JP5144957B2 - 多分岐シクロデキストリン化合物、その製造方法、および標的指向性薬物送達システム用の薬物送達剤 - Google Patents

Description

本発明は、標的指向性薬物送達システム（ＴＤＤＳ）用の薬物送達剤として用いられる多分岐シクロデキストリン化合物、及びその製造方法に関し、詳しくは、シクロデキストリンを構成するグルコピラノースの６位の第１級水酸基が標的タンパク質に認識される基で置換された多分岐シクロデキストリン化合物、煩雑な工程を要することがない前記多分岐シクロデキストリン化合物の製造方法、及び前記多分岐シクロデキストリン化合物からなる薬物送達剤に関する。

下記式で表されるβ−シクロデキストリンに代表されるシクロデキストリン（以下、単に「ＣＤ」ということもある。）は薬物包接能を有することから薬物送達システムに広く用いられている。

ＣＤを構成するグルコピラノースの６位には、第１級水酸基が存在し、例えば、ＣＤを構成するグルコピラノースが６個の場合には、ＣＤ中６個の第１級水酸基が存在する。下記一般式ａで表されるような、ＣＤ中に複数存在する前記第１級水酸基を、それぞれ、糖鎖を結合してなる糖鎖アームで置換したＣＤ化合物（以下、「多分岐ＣＤ化合物」という。）の製造が試みられている。

一般式ａ中置換基Ａは糖鎖アームを表す。
しかし、従来、ＣＤ中に複数存在する前記第１級水酸基全て（例えば、β−ＣＤであれば７つ全て）が糖鎖アームで置換された多分岐ＣＤ化合物は、製造中間体の単離の困難性、立体障害等により製造が困難であった。また、前記第１級水酸基全てに糖鎖アームが置換されることなく、中間体の反応性置換基が残存したままの不完全に置換された多分岐ＣＤ化合物は毒性を有するおそれがあった。
以前、卵白オバルミンから分離・精製したマンノース含有天然糖鎖アームをβ−ＣＤに結合させることを行った（例えば、非特許文献１参照。）。上記得られた多分岐ＣＤ化合物は、医薬ともレクチンとも非常に高い会合能、いわゆる二重認識能を有しているが、マンノース含有天然糖鎖の分離精製が非常に困難であるため、大量合成に向いていなかった。天然糖鎖をミミックし、レクチン認識に重要ないくつかの単糖部分だけを残して、大量合成に適するように設計したスペーサーアームの構築が望まれていた。
特に、マンノース又はガラクトース含有スペーサーアームの構築について、工程が煩雑ではない大量合成に適した製造方法が望まれていた（例えば、特許文献１、非特許文献２及び３参照。）。また、従来の製造方法では、多分岐ＣＤ化合物をアセチル基などの保護基を使用することにより製造しているので工程が煩雑であった。
さらに、従来は、製造されたＣＤ化合物の薬物送達剤としての評価は、動物実験、臨床試験のプロセスを経て行われていたが、薬物および標的タンパクとの会合定数を求めることにより優れた薬物送達剤を探査する方法が望まれていた。
ＷＯ２００４／０８５４８７Ａ１公報 服部憲治郎および稲津敏行、「糖鎖クラスターシクロデキストリンの合成及びレクチンタンパクと医薬品に対する二重認識について」、有機合成化学協会誌（２００１）５９巻７４２頁〜７５４頁。 Ｈ．Ａｂｅ，Ａ．Ｋｅｎｍｏｋｕ，Ｎ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｋ．Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｊ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｐｈｅｎｏｍ．Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．５２，３９−４７(２００２) Ｋ．Ｈａｔｔｏｒｉ，Ａ．Ｋｅｎｍｏｋｕ，Ｔ．Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｉｋｅｄａ，Ｍ．Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ．Ｉｎａｚｕ，Ｊ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｐｈｅｎｏｍ．Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６，９−１６（２００６）

本発明の目的は、上記のような問題点を解消するため、ＣＤを構成するグルコピラノースの６位の第１級水酸基が標的タンパク質に認識される基で置換された多分岐ＣＤ化合物、煩雑な操作を要することなく、大量製造に適した前記多分岐ＣＤ化合物の製造方法、及び前記多分岐シクロデキストリン化合物からなる薬物送達剤を提供することにある。

上記課題は下記の手段により達成された。
すなわち、本発明は、
（１） シクロデキストリンを構成するグルコピラノースの６位の第１級水酸基が下記一般式１で表される置換基で置換されてなる多分岐シクロデキストリン化合物、

一般式１中、α−グリコシルは、アノマー位で酸素原子を介してα結合するグリコシル基を表し、Ｃはシクロデキストリンを構成するグルコピラノースの６位炭素原子との結合位置を表す。また、ｎは０〜２の整数を表し、ｎが０の場合、カルボニル炭素原子とアミノ窒素原子を結ぶ単結合を表す、
（２） 前記α−グリコシルが、α−Ｄ−マンノシル、α−Ｄ−ガラクトシル、α−Ｌ−フコシル又はα−Ｄ−グルコシルである、（１）に記載の多分岐シクロデキストリン化合物、
（３） 前記シクロデキストリンが、β−シクロデキストリンである、（１）又は（２）に記載の多分岐シクロデキストリン化合物、
（４） ヘプタキス−６−（１−α−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミド）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス−６−（１−α−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミドヘキサノイルアミド）−β−シクロデキストリン又はヘプタキス−６−（１−α−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミドヘキサノイルアミドヘキサノイルアミド）−β−シクロデキストリンであることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の多分岐シクロデキストリン化合物、
（５） シクロデキストリン環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基に、アミノ基又はアミノオリゴカプロン酸アミド基を有するシクロデキストリンと、１−α−グリコシル−オキシプロピルチオ脂肪酸とを縮合させることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の多分岐シクロデキストリン化合物の製造方法、及び
（６） 前記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の多分岐シクロデキストリン化合物からなる標的指向性薬物送達剤を提供するものである。

本発明の多分岐シクロデキストリン化合物は、それが有するＣＤ部分によって薬物を包接会合することができる一方で、ＣＤを構成するグルコピラノースの６位の第１級水酸基が標的タンパク質と会合する置換基で置換されたことによる糖クラスター効果（例えば、Ｙ．Ｃ．Ｌｅｅ ａｎｄ Ｒ．Ｔ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ，１９９５，２８参照。）により指数関数的に増大された前記標的タンパク質に対する標的指向性を奏する。
本発明の多分岐シクロデキストリン化合物は、標的タンパク質との認識能を高めるために認識部位間の距離を調節するためのアミノカプロン酸からなるスペーサーアームを有することができ、また、前記スペーサーアームは大量製造に適する。
本発明の多分岐シクロデキストリン化合物の製造方法は、アセチル基などの保護基を使用する煩雑な保護・脱保護工程を経ることなく、出発原料の単糖をマンノース、グルコース、ガラクトース、フコース、シアル酸などから選択することにより、マンノースおよびグルコースではマクロファージを介した癌、ガラクトースでは肝癌、フコースでは大腸癌、シアル酸ではインフルエンザ等の疾患に対するＴＤＤＳ用の薬物送達剤を製造できる。
本発明の標的指向性薬物送達剤は、前記多分岐ＣＤ化合物からなるので、マクロファージを介した癌、肝癌、大腸癌、インフルエンザ等の疾患に対するＴＤＤＳに好適に用いることができる。

まず、本発明の多分岐シクロデキストリン化合物について説明する。
本発明の多分岐シクロデキストリン化合物は、シクロデキストリン（以下、単に「ＣＤ」ということもある。）を構成するグルコピラノースの６位の第１級水酸基が実質的に全て、下記一般式１で表される置換基で置換されてなる。

一般式１中、α−グリコシルは、アノマー位（１位）で酸素原子を介してα結合するグリコシル基を表し、Ｃはシクロデキストリンを構成するグルコピラノースの６位炭素原子との結合位置を表す。また、ｎは０〜２の整数を表す。
本発明において、前記α−グリコシルが、α−Ｄ−マンノシル、α−Ｄ−ガラクトシル、α−Ｌ−フコシル又はα−Ｄ−グルコシルであることが好ましい。
一般式１中、下記式で表される部分は、後述するようにスペーサーアームとしてのアミノカプロン酸に由来する繰り返しユニットである。

よって、本明細書において、以下、単に、前記式で表される部分を「ｃａｐ」で表すこともある。したがって、前記一般式１は下記のように表すこともできる。

前記一般式１中の、α−グリコシル、Ｃ、及びｎは前述のとおりである。
本明細書において、ｎが２の場合、単にｃａｐ２といい、ｎが１の場合、単にｃａｐ１ということもある。
なお、ｎが０の場合、ｃａｐは式中のカルボニル炭素原子とアミノ窒素原子を結ぶ単結合を表す。
前記ＣＤとしては、β−ＣＤが好ましく、その場合、本発明の多分岐ＣＤ化合物は下記一般式ａで表されることが好ましい。

前記一般式ａ中置換基Ａは、前記一般式１で表される置換基を表す。
本明細書において、前記一般式ａで表される本発明の多分岐ＣＤ化合物のβ−ＣＤ部位は、以下、単に下記一般式ｂで表す。

前記一般式ｂ中、置換基Ａは、前記一般式１で表される置換基を表す。
この場合、本発明の多分岐ＣＤ化合物は下記一般式ｃで表すことができる。

前記一般式ｃ中、α−グリコシル、ｃａｐ及びｎは前述のとおりである。
本発明の多分岐シクロデキストリン化合物としては、ヘプタキス−６−（１−α−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミド）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス−６−（１−α−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミドヘキサノイルアミド）−β−シクロデキストリン又はヘプタキス−６−（１−α−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミドヘキサノイルアミドヘキサノイルアミド）−β−シクロデキストリンであることが好ましい。
本発明の多分岐シクロデキストリン化合物の具体例として下記例示化合物１〜９を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。

次に、本発明に原料として用いられるＣＤについて説明する。
本発明に原料として用いられるＣＤは、シクロデキストリンの基本骨格を有している限り、特に制限はないが、α−ＣＤ、β−ＣＤおよびγ−ＣＤが挙げられる。これらのＣＤは環を構成しているグルコピラノースの数が異なり（α：６個；β：７個；γ：８個）、したがってその空洞径も異なる（α：０．４５ｎｍ；β：０．７０ｎｍ；γ：０．８５ｎｍ）。たとえば、α−ＣＤは、ベンゼン環が充分に入る大きさであり、トリクレン、パークレン等を包接することができる。また、β−ＣＤは、ナフタレン環が入る大きさであり、γ−ＣＤはアントラセンやナフタレン環２個が入る大きさである。したがって、包接すべき薬物の分子サイズを考慮して最適の空洞径を有するＣＤを当業者が適宜選択することができる。
また、薬物の包接能の点からは、糖鎖分岐の数、すなわちＣＤ構成グルコピラノース分子の数が多い方が好ましい。

次に、本発明の多分岐ＣＤ化合物の製造方法について説明する。
本発明の多分岐ＣＤ化合物の製造方法は、
（１）糖を含有する糖アームユニットと、ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基全てに官能基を有するＣＤとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させる、又は
（２）前記糖アームユニットと、ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基全てに、スペーサーアームを有するＣＤとを、縮合剤の存在下または非存在下で反応させることを特徴とする。
前記糖アームユニットは、１個以上の糖ないしは糖鎖を有する。
前記糖アームユニットを構成する糖は、特定の標的タンパク質によって特異的に認識されるものであれば、特に制限されない。糖は、単糖であってもよく、糖が２個以上連結して糖鎖を形成したものであってもよい。前記糖は、未修飾であっても修飾されていてもよい。前記糖ないしは糖鎖は、マンノース、ガラクトース、フコース、グルコース、シアル酸、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミンなどから選択されてなることが好ましい。合成の容易さの観点から、マンノース、ガラクトース、フコース、グルコースまたはシアル酸がより好ましく、マンノース、ガラクトースまたはフコースがさらに好ましい。糖鎖が２個以上の糖を含む場合、それらの糖は同じ種類であっても異なる種類であってもよい。また、糖鎖は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。

入手の容易性および合成の容易性の点から、好ましくは糖１〜６個の糖ないしは糖鎖であり、さらに好ましくは糖１〜４個の糖ないしは糖鎖であり、より好ましくは糖１〜４個の直鎖状の糖ないしは糖鎖であり、特に好ましくは単糖、すなわち、ＴＤＤＳの疾患の目的に合わせて、マンノシル基、ガラクトシル基、グルコシル基およびフコシル基等であることが好ましい。
次に、前記糖アームユニットの構築について説明する。
糖アームユニットは、グリコシドがマンノシドの場合を例にすると下記反応スキームのように構築できる。

糖アームユニットは、酸触媒存在下、アリルアルコールによる糖ないしは糖鎖のオキシプロペン化、炭素数２〜７のメルカプト脂肪酸を用いて光付加反応することにより構築できる。前記メルカプト脂肪酸としては、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸等が好ましい。
具体的には、糖ないしは糖鎖をアリルアルコールに溶解し、酸触媒を加えて窒素気流下９７℃で還流してアリルグリコシドが合成できる。得られたアリルグリコシドに、３−メルカプトプロピオン酸等のメルカプト脂肪酸を光付加反応することにより糖アームユニットを構築できる。

前記アリルグリコシドとメルカプト脂肪酸との反応は、窒素、アルゴン等の不活性気体雰囲気で紫外線を照射することで進行する。
照射する紫外線は２００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲で用いられるが、３４０〜３８０ｎｍが好ましい。照射時間は１〜２０時間が用いられるが、３〜７時間が好ましい。反応スケール、反応装置に応じて適宜変えられる。反応溶媒はＤＭＦ、メタノール、水等が用いられる。
生成物はイオン交換樹脂で生成物を吸着させたのち、アンモニア水で生成物を脱離させて精製できる。吸着に用いるイオン交換樹脂はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｄｏｗｅｘ１−Ｘ８が用いられる。

次に、前記官能基を有するＣＤについて説明する。
本発明において、官能基を有するＣＤは、ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基全てが、官能基で置換されてなることが好ましい。ＣＤへの前記官能基の導入は、任意の方法によって行うことができる。
ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基に官能基を有するＣＤの官能基は、アミノ基、エーテル基、チオエーテル基、カルボキシル基、アジド基、ｐ−トルエンスルホニル基、エポキシド基、不飽和基、チオール基、アセトキシ基、フェノキシ基、およびヨウ素、臭素および塩素のハロゲン基等が挙げられ、アミノ基がより好ましい。

具体例として、ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基全てを、アミノ基で置換したヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（下記式１）（以下、単に「パーアミノ化ＣＤ」ということもある。）は、当業界における任意の方法で、各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基全てをクロロ化（いわゆるパークロロ化）し、パーアジド化した後にパーアミノ化することにより得られる。

次に、前述のＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基全てにスペーサーアームを有するＣＤについて説明する。
前記スペーサーアームを有するＣＤは、前記ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基全てに官能基を有するＣＤに、スペーサーアームとして１又は２以上（好ましくは１又は２）のアミノカプロン酸を縮合反応することにより構築することができる。
前記縮合反応は下記スキームのように表される。

具体的には、メタノール／水の混合溶媒等の反応溶媒中、へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤ（前記式１）に対し、アミノ基がテトラ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で保護されたアミノカプロン酸８〜４０当量を室温（２０℃）で２時間〜１５０時間（好ましくは２時間〜２４時間）縮合反応させた後、任意の脱保護（脱Ｂｏｃ化）反応することが好ましい。縮合剤の選択および反応溶媒の選択は、すべて当業者が適宜行うことができるが、縮合剤としては、後述する４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドが好ましく、反応溶媒としては、トリエチルアミン（ＴＥＡ）あるいはＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）等の塩基性化合物が存在するメタノール／水の混合溶媒が好ましい。
前記縮合反応と脱保護反応とをｎ回繰り返すことにより、ＣＤ環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基全てに、スペーサーアームとしてのアミノカプロン酸をｎ個有するＣＤを構築することができる。後述のようにｎは１又は２であることが好ましい。
以下、ｎ＝１の場合の上記式２で表されるβ−ＣＤは、単に「へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ」ということもあり、ｎ＝２の場合の上記式３で表されるβ−ＣＤは、単に「へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤ」ということもある。
本発明の製造方法において、前記スペーサーアームにより煩雑な操作を要することなく分離精製が困難で入手が困難な天然糖鎖をミミックすることができる。ここで、「天然糖鎖をミミックする」とは、天然糖鎖のうち、レクチン等の標的タンパク質による認識に最も関わる特定の糖だけを前記糖鎖アームユニットに含ませ、前記認識に強く関わらない部分についてはスペーサーアームとしてミミックし、大量合成を可能とすることをいう。
前記スペーサーアームは、天然糖鎖をミミックするのに充分な長さおよび構造を有する観点からｎは１又は２であることが好ましい。前記スペーサーアームは、末端に縮合反応のための官能基を有する。

本発明の製造方法において、前記パーアミノ化ＣＤ（式１）、前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ（式２）又は前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤ（式３）と、上記の糖アームユニットとを一緒にして縮合反応により結合させ、目的の多分岐ＣＤ化合物を製造することができる。
前記縮合反応は、糖アームユニットのグリコシドがマンノシドの場合を例にすると下記スキームのように表される。

具体的には、前記パーアミノ化ＣＤ（式１）、前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ（式２）又は前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤ（式３）に対し、８〜４０当量の糖アームユニット（式４）を反応溶媒に溶解し、トリエチルアミン（ＴＥＡ）あるいはＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）等の塩基性化合物存在下、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドとパーアミノ化ＣＤとの反応を室温（２０℃）で２時間〜１５０時間行うことが好ましく、２時間〜２４時間行うことがより好ましい。
反応溶媒としては、化合物の溶解性に応じて、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、水、メタノール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）等を使用することができる。縮合剤の選択および反応溶媒の選択は、すべて当業者が適宜行うことができる。
上記縮合反応において使用しうる縮合剤としては、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（以下「ＤＭＴ−ＭＭ」という）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下「ＤＣＣ」という）、水溶性カルボジイミド（以下「ＷＳＣ」という）等の当業界で任意の縮合剤が挙げられる。当業者は、選択した官能基や反応溶媒の種類に応じて適切な縮合剤を選択することができる。たとえば、上記縮合反応において糖アームユニットの側鎖の末端の官能基がカルボキシル基であり、ＣＤ上の官能基がアミノ基である場合のように、カルボキシル基とアミノ基とを反応させる場合、前記縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを用いることが効率の点で好ましい。
ＤＭＴ−ＭＭは、カルボン酸と反応して活性エステルを生成し、その後アミンと反応してアミド結合を生成する。反応もエタノール、メタノール、ｉ−プロパノール、水等の様々な溶媒中で進行し、かつ定量的に反応が進行するという報告があり、注目されている（例えば、Ｍ．Ｋｕｎｉｓｈｉｍａ，Ｃ．Ｋａｗａｃｈｉ，Ｊ．Ｍｏｒｉｔａ，Ｋ．Ｔｅｒａｏ，Ｆ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ｓ．Ｔａｎｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５５，１３１５９‐１３１７０(１９９９)参照。）。
たとえば、反応溶媒としてカルボン酸と等しいモル当量のトリエチルアミンを使用し、縮合剤として５倍モル当量のＤＭＴ−ＭＭを使用することができる。
生成物はＤＥＡＥ−Ｓｅｐａｈｄｅｘイオン交換樹脂による未反応物の除去のあと、ＧＰＣクロマトグラムにより生成物を精製・単離することが好ましい。
ＧＰＣに用いるゲルは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＴＯＳＯ−ＰＷ ｇｅｌ、Ｂｉｏ ｇｅｌ（いずれも商品名）などが用いられるが、分離精製能の観点から、Ｂｉｏ ｇｅｌが好ましい。
また、上記縮合反応は、縮合剤の非存在下で行うことができる。たとえば、糖アームユニットに官能基としてチオール基を導入し、ＣＤにヨウ素のようなハロゲン基を導入して、両者をアルカリ雰囲気中で反応させることができる。
製造された目的の多分岐ＣＤ化合物の構造確認は、当業界で任意の方法によって行うことができる。

次に、本発明の標的指向性薬物送達剤について説明する。
本発明の標的指向性薬物送達剤は、前記多分岐シクロデキストリン化合物からなるＴＤＤＳ用の薬物送達剤である。
ここで、標的指向性薬物送達システム（ＴＤＤＳ）とは、薬物の投与形態を工夫することで薬物の体内動態を精密に制御することにより、薬物を標的細胞に選択的かつ局所的に投与することをいう。
本発明の標的指向性薬物送達剤は、前記一般式１中の前記α−グリコシル基が、マンノシル又はグルコシルである多分岐ＣＤ化合物の場合には、マクロファージを介して癌疾患に対して用いられる。
また、前記一般式１中の前記α−グリコシル基がガラクトシルである多分岐ＣＤ化合物の場合には、肝実質細胞表面を標的とすることができ、肝癌疾患に対して用いられる。
また、前記α−グリコシル基がフコシルである多分岐ＣＤ化合物の場合には、大腸表面細胞を標的とすることができ、大腸癌疾患に対して用いられる。また、前記α−グリコシル基がシアル酸基である多分岐ＣＤ化合物の場合には、インフルエンザウイルス疾患に対して用いられる。

次に、薬物および標的タンパクとの会合評価について説明する。
前記多分岐ＣＤ化合物の二重認識能を評価する方法としては、表面プラズモン共鳴法により得られた、前記多分岐ＣＤ化合物の薬物に対する包接会合定数、及び前記多分岐ＣＤ化合物の標的タンパク質に対する認識会合定数からなる二次元プロットを用いてなることが好ましい。
ここで、「二重認識」とは、本発明の多分岐ＣＤ化合物が、その糖鎖部分によって標的タンパク質に会合する一方、ＣＤ部分によって薬物を包接会合することをいう。
前記包接される薬物としては、制癌医薬品ドキソルビシン（ＤＸＲ）等が挙げられる。
標的タンパク質としては、コンカナバリンＡ等のレクチン、細胞表面等に存在するレセプタータンパク質等が挙げられる。
ＤＸＲ等の薬物、またはレクチン等の標的タンパク質を固定化したＳＰＲ光学バイオセンサーを用いて、各会合定数を求め、二次元プロットすることにより、前記標的指向性薬物送達剤として有望な多分岐ＣＤ化合物をスクリーニングできる。
前述の二重認識能を評価する方法において、動物実験や臨床実験を経ずして、医薬品および対応するレクチンタンパクまたは対応する細胞表面のレセプタータンパクとの会合定数を、それぞれ求め、各対数を横軸、縦軸にプロットして二重認識を評価し、右上に上がれば上がるほど、薬剤包接能及び標的タンパク質との会合能いずれにも優れるＴＤＤＳ用の薬物送達剤ということができる。

次に、ＳＰＲ光学バイオセンサーの原理について説明する。
ＳＰＲ光学バイオセンサー（例えば、ＩＡｓｙｓ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法は、生体高分子の分子間相互作用を測定することができる。
本発明の多分岐ＣＤ化合物の、標的タンパク質に対する会合測定、及び薬剤包接会合測定はいずれも、ＳＰＲ法により行うことができる。
具体的には、リガンド（例えば、コンカナバリンＡ）をキュベット上に固定化し、緩衝溶液に溶解させたアナライト（例えば、本発明の多分岐ＣＤ化合物）を前記キュベットに注入する。そして、プリズムに全反射角以下の入射角でレーザーを入射するときに生じるエバネッセント波と表面プラズモン波が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を起こすときの入射角を測定する。６００ｎｍのエバネッセントフィールド内の質量に応じて、ＳＰＲを生じる入射角が変化する。その変化量を観測でき、このときの変化量をレスポンス（Ｒ）という。この入射角が会合した分子の質量に比例する。すなわち、これらの質量変化から会合解離相互作用を観測できる。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

参考例１ へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤ（前記式１）の製造
（１）へプタキス−６−クロロ−β−ＣＤの製造
二口フラスコにβ−ＣＤ３．０２７４ｇ入れ、エタノールにて４回共沸させ脱水後、真空乾燥（４０℃）を２０時間行った。真空乾燥後、フラスコ内をＮ_２置換してから取り出し、β−ＣＤ２．７５ｇ（２．４２×１０^−３ｍｏｌ）を得た。これに、予めＣａＨ_２で脱水したＤＭＦ２３ｍｌを入れて溶解させ、Ｎ_２気流下に置いた。さらに、メタンスルホニルクロライド２．９ｍｌ（３７×１０^−３ｍｏｌ）を穏やかに滴下した。その後、油浴温度８０℃で４時間３０分反応させた。室温まで冷ました後、反応を停止させるためにエタノール５ｍｌを入れて３０分攪拌し、ナトリウムメトキシド２８％メタノール溶液約１２ｍｌで中和させて（ｐＨ７〜８）、１６時間２０分攪拌した。
これをエバポレーターにて濃縮乾固し、ブフナー漏斗に移してメタノールおよび水により生成物を洗浄した。真空乾燥（４０℃）２４時間２０分後、収量２．５８８６ｇ、収率８５％を得た。生成物はＴＬＣおよびレーザーイオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）にて確認した。ＴＬＣは、展開溶媒１−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３、呈色試薬アニスアルデヒドを用い、Ｒ_ｆ値０．８３を示した。

（２）へプタキス−６−アジド−β−ＣＤの製造
ナスフラスコ中、へプタキス−６−クロロ−β−ＣＤ１．２６３０ｇ（９．９９３０×１０^−４ｍｏｌ）をＤＭＡｃ（ジメチルアセトアミド）：水＝６０ｍｌ：８ｍｌで溶解し、アジ化ナトリウム１．４２３２ｇ（２１８．９×１０^−４ｍｏｌ）を加えた。油浴温度１１０℃で２４時間反応後、反応溶液が室温に下がるまで１時間攪拌した。溶液を約７００ｍｌの水にピペットを用いて滴下し、生成物を沈殿化させ、不純物である濾液を除去した。濾物は、ブフナー漏斗に移して水により洗浄した。真空乾燥（４０℃）１３時間後、収量１．１５６２ｇ、収率８８％を得た。生成物はＴＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにて確認した。ＴＬＣは、展開溶媒１−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３、呈色試薬アニスアルデヒドを用い、Ｒｆ値０．７７を示した。

（３）へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤ（前記式１）の製造
ナスフラスコ中、へプタキス−６−アジド−β−ＣＤ１．００１５ｇ（７．６４４６×１０^−４ｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン３．１９６２ｇ（１２１．８６×１０^−４ｍｏｌ）をＤＭＡｃ７３ｍｌで溶解させ、室温にて１時間反応後、２５％アンモニア水３０ｍｌ（４０００×１０^−４ｍｏｌ）を加えて２２時間３０分攪拌した。反応後、エバポレーターにて濃縮し、エタノール５００ｍｌを加えて生成物を沈殿化させ不純物である濾液を除去した。濾物は、ブフナー漏斗に移してエタノールにより洗浄した。真空乾燥（４０℃）１９時間５０分後、収量０．８３２１ｇ、収率９６％を得た。生成物はＴＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにて確認した。ＴＬＣは、展開溶媒１−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３、呈色試薬アニスアルデヒドおよびニンヒドリンを用いた。

参考例２ へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ（前記式２）の製造
へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤ（前記式１）（１．７１ｇ）へアミノカプロン酸を導入するため、アミノ基がＢｏｃ基で保護されたアミノカプロン酸（１０当量，３．５１ｇ）を用いて、メタノール／水混合溶媒（１：１ｖ／ｖ，２０ｍｌ：２０ｍｌ）中でＮＭＭ（１０当量，１．６７ｍｌ）を加えた後、ＤＭＴ−ＭＭ（１０当量，４．２ｇ）を一気に加え、室温で４８時間反応させた。反応後エバポレーターにて濃縮し、純水により生成物を再沈させた。ろ液を除去後、メタノールへ溶解させ、ろ物を乾固してヘプタキス−６−Ｂｏｃ−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤを得た。
へプタキス−６−Ｂｏｃ−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤへ４Ｍ−ＨＣｌ／ジオキサン溶液約４ｍｌを加えて、氷冷下で３時間撹拌し、脱Ｂｏｃ化を行い、へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ（前記式２）を得た。収量２．１７ｇ、収率７４．６％であった。生成物の確認はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： Ｃａｌｃｄ． １９２０．５５［Ｍ］^＋，１９４３．５４［Ｍ＋Ｎａ］^＋，１９５９．６５［Ｍ＋Ｋ］^＋ ；Ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ １９１９．５０，１９５６．８１

参考例３ へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤ（前記式３）の製造
前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ（１．０ｇ）へ更にアミノカプロン酸を導入するためアミノ基がＢｏｃ基で保護されたアミノカプロン酸（２０当量，２．４ｇ)を用いて、メタノール溶媒（１００ｍｌ)中でＮＭＭ（２０当量，１．１５ｍｌ）を加えた後、ＤＭＴ−ＭＭ（２０当量，２．８８ｇ)を一気に加え、室温で４８時間反応させた。反応後エバポレーターにて濃縮し、純水により生成物を再沈させた。ろ液を除去後、メタノールへ溶解させ、ろ物を乾固してヘプタキス−６−Ｂｏｃ−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤを得た。
へプタキス−６−Ｂｏｃ−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤへ４Ｍ−ＨＣｌ／ジオキサン溶液約４ｍｌを加えて、氷冷下で３時間撹拌し、脱Ｂｏｃ化を行い、へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤ（前記式３）を得た。収量１．４６ｇ、収率１０３．４％であった。生成物の確認はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： Ｃａｌｃｄ．２７１２．３［Ｍ］^＋，２７３５．２９［Ｍ＋Ｎａ］^＋，２７５１．４［Ｍ＋Ｋ］^＋ ；Ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ ２７１１．４５，２７３２．７８，２７４８．８０

実施例１ 例示化合物１「ヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルアミド)−β−ＣＤ」の製造
（１）１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロペンの製造
二口フラスコにマンノース１．００７３ｇ（５．５９４２×１０^−３ｍｏｌ）を入れ、エタノールにて４回共沸させ脱水後、真空乾燥（４０℃）を１３９時間１７分行った。真空乾燥後、フラスコ内をＮ_２置換してから取り出し、アリルアルコール１０ｍｌ；１５０×１０^−３ｍｏｌを入れて溶解させ、Ｎ_２気流下に置いた。これに、Ｄｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ８ ０．６５６０ｇを酸触媒として加え、油浴温度１２５℃で２時間還流した。その後、吸引濾過によりＤｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ８を除き、二口フラスコに移して（吸引瓶内の残りを二口フラスコに移す際はメタノールで）濃縮乾固した。さらに、メタノールを加え濃縮乾固という操作を３回行い、凍結乾燥４４時間２４分後、収量１．２６０２ｇ、収率１００％で生成物を得た。生成物はＴＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにて確認した。ＴＬＣは、展開溶媒１−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３、呈色試薬アニスアルデヒドを用い、Ｒｆ値０．７５を示した。

（２）１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸（前記式４）の製造
二口フラスコ中、１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロペン１．２９３８ｇ（５．８７９×１０^−３ｍｏｌ）をメタノール５ｍｌに溶解し、２０分間アルゴン気流下においた。その後、３−メルカプトプロピオン酸０．５ｍｌ（６×１０^−３ｍｏｌ）を加え、アルゴン気流を止めて蓋を付け、撹拌しながら紫外線（波長３６５ｎｍ）照射を５時間行った。
濃縮乾固、凍結乾燥後、精製は弱陰イオン交換樹脂ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘおよび強陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ１−Ｘ８にて行った。
まず、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（３０ｇ）にてバッチ処理１０時間を行い、生成物のカルボン酸基を吸着させ、吸引濾過を行った。さらに、濾液を濃縮乾固して凍結乾燥し、３分割してＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘでカラム処理を行った。その濾液を濃縮乾固して、水１５ｍｌ、Ｄｏｗｅｘ１−Ｘ８ １１．３５ｇを加え１６時間１５分バッチ処理後、吸引濾過した。濾液に約１８ｇのＤｏｗｅｘ１−Ｘ８を加え（ｐＨ４→ｐＨ６．５になるまで）２時間バッチ処理後吸引濾過した。生成物を吸着させたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｄｏｗｅｘ１−Ｘ８をそれぞれ、１Ｍアンモニア水（樹脂の交換容量の５倍以上のモル数を含む量）にて３０分〜１時間バッチ処理し、生成物を脱離、吸引濾過、１Ｍアンモニア水で洗浄。この操作を３回〜６回行い、濾液を濃縮した。混入した樹脂を再度濾別して凍結乾燥した。収量１．６７４４ｇ、収率８７％を得た。
生成物はＴＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＮＭＲにて確認した。ＴＬＣは、展開溶媒１−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３、呈色試薬アニスアルデヒドおよびブロモクレゾールグリーンを用い、Ｒｆ値０．４７を示した。

（３）例示化合物１「ヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルアミド)−β−ＣＤ」の製造
へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤ（前記式１）４４．３ｇと、前記１−α−Ｄ−マンノシル‐オキシプロピルチオエチルカルボン酸（前記式４）５９１ｍｇ（へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤに対し４０当量）を水２ｍｌ、メタノール２ｍｌ（１：１）で溶解し、縮合剤であるＤＭＴ−ＭＭを５１０．２ｇ（へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤに対し４０当量）加え、常温で２４時間攪拌し反応させた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで生成物の確認後、１０倍量のアセトンに溶液をパスツールピペットを用いて、少量ずつ加えていき、生成物を析出させた。
一晩おき、アセトンを取り除いた後固体を水で溶解し、サンプル瓶に移し、凍結乾燥した。
この粗生成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５にてカラム精製し、ヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルアミド)−β−ＣＤ（前記例示化合物１）を収量２９．２ｇ、収率２３％で白色の固体を得た。
確認は、^１Ｈ ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＴＬＣにて行った。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ ＭＨｚ，重水、８０℃）δ（ｐｐｍ）：２．２８（１４H，ｓ） ２．９８（１４Ｈ，ｓ） ３．０４（１４Ｈ，ｓ） ３．２２（１４Ｈ，ｓ） ５．２３（７Ｈ，ｓ） ５．４８（７Ｈ，ｓ）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： Ｃａｌｃｄ． ３３０９．５２［Ｍ＋Ｎａ］^＋、３３２５．６３［Ｍ＋Ｋ］^＋ ；Ｆｏｕｎｄ ３３０９．２４［Ｍ＋Ｎａ］^＋、３３２４．８９［Ｍ＋Ｋ］^＋
ＴＬＣ Ｒｆ値：０．７７ 展開溶媒：１−ブタノール：水：ＤＭＦ：エタノール：酢酸＝１０：１０：３：１：１ 呈色溶液：アニスアルデヒド

実施例２ 例示化合物２「ヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ１）−β−ＣＤ」の製造
前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ５．１ｇと、前記１−α−Ｄ−マンノシル‐オキシプロピルチオエチルカルボン酸（前記式４）５９．８ｇ（前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤに対し３０当量）をメタノール３ｍｌで溶解し、脱塩剤ＮＭＭ２０．０μｌ（前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤに対し３０当量）を加えた後、縮合剤ＤＭＴ−ＭＭを４９．５ｇ（前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤに対し３０当量）加え、油浴温度３０℃で２４時間攪拌し反応させた。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで生成物の確認後、１０倍量のアセトンに溶液をパスツールピペットを用いて、少量ずつ加えていき、生成物を析出させた。
一晩おき、アセトンを取り除いた後固体を水で溶解させ、サンプル瓶に移し、凍結乾燥した。
粗生成物を、Ｂｉｏ Ｇｅｌ Ｐ−４でカラム精製し、収量２．９７ｇ、収率１３％で無色で透明なアメ状のヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ１）−β−ＣＤ（例示化合物２）を得た。
確認は、^１Ｈ ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、および ＴＬＣにて行った。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水、７０℃）δ（ｐｐｍ）：１．５９〜１．６５ （１４Ｈ，ｍ） １．７８〜１．８５（１４Ｈ，ｍ） １．８５〜１．９１（１４Ｈ，ｍ） ２．１７〜２．２２（１４Ｈ，ｍ） ２．５４〜２．５８（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．２５Ｈｚ） ２．８０〜２．８３（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ） ２．９４〜２．９７（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ） ３．０９〜３．１２（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８５Ｈｚ） ３．４７〜３．５０（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５５Ｈｚ） ５．１６（７Ｈ，ｓ） ５．３５（７Ｈ，ｓ）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：Ｃａｌｃｄ． ４１０２．０７［Ｍ＋Ｎａ］^＋ ；Ｆｏｕｎｄ ４１０１．４３［Ｍ＋Ｎａ］^＋
ＴＬＣ Ｒｆ値：０．８８ 展開溶媒：１‐ブタノール：ＤＭＦ：水＝１：１：１
呈色溶液：アニスアルデヒド

実施例３ 例示化合物３「ヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ２）−β−ＣＤ」の製造
メタノール６ｍｌ中、脱塩酸剤ＮＭＭ５３μｌ存在下で、へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤ４３．２ｍｇを１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸（前記式４）１６４．６ｍｇとＤＭＴ−ＭＭ１４０．５ｍｇにより室温で８時間反応させた。アセトンにて再沈、吸引濾過した。アセトン洗浄し、メタノールで濾紙中の生成物を溶かし出して濃縮乾固した。凍結乾燥後、精製は、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−４（φ３ｃｍ×６４．５ｃｍ、溶出速度０．０６ｍｌ／分、ｓａｍｐｌｅ ｓｉｚｅ ３４ｍｇ／ｍｌ（水））を用いて、ＧＰＣにより行い、収量２２．８ｍｇ、収率２９％でヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ２）−β−ＣＤ（例示化合物３）を得た。また、ＴＬＣ Ｒｆ値：０．７８ 展開溶媒：１‐ブタノール：ＤＭＦ：水＝１：１：１ 呈色溶液：アニスアルデヒド)、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：（［Ｍ＋Ｎａ］^＋；Ｃａｌｃｄ．４８９３．７２，Ｆｏｕｎｄ４８９６．１１，［Ｍ＋Ｋ］^＋；Ｃａｌｃｄ．４９０９．８３，Ｆｏｕｎｄ ４９１２．２１）、¹Ｈ ＮＭＲにて生成物を確認した。
^１Ｈ ＮＭＲ：（５００ＭＨｚ，重水、７０℃）δ（ｐｐｍ）：１．６０〜１．６６ （２８Ｈ，ｍ） １．７８〜１．８５（２８Ｈ，ｍ） １．８５〜１．９１（２８Ｈ，ｍ） ２．１５〜２．２１（１４Ｈ，ｍ） ２．５０〜２．５３（２８Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ） ２．８０〜２．８２（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４３Ｈｚ） ２．９４〜２．９６（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７０Ｈｚ） ３．０８〜３．１１（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７０Ｈｚ） ３．４７〜３．５０（２８Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０３Ｈｚ） ５．１５（７Ｈ，ｓ） ５．３５（７Ｈ，ｓ）

実施例４ 例示化合物４「ヘプタキス−６−(１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルアミド)−β−ＣＤ」の製造
実施例１において前述した１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸（前記式４）の製造と同様な手順により１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸を製造した。
Ｃａｌｃｄ： ３３３．３５［Ｍ＋Ｎａ］^＋、３４９．４６［Ｍ＋Ｋ］^＋；Ｆｏｕｎｄ：３３２．２１［Ｍ＋Ｎａ］^＋、３４８．２０［Ｍ＋Ｋ］^＋
次に、前記１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸と、前記へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤを縮合反応させた、新規化合物ヘプタキス−６−(１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルアミド)−β−ＣＤ（例示化合物４）の製造を行った。
前記１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸８１２．２ｍｇ、２．６６×１０^−３ｍｏｌ（３０当量）と、前記へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤ １０２．０ｍｇ、８．８６×１０^−５ｍｏｌを三角フラスコに入れ、メタノール２．０ｍｌ、水２．０ｍｌで溶解した。次に縮合剤としてＤＭＴ−ＭＭを７３６．９ｍｇ加えて溶解させ、室温で約２４時間攪拌し、反応させた。
その後、反応溶液にアセトンを加え沈殿化させ、凍結乾燥を行った。反応物を２８６．４ｍｇを得た。精製はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５によるＧＰＣで行った。
生成物はＴＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、^１Ｈ ＮＭＲにて確認を行った。
ＴＬＣの展開溶媒は、１−ブタノール：水：ＤＭＦ：メタノール：酢酸＝１０：１０：３：１：１、呈色試薬はアニスアルデヒドを用いて、Ｒｆ値０．６５の単一スポットを得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： Ｃａｌｃｄ．：３１９７．５３［Ｍ＋Ｎａ］^＋、３２１３．６３［Ｍ＋Ｋ］^＋；Ｆｏｕｎｄ：３１９７．６８［Ｍ＋Ｎａ］^＋、３２１３．６３［Ｍ＋Ｋ］^＋
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水、２５℃）δ（ｐｐｍ）：１．１０〜１．１３（２１Ｈ，ｄ） １．３５（１４Ｈ，ｓ） ２．４３（１４Ｈ，ｓ） ２．５０（１４Ｈ，ｓ） ２．７０（１４Ｈ，ｓ） ４．７１（７Ｈ，ｓ） ４．９８（７Ｈ，ｓ）

実施例５ 例示化合物５「へプタキス−６−（１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ１）−β−ＣＤ」の製造
参考例２で製造したヘプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ（前記式２）に前記１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸を縮合反応させ、新規化合物ヘプタキス−６−（１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ１）−β−ＣＤ（例示化合物５）の製造を行った。三角フラスコにヘプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ（０．１ｇ）と前記１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸（３０当量，０．４９ｇ)を加え、メタノール（５０ｍｌ)で溶解させた後、ＮＭＭ（３０当量，１７５μｌ)、ＤＭＴ−ＭＭ（３０当量，０．４４ｇ）を一気に加え、２４時間反応させた。そして、アセトン再沈、吸引ろ過、凍結乾燥後、へプタキス−６−（１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ１）−β−ＣＤ（例示化合物５）を得た。粗収量０．２１１ｇ、粗収率１０１．３５％であった。その後Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５およびＢｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ４によるカラムクロマトグラフィーによって精製を行った。精製収量９．４ｍｇ、精製収率２．１％であった。生成物の確認はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ及びＴＬＣ、^１Ｈ ＮＭＲを用いた。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水、７０℃）δ（ｐｐｍ）：１．５１〜１．６３（１４Ｈ，ｍ） １．８０〜１．８３（１４Ｈ，ｍ） １．８８〜１．９１（１４Ｈ，ｍ） ２．１９〜２．２０（１４Ｈ，ｍ） ２．５３〜２．５５（１４Ｈ，ｍ） ２．８０〜２．８３（１４Ｈ，ｔ） ２．９５〜２．９８（１４Ｈ，ｔ） ３．０９〜３．１２（１４Ｈ，ｔ） ３．４８〜３．５０（１４Ｈ，ｍ） ５．１６〜５．１７（７Ｈ，ｄ） ５．３５〜５．３４（７Ｈ，ｄ）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： Ｃａｌｃｄ．３９６６．６３［Ｍ］^＋，３９８９．９６［Ｍ＋Ｎａ］^＋，４００６．０６［Ｍ＋Ｋ］^＋ Ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ３９９１．２９，４００７．９０
ＴＬＣ： Ｒｆ値０．８６ 展開溶媒１−ブタノール：ＤＭＦ：水＝１：１：１ 呈色溶液：アニスアルデヒド

実施例６ 例示化合物６「へプタキス−６−（１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ２）−β−ＣＤ」の製造
参考例３で製造したヘプタキス−６−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤ（前記式３）に糖鎖ユニットである前記１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸を縮合反応させ、新規化合物ヘプタキス−６−（１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ２）−β−ＣＤ（例示化合物６）の製造を行った。三角フラスコにヘプタキス−６−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤ（前記式３）（３０当量，７８．１ｍｇ）と前記１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸（３０当量，０．２７ｇ）を加え、メタノール（２０ｍｌ）で溶解させた後、ＮＭＭ（３０当量，９６μｌ）、ＤＭＴ−ＭＭ（３０当量，０．２４ｇ）を一気に加え、２４時間反応させた。そして、アセトン再沈、吸引ろ過、凍結乾燥後、ヘプタキス−６−（１−α−Ｌ−フコシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ２）−β−ＣＤを得た。粗収量７６．９ｍｇ、粗収率５６．１２％であった。その後Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５によるカラムクロマトグラフィーによって精製を行った。精製収量７．６ｍｇ、精製収率１２％であった。生成物の確認はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳおよびＴＬＣ、^１Ｈ ＮＭＲを用いた。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水、７０℃）δ（ｐｐｍ）：１．０６〜１．１１（２８Ｈ，ｍ） １．１６〜１．１９（２８Ｈ，ｍ） １．３３〜１．４３（２８Ｈ，ｍ） １．４４〜１．４５（１４Ｈ，ｍ） ２．０４〜２．０７（２８Ｈ，ｔ） ２．３４〜２．３７（１４Ｈ，ｔ） ２．５０〜２．５３（１４Ｈ，ｔ） ２．６３〜２．６５（１４Ｈ，ｔ） ３．０１〜３．０４（２８Ｈ，ｔ） ４．７１（５Ｈ，ｄ） ４．８０（２Ｈ，ｄ） ４．８８（７Ｈ，ｓ）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： Ｃａｌｃｄ．４７８１．７３［Ｍ＋Ｎａ］^＋，４７９７．８４［Ｍ＋Ｋ］^＋ Ｆｏｕｎｄ ｍ／ｚ ４７８５．０３，４８０１．６２
ＴＬＣ： Ｒｆ値０．８１ 展開溶媒１−ブタノール：ＤＭＦ：水＝１：１：１ 呈色溶液：アニスアルデヒド

実施例７ 例示化合物７「ヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルアミド)−β−ＣＤ」の製造
実施例１において前述した１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸（前記式４）の製造と同様な手順により１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸を製造した。
Ｃａｌｃｄ．：３４９．３５［Ｍ＋Ｎａ］^＋、３６５．４６［Ｍ＋Ｋ］^＋；Ｆｏｕｎｄ：３４９．０２，３６５．００
次に、１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸(１．５９ｇ)、へプタキス−６−アミノ−β−ＣＤ（前記式１）（０．１０５ｇ）、ＤＭＴ−ＭＭ（１．２３ｇ）をメタノール中室温で４４時間撹拌し、アセトンによる再沈殿後、ＧＰＣにより精製を施しヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルアミド)−β−ＣＤを収率０．０８％で得た。生成物の確認はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ及び、ＴＬＣによって行った。（展開溶媒 １−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３，呈色試薬 アニスアルデヒド，Ｒｆ値０．０６）
ＧＰＣ条件：φ３ｃｍ×１１９ｃｍ、溶出速度０．２０／分、濃度１０．６ｍｇ／ｍｌ（水）
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：Ｃａｌｃｄ．：３３０９．５２［Ｍ＋Ｎａ］^＋、Ｆｏｕｎｄ：３３０９．８２［Ｍ＋Ｎａ］^＋

実施例８ 例示化合物８「ヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ１)−β−ＣＤ」の製造
１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸（１８４ｍｇ）、前記へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ１−β−ＣＤ（３７ｍｇ）、ＤＭＴ−ＭＭ（１５５ｍｇ）、ＮＭＭ（６２μｌ）をメタノール中室温で３時間撹拌し、アセトンによる再沈殿後、ＧＰＣにより精製を施しヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ１)−β−ＣＤ（例示化合物８）を収率２５％で得た。生成物の確認はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＴＬＣ及び、^１Ｈ ＮＭＲによって行った。
ＴＬＣ： (展開溶媒 1−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３、呈色試薬 アニスアルデヒド，Ｒｆ値０．０６)。
ＧＰＣ条件：φ３ｃｍ×６３ｃｍ、溶出速度０．１０／分
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： Ｃａｌｃｄ．：４１０１．６２［Ｍ＋Ｎａ］^＋、４１１７．７２［Ｍ＋Ｋ］^＋、Ｆｏｕｎｄ：４１０３．６４［Ｍ＋Ｎａ］^＋、４１１８．９６［Ｍ＋Ｋ］^＋
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水、８０℃）δ（ｐｐｍ）： １．７１〜１．７２（１４Ｈ，ｍ） １．８９〜１．９２（１４Ｈ，ｍ） １．９７〜２．００（１４Ｈ，ｍ） ２．２６〜２．２９（１４Ｈ，ｍ） ２．６２〜２．６４（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．５５Ｈｚ） ２．８９〜２．９２（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．００Ｈｚ） ３．０３〜３．０６（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５０Ｈｚ） ３．１８〜３．２１（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０５Ｈｚ） ３．５７〜３．５８（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．９０Ｈｚ） ５．３７（７Ｈ，ｓ） ５．４３〜５．４４（７Ｈ，ｓ）

実施例９ 例示化合物９「ヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ２)−β−ＣＤ」の製造
１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルカルボン酸（１８３ｍｇ)、へプタキス−６−アミノ−ｃａｐ２−β−ＣＤ（５１ｍｇ）、ＤＭＴ−ＭＭ（１５６ｍｇ）、ＮＭＭ（６０μｌ）をメタノール中室温で３時間撹拌し、アセトンによる再沈殿後、ＧＰＣにより精製を施しヘプタキス−６−(１−α−Ｄ−ガラクトシル−オキシプロピルチオエチルアミド−ｃａｐ２)−β−ＣＤを収率４％で得た。生成物の確認はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＴＬＣ及び、^１Ｈ ＮＭＲによって行った。
ＴＬＣ：（展開溶媒 １−ブタノール：エタノール：水＝５：４：３、呈色試薬 アニスアルデヒド，Ｒｆ値０．０６）。
ＧＰＣ条件：φ３ｃｍ×６３ｃｍ、溶出速度０．０８／分
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ： Ｃａｌｃｄ．：４８９３．９１［Ｍ＋Ｎａ］^＋、４９１０．０２［Ｍ＋Ｋ］^＋、Ｆｏｕｎｄ：４８９７．９８［Ｍ＋Ｎａ］^＋、４９１４．８２［Ｍ＋Ｋ］^＋
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，重水、８０℃）δ（ｐｐｍ）：１．７０〜１．７４（２８Ｈ，ｍ） １．８７〜１．９２（２８Ｈ，ｍ） １．９７〜１．９９（２８Ｈ，ｍ） ２．２６〜２．２８（１４Ｈ，ｍ） ２．５９〜２．６１（１４Ｈ，ｍ） ２．８８〜２．９１（２８Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．９８Ｈｚ） ３．０２〜３．０５（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４０Ｈｚ） ３．１７〜３．２０（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８８Ｈｚ） ３．５５〜３．５８（１４Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８５Ｈｚ） ５．３７（７Ｈ，ｓ） ５．４３（７Ｈ，ｓ）

実施例１０ 例示化合物１〜３の標的タンパク質（コンカナバリンＡ）及びＤＸＲに対する認識会合能の評価
試験１． コンカナバリンＡに対する認識会合能の測定
＜コンカナバリンＡの固定化＞
固定化に用いた試薬類は下記のようにして得た。
・１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．７）：１０ｍＭリン酸二水素カリウム溶液と１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム溶液をそれぞれ調製し、ｐＨ７．７になるように混合して得た。
・１ｍＭ ＢＳ^３溶液：ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ^３） ２．９ｍｇを上記の１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．７）５ｍｌに溶かして得た。
・１０ｍＭ酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．３）：１０ｍＭ酢酸溶液と１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液をそれぞれ調製し、ｐＨ５．３になるように混合してえた。
・コンカナバリンＡ固定溶液：コンカナバリンＡ２．５ｍｇを上記の１０ｍＭ酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．３）１ｍｌに溶かして得た。
・１Ｍエタノールアミン溶液：エタノールアミン２１０μｌを上記の１０ｍＭ酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．３）５ｍｌに溶かして得た。

前記ＩＡｓｙｓを用いて下記（１）〜（１０）の方法でコンカナバリンＡを固定化した。
各注入量はコンカナバリンＡについては２００μｌを１回、その他の液については２００μｌを３回注入した。
（１）まず、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．７）を０．５〜２時間間隔でＳＰＲ光学バイオセンサーキュベットに何度か加え、レスポンスを安定した。
（２）前記キュベット表面上のアミノシラン基にレクチンタンパクのアミノ基と反応させるためのリンカー剤として、前記１ｍＭ ＢＳ^３溶液を注入し予め反応させ、レスポンスが平衡するまで１５分ほど放置した。
（３）１０mMリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．７）を前記キュベットに注入しレスポンスが安定するまで待った。
（４）前記（２）、（３）をレスポンスが変化しにくくなるまで複数回（例えば、４回）繰り返した。
（５）未反応のアミノシラン基を不活性化させ、ブロッキングする為、無水酢酸‐酢酸溶液（混合体積比１：１）をキュベットに注入した。
（６）洗浄のため、前記１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．７）を注入し、その後１０ｍＭ酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．３）を注入して溶媒置換した。
（７）前記コンカナバリンＡ固定溶液を注入し、反応させ、平衡になるまで放置した。
（８）１０ｍＭ酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．３）を注入して安定するまで待った。
（９）未反応のＢＳ^３末端のコハク酸アミドエステル基を不活性化させ、ブロッキングするため、前記１Ｍエタノールアミン溶液を注入し５分間ほど放置した。
（１０）１０ｍＭ酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．３）を注入して洗浄した。
なお、以上得られたキュベットの保存には、０．１％アジ化ナトリウム水溶液を添加して保存した。
固定化量に対応するレスポンス（Ｒ）が（７）の注入時に測定され、２０００ａｒｃ ｓｅｃであった。

＜固定化率の計算＞
下記のように固定化率を計算した。
ここで、固定化率とは、キュベット表面上の全アミノシラン基に対して固定化された固定化物の個数を百分率として表した値をいう。
用いたアミノシランキュベットでは、レスポンス（Ｒ）６００ａｒｃ ｓｅｃは固定化量１ｎｇ／ｍｍ^２に相当するので、固定化量は、Ｒ／６００［ｎｇ／ｍｍ^２］となる。
前記固定化量を固定化物のモル数に換算し、アボガドロ数を考慮し、さらに、キュベット表面上のアミノシラン基が１００Å^２に１本存在することを考慮すれば、固定化の割合は、
６．０２Ｒ×１０^１４／６００Ｍ［固定化物の個数／１×１０^１４Å^２］／アミノシラン基1本／１００Å^２＝６０２Ｒ／６００Ｍ［固定化物の個数／アミノシラン基１本］
で表され、求める固定化率は、百分率として、６０２Ｒ／６Ｍ［％］で表される。
ここで、Ｒは、固定化のレスポンス［ａｒｃ ｓｅｃ］、Ｍは固定化物の分子量を表す。
ｐＨ５．３において二量体となるコンカナバリンＡの分子量は約５３０００である。したがって、コンカナバリンＡの固定化率は下記のように３．７９％と算出された。
６０２×２０００／６×５３０００＝３．７９ ％

＜コンカナバリンＡに対する前記例示化合物１〜３の会合評価＞
コンカナバリンＡを固定化したキュベットに、１０ｍＭ酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．３；１ｍＭ ＭｎＣｌ_２，１ｍＭ ＣａＣｌ_２，１００ｍＭ ＮａＣｌ含有）に溶解したヘキサキス−６−（１−α−Ｄ−マンノシル−オキシプロピルチオエチルカルボキシアミド）−β−ＣＤ（前記例示化合物１）（１．９×１０^−６Ｍ）を２００μｌ注入したところ、図１に示した飽和曲線が得られた。図１は、前記例示化合物１とコンカナバリンＡとの認識会合を表すＳＰＲ測定結果を示す図である。
測定温度は２５．０℃であり、所要時間はレスポンスが飽和に達するまでの５〜１５分であった。
これにより、コンカナバリンＡに対して前記例示化合物１が会合したことを確認した。

さらに、コンカナバリンＡに対する会合定数を求めるため、１０ｍＭ酢酸緩衝溶液（ｐＨ５．３）中に、０．１×１０^−５〜１．３×１０^−５Ｍの範囲で６点の濃度に変化させた前記例示化合物１を含む溶液２００μＬを、コンカナバリンＡを固定化したキュベットに注入して、ＳＰＲ測定を行った。図２ａに得られた結果を示す。図２ａは、コンカナバリンＡに対する速度論的会合挙動を示す直線プロットである。
図２ａに示した直線プロットから、前記例示化合物１のコンカナバリンＡに対する会合定数は３．６×１０^５Ｍ^−１であった。
例示化合物２、３についても例示化合物１と同様な手法によりコンカナバリンＡに対する会合定数を測定したところ、前記例示化合物２、３のコンカナバリンＡに対する会合定数は、それぞれ、４．１×１０^６Ｍ^−１、１．４×１０^１０Ｍ^−１であった。

試験２． 薬物の包接能の測定
薬物として制癌抗生物質であるドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ；以下「ＤＸＲ」という。）を用い、試験例１と同様の方法で本発明により製造されるＣＤ化合物の包接能を評価した。
１）ＤＸＲの固定化
ＤＸＲの光学バイオセンサーキュベット表面への固定化は、薬物を溶解させる緩衝溶液としてｐＨの異なるものを用いたことを除き、上述したレクチンの固定化と同様の操作方法で行った。
キュベット表面のアミノシラン基にＤＸＲのアミノ基と反応させるためのリンカー剤として、１ｍＭ ＢＳ^３溶液／１０ｍＭリン酸緩衝溶液、ｐＨ６．５を反応させた。これを、光学バイオセンサーのレスポンスが変化しなくなるまで数回繰り返し、無水酢酸−酢酸溶液（混合体積比１：１）を加えることで未反応のアミノシラン基を不活性化させ、ブロッキングした。
ブロッキング後、ｐＨ５．３の１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液に置換し、ＤＸＲ溶液（２ｍｇ ＤＸＲ／１０ｍＭ−酢酸緩衝溶液、ｐＨ５．３）を加え、反応させた。その後、キュベット上のバックグラウンドの影響を考慮し、１Ｍエタノールアミン水溶液、ｐＨ８．５でコハク酸アミドエステル基のブロッキングを行った。

ＤＸＲの固定化率は、前述のコンカナバリンＡの固定化率と同様に算出できる。
ＤＸＲのレスポンスの変化量は１８６．１ａｒｃ ｓｅｃであったので、Ｒ＝６００ａｒｃ ｓｅｃのとき１ｎｇ／ｍｍ^２で１ｎｍ^２あたり１本のアミノシラン基が存在しているものとして、固定化率はアミノシラン基の３２．１％と算出された。
２）測定
上記で作製したＤＸＲ固定化キュベットを用い、試験１と同様にして前記例示化合物１とＤＸＲとの速度論的会合挙動を測定した。但し、前記例示化合物１の濃度は、０．５×１０^−５〜４．０×１０^−５Ｍの範囲であった。図２ｂに得られた結果を示す。図２ｂは、ＤＸＲに対する速度論的会合挙動を示す直線プロットである。
また、同様にして制癌医薬品ＤＸＲを固定化したＳＰＲセンサーの測定で得られた図２ｂに示した直線プロットから、例示化合物１のＤＸＲに対する包接会合定数は１．５×１０^５Ｍ^−１であった。
例示化合物２、３についても例示化合物１と同様な手法によりＤＸＲに対する会合定数を測定したところ、前記例示化合物２、３のＤＸＲに対する会合定数は、それぞれ、１．２×１０^６Ｍ^−１、３．０×１０^１０Ｍ^−１であった。

試験３． 二次元プロットによる例示化合物１〜３の二重認識の評価
前述のように測定された、例示化合物１〜３のコンカナバリンＡに対する認識会合定数及びＤＸＲに対する包接会合定数について、それぞれ対数に変換したものを二次元マップにプロットした。
図３は、例示化合物１〜３のＤＸＲおよびコンカナバリンＡとの会合定数の２次元プロットを示す図である。
図３において、比較例として未修飾のβ−ＣＤ、本発明者らがこれまで製造した下記ＴＤＤＳ用薬物送達剤Ｉ、IIについても同様に、二次元マップ上にプロットした。

図３から、下記のように、修飾ＣＤ化合物の構造と二重認識能の相関が分かる。
図３中、比較例として未修飾のβ−ＣＤ（「III」）は、薬剤に対するｌｏｇ Ｋａは３．５程度であるが、糖を有さないためレクチンに対しては０である。
図３中に示したＩ、IIを結ぶ折れ線は、スペーサーアームが長ければ長いほど、二重認識能に優れることを示している。
図３から明らかなように、本発明の例示化合物１、２及び３は、これまでに得られた他のＴＤＤＳ用薬物送達剤Ｉ、ＩＩに匹敵する高い二重認識能を示し、例示化合物１から２、２から３に行くほど指数関数的に二重認識能が増加し、特に例示化合物３はＴＤＤＳ用薬物送達剤として有望であることが分かった。

実施例１１ 例示化合物４〜６のＡＡＬ及びＤＸＲに対する認識会合能の評価
フコース残基が特異的会合性を示す大腸表面細胞のモデル物質として、大腸表面細胞のレセプターモデルであるＡｌｅｕｒｉａ ａｕｒａｎｔｉａ ｌｅｃｔｉｎ（以下ＡＡＬという。）を用いて、糖鎖認識相互作用を評価した。なお、ＡＡＬはα−Ｌ−フコース含有糖鎖に対し、強く結合することが知られている。
試験１． ＡＡＬに対する認識会合能の測定
コンカナバリンＡ固定溶液の代わりにＡＡＬ固定溶液としてＡＡＬ２．１２ｍｇ／ｍｌ溶液（リン酸緩衝溶液、ｐＨ７．２＋０．０２％ＮａＮ_３）を用いた以外は、実施例１０の＜コンカナバリンＡの固定化＞と同様な手順によりＡＡＬの固定化を行い（固定化率１．８４％）、実施例１０と同様な手順によりＡＡＬに対する会合定数を測定した。
試験２． ＤＸＲの包接能の測定
実施例１０で作製したＤＸＲ固定化キュベットを用いＤＸＲとの速度論的会合挙動を測定した。
図４に試験１及び２で得られた結果を示す。図４ａは、ＡＡＬに対する速度論的会合挙動を示す直線プロットである。図４ｂは、ＤＸＲに対する速度論的会合挙動を示す直線プロットである。
図４ａ及びｂから明らかなように、ＡＡＬ及びＤＸＲとの会合測定の結果、例示化合物４では２．０×１０^８Ｍ^−１、および２．１×１０^８Ｍ^−１となり、例示化合物５では２．８×１０^８Ｍ^−１、および１．５×１０^８Ｍ^−１となり、例示化合物６では３．４×１０^９Ｍ^−１、および１．３×１０^８Ｍ^−１となった。
次に、例示化合物４〜６のＤＸＲおよびＡＡＬとの会合定数の２次元プロットを作成して二重認識を評価した。
図５は、例示化合物４〜６のＤＸＲおよびＡＡＬとの会合定数の２次元プロットを示す図である。
図５から明らかなように、例示化合物４〜６はレクチンに対する会合能は例示化合物４から５、５から６の順に若干の向上したことがわかる。しかし、薬物に対する会合能は同程度であった。
図５中にも示した前記ＴＤＤＳ用薬物送達剤IIと比較すると約１００倍の会合定数という結果になった。これはフコース基が疎水性のメチル基を有しているために、ＤＸＲを包接したときに、イソギンチャク効果（Ｋ．Ｈａｔｔｏｒｉ，Ａ．Ｋｅｎｍｏｋｕ，Ｔ．Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｄ．Ｉｋｅｄａ，Ｍ．Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ．Ｉｎａｚｕ，Ｊ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｐｈｅｎｏｍ．Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６，９−１６（２００６）参照。）が強く作用したためと考えられる。
以上の結果より例示化合物４〜６はＴＤＤＳの送達剤として応用できることがわかった。

実施例１２ 例示化合物７〜９の標的タンパク質（ＰＮＡ）及びＤＸＲに対する認識会合能の評価
肝実質細胞表面に存在する、β−ガラクトース残基へ特異認識を示すアシアロ糖タンパク質レセプターのモデルレクチンであるＰＮＡに対する会合挙動、及び制癌剤ＤＸＲに対する包接会合を評価した。
コンカナバリンＡ固定溶液の代わりにＰＮＡ固定溶液を用いた以外は、実施例１０の＜コンカナバリンＡの固定化＞と同様な手順によりＰＮＡ固定化キュベットを作製した。
さらに、ＰＮＡに対する会合定数を求めるため、各例示化合物７〜９について、様々な濃度に変化させた溶液を、ＰＮＡを固定化したキュベットに注入して、ＳＰＲ測定を行い、ＰＮＡに対する速度論的会合挙動を示す直線プロットを作成した。
同様に、実施例１０で作製したＤＸＲ固定化キュベットを用いＤＸＲとの速度論的会合挙動を示す直線プロットを作成した。
上記手順により得られた、各例示化合物７〜９についてのＰＮＡ及びＤＸＲに対する会合定数を表１に示す。

表１から明らかなように、ガラクトシド−ＣＤ間の距離の増加に伴うレクチン及び薬物への会合能の向上がみられた。また、ガラクトシド−ＣＤ間の距離の増加に伴う会合能の向上は一定の増加率を示し、例示化合物７から８、８から９への会合能の向上はそれぞれ約１０倍であった。このことから、ガラクトシド−ＣＤ間をアミド結合を含むアルキル鎖スペーサーアームで約０．７ｎｍ伸張すると、レクチン及び薬物に対する会合が約１０倍程度向上することが分かる。
また、スペーサーアームの伸長に伴う疎水性度の増加により薬物への会合能が向上したことがわかる。
図６は例示化合物７〜９のＤＸＲおよびＰＮＡとの会合定数の２次元プロットを示す図である。
図６から明らかなように、例示化合物７から８、８から９の順にレクチン及び薬物いずれにも対する会合能が向上していることがわかる。

実施例１３ 本発明の多分岐シクロデキストリン化合物からなる標的指向性薬物送達剤のフローサイトメトリーによる細胞内取り込み試験
血液中に存在する通常の糖タンパク質は側鎖末端部にシアル酸末端、ガラクトシル基と続く複雑なマルチアンテナ型のオリゴ糖鎖構造を有し複雑な階層構造をなす複合体を形成している。それらが古くなり寿命が尽きるとともにアンテナ糖側鎖の最先端に位置するシアル酸が切れ、プレ末端基のガラクトシル基が露出したアシアロ糖タンパク質になる。肝実質細胞表面にはアシアロ糖タンパク質レセプターが存在し、その末端構造の変化を識別しながら取り込み、細胞内で消化する機能を有している。
イン ビトロでのヒト肝癌細胞であるＨｅｐＧ２細胞（アシアロ糖タンパク質レセプター発現細胞）内への例示化合物７の取り込み評価を、フローサイトメトリーによって行った。
すなわち、３５ｍｍディッシュの一定のウェルで２４時間培養したＨｅｐＧ２細胞（２×１０^５細胞数／ウェル）へテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）でＣＤの水酸基と反応させ、チオウレタン結合を形成させて蛍光標識したβ−ＣＤ、例示化合物７をそれぞれ細胞へ４０ｍＭ添加し、ウシ胎仔血清なしの培地で１時間培養した後フローサイトメトリー（商品名ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を行った。洗浄等には１０ｍＭ等張リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。
図７は、細胞内取り込みについて得られた結果を示すフローサイトメトリーによる、蛍光強度に対する細胞数のヒストグラムである。
図７中ａのピークはコントロールとして何も添加しないＨｅｐＧ２細胞のヒストグラムであり、ｂのピークは比較例として無修飾β−ＣＤを添加したＨｅｐＧ２細胞のヒストグラムであり、ｃのピークは本発明の多分岐シクロデキストリン化合物（例示化合物７）を添加したＨｅｐＧ２細胞のヒストグラムである。
無修飾β−ＣＤのピークｂの蛍光強度は何も添加していないコントロールａと大差がない。これに対し、本発明の多分岐シクロデキストリン化合物を添加したピークｃは、蛍光強度が増加している。これにより、ＨｅｐＧ２細胞に本発明の多分岐シクロデキストリン化合物が取り込まれ、その標識であるＴＲＩＴＣによる蛍光に由来して蛍光強度が増加したといえる。
この結果から、本発明の多分岐シクロデキストリン化合物が標的細胞に対し指向的に薬物を送達できることが分かる。

実施例１４ 共焦点レーザー顕微鏡による細胞内挙動の評価
ＨｅｐＧ２細胞に取り込まれた本発明の多分岐シクロデキストリン化合物からなる標的指向性薬物送達剤の細胞内挙動を共焦点レーザー顕微鏡により評価した。
すなわち、３５ｍｍディッシュの一定のウェルで２４時間培養したＨｅｐＧ２細胞（２×１０^５細胞数／ウェル）へＴＲＩＴＣで蛍光標識したβ−ＣＤ、例示化合物７をそれぞれ細胞へ４０ｍＭ添加し、ウシ胎仔血清なしでの培地で１時間培養した後、メタノールにより定着させ共焦点レーザー顕微鏡（商品名ＬＳＭ−４１０；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）により観察を行った。コントロールとして共焦点レーザー微分干渉顕微鏡でも観察を行った。
ＴＲＩＴＣで蛍光標識した無修飾β-ＣＤは全くＨｅｐＧ２細胞に全く取り込まれず、ＨｅｐＧ２細胞内で蛍光が発せられることは観察されなかった。これに対し、本発明の多分岐シクロデキストリン化合物（例示化合物７）からなる標的指向性薬物送達剤はＨｅｐＧ２細胞に取り込まれ、本発明の多分岐シクロデキストリン化合物を標識したＴＲＩＴＣに由来する蛍光がＨｅｐＧ２細胞全体の各器官から発せられていた。
この結果から、本発明の多分岐シクロデキストリン化合物が標的細胞に指向的に薬物を送達できることが分かる。

図１は、本発明の例示化合物１とコンカナバリンＡとの認識会合を表すＳＰＲ測定結果を示す図である。 図２ａは、例示化合物１のコンカナバリンＡに対する速度論的会合挙動を示す直線プロットである。図２ｂは、例示化合物１のＤＸＲに対する速度論的会合挙動を示す直線プロットである。 図３は、例示化合物１〜３のＤＸＲおよびコンカナバリンＡとの会合定数の２次元プロットを示す図である。 図４ａは、例示化合物４のＡＡＬに対する速度論的会合挙動を示す直線プロットである。図４ｂは、例示化合物４のＤＸＲに対する速度論的会合挙動を示す直線プロットである。 図５は、例示化合物４〜６のＤＸＲおよびＡＡＬとの会合定数の２次元プロットを示す図である。 図６は例示化合物７〜９のＤＸＲおよびＰＮＡとの会合定数の２次元プロットを示す図である。 図７は、本発明の多分岐ＣＤ化合物（例示化合物７）からなる標的指向性薬物送達剤の細胞内取り込みを示すフローサイトメトリーによるヒストグラムを示す。

Claims (3)

1. ヘプタキス−６−（１−α−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミド）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス−６−（１−α−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミドヘキサノイルアミド）−β−シクロデキストリン、及びヘプタキス−６−（１−α−グリコシル−オキシプロピルチオエチルアミドヘキサノイルアミドヘキサノイルアミド）−β−シクロデキストリンからなる群より選ばれる、多分岐シクロデキストリン化合物。
2. シクロデキストリン環を構成する各グルコピラノース分子の６位の第１級水酸基に、アミノ基又はアミノオリゴカプロン酸アミド基を有するシクロデキストリンと、１−α−グリコシル−オキシプロピルチオ脂肪酸とを縮合させることを特徴とする、請求項１記載の多分岐シクロデキストリン化合物の製造方法。
3. 請求項１記載の多分岐シクロデキストリン化合物からなる標的指向性薬物送達剤。

Images