JP5300200B2 - Rapid diagnostic method specific to avian influenza virus - Google Patents
Rapid diagnostic method specific to avian influenza virus Download PDFInfo
- Publication number
- JP5300200B2 JP5300200B2 JP2007018400A JP2007018400A JP5300200B2 JP 5300200 B2 JP5300200 B2 JP 5300200B2 JP 2007018400 A JP2007018400 A JP 2007018400A JP 2007018400 A JP2007018400 A JP 2007018400A JP 5300200 B2 JP5300200 B2 JP 5300200B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- influenza virus
- virus
- avian influenza
- influenza
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 149
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 35
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 18
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 16
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 11
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 6
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 claims description 4
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 claims description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000744 eyelid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 abstract description 96
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 72
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 abstract description 3
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 60
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 60
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 56
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 35
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 33
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 29
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 21
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 14
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 14
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 14
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 13
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 12
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 12
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 12
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 12
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 12
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 12
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 11
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 9
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 9
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 7
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102100027368 Histone H1.3 Human genes 0.000 description 3
- 101001009450 Homo sapiens Histone H1.3 Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102100021960 Leukemia NUP98 fusion partner 1 Human genes 0.000 description 3
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 3
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 3
- 102100038436 Neuronal pentraxin-1 Human genes 0.000 description 3
- 102100021878 Neuronal pentraxin-2 Human genes 0.000 description 3
- 101710111966 Non-structural protein NP-1 Proteins 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 101710102575 Pre-neck appendage protein Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000002964 rayon Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- PYSRRFNXTXNWCD-UHFFFAOYSA-N 3-(2-phenylethenyl)furan-2,5-dione Chemical compound O=C1OC(=O)C(C=CC=2C=CC=CC=2)=C1 PYSRRFNXTXNWCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241001136800 Anas acuta Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000272161 Charadriiformes Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 101001091371 Homo sapiens Kallikrein-8 Proteins 0.000 description 1
- 101900222562 Influenza A virus Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000272168 Laridae Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000007696 Multicystic Dysplastic Kidney Diseases 0.000 description 1
- 241000845082 Panama Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 229920009405 Polyvinylidenefluoride (PVDF) Film Polymers 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000147 Styrene maleic anhydride Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 description 1
- 229920000592 inorganic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N octoxybenzene Chemical compound CCCCCCCCOC1=CC=CC=C1 ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical class [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229920005613 synthetic organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000002759 woven fabric Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
本発明は、トリインフルエンザウイルス検出方法及びトリインフルエンザウイルスを検出するためのイムノクロマトグラフ法用試験具に関する。 The present invention relates to an avian influenza virus detection method and an immunochromatographic test device for detecting an avian influenza virus.
インフルエンザウイルスは、核タンパク質（ＮＰ）と膜タンパク質（Ｍ）の抗原性の違いによりＡ型、Ｂ型、及びＣ型に分類される。このうちのインフルエンザＡ型ウイルスは、さらにヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）のアミノ酸配列又は抗原性の違いにより、ＨＡはＨ１〜１５の１５種類、ＮＡはＮ１〜９の９種類に分類され、その組み合わせの数の亜型が存在する。この中で、ヒトを宿主としてヒトに感染する亜型は、Ｈ１〜３、Ｎ１〜２である。そして、インフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ１〜３、Ｎ１〜２）及びインフルエンザＢ型ウイルス（以下、「ヒトインフルエンザウイルス」ということもある）が、毎年大流行を引き起こす、いわゆるインフルエンザ（ヒトインフルエンザ）の原因となるものである。 Influenza viruses are classified into type A, type B, and type C depending on the difference in antigenicity between nucleoprotein (NP) and membrane protein (M). Of these, influenza A viruses are further classified into 15 types of H1-15, and NA of 9 types of N1-9, depending on the amino acid sequence or antigenicity of hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), There are as many subtypes of that combination. Among these, the subtypes that infect humans with humans as hosts are H1 to 3 and N1 to 2. And, influenza A virus (H1-3, N1-2) and influenza B virus (hereinafter sometimes referred to as “human influenza virus”) cause a pandemic each year, the cause of so-called influenza (human influenza) It will be.
インフルエンザＡ型ウイルスはヒトだけでなく、多くの哺乳動物及び鳥類にも感染する。インフルエンザＡ型ウイルスが鳥類に感染して起きる鳥類の感染症が「トリインフルエンザ」であり、その原因となるトリインフルエンザウイルスには、Ｈ１〜１５、Ｎ１〜９のすべての亜型が確認されている。トリインフルエンザウイルスの多くは重篤な症状を示さないが、Ｈ５及びＨ７亜型のトリインフルエンザウイルスの中には、鳥に感染した場合に重篤な症状を示すものもある。これらは高病原性トリインフルエンザウイルスと呼ばれるものであり、ヒトへの感染の可能性が危惧されている。また、Ｈ９亜型のトリインフルエンザウイルスの中には、ウイルスに感染した家禽と接触したヒトへの感染、発病が報告されている例もあるため、ヒトでの感染の拡大が危惧されている。 Influenza A virus infects not only humans but also many mammals and birds. An avian infectious disease caused by an influenza A virus infecting birds is “avian influenza”, and all subtypes of H1-15 and N1-9 have been confirmed in the avian influenza virus that causes it . Many avian influenza viruses do not show severe symptoms, but some H5 and H7 subtype avian influenza viruses show severe symptoms when infected with birds. These are called highly pathogenic avian influenza viruses, and there is concern about the possibility of human infection. In addition, since some H9 subtype avian influenza viruses have been reported to infect and develop humans in contact with poultry infected with the virus, the spread of infection in humans is a concern.
現在、臨床ではインフルエンザウイルス抗原を迅速に検出するキットを用いてインフルエンザの診断が行われている。このような迅速診断キットとしては、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、イムノクロマトグラフ法を原理として用いたものが挙げられ、インフルエンザＡ型ウイルスのみを検出するもの（例えば、特許文献１参照）、インフルエンザＡ型ウイルスとインフルエンザＢ型ウイルスとをまとめて検出するもの、インフルエンザＡ型ウイルスとインフルエンザＢ型ウイルスとを別々に検出するものなどがある。 At present, influenza is diagnosed using a kit for rapidly detecting influenza virus antigens in clinical practice. Examples of such rapid diagnosis kits include those using enzyme immunoassay (EIA) and immunochromatography as the principle, and those that detect only influenza A virus (for example, see Patent Document 1), influenza A virus. And influenza B virus are collectively detected, and influenza A virus and influenza B virus are separately detected.
しかしながら、特許文献１の迅速診断キットは、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスであるかトリインフルエンザウイルスであるかを区別せず、インフルエンザＡ型ウイルスに属する広範囲のウイルスを検出するものである。従って、ヒトがインフルエンザの徴候を示した場合、それがトリインフルエンザウイルスによるものなのか、あるいはヒトインフルエンザウイルスによるものであるかを診断することができない。このためトリインフルエンザウイルスの迅速な診断法の開発が必要とされている。 However, the rapid diagnostic kit of Patent Document 1 does not distinguish between human influenza A virus and avian influenza virus, and detects a wide range of viruses belonging to influenza A virus. Therefore, when a human shows signs of influenza, it cannot be diagnosed whether it is due to an avian influenza virus or a human influenza virus. For this reason, it is necessary to develop a rapid diagnostic method for avian influenza virus.
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、ヒトインフルエンザウイルスと区別して、トリインフルエンザウイルスを特異的、迅速かつ簡便に検出する方法及びこれに用いるイムノクロマトグラフ法用試験具を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of such circumstances, and provides a method for detecting avian influenza virus in a specific, rapid and simple manner, distinguishing it from human influenza virus, and an immunochromatographic test device used therefor. The purpose is that.
本発明は上記目的を達成するために次の技術的手段を講じた。
トリインフルエンザウイルス検出方法に係る本発明は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を用いて、免疫学的測定法により、患者から採取された試料中のトリインフルエンザウイルスを検出することを特徴としている。
この検出方法によれば、ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１〜３亜型）及びＢ型）とは反応せず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応する抗インフルエンザウイルス抗体を用いているので、今まではヒト由来のインフルエンザウイルスであるかトリ由来のインフルエンザウイルスであるかを区別することなくインフルエンザＡ型ウイルスとしてしか検出できなかったのに比べ、ヒトインフルエンザウイルスとトリインフルエンザウイルスとを区別して、複数種の亜型のトリインフルエンザウイルスを検出することができる。
In order to achieve the above object, the present invention takes the following technical means.
The present invention relating to the avian influenza virus detection method is not reactive to human influenza A virus H1 subtype, H2 subtype and H3 subtype and human influenza B virus, and all avian influenza H3 subtypes An avian influenza virus in a sample collected from a patient is detected by an immunoassay using an anti-influenza virus antibody reactive to the virus .
According to this detection method, anti-influenza virus antibodies that do not react with human influenza viruses (types A (H1 to 3) and B) and react with all avian influenza viruses of H3 to 15 are used. So far, human influenza virus and avian influenza virus are compared to those that could only be detected as influenza A virus without distinguishing between human and avian-derived influenza viruses. It is possible to detect multiple subtypes of avian influenza viruses.
また、前記抗インフルエンザウイルス抗体が、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応性を示すものであるので、トリインフルエンザウイルスがＨ３〜１５亜型のものであれば広範囲に検出することができる。 The front Symbol anti-influenza virus antibody, all avian influenza virus der those reactive with Runode of H3~15 subtype avian influenza virus widely detected as long as subtypes H3~15 be able to.
上記トリインフルエンザウイルス検出方法において、前記抗インフルエンザウイルス抗体として、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質に対する抗体を用いることができ、また、トリインフルエンザウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端側から第４６位〜第１５９位の領域に存在するエピトープを認識する抗体を用いることもできる。
また、上記トリインフルエンザウイルス検出方法において、前記抗インフルエンザウイルス抗体が、受託番号がＦＥＲＭ Ｐ−２０８２２であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
In the above avian influenza virus detection method, an antibody against the influenza A virus nucleoprotein can be used as the anti-influenza virus antibody, and the 46th position from the N-terminal side of the amino acid sequence of the avian influenza virus nucleoprotein An antibody that recognizes an epitope present in the region at position 159 can also be used.
In the above avian influenza virus detection method, the anti-influenza virus antibody is preferably a monoclonal antibody produced by a hybridoma whose accession number is FERM P-20822.
さらに、上記トリインフルエンザウイルス検出方法は、前記免疫学的測定法が、インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を用い、標識された前記第一の抗体と固相に固定された前記第二の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ少なくとも前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。
この場合、第一の抗体とトリインフルエンザウイルス（抗原）と第二の抗体とでいわゆるサンドイッチ構造を構築させることにより、試料中のトリインフルエンザウイルスを高感度で測定することができる。
Further, in the above avian influenza virus detection method, the immunological assay uses the first and second antibodies against influenza virus, and the second antibody immobilized on a solid phase with the labeled first antibody. Forming a complex comprising an antibody and an influenza virus, and at least the second antibody is a human influenza A virus H1 subtype, H2 subtype and H3 subtype, and a human influenza B virus. It is preferably an anti-influenza virus antibody that does not show reactivity and is reactive to all avian influenza viruses of the H3-15 subtype .
In this case, the avian influenza virus in the sample can be measured with high sensitivity by constructing a so-called sandwich structure with the first antibody, the avian influenza virus (antigen) and the second antibody.
前記第一及び第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。
この場合、第一及び第二の抗体の両方に前記抗インフルエンザウイルス抗体を使用することにより、感度及び特異性が上がり、検出精度が向上する。
The first and second antibodies are not reactive to human influenza A virus H1 subtype, H2 subtype and H3 subtype and human influenza B virus, and all avian influenza viruses of subtype H3-15 It is preferably an anti-influenza virus antibody that is reactive to.
In this case, by using the anti-influenza virus antibody for both the first and second antibodies, sensitivity and specificity are increased, and detection accuracy is improved.
前記免疫学的測定法が、イムノクロマトグラフ法であることが好ましい。操作が簡便で、特別な装置が不要であり、迅速に測定を行うことができるからである。
前記イムノクロマトグラフ法が、前記第二の抗体が固定されたクロマト用膜担体において、当該第二の抗体と標識された前記第一の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。この場合、クロマト用膜担体において、第一抗体と抗原と第二抗体との複合体（サンドイッチ構造）が形成されるため、第一抗体の標識を認識することによりトリインフルエンザウイルスを検出することができる。
また、患者から採取された試料が、涙、目脂、喀痰、唾液、大便、鼻腔又は咽頭から採取された試料であることが好ましい。
The immunological measurement method is preferably an immunochromatographic method. This is because the operation is simple, no special device is required, and the measurement can be performed quickly.
The immunochromatographic method includes a step of forming a complex containing the second antibody, the labeled first antibody, and influenza virus in a chromatographic membrane carrier on which the second antibody is immobilized. And the second antibody is not reactive with human influenza A virus H1, H2 and H3 and human influenza B viruses, and all avian influenza viruses of subtypes H3-15 It is preferably an anti-influenza virus antibody that is reactive to. In this case, since a complex (sandwich structure) of the first antibody, the antigen and the second antibody is formed on the chromatographic membrane carrier, the avian influenza virus can be detected by recognizing the label of the first antibody. it can.
Further, the sample collected from the patient is preferably a sample collected from tears, eyelids, sputum, saliva, stool, nasal cavity or pharynx.
イムノクロマトグラフ法用試験具に係る本発明は、インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を利用して患者から採取された試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのイムノクロマトグラフ法用試験具であって、前記患者から採取された試料を添加する試料添加部材と、標識物質で標識された第一の抗体を担持する標識保持部材と、第二の抗体が固定された判定領域を配置したクロマト用膜担体とを有し、前記第一の抗体が、トリインフルエンザウイルスに反応性を示し、前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることを特徴としている。
このイムノクロマトグラフ法用試験具を使用すれば、ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１〜３亜型）及びＢ型）とは反応せず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応する抗インフルエンザウイルス抗体が用いられているので、ヒトがインフルエンザに感染した場合、その原因となるインフルエンザウイルスがトリ由来のものであるか否かを確認することができる。
The present invention relating to an immunochromatographic test device is an immunochromatographic test device for detecting influenza virus in a sample collected from a patient using the first and second antibodies against influenza virus. A chromatographic membrane in which a sample addition member for adding a sample collected from the patient , a label holding member for supporting a first antibody labeled with a labeling substance, and a determination region to which the second antibody is fixed And the first antibody is reactive to avian influenza virus, and the second antibody is human influenza A virus H1 subtype, H2 subtype and H3 subtype, and human influenza B type Anti-influenza virus antibodies that are not reactive to viruses and are reactive to all avian influenza viruses of the H3-15 subtype It is characterized by being.
If this immunochromatographic test device is used, it will not react with human influenza viruses (types A (H1-3) and B), but will react with all H3-15 subtypes of avian influenza viruses. Since an influenza virus antibody is used, when a human is infected with influenza, it can be confirmed whether the influenza virus which causes it is derived from a bird.
上記イムノクロマトグラフ法用試験具において、前記標識物質が、不溶性粒状マーカーであることが好ましい。また、その中でも特に、着色合成高分子粒子又はコロイド状金属粒子であることが好ましい。これらを用いれは、判定領域での色の変化を肉眼で観察することにより、迅速且つ簡便に判定することが可能となる。 In the immunochromatographic test device, the labeling substance is preferably an insoluble granular marker. Of these, colored synthetic polymer particles or colloidal metal particles are particularly preferred. When these are used, it is possible to quickly and easily determine the color change in the determination region by observing with the naked eye.
本発明によれば、ヒトインフルエンザウイルスとトリインフルエンザウイルスとを区別して、トリインフルエンザウイルスを特異的、迅速かつ簡便に検出することができる。 According to the present invention, human influenza virus and avian influenza virus can be distinguished and avian influenza virus can be detected specifically, rapidly and simply.
トリインフルエンザウイルス検出方法は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を用いて、免疫学的測定法により、患者から採取された試料中のトリインフルエンザウイルスを検出する方法である。 The avian influenza virus detection method is not reactive to human influenza A viruses H1, H2 and H3 and human influenza B viruses, and is reactive to all avian influenza viruses of H3-15 subtypes This method detects an avian influenza virus in a sample collected from a patient by an immunoassay using an anti-influenza virus antibody having the following formula.
トリインフルエンザウイルス検出方法に用いられる抗体は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体である。この抗インフルエンザウイルス抗体は、ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１〜３亜型）及びＢ型）とは反応せず、Ｈ３〜１５亜型のすべてのトリインフルエンザウイルスに反応するので、今までヒト由来かトリ由来かを区別することなくインフルエンザＡ型ウイルスを検出していたものを、ヒト由来かトリ由来かを区別してトリ由来のインフルエンザＡ型ウイルスを検出することができる。 Antibodies used in the avian influenza virus detection method are not reactive to human influenza A virus H1, H2 and H3, and human influenza B viruses, and all avian influenza of H3 to 15 subtypes It is an anti-influenza virus antibody that is reactive to viruses. This anti-influenza virus antibody does not react with human influenza viruses (types A (H1 to 3) and B), but reacts with all avian influenza viruses of the H3 to 15 subtypes. It is possible to detect an influenza A virus derived from an avian by distinguishing whether it was derived from a human or an avian from what had been detected from an influenza A virus without distinguishing whether it was derived from a bird or a bird.
抗インフルエンザウイルス抗体が反応性を示すトリインフルエンザウイルス亜型のうち、少なくとも１つがトリインフルエンザウイルスＨ５亜型、Ｈ７亜型及びＨ９亜型からなる群から選ばれることが好ましい。トリインフルエンザウイルスＨ５亜型、Ｈ７亜型又はＨ９亜型は、過去にヒトへの感染が確認されたことがあるトリインフルエンザウイルスであり、ヒトでの感染拡大を引き起こす可能性があるからである。
抗インフルエンザウイルス抗体が、少なくともＨ３〜１５亜型のトリインフルエンザウイルスに反応性を示すものであってもよい。この場合、トリインフルエンザウイルスがＨ３〜１５亜型のものであれば検出することができる。
抗インフルエンザウイルス抗体が、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質に対する抗体であることが好ましい。また、抗インフルエンザウイルス抗体として、トリインフルエンザウイルスの核タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端側から第４６位〜第１５９位の領域に存在するエピトープを認識する抗体を用いることも好ましい。
Of the avian influenza virus subtypes to which the anti-influenza virus antibody is reactive, at least one is preferably selected from the group consisting of avian influenza virus H5 subtype, H7 subtype and H9 subtype. This is because the avian influenza virus H5 subtype, H7 subtype, or H9 subtype is an avian influenza virus that has been confirmed to be infected in humans in the past and may cause spread of infection in humans.
The anti-influenza virus antibody may be reactive to at least H3-15 subtype avian influenza virus. In this case, if the avian influenza virus is of the H3-15 subtype, it can be detected.
The anti-influenza virus antibody is preferably an antibody against the nucleoprotein of influenza A virus. In addition, as an anti-influenza virus antibody, it is also preferable to use an antibody that recognizes an epitope present in the region of positions 46 to 159 from the N-terminal side of the amino acid sequence of the avian influenza virus nucleoprotein.
抗インフルエンザウイルス抗体の具体例として、ハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ４Ｅ３により産生されるモノクローナル抗体（以下、「４Ｅ３」という）が挙げられる。当該ハイブリドーマは、大阪府立公衆衛生研究所により独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されたものであり、平成１８年２月２４日付で受領され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０８２２が付与されている。このハイブリドーマは、マウス骨髄腫細胞由来株とマウスリンパ球との融合細胞であり、インフルエンザＡ型ウイルスＨ３〜１５亜型の核タンパク質（ＮＰ）に結合するモノクローナル抗体（４Ｅ３）を産生する。４Ｅ３は、例えばハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ４Ｅ３を１０％ウシ胎児血清、１０ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．２５％ ＮａＨＣＯ３を含むＲＰＭＩ １６４０培地（ＳＩＧＭＡ Ｒ６５４０）中、３７℃、５％ ＣＯ２にて培養し、産生された４Ｅ３を公知の方法にて回収及び精製することにより、製造することができる。
このモノクローナル抗体は、そのフラグメント、及びそのキメラ抗体及びヒト化抗体等の改変抗体並びに変異抗体を含む。これらのフラグメント、改変抗体又は変異抗体もまた、元の抗体と同様のトリインフルエンザウイルスの複数の亜型に対する特異性を有するものである。これらは、当業者により既知の手段又は方法により製造され得る。
Specific examples of the anti-influenza virus antibody include a monoclonal antibody (hereinafter referred to as “4E3”) produced by the hybridoma Mouse-Mouse Hybridoma 4E3. The hybridoma was deposited by the Osaka Prefectural Institute of Public Health at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, February 6). It has been received on the 24th and has been assigned a deposit number of FERM P-20822. This hybridoma is a fusion cell of a mouse myeloma cell-derived strain and mouse lymphocytes, and produces a monoclonal antibody (4E3) that binds to influenza A virus H3-15 subtype nucleoprotein (NP). For example, 4E3 is obtained by culturing the hybridoma Mouse-Mouse Hybridoma 4E3 at 37 ° C., 5% CO 2 in RPMI 1640 medium (SIGMA R6540) containing 10% fetal bovine serum, 10 mM L-glutamine, and 0.25% NaHCO 3. The produced 4E3 can be produced by recovering and purifying by a known method.
This monoclonal antibody includes fragments thereof, modified antibodies such as chimeric antibodies and humanized antibodies, and mutant antibodies. These fragments, modified antibodies or mutant antibodies also have specificity for multiple subtypes of avian influenza virus similar to the original antibody. These can be prepared by means or methods known to those skilled in the art.
免疫学的測定法（イムノアッセイ）は、抗体との結合能力を利用して物質を定量的に測定する方法であり、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法、免疫放射定量測定（ＩＲＭＡ）法、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）法、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、均一系酵素免疫測定法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）法、免疫蛍光分析（ＩＦＭＡ）法、蛍光偏光法、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）法、化学発光酵素イムノアッセイ（ＣＬＥＩＡ）法、イムノクトロマトグラフ法を用いることができる。免疫学的測定法において用いられる上記抗インフルエンザウイルス抗体は、１種類でも２種類以上であってもよい。 An immunological measurement method (immunoassay) is a method for quantitatively measuring a substance using its ability to bind to an antibody. For example, a radioimmunoassay (RIA) method, an immunoradiometric assay (IRMA) method, an enzyme immunoassay (EIA) method, enzyme immunoassay (ELISA) method, homogeneous enzyme immunoassay method, fluorescence immunoassay (FIA) method, immunofluorescence analysis (IFMA) method, fluorescence polarization method, chemiluminescence immunoassay (CLIA) method, chemiluminescent enzyme An immunoassay (CLEIA) method or an immunochromatographic method can be used. The anti-influenza virus antibody used in the immunoassay may be one type or two or more types.
試料は、インフルエンザウイルスが含まれる可能性があるものであればよく、例えば被疑患者からの涙、目脂、喀痰、唾液及び大便等の生体試料を、生理食塩水、リン酸緩衝液等の溶媒と混合したもの、被疑患者の患部（鼻腔、咽頭等）を清拭したガーゼ、スワブ等から前記の溶媒で洗浄又は抽出したもの、又は被疑患者の患部の前記溶媒による洗浄液であってもよい。 The sample may be anything that may contain influenza virus. For example, a biological sample such as tears, eyelids, sputum, saliva and stool from a suspected patient, a solvent such as physiological saline, phosphate buffer, etc. It may be a mixture mixed with the above, washed or extracted from the gauze, swab etc. of the affected part (nasal cavity, pharynx, etc.) of the suspected patient with the above solvent, or a washing solution of the affected part of the suspected patient with the above solvent.
免疫学的測定法の中でも、インフルエンザウイルスに対する第一及び第二の抗体を用い、標識された前記第一の抗体と固相に固定された前記第二の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含む、サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法を用いることが好ましい。
ここで、少なくとも前記第二の抗体として、上述のヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体が使用されるが、前記第一及び第二の抗体が、前記抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。第一及び第二の抗体の両方に前記抗インフルエンザウイルス抗体を使用することにより、感度及び特異性が上がり、検出精度が向上する。
Among immunoassays, the first and second antibodies against influenza virus are used, and a complex comprising the labeled first antibody, the second antibody immobilized on a solid phase, and influenza virus is used. It is preferable to use an immunoassay that uses the sandwich method as a measurement principle, including the step of forming.
Here, at least the second antibody is not reactive to the above-mentioned human influenza A virus H1 subtype, H2 subtype and H3 subtype and human influenza B virus, and a plurality of subtypes of avian influenza virus Anti-influenza virus antibodies that are reactive to the above are used, but the first and second antibodies are preferably the anti-influenza virus antibodies. By using the anti-influenza virus antibody for both the first and second antibodies, sensitivity and specificity are increased, and detection accuracy is improved.
サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法には、ＩＲＭＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＩＦＭＡ法、イムノクロマトグラフ法等が含まれる。
第一の抗体に結合させる標識物質としては、放射性同位元素（１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐ等）、酵素（β−ガラクトシターゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光物質（フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体等）、不溶性粒状マーカー等が挙げられる。
第二の抗体を固定する固相の素材又は形状は、測定法に応じて適宜選択される。固相の素材としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、スチレンン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレンン−無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン等の合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体、アガロースゲル、セルロース等の多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーン等の無機高分子化合物が挙げられる。これらは、さらにアミノ基、アミノアシル基、カルキシル基、アシル基、水酸基、ニトロ基等の官能基が導入されたものであってもよい。固相の形状としては、例えば、マイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡプレート）、ディスク等の平板状、ビーズ等の粒子状、試験管、チューブ等の管状、繊維状、膜状にすることができる。
Examples of immunological measurement methods based on the sandwich method include IRMA method, ELISA method, IFMA method, immunochromatography method and the like.
The labeling substance to be bound to the first antibody, a radioactive isotope (125 I, 14 C, 32 P , etc.), enzymes (beta-galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), fluorescent substance (fluorescein derivatives, rhodamine derivatives Etc.) and insoluble granular markers.
The material or shape of the solid phase for immobilizing the second antibody is appropriately selected according to the measurement method. Examples of the solid phase material include polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride (PVDF), polystyrene, styrene-divinylbenzene copolymer, styrene-maleic anhydride copolymer, nylon, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, polyacrylonitrile, Examples include synthetic organic polymer compounds such as polypropylene, dextran derivatives, polysaccharides such as agarose gel and cellulose, and inorganic polymer compounds such as glass, silica gel, and silicone. These may be further introduced with functional groups such as amino group, aminoacyl group, carboxyl group, acyl group, hydroxyl group, nitro group and the like. The shape of the solid phase can be, for example, a microtiter plate (ELISA plate), a flat plate such as a disk, a particle such as a bead, a tube such as a test tube or a tube, a fiber, or a membrane.
サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法の中では、操作が簡便で、特別な装置が不要であり、迅速に測定を行うことができることから、イムノクトマトグラフ法が好ましい。
前記イムノクロマトグラフ法は、前記第二の抗体が固定されたクロマト用膜担体において、当該第二の抗体と標識された前記第一の抗体とインフルエンザウイルスとを含む複合体を形成させる工程を含んでおり、且つ前記第二の抗体が、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であることが好ましい。この場合、クロマト用膜担体において、第一抗体と抗原と第二抗体との複合体（サンドイッチ構造）が形成されるため、第一抗体の標識を認識することによりトリインフルエンザウイルスを検出することができる。
イムノクロマトグラフ法においても、上述の標識物質を使用することができるが、その中でも色を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できることから、不溶性粒状マーカーが好ましく用いられる。不溶性粒状マーカーは、イムノクロマトグラフ法で標識物質として使用されている粒子のうち、それ自身が色を呈する粒子のことであり、例えば、金コロイド、白金コロイド等のコロイド状金属粒子、顔料等で着色されたポリスチレンラテックス等の合成高分子粒子（着色合成高分子粒子）、重合染色粒子等が挙げられる。
Among immunological measurement methods based on the sandwich method, the immunotomato graph method is preferable because it is easy to operate, does not require a special device, and can perform measurement quickly.
The immunochromatographic method includes a step of forming a complex containing the second antibody, the labeled first antibody, and influenza virus in a chromatographic membrane carrier on which the second antibody is immobilized. And the second antibody is not reactive with human influenza A virus H1 subtype, H2 subtype and H3 subtype and human influenza B virus, and is reactive with multiple subtypes of avian influenza virus It is preferable that it is an anti-influenza virus antibody which shows. In this case, since a complex (sandwich structure) of the first antibody, the antigen and the second antibody is formed on the chromatographic membrane carrier, the avian influenza virus can be detected by recognizing the label of the first antibody. it can.
In the immunochromatography method, the above-mentioned labeling substances can be used. Among them, insoluble granular markers are preferably used because they can be determined quickly and easily by observing the color with the naked eye. An insoluble granular marker is a particle that exhibits a color among particles used as a labeling substance in an immunochromatographic method. For example, it is colored with colloidal metal particles such as gold colloid and platinum colloid, pigments, etc. And synthetic polymer particles (colored synthetic polymer particles) such as polystyrene latex and polymerized dyed particles.
図１は、本発明の１つの実施形態に係るイムノクロマトグラフ法用試験具の断面図である。このイムノクロマトグラフ法用試験具１は、表面に粘着層を有するプラスチック板からなる基材２上に、レーヨンの不織布からなる試料添加部材３と、ガラス繊維の不織布からなる標識保持部材４と、ニトロセルロースの多孔体からなるクロマト用膜担体５と、セルロースの不織布からなる吸収部材６とを備える。 FIG. 1 is a cross-sectional view of an immunochromatographic test device according to one embodiment of the present invention. This immunochromatographic test device 1 includes a sample addition member 3 made of a rayon nonwoven fabric, a label holding member 4 made of a nonwoven fabric of glass fiber, and a nitro on a base material 2 made of a plastic plate having an adhesive layer on the surface. A chromatographic membrane carrier 5 made of a porous cellulose material and an absorbent member 6 made of a cellulose nonwoven fabric are provided.
基材２は、試料添加部材３や標識保持部材４等の上記部材を適切に配置するためのものであり、プラスチック以外にも紙、ガラス等の材質のものを用いることができる。
試料添加部材３には試料が添加される。試料としては上記免疫学的測定法で用いられる試料と同様のものを使用することができるが、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液又は咽頭拭い液が好ましい。試料は、緩衝液等の適当な溶媒で希釈して添加してもよい。試料添加部材３としては、レーヨンの不織布以外にも、例えば、多孔質ポリエチレン、多孔質ポリプロピレン等の多孔質合成樹脂のシート又はフィルム、濾紙、綿布等のセルロース製の紙、織布又は不織布、ガラス繊維の不織布を用いることができる。
The base material 2 is for appropriately arranging the above-described members such as the sample addition member 3 and the label holding member 4, and materials other than plastic, such as paper and glass, can be used.
A sample is added to the sample addition member 3. As the sample, the same sample as that used in the above-described immunological assay can be used, but nasal aspirate, nasal wipe, or pharyngeal wipe is preferable. The sample may be diluted with an appropriate solvent such as a buffer and added. As the sample addition member 3, in addition to the rayon nonwoven fabric, for example, a porous synthetic resin sheet or film such as porous polyethylene or porous polypropylene, filter paper, cellulose paper such as cotton cloth, woven fabric or nonwoven fabric, glass A fiber nonwoven fabric can be used.
標識保持部材４は、試料添加部材３に接触して配置され、標識物質で標識された第一の抗体が担持されている。この第一の抗体は、試料中の測定対象と抗原抗体反応するものであり、ここではトリインフルエンザに反応性を示す抗体が使用される。トリインフルエンザに反応性を示す抗体であれば、１種類又は２種類以上を使用することができる。第一の抗体として、好ましくは４Ｅ３が使用される。また、４Ｅ３と他のトリインフルエンザに反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体を組み合わせて使用することもできる。
第一の抗体を標識する標識物質としては、上記サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法及びイムノクロマトグラフ法で用いられる標識物質と同様のものを使用することができる。その中でも色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できることから不溶性粒状マーカーが好ましく、その中でも特に着色合成高分子粒子又はコロイド状金属粒子が好ましい。
当該標識保持部材４は、標識された第一の抗体の懸濁液をガラス繊維の不織布に含浸せしめ、これを乾燥させること等によって作製することができる。なお、標識保持部材４としてガラス繊維の不織布が用いられているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類の布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布等も使用することができる。
The label holding member 4 is disposed in contact with the sample addition member 3 and carries a first antibody labeled with a labeling substance. This first antibody reacts with an object to be measured in a sample for an antigen-antibody reaction, and here, an antibody reactive to avian influenza is used. One type or two or more types can be used as long as they are antibodies reactive to avian influenza. As the first antibody, 4E3 is preferably used. Moreover, 4E3 and the anti-influenza virus antibody which shows reactivity with other avian influenza can also be used in combination.
As the labeling substance for labeling the first antibody, the same labeling substances as those used in the immunological measurement method and immunochromatography method based on the sandwich method can be used. Among them, insoluble granular markers are preferable because color changes can be determined quickly and easily by observing with the naked eye, and among them, colored synthetic polymer particles or colloidal metal particles are particularly preferable.
The label holding member 4 can be produced by impregnating a glass fiber nonwoven fabric with a labeled first antibody suspension and drying the suspension. In addition, although the nonwoven fabric of glass fiber is used as the label | marker holding member 4, it is not limited to this, For example, porous cloths, such as cellulose cloth (filter paper, a nitrocellulose membrane, etc.), polyethylene, a polypropylene, etc. Cloth etc. can also be used.
クロマト用膜担体５は、標識保持部材４と間隔を介して配置され、測定対象と抗原抗体反応する第二の抗体が固定された判定領域５Ａを有する。第二の抗体は、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型、Ｈ２亜型及びＨ３亜型並びにヒトインフルエンザＢ型ウイルスに反応性を示さず、トリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応性を示す抗インフルエンザウイルス抗体であり、好ましくは４Ｅ３である。
クロマト用膜担体５として、ニトロセルロースの多孔体を用いているが、試料に含まれる測定対象をクロマト展開可能で、かつ、上記判定領域５Ａを形成する第二の抗体を固定可能なものであればいかなるものであってもよく、他のセルロース（例えば、セルロースアセテート）の膜、ナイロン（例えば、カルボキシル基、アルキル基等を置換基として有してもよいアミノ基が導入された修飾ナイロン）の膜、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜等を使用することもできる。
吸収部材６は、クロマト用膜担体５と接触するように配置されており、過剰試料を吸収するためのものである。吸収部材６は、液体を速やかに吸収し、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、ポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を使用することができる。そして、試料添加部材３の一部及び吸収部材６の表面は、図１に示されるように透明シート７で覆われている。
The chromatographic membrane carrier 5 has a determination region 5 </ b> A, which is arranged with a gap from the label holding member 4, and to which a second antibody that undergoes an antigen-antibody reaction with the measurement target is fixed. The second antibody is an anti-influenza that is not reactive to human influenza A viruses H1, H2 and H3 and human influenza B virus, and is reactive to multiple subtypes of avian influenza virus Viral antibody, preferably 4E3.
As the chromatographic membrane carrier 5, a porous body of nitrocellulose is used, but it is possible to develop a measurement target contained in the sample and to fix the second antibody forming the determination region 5A. Any other cellulose (for example, cellulose acetate) film, nylon (for example, modified nylon having an amino group which may have a carboxyl group, an alkyl group or the like as a substituent) A film, a polyvinylidene fluoride (PVDF) film, or the like can also be used.
The absorbing member 6 is disposed so as to come into contact with the chromatographic membrane carrier 5 and is for absorbing an excess sample. The absorbent member 6 may be made of any material that can quickly absorb and retain liquid, and a porous plastic nonwoven fabric made of cotton, filter paper, polyethylene, polypropylene, or the like can be used. A part of the sample addition member 3 and the surface of the absorption member 6 are covered with a transparent sheet 7 as shown in FIG.
本発明のイムノクロマトグラフ法用試験具１は、例えば以下のように作製することができる。まず、クロマト用膜担体５を基材２の中程に貼着し、当該クロマト用膜担体５のクロマト展開の開始点側（すなわち、図１の左側、以下「上流側」という）の末端と接触しないように間隔をあけて標識保持部材４を基材２の上流側に貼着する。そして、試料添加部材３の上流側部分を基材２の最上流側部分に貼着し、それと同時に当該試料添加部材３のクロマト展開の終了点側（すなわち、図１の右側、以下「下流側」という）部分を標識保持部材４及びクロマト用膜担体５の上流側部分の上面に載置するとともに、標識保持部材４とクロマト用膜担体５との間にある基材２に貼着する。また、クロマト用膜担体５の下流側部分の上面に吸収部材６の上流側部分を載置するとともに、当該吸収部材６の下流側部分を基材２の最下流側部分に貼着する。そして、試料添加部材３の下流側部分及び吸収部材６の表面を透明シート７で覆う。 The immunochromatographic test device 1 of the present invention can be produced, for example, as follows. First, the chromatographic membrane carrier 5 is attached to the middle of the base material 2, and the chromatographic development carrier 5 has a chromatographic development start side (that is, the left side in FIG. 1, hereinafter referred to as “upstream side”) The label holding member 4 is pasted on the upstream side of the base material 2 with an interval so as not to contact. Then, the upstream portion of the sample addition member 3 is attached to the most upstream portion of the base material 2 and at the same time, the end point side of the sample addition member 3 for chromatographic development (that is, the right side of FIG. ")" Is placed on the upper surface of the upstream side of the label holding member 4 and the chromatographic membrane carrier 5, and is attached to the substrate 2 between the label holding member 4 and the chromatographic membrane carrier 5. Further, the upstream portion of the absorbing member 6 is placed on the upper surface of the downstream portion of the chromatographic membrane carrier 5, and the downstream portion of the absorbing member 6 is attached to the most downstream portion of the substrate 2. And the downstream part of the sample addition member 3 and the surface of the absorption member 6 are covered with the transparent sheet 7.
かくして、試料を必要に応じて適当な溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液とし、当該混合液に前記イムノクロマトグラフ法用試験具１の上流（試料添加部材３）側を浸すと、当該混合液は、試料添加部材３を通過して標識保持部材４において、標識された第一の抗体と混合される。
その際、前記混合液中にトリインフルエンザウイルス（抗原）が存在すれば、抗原抗体反応により標識保持部材４と第一の抗体とが結合して複合体が形成される。
この複合体は、クロマト用膜担体５中をクロマト展開されて判定領域５Ａに到達し、そこに固定された第二の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。
このとき、標識物質として青色ラテックス粒子等の着色合成高分子粒子が使用されていれば、当該粒子の集積により判定領域５Ａが青色に着色するので、直ちにトリインフルエンザウイルスの存在を目視により確認することができる。
Thus, if the sample is mixed with an appropriate solvent as required to obtain a mixed solution that can be chromatographed, and the upstream (sample addition member 3) side of the immunochromatographic test device 1 is immersed in the mixed solution, the mixing is performed. The liquid passes through the sample addition member 3 and is mixed with the labeled first antibody in the label holding member 4.
At this time, if the avian influenza virus (antigen) is present in the mixed solution, the label holding member 4 and the first antibody are bound to form a complex by the antigen-antibody reaction.
This complex is chromatographed in the chromatographic membrane carrier 5 to reach the determination region 5A, and is captured by an antigen-antibody reaction with the second antibody immobilized thereon.
At this time, if colored synthetic polymer particles such as blue latex particles are used as the labeling substance, the determination region 5A is colored blue due to the accumulation of the particles, so the presence of avian influenza virus should be immediately confirmed visually. Can do.
なお、クロマト用膜担体５は、判定領域を１つだけでなく２つ以上備えることも可能である。また、クロマト用膜担体５は、対照部を備えていてもよい。対照部を備える場合、標識保持部材４に、例えば、赤色ラテックス粒子で標識されたアビジンを保持し、クロマト用膜担体５の対照部に、アビジンと特異的に結合するビオチンを固定すればよい。また、アビジンとビオチンの組み合わせの代わりに、例えば、２，４−ジニトロフェノール（ＤＮＰ）等のハプテンとそのハプテンを認識する抗体とを組み合わせて使用することができる。このとき、ハプテンとしては、測定に使用する試料中に存在しないハプテンを使用することが好ましい。 Note that the chromatographic membrane carrier 5 can include not only one determination region but also two or more determination regions. Further, the chromatographic membrane carrier 5 may include a control part. When the control part is provided, for example, the label holding member 4 may hold avidin labeled with red latex particles, and biotin that specifically binds to avidin may be fixed to the control part of the chromatographic membrane carrier 5. Further, instead of the combination of avidin and biotin, for example, a hapten such as 2,4-dinitrophenol (DNP) and an antibody that recognizes the hapten can be used in combination. At this time, it is preferable to use a hapten that does not exist in the sample used for measurement.
また、本発明のトリインフスエンザウイルス検出方法に用いられる抗インフルエンザウイルス抗体が反応性を示す亜型は、Ｈ１５亜型までに限定されるわけではなく、現在インフルエンザＡ型ウイルスの亜型として確認されているＨ１６亜型、さらには将来確認されるであろうＨ１７以降の亜型についても含まれる。 In addition, the subtype in which the anti-influenza virus antibody used in the method for detecting avian influenza virus of the present invention is reactive is not limited to the H15 subtype, and is currently confirmed as a subtype of influenza A virus. H16 subtypes that have been identified, and subtypes after H17 that will be identified in the future are also included.
以下の実施例、比較例及び試験例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例及び比較例のイムノクロマトグラフ用試験具に使用する抗体は、先に説明したハイブリドーマ（特許生物寄託センター、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０８２２）により産生されるモノクローナル抗体４Ｅ３、およびハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １Ｃ１０により産生されるモノクローナル抗体（以下、「１Ｃ１０」という）である。当該ハイブリドーマは、大阪府立公衆衛生研究所により独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に寄託されたものであり、平成１８年２月２４日付で受領され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０８２１が付与されている。
ここで、インフルエンザウイルスが感染したＭＤＣＫ細胞を用いて、酵素抗体法によりインフルエンザウイルスに対する４Ｅ３又は１Ｃ１０の反応性を調べた。９６ウェルマイクロプレートのウェルにおいてインフルエンザウイルスとＭＤＣＫ細胞を１２時間インキュベーションし、ＭＤＣＫ細胞にインフルエンザウイルスを感染させた。次に、感染したＭＤＣＫ細胞をエタノールで固定し、４Ｅ３を生産するハイブリドーマを培養して得られる上清又は１Ｃ１０を生産するハイブリドーマを培養して得られる上清と３０分間室温にてインキュベーションした。インキュベーション後、ＰＢＳで洗浄し、次にペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄し、ジアミノベンチジンを添加して抗マウス免疫グロブリン抗体を視覚化した。この方法では、ＭＤＣＫ細胞に感染させたインフルエンザウイルスと４Ｅ３又は１Ｃ１０の抗体とが結合した場合には抗マウス免疫グロブリン抗体の標識が検出されるが、結合しなかった場合には標識が検出されない。なお、インフルエンザウイルスとしては、表１に示したようにヒトから分離したインフルエンザＡ型ウイルス（１４種類）、トリから分離したインフルエンザＡ型ウイルス（１６種類）、インフルエンザＢ型ウイルス（５種類）を使用した。
その結果を表１に示す。表１において、ＭＤＣＫ細胞に感染させたインフルエンザウイルスと抗体との結合が認められたものを（＋）、結合が認められなかったものを（−）とした。
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, comparative examples and test examples, but the present invention is not limited thereto.
The antibodies used in the immunochromatographic test devices of Examples and Comparative Examples are the monoclonal antibody 4E3 produced by the hybridoma described above (patent biological deposit center, accession number FERM P-20822), and the hybridoma Mouse-Mouse Hybridoma 1C10. Is a monoclonal antibody (hereinafter referred to as “1C10”). The hybridoma was deposited by the Osaka Prefectural Institute of Public Health at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, February 6). It has been received on the 24th and has been assigned a deposit number of FERM P-20821.
Here, the reactivity of 4E3 or 1C10 against influenza virus was examined by enzyme antibody method using MDCK cells infected with influenza virus. Influenza virus and MDCK cells were incubated for 12 hours in wells of a 96-well microplate to infect MDCK cells with influenza virus. Next, the infected MDCK cells were fixed with ethanol and incubated with a supernatant obtained by culturing a hybridoma producing 4E3 or a supernatant obtained by culturing a hybridoma producing 1C10 at room temperature for 30 minutes. After incubation, the plate was washed with PBS, and then reacted with peroxidase-labeled anti-mouse immunoglobulin antibody for 30 minutes. After the reaction, it was washed with PBS, and diaminobenzidine was added to visualize the anti-mouse immunoglobulin antibody. In this method, the label of the anti-mouse immunoglobulin antibody is detected when the influenza virus infected with MDCK cells binds to the 4E3 or 1C10 antibody, but the label is not detected when it does not bind. As shown in Table 1, influenza A viruses (14 types) isolated from humans, influenza A viruses (16 types) isolated from birds, and influenza B viruses (5 types) are used. did.
The results are shown in Table 1. In Table 1, (+) indicates that the binding between the influenza virus infected with MDCK cells and the antibody was observed, and (−) indicates that the binding was not observed.
表１より、４Ｅ３はトリから分離されたインフルエンザＡ型ウイルスＨ３〜１５亜型に反応性を示すことが確認された。また、１Ｃ１０はトリから分離されたインフルエンザＡ型ウイルスＨ５亜型のみに反応性を示すことが確認された。 From Table 1, it was confirmed that 4E3 shows reactivity with influenza A virus H3-15 subtypes isolated from birds. It was also confirmed that 1C10 was reactive only with influenza A virus H5 subtype isolated from birds.
実施例１
標識物質で標識される第一の抗体及びクロマト用膜担体５に固定される第二の抗体として上述した４Ｅ３を使用し、以下の方法に従ってイムノクロマトグラフ用試験具１（以下、試験具という）を作製した。
まず、図１に示すように、ニトロセルロースメンブレンからなるクロマト用膜担体５の判定領域５Ａに、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した４Ｅ３を塗布し、５０℃で３０分間乾燥させた。
乾燥後のクロマト用膜担体５をブロッキング液（ＢＳＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に浸漬し、ブロッキングを行った。その後、洗浄液（ＳＤＳを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄し、４０℃で１２０分間乾燥させ、クロマト用膜担体５を得た。
Example 1
Using the above-mentioned 4E3 as the first antibody labeled with the labeling substance and the second antibody immobilized on the chromatographic membrane carrier 5, the immunochromatographic test device 1 (hereinafter referred to as the test device) is prepared according to the following method. Produced.
First, as shown in FIG. 1, using an antibody coater (BioDot), the determination region 5A of the chromatographic membrane carrier 5 made of a nitrocellulose membrane is 2.0 mg / pH with a phosphate buffer (pH 7.0). 4E3 diluted to a concentration of mL was applied and dried at 50 ° C. for 30 minutes.
The chromatographic membrane carrier 5 after drying was immersed in a blocking solution (phosphate buffer solution (pH 7.0) containing BSA) for blocking. Thereafter, the membrane was washed with a washing solution (phosphate buffer solution (pH 7.0) containing SDS) and dried at 40 ° C. for 120 minutes to obtain a membrane carrier 5 for chromatography.
次に、４Ｅ３を青色着色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．３μｍ）に感作し、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、４Ｅ３感作ラテックス粒子を作製した。感作する際の抗体の濃度は、１％ラテックス粒子１ｍＬに２００μｇ ＩｇＧとなる濃度であった。この４Ｅ３感作ラテックス粒子を、ガラス繊維製パッドに添加後、真空乾燥機で乾燥させ、標識保持部材４を得た。
そして、このクロマト用膜担体５及び標識保持部材４を用いて、常法により、実施例１の試験具を得た。
Next, 4E3 is sensitized to blue colored polystyrene latex particles (particle size 0.3 μm) and suspended in a dispersion buffer solution (phosphate buffer solution (pH 7.0) containing BSA and sucrose). Made latex particles. The concentration of the antibody at the time of sensitization was such that 200 μg IgG was present in 1 mL of 1% latex particles. The 4E3 sensitized latex particles were added to a glass fiber pad and then dried with a vacuum dryer to obtain a label holding member 4.
Using the chromatographic membrane carrier 5 and the label holding member 4, the test device of Example 1 was obtained by a conventional method.
試験例１
実施例１の試験具を用い、ヒトから分離されたインフルエンザウイルス（ヒトインフルエンザウイルス）に対する反応性を検討した。
（１） 本試験例では、下記の表２に示した１９種類のヒトインフルエンザウイルスを鶏卵培養し、得られたウイルスを生理食塩水で希釈したものをウイルス液として用いた。ウイルス液中のウイルス濃度はＨＡ価又はＦＦＵで表される。各ウイルス液中のウイルス濃度は、表２の通りである。ＨＡ価は、インフルエンザのもつ赤血球凝集能を利用したインフルエンザ定量法（赤血球凝集法）の単位で、感染性のあるウイルスの活性を示す基準であり、ＦＦＵ(focus forming unit)は、細胞に感染したウイルスを免疫染色することによって確認できるウイルス感染細胞数から算出されたウイルス数を表す単位である。なお、表２中のＨＡ価又はＦＦＵにおいて（−）と示されているのは、ＨＡ価又はＦＦＵが未測定であることを表している。
（２） 次に、検体抽出試薬（０．３ｗ／ｖ％ ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）を含むリン酸緩衝液ｐＨ７．３）８００μＬに、所定濃度のウイルス液１５０μＬを加えて混合し、試料とした。
（３） 上記（２）で調製した試料約２００μＬをガラス試験管に滴下し、そこに上記方法で作製した試験具１の上流（試料添加部材３）側を入れて放置し、約１０分後に判定領域５Ａにおける呈色を肉眼で判定した。判定は、呈色が認められたものを（＋）、呈色が認められなかったものを（−）として評価した。これらの結果を表２に示す。
Test example 1
Using the test device of Example 1, the reactivity to influenza virus (human influenza virus) isolated from humans was examined.
(1) In this test example, 19 types of human influenza viruses shown in Table 2 below were cultured in eggs and the resulting virus diluted with physiological saline was used as the virus solution. The virus concentration in the virus solution is represented by HA value or FFU. Table 2 shows the virus concentration in each virus solution. HA titer is a unit of influenza quantification method (hemagglutination method) using the hemagglutination ability of influenza and is a standard indicating the activity of infectious virus. FFU (focus forming unit) is infected with cells. This is a unit representing the number of viruses calculated from the number of virus-infected cells that can be confirmed by immunostaining the virus. In Table 2, the HA value or FFU shown as (−) indicates that the HA value or FFU has not been measured.
(2) Next, the sample extraction reagent (phosphate buffer solution pH 7.3 containing 0.3 w / v% NP-40 (polyoxyethylene (9) octylphenyl ether)) 800 μL is added with 150 μL of a virus solution having a predetermined concentration. In addition, it mixed and it was set as the sample.
(3) About 200 μL of the sample prepared in (2) above is dropped into a glass test tube, and the upstream side (sample addition member 3) side of the test device 1 prepared by the above method is put in the glass test tube. The coloration in the determination area 5A was determined with the naked eye. The evaluation was evaluated as (+) when coloration was observed and (-) when no coloration was observed. These results are shown in Table 2.
なお、比較例として、第一の抗体及び第二の抗体として上記１Ｃ１０を用い、それ以外は実施例１と同様にして試験具を作製した（比較例１）。また、第一の抗体として４Ｅ３、第二の抗体として１Ｃ１０を用い、それ以外は実施例１と同様にして試験具を作製した（比較例２）。
また、市販されているヒト用インフルエンザ検査キットであるポクテム インフルエンザＡ／Ｂ（シスメックス）を比較例３とした。比較例１〜２については上記試験例１と同様にして評価を行った。比較例３については、キットに付属するマニュアルに従って評価を行った。これらの結果を表２に併せて示す。
As a comparative example, a test device was prepared in the same manner as in Example 1 except that 1C10 was used as the first antibody and the second antibody (Comparative Example 1). A test device was prepared in the same manner as in Example 1 except that 4E3 was used as the first antibody and 1C10 was used as the second antibody (Comparative Example 2).
Moreover, Poctem influenza A / B (Sysmex), which is a commercially available influenza test kit for humans, was used as Comparative Example 3. Comparative Examples 1 and 2 were evaluated in the same manner as in Test Example 1 above. Comparative Example 3 was evaluated according to the manual attached to the kit. These results are also shown in Table 2.
表２から、実施例１、比較例１及び比較例２の試験具は、ヒトから分離されたインフルエンザウイルス（ヒトインフルエンザウイルス）とは全く反応しないことがわかった。これに対して、市販のヒト用インフルエンザ検査キットである比較例３は、試験したすべてのヒトインフルエンザウイルスに対して反応性を示した。 From Table 2, it was found that the test devices of Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 did not react at all with influenza virus (human influenza virus) isolated from humans. In contrast, Comparative Example 3, which is a commercially available human influenza test kit, showed reactivity with all human influenza viruses tested.
試験例２
次に、実施例１、比較例１〜３の試験具が、トリから分離されたインフルエンザウイルス（トリインフルエンザウイルス）と反応するかを検討した。
本試験例では、下記の表３に示した１７種類のヒトインフルエンザウイルスを鶏卵培養し、得られたウイルスを生理食塩水で希釈したものをウイルス液として用いた。各ウイルス液中のウイルス濃度は、表３の通りである。なお、表３中のＨＡ価又はＦＦＵにおいて（−）と示されているのは、ＨＡ価又はＦＦＵが未測定であることを表している。
Test example 2
Next, it was examined whether the test devices of Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 would react with influenza virus isolated from birds (avian influenza virus).
In this test example, 17 types of human influenza viruses shown in Table 3 below were cultured in chicken eggs, and the resulting virus diluted with physiological saline was used as the virus solution. Table 3 shows the virus concentration in each virus solution. In Table 3, the HA value or FFU indicated by (-) indicates that the HA value or FFU has not been measured.
表３から、実施例１の試験具は、試験したトリインフルエンザウイルス（Ｈ３〜１５亜型）すべてに対して反応性を示すことがわかった。これに対して、比較例１及び２の試験具は、トリインフルエンザウイルスＨ５亜型としか反応しなかった。比較例３の試験具（市販のヒト用インフルエンザ検査キット）は、試験したすべてのトリインフルエンザウイルスに対して反応性を示した。
試験例１及び試験例２の結果から、実施例１及び比較例１〜２の試験具は、ヒトインフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１〜３亜型）及びＢ型）とは反応せず、トリインフルエンザウイルスに反応する抗インフルエンザウイルス抗体（４Ｅ３又は１Ｃ１０）を第二の抗体として用いているので、今までの試験具（比較例３）がヒト由来のインフルエンザウイルスであるかトリ由来のインフルエンザウイルスであるかを区別することなくインフルエンザＡ型ウイルスとして検出していたのに対して、ヒト由来かトリ由来かを区別してトリ由来のインフルエンザＡ型ウイルスを検出することができる。さらに、比較例１〜２の試験具ではトリインフルエンザウイルスＨ５亜型しか検出できないのに対し、実施例１の試験具に使用されている４Ｅ３はトリインフルエンザウイルスの複数の亜型に反応するので、トリインフルエンザウイルスの複数種の亜型を検出することができる。すなわち、実施例１の試験具を用いることで、トリインフルエンザウイルスの複数種の亜型を検出することが可能になる。
From Table 3, it was found that the test device of Example 1 showed reactivity to all tested avian influenza viruses (H3-15 subtype). In contrast, the test devices of Comparative Examples 1 and 2 reacted only with the avian influenza virus H5 subtype. The test device of Comparative Example 3 (commercially available human influenza test kit) showed reactivity with all tested avian influenza viruses.
From the results of Test Example 1 and Test Example 2, the test devices of Example 1 and Comparative Examples 1-2 did not react with human influenza viruses (types A (H1-3) and type B), and avian influenza Since the anti-influenza virus antibody (4E3 or 1C10) that reacts with the virus is used as the second antibody, the conventional test device (Comparative Example 3) is a human-derived influenza virus or an avian-derived influenza virus. It was detected as an influenza A virus without distinguishing between them, whereas an avian-derived influenza A virus can be detected by distinguishing between human and avian origin. Furthermore, since only the avian influenza virus H5 subtype can be detected in the test devices of Comparative Examples 1 and 2, 4E3 used in the test device of Example 1 reacts with a plurality of subtypes of avian influenza virus. Multiple subtypes of avian influenza virus can be detected. That is, by using the test device of Example 1, it is possible to detect a plurality of subtypes of avian influenza virus.
試験例３
実施例１、比較例１〜２の試験具を用い、２種類のトリインフルエンザウイルスＨ５亜型で希釈試験を行い、各試験具の感度を調べた。
本試験例では、トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ２（Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨＫ／３４２／７８）及びＨ５Ｎ９（Ａ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７３２／６６）を生理食塩水で希釈したものをウイルス液として用いた。具体的には、トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ２のウイルス液は、まず１．１×１０７ＦＦＵ／ｍＬのウイルス濃度となるウイルス液を調製し、さらにこれを段階希釈して下記の表４に記載のウイルス濃度となるウイルス液を調製した。トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ９のウイルス液は、まず１．３７５×１０６ＦＦＵ／ｍＬのウイルス濃度となるウイルス液を調製し、さらにこれを段階希釈して下記の表５に記載のウイルス濃度となるウイルス液を調製した。このウイルス液を用いて、上記試験例１と同様に試験を行った。トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ２の結果を表４に、トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ９の結果を表５に示す。
Test example 3
Using the test devices of Example 1 and Comparative Examples 1 and 2, a dilution test was conducted with two types of avian influenza virus H5 subtype, and the sensitivity of each test device was examined.
In this test example, avian influenza virus H5N2 (A / Duck / HK / 342/78) and H5N9 (A / Turkey / Ontario / 7773/66) diluted with physiological saline were used as virus solutions. Specifically, as a virus solution of avian influenza virus H5N2, first, a virus solution having a virus concentration of 1.1 × 10 7 FFU / mL was prepared, and this was serially diluted to obtain the viruses described in Table 4 below. A virus solution having a concentration was prepared. As a virus solution of the avian influenza virus H5N9, first, a virus solution having a virus concentration of 1.375 × 10 6 FFU / mL was prepared, and this was serially diluted to obtain virus solutions having the virus concentrations shown in Table 5 below. Was prepared. A test was conducted in the same manner as in Test Example 1 using this virus solution. The results of avian influenza virus H5N2 are shown in Table 4, and the results of avian influenza virus H5N9 are shown in Table 5.
表４及び表５より、第一及び第二の抗体として４Ｅ３を使用した実施例１の試験具は、第二の抗体として１Ｃ１０を使用した比較例１及び２の試験具に比べて、トリインフルエンザウイルスＨ５亜型を感度よく検出できることがわかった。 From Tables 4 and 5, the test device of Example 1 using 4E3 as the first and second antibodies is more avian influenza than the test devices of Comparative Examples 1 and 2 using 1C10 as the second antibody. It was found that the virus H5 subtype can be detected with high sensitivity.
試験例４
実施例１の試験具を用い、ヒトに感染したトリインフルエンザウイルスに対する反応性を検討した。
本試験例では、下記の表６に示した１０種類のトリインフルエンザウイルスに感染したヒトから咽頭拭い液を採取し、ＭＤＣＫ細胞に接種して４〜５日培養した。培養後、得られた培養液の上清を回収した。これをウイルス液として用い、上記試験例１と同様に試験を行った。また、比較例として、上記比較例３を用い、キットに付属するマニュアルに従って評価を行った。これらの結果を表６に併せて示す。
Test example 4
Using the test device of Example 1, the reactivity to avian influenza virus infecting humans was examined.
In this test example, a throat swab was collected from humans infected with 10 types of avian influenza viruses shown in Table 6 below, inoculated into MDCK cells, and cultured for 4 to 5 days. After the culture, the supernatant of the obtained culture broth was collected. Using this as a virus solution, a test was conducted in the same manner as in Test Example 1 above. As a comparative example, the above comparative example 3 was used, and evaluation was performed according to the manual attached to the kit. These results are also shown in Table 6.
表６より、実施例１の試験具は、ヒトに感染したトリインフルエンザウイルスを検出することができることがわかった。 From Table 6, it was found that the test device of Example 1 can detect avian influenza virus that has infected humans.
次に、第一の抗体として、２種類以上の抗インフルエンザ抗体を使用することが可能であるかを検討すべく、実施例２の試験具を作製した。
実施例２
第一の抗体として、４Ｅ３と１Ｃ１０とを等量ずつ使用し、それ以外は上記実施例１と同様にして、実施例２の試験具を得た。
Next, in order to examine whether it is possible to use two or more types of anti-influenza antibodies as the first antibody, the test device of Example 2 was prepared.
Example 2
A test device of Example 2 was obtained in the same manner as in Example 1 except that 4E3 and 1C10 were used in equal amounts as the first antibody.
試験例５
実施例１及び実施例２の試験具を用い、試験例３とは異なるトリインフルエンザウイルスＨ５亜型に対する試験具の感度を調べた。
本試験例では、トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ３（Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨＫ／８２０／８０）を用い、生理食塩水で希釈してウイルス濃度３．４×１０６ＦＦＵ／ｍＬとした以外は、試験例３と同様に試験を行った。その結果を表８に示す。なお、各バンドは、青色の呈色度合いに応じて、「−」、「Ｗ」、「１＋」、「２＋」及び「３＋」の５段階に区別して判定した。「−」、「Ｗ」、「１＋」、「２＋」及び「３＋」は、出現したバンドを、ＴＲＳ３０００ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｔｒｉｐ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＤｏｔ社）で測定した場合に得られる測定値に基づいて、表７に記載の基準で設定した。表中のＲＯＤ値とは、バンドの測定値からニトロセルロースメンブレンの濃淡を測定した値をバックグラウンドとして差し引いた値である。ちなみに、青色のバンドを肉眼で確認することができるのは、「Ｗ」、「１＋」、「２＋」及び「３＋」である。
Test Example 5
Using the test device of Example 1 and Example 2, the sensitivity of the test device to avian influenza virus H5 subtype different from Test Example 3 was examined.
In this test example, avian influenza virus H5N3 (A / Duck / HK / 820/80) was used and diluted with physiological saline to a virus concentration of 3.4 × 10 6 FFU / mL. A similar test was conducted. The results are shown in Table 8. Each band was determined by distinguishing it into five levels of “−”, “W”, “1+”, “2+”, and “3+” according to the degree of blue coloration. “−”, “W”, “1+”, “2+” and “3+” are shown in Table 7 based on the measured values obtained when the appearing bands were measured with TRS3000 Membrane Strip Reader (BioDot). Set according to the criteria described. The ROD value in the table is a value obtained by subtracting, as a background, a value obtained by measuring the density of the nitrocellulose membrane from the measured value of the band. Incidentally, it is “W”, “1+”, “2+” and “3+” that the blue band can be confirmed with the naked eye.
表８から、実施例１及び実施例２の試験具は、同程度の感度でトリインフルエンザウイルスを検出することができることがわかった。このことから、第一の抗体として４Ｅ３とトリインフルエンザウイルスに反応性を示す他の抗インフルエンザウイルス抗体との組み合わせで使用し、第二の抗体として４Ｅ３を使用した試験具でも、トリインフルエンザウイルスを検出することができることがわかる。なお、感度は実施例１の試験具の方がやや良い。 From Table 8, it was found that the test devices of Example 1 and Example 2 can detect avian influenza viruses with the same sensitivity. From this, it is possible to detect avian influenza virus even in a test device using 4E3 as a first antibody in combination with another anti-influenza virus antibody reactive to avian influenza virus and using 4E3 as a second antibody. You can see that you can. The sensitivity of the test device of Example 1 is slightly better.
試験例６
免疫沈降法により、上記試験例で使用したモノクローナル抗体４Ｅ３及び１Ｃ１０が認識する抗原を特定した。
ウイルスとして、インフルエンザウイルスＨ３亜型であるＡ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｙｕ／１５９／９３（Ｈ３Ｎ２）、及びインフルエンザウイルスＨ５亜型であるＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７３２／６６（Ｈ５Ｎ９）を使用した。
抗体として、上記４Ｅ３及び１Ｃ１０、インフルエンザＡ型ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を認識する抗体である７３０４（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社）、インフルエンザＢ型ウイルスの核タンパク質（ＮＰ）を認識する抗体である４１０２７（Ｃａｐｒｉｃｏｎ社）、及びインフルエンザＡ型ウイルスＨ３亜型のヘマグルチニン（ＨＡ）を認識する抗体であるＦ４９（タカラバイオ（株））を使用した。
Test Example 6
Antigens recognized by the monoclonal antibodies 4E3 and 1C10 used in the above test examples were identified by immunoprecipitation.
As viruses, A / Kitakyusyu / 159/93 (H3N2), which is an influenza virus H3 subtype, and A / Turkey / Ontario / 7732/66 (H5N9), which is an influenza virus H5 subtype, were used.
As antibodies, 4E3 and 1C10, 7304 (Medix Biochemica), which recognizes nucleoprotein (NP) of influenza A virus, 41027 (Capricon), which recognizes nucleoprotein (NP) of influenza B virus And F49 (Takara Bio Inc.), an antibody that recognizes hemagglutinin (HA) of influenza A virus H3 subtype.
１．ウイルス感染
６ｗｅｌｌにコンフルエントになったＭＣＤＫ細胞に上記ウイルスを１時間感染させた。上清を除去し、分離用培地を１ｍＬ加えて一昼夜培養した。スクレーパーで細胞をチューブに回収し、遠心後、Ｃｏｌｄ ＰＢＳ（−）で洗浄した。溶解液を加えてソニケーションして細胞を破砕し、そのままドライアイスで保存した。
２．標識及び免疫沈降
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用し、このキット付属のマニュアルに従って標識及び免疫沈降を行った。ここでは、まずウイルスのタンパク質をビオチン化する。そして、ビオチン化ウイルスタンパク質、抗体及びプロテインＡ−セファロースを混合して、プロテインＡ−セファロース上に抗体と当該抗体に特異的に結合するビオチン化ウイルスタンパク質との複合体を形成させる。
３．電気泳動
上記セファロースに５０μＬの電気泳動バッファーを添加し、１００℃で３分間ボイルした。１０μＬずつサンプルをグラジェントゲル（５−２０％）にアプライし、３０ｍＡで９０分間電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した。電気泳動後のゲル中のタンパク質を、２５０ｍＡ、２時間でＰＶＤＦメンブレンに転写した。その後、５％スキムミルク・ＰＢＳ（−）でブロッキングし、メンブレンを３回洗浄した。１：１０００希釈したストレプトアビジン−ＰＯＤ溶液で３０分間反応させてメンブレンを洗浄し、４−クロロナフトール液で検出した。その結果を図２に示す。
1. Virus infection MCDK cells confluent in 6 wells were infected with the virus for 1 hour. The supernatant was removed, and 1 mL of a separation medium was added and cultured overnight. Cells were collected in a tube with a scraper, centrifuged, and washed with Cold PBS (−). Lysate was added and sonicated to disrupt the cells and stored as is on dry ice.
2. Labeling and immunoprecipitation Labeling and immunoprecipitation were performed using Cellular Labeling and immunoprecipitation kit (Roche Diagnostics) according to the manual attached to this kit. Here, the viral protein is first biotinylated. Then, a biotinylated virus protein, an antibody, and protein A-sepharose are mixed to form a complex of the antibody and a biotinylated virus protein that specifically binds to the antibody on protein A-sepharose.
3. Electrophoresis 50 μL of electrophoresis buffer was added to the Sepharose and boiled at 100 ° C. for 3 minutes. 10 μL of each sample was applied to a gradient gel (5-20%) and electrophoresed at 30 mA for 90 minutes (SDS-PAGE). The protein in the gel after electrophoresis was transferred to a PVDF membrane at 250 mA for 2 hours. Thereafter, the membrane was blocked with 5% skim milk / PBS (−), and the membrane was washed three times. The membrane was washed by reacting with 1: 1000 diluted streptavidin-POD solution for 30 minutes, and detected with 4-chloronaphthol solution. The result is shown in FIG.
図２から、４Ｅ３のＨ５ウイルスのところで出現したバンドが、７３０４（Ａ型インフルエンザの核タンパク質（ＮＰ）を認識する抗体）で出現したバンドと同じ位置であることから、４Ｅ３がトリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ９）の核タンパク質（ＮＰ）を認識する抗体であることが確認された。また、１Ｃ１０のＨ５ウイルスのところで出現したバンドが、Ｆ４９で出現したバンドと同じ位置であることから、１Ｃ１０がトリインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ９）のヘマグルチニン（ＨＡ）を認識する抗体であることが確認された。 From FIG. 2, since the band that appeared in the 4E3 H5 virus was at the same position as the band that appeared in 7304 (an antibody recognizing influenza A nucleoprotein (NP)), 4E3 was avian influenza virus (H5N9). ) Was recognized as an antibody that recognizes the nucleoprotein (NP). In addition, since the band that appeared in the 1C10 H5 virus was at the same position as the band that appeared in F49, it was confirmed that 1C10 is an antibody that recognizes hemagglutinin (HA) of avian influenza virus (H5N9). .
試験例７
上記試験例で使用したモノクローナル抗体である４Ｅ３が認識するエピトープを特定することを目的として以下のような実験を行った。
Test Example 7
The following experiment was conducted for the purpose of specifying the epitope recognized by 4E3, which is the monoclonal antibody used in the above test example.
（１）遺伝子組換え核タンパク質（ＮＰ）の作製
大阪府立公衆衛生研究所から入手したヒトインフルエンザウイルス株（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４）を用いて、ヒトインフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞に感染させ、感染したＭＤＣＫ細胞を培養した。得られた培養上清からＱＩＡＧＥＮ Ｍａｇｔｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ６ＧＣ（ＱＩＡＧＥＮ）及びＥＺ Ｖｉｒｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ試薬（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてウイルス核酸を抽出した。そして、以下のプライマー（配列番号１及び２）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、抽出したウイルス核酸からヒトインフルエンザウイルスＮＰをコードする領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。
フォワードプライマー：5’-ATGGCGTCCCAAGGCACCAA-3’（配列番号１）
リバースプライマー：5’-TTAATTGTCGTACTCCTCTGCA-3’（配列番号２）
上記で増幅したヒトインフルエンザウイルスＮＰをコードする領域を含むＤＮＡ断片に、制限酵素（ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ）により切断される部位及び６つのヒスチジン残基をコードする配列を付加するために、以下のようなプライマー（配列番号３及び４）を用いてＰＣＲを行った。
フォワードプライマー：5’-ATGGTACCATGGCGTCCCAAGGCACCAA-3’（配列番号３）
リバースプライマー：5’-TAGAATTCTAGTGATGGTGATGGTGATGATTGTCGTACTCCTCTGCATT-3’（配列番号４）
ゆえに、本試験例で得られる遺伝子組換えＮＰはＣ末端に６個のヒスチジン残基が付加される。
(1) Production of genetically modified nuclear protein (NP) Using human influenza virus strain (Puerto Rico / 8/34) obtained from Osaka Prefectural Public Health Research Institute, human influenza virus was infected to MDCK cells and infected. MDCK cells were cultured. Viral nucleic acid was extracted from the obtained culture supernatant using QIAGEN Migration system 6GC (QIAGEN) and EZ Virus Mini Kit reagent (QIAGEN). Then, a DNA fragment containing a region encoding human influenza virus NP was amplified from the extracted viral nucleic acid by RT-PCR using the following primers (SEQ ID NOs: 1 and 2).
Forward primer: 5'-ATGGCGTCCCAAGGCACCAA-3 '(SEQ ID NO: 1)
Reverse primer: 5'-TTAATTGTCGTACTCCTCTGCA-3 '(SEQ ID NO: 2)
In order to add a site that is cleaved by restriction enzymes (KpnI and EcoRI) and a sequence encoding six histidine residues to the DNA fragment containing the region encoding human influenza virus NP amplified above, the following PCR was performed using primers (SEQ ID NOs: 3 and 4).
Forward primer: 5'-ATGGTACCATGGCGTCCCAAGGCACCAA-3 '(SEQ ID NO: 3)
Reverse primer: 5'-TAGAATTCTAGTGATGGTGATGGTGATGATTGTCGTACTCCTCTGCATT-3 '(SEQ ID NO: 4)
Therefore, 6 histidine residues are added to the C-terminus of the recombinant NP obtained in this test example.
大阪府立公衆衛生研究所から入手したトリインフルエンザウイルス株（Ｈ５Ｎ９／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７３２／１９６６）感染細胞を培養し、得られた培養上清から上記と同様の方法でウイルス核酸を抽出した。そして、以下のプライマー（配列番号５及び６）を用いたＲＴ−ＰＣＲ法により、抽出したウイルス核酸からトリインフルエンザウイルスＮＰをコードする領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。
フォワードプライマー：5’-ATGGCGTCTCAAGGCACCAAAC-3’（配列番号５）
リバースプライマー：5’-TTAATTGTCATATTCCTCTGCATTG-3’（配列番号６）
上記で増幅したトリインフルエンザウイルスＮＰをコードする領域を含むＤＮＡ断片に、制限酵素（ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ）により切断される部位及び６つのヒスチジン残基をコードする配列を付加するために、以下のようなプライマー（配列番号７及び８）を用いてＰＣＲを行った。
フォワードプライマー：5’-ATGGTACCATGGCGTCTCAAGGCACCAAAC-3’（配列番号７）
リバースプライマー：5’-TAGAATTCTAGTGATGGTGATGGTGATGATTGTCATATTCCTCTGCATTGTC-3’（配列番号８）
得られた各ＤＮＡ断片（制限酵素切断部位及び６つのヒスチジン残基をコードする配列を含む）を、真核細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ部位に組込み、野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクター及び野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクターを作製した。
Cells infected with avian influenza virus strain (H5N9 / Ontario / 7732/1966) obtained from Osaka Prefectural Public Health Research Institute were cultured, and viral nucleic acids were extracted from the obtained culture supernatant by the same method as described above. And the DNA fragment containing the area | region which codes avian influenza virus NP was amplified from the extracted viral nucleic acid by RT-PCR method using the following primers (sequence number 5 and 6).
Forward primer: 5'-ATGGCGTCTCAAGGCACCAAAC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Reverse primer: 5'-TTAATTGTCATATTCCTCTGCATTG-3 '(SEQ ID NO: 6)
In order to add a site cleaved by restriction enzymes (KpnI and EcoRI) and a sequence encoding 6 histidine residues to the DNA fragment containing the region encoding the avian influenza virus NP amplified above, the following PCR was performed using primers (SEQ ID NOs: 7 and 8).
Forward primer: 5'-ATGGTACCATGGCGTCTCAAGGCACCAAAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
Reverse primer: 5'-TAGAATTCTAGTGATGGTGATGGTGATGATTGTCATATTCCTCTGCATTGTC-3 '(SEQ ID NO: 8)
Each of the obtained DNA fragments (including a restriction enzyme cleavage site and a sequence encoding 6 histidine residues) was incorporated into the KpnI / EcoRI site of the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 (+) (Invitrogen). Type human influenza NP expression vector and wild type avian influenza NP expression vector were prepared.
次に、野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクターを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ）で切断し、得られた断片を電気泳動した後、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、Ｃ末端側３３９アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターとをコードする断片をそれぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
同様にして、野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクターを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ）処理し、得られた断片を電気泳動した後、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、Ｃ末端側３３９アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターとをコードする断片をそれぞれ精製した。
Next, the wild-type human influenza NP expression vector was cleaved with restriction enzymes (KpnI and BamHI), the resulting fragment was electrophoresed, and then a DNA fragment encoding the N-terminal 159 amino acids of human influenza NP, and C Fragments encoding the terminal 339 amino acids, 6 histidine residues and the vector were purified using QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN), respectively.
Similarly, a wild type avian influenza NP expression vector was treated with restriction enzymes (KpnI and BamHI), the resulting fragment was electrophoresed, and then a DNA fragment encoding the N-terminal 159 amino acids of avian influenza NP, and C Fragments encoding the terminal 339 amino acids, 6 histidine residues and the vector were purified respectively.
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、ヒトインフルエンザＮＰのＣ末端側３３９アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターとをコードする断片をライゲーションすることにより、キメラＮＰ１の発現ベクターを構築した。
同様にして、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、トリインフルエンザＮＰのＣ末端側３３９アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターとをコードする断片をライゲーションすることにより、キメラＮＰ２の発現ベクターを構築した。
DNA fragment that encodes 159 amino acids on the N-terminal side of avian influenza NP using DNA Ligation kit (Takara Bio), as well as a fragment that encodes 339 amino acids on the C-terminal side of human influenza NP, 6 histidine residues, and a vector Was ligated to construct an expression vector for chimeric NP1.
Similarly, by ligating a DNA fragment encoding the N-terminal 159 amino acids of human influenza NP, and a fragment encoding the C-terminal 339 amino acids, 6 histidine residues and the vector of avian influenza NP, chimera An expression vector for NP2 was constructed.
次に、野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクターを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＡｐａＬＩ）で切断し、上記と同様にして、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、Ｃ末端側４５３アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターをコードする断片を精製した。
さらに、野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクターを制限酵素（ＫｐｎＩおよびＡｐａＬＩ）で切断し、上記と同様にして、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片とＣ末端側４５３アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターをコードする断片を精製した。
Next, the wild-type human influenza NP expression vector was cleaved with restriction enzymes (KpnI and ApaLI), and in the same manner as described above, a DNA fragment encoding the N-terminal 45 amino acids of human influenza NP, and the C-terminal 453 amino acids And 6 histidine residues and the fragment encoding the vector was purified.
Further, the wild type avian influenza NP expression vector was cleaved with restriction enzymes (KpnI and ApaLI), and in the same manner as described above, a DNA fragment encoding the N-terminal 45 amino acids of avian influenza NP, 453 amino acids on the C-terminal side, The fragment encoding the histidine residue and the vector was purified.
ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、ヒトインフルエンザＮＰのＣ末端側４５３アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターをコードする断片をライゲーションすることにより、キメラＮＰ３の発現ベクターを構築した。
同様にして、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸をコードするＤＮＡ断片、並びに、トリインフルエンザＮＰのＣ末端側４５３アミノ酸と６つのヒスチジン残基とベクターをコードする断片をライゲーションすることにより、キメラＮＰ４の発現ベクターを構築した。
Using DNA Ligation Kit (Takara Bio), a DNA fragment encoding the N-terminal 45 amino acids of avian influenza NP, and a fragment encoding human NP C-terminal 453 amino acids, 6 histidine residues and a vector An expression vector for chimeric NP3 was constructed by ligation.
Similarly, by ligating a DNA fragment encoding the N-terminal 45 amino acids of human influenza NP, and a fragment encoding the vector of the avian influenza NP with the C-terminal 453 amino acids, 6 histidine residues, and chimeric NP4 An expression vector was constructed.
上記のようにして作製した野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクター、野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクター、キメラＮＰ１発現ベクター、キメラＮＰ２発現ベクター、キメラＮＰ３発現ベクター及びキメラＮＰ４発現ベクターは、それぞれＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。そして、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、精製後の各発現ベクターをサル腎臓由来のＣＯＳ−７細胞に導入し、５％ＣＯ２インキュベーター内で４８時間培養し、各遺伝子組換えＮＰを発現させた。このうち、野生型ヒトインフルエンザＮＰ発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｈｕｍａｎ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号９）とし、野生型トリインフルエンザＮＰ発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ａｖｉａｎ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１０）とし、キメラＮＰ１発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｃｈ１ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１１）とし、キメラＮＰ２発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｃｈ２ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１２）とし、キメラＮＰ３発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｃｈ３ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１３）とし、キメラＮＰ４発現ベクターから得られた遺伝子組換えＮＰをｒ−Ｃｈ４ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１４）とした。 The wild-type human influenza NP expression vector, the wild-type avian influenza NP expression vector, the chimeric NP1 expression vector, the chimeric NP2 expression vector, the chimeric NP3 expression vector, and the chimeric NP4 expression vector prepared as described above are respectively EndoFree Plasmid Maxi Kit ( QIAGEN). Then, using Superfect Transfection Reagent (QIAGEN), each purified expression vector is introduced into monkey kidney-derived COS-7 cells and cultured in a 5% CO 2 incubator for 48 hours to express each recombinant NP. I let you. Among these, the recombinant NP obtained from the wild-type human influenza NP expression vector was designated as r-Human Flu NP (SEQ ID NO: 9), and the recombinant NP obtained from the wild-type avian influenza NP expression vector was designated as r-Avian. Flu NP (SEQ ID NO: 10), the recombinant NP obtained from the chimeric NP1 expression vector as r-Ch1 Flu NP (SEQ ID NO: 11), and the recombinant NP obtained from the chimeric NP2 expression vector as r-Ch2 Flu NP (SEQ ID NO: 12), the recombinant NP obtained from the chimeric NP3 expression vector as r-Ch3 Flu NP (SEQ ID NO: 13), and the recombinant NP obtained from the chimeric NP4 expression vector as r-Ch4 Flu NP (SEQ ID NO: 14) was used.
図３は、ｒ−Ｈｕｍａｎ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号９）、ｒ−Ａｖｉａｎ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１０）、ｒ−Ｃｈ１ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１１）、ｒ−Ｃｈ２ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１２）、ｒ−Ｃｈ３ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１３）、及びｒ−Ｃｈ４ Ｆｌｕ ＮＰ（配列番号１４）のアミノ酸配列を模式的に示したものである。図３で示しているように、何れのアミノ酸配列も全長５０４残基であり、Ｃ末端のアミノ酸６残基（すなわちアミノ酸配列第４９９位から第５０４位）がヒスチジンになっている。 FIG. 3 shows r-Human Flu NP (SEQ ID NO: 9), r-Avian Flu NP (SEQ ID NO: 10), r-Ch1 Flu NP (SEQ ID NO: 11), r-Ch2 Flu NP (SEQ ID NO: 12), r- This figure schematically shows the amino acid sequences of Ch3 Flu NP (SEQ ID NO: 13) and r-Ch4 Flu NP (SEQ ID NO: 14). As shown in FIG. 3, each amino acid sequence has a total length of 504 residues, and the C-terminal amino acid 6 residues (that is, amino acid sequence from position 499 to position 504) is histidine.
そして、ｒ−Ｈｕｍａｎ Ｆｌｕ ＮＰのアミノ酸配列第１位から第４９８位は、ヒトインフルエンザウイルスＮＰのアミノ酸配列の全長（４９８残基）に相当する。
ｒ−Ａｖｉａｎ Ｆｌｕ ＮＰのアミノ酸配列第１位から第４９８位は、トリインフルエンザウイルスＮＰのアミノ酸配列の全長（４９８残基）に相当する。
また、ｒ−Ｃｈ１ Ｆｌｕ ＮＰのアミノ酸配列第１位から第１５９位は、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第１６０位から第４９８位は、ヒトインフルエンザＮＰのＣ末端側３３９アミノ酸に相当する。
ｒ−Ｃｈ２ Ｆｌｕ ＮＰ のアミノ酸配列第１位から第１５９位は、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側１５９アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第１６０位から第４９８位は、トリインフルエンザＮＰのＣ末端側３３９アミノ酸に相当する。
ｒ−Ｃｈ３ Ｆｌｕ ＮＰ のアミノ酸配列第１位から第４５位は、トリインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第４６位から第４９８位は、ヒトインフルエンザＮＰのＣ末端側４５３アミノ酸に相当する。
ｒ−Ｃｈ４ Ｆｌｕ ＮＰのアミノ酸配列第１位から第４５位は、ヒトインフルエンザＮＰのＮ末端側４５アミノ酸に相当し、アミノ酸配列第４６位から第４９８位は、トリインフルエンザＮＰのＣ末端側４５３アミノ酸に相当する。また、参考までに、今回作製したｒ−Ｈｕｍａｎ Ｆｌｕ ＮＰ及びｒ−Ａｖｉａｎ Ｆｌｕ ＮＰ、並びに、下記の１２種類のヒトインフルエンザウイルス株由来ＮＰ及び下記の１２種類のトリインフルエンザウイルス株由来ＮＰのアミノ酸配列を図４〜図１３に示す。
And the 1st to 498th amino acid sequence of r-Human Flu NP corresponds to the full length (498 residues) of the amino acid sequence of human influenza virus NP.
The 1st to 498th amino acid sequences of r-Avian Flu NP correspond to the full length (498 residues) of the avian influenza virus NP amino acid sequence.
In addition, the 1st to 159th amino acid sequences of r-Ch1 Flu NP correspond to 159 amino acids on the N-terminal side of avian influenza NP, and the 160th to 498th amino acid sequences represent C-terminal side of human influenza NP. It corresponds to 339 amino acids.
The 1st to 159th amino acid sequences of r-Ch2 Flu NP correspond to 159 amino acids on the N-terminal side of human influenza NP, and the 160th to 498th amino acid sequences represent 339 amino acids on the C-terminal side of avian influenza NP. It corresponds to.
The 1st to 45th amino acid sequence of r-Ch3 Flu NP corresponds to 45 amino acids on the N-terminal side of avian influenza NP, and the 46th to 498th amino acid sequences are 453 amino acids on the C-terminal side of human influenza NP. It corresponds to.
The 1st to 45th amino acid sequences of r-Ch4 Flu NP correspond to 45 amino acids on the N-terminal side of human influenza NP, and the 46th to 498th amino acid sequences represent 453 amino acids on the C-terminal side of avian influenza NP. It corresponds to. For reference, the amino acid sequences of r-Human Flu NP and r-Avian Flu NP prepared here, NP derived from the following 12 types of human influenza virus strains, and NP derived from the following 12 types of avian influenza virus strains are also shown. As shown in FIGS.
ヒトインフルエンザウイルス株：
Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１１７／１９７７（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｊａｐａｎ／１７０／６２（Ｈ２Ｎ２）
Ａ／Ｋｉｔａｋｙｕｓｈｕ／１５９／９３（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／Ｋｕｍａｍｏｔｏ／１／６５（Ｈ２Ｎ２）
Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／５／２００４（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｋｉｅｖ／５９／７９（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／１９８９（Ｈ３Ｎ２）
Ａ／Ｂｒａｚｉｌ／１１／１９７８（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／１５６８１／５９（Ｈ２Ｎ２）
Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）
Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／１９９９（Ｈ３Ｎ２）
Human influenza virus strains:
A / Hong Kong / 117/1977 (H1N1)
A / Japan / 170/62 (H2N2)
A / Kitakyushu / 159/93 (H3N2)
A / Kumamoto / 1/65 (H2N2)
A / New York / 5/2004 (H3N2)
A / PuertoRico / 8/34 (H1N1)
A / Kiev / 59/79 (H1N1)
A / Beijing / 353/1989 (H3N2)
A / Brazil / 11/1978 (H1N1)
A / Victoria / 15681/59 (H2N2)
A / New Caledonia / 20/1999 (H1N1)
A / Panama / 2007/1999 (H3N2)
トリインフルエンザウイルス株：
Ａ／Ｄｕｃｋ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／３４１／８３（Ｈ１５Ｎ８）
Ａ／Ｍａｌｌａｒｄ／Ａｓｔｒａｋａｎ／２６３／８２（Ｈ１４Ｎ８）
Ａ／ｇｕｌｌ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／７０４／１９７７（Ｈ１３Ｎ６）
Ａ／ｐｉｎｔａｉｌ／Ａｌｂｅｒｔａ／４９／２００３（Ｈ１２Ｎ５）
Ａ／ｄｕｃｋ／Ｅｎｇｌａｎｄ／１９５６（Ｈ１１Ｎ６）
Ａ／ｐｉｎｔａｉｌｄｕｃｋ／ＡＬＢ／５８４／１９８４（Ｈ１０Ｎ６）
Ａ／ｓｈｏｒｅｂｉｒｄ／ＤＥ／２６１／２００３（Ｈ９Ｎ５）
Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／６１１８／１９６８（Ｈ８Ｎ４）
Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ／Ｒ２８／０３（Ｈ７Ｎ７）
Ａ／ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ／Ａｕｓｔｒａｌｉａ／１９７２（Ｈ６Ｎ５）
Ａ／ｂｌａｃｋｄｕｃｋ／ＮｅｗＹｏｒｋ／１８４／１９８８（Ｈ５Ｎ２）
Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／Ｏｎｔａｒｉｏ／７７３２／１９６６（Ｈ５Ｎ９）
Avian influenza virus strains:
A / Duck / Australia / 341/83 (H15N8)
A / Mallard / Astrakan / 263/82 (H14N8)
A / gull / Maryland / 704/1977 (H13N6)
A / pintail / Alberta / 49/2003 (H12N5)
A / duck / England / 1956 (H11N6)
A / PintailDuck / ALB / 584/1984 (H10N6)
A / shorebird / DE / 261/2003 (H9N5)
A / turkey / Ontario / 6118/1968 (H8N4)
A / chicken / Germany / R28 / 03 (H7N7)
A / shearwater / Australia / 1972 (H6N5)
A / blackduck / NewYork / 184/1988 (H5N2)
A / turkey / Ontario / 7773/1966 (H5N9)
（２）反応性の比較
（１）で調製した遺伝子組換えＮＰを発現する各ＣＯＳ−７細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）によりシャーレから剥がし、各ＣＯＳ−７細胞をＰＢＳで洗浄した。洗浄後の各ＣＯＳ−７細胞を適量のＰＢＳ中に懸濁させ、細胞浮遊液を調製した。細胞浮遊液をスライドグラスに適量スポットし、風乾後アセトンで固定した。アセトン固定後のスライドグラスに４Ｅ３抗体液（１０μｇ／ｍｌの４Ｅ３、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を滴下し、スライドグラス上のＣＯＳ−７細胞と４Ｅ３とを反応させた。次に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１００倍希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ）をスライドグラスに滴下した。そして、蛍光顕微鏡下でスライドグラスを観察することにより、ＣＯＳ−７細胞で発現している各遺伝子組換えＮＰに対する４Ｅ３の反応性を調べた。
なお、対照として、４Ｅ３の代わりに抗Ｈｉｓタグ抗体（ＰｅｎｔａＨｉｓ、ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。結果を図１４に示す。
(2) Comparison of reactivity Each COS-7 cell expressing the recombinant NP prepared in (1) was detached from the petri dish with Trypsin-EDTA solution (manufactured by Sigma), and each COS-7 cell was washed with PBS. . Each COS-7 cell after washing was suspended in an appropriate amount of PBS to prepare a cell suspension. An appropriate amount of the cell suspension was spotted on a slide glass, air-dried and fixed with acetone. A 4E3 antibody solution (PBS containing 10 μg / ml of 4E3 and 1% BSA) was dropped onto the slide glass after fixation with acetone, and COS-7 cells on the slide glass were reacted with 4E3. Next, FITC-labeled anti-mouse Ig antibody (DAKO) diluted 100-fold with PBS containing 1% BSA was dropped onto a slide glass. Then, the reactivity of 4E3 to each recombinant NP expressed in COS-7 cells was examined by observing a slide glass under a fluorescence microscope.
As a control, an anti-His tag antibody (PentaHis, QIAGEN) was used instead of 4E3. The results are shown in FIG.
図１４より、４Ｅ３は、ｒ−Ｈｕｍａｎ Ｆｌｕ ＮＰ、ｒ−Ｃｈ２ Ｆｌｕ ＮＰ及びｒ−Ｃｈ３ Ｆｌｕ ＮＰに反応せず、ｒ−Ａｖｉａｎ Ｆｌｕ ＮＰ、ｒ−Ｃｈ１ Ｆｌｕ ＮＰ及びｒ−Ｃｈ４ Ｆｌｕ ＮＰに反応することが分かった。すなわち、４Ｅ３は、トリインフルエンザウイルスＮＰのアミノ酸配列４６位〜１５９位を含む核タンパク質には反応性を示すが、含まない核タンパク質には反応性を示さないことが分かった。このことから、４Ｅ３がトリインフルエンザウイルスＮＰのＮ末端側の特定の領域（アミノ酸配列４６位〜１５９位）内に存在するエピトープを認識していると推定できる。 From FIG. 14, 4E3 does not react with r-Human Flu NP, r-Ch2 Flu NP and r-Ch3 Flu NP, but reacts with r-Avian Flu NP, r-Ch1 Flu NP and r-Ch4 Flu NP. I understood. That is, it was found that 4E3 shows reactivity to a nucleoprotein containing amino acid sequences 46 to 159 of avian influenza virus NP, but not to a nucleoprotein not containing it. From this, it can be presumed that 4E3 recognizes an epitope present in a specific region (amino acid sequence of positions 46 to 159) on the N-terminal side of avian influenza virus NP.
１ イムノクロマトグラフ法用試験具
２ 基材
３ 試料添加部材
４ 標識保持部材
５ クロマト用膜担体
６ 吸収部材
７ 透明シール
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Test device for immunochromatography method 2 Base material 3 Sample addition member 4 Label holding member 5 Chromatographic membrane carrier 6 Absorbing member 7 Transparent seal
Claims (9)
前記患者から採取された試料を添加する試料添加部材と、
標識物質で標識された第一の抗体を担持する標識保持部材と、
第二の抗体が固定された判定領域を配置したクロマト用膜担体とを有し、
前記第一の抗体が、トリインフルエンザウイルスに反応性を示し、
前記第二の抗体が、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０８２２であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であることを特徴とするイムノクロマトグラフ法用試験具。 An immunochromatographic test device for detecting avian influenza virus in a sample collected from a patient using first and second antibodies against influenza virus,
A sample addition member for adding a sample collected from the patient;
A label holding member carrying a first antibody labeled with a labeling substance;
A chromatographic membrane carrier with a determination region on which the second antibody is fixed;
The first antibody is reactive to avian influenza virus;
The immunochromatographic test device, wherein the second antibody is a monoclonal antibody produced by a hybridoma having the accession number FERM P-20822 .
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007018400A JP5300200B2 (en) | 2006-08-31 | 2007-01-29 | Rapid diagnostic method specific to avian influenza virus |
| CN2007800323059A CN101553732B (en) | 2006-08-31 | 2007-08-31 | Rapid diagnosis method specific to avian influenza virus |
| EP07806545A EP2063270B1 (en) | 2006-08-31 | 2007-08-31 | Rapid diagnosis method specific to avian influenza virus |
| PCT/JP2007/067072 WO2008026741A1 (en) | 2006-08-31 | 2007-08-31 | Rapid diagnosis method specific to avian influenza virus |
| US12/439,432 US8298757B2 (en) | 2006-08-31 | 2007-08-31 | Rapid diagnosis method specific to avian influenza virus |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006235356 | 2006-08-31 | ||
| JP2006235356 | 2006-08-31 | ||
| JP2007018400A JP5300200B2 (en) | 2006-08-31 | 2007-01-29 | Rapid diagnostic method specific to avian influenza virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008083024A JP2008083024A (en) | 2008-04-10 |
| JP5300200B2 true JP5300200B2 (en) | 2013-09-25 |
Family
ID=39136022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007018400A Expired - Fee Related JP5300200B2 (en) | 2006-08-31 | 2007-01-29 | Rapid diagnostic method specific to avian influenza virus |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8298757B2 (en) |
| EP (1) | EP2063270B1 (en) |
| JP (1) | JP5300200B2 (en) |
| CN (1) | CN101553732B (en) |
| WO (1) | WO2008026741A1 (en) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101990575B (en) * | 2008-03-28 | 2015-06-17 | 国立大学法人北海道大学 | Anti-(influenza a virus subtype h5 hemagglutinin) monoclonal antibody |
| JP5532660B2 (en) * | 2009-04-09 | 2014-06-25 | 日立化成株式会社 | Detection apparatus and detection method |
| ITRM20090214A1 (en) * | 2009-05-05 | 2010-11-06 | Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz | KIT FOR THE IDENTIFICATION OF INFLUENCED VIRUSES |
| JP2010261912A (en) * | 2009-05-11 | 2010-11-18 | Bl:Kk | Immunology-detection method of human influenza virus h3 subtype |
| JP5630153B2 (en) * | 2010-09-01 | 2014-11-26 | 富士レビオ株式会社 | Method for determining whether the 100th amino acid of influenza A virus nucleoprotein is arginine |
| CN102778558B (en) * | 2011-05-10 | 2015-01-07 | 北京伊康纳斯生物医药科技有限公司 | Lateral reciprocating immunochromatography method and diagnosis test strip and device based on lateral reciprocating immunochromatography method |
| JP2013087069A (en) * | 2011-10-17 | 2013-05-13 | Toyobo Co Ltd | Monoclonal antibody specifically recognizing h5 subtype influenza virus |
| JP6591398B2 (en) * | 2013-04-01 | 2019-10-16 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ | Methods and kits for influenza diagnosis |
| JP6481192B2 (en) * | 2013-12-27 | 2019-03-13 | 地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所 | Rapid detection of quadrature septa |
| CN103941005B (en) * | 2014-02-17 | 2016-01-20 | 广西壮族自治区兽医研究所 | Detect the colloidal gold strip of H7 subtype avian influenza virus |
| CN105602907A (en) * | 2014-03-13 | 2016-05-25 | 华中农业大学 | Infectious bronchitis virus resistance monoclonal antibodies |
| CN104407135A (en) * | 2014-11-03 | 2015-03-11 | 清华大学深圳研究生院 | Method and kit for detecting A type influenza virus H5 and H9 subtypes |
| CN106443001A (en) * | 2016-11-29 | 2017-02-22 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | Avian influenza detection kit |
| CN107589252A (en) * | 2017-09-06 | 2018-01-16 | 扬州千代科技有限公司 | A kind of H5 subtype avian influenza virus fluorescent microsphere detection card and its application |
| CN107589253A (en) * | 2017-09-06 | 2018-01-16 | 詹爱军 | A kind of H9 subtype avian influenza virus fluorescent chromatographic test strips and its application |
| CN107831306B (en) * | 2017-10-10 | 2020-04-24 | 武汉科前生物股份有限公司 | H7 subtype avian influenza virus double-antibody sandwich ELISA kit and detection method thereof |
| US11053531B2 (en) | 2019-05-31 | 2021-07-06 | Linda Marie Petter | Tester paper and methods of use thereof for detecting a bacterial infection |
| CN113759118A (en) * | 2021-11-05 | 2021-12-07 | 山东畜牧兽医职业学院 | Avian influenza virus infection and vaccine immunity differential diagnosis detection card and preparation method thereof |
| CN114835778B (en) * | 2022-04-27 | 2023-06-06 | 华南农业大学 | A H9N2 subtype AIV MHC B2 restricted epitope peptide and its application |
| TW202449396A (en) * | 2023-04-24 | 2024-12-16 | 日商電化股份有限公司 | Test strips for lateral flow testing using wet nonwovens for body identification |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2612003A1 (en) | 1976-03-20 | 1977-09-22 | Geb Vobis Ursula Hauck | Tear off type shopping list aid - made as unit including writing base, paper roll with preprinted shopping list and tear off device |
| CN1092979C (en) * | 1999-07-01 | 2002-10-23 | 邱义能 | Method for preparing polyclonal antibody by using waterfowl |
| CN2438121Y (en) * | 2000-09-18 | 2001-07-04 | 王冰 | Biological chip for discriminating and diagnosing virus hepatitis |
| AU2003238767A1 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-19 | Penn State Research Foundation | Dot-elisa for the detection of animal viruses |
| WO2005007697A1 (en) * | 2003-07-23 | 2005-01-27 | Fujirebio Inc. | Anti-influenza type a virus monoclonal antibody and immunoassay instrument using the antibody |
| JP2006067979A (en) * | 2004-09-06 | 2006-03-16 | Bl:Kk | Immunity detecting method for influenza a type virus |
-
2007
- 2007-01-29 JP JP2007018400A patent/JP5300200B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-08-31 EP EP07806545A patent/EP2063270B1/en not_active Not-in-force
- 2007-08-31 US US12/439,432 patent/US8298757B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-08-31 WO PCT/JP2007/067072 patent/WO2008026741A1/en active Application Filing
- 2007-08-31 CN CN2007800323059A patent/CN101553732B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090311667A1 (en) | 2009-12-17 |
| CN101553732B (en) | 2013-12-25 |
| EP2063270A4 (en) | 2009-11-04 |
| CN101553732A (en) | 2009-10-07 |
| WO2008026741A1 (en) | 2008-03-06 |
| JP2008083024A (en) | 2008-04-10 |
| EP2063270A1 (en) | 2009-05-27 |
| US8298757B2 (en) | 2012-10-30 |
| EP2063270B1 (en) | 2012-11-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5300200B2 (en) | Rapid diagnostic method specific to avian influenza virus | |
| JP5849065B2 (en) | Detection method of influenza A virus H5 subtype | |
| JP5432453B2 (en) | Detection method of influenza A virus virulent strain | |
| US20110129816A1 (en) | Device for detection of influenza virus | |
| CN101470116B (en) | Colloidal gold immunity percolation sensitization method for detecting avian influenza virus and its reagent kit | |
| JP5575377B2 (en) | RS virus detection kit and immunochromatography test device using anti-RS virus monoclonal antibody, and novel anti-RS virus monoclonal antibody | |
| KR20100124720A (en) | Anti-(influenza a virus subtype h5 hemagglutinin) monoclonal antibody | |
| CN101701958A (en) | Fluorescence test strip and its application for simultaneous detection of Newcastle disease and avian influenza virus | |
| JP2014095720A (en) | Immunodetection method of influenza virus h5 subtype | |
| Atmar | Immunological detection and characterization | |
| Ho et al. | Rapid detection of H5N1 subtype influenza viruses by antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay using H5-and N1-specific monoclonal antibodies | |
| JP2010261912A (en) | Immunology-detection method of human influenza virus h3 subtype | |
| TW202128749A (en) | Antibody recognizing anti-RS virus, and immunoassay method and immunoassay instrument using same | |
| Nikkari et al. | One-incubation time-resolved fluoroimmunoassay based on monoclonal antibodies in detection of influenza A and B viruses directly in clinical | |
| Li et al. | Development of an immunochromatographic strip for rapid detection of H7 subtype avian influenza viruses | |
| Direksin et al. | An immunoperoxidase monolayer assay for the detection of antibodies against swine influenza virus | |
| Xiao et al. | Novel protein microarray for the detection of avian influenza virus antibodies and simultaneous distinction of antibodies against H5 and H7 subtypes | |
| JP5630153B2 (en) | Method for determining whether the 100th amino acid of influenza A virus nucleoprotein is arginine | |
| KR101032956B1 (en) | Rapid Diagnostic Kit for Detection of Renal Syndrome Hemorrhagic Fever-specific IgM and IgＧ Using Nucleocapsid Protein Derived from a Hearing Virus | |
| Yang et al. | Evaluation of diagnostic applications of monoclonal antibodies against avian influenza H7 viruses | |
| JP6824026B2 (en) | Influenza virus H5 subtype immunoassay | |
| TWI867090B (en) | Antibodies for identifying N protein of RS virus, and immunoassay method and immunoassay device using the antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091127 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120605 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120801 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130219 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130422 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130521 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130618 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5300200 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |