JP5423408B2 - 質量分析方法及び質量分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、イオントラップ質量分析装置等、ＭＳ^ｎ分析（ｎ≧２の整数）が可能な質量分析装置を用いた質量分析方法、及び該方法を実施するための質量分析装置に関する。

糖鎖やペプチドなどの高分子化合物の構造解析を行う際には、３次元四重極型イオントラップを搭載した質量分析装置によるＭＳ^ｎ分析が有用である（非特許文献１など参照）。こうしたイオントラップ質量分析装置を用いた高分子化合物に対する従来の一般的な分析手法は次の通りである。

即ち、分析目的である化合物をイオン化してイオントラップ内に捕捉したあと、まず、特定の質量電荷比（m/z）を有するイオンをプリカーサイオンとして選択的にイオントラップ内に残し、他の不要なイオンをイオントラップ外部に排出するようなイオン選択操作を行う。その後、イオントラップ内に衝突誘起解離（Collision-Induced Dissosiation：ＣＩＤ）ガスを導入し、選択的に残したプリカーサイオンを励振させてＣＩＤガスに衝突させることで解離を促す。場合によっては、１回のＣＩＤ操作では目的とする構造体が十分に解離しないため、プリカーサイオンの選択とＣＩＤ操作とを複数回繰り返すこともある。そうして分析対象の化合物由来のイオンに対し１回以上のＣＩＤ操作を行うことで細かく断片化させたプロダクトイオンについて、質量走査を伴うイオンの検出を実行してマススペクトル（ＭＳ^ｎスペクトル）を取得し、このマススペクトルを解析して化合物の構造を推定する。

このようなＭＳ^ｎ分析において、目的化合物に脱離し易い修飾物や官能基が含まれていると、分析の過程でそれらが優先的に脱離してしまい、他の結合部位が切れることによるプロダクトイオンの生成効率が低下する。そのため、目的化合物の構造が十分に反映されたマススペクトルが得られず、正確な構造解析に支障をきたすという問題がある。こうした現象は特に、１価イオンが生成し易いＭＡＬＤＩイオン源を用いた質量分析において低エネルギーＣＩＤ（イオンに運動エネルギーを付与するための加速電圧が数Ｖ〜数十Ｖ程度であるようなＣＩＤ）を利用した場合に顕著である。

例えばＭＡＬＤＩイオン源を用いたイオントラップ質量分析装置において、酸性糖の一種であるシアル酸が結合している糖鎖やシアル酸結合糖鎖が付加した糖ペプチドを低エネルギーＣＩＤで解離させると、シアル酸が優先的に脱離することが知られている。しかしながら、こうしたシアル酸の脱離はＣＩＤの過程のみならず、インソース分解やクーリングガスとの衝突によっても容易に生じるため、ＣＩＤ操作を伴わない通常の質量分析でも、シアル酸の一部や全てが脱離したイオンのピークが観測される（非特許文献２など参照）。

そこで、このような化合物に対して、一般的には次のような手順でＭＳ^ｎ分析を利用した構造解析が行われる。図５はこの手順を説明する模式図である。
いま、分析対象である化合物分子Ａは脱離し易い修飾物ａを３個有しているものとする（図５（ａ）参照）。ここでは、この修飾物ａとしてシアル酸を想定しているが、修飾物ａはこれに限らないことは後述の説明で明らかである。

化合物分子ＡをＭＡＬＤＩイオン源でイオン化した場合、特段にＣＩＤ操作を行わなくてもシアル酸が容易に離脱してしまう。このため、生成されたイオンを捕捉するイオントラップの内部には、シアル酸が脱離していないイオン［Ｍ＋Ｈ］^＋、１個のシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋、２個のシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋、 ３個の（全ての）シアル酸が脱離したイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋、という化合物分子Ａ由来の４種のイオンが主として捕捉される（図５（ｂ）参照）。なお、図５（ｂ）では、説明を簡単にするために４種のイオンを１個ずつ記載しているが、これらイオンが同比率で生成されることを意味するものではなく、その生成比率は化合物の構造や分析条件などに依存する。

シアル酸を含む化合物の構造を解析するには、本来、シアル酸も含めた構造情報を得る必要がある。しかしながら、上述したようにシアル酸付加化合物分子をＣＩＤにより開裂させるとシアル酸脱離イオンが優位に生成するため、他の部位の開裂に由来するプロダクトイオンは得にくくなる。そこで、最終的にはＭＳ^ｎ分析でシアル酸が全て脱離したイオンをＣＩＤにより開裂させる必要がある。そのため、シアル酸が全て脱離したイオンが検出されている場合には、そのイオンを直接ＣＩＤにより開裂させることが一般的に行われている。

そこで、通常、上述したようにイオントラップ内に捕捉されている化合物分子Ａ由来の４種のイオンのうち、全てのシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋をプリカーサイオンとして選別し、他のイオンをイオントラップ内から排除するようにイオン選択操作を行う。そのあとにイオントラップ内にＣＩＤガスを導入し、残しておいたイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋をＣＩＤにより解離させる（図５（ｃ）参照）。これにより、イオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋が分裂した各種のプロダクトイオンが生成されるから、このプロダクトイオンに対し質量走査を行いつつイオンを検出することによりマススペクトルを取得する（図５（ｄ）参照）。このマススペクトルには各種プロダクトイオンのピークが現れるから、これに基づいて、糖鎖結合部位、アミノ酸配列など、シアル酸を除く糖鎖組成を推定する。
このように全てのシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋をプリカーサイオンとしたＭＳ^ｎ分析を行うことにより、化合物分子Ａの構造解析に有用な情報を得ることができる。

しかしながら、上述した従来の手法では、イオン化後にイオントラップ内に捕捉されているイオンの中で、シアル酸が含まれているイオンはイオン選択操作の際に廃棄されてしまい、これらイオンは実質的に分析に利用されないことになる。そのため、全てのシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋の生成割合が非常に高く、それ以外のイオンの生成割合が無視できる程度であれば何ら問題はないが、そうでないと無駄に試料由来のイオンを捨ててしまうことになり、構造情報を得るための各種プロダクトイオンの検出感度を下げる大きな要因となる。

１つの実例として、シアル酸結合糖鎖が付加した糖ペプチドの一種であるウシフェツイン（Bovine fetuin）由来糖ペプチド（Ｆｅｔ−ＧＰ３）を試料としてＭＡＬＤＩデジタルイオントラップ質量分析装置で測定した結果を示す（なお、デジタルイオントラップ質量分析装置については特許文献１、２など参照）。ＭＡＬＤＩ用のマトリックスは、１０mM ammonium phosphateを含む3-aminoquinoline/a-Cyano-4-hydroxycinnamic acidである。

図６はＦｅｔ−ＧＰ３の概略構造を示す図である。Ｆｅｔ−ＧＰ３は３個のシアル酸を含み、図５（ａ）に示した化合物分子Ａに相当する。図７は、Ｆｅｔ−ＧＰ３に対しＣＩＤ操作を伴わない通常の質量分析で得られるマススペクトルである。この図をみると、全てのシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋以外の３種のイオンが、かなり高い強度で存在していることが分かる。上記のような分析手法では、試料由来のこうしたイオンが分析に利用されないために、構造情報を含むプロダクトイオンの検出感度が上がりにくいことが容易に想像できる。そうしたマススペクトルの感度の低さにより、構造解析が困難になって効率が下がるとともに解析の精度も低下するおそれがある。

特表２００５−５１２２７６号公報 特表２００３−５１２７０２号公報

山田、福山、「ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦＭＳによるタンパク質糖鎖修飾解析」、島津評論、島津評論編集部、第６３巻、第１・２号、２００６年９月２９日発行、ｐ．６７−７１ 関谷、飯田、「質量分析による糖鎖解析」、トレンズ・イン・グリコサイエンス・アンド・グリコテクノロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnology）、第２０巻、第１１１号、２００８年１月、ｐ．５５−６５

本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、脱離し易い修飾物や官能基などが存在する高分子化合物の構造解析を行うに際し、構造解析に有用な情報を含むマススペクトルを高い検出感度で得ることができる質量分析方法及び質量分析装置を提供することである。

上記課題を解決するために成された第１発明は、イオンを捕捉しつつ解離させることが可能なイオン保持手段を具備する質量分析装置を用いた質量分析方法であって、前記イオン保持手段に捕捉されている解離操作対象である第１のイオン種が、同時に該イオン保持手段に捕捉されている第２のイオン種の解離で生成されるプロダクトイオンと同一種であるとき、
a)第２のイオン種に対し質量電荷比に応じたイオン選別操作を行うことなく解離操作を行うことにより、その解離操作の前から前記イオン保持手段に存在する第１のイオン種を該イオン保持手段に捕捉し続けつつ、第２のイオン種由来のプロダクトイオンである第１のイオン種を新たに生成させる予備的解離ステップと、
b)前記予備的解離ステップにより新たに生成された第１のイオン種を、該予備的解離ステップにおいて捕捉し続けていた第１のイオン種に加えて捕捉し、それら第１のイオン種をプリカーサイオンとして質量電荷比に応じて選別した上で解離させる主解離ステップと、
を実行することを特徴としている。

上記第１発明に係る質量分析方法では、イオン保持手段に捕捉されている解離操作対象である第１のイオン種が、同時に該イオン保持手段に捕捉されている第２のイオン種の複数段階の解離で生成されるプロダクトイオンと同一種であるときには、上記予備的解離ステップにおいて、第２のイオン種に対し質量電荷比に応じたイオン選別操作を行うことなく解離操作を行うことにより、その解離操作の前から前記イオン保持手段に存在する第１のイオン種を該イオン保持手段に捕捉し続けつつ、第２のイオン種由来のプロダクトイオンを新たに生成させ、次に、該プロダクトイオンに対し質量電荷比に応じたイオン選別操作を行うことなく解離操作を行うことにより、その解離操作の前から前記イオン保持手段に存在する第１のイオン種を該イオン保持手段に捕捉し続けつつ、第２のイオン種由来のさらに小さな質量電荷比を有するプロダクトイオンを新たに生成させる、という操作を複数回繰り返すことにより、第２のイオン種由来の第１のイオン種を新たに生成させることを特徴としている。

第１発明に係る質量分析方法における分析対象の化合物は、典型的には、イオン化の過程やイオン源からイオン保持手段までイオンが輸送される過程で容易に脱離する修飾物や官能基が基幹的構造部に対し１乃至複数結合している化合物である。具体的には、こうした修飾物・官能基としてシアル酸、硫酸基、リン酸基などを挙げることができる。例えば、こうした脱離し易い修飾物・官能基が全て脱離した状態の目的化合物由来のイオンが上記第１のイオン種であり、修飾物・官能基が全く脱離していない状態又は少なくとも１つは脱離せずに残っている状態の目的化合物由来のイオンが上記第２のイオン種である。

第１発明に係る質量分析方法において、予備的解離ステップは、脱離し易い修飾物・官能基を除いた基幹的構造部のイオンを増量するための解離操作を行うものである。即ち、従来であれば、特定の質量電荷比を有するイオンのみをイオン保持手段に残すようなイオン選別操作を実行したあとに解離操作を実行するのに対し、本発明における予備的解離ステップでは、イオン選別操作を実行せずに第２のイオン種に対する解離操作を実行する。このとき、第１のイオン種はそのままイオン保持手段に残るため、第２のイオン種が解離することで新たに生成された第１のイオン種の分だけ、第１のイオン種の量が増えることになる。これにより、主解離ステップでイオン選別操作及び解離操作の対象となるプリカーサイオンの量が増えるため、その解離によって生成される各種プロダクトイオンの量も増える。

したがって、例えば主解離ステップにより生成されたプロダクトイオンに対して質量分析・イオン検出を行う場合に、各プロダクトイオンの信号強度が高くなり、高い感度のマススペクトルを取得することができる。つまり、マススペクトル上で各ピークの強度が従来よりも上がるとともに、従来では検出できなかった（例えばノイズに埋もれていた）微量のプロダクトイオンも検出できるようになりピークに反映される。その結果、構造解析が行い易くなり効率化が図れるとともに、解析精度も向上する。

もちろん、主解離ステップにより生成されたプロダクトイオンの１つを再びプリカーサイオンとして設定して解離操作を行う或いはそれを複数回繰り返し、より一層小さな質量電荷比のプロダクトイオンを生成して、該プロダクトイオンについて質量分析・イオン検出を行うようにしてもよい。このような分析により得られるマススペクトル（ＭＳ^ｎスペクトル）についても従来より高感度となるから、構造解析に有利であることは上記と同様である。

第１発明に係る質量分析方法を適用可能な質量分析装置としては様々な態様を採り得る。質量分析装置に含まれる上記イオン保持手段は、イオンを捕捉する機能とイオンを解離させる機能とを有する。イオンを捕捉するためには電場又は磁場を利用することができ、電場を利用したものとしてイオントラップ（３次元四重極型又はリニア型）が挙げられ、磁場を利用したものとしてサイクロトロン共鳴型試料セルが挙げられる。また、イオンを解離させる手法としては、予備的解離ステップで第２のイオン種を解離する際に基幹的構造部まで分裂させることがないような比較的ソフトな解離手法が好ましい。こうしたことから、ＣＩＤ（低エネルギーＣＩＤ）や赤外多光子吸収解離（Infrared Multi-Photon Dissosiation：ＩＲＭＰＤ）が有用である。

典型的には、上記イオン保持手段は、３次元四重極型イオントラップ、その内部にＣＩＤガスを供給するガス供給部、イオントラップの各電極（リング電極、エンドキャップ電極）を駆動する駆動回路部、などを含むものとすることができる。この場合、主としてリング電極に印加される電圧（周波数及び／又は振幅）に応じてイオントラップ内に捕捉されるイオンの質量電荷比又はその範囲が決まり、エンドキャップ電極に印加される電圧（周波数及び／又は振幅）に応じて共鳴励振される（つまりＣＩＤのための運動エネルギーを付与される）イオンの質量電荷比又はその範囲が決まる。したがって、イオントラップ内にＣＩＤガスを導入した上で各電極に印加する電圧を適宜に決めることにより、予備的解離ステップにおけるイオン選別操作なしの解離操作を実施することができる。また、イオントラップ内にＣＩＤガスを導入せずに各電極に印加する電圧を適宜に決めることにより主解離ステップにおけるイオン選別操作を実施し、引き続いてイオントラップ内にＣＩＤガスを導入して各電極に印加する電圧を適宜に変更することにより、主解離ステップにおけるイオン選別操作後の解離操作を実施することができる。

即ち、第１発明に係る質量分析方法を実施するための第２発明に係る質量分析装置は、目的とする化合物をイオン化し、そのイオンに対する１乃至複数段階の解離により生成されたプロダクトイオンを質量分析する質量分析装置において、
a)電場又は磁場の作用によりイオンを捕捉するイオン捕捉手段と、該イオン捕捉手段に捕捉されているイオンを解離させるイオン解離手段と、を含むイオン保持手段と、
b)前記イオン捕捉手段に捕捉されている解離操作対象である第１のイオン種が、同時に該イオン捕捉手段に捕捉されている第２のイオン種の解離で生成されるプロダクトイオンと同一種であるとの条件の下で、第１のイオン種を前記イオン捕捉手段に捕捉し続けつつ、第２のイオン種由来のプロダクトイオンである第１のイオン種を新たに生成させるべく、第２のイオン種に対し質量電荷比に応じたイオン選別操作なしに該イオンを解離させるように前記イオン捕捉手段及び前記イオン解離手段の動作を制御するとともに、新たに生成された第１のイオン種を、その生成以前から捕捉し続けていた第１のイオン種に加えて捕捉し、それら第１のイオン種をプリカーサイオンとして質量電荷比に応じて選別した上で解離させるように前記イオン捕捉手段及び前記イオン解離手段の動作を制御する制御手段と、
を備えることを特徴としている。

第２発明に係る質量分析装置の好ましい一態様として、前記イオン捕捉手段は３次元四重極型のイオントラップ及びそのイオントラップを構成する各電極にイオン捕捉用の電圧を印加する駆動回路を含み、イオン解離手段はイオントラップ内にＣＩＤガスを導入するガス供給部及びＣＩＤ対象のイオンにエネルギーを付与するべくイオントラップを構成する各電極に励振用の電圧を印加する駆動回路を含むものとすることができる。当然のことながら、イオン捕捉手段とイオン解離手段の駆動回路は共通であって、その制御の切替えによって発生する電圧を変化させるものとすることができる。

また第２発明に係る質量分析装置の別の態様として、３次元四重極型イオントラップに代えてリニア型イオントラップを用いるようにしてもよい。また、電場によりイオンを捕捉するイオントラップに代えて、磁場によりイオンを捕捉するサイクロトロン共鳴型試料セルを用いてもよい。またイオン解離手段は、ＩＲＭＰＤを行うためにイオン捕捉空間に赤外光を照射する光源を含むものとしてもよい。それ以外にも、上記のように第１発明に係る質量分析方法で採り得る様々な手法に対応した手段を採用できることは明らかである。

なお、第１発明に係る質量分析方法及び第２発明に係る質量分析装置において、プロダクトイオンに対する質量分析・イオン検出は、イオントラップ等、イオン捕捉手段自体の質量選択機能を利用して行うようにしてもよいが、イオン捕捉手段の外部に飛行時間型質量分析器などの質量分析器を別途設け、イオン捕捉手段に捕捉していたイオンに運動エネルギーを与えることより一斉に吐き出して外部の質量分析器に導入し、そこで質量分析・イオン検出を行うようにしてもよい。

本発明に係る質量分析方法及び質量分析装置によれば、脱離し易い修飾物や官能基が基幹的構造部に対し１乃至複数結合している化合物を質量分析（ＭＳ^ｎ分析）する際に、従来よりも高い感度のマススペクトルを取得することができる。これにより、マススペクトルを利用した構造解析が行い易くなりその解析作業の効率化が図れるとともに、解析精度も向上する。

本発明の一実施例であるイオントラップ質量分析装置の全体構成図。 本実施例の質量分析装置における特徴的な分析動作の処理手順を示すフローチャート。 本実施例の質量分析装置における特徴的な分析手法を説明するための模式図。 Ｆｅｔ−ＧＰ３に対してイオン選択を伴わないＣＩＤを順次実行したときに得られるマススペクトルの実測例を示す図。 従来の分析手法を説明するための模式図。 実測で用いたＦｅｔ−ＧＰ３の概略構造を示す図。 Ｆｅｔ−ＧＰ３のマススペクトルの実測例を示す図。

本発明に係る質量分析方法の分析手順を、既に説明した図５に対応する図３の模式図を参照しつつ説明する。ここでは、図５と同様に、脱離し易い修飾物ａとしてシアル酸を有する化合物分子Ａを分析対象として考える（図３（ａ）参照）。

この化合物分子Ａを例えばＭＡＬＤＩイオン源でイオン化すると、上述したようにシアル酸は離脱し易いため、イオントラップ内には、シアル酸が脱離していないイオン［Ｍ＋Ｈ］^＋、１個のシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋、２個のシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋ ３個の（全ての）シアル酸が脱離したイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋ 、という化合物分子Ａ由来の４種のイオンが捕捉される（図３（ｂ）参照）。これは従来と同じである。

次に、質量電荷比に応じたイオン選択操作を行うことなく、シアル酸が脱離していないイオン［Ｍ＋Ｈ］^＋に対するＣＩＤ（低エネルギーＣＩＤ）操作を実行する。即ち、ＣＩＤ対象であるイオン［Ｍ＋Ｈ］^＋以外の３種のイオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋、［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋、［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋をイオントラップから排出することなく捕捉し続けたまま、イオン［Ｍ＋Ｈ］^＋のみを励振させてＣＩＤガスに衝突させ、解離を促す。このＣＩＤによりイオン［Ｍ＋Ｈ］^＋からシアル酸が脱離する。一部のイオンからは２個以上のシアル酸が脱離するが、ここでは１個のシアル酸の脱離のみを考えることとする。すると、イオントラップ内において、シアル酸が脱離していないイオン［Ｍ＋Ｈ］^＋は消滅し、その代わりに１個のシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋の数が増加する（図３（ｃ）参照）。

次に、質量電荷比に応じたイオン選択操作を行うことなく、１個のシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋に対するＣＩＤ（低エネルギーＣＩＤ）操作を実行する。即ち、ＣＩＤ対象であるイオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋以外の２種のイオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋、［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋をイオントラップから排出することなく捕捉し続けたまま、イオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋のみを励振させてＣＩＤガスに衝突させ、解離を促す。このＣＩＤ操作によりイオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋からシアル酸が脱離する。２個のシアル酸が脱離することもあるが１個のシアル酸の脱離のみを考えると、イオントラップ内において、１個のイオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋ は消滅し、その代わりに２個のシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋の数が増加する（図３（ｄ）参照）。

さらに、質量電荷比に応じたイオン選択操作を行うことなく、２個のシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋に対するＣＩＤ（低エネルギーＣＩＤ）操作を実行する。即ち、ＣＩＤ対象であるイオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋以外のイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋をイオントラップから排出することなく捕捉し続けたまま、イオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋のみを励振させてＣＩＤガスに衝突させ、解離を促す。このＣＩＤ操作によりイオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋からシアル酸が脱離する。その結果、イオントラップ内において、イオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋は消滅し、その代わりに全てのシアル酸が脱離したイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋の数が増加する（図３（ｅ）参照）。

理想的には、図３（ｂ）に示した、初期的にイオントラップ内に捕捉されている化合物分子Ａ由来の４種のイオン全てが１種のイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋に変化し、その４種のイオンの総量が集約される１種のイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋の量と等しくなる。ただし、現実的には、低エネルギーＣＩＤが実行される際にイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋の一部が解離されてより小さな質量電荷比のイオンに分裂するため、元の４種のイオン全てがイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋となるわけではない。それでも、図３（ｂ）の状態のときに存在していたイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋の量に比べると、図３（ｅ）では遙かに同イオンの量が増えることになる。

以上のように、分析対象の化合物分子Ａ由来であって、シアル酸が全て脱離したイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋をイオントラップ内で十分に増量した後に、このイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋をプリカーサイオンとして選択的にイオントラップ内に残すようにイオン選択操作を実行し、その後にそのプリカーサイオンを対象とするＣＩＤ操作を実行する。これにより、シアル酸を除いた化合物分子Ａの主要な構造部分が分裂し、重要な構造情報を含む様々なプロダクトイオンが生成される（図３（ｆ）参照）。この各種プロダクトイオンについて質量走査を実行して質量電荷比の順にイオンを検出し、その検出信号に基づいてマススペクトルを作成する（図３（ｇ）参照）。

上述したようにプリカーサイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋の量が従来よりも多いことによって、生成される各種プロダクトイオンの量も多くなる。その結果、マススペクトルに現れる各ピークの信号強度が高くなるとともに、従来であれば検出できなかったような微量のプロダクトイオンも検出されるようになる。各ピークの位置つまり質量電荷比や、信号強度つまり量は構造解析に有用な情報であるから、これにより、従来よりも構造解析が容易になり構造解析の精度も向上する。

なお、［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋をプリカーサイオンとする１回のＣＩＤ操作を行うのではなく、２回以上のＣＩＤ操作、つまりはｎが３以上のＭＳ^ｎ分析を実行するようにしてもよい。

上記説明は化合物分子Ａに修飾物ａが３個存在する場合の例であるが、その存在個数に応じてイオン選択操作なしの低エネルギーＣＩＤ操作を実行する回数が相違することは容易に理解できる。

図６に概略構造を示したＦｅｔ−ＧＰ３について、図３（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）の状態で質量分析を実行して取得したマススペクトルの実測例を図４に示す。このときの低エネルギーＣＩＤはアルゴンガスをＣＩＤガスとしたものであり、この低エネルギーＣＩＤにより、シアル酸とガラクトースとの間のグリコシド結合の切断が優先的に生じる。そのため、シアル酸の脱離が顕著に観測される。

図４（ａ）は図３（ｂ）の状態の、つまり低エネルギーＣＩＤを行わない状態で質量分析を実行して得られるマススペクトルである。このときのイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋のピーク強度は２４．０[nA]である。上述したように低エネルギーＣＩＤを段階的に行うと高い質量電荷比のイオンが順に消滅し、最終的に図４（ｄ）に示すように、全てのシアル酸がＦｅｔ−ＧＰ３から脱離してイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋に集約される。このとき、上述したイオン増量の効果により、イオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋のピーク強度は６５．５４[nA]まで増加している。即ち、この例では、イオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋の強度は２．７倍程度増加しており、これをプリカーサイオンとしてＣＩＤ操作を行って生成したプロダクトイオンに対するマススペクトルにおいても、各イオンピークの強度が同程度増加することになる。

次に、本発明に係る質量分析方法を実施する質量分析装置の一実施例について図１、図２により説明する。図１は本実施例の質量分析装置の全体構成図、図２は本実施例の質量分析装置において上記方法に基づく分析を実行する際の測定シーケンスのフローチャートである。

この質量分析装置は、目的試料をイオン化するイオン化部１と、イオンを保持するとともに質量電荷比に応じて分離する３次元四重極型のイオントラップ２と、イオンを検出する検出部３と、を備える。この例ではイオントラップ２が本発明におけるイオン保持手段に相当する。

ＭＡＬＤＩを用いたイオン化部１は、パルス状のレーザ光を出射するレーザ照射部１１、目的化合物分子を含むサンプルＳが付着されたサンプルプレート１２、レーザ光の照射によってサンプルＳから放出されたイオンを引き出すとともにその引き出し方向を限定するアパーチャ１３、引き出されたイオンを案内するイオンレンズ１４、などを含む。もちろん、ＭＡＬＤＩ以外の他のレーザイオン化法やレーザ光を用いないイオン化法を用いても構わない。

イオントラップ２は、円環状の１個のリング電極２１と、これを挟むように対向して配置された、入口側エンドキャップ電極２２及び出口側エンドキャップ電極２４と、からなり、これら３個の電極２１、２２、２４で囲まれた空間が捕捉領域となる。入口側エンドキャップ電極２２の略中央にはイオン入射口２３が穿設され、イオン化部１から出射したイオンはイオン入射口２３を経てイオントラップ２内に導入される。一方、出口側エンドキャップ電極２４の略中央にはイオン出射口２５が穿設され、イオン出射口２５を経てイオントラップ２内から排出されたイオンは検出部３に到達して検出される。さらに、イオントラップ２にはクーリングガス供給部２６及びＣＩＤガス供給部２７が付設されており、制御部５の指示に基づいてクーリングガスやＣＩＤガスをイオントラップ２に供給する。一例として、クーリングガスとしてはヘリウム（Ｈｅ）ガス、ＣＩＤガスとしてはアルゴン（Ａｒ）ガスを用いることができるが、ガスの種類はこれに限らない。

検出部３は、イオンを電子に変換するコンバージョンダイノード３１と、コンバージョンダイノード３１から到来する電子を増倍して検出する二次電子増倍管３２とからなり、入射したイオンの量に応じた検出信号をデータ処理部４に送る。データ処理部４は、イオントラップ２において質量分離されつつ順次排出されるイオンに対して検出部３で得られる検出信号に基づいて、マススペクトル（ＭＳⁿスペクトル）を作成する機能などを有する。

主電源部６は制御部５による制御の下に、リング電極２１にイオン捕捉用の矩形波電圧を印加するものである。イオン捕捉用矩形波電圧は例えば振幅が±百Ｖ〜１ｋＶ程度の範囲であり、また周波数ｆは通常数十ｋＨｚ〜数ＭＨｚ程度の範囲である。また補助電源部７は、イオントラップ２に捕捉されているイオンを低エネルギーＣＩＤする際に該当イオンを共鳴励振させたり、或いは、イオントラップ２からイオンを排出したりするために、エンドキャップ電極２２、２４にそれぞれ相違する矩形波低電圧を印加するものである。

ＣＰＵやメモリ、各種ハードウエア回路などを含んで構成される制御部５には、ユーザが分析のための各種パラメータなどを入力するための入力部８と、データ処理部４で得られるマススペクトル等の分析結果などが表示される表示部９とが接続されている。制御部５は分析を実行するために測定の手順、つまり測定シーケンスを制御プログラムとして有しているが、この実施例の質量分析装置では、上記方法を実施するための特徴的な測定シーケンスを格納した特定化合物測定シーケンス記憶部５１を備えている。

本実施例の質量分析装置を用いて脱離し易い修飾物や官能基を含む高分子化合物を分析したい場合、オペレータが入力部８で所定の操作を行うことで、以下のような特徴的な分析が実行される。脱離し易い修飾物や官能基としては例えば、シアル酸のほか、硫酸基、リン酸基などがあり、分析対象とし得る化合物としては、シアル酸結合糖鎖、シアル酸結合糖鎖が付加した糖ペプチド、硫酸化糖鎖、硫酸化ペプチド、リン酸化糖鎖、リン酸化ペプチドなどが代表的なものである。こうした化合物は解離操作を伴わない通常の質量分析を実行したときに、マススペクトルに図４（ａ）及び図７に示すような顕著なパターンが出現する。即ち、既知である上記修飾物（又は官能基）の質量電荷比を差に持つ複数のピークが現れる。したがって、仮に未知の化合物であっても、予備的な実験によりマススペクトルを取得してそのスペクトルパターンを確認することにより、分析対象とし得る化合物であるか否かがかなり高い確度で推定可能である。

予備的な実験により図４（ａ）に示したようなマススペクトルを取得した上で、それと同一サンプルＳに対する分析を指示すると、制御部５はマススペクトルデータから、元の化合物に由来するシアル酸（又は他の修飾物や官能基）が脱離していないイオン及び１又は複数個のシアル酸が脱離したイオンの質量電荷比をそれぞれパラメータとして抽出することができる。また、オペレータ自身が各イオンの質量電荷比を入力部８から入力するようにしてもよい。

分析が開始されると、イオン化部１において、制御部５の制御の下にレーザ照射部１１は短時間レーザ光を出射する。レーザ光はサンプルＳに照射され、サンプルＳ中のマトリックスは急速に加熱されて目的化合物を伴い気化する。この際に目的化合物がイオン化される（ステップＳ１）。また、これとほぼ同時に又は先行して、クーリングガス供給部２６からイオントラップ２内にクーリングガスを供給する（ステップＳ２）。レーザ照射により発生したイオンはイオンレンズ１４により形成される静電場によって収束され、イオン入射口２３を経てイオントラップ２内に導入され、主電源部６から印加されるイオン捕捉用矩形波電圧に応じて形成される高周波電場により捕捉される（ステップＳ３）。例えば目的化合物がＦｅｔ−ＧＰ３である場合、イオントラップ２内には主として、［Ｍ＋Ｈ］^＋、［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋、［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋、［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋の４種のイオンが捕捉される。

制御部５はＣＩＤガス供給部２７からＣＩＤガスをイオントラップ２内に導入する（ステップＳ４）。そして、全てのイオンをイオントラップ２内に捕捉するようにリング電極２１に印加する矩形波電圧を保ちつつ、イオン［Ｍ＋Ｈ］^＋を共鳴励起させるような矩形波低電圧をエンドキャップ電極２２、２４に印加する。これにより、エネルギーを付与したイオン［Ｍ＋Ｈ］^＋をＣＩＤガスに衝突させて解離を促進する（ステップＳ５）。その結果、イオン［Ｍ＋Ｈ］^＋からシアル酸が脱離したプロダクトイオン（主として［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋）が生成され、これが先のイオンとともにイオントラップ２内に捕捉される。それから、クーリングガス供給部２６からクーリングガスをイオントラップ２内に導入し、生成されたプロダクトイオンのクーリングを行う（ステップＳ６）。

適宜の時間クーリングを行った後、制御部５はＣＩＤガス供給部２７からＣＩＤガスをイオントラップ２内に導入する（ステップＳ７）。そして、全てのイオンをイオントラップ２内に捕捉するようにリング電極２１に印加する矩形波電圧を保ちつつ、イオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋を共鳴励起させるような矩形波低電圧をエンドキャップ電極２２、２４に印加する。これにより、エネルギーを付与したイオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋をＣＩＤガスに衝突させて解離を促進する（ステップＳ８）。その結果、イオン［Ｍ−Sia＋２Ｈ］^＋からシアル酸が脱離したプロダクトイオン（主として［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋）が生成され、これが先のイオンとともにイオントラップ２内に捕捉される。それから、クーリングガス供給部２６からクーリングガスをイオントラップ２内に導入し、生成されたプロダクトイオンのクーリングを行う（ステップＳ９）。

適宜の時間クーリングを行った後、制御部５はＣＩＤガス供給部２７からＣＩＤガスをイオントラップ２内に導入する（ステップＳ１０）。そして、全てのイオンをイオントラップ２内に捕捉するようにリング電極２１に印加する矩形波電圧を保ちつつ、イオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋を共鳴励起させるような矩形波低電圧をエンドキャップ電極２２、２４に印加する。これにより、エネルギーを付与したイオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋をＣＩＤガスに衝突させて解離を促進する（ステップＳ１１）。その結果、イオン［Ｍ−２Sia＋３Ｈ］^＋からシアル酸が脱離したプロダクトイオン（主として［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋）が生成され、これが先のイオンとともにイオントラップ２内に捕捉される。それから、クーリングガス供給部２６からクーリングガスをイオントラップ２内に導入し、生成されたプロダクトイオンのクーリングを行う（ステップＳ１２）。

ステップＳ１２までのＣＩＤ操作の繰り返しにより、イオントラップ２内に捕捉されているイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋は最初の状態から大幅に増量される。そして、適宜の時間クーリングを行った後、制御部５は、イオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋のみをプリカーサイオンとして残し、他のイオンを共鳴励起排出するように、リング電極２１及びエンドキャップ電極２２、２４に印加している電圧の周波数を走査するべく主電源部６を制御する（ステップＳ１３）。プリカーサイオン選択は例えば非特許文献１などに開示されている手法を用いることができる。簡単に説明すると、まずリング電極２１に印加している矩形波電圧のデューティ比を０．５から変化させることにより、プリカーサイオンから質量電荷比が離れた不要なイオンを発散させて除去する。その後に、プリカーサイオンの質量電荷比に対応した周波数を除き、矩形波電圧の周波数を走査して不要なイオンを共鳴励起排出させることにより、高い分解能で目的とするプリカーサイオンのみをイオントラップ２内に残す。

ステップＳ１３のイオン選択が終わると、ＣＩＤガス供給部２７からＣＩＤガスをイオントラップ２内に導入し（ステップＳ１４）、プリカーサイオンを共鳴励起させるように矩形波電圧の周波数を設定することにより、エネルギーを付与したプリカーサイオンをＣＩＤガスに衝突させて開裂を促進する（ステップＳ１５）。これにより、プリカーサイオン［Ｍ−３Sia＋４Ｈ］^＋が開裂して各種プロダクトイオンが生成され、これがイオントラップ２内に捕捉される。それから、クーリングガス供給部２６からクーリングガスをイオントラップ２内に導入し、生成されたプロダクトイオンのクーリングを行う（ステップＳ１６）。

クーリングにより捕捉領域に各種プロダクトイオンを安定的に捕捉した後に、リング電極２１、エンドキャップ電極２２、２４に印加する矩形波電圧の周波数を走査することで、捕捉していたイオンを質量電荷比に応じて順次共鳴励起させ、イオン出射口２５から排出させる。排出されたイオンは検出部３に導入されて検出される。これによりイオンの質量分離及び検出が行われる（ステップＳ１７）。データ処理部４は、上記の周波数走査に伴って検出部３から順次得られる検出信号を処理することにより、プロダクトイオンのマススペクトルを作成する。
以上のようにして、高い感度で各プロダクトイオンが検出されたマススペクトルを得ることができる。

ステップＳ５、Ｓ８、Ｓ１１におけるＣＩＤ操作実行時にそれぞれ共鳴励振させるイオンの質量電荷比は、上述したような予備的に得られるマススペクトルから、或いは入力部８から入力された情報に基づいて特定される。また、ステップＳ１３におけるイオン選択操作実行時に選択的に残すべきイオンの質量電荷比（ステップＳ１５におけるＣＩＤ操作実行時に共鳴励振させるイオンの質量電荷比も同じ）も、上述したような予備的に得られるマススペクトルから、或いは入力部８から入力された情報に基づいて特定される。したがって、上記ステップＳ１〜Ｓ１７までの処理は、特定化合物測定シーケンス記憶部５１に格納されている制御プログラムに従って制御部５が自動的に実行可能である。また、目的化合物に含まれる修飾物（又は官能基）の数に応じて、またその質量電荷比に応じて、測定シーケンスは適宜に修正され、常に全ての修飾物（又は官能基）が脱離した状態のプリカーサイオンが用意され、このプリカーサイオンを解離させることで生成されたプロダクトイオンのマススペクトルを取得することができる。

また、さらに全ての修飾物（又は官能基）が脱離した状態のプリカーサイオンが解離されることで生成されたプロダクトイオンの中の１つを、プリカーサイオンとして選択し解離させる、という操作を複数回繰り返すようにしてもよい。このように全ての修飾物（又は官能基）が脱離した状態のイオンに対するｎが３以上のＭＳ^ｎ分析を実行する場合でも、そのイオンが増量されることにより最終的に得られるマス（ＭＳ^ｎ）スペクトルの感度が向上する。

なお、上記実施例では、矩形波電圧により駆動されるデジタルイオントラップを利用しているが、正弦波電圧により駆動される一般的なイオントラップを利用してもよい。

また上記実施例では、イオンを解離させるために低エネルギーＣＩＤを利用していたが、比較的低エネルギーでイオンを解離させる他の解離手法を利用することもできる。例えば、赤外レーザ光をイオンに照射し、多光子吸収によってイオンの内部エネルギーを上昇させて解離を促す赤外多光子吸収解離（ＩＲＭＰＤ）などを利用してもよい。

また、上記実施例では、イオン保持手段として３次元四重極型のイオントラップを利用していたが、イオンを捕捉しつつ特定のイオンを解離させることが可能であれば、他の構成のイオン保持手段を利用するも可能である。例えば、電場ではなく静磁場を利用してイオンを捕捉するフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型の質量分析装置（ＦＦＴ−ＩＣＲＭＳ）に本発明を適用することも可能である。

また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。

１…イオン化部
１１…レーザ照射部
１２…サンプルプレート
１３…アパーチャ
１４…イオンレンズ
２…イオントラップ
２１…リング電極
２２…入口側エンドキャップ電極
２３…イオン入射口
２４…出口側エンドキャップ電極
２５…イオン出射口
２６…クーリングガス供給部
２７…ＣＩＤガス供給部
３…検出部
３１…コンバージョンダイノード
３２…二次電子増倍管
４…データ処理部
５…制御部
５１…特定化合物測定シーケンス記憶部
６…主電源部
７…補助電源部
８…入力部
９…表示部

Claims (3)

1. イオンを捕捉しつつ解離させることが可能なイオン保持手段を具備する質量分析装置を用いた質量分析方法であって、前記イオン保持手段に捕捉されている解離操作対象である第１のイオン種が、同時に該イオン保持手段に捕捉されている第２のイオン種の解離で生成されるプロダクトイオンと同一種であるとき、
   a)第２のイオン種に対し質量電荷比に応じたイオン選別操作を行うことなく解離操作を行うことにより、その解離操作の前から前記イオン保持手段に存在する第１のイオン種を該イオン保持手段に捕捉し続けつつ、第２のイオン種由来のプロダクトイオンである第１のイオン種を新たに生成させる予備的解離ステップと、
   b)前記予備的解離ステップにより新たに生成された第１のイオン種を、該予備的解離ステップにおいて捕捉し続けていた第１のイオン種に加えて捕捉し、それら第１のイオン種をプリカーサイオンとして質量電荷比に応じて選別した上で解離させる主解離ステップと、
   を実行することを特徴とする質量分析方法。
2. 請求項１に記載の質量分析方法であって、
   前記イオン保持手段に捕捉されている解離操作対象である第１のイオン種が、同時に該イオン保持手段に捕捉されている第２のイオン種の複数段階の解離で生成されるプロダクトイオンと同一種であるときには、
   前記予備的解離ステップにおいて、第２のイオン種に対し質量電荷比に応じたイオン選別操作を行うことなく解離操作を行うことにより、その解離操作の前から前記イオン保持手段に存在する第１のイオン種を該イオン保持手段に捕捉し続けつつ、第２のイオン種由来のプロダクトイオンを新たに生成させ、次に、該プロダクトイオンに対し質量電荷比に応じたイオン選別操作を行うことなく解離操作を行うことにより、その解離操作の前から前記イオン保持手段に存在する第１のイオン種を該イオン保持手段に捕捉し続けつつ、第２のイオン種由来のさらに小さな質量電荷比を有するプロダクトイオンを新たに生成させる、という操作を複数回繰り返すことにより、第２のイオン種由来の第１のイオン種を新たに生成させることを特徴とする質量分析方法。
3. 目的とする化合物をイオン化し、そのイオンに対する１乃至複数段階の解離により生成されたプロダクトイオンを質量分析する質量分析装置において、
   a)電場又は磁場の作用によりイオンを捕捉するイオン捕捉手段と、該イオン捕捉手段に捕捉されているイオンを解離させるイオン解離手段と、を含むイオン保持手段と、
   b)前記イオン捕捉手段に捕捉されている解離操作対象である第１のイオン種が、同時に該イオン捕捉手段に捕捉されている第２のイオン種の解離で生成されるプロダクトイオンと同一種であるとの条件の下で、第１のイオン種を前記イオン捕捉手段に捕捉し続けつつ、第２のイオン種由来のプロダクトイオンである第１のイオン種を新たに生成させるべく、第２のイオン種に対し質量電荷比に応じたイオン選別操作なしに該イオンを解離させるように前記イオン捕捉手段及び前記イオン解離手段の動作を制御するとともに、新たに生成された第１のイオン種を、その生成以前から捕捉し続けていた第１のイオン種に加えて捕捉し、それら第１のイオン種をプリカーサイオンとして質量電荷比に応じて選別した上で解離させるように前記イオン捕捉手段及び前記イオン解離手段の動作を制御する制御手段と、
   を備えることを特徴とする質量分析装置。

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