK、pVK9-PS2_xfp_PFK*1及び pVK9-PS2_xfp_PFK*2）を上述のATCC13869 ΔsucAΔpfk株に形質転換し、PFK酵素活性を検討した。形質転換は電気パルス法により行い、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄・7H₂O 0.4g/L、FeSO₄・7H₂O 0.01g/L、MnSO₄・7H₂O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、biotin 10 ug/L、pH7.5(NaOH)）に塗布し、31.5℃で約30時間培養することで得た。
粗酵素液の抽出は以下に示す方法で行った。対数増殖期の菌体を遠心分離により回収し、100mM KPi(pH8.2) バッファーで洗浄後、同バッファーに溶解し、超音波破砕した。超遠心(60000rpm 30min)にて可溶性画分を分離し粗酵素抽出液とした。粗酵素液のたんぱく質量を定量するための手順を以下に示す。粗酵素液及び検量線作成のための濃度既知のBSAをそれぞれCBB溶液(ナカライテスク プロテインアッセイCBB溶液)と反応し発色後、酵素活性測定装置（Molecular Divices, spectra max 190）でOD595 nm を測定した。
次に、従来の方法( Denise Kotlars and Henri Buc, Methods in Enzymology (1982) 90: 60-70)に従いPFKの酵素活性を測定した。具体的な手順を以下に示す。酵素活性反応は、100 mM Tris-HCl (pH8.2), 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1U/ml glycerol-3-phosphate dehydrogenase, 1U/ml triosephosphate isomerase, 1U/ml aldolase, 0.2 mM NADH, 10 mM fructose-6-phosphate, 粗酵素抽出液を混合後、酵素活性測定装置（Molecular Divices,
spectra max 190）でOD340 nmの経時変化測定した。野生型PFKの活性を1とした時の、弱化型PFKの相対活性を表５にまとめる。

１０−３． PFK活性弱化によるL-グルタミン酸収率向上
（１）ビオチン充分条件での評価
C.glutamicum ATCC13869ΔsucAΔpfk株を用い、PFK活性弱化によるL-グルタミン酸発酵収率への効果を評価した。CM-Dexプレート培地にて培養して生育した各菌株を、グルコース 30ｇ、KH₂PO₄ 1ｇ、MgSO₄ 0.4ｇ、(NH₄) ₂SO₄ 15ｇ、FeSO₄・7H₂O 0.01ｇ、MnSO₄・7H₂O 0.01ｇ、大豆加水分解液 13.7ml、サイアミン塩酸塩 200μｇ、ビオチン 300μｇ、及びCaCO₃ 50ｇを純水 1L中に含む培地（KOHを用いてpHは8.0に調整されている）において、31.5℃にて培養した。培養後に培地中のＬ−グルタミン酸の蓄積量及び菌体量（OD）を測定した。結果を図１０に示す。L-グルタミン酸収率は、野生型PFK発現株と比べて、PFK
弱化型発現株が高いことが明らかになった。

（２）ペニシリン添加下での評価
次に、上述の培地に培養開始後ODが10-14の適当な複数の時点でペニシリンＧを終濃度4U/mlになるように添加し、菌の増殖を止めることで最終菌体量をそろえてL-グルタミン酸の収率を比較した。結果を図１１に示す。
以上の結果は、ホスホケトラーゼの導入株においてPFKの弱化がL-グルタミン酸発酵収率の向上に有効であることを示している。

［実施例１１］
ホスホケトラーゼ活性が増強される細菌を用いたＬ−グルタミン生産の評価
ビフィドバクテリウム・フラバムＡＪ１１５７６株（特開昭５６−１６４７９号公報）を用いることにより、Ｌ−グルタミンの発酵収率の改善に及ぼすホスホケトラーゼ遺伝子の導入の作用を評価した。
ＡＪ１１５７６株は、ビタミンＰ活性を有する化合物に耐性である。この株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（郵便番号３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１−１中央第６））で、１９８０年５月６日に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ−０５５０２の寄託番号を付与された。次にそれは、ブダペスト条約の条項下で国際寄託に移管されて、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３８１の寄託番号を付与された。

ｐＶＫ９（対照のためのプラスミド）及びｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ（ネイティブプロモーターがＰＳ２プロモーターで置き換えらたビフィドバクテリウム・アニマリスのｘｆｐ遺伝子を増幅するためのプラスミド）を各々、上記のビフィドバクテリウム・フラバムＡＪ１１５７６株中に導入して、ホスホケトラーゼ発現株を得た。具体的には、菌株を、電気パルス法によりプラスミドの各々を用いて形質転換して、２５ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＣＭ２Ｇ培地（５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌのポリペプトン、１０ｇ／Ｌの酵母エキス、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、ＫＯＨでｐＨ７．０に調整）上にプレーティングし、３１．５℃で約３０時間培養した。出現したコロニーを形質転換体として単離し、そしてそれぞれＡＪ１１５７６（ｐＶＫ９）及びＡＪ１１５７６（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ）と名づけた。

ＣＭ２Ｇプレート培地上で培養することにより得られたＡＪ１１５７６（ｐＶＫ９）及びＡＪ１１５７６（ｐＶＫ９−ＰＳ２＿ｘｆｐ）の細胞を、純水１Ｌ中に１００ｇのグルコース、２．５ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇのＭｇＳＯ₄、６０ｇの（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０．０１ｇのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５．７ｍｌの大豆加水分解溶液、２ｍｇの塩酸チアミン、４μｇのビオチン、０．０２ｍｌのＧＤ−１１３及び５０ｇのＣａＣＯ₃（ＮａＯＨでｐＨ６．８に調整）を含有するフラスコ培地中に接種し、糖が完全に消費されるまで、振盪しながら３１．５℃で培養した。培養終了後、培養ブロス中の蓄積Ｌ−グルタミンの量及びＯＤを測定した。結果を図１２に示す。ｘｆｐ−遺伝子増幅株のすべてが、対照株と比較して高いＬ−グルタミン生産を示したことが示された。

本発明を、その好ましい実施形態を参照しながら詳細に説明してきたが、本発明の範囲を逸脱しない限り、種々の変更がなされ得るし、均等物が用いられ得ることは、当業者には明らかである。本明細書中に引用した参考文献はすべて、優先権文書、ＲＵ２００４１２４２２６及びＵＳ６０／６４４，５６２を含め、参照により本出願の一部として本明細書中で援用される。

ラクトバクテリウム・ペントスス及びラクトバクテリウム・プランタルムのＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼのアラインメントを示す（相同性９８．５％）図である。 プラスミドｐＢＳ３の構築手法を示す図である。 プラスミドｐＢＳ４Ｓの構築手法を示す図である。 プラスミドｐＢＳ５Ｔの構築手法を示す図である。 酢酸塩を含有する最少培地上のホスホケトラーゼ遺伝子増幅株及び対照株の増殖曲線を示す図である。 最少培地中のホスホケトラーゼ遺伝子増幅株及び対照株の増殖曲線を示す図である。 ホスホケトラーゼタンパク質を含有する細胞抽出物の電気泳動を示す図である（写真）。 ビオチン十分条件下でホスホケトラーゼ遺伝子増幅株を用いたＬ−グルタミン酸の生産を示す図である。 ペニシリンの添加を伴うホスホケトラーゼ遺伝子増幅株を用いたＬ−グルタミン酸の生産を示す図である。 ホスホケトラーゼ遺伝子が導入され、６−ホスホフルクトキナーゼ活性が低減された株を用いたＬ−グルタミン酸の生産を示す図である。 ホスホケトラーゼ遺伝子が導入され、６−ホスホフルクトキナーゼ活性が低減された株を用いたペニシリンの存在下でのＬ−グルタミン酸の生産を示す図である。 ホスホケトラーゼ遺伝子増幅株を用いたＬ−グルタミン（Ｇｌｎ）の生産を示す図である。

Claims (4)

1. Ｌ−グルタミン酸及びＬ−グルタミンからなる群から選択される有用な代謝産物の製造方法であって、腸内細菌科属細菌及びコリネ型細菌からなる群から選択される細菌をグルコース及び／又はスクロースを含む培地で培養すること、及び、該培地及び／又は該細菌から前記有用な代謝産物を採取することを含み、前記細菌は前記有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌であって、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子並びに／又はＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ活性及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のコピー数を増大させることまたは該遺伝子の発現調節配列を改変することによりＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及び／又はフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性が増大するように改変された細菌である、前記有用な代謝産物の製造方法。
2. 前記細菌が、本来的にＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼの活性を有さず、Ｄ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片、フルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片並びに／又はＤ−キシルロース−５−リン酸ホスホケトラーゼ活性及びフルクトース−６−リン酸ホスホケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片で形質転換された細菌である、請求項１記載の方法。
3. 前記細菌が６−ホスホフルクトキナーゼの活性が低減するようにさらに改変された細菌である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記細菌がエシェリヒア属又はパントエア属に属する細菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

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