JP5243878B2 - フルクトシルバリルヒスチジン測定用酵素、およびその利用法 - Google Patents

Description

本発明は、フルクトシルバリルヒスチジンの測定に有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質に関する。より詳しくは、フルクトシルバリルヒスチジンに実質的にオキシダーゼ活性を有さないフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いて作製されたフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有する変異タンパク質である。また本発明は、フルクトシルバリルヒスチジン測定方法、該測定用試薬組成物等、上記変異タンパク質の利用法に関する。

糖尿病患者の血糖コントロールマーカーとして、血液タンパク質に含まれる糖化タンパク質であるヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、グリコアルブミンの測定が重用されている。糖化タンパク質は、血液中に存在するＤ−グルコースと、血液タンパク質を構成するアミノ酸残基が反応して生成する。血液タンパク質の主な糖化部位は、リジン残基のε−アミノ基および血液タンパク質のアミノ末端アミノ酸のα−アミノ基である。ＨｂＡ１ｃを測定する場合、Ｄ−グルコースがヘモグロビンβ鎖のアミノ末端アミノ酸であるバリンのα−アミノ基に結合して生じた糖化タンパク質の量を測定する。

近年、血液中の糖化タンパク質を簡便且つ短時間で測定できる酵素的測定法が開発され、既に商品化されている。酵素的測定法を利用することにより、糖化タンパク質をハイスループットに測定することが可能となり、臨床検査分野で役立てられている。酵素法は、まず、プロテアーゼで糖化タンパク質を加水分解し、次に生じたフルクトシルバリン、フルクトシルリジン、フルクトシルバリルヒスチジンなどの糖化アミノ酸をフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）で酸化的加水分解する。最後に、オキシダーゼ反応により生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ−色原体反応システムにより比色定量する（特許文献１〜１１参照）。

酵素法による糖化タンパク質の測定では、主反応酵素であるＦＡＯＤの基質特異性が重要な要素となる。例えば、ＨｂＡ１ｃの測定では、フルクトシルバリンに対する特異性の高い酵素が望まれている。また、糖化ヘモグロビンのβ鎖に特異的な測定を行うためには、フルクトシルバリルヒスチジンに作用する酵素が望まれている。これは、ヘモグロビンα鎖およびβ鎖のアミノ末端アミノ酸が共にバリンであることから、β鎖に特異的な測定を行うためには、アミノ末端アミノ酸２残基（すなわち、フルクトシルバリルヒスチジン）の認識が必要であるためである。（特許文献１２、特許文献１３参照）。

これまでに、フルクトシルバリルヒスチジンに作用するオキシダーゼは、数種の糸状菌、またはその遺伝子組換え体より抽出、精製されている。また、該フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼをコードする遺伝子も単離されている（特許文献１４、非特許文献１、非特許文献２参照）。

しかしながら、フルクトシルバリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの多くは、より大きな基質であるフルクトシルバリルヒスチジンには実質的に作用しないため、フルクトシルバリンに作用するフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを得るためには多大な労力、時間、コストをかけてスクリーニングする必要があった。
特開２００４−１２９５３１号公報（公開日：平成１６年４月３０日（２００４．４．３０）） 特開２００４−１１３０１４号公報（公開日：平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）） 国際公開第２００３／０６４６８３号パンフレット（国際公開日：２００３年８月７日（２００３．８．７）） 特開２００７−１８１４６６号公報（公開日：平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）） 特開２００７−２８９２０２号公報（公開日：平成１９年１１月８日（２００７．１１．８）） 特開２００５−１１０６５７号公報（公開日：平成１７年４月２８日（２００５．４．２８）） 特許第４０４５３２２号公報（発行日：平成２０年２月１３日（２００８．２．１３）） 特許第４０１４０８８号公報（発行日：平成１９年９月２１日（２００７．９．２１）） 特許第４０３９６６４号公報（発行日：平成２０年１月３０日（２００８．１．３０）） 特許第４０１０４７４号公報（発行日：平成１９年１１月２１日（２００７．１１．２１）） 特許第３９７１７０２号公報（発行日：平成１９年９月５日（２００７．９．５）） 国際公開２００５／０４９８５７号パンフレット（国際公開日：２００５年６月２日（２００５．６．２）） 国際公開２００５／０４９８５８号パンフレット（国際公開日：２００５年６月２日（２００５．６．２）） 特開２００３−２３５５８５号公報（公開日：平成１５年８月２６日（２００３．８．２６）） Arch. Microbiol., 180: 227-231 (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun., 311: 104-111 (2003)

本発明の目的は、フルクトシルバリルヒスチジンの測定に有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有する変異タンパク質を、フルクトシルバリンに作用するがフルクトシルバリルヒスチジンに実質的に作用しないフルクトシルアミノ酸オキシダーゼから造成し、これを提供することである。また、上記変異タンパク質の代表的な利用例として、当該変異タンパク質を用いたフルクトシルバリルヒスチジンの測定方法、フルクトシルバリルヒスチジンの測定キット、および糖化タンパク質センサーを提供する。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を実質的に有しないフルクトシルアミノ酸オキシダーゼの一部のアミノ酸残基を置換することによって、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有する変異タンパク質を造成することに成功した。さらに本発明者らは、当該タンパク質をフルクトシルバリルヒスチジン含有検体に作用させ、生じた過酸化水素をペルオキシダーゼ反応で定量することによって、フルクトシルバリルヒスチジンを測定することが可能であることを確認し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下発明を包含する。

本発明にかかるタンパク質は、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）を特徴とするタンパク質である：
（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５９番目のセリン、６５番目のリジン、および１０９番目のリジンのいずれか１つ以上のアミノ酸残基が置換され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
（ＩＩ）上記（Ｉ）のタンパク質において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または付加され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。

また本発明にかかるタンパク質は、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかを特徴とするタンパク質であってもよい：
（ａ）配列番号９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｄ）配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。

上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、アスペルギルス・ニードランス（Aspergillus nidulans）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼであってもよい。

また本発明は、上記本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。

また本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号１０に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１４に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、配列番号１８に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、または配列番号２０に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。また上記のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。

また本発明は、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むベクターを包含する。

また本発明は、上記本発明にかかるベクターで形質転換された形質転換体を包含する。

また本発明は、上記本発明にかかる形質転換体を培養する工程を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの製造方法を包含する。

また本発明は、糖化アミンに、本発明にかかるタンパク質を作用させる工程を含む、フルクトシルバリルヒスチジンの測定方法を包含する。

また本発明は、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質を備えることを特徴とする糖化タンパク質測定キットを包含する。

また本発明は、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質を備えることを特徴とする糖化タンパク質センサーを包含する。

なお、フルクトシルバリルヒスチジン（分子量４１６．４１）は、フルクトシルバリン（分子量２７９．２５）に対して約１．５倍大きく、既存の酵素が有する基質特異性の改変、例えば、天然に作用しない分子量の大きな基質に対して人工的に作用させることは、技術的に非常に困難であることが当業者に広く知られていた。本発明は、本発明者らの鋭意努力によって上記技術的困難を克服することによって完成された。したがって、本発明は当業者が予想し得ない顕著且つ有利な効果を有するといえる。

本発明により、フルクトシルバリルヒスチジン測定用として優れた特性を有する、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、およびその利用法を提供することが可能となる。

本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「〜」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「★〜☆」と記載されていれば「★以上、☆以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。

＜１．本発明にかかるタンパク質＞
本発明にかかるタンパク質は、以下の（Ｉ）または（ＩＩ）を特徴とするタンパク質である。
（Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５９番目のセリン、６５番目のリジン、および１０９番目のリジンのいずれか１つ以上のアミノ酸残基が置換され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（ＩＩ）上記（Ｉ）のタンパク質において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または付加され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質。

上記配列番号１に示されるアミノ酸配列は、アスペルギルス・ニードランス（Aspergillus nidulans）のゲノムデータベース（http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group/GenomesIndex.html）由来のＦＡＯＤのアミノ酸配列である。

本発明にかかるタンパク質においてアミノ酸残基が置換される部位は、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有する限りにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端より５９番目のセリン、６５番目のリジン、および１０９番目のリジンのいずれか１つ以上のアミノ酸残基であれば特に限定されるものではなく、当該３箇所アミノ酸残基単独、またはこれらの組み合わせであってもよい。つまり本発明にかかるタンパク質には、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、５９番目のセリンのみ、６５番目のリジンのみ、１０９番目のリジンのみ、５９番目のセリンおよび６５番目のリジン、５９番目のセリンおよび１０９番目のリジン、６５番目のリジンおよび１０９番目のリジン、または５９番目のセリンおよび６５番目のリジンおよび１０９番目のリジンが、置換されてなるものが含まれる。なお、置換されるアミノ酸はフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有する限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、５９番目のセリンはグリシンに、６５番目のリジンはグリシンに、１０９番目のリジンにおいてはグルタミンに置換されている場合が挙げられる。

本発明にかかるタンパク質の一実施形態のアミノ酸配列としては、例えば以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列が挙げられる。なお本発明にかかるタンパク質は下記に限定されるものではないことは言うまでもない。
（ａ）配列番号９に示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列
配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ末端より５９番目のセリンがグリシンに置換されたタンパク質である。また配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ末端より１０９番目のリジンがグルタミンに置換されたタンパク質である。また配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のアミノ末端より５９番目のセリンおよび６５番目のリジンがともにグリシンに置換されたタンパク質である。配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質のアミノ末端より５９番目のセリンおよび６５番目のリジンがともにグリシンに置換され、且つ１０９番目のリジンがグルタミンに置換されたタンパク質である。

また本発明には、上記で説示した本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をも包含するが、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加される部位は、欠失、置換および／または付加後のタンパク質がフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有していれば、該アミノ酸配列中のどの部位であってもよい。ここで「１または数個のアミノ酸残基」とは、具体的には１０個以内の範囲のアミノ酸残基数をいう。

本発明におけるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性は、後述する実施例の「活性測定法」の項において説明した方法によって測定される。フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を測定する場合、フルクトシルバリルヒスチジンを基質として用いればよい。なお、本発明の説明において「フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有する」とは、好ましくは０．１Ｕ/ｍｇ-protein以上を意味し、さらに好ましくは１．０Ｕ/ｍｇ-protein以上を意味する。

上記本発明にかかるタンパク質は、例えば遺伝子組み換え技術を用いて生産されてもよいし、アミノ酸合成機などを用いて化学合成されてもよい。遺伝子組み換え技術において、好適に用いられる各種組換えタンパク質発現系は、例えば、大腸菌発現系、昆虫細胞発現系、哺乳類細胞発現系、および無細胞発現系を用いてもよく、これらに限定されない。本発明のタンパク質等の製造方法については後述する。

また本発明にかかるタンパク質等は、例えば、分子間および／または分子内架橋（例えば、ジスルフィド結合など）が施されたもの、化学修飾（例えば、糖鎖、リン酸もしくはその他の官能基など）されたもの、標識（例えば、ヒスチジンタグなど）が付与されたもの、または融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、およびＧＦＰなど）を付与されたものなどが含まれるが、特にこれらに限定されない。さらに、本発明にかかるタンパク質等は、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性が実質的に維持される限り、数種のタンパク質の断片を組み合わせて構成したキメラタンパク質も含み得る。

本発明にかかるタンパク質と、血清タンパク質や有機酸、デキストランをはじめとする賦形剤等とからフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤を構成してもよい。上記フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ剤には、酵素剤の構成物品として公知の物品が含まれていてもよい。

＜２．本発明にかかるポリヌクレオチド等＞
本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるタンパク質をコードすることを特徴としている。

ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。

また、本発明にかかるポリヌクレオチドは化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）を変更してもよい。

本発明にかかるポリヌクレオチドを改変する方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法が用いられる。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、および／または付加することで組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製してよい。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製，ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。

本発明にかかるポリヌクレオチドは、上記本発明にかかるタンパク質をコードしていればその塩基配列は特に限定されるものではない。よって本発明にかかるタンパク質のアミノ酸配列に応じた塩基配列からなる全てのポリヌクレオチドが本発明に含まれる。

本発明にかかるポリヌクレオチドの一実施形態としては、例えば以下の（ｅ）〜（ｈ）のポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｅ）配列番号１０に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１４に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１８に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド
（ｈ）配列番号２０に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド
ここで、配列番号１０に示される塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５９番目のセリンがグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質（便宜上「Ｓ５９Ｇ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。また配列番号１４に示される塩基配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の１０９番目のリジンがグルタミンに置換されアミノ酸配列を有するタンパク質（便宜上「Ｋ１０９Ｑ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。また配列番号１８に示される塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５９番目のセリンがグリシンに置換され且つ６５番目のリジンがグリシンに置換されたアミノ酸配列（Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ）を有するタンパク質（便宜上「Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。また配列番号２０に示される塩基配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５９番目のセリンがグリシンに置換され且つ６５番目のリジンがグリシンに置換され且つ１０９番目のリジンがグルタミンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質（便宜上「Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ」と表記する場合がある）をコードする塩基配列である。

本発明の一実施形態では、本発明にかかるポリヌクレオチドは化学的に合成された塩基で置換されてもよい。また、本発明にかかるポリヌクレオチドが置換される部位は特に限定されず、置換後の塩基配列から発現するタンパク質が好適な性質を有していればよい。

本発明にかかるポリヌクレオチドは、本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもいてもよい。付加される塩基配列としては、限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、およびＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴおよびＭＢＰなど）、プロモーター配列（例えば、酵母由来プロモーター配列、ファージ由来プロモーター配列、および大腸菌由来プロモーター配列など）、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。

また本発明にかかるポリヌクレオチドには、上記本発明にかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号１０、１４、１８、２０に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド）、またはこれに相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。

ここで、「ストリンジェントな条件」とは、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドのＴｍ値から１５℃、好ましくは１０℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件をいう。具体例としては、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件をいう。

本発明にかかるポリヌクレオチドの塩基配列は、Science, 214: 1205 (1981)に記載されたジデオキシ法により決定され得る。

一方、本発明にかかるベクターは、上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものである。上記本発明にかかるポリヌクレオチドを含むものであれば、その他の構成は特に限定されるものではない。本発明にかかるベクターを構成するベースとなるベクターとしては、宿主細胞において好適なベクターが適宜選択され得る。本発明にかかるベクターとしてプラスミドベクターを用いる場合、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）、ｐＵＣ１８などが使用できる。この場合、ベクターが導入される宿主微生物としては、例えば、酵母、大腸菌（エシェリヒア・コリーＷ３１１０（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α）、昆虫細胞、哺乳類細胞などに利用可能である。

上記宿主微生物に本発明にかかるベクターを導入する方法としては特に限定されるものではないが、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物にベクターを導入する場合は、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡを導入する方法や、エレクトロポレーション法を用いる方法が適用され得る。その他、市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９、コンピテントハイＤＨ５α；東洋紡績製）を用いて遺伝子導入が行われても良い。

本発明にかかるベクターを構築するには、本発明にかかるポリヌクレオチドを分離および精製した後、制限酵素処理などを用いて切断した該ポリヌクレオチドの断片と、ベースとなるベクターを制限酵素で切断して得た直鎖ポリヌクレオチドを結合閉鎖させて構築することができる。結合閉鎖する際にはＤＮＡリガーゼなどがベクターおよび該ポリヌクレオチドの性質に応じて使用され得る。本発明のベクターを複製可能な宿主に導入した後、ベクターのマーカーおよび酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、本発明のポリヌクレオチドを含有する形質転換体を得ることができる。よって、本発明にかかるベクターには薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。

なお本発明は、上記本発明にかかるベクターで形質転換された形質転換体を包含する。本発明にかかるベクターによって形質転換される宿主細胞は、特に限定されないが、酵母、大腸菌、昆虫細胞、および哺乳類細胞などが挙げられる。

＜３．本発明にかかるタンパク質の製造方法＞
本発明にかかるタンパク質の製造方法は、上記本発明にかかる形質転換体を培養する工程（「培養工程」という）を含むことを特徴としている。本発明にかかるタンパク質の製造方法には、上記培養工程の他、形質転換体を用いたタンパク質生産において含まれ得るその他の工程が含まれていてもよい。その他の工程としては、例えば、培養工程後に本発明にかかる形質転換体が生産したタンパク質を回収する工程や、当該タンパク質を精製する工程が挙げられる。

（３−１）培養工程
上記培養工程では、本発明にかかる形質転換体が栄養培地で培養されることにより、多量の組換えタンパク質を安定して生産し得る。形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、多くの場合は液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。

培養工程で用いられる栄養培地の栄養源としては、培養に通常用いられるものが広く使用されてよい。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、ラクトース、糖蜜、およびピルビン酸などが使用される。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、および大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。これらに加えて、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて培地に添加されてよい。

本発明にかかる形質転換体の培養温度は、当該形質転換体が本発明にかかるタンパク質を生産可能な範囲内であれば適宜変更し得るが、例えば、エシェリヒア・コリーを宿主として利用する場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は、本発明にかかるタンパク質が最高収量に達する適当な時期に培養を完了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地のｐＨは本発明にかかる形質転換体が好適に発育し、且つ本発明にかかるタンパク質を生産可能な範囲内で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度の範囲である。

（３−２）回収工程
本発明にかかる形質転換体がタンパク質を細胞外に分泌する場合、その培養物には本発明のタンパク質が含まれている。よって培養物を本発明にかかるタンパク質としてそのまま利用することが可能である。この時、例えばろ過や遠心分離などにより、培養液と本発明にかかる形質転換体とを分離してもよい。

また本発明にかかるタンパク質が形質転換体内に存在する場合、形質転換体を培養して得られた培養物からろ過または遠心分離などの手段を用いて形質転換体を採取し、該形質転換体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊後、目的のタンパク質を回収すればよい。また、必要に応じて、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）および界面活性剤（例えば、トリトン−Ｘ１００など）を添加して本発明にかかるタンパク質を可溶化し、水溶液として分離採取してもよい。

（３−３）精製工程
精製工程は、上記回収工程によって得られたタンパク質を精製する工程である。精製工程の具体的な方法は特に限定されるものではないが、例えば、本発明にかかるタンパク質を含む溶液を、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムなどを用いる）、または親水性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、アセトンなど）による分別沈殿法に供すればよい。上記操作によって、目的である本発明にかかるタンパク質を沈殿させ、精製することができる。

また、前記精製工程では、加熱処理、等電点処理、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、またはこれらの組み合わせを用いて精製工程を行ってもよい。

上記手法を用いて得られた目的のタンパク質を含む精製酵素は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。

上記の精製酵素は、例えば凍結乾燥、真空乾燥、およびスプレードライなどにより粉末化して流通させることが可能である。また、精製酵素を使用する際は、その用途によって適宜緩衝液に溶解した状態で使用することができる。緩衝液としては、例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液などが目的のタンパク質の性質、および／または実験条件もしくは環境に応じて好適に選択されてよい。さらに、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グルタミン、またはリジンなど）、および血清アルブミンなどを精製酵素に添加することにより安定化することができる。

＜４．本発明にかかる糖化タンパク質の測定方法＞
本発明にかかる糖化タンパク質は、フルクトシルバリルヒスチジンの測定方法に用いることが可能である。また上記フルクトシルバリルヒスチジンの測定方法は、糖化ヘモグロビンなどの糖化タンパク質の測定に適用され得る。以下に本発明にかかる糖化タンパク質を用いた糖化タンパク質の測定方法（以下「本発明の測定方法」という）を説明する。

本発明の測定方法は、少なくとも糖化アミンに本発明にかかるタンパク質を作用させることを特徴としている。以下に本発明の測定方法の一実施形態を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明にかかる測定方法の一実施形態は、
（１）試料とプロテアーゼとを反応させて、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程（便宜上「第１工程」という）、
（２）前記（１）の工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程（便宜上「第２工程」という）、および、
（３）前記（２）の工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程（便宜上「第３工程」という）、を含む糖化タンパク質を測定するための方法である。

（４−１）第１工程
第１工程は、試料中の糖化タンパク質を分解し、試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンを調製する工程である。

上記「糖化タンパク質」とは、タンパク質を構成するアミノ酸残基の一部または全部に糖が結合した（糖化した）タンパク質を意味する。糖化タンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質のアミノ末端のα−アミノ基が糖化されたもの（例えばＨｂＡ１ｃ）等が挙げられる。なお上記例示したＨｂＡ１ｃは、糖尿病の診断など臨床診断の指標として使用されている。

上記プロテアーゼとしては、試料中に含まれる糖化タンパク質を糖化アミノ酸または糖化ペプチドに分解し得るものであれば特に限定されるものではない。例えば臨床検査において使用されているプロテアーゼが好ましく利用され得る。

また上記「試料」は、糖化タンパク質の有無や濃度を検出すべき対象物であれば特に限定されるものではなく、例えば、全血、血漿、血清、血球等の他に、尿、髄液等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。本発明の方法は、糖尿病の診断に応用することができるため、上記の中でも特に全血試料、血球試料に有用である。特に限定されるものではないが、赤血球内の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血したりして、この溶血試料を測定用の試料とすればよい。

試料とプロテアーゼとを反応させる際の具体的な条件は、所望の糖化アミンが調製され得る条件であれば特に限定されるものではなく、試料の濃度や種類、プロテアーゼの種類や濃度に応じて適宜好適な条件を検討の上、採用されればよい。

本発明の測定方法に好適に使用できる、プロテアーゼの濃度は例えば０．１Ｕ〜１ＭＵ／ｍｌ（より好ましくは１Ｕ〜５００ＫＵ／ｍｌ、最も好ましくは５Ｕ〜１００ＫＵ／ｍｌ）である。上記のプロテアーゼの濃度は、限定されるものではなく、反応条件、試料の種類並びに状態、実験者の手技および使用する試薬の種類などに応じて、実験者または使用者に好適に決定され得る。

また上記「糖化アミン」は、試料中に含まれる糖化タンパク質に由来の糖化アミノ酸や糖化ペプチドなどが挙げられる。糖化ペプチドの長さは特に限定されるものではないが、本発明のタンパク質が作用し得る長さ、例えばアミノ酸残基数が２〜６の範囲のものが挙げられる。

（４−２）第２工程
第２工程は、上記第１工程によって得られた試料中の糖化タンパク質由来の糖化アミンに本発明にかかるタンパク質を作用させる工程である。

本発明にかかるタンパク質が有し得るＦＡＯＤ活性は特に限定されるものではないが、ＦＡＯＤ活性が高いほど高感度で糖化アミンを検出することができ、ＦＡＯＤタンパク質の使用量を少なくすることができるために好ましい。なお本発明の測定方法に好適に使用できるＦＡＯＤタンパク質の濃度は、例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌ（好ましくは０．５〜２００ Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは１．０〜１００ Ｕ／ｍｌ）である。ただし上記のＦＡＯＤの濃度は、特に限定されるものではなく、反応条件、試料の種類並びに状態、実験者の手技および使用する試薬の種類などに応じて、適宜、決定され得る。

（４−３）第３工程
第３工程は、上記第２工程において発生した過酸化水素の量または消費された酸素の量を測定する工程である。第３工程は過酸化水素の量または酸素の量を測定し得る方法であれば、その具体的方法は特に限定されるものではない。したがって、公知の方法が適宜適用され得る。

第３工程に用いられる方法は、限定されないが、例えば、酵素法などが挙げられる。酵素法においては、試料中の糖化タンパク質をアミノ酸、またはペプチドのレベルまで酵素（例えば、プロテアーゼ）を用いて断片化する。次に、生じた糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに、ＦＡＯＤを加え、酸化還元反応により過酸化水素を発生させる。この試料にＰＯＤ、および酸化により発色する還元剤を添加し、前記ＰＯＤを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反応を生じさせる。前記酸化還元反応により前記還元剤を発色させ、この発色強度を測定することにより前記過酸化水素量を測定できる。

第３工程において好適なＰＯＤは、西洋ワサビ、微生物などに由来するものである。また、前記のＰＯＤの好適な使用濃度は、０．０１〜１００単位／ｍＬである。

第３工程において好適な過酸化水素の測定方法としては、ＰＯＤの存在下でのカップラー（４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）並びに３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）など）に対してフェノール系、アニリン系またはトルイジン系の色原体を酸化縮合反応させることにより色素を生成するトリンダー試薬類、およびＰＯＤの存在下で直接酸化呈色するロイコ色素が使用され得る。これらの方法は、当業者に公知であり、一般に容易に使用され得る。

上記トリンダー試薬としては、限定されないが、例えば、フェノール及びその誘導体を用いることができる。

第３工程において好適に使用可能な上記カップラーとしては、４−アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）およびスルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）などが挙げられる。

第３工程において好適に使用できる前記ロイコ色素としては、特に限定されないが、例えば、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体などが使用できる。

第３工程における前記過酸化水素量の測定において、前記ＰＯＤ等を用いた発色方法以外に、各種センサー系を用いた測定法が当業者に一般的に知られている（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと）。具体的には、各種センサー系に用いる電極としては、酸素電極、カーボン電極、金電極、および白金電極などが挙げられる。本発明において、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／Ｃｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持しながら、作用電極に一定の電圧を加え、さらに試料を添加して、酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。

また、カーボン電極、金電極、および白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する方法として、固定化電子メディエーターを用いる系がある。例えば、作用電極として酵素およびフェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、およびフェナジンメトサルフェートなどの電子メディエーターを吸着、または共有結合法により高分子マトリクスに固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。続いて、作用電極に一定の電圧を加え、試料を添加して酵素反応の結果生じる過酸化水素に起因する電流の増加値を測定することができる。

第３工程で消費された酸素量を測定することで糖化アミン量を測定することもできる（限定されないが、例えば、特開２００１−２０４４９４号公報を参照のこと）。具体的には、酸素電極を用い、電極表面に酸素を固定化して、本発明に好適な条件下の緩衝液中に挿入して一定温度に保持する。ここに試料を加えて、電流の減少値を測定する。

カーボン電極、金電極、白金電極などを用いてアンペロメトリック系で測定する場合には、作用電極として酵素を固定化したこれらの電極を用い、対極（例えば、白金電極など）、および参照電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）と共に、メディエーターを含む電流の増加量を測定する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、オスミウム誘導体、およびフェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。

本発明の測定法において、各工程を実施する系に本発明のタンパク質の安定性を増すために不活性タンパク質を添加してもよい。不活性タンパク質は、血清アルブミン類、グロブリン類および繊維性タンパク質類を含む。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンであり、ｗｔ／ｖｏｌにおける好ましい濃度は、０．０５〜１％である。好ましい不活性タンパク質は、酵素分解を起こすプロテアーゼ不純物を含まないものである。

フルクトシルバリルヒスチジン濃度の測定は、試料の特定体積および試薬の特定体積を用いて行われる。吸光度測定は、試料ブランクを測定するために、混合後、かつフルクトシルバリルヒスチジンによる有意な吸光度変化が起こる前にできるだけ速やかに行われる。０．５〜５秒後の第１の吸光度測定が適当である。第２の吸光度測定は、吸光度が定常的になった後、典型的には１ｍｇ／ｄＬのフルクトシルバリルヒスチジン濃度において３７℃にて３〜５分間である。典型的には、該試薬は既知のフルクトシルバリルヒスチジン濃度を有する水性または血清溶液にて標準化される。

＜５．本発明にかかる糖化タンパク質測定キットおよび糖化タンパク質センサー＞
（５−１）糖化ヘモグロビン測定キット
本発明にかかる糖化ヘモグロビン測定キット（以下「本発明のキット」という）は、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質を含むことを特徴としている。本発明のキットに含まれる、本発明にかかるタンパク質の形態は特に限定されるものではないが、例えば、水溶液、懸濁液または凍結乾燥粉末など形態が採用され得る。上記凍結乾燥粉末は常法に従って作製され得る。

前記添加物の配合法は特に制限されるものではない。例えば、本発明にかかるタンパク質を含む緩衝液に添加剤を配合する方法、添加剤を含む緩衝液に本発明にかかるタンパク質を配合する方法、または本発明にかかるタンパク質および安定化剤を緩衝液に同時に配合する方法などが挙げられる。

本発明のキットは、少なくとも上記本発明にかかるタンパク質、ペルオキシダーゼ、および色原体を備える試薬組成物により構成されていてもよい。

本発明の測定方法においてフルクトシルバリルヒスチジンの酸化に由来する過酸化水素の検出には、ペルオキシダーゼ反応を利用する。よって上記試薬組成物には、ペルオキシダーゼおよび色原体（過酸化水素発色試薬）が好ましく用いられる。上記ペルオキシダーゼおよび色原体（過酸化水素発色試薬）は何ら制限されるものではない。

本発明に用いられる色原体（過酸化水素発色試薬）は、溶液において安定であり、且つビリルビン干渉が低いものであることが好ましい。本発明に好適に用いることができる色原体（過酸化水素発色試薬）としては、例えば４−アミノアンチピリンもしくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、およびフェノールもしくはその誘導体またはアニリンもしくはその誘導体を組み合わせからなる試薬が挙げられる。また、本発明において用いられる色原体（過酸化水素発色試薬）は、ベンジジン類、ロイコ色素類、４−アミノアンチピリン、フェノール類、ナフトール類およびアニリン誘導体類であってもよい。

また本発明において好適に用いられるペルオキシダーゼは、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。前記ペルオキシダーゼは、高純度かつ低価格のものが商業的に入手可能である。酵素濃度は、迅速かつ完全な反応のために充分高くなければならず、好ましくは、１，０００〜５０，０００Ｕ／Ｌである。

また上記試薬組成物には、上記構成の他、緩衝剤（例えば、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、およびＧＯＯＤ緩衝液など）が含まれていてもよい。さらに上記試薬組成物には、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬（例えば、ＥＤＴＡおよびＯ−ジアニシジンなど）、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、各種界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００およびＮＰ−４０など）、ならびに各種抗菌剤および防腐剤（例えば、ストレプトマイシンおよびアジ化ナトリウムなど）などが含まれていてもよい。これらの試薬は、単一試薬でも２種類以上の試薬を組み合わせてなるものであってもよい。

上記緩衝剤としては特に限定されないが、６〜８．５のｐＨ範囲において充分な緩衝能力を有する任意の緩衝剤を使用することができる。このｐＨ範囲の緩衝剤としては、リン酸塩、トリス、ビス−トリスプロパン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−モルフォリノエタンスルホン酸１水和物（ＭＥＳ）、ピペラジン―１，４―ビス（２−エタンスルホン酸）（piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid)）（ＰＩＰＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid）（ＨＥＰＥＳ）、および３−〔Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）などが挙げられる。特に、好ましい緩衝剤はＭＥＳおよびＰＩＰＥＳである。また特に、好ましい濃度範囲は、２０〜２００ｍＭであり、ｐＨ６〜７である。

本発明のキットには、例えば、ＦＡＯＤ、緩衝液、プロテアーゼ、ＰＯＤ、発色試薬、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、抗菌剤、防腐剤、ウェルプレート、蛍光スキャナー、自動分析機、および本発明にかかる測定方法を紙媒体に記載した取り扱い説明書などが含まれていてもよい。

（５−２）糖化タンパク質センサー
本発明にかかる糖化タンパク質センサー（以下「本発明のセンサー」）は、糖化タンパク質を検出するために用いられるセンサーであり、少なくとも本発明にかかるタンパク質を備えている。本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる。よって、本発明のセンサーは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法および本発明のキットの項における緩衝剤等の説明を援用することができる。

本発明のセンサーの一実施形態は、本発明にかかるタンパク質を支持体に固定して用いることができる。支持体としては、本発明にかかるタンパク質を固定化できるものであれば、特に限定されるものではなく、形状や材質は該タンパク質の性質に応じて好適なものを使用してよい。支持体の形状は、本発明にかかるタンパク質が固定化できる十分な面積を有するものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、基板、ビーズおよび膜などが挙げられる。支持体の材料としては、例えば、無機系材料、天然高分子、および合成高分子などが挙げられる。

なお、本発明は上記の各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種種の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。表１に実施例において使用した活性測定試薬の組成を示した。なお、実施例において使用した試薬は特記しない限り、ナカライテスク社より購入したものを用いた。

実施例におけるＦＡＯＤの活性測定条件を以下に示した。

−活性測定法−
各基質に対する酵素活性は、酵素反応により生成する過酸化水素を追随するペルオキシダーゼ反応により生じた色素の吸光度の増加で測定した。活性測定試薬３ｍｌを３７℃で５分間予備加温後、予め、酵素希釈液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５））で希釈した酵素溶液０．１ｍｌを加え、反応を開始する。３７℃で５分間反応させ、５００ｎｍの吸光度変化を測定する（ΔＯＤ_ｔｅｓｔ／ｍｉｎ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液０．１ｍｌを加え、上記同様に操作を行って吸光度変化を測定した（ΔＯＤ_{ｂｌａｎｋ}／ｍｉｎ）。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づき酵素活性を算出した。尚、上記条件で１分間に１マイクロモルの基質を酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とする。

−計算式−
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤ_ｔｅｓｔ−ΔＯＤ_{ｂｌａｎｋ}）×３．１（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１（ｍｌ）：全液量
１３：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍｌ）：酵素サンプル液量
＜参考例１．ＦＡＯＤ遺伝子のクローニング＞
アスペルギルス・ニードランス（Aspergillus nidulans）ＦＡＯＤ遺伝子のクローニングを行うために、アスペルギルス・ニードランスのゲノムデータベース（http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group/GenomesIndex.html）を検索した。前記ゲノムデータベースの中から、ＦＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅをコードすることが予測される遺伝子を抽出した。検索結果から得られた種々の遺伝子のうち、フルクトシルバリンに実質的に作用するＦＡＯＤタンパク質をコードする遺伝子として、DDBJ番号AACD01000139のAspergillus nidulans FGSC A4 chromosome II ANcontig1.139（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=29570992）の325868〜327486に対応する遺伝子をクローニングした。

次に、前記ＦＡＯＤ遺伝子のｃＤＮＡクローニングを行った。アスペルギルス・ニードランスA89株を、ＧＰＹ液体培地（２％グルコース、０．５％カザミノ酸、１％ペプトン、０．５％イーストエキストラクト、０．１％リン酸１水素２カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、０．０５％塩化カリウム、０．００１％硫酸鉄、ｐＨ６．０）で、３０℃、２日間培養した。液体培養したアスペルギルス・ニードランスA89株からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を利用して全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの調製方法は、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）のプロトコールに従った。調製した全ＲＮＡからＭａｇ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ−ｍＲＮＡ−（東洋紡績社）を用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡ０．１μｇを用いて、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社）によるＲＴ−ＰＣＲを行った。１段階目の逆転写反応では、配列番号３に示したオリゴデオキシリボヌクレオチドＰ１プライマー（5’-CTACATCTTTGCCTCATTCCTCCACCCCGG-3’）を用いた。２段階目のＰＣＲでは、Ｐ１プライマーと、配列番号４に示したオリゴデオキシリボヌクレオチドＰ２プライマー（5’-ATGACGCCCCGAGCCAACACCAAAATCATT-3’）とをプライマーとして用いた。得られたｃＤＮＡを、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｈｉｇｈ（東洋紡績社）で末端の平滑化を行い、公知のプラスミドｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位へサブクローニングした。ｃＤＮＡ部分についてシーケンス解析を行った結果、配列番号２に示した塩基配列が得られた。配列番号２に示した塩基配列のｃＤＮＡコーディング領域は、１番目の塩基から１３１４番目の塩基であり、開始コドンは１番目の塩基から３番目の塩基、終止コドンＴＡＧは１３１５番目の塩基から１３１７番目の塩基に相当する。配列番号２の塩基配列から明らかとなったアミノ酸配列は配列番号１に示した。

＜参考例２．ＦＡＯＤ遺伝子の大腸菌での大量発現と精製、酵素アッセイ＞
上記配列番号１に示した塩基配列を有するＦＡＯＤ遺伝子を含むプラスミドの大腸菌における大量発現を試みた。ＦＡＯＤ遺伝子の終止コドンを除いた全長ｃＤＮＡ領域（配列番号２に示した塩基配列の１〜１３１４番目の塩基まで）をＰＣＲで増幅した。その際、アミノ酸配列のＮ末端側に配列番号５に示すプライマーＰ３（5’-GGAATTCCATATGACGCCCCGAGCCAACACCAAAATCATTGTC-3’）（上記塩基配列における「CATATG」はＮｄｅI部位）を用いてＮｄｅＩ切断部位を挿入し、Ｃ末端側に配列番号６に示すプライマーＰ４（5’-CCGCTCGAGCATCTTTGCCTCATTCCTCCACCCCGGCAT-3’）（上記塩基配列における「CTCGAG」はＸｈｏＩ部位）を用いてＸｈｏＩ切断部位を導入した。本ＤＮＡ断片をｐＥＴ−２３ｂベクター（ノバジェン社）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位へＴ７プロモーターと正方向になるようにサブクローニングした。作製したプラスミドは、ＦＡＯＤ発現用プラスミドとしてｐＩＥ２０１と命名した。

前記のプラスミドｐＩＥ２０１を用いて大腸菌ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ストラタジーン社）を形質転換した。その後、アンピシリン耐性を示す形質転換体ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ２０１）を選択した。

前記形質転換体の培養用の培地として、２００ｍｌのＴＢ培地を２Ｌ容坂口フラスコに分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行ったものを用いた。前記培地を放冷後、別途無菌濾過したアンピシリンを終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように培地に添加した。この培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（ｐＩＥ２０１）の培養液を２ｍｌ接種した。続いて、３０℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、細胞を超音波破砕した。次に、前記懸濁液を遠心分離して、上清液を粗酵素液として得た。フルクトシルバリン含有測定試薬を用いて測定した粗酵素液のＦＡＯＤ活性は、約４．０Ｕ／ｍｌであった。一方、フルクトシルバリルヒスチジン含有測定試薬を用いて測定した処、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性は検出されなかった。

得られた粗酵素液についてポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて透析を行った。透析後のサンプルを、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｈｉｓ−ｔａｇ−（東洋紡績製）を用いて、規定のプロトコールに従って精製した。次に、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）カラムクロマトグラフィーによりさらに分離・精製し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて透析を行い、精製酵素標品（ＩＥ２０１）を得た。本方法により得られたＩＥ２０１標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。

前記ＩＥ２０１標品の酵素活性を、フルクトシルバリルヒスチジンおよびフルクトシルバリンをそれぞれ単独に含有する測定試薬を用いて測定し、前記酵素標品がフルクトシルバリンオキシダーゼ活性を有するが、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を実質的に有しないことを確認した。

＜実施例１．ＦＡＯＤ遺伝子の機能改変によるフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質の造成と精製、酵素アッセイ＞
発現プラスミドｐＩＥ２０１、および合成オリゴヌクレオチド（配列番号７および配列番号８）を用いて、KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit（東洋紡績製）を使用して、規定のプロトコールに従って変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の５９番目のセリンがグリシンに置換されたＦＡＯＤ変異体（配列番号９）をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ）を取得した。同様に、配列番号１１および配列番号１２に示した合成オリゴヌクレオチドを用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の１０９番目のリジンがグルタミンに置換されたＦＡＯＤ変異体（配列番号１３）をコードする組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｋ１０９Ｑ）を取得した。同様に、配列番号１５および配列番号１６に示した合成オリゴヌクレオチドを用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の５９番目のセリンがグリシン、６５番目のリジンがグリシンにそれぞれ置換されたＦＡＯＤ変異体（配列番号１７）を有する組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ）を取得した。また、組換えプラスミドｐＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ、および合成オリゴヌクレオチド（配列番号１１および配列番号１２）を用いて変異処理操作を行い、塩基配列を決定して、配列番号１に示したアミノ酸配列の５９番目のセリンがグリシン、６５番目のリジンがグリシン、１０９番目のリジンをグルタミンにそれぞれ置換したＦＡＯＤ３重変異体（配列番号１９）を有する組換えプラスミド（ｐＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ）を取得した。

取得した各プラスミドでＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬを形質転換後、アンピシリン耐性を示す形質転換体をそれぞれ選択した。

参考例２と同様に、各形質転換体を培養し、得られた粗酵素液の精製を行うことにより、それぞれの精製酵素標品（ＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ、ＩＥ２０１−Ｋ１０９Ｑ、ＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ、ＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ）を得た。本方法により得られた各標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により、単一であることが確認された。

＜実施例２．各ＦＡＯＤタンパク質の特性評価＞
野生型ＦＡＯＤ（ＩＥ２０１）、およびＦＡＯＤ変異体（ＩＥ２０１−Ｋ１０９Ｑ、ＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ、ＩＥ２０１−Ｓ５９Ｇ＋Ｋ６５Ｇ＋Ｋ１０９Ｑ）の精製酵素標品の酵素活性を、フルクトシルバリルヒスチジンおよびフルクトシルバリンをそれぞれ単独に含有する測定試薬を用いて測定した結果を表２に示す。

表２の結果から明らかなように、野生型ＦＡＯＤはフルクトシルバリンオキシダーゼ活性を有するが、フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有しない。しかし、各ＦＡＯＤ変異体はフルクトシルバリンおよびフルクトシルバリルヒスチジンに作用する。すなわち、野生型ＦＡＯＤのアミノ酸配列を置換した３種のＦＡＯＤ変異体において、フルクトシルバリルヒスチジンに対する酵素活性が新たに付与されたことが確認された。

なお、比活性の測定においてタンパク質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法に基づく比色定量法により測定した。

本発明によって、フルクトシルバリルヒスチジンの測定に有用なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを新たに創出し、これを提供することが可能となる。また、該フルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼを利用したフルクトシルバリルヒスチジンの測定方法、およびフルクトシルバリルヒスチジン測定用試薬組成物等を提供することが可能となる。したがって、予防医学に基づく臨床検査の更なる普及に貢献することができる。

Claims (13)

1. 以下の（Ｉ）または（ＩＩ）を特徴とするタンパク質であり、且つ以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかを特徴とするタンパク質：
   （Ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ末端から５９番目のセリン、６５番目のリジン、および１０９番目のリジンのいずれか１つ以上のアミノ酸残基が置換され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
   （ＩＩ）上記（Ｉ）のタンパク質において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、および／または付加され、且つフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質；
   （ａ）配列番号９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
   （ｂ）配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
   （ｃ）配列番号１７に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
   （ｄ）配列番号１９に示すアミノ酸配列からなるタンパク質；
   （ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のタンパク質において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
2. 上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、アスペルギルス・ニードランス（Aspergillus nidulans）由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼである、請求項１に記載のタンパク質。
3. 請求項１または２に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
4. 配列番号１０に示される塩基配列を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
5. 配列番号１４に示される塩基配列を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
6. 配列番号１８に示される塩基配列を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
7. 配列番号２０に示される塩基配列を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
8. 請求項３〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
9. 請求項８に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
10. 請求項９に記載の形質転換体を培養する工程を含むフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼの製造方法。
11. 糖化アミンに請求項１または２に記載のタンパク質を作用させる工程を含む、フルクトシルバリルヒスチジンの測定方法。
12. 少なくとも請求項１または２に記載のタンパク質を備えることを特徴とする糖化タンパク質測定キット。
13. 少なくとも請求項１または２に記載のタンパク質を備えることを特徴とする糖化タンパク質センサー。