JP5209204B2 - ポリマーオリゴヌクレオチドプロドラッグ - Google Patents

Description

関連出願へのクロスリファレンス
本明細書は、参照により本開示に含まれる２００３年４月１３日出願の米国仮特許出願第６０／４６２，０７０号に基づく優先権の利益を主張する。

本発明は治療薬として有用なポリマーオリゴヌクレオチドプロドラッグに関する。そのようなプロドラッグを用いる組成物および方法もまた提供される。

多細胞生物において身体的状態の大部分は、大半の疾患状態を含めて、タンパク質によってもたらされることがよく知られている。そのようなタンパク質は、直接にまたは酵素的なまたは他の機能を通じて作用し、動物またはヒトにおいて多数の疾患および調節機能に主成分として寄与する。疾患状態については、古典的な治療薬は一般的に、疾患を引き起こすかまたは疾患を増強するタンパク質の機能を抑える目的で、そのようなタンパク質との相互作用に注目してきた。より新しい治療手法では、そのようなタンパク質の実際の産生の調節が望まれる。タンパク質の産生に干渉することによって、最小の副作用で最大の治療効果を得ることができる。したがって、望ましくないタンパク質生成に繋がる遺伝子発現を干渉しまたは遺伝子発現を調節することが、そのような治療手法の一般的目的である。

特定の遺伝子発現を阻害するための１つの方法は、オリゴヌクレオチド、特に特定の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列と相補的であるオリゴヌクレオチドを用いる。一般的に、遺伝子転写の産物（例えば、ｍＲＮＡ）と相補的である核酸配列は、「アンチセンス」と表され、および転写産物と同一の配列を有するかまたは転写産物として 作成された核酸配列は、「センス」と表される。例えば、非特許文献１を参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現を調節するような方法で、遺伝子の全部または一部とハイブリダイズするように選択することができる。転写因子は転写の調節中に２本鎖ＤＮＡと相互作用する。オリゴヌクレオチドは、転写因子の競合阻害剤となってその作用を調節することができる。いくつかの近年の報告がそのような相互作用を説明している（非特許文献２；および非特許文献３を参照）。

不必要な遺伝子発現をダウンレギュレートするために分子的戦略が開発されている。近年、オリゴヌクレオチド化合物の使用が、ウイルス感染症、炎症性および遺伝性疾患および注目すべきことに、癌のような疾患に対する治療の有望な方法に発展している。アンチセンスＤＮＡは最初に、天然に存在する核酸に対する相補オリゴデオキシヌクレオチドのアルキル化として考えられた（非特許文献４）。ＺａｍｅｃｎｉｋおよびＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎは、治療目的のための合成アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を最初に提案した。（非特許文献５；非特許文献６）。彼らは、ラウス肉腫ウイルスのＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド１３量体の使用が、細胞培養中のウイルスの増殖を阻害したことを報告した。それ以来、例えば、水疱性口内炎ウイルス（非特許文献７）、単純ヘルペスウイルス （非特許文献８）、およびインフルエンザウイルス（非特許文献９）のように、ウイルス増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害のin vitroでの効果を明らかにする、多数の他の研究が出版されている。

オリゴヌクレオチドはまた、中でも、診断検査、例えばＰＣＲ技術および他の実験手順におけるプライマーのような研究試薬に用途が見出されている。オリゴヌクレオチドは、目的の用途に適合するように調整された特性を有するように特注で合成することができる。このように、多数の化学修飾がオリゴマー性化合物へ導入されており、診断における、研究試薬として、および治療薬としてのその有用性が高められる。

オリゴヌクレオチド、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドは治療薬として有望であるが、それらはヌクレアーゼに対して非常に感受性が高く、および標的細胞への進入の前後に速やかに分解される可能性があり、そのため、修飾されていないアンチセンスオリゴヌクレオチドはin vivo系での使用に適さない。分解を担う酵素は大部分の組織で見出されるため、その化合物を安定化しおよびこの問題を改善するための試みとして、オリゴヌクレオチドへの修飾が行われている。最も広く試されている修飾は、オリゴヌクレオチド化合物の骨格部分に行われている。一般的に非特許文献１０およびその中の参考文献を参照。 作成された多数の異なる骨格の中で、ホスホロチオエートだけが顕著なアンチセンス活性を示した。例えば、非特許文献１１を参照。骨格への硫黄原子の導入は酵素分解速度を遅らせる一方、それはまた同時に毒性を高める。硫黄原子を付加することの別の短所は、それが骨格をアキラルからキラルに変え、および結果として２^ｎ個のジアステレオマーを生じることである。これは別の副作用を生じ得る。現在のアンチセンスオリゴヌクレオチドのさらに別の短所は、それらがリン酸基に負電荷を有する可能性があり、そのことが親油性の細胞膜を通過するその能力を妨げる点である。その化合物が細胞外により長く留まるほど、それはより分解され、結果として標的に到達する活性な化合物はより少なくなる。現在のアンチセンス化合物の別の短所は、オリゴヌクレオチドが二次および高次溶液構造を形成しやすい点である。これらの構造が一旦形成されると、それらはさまざまな酵素、タンパク質、ＲＮＡ、およびＤＮＡの結合のための標的となる。このことは、非特異的副作用、およびｍＲＮＡに結合する活性化合物の量の減少を結果として生じる。オリゴヌクレオチド療法を改良するための他の試みは、連結部分およびポリエチレングリコールを加えることを含んでいる。例えば、非特許文献１２、および特許文献１を参照。これらの例の両方で、修飾は、オリゴヌクレオチドを分解に対して安定化しおよび細胞透過性を高めるための試みとして、本質的に永続的である連結部分の使用を含む。しかし、これらの努力の両方は、有効性を提供することができない。
米国特許第４，９０４，５８２号明細書 Crooke,1992,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol,32: 329-376 Bielinska,A.,et al.,1990,Science,250: 997-1000 Wu,H.,et al.,1990,Gene 89: 203-209 Belikova,et al.,Tetrahedron Lett.37: 3557-3562,1967 Zamecnik & Stephenson,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75: 285-289 Zamecnik & Stephenson,1978,Proc.Natl.Acatl.Sci.U.S.A.,75: 280-284 Leonetti et al.,1988,Gene,72: 323 Smith et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83: 2787 Seroa ;et al.,1987,Nucleic Acids Res.15: 9909 Uhlmann and Peymann,1990,Chemical Reviews 90,545-561 pages Padmapriya and Agrawal,1993,Bioorg.& Med.Chenu.Lett.3 761 Kawaguchi,et al.,Stability,Specific Binding Activity,and Plasma Concentration in Mice of an Oligodeoxynucleotide Modified at 5'-Terminal with Poly (Ethylene glycol),Biol.Pharm.Bull.,18 (3) 474- 476 (1995)

現在の方法の不適当さのため、安定性およびヌクレアーゼ分解への耐性を改善し、および、毒性を低下させおよびオリゴヌクレオチド化合物のｍＲＮＡへの結合親和性を高める必要が存在する。現行のオリゴヌクレオチド両方は高価である。これは主に分解の問題のためである。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を分解から守り、高次構造の生成を防ぎ、および同時に、活性なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の十分な量を標的へ送ることの真の必要性がある。本発明はそのような改良を提供する。

本発明の一態様では、化学式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドプロドラッグが提供される：

ここで、Ｒ_１およびＲ_２は独立してＨまたはポリマー残基であり；
Ｌ_１およびＬ_４は独立して選択された放出可能な連結部分であり；
Ｌ_２およびＬ_３は独立して選択されたスペーサー基であり；
Ｘ_１はヌクレオチド残基またはオリゴヌクレオチド残基であり；
ｍ、ｎ、ｏおよびｐは独立して０または正の整数であり、ただし（ｏ＋ｎ）または（ｐ＋ｍ）≧２のいずれかである。

本発明の別の一態様は、２つのオリゴヌクレオチドが、与えられたポリマーデリバリー系へ結合するように、Ｒ_１および／またはＲ_２が本明細書に記載のαおよびω末端連結基の両方を含むポリマー残基である際に生じる二官能性化合物を含む。本実施形態の例は、例えば３'−ビスオリゴヌクレオチド複合体または５'−ビスオリゴヌクレオチド複合体のように、それぞれの３'末端基、５'末端基を介してポリマー系に結合したオリゴヌクレオチド、または、第１のオリゴヌクレオチドを、３'末端を介して第２のオリゴヌクレオチドの５'末端へ結合することによって生じた複合体を含む。そのようなポリマー複合体の例を化学式（i）、（ii）、（iii）および（iv）として下記に図解する：

ここで、すべての変数は上記の通りである。

本発明の目的のためには、「残基」の語は、生物学的に活性な化合物すなわちオリゴヌクレオチド、より具体的にはアンチセンスオリゴヌクレオチドの、プロドラッグキャリヤーが付加される置換反応を受けた後に残る部分を意味すると解される。

本発明の目的のためには、「ポリマー残基」または「ＰＥＧ残基」の語はそれぞれ、ポリマーまたはＰＥＧの、修飾オリゴヌクレオチド化合物との反応を受けた後に残る部分を意味すると解される。

本発明の目的のためには、「アルキル」の語は、直鎖、分枝鎖、置換、例えばハロ−、アルコキシ−、ニトロ−、Ｃ_１-１２アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキルまたは置換シクロアルキルなどを含むと解される。

本発明の目的のためには、「置換」の語は、官能基または化合物中に含まれる１個以上の原子に１個以上の別の原子を加えるか、または、その１個以上の原子を別の１個以上の原子で交換することを含むと解される。

本発明の目的のためには、置換アルキルは、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキルおよびメルカプトアルキルを含み；置換アルケニルは、カルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニルおよびメルカプトアルケニルを含み；置換アルキニルは、カルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニルおよびメルカプトアルキニルを含み；置換シクロアルキルは４−クロロシクロヘキシルといった部分を含み；アリールはナフチルといった部分を含み；置換アリールは３−ブロモ−フェニルといった部分を含み；アラルキルはトルイルといった部分を含み；ヘテロアルキルはエチルチオフェンといった部分を含み；置換ヘテロアルキルは３−メトキシ−チオフェンといった部分を含み；アルコキシはメトキシといった部分を含み；およびフェノキシは３−ニトロフェノキシといった部分を含む。ハロ−は、フルオロ、クロロ、ヨードおよびブロモを含むと解される。

本発明の目的のための「十分量」または「有効量」という語は、当業者に理解される通りの治療効果を達成する量を意味するとする。

本発明の主な長所の一部は、安定性およびヌクレアーゼ分解に対する耐性の上昇、溶解度の上昇、細胞透過性の上昇および毒性の低下を示す、新規のポリマーオリゴヌクレオチドプロドラッグを含む。

本発明の化合物の別の長所は、さまざまなポリマープロドラッグ基本骨格が修飾オリゴヌクレオチド化合物と放出可能に結合している点である。この長所は、ポリマー残基と付加されたオリゴヌクレオチドとの間に、プロドラッグの加水分解の速度に影響し得るさまざまな部分を含むように操作することができる医薬複合体を当業者に設計可能にする。当業者はこのように、プロドラッグの加水分解の速度の調節を可能にする置換基を含めることができる。

癌または悪性腫瘍の治療の方法においてといった、本化合物を 作成および使用する方法、および本明細書に記載の複合体もまた提供される。また、本発明のポリマーオリゴヌクレオチドプロドラッグが任意の他の抗癌剤と共に（同時におよび／または連続して）投与されることもまた考えられる。

したがって、本発明は、診断および分析試薬として、in vitroおよびin vivoの両方での研究および調査手法として、および治療薬としての用途を含む多数の実際的用途を有する、有用なポリマー結合オリゴヌクレオチドプロドラッグを提供する。本発明の範囲をより完全に理解するために、下記の用語が定義される。当業者は、「核酸」または「ヌクレオチド」の語はデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、リボ核酸（「ＲＮＡ」）、特に明記しない限り１本鎖または２本鎖、およびその任意の化学修飾に当てはまることを理解する。「オリゴヌクレオチド」は一般的に、相対的に短いポリヌクレオチド、例えば、約２ないし約２００ヌクレオチドの大きさ、またはより好ましくは長さ約１０ないし約３０ヌクレオチドの範囲である。本発明に記載のオリゴヌクレオチドは、一般的に合成核酸、および１本鎖である。「ポリヌクレオチド」および「ポリ核酸」の語はまた本明細書では同義に用いられる。

本発明のオリゴヌクレオチドへの修飾は、必要に応じて、例えば、望ましいポリマーへのオリゴヌクレオチドの共有結合、および／または、付加的電荷、分極率、水素結合、静電的相互作用、および機能をオリゴヌクレオチドへ組み込む機能部分の付加または置換を可能にする官能基または部分を有する選択されたヌクレオチドへの付加またはその置換を含む。そのような修飾は、２'位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、骨格修飾、メチル化、イソ塩基のイソシチジンおよびイソグアニジンといった塩基対組み合わせ、および相同組み合わせを含むがそれらに限定されない。オリゴヌクレオチド修飾はまた、キャッピングといった３'および５'修飾を含み得る。

ここで用いられる「アンチセンス」の語は、遺伝子産物をコードするかまたは対照配列をコードする特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列と相補的であるヌクレオチド配列をいう。「アンチセンス鎖」の語は、「センス」鎖と相補的である核酸鎖に関して用いられる。細胞代謝の通常の作用では、ＤＮＡ分子のセンス鎖は、ポリペプチドおよび／または他の遺伝子産物をコードする鎖である。センス鎖はメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）転写産物（アンチセンス鎖）の合成のための鋳型として作用し、次に転写産物は任意のコードされた遺伝子産物の産生を指示する。アンチセンス核酸分子は、目的の遺伝子を逆方向でウイルスプロモーターにライゲーションして相補鎖の合成を可能にすることによる合成を含む、本分野で公知である任意の方法によって 作成することができる。細胞へ一旦導入されると、この転写された鎖は細胞によって産生された天然の配列と組み合わされて２重鎖を形成する。これらの２重鎖はその結果、以降の転写または翻訳のどちらかを遮断する。この方法で、突然変異表現型を生じることができる。「ネガティブ」または（−）の表記はまた本分野で公知であってアンチセンス鎖をいい、および「ポジティブ」または（＋）はまた本分野で公知であってセンス鎖をいう。

例えば、１または複数の細胞におけるｍＲＮＡ転写産物の発現をダウンレギュレートすることを意図する場合は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞に導入される。細胞へ一旦導入されると、アンチセンスオリゴヌクレオチドは対応するｍＲＮＡ配列とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ結合によってハイブリダイズし、ヘテロ２重鎖を形成する。２重鎖が一旦形成されると、結合したｍＲＮＡの配列によってコードされるタンパク質の翻訳が阻害される。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、一般的にタグまたは標識と結合した、プローブ例えばハイブリダイゼーションプローブとして本分野で用いられ、および研究および治療目的の両方で特定の細胞産物または遺伝子調節配列の発現の正確なダウンレギュレーションを与えるために用いられる。

本発明の目的のためには、単数形または複数形の使用は、言及される物または対象の数を限定しないことが意図される。したがって、明示的に記載されない限り、細胞、ポリマーまたは医薬をいうための単数形の使用は、単一の細胞が処理され、単一の分子が調製されまたは使用され、および／または単一の医薬が使用されることを含意せず、および、複数形の使用は、言及された単一の物の使用を除外しない。

本発明の目的のためには、「残基」の語は、利用可能な水酸基またはアミノ基の修飾によってプロドラッグキャリヤー部分が付加されていて例えばエステルまたはアミド基をそれぞれ生じる反応を受けた後に残る、オリゴヌクレオチドといった、生物学的に活性な化合物の部分を意味すると解される。

Ａ．オリゴヌクレオチドの説明
本発明の性質の１つは、改良されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドポリマー複合体を提供する能力である。本明細書に記載のポリマー輸送系は、単一の種類のオリゴヌクレオチドに限定されず、代わりに、さまざまな部分と作用するように設計されており、ポリマー輸送系は１つ以上のヌクレオチドの３'または５'末端の、通常はＰＯ_４またはＳＯ_４基へ結合することができるとされている。ヌクレオチド配列は本明細書では従来の命名法を用いて表され、配列は左から右へ、５'末端から３'末端へ（５'−→３'−）進んで読まれる。

Ｘ_１-３は、本発明の目的のためにはオリゴデオキシヌクレオチド残基を含む、同一のまたは異なるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド残基を表す。より好ましくは、Ｘ_１-３は独立して選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチド残基またはアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド残基である。

単独でまたはオリゴヌクレオチド（１０−１，０００ヌクレオチド）の一部として用いることができる、可能なヌクレオチドの非限定的な一覧は下記を含む：

ここで、ＭはＯまたはＳであり；
Ｂ_１およびＢ_２はＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）、Ｕ（ウラシル）ならびに下記に示すものおよび当業者に公知のものを含む修飾塩基より成る群から独立して選択され；
Ｒ_１００およびＲ_１０１は、Ｈ、Ｒ'がＨであるＯＲ'、Ｃ_１-６アルキル、置換アルキル、ニトロ、ハロ、アリール、などより成る群から独立して選択される。

本発明の方法において有用であるオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドの一部は、下記を含むがそれらに限定されない：
天然のホスホジエステル骨格またはホスホロチオエート骨格または任意の他の修飾された骨格アナログを有する、オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチド；
ＬＮＡ（ロックされた核酸）；
ＰＮＡ（ペプチド骨格を有する核酸）；
トリシクロＤＮＡ；
おとりＯＤＮ（２本鎖オリゴヌクレオチド）；
ＲＮＡ（触媒ＲＮＡ配列）；
リボザイム；
シュピーゲルマー（Ｌ−立体配座オリゴヌクレオチド）；
ＣｐＧオリゴマー、など例えば下記の文献（それらの内容は参照により本開示に含まれる）に開示されるもの：
Tides 2002,Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences,May 6-8,2002,Las Vegas,NV；および
Oligonucleotide & Peptide Technologies,18th & 19th November 2003,Hamburg,Germany。

本発明に記載のオリゴヌクレオチドはまた、 下記の表１に列記されるものを含む、本分野で公知である任意の適当なヌクレオチドアナログおよび誘導体を含む。

好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、腫瘍細胞の抗癌剤に対する耐性に関与するタンパク質をダウンレギュレートするものである。例えば、タンパク質ＢＣＬ−２はミトコンドリアからのチトクロムＣおよびアポトーシス開始因子の放出を阻害し、およびそれによってアポトーシスの発生を妨げる。高レベルのＢＣＬ−２を有する癌細胞は、したがって、化学療法または放射線療法の両方に対して非常に抵抗性である。参照により本開示に含まれる米国特許第６，４１４，１３４号明細書は、例えば、前立腺癌細胞、骨髄腫細胞および他の腫瘍細胞を含む、いくつかの腫瘍細胞における抗癌療法に対する耐性に関連するタンパク質Ｂｃｌ−２をダウンレギュレートするアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する。上記の米国特許によると、ｂｃｌ−２遺伝子は、細胞分裂を加速することによってではなく、腫瘍細胞生存を延長することによって癌の病因に寄与すると考えられている。米国特許第６，４１４，１３４号明細書は一般的に長さ１７から３５塩基の、ｂｃｌ−２ｍＲＮＡと相補的であり、およびＴＡＣＣＧＣＧＴＧＣＧＡＣＣＣＴＣ（配列番号５）の配列を有する核酸分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載する。これらは好ましくは少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。

癌治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドによるダウンレギュレーションの標的としてさまざまな企業によって考えられている、本分野で公知である他の細胞タンパク質を下記の表に要約する。

ｂｃｌ−２発現といった、癌細胞生存に関係するタンパク質の発現のダウンレギュレートにおける使用に適したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約２ないし２００ヌクレオチドコドン；より好ましくは１０ないし４０コドン；および非常に好ましくは約１７から２０コドンであるオリゴヌクレオチドを含む。そのオリゴヌクレオチドは、翻訳開始部位、ドナーおよびスプライシング部位、または輸送または分解のための部位といった、ｂｃｌ−２のプレｍＲＮＡに沿った戦略的な部位に相補的であるオリゴヌクレオチドから好ましくは選択される。

そのような戦略的な部位で翻訳を阻害することは、機能するｂｃｌ−２遺伝子産物の生成を妨げる。しかし、ｂｃｌ−２プレｍＲＮＡまたは細胞増殖を阻害するｍＲＮＡと相補的または実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドを含む、アンチコードオリゴマーの任意の組み合わせまたは部分組み合わせは、本発明における用途に適していることに注意する。例えば、ｂｃｌ−２ＲＮＡの連続または非連続配列の配列部分と相補的であるオリゴデオキシヌクレオチドは細胞増殖を阻害する可能性があり、およびしたがって本発明の方法における用途に適している。

ｂｃｌ−２発現をダウンレギュレートするのに適したオリゴヌクレオチドはまた、ｂｃｌ−２ｍＲＮＡ上の戦略部位または他の部位に隣接する配列部分と相補的または実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドを含む。隣接配列部分は好ましくはｂｃｌ−２ｍＲＮＡ上の上述の部位の上流または下流の、約２ないし約１００塩基の範囲にわたる。

これらの部位は好ましくは長さ約５ないし約２０コドンの範囲にわたる。また、オリゴヌクレオチドは、他の遺伝子に由来するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡについてのオリゴヌクレオチドのホモロジーを最小化するため、他の遺伝子のプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡには一般的に見出されないプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの配列部分と相補的であることが好ましい。

ｂｃｌ−２発現をダウンレギュレートするために好ましいいくつかの好ましいアンチセンス、または相補、オリゴヌクレオチドを下記の通り表３に列記する。

上記の表３に列記されたものと相対的に、より多数またはより少数の置換ヌクレオチドを含む、および／またはｂｃｌ−２ｍＲＮＡ鎖に沿って３'または５'方向のどちらかへより長く伸びるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができることが理解される。

好ましくは、本発明のプロドラックに用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（別名オブリマーセンナトリウム、Ｇｅｎｔａ Ｉｎｃ．（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪ）製）が有するのと同一または実質的に同様のヌクレオチド配列を有する。Ｇｅｎａｓｅｎｓｅは１８量体ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ（配列番号１）であり、ヒトｂｃｌ−２ｍＲＮＡの開始配列の最初の６個のコドンと相補的である（ヒトｂｃｌ−２ｍＲＮＡは本分野で公知であり、および例えば、参照により本開示に含まれる米国特許第６，４１４，１３４号明細書の配列番号１９として記載されている）。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）はＧｅｎａｓｅｎｓｅを２０００年８月にオーファンドラッグに指定しており、および癌治療におけるＧｅｎａｓｅｎｓｅについて新薬承認申請（ＮＤＡ）を承認している。そのＮＤＡは、以前に化学療法を受けたことがない進行メラノーマの患者の治療のために、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅをダカルバジンと併用して投与することを提案している。加えて、ＦＤＡはその申請を優先審査品目に指定しており、それは２００４年６月８日以前の決定を目標とする。初期臨床試験での前立腺癌の併用療法におけるＧｅｎａｓｅｎｓｅの活性を確認している、参照により本開示に含まれるChi et al.,2001,Clinical Cancer Research Vol.7,3920-3927も参照。本発明のプロドラッグは、天然（未修飾）１８量体について認められるのと同じ有用性を持つ。

Ｇｅｎａｓｅｎｓｅは、Ｂｃｌ−２タンパク質の産生をダウンレギュレートし、および腫瘍細胞の治療への感受性を高め、および最終的に、細胞死を引き起こすことが示されている。いくつかの研究は、抗癌剤と併用したＧｅｎａｓｅｎｓｅを用いたいくつかの癌の治療において有望な結果を報告している。黒色腫患者におけるダカルバジン併用Ｇｅｎａｓｅｎｓｅの第Ｉ／ＩＩ相治験は有望な活性を示しており、および第ＩＩＩ相多施設治験が進行中である。加えて、ホルモン治療抵抗性前立腺癌患者においてミトザントロンと併用して用いられるＧｅｎａｓｅｎｓｅは有望な結果を示している。Kim et al.,2001(同上)。

Ｇｅｎａｓｅｎｓｅといったアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ポリマーへの結合は、本発明の好ましい一実施形態の例となる。

別の一実施形態では、追加の適当なアンチセンスオリゴヌクレオチドは：
Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ；（化合物１３−配列番号１）
Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ；（化合物３６−配列番号２）
Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ；（化合物３７−配列番号３）および
Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ、（化合物３８−配列番号４）
および実施例に見出されるものを含む。

Ｂ．化学式（Ｉ）
本発明の好ましい一実施形態では、化学式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドプロドラッグが提供される：

ここで、Ｒ_１およびＲ_２は独立してＨまたはポリマー残基であり；
Ｌ_１およびＬ_４は独立して選択された放出可能な連結部分であり；
Ｌ_２およびＬ_３は独立して選択されたスペーサー基であり；
Ｘ_１はヌクレオチド残基またはオリゴヌクレオチド残基であり；
ｍ、ｎ、ｏおよびｐは独立して０または正の整数であり、ただし（ｏ＋ｎ）または（ｐ＋ｍ）≧２のいずれかである。

本発明のポリマー輸送系は、好ましくはポリマー残基であり、Ａとして表されるキャッピング基を必要に応じて有する、Ｒ_１およびＲ_２のうち少なくとも１つを部分的に基礎とする。適当なキャッピング基は、例えば、ＯＨ、ＮＨ_２、ＳＨ、ＣＯ_２Ｈ、Ｃ_１-６アルキル、および下記のようなオリゴヌクレオチドを含み

ここで、Ｘ_２およびＸ_３はＸ_１と同一であるかまたは別のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド残基である。

好ましいキャッピング基（II）および（III）は、下記の化学式（i）、（ii）、（iii）および（iv）の組成物が生成されるのを可能にする：

ここで、すべての変数は上記の通りである。

本発明の別の好ましい一実施形態では、Ｌ_４は下記の化学式のうちから選択された放出可能な連結部分である：

ここで、Ｙ_１-２５はＯ、ＳまたはＮＲ_９より成る群から独立して選択され；
Ｒ_６-７、Ｒ_９-１３、Ｒ_{１６-２５}、およびＲ_{２７-４１}は水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、Ｃ_１-６置換アルキル、Ｃ_３-８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、置換Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から独立して選択され；
Ａｒは多置換芳香族炭化水素または多置換ヘテロ環基を形成する部分であり；
Ｌ_５-１２は独立して二官能性スペーサーであり；
Ｚは、標的細胞中へ能動的に輸送される部分、疎水性部分、二官能性連結部分およびその組み合わせから選択され；
ｃ、ｈ、ｋ、ｌ、ｒ、ｓ、ｖ、ｗ、ｖ'、ｗ'、ｃ'、およびｈ'は独立して選択された正の整数であり；
ａ、ｅ、ｇ、ｊ、ｔ、ｚ、ａ'、ｚ'、ｅ'およびｇ'は独立して０または正の整数のどちらかであり；および
ｂ、ｄ、ｆ、ｉ、ｕ、ｑ、ｂ'、ｄ'およびｆは独立して０または１である。

別の好ましい一実施形態では、Ｌ_１は下記の化学式のうちから選択された放出可能な連結部分である：

ここで、Ｙ_{１’-２５’}はＯ、ＳまたはＮＲ_９より成る群から独立して選択され；
Ｒ_{６’-７’}、Ｒ_{９’-１３’}、Ｒ_{１６’-２５’}、およびＲ_{２７’-４１’}は水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、Ｃ_１-６置換アルキル、Ｃ_３-８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、置換Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から独立して選択され；および
Ｌ_{５’-１２’}は独立して二官能性スペーサーである。

本発明の一部の好ましい一実施形態では、Ｌ_５-１２は独立して、下記のうちから選択された二官能性スペーサーであり：

さらに、Ｌ_{５’-１２’}は独立して、下記のうちから選択された二官能性スペーサーである：

ここで、Ｒ_５５-Ｒ_５９およびＲ_{５５'-５９'}は、水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、Ｃ_１-６置換アルキル、Ｃ_３-８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、置換Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から独立して選択され、および
Ｒ_６０およびＲ_６０'は、水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、Ｃ_１-６置換アルキル、Ｃ_３-８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、置換Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシ、Ｃ_１-６ヘテロアルコキシ、ＮＯ_２、ハロアルキルおよびハロゲンより成る群から独立して選択され；および
ｓ'およびｔ'は正の整数である。

本発明の別の好ましい一実施形態では、Ｌ_２およびＬ_３は、独立して約１から約６０個の炭素原子および約１ないし約１０個のヘテロ原子を有するスペーサー基である。好ましくは、Ｌ_２およびＬ_３は、独立して約２から約１０個の炭素原子および約１ないし約６個のヘテロ原子を有するスペーサー基である。非常に好ましくは、Ｌ_３は下記のうちから選択される：

さらに、最も好ましくは、Ｌ_２は下記のうちから選択される：

ここで、ＱおよびＱ'はＯ、ＳまたはＮＨから独立して選択され；
Ｒ_{５０-５３}およびＲ_{５０'-５３'}は水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、Ｃ_１-６置換アルキル、Ｃ_３-８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、置換Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から独立して選択され；
Ｒ_５４およびＲ_５４'は、水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、Ｃ_１-６置換アルキル、Ｃ_３-８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、置換Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシ、Ｃ_１-６ヘテロアルコキシ、ＮＯ_２、ハロアルキルおよびハロゲンより成る群から独立して選択され；および
ｑ'およびｒ'はそれぞれ正の整数である。

本発明の化学式を構成する他の変数に関しては、下記が好ましい：
Ｙ_１-２５およびＹ_１'-２５'はＯ、ＳまたはＮＲ_９より成る群から独立して選択され；
Ｒ_６-７、Ｒ_９-１３、Ｒ_{１６-２５}、Ｒ_{２７-４１}、ならびにＲ_{６’-７’}、Ｒ_{９’-１３’}、Ｒ_{１６’-２５’}、およびＲ_{２７’-４１’}は水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、アリール、アラルキル、およびＣ_１-６ヘテロアルキルより成る群から独立して選択され；
ｃ、ｈ、ｋ、１、ｒ、ｓ、ｖ、ｗ、ｖ'、ｗ'、ｃ'、およびｈ'は１であり；
ａ、ｅ、ｇ、ｊ、ｔ、ｚ、ａ'、ｚ'、ｅ'およびｇ'は独立して０または１のいずれかであり；および
ｂ、ｄ、ｆ、ｉ、ｕ、ｑ、ｂ'、ｄ'およびｆは独立して０または１である。

本発明のさらに別の好ましい一実施形態では、化学式（Ia）の化合物が提供される：

ここで、Ｌ_２はスペーサー基であり；
Ｘ_１はヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド残基であり；
ｕ'は正の整数であり；および
Ｔは、参照によりそれぞれ本開示に含まれる、同一出願人による国際公開第０２／０６５９８８号パンフレットおよび国際公開第０２／０６６０６６号パンフレットに記載された化合物のうちから好ましくは選択される分枝鎖ポリマーである。これらの一般化学式の中で、下記が好ましい：

ここで、Ｄ'は下記のうちの１つであり：

ここで、Ｒ_６１は、Ｒ_６１が両端に置換基を有するのが示される場合はポリマーは二官能性であり得るという了解の下で、Ｒ_１について定義されたようなポリマー残基であり；および他のすべての変数は上記の通りである。

例示の目的で、化学式（Ia）の非限定的な化合物は下記の通りである：

ここで、すべての変数は上記の通りである。

化学式（Ia）の別の一態様は、少なくとも４個のオリゴヌクレオチドが送られるようにポリマー残基（Ｒ_６１）がαおよびω末端連結基の両方を含む場合に生じる二官能性化合物を含む。

そのようなポリマー複合体の例は下記に化学式（vi）および（vii）として例示される：

ここで、すべての変数は上記の通りである。

本発明の別の好ましい一実施形態では、Ｌ_２およびＬ_３は、独立して約１から約６０個の炭素原子および約１ないし約１０個のヘテロ原子を有するスペーサー基である。好ましくは、Ｌ_２およびＬ_３は、独立して約２から約１０個の炭素原子および約１ないし約６個のヘテロ原子を有するスペーサー基である。非常に好ましくは、Ｌ_３は下記のうちから選択される：

さらに、最も好ましくは、Ｌ_２は下記のうちから選択される：

ここで、ＱおよびＱ'はＯ、ＳまたはＮＨから独立して選択され；
Ｒ_{５０-５３}およびＲ_{５０'-５３'}は水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、Ｃ_１-６置換アルキル、Ｃ_３-８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、置換Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から独立して選択され；
Ｒ_５４およびＲ_５４'は、水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、Ｃ_１-６置換アルキル、Ｃ_３-８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、置換Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシ、Ｃ_１-６ヘテロアルコキシ、ＮＯ_２、ハロアルキルおよびハロゲンより成る群から独立して選択され；および
ｑ'およびｒ'はそれぞれ正の整数である。

本発明の化学式を構成する他の変数に関しては、下記が好ましい：
Ｙ_１-２５およびＹ_１'-２５'はＯ、ＳまたはＮＲ_９より成る群から独立して選択され；
Ｒ_６-７、Ｒ_９-１３、Ｒ_{１６-２５}、Ｒ_{２７-４１}、ならびにＲ_{６’-７’}、Ｒ_{９’-１３’}、Ｒ_{１６’-２５’}、およびＲ_{２７’-４１’}は水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、アリール、アラルキル、およびＣ_１-６ヘテロアルキルより成る群から独立して選択され；
ｃ、ｈ、ｋ、１、ｒ、ｓ、ｖ、ｗ、ｖ'、ｗ'、ｃ'、およびｈ'は１であり；
ａ、ｅ、ｇ、ｊ、ｔ、ｚ、ａ'、ｚ'、ｅ'およびｇ'は独立して０または１のいずれかであり；および
ｂ、ｄ、ｆ、ｉ、ｕ、ｑ、ｂ'、ｄ'およびｆは独立して０または１である。

Ｃ．Ａｒ部分の説明
本発明の一部の態様では、Ａｒ部分が化学式（Ｉ）に含まれる場合に多置換芳香族炭化水素または多置換ヘテロ環基を形成する部分であることがわかる。重要な性質は、そのＡｒ部分が本質的に芳香族である点である。一般的に、芳香族であるためには、パイ電子は環分子の平面の上および下の両方の「電子雲」の中で共有されなければならない。さらに、パイ電子の数はＨｕｃｋｅｌ則を満たさなければならない（４ｎ＋２）。無数の部分が化学式（Ｉ）についての部分の芳香族条件を満たしおよびしたがってここでの使用に適することを当業者は理解する。

一部の特に好ましい芳香族基は下記を含む：

ここで、Ｒ_{６２-６７}は、Ｒ_６を定義するのと同一の群から独立して選択される。

他の好ましい芳香族炭化水素部分は、限定はされないが下記のものを含む：

ここで、ＥおよびＥ'は独立してＣＲ_６８またはＮＲ_６９であり；およびＪはＯ、ＳまたはＮＲ７０であって、Ｒ_{６８-７０}はＲ_６を定義するのと同一の群から選択されるかまたはシアノ、ニトロ、カルボキシル、アシル、置換アシルまたはカルボキシアルキルである。五員環および六員環の異性体もまた考えられており、および、ベンゾおよびジベンゾ系およびそれらの関連する同族体もまた考えられている。また、Ｈｕｃｋｅｌ則が満たされる限り芳香族環は必要に応じてＯ、Ｓ、ＮＲ_９、などといったヘテロ原子で置換され得ることが当業者に理解される。さらに、芳香族またはヘテロ環構造は必要に応じてハロゲンおよび／または側鎖で置換でき、それらの語は本分野で通常理解されている。

Ｄ．ポリアルキレンオキサイド
化学式（Ｉ）を参照すると、Ｒ_１およびＲ_２はポリアルキレンオキサイドといったポリマー部分であることがわかる。そのようなポリマーの適当な例は、実質的に非抗原性であるポリエチレングリコールを含む。同一出願人による米国特許第５，６４３，５７５号明細書、第５，９１９，４５５号明細書および第６，１１３，９０６号明細書に記載されたもののようなポリプロピレングリコールもまた有用である。本発明の方法で有用な他のＰＥＧは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．のカタログ『ポリエチレングリコールおよび誘導体２００１』に記載されている。それぞれの開示は参照により本開示に含まれる。Ｒ_１およびＲ_２は好ましくはＰＥＧ誘導体、例えば−Ｏ−(ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ)_ｘ−である。この態様では、Ｒ_１-２は下記のうちから独立して選択される：

ここで、ｎ'は重量平均分子量が少なくとも約２，０００Ｄａから約１３６，０００Ｄａとなるように選択された重合度であり；
Ｒ_４８は水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、Ｃ_１-６置換アルキル、Ｃ_３-８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、置換Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から選択され；および
Ｊはメチル基のようなキャッピング基、または二官能性ポリマーを提供することを可能にする相補連結基である。

ＰＡＯおよびＰＥＧは実質的に重量平均分子量が異なり得るが、本発明の大部分の態様で、好ましくは、Ｒ_１およびＲ_２は独立して約２，０００Ｄａないし約１３６，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。より好ましくは、Ｒ_１およびＲ_２は独立して約３，０００Ｄａないし約１００，０００Ｄａの重量平均分子量を有し、約５，０００Ｄａないし約４０，０００Ｄａの重量平均分子量が非常に好ましい
本開示に含まれるポリマー物質は好ましくは室温にて水溶性である。そのようなポリマーの非限定的な一覧は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールといったポリアルキレンオキサイドホモポリマー、その共重合体およびそのブロック共重合体を含み、ただしブロック共重合体の水への溶解度が維持されることを条件とする。

Ｅ オリゴヌクレオチドポリマー複合体の合成
概して、プロドラッグは以下の工程によって調製される：
ａ）下記化学式の化合物：
Ｒ_２−Ｌ_４−脱離基
を、下記化学式の化合物：
Ｈ−Ｌ_３−Ｘ_１
と、下記の化学式のプロドラッグを生じるのに十分な条件下で反応させる：
Ｒ_２−Ｌ_４−Ｌ_３−Ｘ_１
ここで、
Ｒ_２はポリマー残基であり；
Ｌ_４は放出可能な連結部分であり；
Ｌ_３はスペーサー基であり；
Ｘ_１はヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド残基である。

本発明のこの態様では、結合した放出可能なリンカーを既に含む活性化ポリマーを用いるのが好ましい。適当な組み合わせの非限定的な一覧は、それぞれの内容が参照により本開示に含まれる、同一出願人による米国特許第６，６２４，１４２号明細書、第６，３０３，５６９号明細書、第５，９６５，１１９号明細書、第６，５６６，５０６号明細書、第５，９６５，１１９号明細書、第６，３０３，５６９号明細書、第６，６２４，１４２号明細書、および第６，１８０，０９５号明細書に記載された放出可能なＰＥＧを基礎とする輸送系を含む。

具体的な例は下記を含むがそれらに限定されず、もちろんポリマー部分の分子量は当業者の必要に応じて変え得ることが理解される：

次に、上記のポリマー放出可能なリンカーを、修飾オリゴマーと、複合体が形成されるのを可能にするのに十分な条件下で反応させる。

上記のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれかは、ホスホロアミダイト法といった常法を用いて目的のアルキル−アミノまたは他の基を末端リン酸へ付加して、５'または３'末端リン酸またはホスホロチオエートの１つで官能基化することができる。例えば、ブロック化（Ｆｍｏｃ）アミノアルキルが付加され、結果として得られる化合物が酸化され、脱保護されおよび精製される。

具体的なオリゴヌクレオチドポリマー複合体またはプロドラッグの合成を実施例に示す。あるいは、プロドラッグは以下の工程によって調製される：
１）活性化ＰＥＧポリマーを二官能性の放出可能な連結基と、第１の中間体を生じる適当な条件下で反応させ；
２）工程１）の中間体を脱保護し、さらにＮＨＳエステルといった適当な活性化基を用いて活性化する；さらに
３）工程３）の活性化された中間体をＰＢＳ緩衝系中で修飾オリゴヌクレオチドと反応させ、目的のオリゴヌクレオチドポリマープロドラッグを得る。

活性化ポリマーの非限定的な一覧は、ビス−スクシンイミジルカルボナート活性化ＰＥＧ（ＳＣ−ＰＥＧ）、ビス−チアゾリジン−２−チオン活性化ＰＥＧ（Ｔ−ＰＥＧ）、Ｎヒドロキシフタルアミジルカルボナート活性化ＰＥＧ（ＢＳＣ−ＰＥＧ）、（参照により本開示に含まれる、同一出願人による米国特許出願第０９／８２３，２９６号明細書を参照）、スクシンイミジルスクシネート活性化ＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）および、例えば、前出の２００１Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒカタログに見られるもののようなモノ活性化ＰＥＧを含む。

活性化ＰＥＧポリマーの、保護された二官能性の放出可能な連結基への結合は、カップリング剤の存在下で実施することができる。適当なカップリング剤の非限定的な一覧は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌといった販売元から入手可能であるかまたは公知の方法を用いて合成される、１，３−ジイソプロピルカルボジイミド （ＤＩＰＣ）、任意の適当な ジアルキル カルボジイミド、２−ハロ−１−アルキル−ピリジニウムハロゲン化物 （向山 試薬）、１− （３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル カルボジイミド （ＥＤＣ）、プロパンホスホン酸環状無水物 （ＰＰＡＣＡ） および フェニルジクロロリン酸などを含む。

好ましくは、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）、塩化メチレン（ＤＣＭ）、クロロホルム（ＣＨＣｌ_３）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはその混合物といった不活性溶媒中で、および０℃ないし最大約２２℃（室温）の温度にて置換基を反応させる。

修飾オリゴヌクレオチドのＰＥＧ−放出可能リンカーへの結合は、約７．４−８．５のｐＨ範囲にあるＰＢＳ緩衝系中で実施することができる。当業者はもちろん、本開示に記載されるプロドラッグの合成はまた、通常見られる実験条件、すなわち実施例に記載されるような溶媒、温度、カップリング剤などの使用を含むことを理解する。

選択された合成にかかわらず、本開示に記載される合成法の結果として得られる好ましい化合物の一部は下記を含む：

ここで、

は、オリゴヌクレオチドおよび末端リン酸修飾の位置を表し、およびｍＰＥＧはＣＨ_３−Ｏ−(ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ)_Ｘ−であり；ｘは約１０ないし約２３００から選択された正の整数である。

本発明のより好ましい化合物は下記を含む：

Ｇ．治療方法
本発明の別の一態様は、哺乳類におけるさまざまな医学的症状のための治療の方法を提供する。本方法は、そのような治療を必要とする哺乳類へ、本開示に記載の方法通りに調製されたオリゴヌクレオチドプロドラッグの有効寮を投与することを含む。本組成物は、哺乳類において、特に、新生物性疾患の治療、腫瘍組織量の減少、新生物の転移の防止および、腫瘍／新生物増殖、肝疾患、ＨＩＶのようなウイルス疾患の再発の防止に有用である。本発明のプロドラッグは、天然のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドが用いられる適応のどれにでも、すなわち癌治療などに用いることができる。単に一例として、本発明のプロドラッグは、多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前立腺癌および多数にわたるため挙げない他の腫瘍または癌の治療に使用することが考えられている。

投与されるプロドラッグの量は、含まれる親分子および治療される症状に依存する。一般的に、本治療法に用いられるプロドラッグの量は、哺乳類において目的の治療結果を効果的に達成する量である。必然的に、さまざまなプロドラッグ化合物の用量は、親化合物、in vivo加水分解の速度、ポリマーの分子量、などにいくらか依存して変動する。上記に示す範囲は一例であり、および当業者が、臨床経験および治療適応に基づいて選択されたプロドラッグの最適な投与を決定する。実際の用量は、必要以上の実験なしに当業者に明らかとなる。

本発明のプロドラッグは、哺乳類への投与のための１つ以上の適当な医薬組成物に含めることができる。本医薬組成物は、本分野で既知である方法に従って調製された、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル剤などの剤形であり得る。また、そのような組成物の投与は、当業者の必要に応じて、経口および／または非経口経路によることができることが考えられている。本組成物の溶液および／または懸濁液は、例えば静脈注射、筋肉内注射、皮下注射などのような本分野で既知の任意の方法による、例えば、本組成物の注射または浸潤用のキャリヤー媒体として利用することができる。

そのような投与はまた、体腔または空洞への注入により、および吸入および／または鼻腔内経路によることができる。本発明の好ましい態様では、しかし、本プロドラッグはそれを必要とする哺乳類へ非経口的に投与される。

また、本発明のプロドラッグが、本分野で公知である他の抗癌剤と併用して（例えば、同時におよび／または連続して）投与されることが考えられている。適当な抗癌剤は、単に例として、そのような薬剤を少数だけ挙げると下記を含む：（パクリタキセル； Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）（イリノテカン； Ｐｆｉｚｅｒ．） ；Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＩＤＥＣ）；Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標）（フルダラビン；Ｂｅｒｌｅｘ Ｌａｂｓ）；Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）（シクロホスファミド； Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）（ドセタキセル；Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｎｎａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）（ゲムツズマブ・オゾガマイシン；Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ）；シトシンアラビノシドおよび／またはデキサメタゾン。

下記の実施例は本発明のさらなる理解を提供する役割を果たすが、いかなる方法でも本発明の有効範囲を制限しないことが意図される。実施例中で列挙される下線および太字の数字は、図面に示される数字に対応する。各図において、糖部分およびリン酸骨格は下記のように表される：

塩基＝Ａ，Ｇ、ＣまたはＴ、あるいは単に―で表される：
ｍＰＥＧの表記は以下を表すと解される：

一般的手順 ＰＥＧリンカーとオリゴヌクレオチドの間のすべての結合反応はＰＢＳ緩衝液系中で室温にて実施された。一般的に有機溶媒を用いた抽出によって未反応オリゴヌクレオチドを除去し、さらに陰イオン交換クロマトグラフィーによってＰＥＧ−オリゴ複合体を未反応の過剰のＰＥＧリンカーから分離して純粋な産物をもたらした。

ＨＰＬＣ法 反応混合物ならびに中間体および最終産物の純度は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ（登録商標）ＨＰＬＣ装置によって、ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）３００ ＳＢ Ｃ−８逆相カラム（１５０ｘ４．６ｍｍ）またはＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）３００Ａ Ｃ１８逆相カラム（１５０ｘ４．６ｍｍ）を使用し、多波長ＵＶ検出器を用いて、３０−９０％のアセトニトリルを含む０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および２５−３５％アセトニトリルを含む４ｍＭＴＢＡＣ１含有５０ｍＭＴＥＡＡ緩衝液のグラジエントを使用して流速１ｍＬ／分にて監視した。陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＢｉｏ−Ｃａｄ ７００Ｅ潅流クロマトグラフィーワークステーション上で、ＷａｔｅｒｓからのＡＰ空ガラスカラムに充填したＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＰｏｒｏｓ ５０ＨＱ強陰イオン交換樹脂またはＡｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅファストフロー弱陰イオン交換樹脂のどちらかを用いて実施した。脱塩はＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＨｉＰｒｅｐ２６／１０またはＰＤ−１０脱塩カラムを用いて達成した。

実施例１
化合物３ 化合物１（４４０ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）および２（５ｍｇ、３．６μｍｏｌ）のＰＢＳ緩衝液（１０ｍＬ、ｐＨ７．４）溶液を室温にて１２時間攪拌した。反応溶液を塩化メチレン（ＤＣＭ、３ｘ１０ｍＬ）を用いて抽出し、および合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、および溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を二回蒸留水に溶解し（１００ｍｇあたり１．５ｍＬ）およびＨＱ／１０Ｐｏｒｏｓ強陰イオン交換カラム（１０ｍｍｘ６０ｍｍ、ベッド容量−６ｍＬ）に負荷した。未反応ＰＥＧリンカーは水と共に溶出し（３−４カラム容量）および産物はその後に０．２ＭＮＨ_４ＨＣＯ_３溶液で溶出した（〜２カラム容量）。純粋な産物を含む画分をプールしおよび凍結乾燥して純粋な３を得た（１９ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ、４０％）。

実施例２−６
化合物５、７、９、１１、および１２は、３と同様の方法で作成および精製し、収率は３０％ないし５０％の範囲であった。

実施例７
化合物１４ 化合物１３（１０ｍｇ、１．７μｍｏｌ）を含むＰＢＳ緩衝液（５ｍＬ、ｐＨ７．４）溶液に、１０（１７５ｍｇ、８５ｐｍｏｌ）を等量に分けて５回、毎時間加え、および室温にて１２時間攪拌した。反応溶液をＤＣＭ（３ｘ１０ｍＬ）および食塩水（１０ｍＬ）を用いて抽出し、さらに合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、および溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を二回蒸留水（１．５ｍＬ）に溶解し、および２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で予め平衡化したＤＥＡＥファストフロー弱陰イオン交換カラム（１０ｍｍｘ６０ｍｍ、ベッド容量〜６ｍＬ）に負荷した。未反応ＰＥＧリンカーは水と共に溶出し（３−４カラム容量）および産物はその後に、０から１００％の１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液７．４の１０分間でのグラジエントを用い、次いで１００％１Ｍ ＮａＣｌを１０分間流速３ｍＬ／分にて溶出した。純粋な産物を含む画分をプールし、およびＰＤ−１０脱塩カラムで０．２Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３溶液（〜２カラム容量）を用いて脱塩し、および結果として得られた溶液を凍結乾燥して純粋な１４を得た（２５ｍｇ、０．９５μｍｏｌ、５７％）。

実施例８
化合物１６は、１４と同様の方法で作成および精製し、収率は６０％であった。

実施例９
化合物１７ ＡＳ１（５ｍｇ、０．８５μｍｏｌ）を含むリン酸緩衝液（２ｍＬ、ｐＨ７．８）溶液へ、１０（１７５ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を等量に分けて５回、２時間中に加え、および結果として得られた溶液を室温にてさらに２時間攪拌した。反応溶液をＤＣＭ（３ｘ６ｍＬ）および食塩水（５ｍＬ）を用いて抽出し、さらに合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、および溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を二回蒸留水（５ ｍＬ） に溶解し、および２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で予め平衡化したＤＥＡＥファストフロー弱陰イオン交換カラム（１０ｍｍｘ６０ｍｍ、ベッド容量〜６ｍＬ）に負荷した。未反応ＰＥＧリンカーは水と共に溶出し（３−４カラム容量）および産物はその後に、０から１００％の１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４の１０分間でのグラジエントを用い、次いで１００％１Ｍ ＮａＣｌを１０分間流速３ｍＬ／分にて溶出した。純粋な産物を含む画分をプールし、およびＰＤ−１０脱塩カラムで脱塩し、および結果として得られた溶液を凍結乾燥して純粋な１７を得た（１５ｍｇ、０．５７μｍｏｌ、６７％）。

実施例１０−１１
化合物１８および１９は、１７と同様の方法で作成および精製し、収率はＡＳ２およびＡＳ３をＡＳ１の代わりに用いて最終産物について６７％であった。

実施例１２−１５
化合物２１は、１２を２０で置き換えることによって１４と同様の方法で作成および精製し、収率は９０％であった。

化合物２２は、１２を２０で置き換えることによって１４と同様の方法で作成および精製し、収率は６５％であった。

化合物２４は、１２を２３で置き換えることによって１４と同様の方法で作成および精製し、さらに、脱塩では、産物を溶出するために０．２Ｍ ＮＨ_４ＨＣＯ_３溶液の代わりに水（〜２カラム容量）を用いた。最終収率は３０％であった。

化合物２６は、２３を２５で置き換えることによって２４と同様の方法で作成および精製した。収率は３０％であった。

実施例１６
化合物２７ １３（１０ｍｇ、１．７μｍｏｌ）を含むリン酸緩衝液（５ｍＬ、ｐＨ８．５）溶液に、１０等分された２７（１８０ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を加え、および結果として得られた溶液を室温にて４日間攪拌した。反応溶液をＤＣＭ（３ｘ１０ｍＬ）および食塩水（１０ｍＬ）を用いて抽出し、さらに合わせた有機相を乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、ろ過し、および溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を二回蒸留水（１．５ｍＬ）に溶解し、および２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４で予め平衡化したＤＥＡＥファストフロー弱陰イオン交換カラム（１０ｍｍｘ６０ｍｍ、ベッド容量〜６ｍＬ）に負荷した。未反応ＰＥＧリンカーは水と共に溶出し（３−４カラム容量）および産物はその後に、０から１００％の１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液７．４の１０分間でのグラジエントを用い、次いで１００％１Ｍ ＮａＣｌを１０分間流速３ｍＬ／分にて溶出した。純粋な産物を含む画分をプールし、およびＰＤ−１０脱塩カラムで脱塩し、および結果として得られた溶液を凍結乾燥して純粋な１４を得た（１０５ｍｇ、０．０１０２ｍｍｏｌ、６０％）。産物の純度はＨＰＬＣによって決定した。

実施例１７−２１
化合物２９、３０および３１は、１３がそれぞれＡＳ１、ＡＳ２およびＡＳ３で置き換えられた点を除いて、２８と同様の方法で作成および精製した。各最終産物について６５％の収率が得られた。

化合物３３は、１２を３２で置き換えて１４と同様の方法で作成および精製し、結果として７６％の収率が得られた。

化合物３５は、活性化ＰＥＧ３４が１０の代わりに用いられた点を除き、１４と同様の方法で作成および精製した。最終収率は３０％であった。

生物学的データ
ＰＥＧ−オリゴ複合体のin vitro特性の一部を下記の表に要約する：

ＰＥＧ−オリゴ複合体のＩＣＲマウスにおける薬物動態
一般的手順
１）動物飼育：マウスは飼育ケージ内で、ケージ当たり６個体を飼育した。ケージは"Guide for the Care および Use of Laboratory Animals of the Institute of Laboratory Animal Resource", National Research Councilに従った大きさとした；
２）飼料：マウスは水道水を利用でき、および市販の実験用飼料を自由摂取させた；
３）化合物調製：化合物１３を４．０ｍＬの生理食塩水に溶解し、および化合物１４を４．１ｍＬの生理食塩水に溶解した；
４）投与部位：化合物１３および１４を単回投与（１日目）として尾静脈から投与した。

実験計画
６０個体のマウスを、下記の表５に示す以下の設計に従って群分けし、投与および採血した：

未処理対照血漿の採取のため、３個体の未処理マウスを心臓穿刺によってＥＤＴＡ入り試験管へ採血した。

マウスに１個体当たり１００μＬの天然の化合物１３および１４を静脈注射した。０．０９％Ａｖｅｒｔｉｎを用いて鎮静後、マウスは心臓穿刺によって〜１０００μＬ採血し死亡させた。血液はＥＤＴＡ入りバイアルに採取した。血液の遠心分離後に血漿を回収し、および直ちにドライアイス上で−８０℃にて凍結させた。

臨床検査：
マウスは被験物質の輸液後に１日１回、死亡および処置への反応の徴候に関して目視検査した。すべての死亡および臨床徴候を記録した。体重は注射当日だけ先に測定した。

化合物２８および３３についての薬物動態試験を同様の方法で実施した。

実験結果
薬物動態結果を下記の表６に要約する：

実施例２２−２５
アンチセンスＰＥＧ複合体のin vitro活性の確認
Ｂｃｌ−２タンパク質は前立腺癌細胞において顕著な抗アポトーシス活性を有することが示されている。前立腺癌細胞におけるｂｃｌ−２タンパク質のダウンレギュレーションは細胞死によって確認され、およびｂｃｌ−２アンチセンスＰＥＧ複合体による細胞死の誘導を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内送達の成功を確認した。

実施例２２−２５についての材料および方法
試験した化合物を下記の表７に列挙する：

これら化合物は上記の通り調製した。

細胞培養
マイコプラズマフリーＰＣ３細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手し、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（「ＲＰＭＩ」）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ） に１０％ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）を加えた培地中で培養した。ＦＢＳは、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸）緩衝液、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧナトリウムおよび１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシンを添加した１０％（ｖ／ｖ）熱不活化（５６℃）ＦＢＳを含む。ストック培養は３７℃にて加湿５％ＣＯ_２インキュベーター内で維持した。

試薬
ＦＢＳおよびリポフェクチン（陽イオン性脂質の塩化Ｎ−[１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル]−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムのリポソーム処方）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入した。抗ｂｃｌ−２モノクローナル抗体はＤａｋｏ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）から入手した。抗αチューブリンモノクローナル抗体および臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（「ＭＴＴ」）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、標準的な手順によって合成および精製した。

オリゴヌクレオチドトランスフェクション
細胞は実験の前日に６ウェルプレートにウェル当たり２５ｘ１０^４細胞の密度で播種し、実験当日に６０−７０％集密となるようにした。すべてのトランスフェクションはＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中で、ＦＢＳおよび抗生物質の非存在下で取扱説明書に従って実施した。適当な量の試薬を１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈し、リポフェクチンおよびオリゴヌクレオチドの終濃度を与えるようにした。溶液は穏やかに混合し、および室温にて３０分間予備インキュベートして複合体を形成させた。次いで、８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを加え、溶液を混合し、およびＯｐｔｉ−ＭＥＭで予め洗浄した細胞に重層した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中のオリゴヌクレオチド／リポフェクチン複合体のためのインキュベート時間は２４時間であって、次いで、１０％ＦＢＳを含む完全培地中でインキュベートした。細胞溶解およびタンパク質単離の前の総インキュベート時間は通常は３７℃にて７２時間であった。

ウェスタンブロット分析
オリゴヌクレオチド−脂質複合体で処理した細胞をＰＢＳで洗浄し、および次いで溶解緩衝液[５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ ７．４、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５０μｇ／ｍｌ Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、１５μｇ／ｍｌアプロチニン、ロイペプチン、キモスタチン、ペプスタチンＡ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＮａＦ]で４℃にて１時間抽出した。細胞残渣を１４０００ｇで２０分間４℃にての遠心分離によって除去した。タンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）を用いて測定した。２５−４０μｇのタンパク質を含む、細胞抽出物の部分標本をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、および次いでＨｙｂｏｎｄ ＥＣＬ濾紙（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）へ転写し、および濾紙を、室温にて１−２時間、５％ＢＳＡを含み０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中でインキュベートした。濾紙を次いで、抗ｂｃｌ−２抗体の、５％ＢＳＡを含み０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでの１：５００希釈で、４℃にて一夜プロービングした。０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄後、濾紙を１時間室温にて、５％ミルクを含み０．５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ中で１：３，０００希釈のペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共にインキュベートした。洗浄後（３ｘ１０分間）、電気化学発光（「ＥＣＬ」）を取扱説明書に従って実施した。

細胞増殖の測定
細胞生存に及ぼすＰＥＧ複合体の作用をＭＴＴ測定法によって測定した。要約すると、１５−２０ｘ１０^４細胞を６ウェルプレートに播種し、および一夜付着させた。細胞を次いで適当な濃度の、リポフェクチンと複合体化させたオリゴヌクレオチドを用いて２４時間３７℃にて処理し、次いで１０％ＦＢＳを含む完全培地（１００μｌ）中でインキュベートした。細胞生存は毎日測定した。１０μｌの５ｍｇ／ｍｌ ＭＴＴを含むＰＢＳを各ウェルに加え、続いて４時間３７℃にてインキュベートした。その後、１００μｌの１０％ ＳＤＳ含有０．０４ Ｍ ＨＣｌを各ウェルに加え、次いで一夜３７℃にてインキュベートしてホルマザン結晶を溶解する。吸光度を５７０ｎｍにてＢｅｎｃｈｍａｒｋ ｐｌｕｓマイクロプレート分光光度計（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。実験は６連で実施し、およびデータは平均±Ｓ．Ｄ．で示す。

細胞内ＲＯＳレベルの定量
２'，７'−ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸（Ｈ_２ＤＣＦ−ＤＡ）およびジヒドロエチジウム（ＨＥ）を用いて活性酸素種（「ＲＯＳ」）およびスーパーオキシドレベルを測定した。両方の色素は非蛍光性であり、および自由に細胞中へ拡散し得る。ＨＥがエチジウム（Ｅ）へ酸化される際、それは細胞ＤＮＡに挿入され、さらに蛍光を生じる。Ｈ_２ＤＣＦ−ＤＡの酸化は２'−７'ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）を生じ、これもまた蛍光を発し、両方がフローサイトメトリーによって検出され得る。細胞はトリプシン処理によって採取し、ＰＢＳで洗浄し、さらに５０μＭ Ｈ_２ＤＣＦ−ＤＡまたは５０μＭ ＨＥを用いてフェノールレッドフリーＤＭＥＭ中で２時間３７℃にて染色した。ＤＣＦおよびＥの平均蛍光チャンネル数はフローサイトメトリーによってＦＬ−１およびＦＬ−２チャンネルでそれぞれ分析した。最小１０，０００細胞が各試料について捕獲され、データはＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。棒グラフは対数目盛でプロットした。

実施例２２ Ｂｃｌ−２タンパク質発現の阻害
ｂｃｌ−２発現を標的とする３種類のＰＥＧオリゴヌクレオチド（化合物１４、２８および３３）をＰＣ３細胞にトランスフェクションし、およびそれらがｂｃｌ−２タンパク質発現を阻害する能力を、ウェスタンブロッティングによって評価した。

リポフェクチンの作用
最初に、化合物１４によって誘導されるＰＣ３細胞におけるｂｃｌ−２タンパク質発現の阻害の程度を、リポフェクチンの存在下および非存在下で測定した。ＰＣ３細胞は化合物１４（２００、４００および８００ｎＭにて）を用いてリポフェクチンの存在下または非存在下で２４時間Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で、および次いでさらに６７時間完全培地中で処理した。タンパク質試料（タンパク質３０−４０μｇ／レーン）をウェスタンブロッティングによって、チューブリンを対照タンパク質種として用いて、材料および方法の項に記載の通りに分析した。対照の未処理細胞に対する％阻害は、レーザースキャンデンシトメトリーによって測定した。ウェスタンブロット結果を図１２に示す。

α−チューブリンおよびＰＫＣ−αの発現は変化せず、リポフェクチンが化合物１４のＰＣ−３細胞への浸透を得るために有用であることが確認され、および、ｂｃｌ−２タンパク質発現だけが化合物１４によってダウンレギュレートされたことが確認された。

さらなる研究は、化合物１４および２８は４００ｎＭで最も活性であったことを実証した。ＰＣ３細胞を、４００、８００および１０００ｎＭの化合物１４、化合物２８、および化合物２３とリポフェクチンの複合体を用いて、２４時間Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で、および次いでさらに６７時間完全培地中で処理した。タンパク質試料（タンパク質３０−４０μｇ／／レーン）をウェスタンブロッティングによって、チューブリンを対照タンパク質種として用いて、材料および方法の項に記載の通りに分析した。対照の未処理細胞に対する％阻害は、レーザースキャンデンシトメトリーによって測定した。

化合物１４は８６％ダウンレギュレーションを生じ、および化合物２８は７８％ダウンレギュレーションを生じた。

実施例２３ ＰＥＧオリゴヌクレオチドによるｂｃｌ−２タンパク質発現の用量依存分析
化合物１４および２８のｂｃｌ−２タンパク質発現に対する阻害作用をさらに確認するために、ＰＣ３細胞をリポフェクチンと複合体化した漸増濃度（２５、５０、１００、２００および４００ｎＭ）の化合物１４、化合物２８、および陽性対照として化合物１３を用いて、２４時間Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で、および次いでさらに６７時間完全培地中で処理した。タンパク質試料（タンパク質３０−４０μｇ／／レーン）をウェスタンブロッティングによって、前出の材料および方法の項に記載の通りに分析した。

ｂｃｌ−２タンパク質発現の濃度依存的阻害は、対照と相対的に、化合物１４および２８についてのウェスタンブロットによって観察された。約１−２％阻害が５０ｎＭで観察され、濃度４００ｎＭでは９９％および７５％へ上昇した。化合物２４については、５０ｎＭでは本質的に阻害は観察されなかったが、阻害は濃度４００ｎＭでは７７％へ上昇した。化合物１３を用いたトランスフェクションを陽性対照として用いた。α−チューブリンの発現はどのオリゴヌクレオチドによっても阻害されなかった。

上記の実験を、対照として化合物２４を用いて繰り返した。ＰＣ３細胞をリポフェクチンと複合体化した化合物３５および２４（２５、５０、１００、２００および４００ｎＭ）を用いて、２４時間Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で、および次いでさらに６７時間完全培地中で処理した。タンパク質試料（タンパク質３０−４０μｇ／／レーン）をウェスタンブロッティングによって、チューブリンを対照タンパク質種として用いて、前出の材料および方法の項に記載の通りに分析した。対照の未処理細胞に対する％阻害は、レーザースキャンデンシトメトリーによって測定した。

実施例２４ ＰＣ３細胞増殖に及ぼすＰＥＧオリゴヌクレオチドの作用
ＰＣ３前立腺癌細胞の増殖にin vitroで及ぼす化合物１４および化合物２８の作用もまた試験した。ＰＣ３細胞はオリゴヌクレオチド／リポフェクチン複合体を用いて処理した。図１０に結果を示す（ｎ＝４）。曲線は下記の通りである：
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図１０に示す通り、４００および２００ｎＭでのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物１４のトランスフェクションは細胞増殖を強く阻害し、一方、化合物２８は増殖速度にわずかに影響しただけであった。

実施例２５ ＰＣ３細胞における活性酸素種の産生に及ぼすＰＥＧオリゴヌクレオチドの作用
ＰＣ３細胞における活性酸素種すなわちＲＯＳの産生をフローサイトメトリーで２つの方法によって評価した。第１はヒドロエチジウム（ＨＥ）のエチジウム（Ｅ）への酸化に基づき、これはその後ＤＮＡ中へ挟み込まれ、フローサイトメトリーによって検出可能な蛍光を伴う。第２の方法は、細胞浸透性である２'、７'−ジヒドロジクロロフルオレセイン二酢酸の、蛍光性である２'、７'−ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）への酸化を利用した。ＰＣ３細胞では、化合物１４／リポフェクチン（４００ｎＭ／１５μｇ／ｍｌ）複合体を用いた２４時間のＯｐｔｉ−ＭＥＭ中での処理は、３日後にフローサイトメトリーにより、Ｅ（対照の未処理細胞に対して１．９倍増加）およびＤＣＦ（対照の未処理細胞に対して２倍増加）蛍光の両方によって評価された通りのＲＯＳを生じた。図１１に要約されたデータによって確認される通り、化合物２８は、対照の未処理細胞に対するＲＯＳ産生に全く増加を生じなかった。さらに、ＲＯＳの産生は細胞増殖の速度と非常に密接に関連している；細胞は４００ｎＭの化合物１４を用いた処理後に増殖を停止し、およびこのオリゴヌクレオチドはまた、ＲＯＳの産生の増加を引き起こす（ＤＣＦおよびＨＥ）。

図１は、化合物３および５のＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの調製の方法を図式的に説明する。 図２は、化合物７および９のＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの調製の方法を図式的に説明する。 図３は、化合物１１、１２（配列番号１）および１４（配列番号１）のＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの調製の方法を図式的に説明する。 図４は、化合物１６（配列番号１）のＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの調製の方法を図式的に説明する。 図５は、ＡＳ１（配列番号２）、ＡＳ２（配列番号３）およびＡＳ３（配列番号４）からの、化合物１７（配列番号２）、１８（配列番号３）および１９（配列番号４）のＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの調製の方法を図式的に説明する。 図６は、化合物２１（配列番号１）および２２（配列番号２）のＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの調製の方法を図式的に説明する。 図７は、化合物２４（配列番号１）および２６（配列番号１）のＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの調製の方法を図式的に説明する。 図８は、ＡＳ１（配列番号２）、ＡＳ２（配列番号３）およびＡＳ３（配列番号４）からの、化合物２８（配列番号１）、２９（配列番号２）、３０（配列番号３）および３１（配列番号４）のＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの調製の方法を図式的に説明する。 図９は、化合物３３（配列番号１）および３５（配列番号１）のＰＥＧ化オリゴヌクレオチドの調製の方法を図式的に説明する。 図１０は、ＰＣ３細胞増殖に及ぼす化合物１４および化合物２８の阻害作用を説明する。０．４ｘ１０４細胞を９６ウェルプレートに播種し、化合物１４または化合物２８（４００ｎＭ）とリポフェクチン（１５μｇ／ｍｌ）の複合体のどちらかを用いて２４時間Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で、およびその後、複合体を含まない完全培地中で処理した。細胞の生存を毎日判定し、および５７０ｎｍにて吸光度を測定した。データは平均＋標準偏差として示す；ｎ＝４。 図１１Ａは、細胞浸透性である２'，７'−ジヒドロジクロロフルオレセイン２酢酸の、蛍光性である２'，７'−ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）への酸化を検出することによる、化合物１４および化合物２８オリゴヌクレオチドによるＲＯＳ産生（フローサイトメトリー分析より）の要約を与える。ＰＣ３細胞はオリゴヌクレオチド（４００ｎＭ）／リポフェクチン（１５μｇ／ｍｌ）複合体で２４時間処理し、および３日後に、記載の通り測定した。平均蛍光チャンネルでの増加倍数は未処理細胞に対して正規化した。実験は３連で行い、およびデータは平均±標準偏差（ｎ＝３）として表す。図１１Ｂは、後でＤＮＡに挟み込まれフローサイトメトリーによって検出可能な蛍光を有するエチジウム（Ｅ）への、水素化エチジウム（ＨＥ）の酸化を検出することによる、化合物１４および化合物２８オリゴヌクレオチドによるＲＯＳ産生（フローサイトメトリー分析より）の要約を与える。ＰＣ３細胞はオリゴヌクレオチド（４００ｎＭ）／リポフェクチン（１５μｇ／ｍｌ）複合体で２４時間処理し、および３日後に、記載の通り測定した。平均蛍光チャンネルでの増加倍数は未処理細胞に対して正規化した。実験は３連で行い、およびデータは平均±標準偏差（ｎ＝３）として表す。 図１２は、リポフェクチンの存在下での化合物１４によるｂｃｌ−２タンパク質発現の阻害を確認するウェスタンブロット結果である。ＰＣ３細胞は、化合物１４オリゴヌクレオチド（２００、４００および８００ｎＭ）を用いてリポフェクチンの存在下（＋Ｌｉｐｏ）および非存在下（−Ｌｉｐｏ）で２４時間Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で、および次いでさらに６７時間完全培地中で処理した。タンパク質試料（タンパク質３０−４０μｇ／レーン）は「材料および方法」に記載の通りウェスタンブロッティングによって分析し、チューブリンを対照タンパク質種として用いた。「Ｃ」は対照を示す。

Claims (18)

1. 下記式で示されるオリゴヌクレオチドプロドラッグ。
   X₁-(L₂)_n-(L₁)_o-R₁
   （ここで、Ｒ_１はポリエチレングリコール、またはＣ_１-６アルキルより成る群から選択されるキャッピング基を有するポリエチレングリコールであり；
   Ｌ_１は下記よりなる群から選択される放出可能な連結部分であり：
   

   

   ここで、Ｙ _１’ 、Ｙ _３’ −Ｙ _５’ 、Ｙ _７’ 、Ｙ _１０’ 、Ｙ _１１’ 、Ｙ _１３’ およびＹ _１９’ はＯであり；
   Ｙ _２’ およびＹ _１２’ はＯまたはＮＨであり；
   Ｙ_６’、Ｙ_８’、Ｙ_９’、Ｙ_１４’−Ｙ_１８’およびＹ_２０’−Ｙ_２５’はＯ、ＳまたはＮＲ_９より成る群から独立して選択され；
   Ｒ _６’ 、Ｒ _７’ 、Ｒ _１１’ 、Ｒ _１２’ 、Ｒ _１６’ −Ｒ _２５’ 、Ｒ _３１’ Ｒ _３２’ 、Ｒ _３９’ およびＲ _４０’ は水素であり；
   Ｒ _９’ 、Ｒ _１０’ 、Ｒ _３７’ およびＲ _３８’ はメチルであり；
   Ｒ_９、Ｒ_１３’、Ｒ_２７’−Ｒ_３０’、Ｒ_３３’−Ｒ_３６’およびＲ_４１は、水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、アリール、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から独立して選択され；
   Ａｒは６員環であり；
   Ｌ_５’−Ｌ_１２’は独立して二官能性スペーサーであり；
   ｃ、ｄ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ、ｒ、ｓ、ｃ’、ｄ’、ｇ’およびｈ’は１であり；
   ｖ、ｗ、ｖ'およびｗ'は独立して選択される正の整数であり；
   ａ、ｅ、ｊ、ｔ、ｚ、ａ'、ｚ'およびｅ'は独立して０または正の整数であり；および
   ｂ、ｆ、ｉ、ｕ、ｂ'およびｆ'は独立して０または１であり；
   Ｌ_２は下記よりなる群から選択される２から１０の炭素原子を有する二官能性スペーサー基であり：
   

   

   ここで、Ｑ'はＮＨであり；
   Ｒ_５０'−Ｒ_５３'は、水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、アリール、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から独立して選択され；
   ｑ'およびｒ'はそれぞれ正の整数であり；
   Ｘ_１は、１０から１，０００ヌクレオチドの１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチド残基であり；
   ｎおよびｏは独立して正の整数であり；
   ただし（ｏ＋ｎ）≧２である。）
2. 前記オリゴヌクレオチドが下記のものより成る群から選択されるヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載のプロドラッグ。
   

   

   （ここで、ＭはＯまたはＳであり；
   Ｂ_１およびＢ_２はＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）、Ｕ（ウラシル）および修飾塩基より成る群から独立して選択され；
   Ｒ_１００およびＲ_１０１は、Ｈ、Ｒ'がＨであるＯＲ'、Ｃ_１-６アルキル、置換アルキル、ニトロ、ハロ、およびアリールより成る群から独立して選択される。）
3. ＭがＳであることを特徴とする請求項２記載のプロドラッグ。
4. 前記オリゴヌクレオチド残基がホスホロチオエートオリゴヌクレオチド残基であることを特徴とする請求項１記載のプロドラッグ。
5. 前記オリゴヌクレオチド残基が、アンチセンスオリゴヌクレオチド残基またはオリゴデオキシヌクレオチド残基であることを特徴とする請求項１記載のプロドラッグ。
6. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチド残基またはオリゴデオキシヌクレオチド残基が、ホスホジエステル骨格またはホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチド、ＬＮＡ、ＰＮＡ、トリシクロＤＮＡ、おとりＯＤＮ、ＲＮＡｉ、リボザイム、シュピーゲルマー、およびＣｐＧオリゴマーより成る群から選択されることを特徴とする請求項５記載のプロドラッグ。
7. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１から４より成る群から選択される配列を有し、配列番号４においてｎは適合する任意のヌクレオチドであることを特徴とする請求項５記載のプロドラッグ。
8. Ｒ_１が２，０００Ｄａから１３６，０００Ｄａの重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１記載のプロドラッグ。
9. Ｒ_１が３，０００Ｄａから１００，０００Ｄａの重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１記載のプロドラッグ。
10. Ｒ_１が５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａの重量平均分子量を有することを特徴とする請求項１記載のプロドラッグ。
11. Ｒ_１はＣＨ_３−Ｏ−(ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ)_Ｘ−であり、ｘは１０ないし２３００から選択される正の整数であることを特徴とする請求項１記載のプロドラッグ。
12. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号１の配列から成ることを特徴とする請求項７記載のプロドラッグ。
13. 下記のものより成る群から選択されることを特徴とする、請求項１記載のプロドラッグ。
    

    

    （ｍＰＥＧは、ＣＨ_３−Ｏ−(ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ)_Ｘ−であり、ｘは１０ないし２３００から選択される正の整数である。）
14. プロドラッグを作成する方法であって：
    Ｒ_１−Ｌ_１−脱離基で表される化合物を、Ｈ−Ｌ_２−Ｘ_１で表される化合物と、Ｒ_１−Ｌ_１−Ｌ_２−Ｘ_１の化学式のプロドラッグを生成するのに十分な条件下で反応させる工程を含み、
    Ｒ_１は、ポリエチレングリコール、またはＣ_１-６アルキルより成る群から選択されるキャッピング基を有するポリエチレングリコールであり；
    Ｌ_１は、下記よりなる群から選択される放出可能な連結部分であり：
    

    

    ここで、Ｙ _１’ 、Ｙ _３’ −Ｙ _５’ 、Ｙ _７’ 、Ｙ _１０’ 、Ｙ _１１’ 、Ｙ _１３’ およびＹ _１９’ はＯであり；
    Ｙ _２’ およびＹ _１２’ はＯまたはＮＨであり；
    Ｙ_６’、Ｙ_８’、Ｙ_９’、Ｙ_１４’−Ｙ_１８’およびＹ_２０’−Ｙ_２５’はＯ、ＳまたはＮＲ_９より成る群から独立して選択され；
    Ｒ _６’ 、Ｒ _７’ 、Ｒ _１１’ 、Ｒ _１２’ 、Ｒ _１６’ −Ｒ _２５’ 、Ｒ _３１’ Ｒ _３２’ 、Ｒ _３９’ およびＲ _４０’ は水素であり；
    Ｒ _９’ 、Ｒ _１０’ 、Ｒ _３７’ およびＲ _３８’ はメチルであり；
    Ｒ_９、Ｒ_１３’、Ｒ_２７’−Ｒ_３０’、Ｒ_３３’−Ｒ_３６’およびＲ_４１は、水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、アリール、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から独立して選択され；
    Ａｒは６員環であり；
    Ｌ_５’−Ｌ_１２’は独立して二官能性スペーサーであり；
    ｃ、ｄ、ｇ、ｈ、ｋ、ｌ、ｒ、ｓ、ｃ’、ｄ’、ｇ’およびｈ’は１であり；
    ｖ、ｗ、ｖ'およびｗ'は独立して選択される正の整数であり；
    ａ、ｅ、ｊ、ｔ、ｚ、ａ'、ｚ'およびｅ'は独立して０または正の整数であり；および
    ｂ、ｆ、ｉ、ｕ、ｂ'およびｆ'は独立して０または１であり；
    Ｌ_２は下記よりなる群から選択される２から１０の炭素原子を有する二官能性スペーサー基であり：
    

    

    ここで、Ｑ'はＮＨであり；
    Ｒ_５０'−Ｒ_５３'は、水素、Ｃ_１-６アルキル、Ｃ_３-１２分枝鎖アルキル、Ｃ_３-８シクロアルキル、アリール、Ｃ_１-６ヘテロアルキル、Ｃ_１-６アルコキシ、フェノキシおよびＣ_１-６ヘテロアルコキシより成る群から独立して選択され；さらに
    ｑ'およびｒ'はそれぞれ正の整数であり；
    Ｘ_１は、１０から１，０００ヌクレオチドの１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチド残基であることを特徴とする方法。
15. 請求項１から１３いずれか１項記載のプロドラッグを含む医薬組成物。
16. 請求項１から１３いずれか１項記載のプロドラッグを含む、哺乳類において癌を治療するための組成物。
17. Ｘ_１がアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１６記載の組成物。
18. 第２の抗癌剤と組み合わせて投与されることを特徴とする請求項１６または１７記載の組成物。

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