JP5474448B2

JP5474448B2 - 変異バチルス属細菌

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Publication number: JP5474448B2
Application number: JP2009195857A
Authority: JP
Inventors: 富士夫河村; 英晃七宮; 生浩劉; 勝俊荒
Original assignee: RIKKYO EDUCATIONAL CORPORATION; Kao Corp
Current assignee: RIKKYO EDUCATIONAL CORPORATION; Kao Corp
Priority date: 2009-08-26
Filing date: 2009-08-26
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2029-08-26
Also published as: JP2011045281A

Description

本発明は、新規な変異バチルス属細菌、及び当該変異バチルス属細菌を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造に関する。

微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。

こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。

リボソームは、あらゆる生物の細胞内に存在する構造であり、ｍＲＮＡの遺伝情報を読み取ってタンパク質へと変換するプロセスである翻訳が行われる機構である。リボソームは大小２つのサブユニットからなり、各サブユニットはリボソームタンパク質とリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の複合体である。例えば枯草菌の場合、リボソームは他の細菌と同様に５０Ｓ及び３０Ｓサブユニットからなり（非特許文献１）、リボソーム全体としては５７種類のリボソームタンパク質と３種類のｒＲＮＡから構成されている。リボソーム中で、ｒＲＮＡは密に折り畳まれてコアを形成し、翻訳プロセスにおけるペプチド結合形成の触媒作用に中心的な役割を果たしている。一方、リボソームタンパク質は通常リボソーム表面に存在してｒＲＮＡの隙間を埋めており、主にＲＮＡコアの安定化に貢献している。リボソームの細胞における重要性からみて、ほとんどのリボソームタンパク質遺伝子は必須遺伝子と考えられている（非特許文献２）。

Nanamiyaら, J. Gen. Appl. Microbiol., 52: 249-258, 2006 Kobayashiら, Proc. Nat. Acad. Sci., 100: 4678-4683, 2003

本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性に優れた変異バチルス属細菌、及び変異バチルス属細菌を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供することに関する。

本発明者らは、バチルス属細菌から従来菌の生存に必須と考えられていたリボソームタンパク質遺伝子rpmB、rpmF及びrpmJから選択される遺伝子のいずれか１以上を欠失又は不活性化させることによって作製した変異株が、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性に優れていることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下を提供するものである。
（１）枯草菌リボソームタンパク質遺伝子rpmB、rpmF及びrpmJならびにそれらの遺伝子に相当するリボソームタンパク質遺伝子から選択される遺伝子のいずれか１以上が欠失又は不活性化されていることを特徴とする変異バチルス属細菌。
（２）（１）記載の変異バチルス属細菌に目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が導入された組換えバチルス属細菌。
（３）前記目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域が作動可能に結合された（２）記載の組換えバチルス属細菌。
（４）転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が作動可能に結合された（３）記載の組換えバチルス属細菌。
（５）分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域由来のものである（３）又は（４）記載の組換えバチルス属細菌。
（６）転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列からなるＤＮＡ断片、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片若しくは当該塩基配列のいずれかの一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である（３）〜（５）のいずれか１記載の組換えバチルス属細菌。
（７）前記目的タンパク質又はポリペプチドがセルラーゼである（２）〜（６）のいずれか１記載の組換えバチルス属細菌。
（８）枯草菌変異株である（１）記載の変異バチルス属細菌。
（９）組換え枯草菌株である（２）〜（７）のいずれか１記載の組換えバチルス属細菌。
（１０）（２）〜（７）及び（９）のいずれか１記載の組換えバチルス属細菌を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

本発明によれば、各種タンパク質又はポリペプチドの生産性に優れた変異バチルス属細菌が提供される。当該変異株を用いることによって、各種酵素等のタンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することが可能となる。

枯草菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例を示す模式図。

本発明の変異バチルス属細菌において欠失又は不活性化される遺伝子としては、枯草菌リボソームタンパク質遺伝子rpmB、rpmF及びrpmJが挙げられる。rpmB、rpmF及びrpmJはそれぞれ、枯草菌５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２８、Ｌ３２、及びＬ３６をコードする遺伝子であり、BSORF Bacillus subtilis Genome Databaseにおいて公開されている（http://bacillus.genome.ad.jp/、2006年1月18日更新)。

これら枯草菌リボソームタンパク質遺伝子rpmB、rpmF及びrpmJに相当するバチルス属細菌リボソームタンパク質遺伝子もまた、本発明の変異株において欠失又は不活性化される遺伝子として挙げられる。当該「相当する遺伝子」は、上記BSORF DBに公開されている野生型枯草菌のゲノム配列と、遺伝子の欠失又は不活性化に供する対象バチルス属細菌のゲノム配列とを比較し、当該野生株rpmB、rpmF及びrpmJ遺伝子に対応する５０Ｓリボソームタンパク質の遺伝子を同定することによって決定することができる。あるいは、当該「相当する遺伝子」は、枯草菌リボソームタンパク質遺伝子rpmB、rpmF及びrpmJと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の塩基配列同一性を有し、且つ５０Ｓリボソームタンパク質をコードするバチルス属細菌遺伝子である。

本発明において、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。

本発明の変異バチルス属細菌においては、枯草菌リボソームタンパク質遺伝子rpmB、rpmF及びrpmJならびにそれらの遺伝子に相当するリボソームタンパク質遺伝子から選択される遺伝子のいずれか１以上が欠失又は不活性化されていればよい。

本発明の変異バチルス属細菌を作製するための親微生物としては、枯草菌の遺伝子rpmB、rpmF若しくはrpmJ又はそれらの遺伝子に相当する遺伝子を有するバチルス属細菌が挙げられる。これらの親微生物は、野生型でも遺伝子工学的に改変されているものでもよい。親微生物の例としては、枯草菌（Bacillus subtilis）168株及びその変異株が挙げられる。

遺伝子の欠失又は不活性化は、標的遺伝子の一部若しくは全部をゲノム中から除去するか又は他の遺伝子と置き換える、当該遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、或いは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができる。好適には、当該遺伝子を物理的に欠失させる。より具体的には、rpmB、rpmF若しくはrpmJ、又は当該遺伝子に相当する遺伝子（以下、標的遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法、及びランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行って所望の変異を選択する方法が挙げられる。

標的遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のＤＮＡ断片等をＰＣＲ等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは他の遺伝子断片と置換させることによって不活性化させることが可能である。

例えば、枯草菌の標的遺伝子を相同組換えにより欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例がある（Mol. Gen. Genet., 223,268, 1990等）。枯草菌を親微生物とする場合、この方法に従って本発明の変異株を得ることができる。

また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についても、ランダムにクローニングしたＤＮＡ断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によって実施可能である。

以下に、遺伝子の欠失又は不活性化方法の具体例として、ＳＯＥ（splicing by overlap extension）−ＰＣＲ法（Gene, 77, 61, 1989)によって調製される欠失用ＤＮＡ断片を用いた二重交差による欠失方法について説明するが、本発明の変異株の作製に用いられる遺伝子欠失又は不活性化方法は下記に限定されるものではない。

欠失用ＤＮＡ断片は、例えば、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約１．０ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約１．０ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。

次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したＤＮＡ断片を得ることができる（図１）。以上のＰＣＲは、市販のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A. White, Humana Press pp251,1993、Gene, 77, 61, 1989)等に示される通常の条件により行うことができる。

かくして得られた遺伝子欠失用ＤＮＡ断片を、コンピテント法等の定法によって親微生物細胞内に導入すると、対応する欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域において、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換された細胞、或いは標的遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が生じ得る（図１）。これを薬剤耐性マーカーによる選択によって分離する。即ち、遺伝子導入した微生物を上記薬剤を含む寒天培地上で培養し、生育するコロニーを分離した後、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによってゲノム上の標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換されていることを確認すればよい。斯くして、標的遺伝子が欠失または不活性化された本発明の変異バチルス属細菌を得ることができる。

上記のとおり得られた変異バチルス属細菌に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を導入することによって、本発明の組換バチルス属細菌を作製することができる。ＤＮＡ断片の導入は、適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法を用いて上記変異株に取り込ませることによって行う。また、当該ＤＮＡ断片と上記変異株のゲノムの適当な相同領域とを結合させたＤＮＡ断片を構築し、それを当該変異株のゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換えバチルス属細菌を得ることができる。

本発明の組換えバチルス属細菌に導入される目的タンパク質又は目的ポリペプチドとしては、特に限定されず、例えば洗剤、食品、飼料、繊維、化粧品、化学品、医療、診断など各種産業用酵素で利用されるタンパク質、酵素、生理活性ペプチドなどが挙げられる。このうち産業用酵素が好ましい。産業用酵素としては、酸化還元酵素（Oxidoreductase）、転移酵素（Transferase）、加水分解酵素（Hydrolase）、脱離酵素（Lyase）、異性化酵素（Isomerase）、合成酵素（Ligase/Synthetase）等が挙げられる。好適には、セルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)等の転移酵素が挙げられ、より好適には、セルラーゼが挙げられる。

セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309, 1991）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、好ましくはバチルス属細菌由来のセルラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、セルラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。

α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、好ましくはバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のアルカリアミラーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アミラーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号５で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アミラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。

プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、好ましくはバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が好適に挙げられる。より具体的な例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるバチルスクラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株(FERM BP-3376)由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。

クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)は、アセチル−ＣｏＡのアセチル基をクロラムフェニコールの３位に転移する酵素である。具体的には、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるStaphylococcus aureus由来のＣＡＴや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。

上記、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、上記「付加」には、アミノ酸配列の一末端及び両末端へのアミノ酸の付加が含まれる。

本発明の組換えバチルス属細菌に導入される目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域と作動可能に結合されていることが好ましい。より好ましくは、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子の上流に作動可能に結合されている。更に好ましくは、分泌シグナルペプチド領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子の上流に作動可能に結合されている。本明細書において「作動可能に結合」とは、目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が、当該制御領域による制御の下に発現し得るように結合されていることをいう。

例えば、本発明の組換えバチルス属細菌に導入される目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子は、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域と作動可能に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に結合されていることが望ましい。あるいは、上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ、又は上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなり、且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に結合されていることが望ましい。

上記、「塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片」とは、塩基配列の一部、好ましくは数個（例えば、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個）の塩基を欠失しているＤＮＡ断片を意味する。また本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば[Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition(Sambrookら、1989)]に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。

本発明の組換えバチルス属細菌を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、当該目的タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。培養に使用される培地の組成及び培養条件、目的タンパク質又はポリペプチドの採取及び精製等の手順については、使用する組換えバチルス属細菌の種類や目的タンパク質又はポリペプチドの種類等にしたがって、当業者が適宜選択することができる。

後記実施例に示すように、rpmB、rpmF又はrpmJを欠失又は不活性化している本発明の組換えバチルス属細菌を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産性は、当該遺伝子を欠失又は不活性化していない微生物を用いた場合と比較して顕著に向上する。

以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１本発明変異株の作製
１）方法
図１に基づいて、枯草菌１６８株を用いてゲノム中rpmB、rpmF、及びrpmJ遺伝子の単独欠失株の構築方法を説明する。尚、rpmB、rpmF、及びrpmJ遺伝子は枯草菌のリボソームタンパク質をコードする遺伝子である。

以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、BSORF Bacillus subtilis Genome Databaseにおいて公開されている（http://bacillus.genome.ad.jp/、2006年1月18日更新)。

本実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）と、LA Taq DNA Polymerase（タカラバイオ）及び付属の試薬類とを用いた。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡ０.５μＬ、センス及びアンチセンスプライマーを各々５０ｐｍｏｌ及びLA Taq DNA Polymerase ２．５Ｕ、及び精製水であり、反応液総量は５０μＬとした。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で１分間、５５℃で１分間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を２５回繰り返すことにより行った。

また、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作又は工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作又は工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの３’側に続く領域を示す。

枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をＣＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０３％アミケース（SIGMA）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５０μｇ／ｍｌトリプトファン）において３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が１程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部（０．５ｍＬ）を分取し、遠心分離にて菌体のみを回収後、１ｍＬのＣＩＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０１５％アミケース（SIGMA）、５ｍＭ塩化マグネシウム、５μｇ／ｍｌトリプトファン）に菌体を再懸濁することで、枯草菌株のコンピテントセル懸濁液を調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液１００μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）を最終濃度が１５μｇ／ｍｌ以上となるよう添加し、３７℃で９０分間振盪培養後、１００μＬのＬＢ液体培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）を加え、３７℃で１時間振盪培養を行った。その後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に培養液１０μＬもしくは１００μＬを塗沫した。３７℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。

２）rpmB、rpmF、及びrpmJ遺伝子の単独欠失株の構築
rpmB欠失株の構築方法を説明する。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示したrpmBUf及びrpmBUrのプライマーセット（配列番号８、９）を用いて、ゲノム中のrpmB遺伝子の上流に隣接する０．５ｋｂ断片（Ａ）をＰＣＲにより増幅した。また、上記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、rpmBDf及びrpmBDrのプライマーセット（配列番号１０、１１）を用いて、ゲノム中のrpmB遺伝子の下流に隣接する０．７ｋｂ断片（Ｂ）をＰＣＲにより増幅した。
さらに、プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150(2), 815 (1982)）ＤＮＡを鋳型とし、表１に示したＣＡＴＦ及びＣＡＴＲのプライマーセット（配列番号１２、１４）を用いて、０．９ｋｂのクロラムフェ二コール（Ｃｍ）耐性遺伝子（ｃａｔ）領域（Ｃ）をＰＣＲにより調製した。
次に、図１に示すように、得られた０．５ｋｂ断片（Ａ）、０．７ｋｂ断片（Ｂ）及びＣｍ耐性遺伝子領域（Ｃ）の３断片を混合して鋳型として、表１に示したrpmBUf及びrpmBDrのプライマーセット（配列番号８、１１）を用いたＳＯＥ−ＰＣＲ法によって、３断片が０．５ｋｂ断片（Ａ）、Ｃｍ耐性遺伝子領域（Ｃ）、０．７ｋｂ断片（Ｂ）の順に含まれる２．１ｋｂのＤＮＡ断片（Ｄ）を得た。
尚、ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液組成は、各鋳型ＤＮＡ０．０５ μg、センス及びアンチセンスプライマーを各々５０ｐｍｏｌ及びLA Taq DNA Polymerase ２．５Ｕ、及び精製水であり、反応液総量は５０μＬとした。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分間反応させた後、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間及び６８℃で４分間の３段階の温度変化を２５回繰り返すことにより行った。

得られたＤＮＡ断片（Ｄ）を用いて、コンピテントセル形質転換法によって168株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェ二コール（５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによってrpmB遺伝子がＣｍ耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、rpmB遺伝子欠失株（ｒｉｋ７株）を構築した。

上述した手順と同様に、Ｃｍ耐性遺伝子に置換することによりrpmF遺伝子欠失株（ｒｉｋ１１株）及びrpmJ遺伝子欠失株（ｒｉｋ１６株）をそれぞれ構築した。ただし、rpmJ遺伝子を欠失する際、ｃａｔ遺伝子の増幅にはＣＡＴＦの代わりにＣＡＴ−Ｆ２プライマー（配列番号１３）を用いた。ｒｉｋ７株及びｒｉｋ１１株の作製では、プロモーターとｃａｔのＯＲＦ配列を含む遺伝子領域を用いている一方、ｒｉｋ１６株ではｃａｔのＯＲＦ配列およびその上流のＳＤ配列領域のみを含む遺伝子領域を増幅している。rpmJ遺伝子はオペロン構造をなしているため、下流遺伝子発現への極性効果の影響を排除するためである。各菌株の構築には表１に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとｒｉｋ７株の構築に用いたプライマーとの対応を表２に示した。

実施例２本発明変異株のタンパク質生産性評価
１）アルカリセルラーゼ分泌生産評価
リボソームタンパク質遺伝子の欠損株ｒｉｋ７、ｒｉｋ１１、ｒｉｋ１６及び対照として枯草菌１６８株の異種タンパク質生産性評価を、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
すなわち、バチルスエスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の断片（３．１ｋｂ）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。このＰＣＲ反応では、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡ（ＫＳＭ−Ｓ２３７株のゲノムＤＮＡ）を１μＬ、237UB1プライマー（5’-TGCGGATCCAACAGGCTTATATTTAGAGGAAATTTC：配列番号２３）および237DB1プライマー（5’-TTGCGGATCCAACAACTCTGTGTCCAGTTATGCAAG：配列番号２４）を各々２０ｐｍｏｌ及びPyrobest DNA Polymeraseを２．５Ｕ添加して、反応液総量を５０μＬとした。ＰＣＲの反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で３分間の３段階の温度変化を３０回繰り返した後、７２℃で５分間反応させることにより行った。

増幅したＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ制限酵素処理し、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入した組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を、プロトプラスト形質転換法（Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)）によって各菌株に導入した。これによって得られた組換え菌株を１０ｍＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）で一夜３７℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。

セルラーゼ活性測定については、１／７．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光純薬）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｃｅｌｌｏｔｒｉｏｓｉｄｅ（生化学工業）を５０μＬ加えて混和し、３０℃にて反応を行った際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとした。
アルカリセルラーゼ活性測定の結果は表３に示した。宿主としてrpmB、rpmF及びrpmJの欠損株ｒｉｋ７、ｒｉｋ１１及びｒｉｋ１６を用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較してアルカリセルラーゼの分泌生産がそれぞれ１１０％、１２２％及び１２２％向上した。

Claims

枯草菌リボソームタンパク質遺伝子rpmB、rpmF及びrpmJ、ならびにそれらの遺伝子と９０％以上の塩基配列同一性を有し、５０Ｓリボソームタンパク質をコードするバチルス属細菌遺伝子から選択される遺伝子のいずれか１以上が欠失又は不活性化されており、且つ目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子が発現可能に導入されており、
該目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が作動可能に結合されており、
該３領域が、配列番号１の塩基番号１〜６５９で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、配列番号３の塩基番号１〜６９６で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は該ＤＮＡ断片のいずれかと９０％以上の塩基配列同一性を有するＤＮＡ断片である、
組換えバチルス属細菌。
前記目的タンパク質又はポリペプチドがセルラーゼである請求項１記載の組換えバチルス属細菌。
組換え枯草菌株である請求項１又は２記載の組換えバチルス属細菌。
請求項１〜３のいずれか１項記載の組換えバチルス属細菌を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。