JP5117542B2 - 組換え第ｖｉｉｉ因子を高発現させるためのｂｈｋ細胞 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳動物宿主細胞における組換えタンパク質生産の一般分野に関する。具体的に言えば、本発明は、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞でシャペロンタンパク質カルレティキュリンおよびＥｒｐ５７と同時発現させることにより分泌型組換え第ＶＩＩＩ因子を高生産させることに関する。

［相互参照］
本願は、２００３年６月２７提出の米国仮出願第６０／４８３，５０５号の利益を主張するものであり、この仮出願はそのまま本明細書に文献援用される。

［発明の背景］
原核細胞においても真核細胞においても、分子シャペロンタンパク質は、ジスルフィド結合交換反応を触媒し、新規合成タンパク質の正しいフォールディングを支援する。この知見に基づき、これらの品質管理タンパク質に関して多くの研究が行われ、様々な使用法が提案されてきた。例えば、細菌、酵母および昆虫細胞発現系でのｐＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）活性の増大は、タンパク質の溶解性およびフォールディングに有効であり、場合によっては、異種タンパク質の分泌を増加させ得る（１〜７）。さらに他の研究で、分子シャペロン免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ、グルコース調節タンパク質とも称される）およびヒト熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ ７０）が昆虫細胞の発現系における組換えタンパク質の発現に有効であることが示されている（５、８〜１２）。

分子シャペロンは、哺乳動物細胞の系における組換えタンパク質の発現および分泌に関しては同レベルの成功を治めていない。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でのｐＤＩシャペロンの過剰発現は、ＩＬ−１５の分泌レベルに効果がなかったばかりか、腫瘍壊死因子受容体−Ｆｃ融合タンパク質（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）の分泌を減少させ、細胞内への停滞を増加させた（１３）。他の研究は、哺乳動物細胞でのＢｉＰシャペロンの過剰発現が、組換えタンパク質の細胞内停滞を増加させ、分泌を減少させ得ることを示している（１４−１５、および特許文献１参照）。哺乳動物細胞内でのタンパク質プロセシングに関与する調節機構は複雑であり、これらシャペロンタンパク質の多くの協同作用を必要とすると思われる。したがって、特定のシャペロンが特定の組換えタンパク質の生産を増加させるかどうかを予測することはできない。

本分野では相反する教示が存在するために、分泌型組換えタンパク質産物の生産に及ぼすシャペロンタンパク質の効果は分っていないし、評価もされていない。特許文献２は、ウイルス粒子を高生産させる方法を記載しており、真核細胞における組換えタンパク質の収量増加に及ぼすシャペロンの効果を推測しているが、組換えタンパク質の実際の発現は開示していない。しかし、他の研究で、真核細胞株でのシャペロンの過剰発現が組換えタンパク質の収量に効果がなかったり、分泌を減少させたりすることが分った。例えば特許文献１も参照されたい。本分野における相反する教示を考えると、特許文献２に従って当業者がシャペロンを使って真核細胞で組換えタンパク質の生産および分泌を増加させることはできない。先端技術は、特定のシャペロンが本明細書に記載のものなどの細胞培養モデルにおける所与の組換えタンパク質の生産および分泌にどのような効果を及ぼすかを予測する方法を教示してはくれない。したがって、本出願人らは、分泌組換えタンパク質を発現する哺乳動物細胞株を本研究に記載されているシャペロンでトランスフェクションしたとき、得られた効果が分泌型タンパク質生産量の全般的な増加であることを発見して驚いた。

米国特許第４，９１２，０４０号明細書 米国特許第６，４５１，５９７号明細書

本発明の目的は、分泌型組換え第ＶＩＩＩ因子を高発現させるためのベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞を提供することにある。

本発明は、組換え第ＶＩＩＩ因子を高発現させるためのＢＨＫ細胞に関する。
本発明の１つの態様では、組換え第ＶＩＩＩ因子を高発現させるためのＢＨＫ細胞が提供され、このＢＨＫ細胞は、組換え第ＶＩＩＩ因子の発現をコードする遺伝物質を有し、シャペロンタンパク質のカルレティキュリンおよびＥｒｐ５７をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１種の発現ベクターで形質転換されている。

本発明の第１態様の１つの実施形態においては、組換え第ＶＩＩＩ因子が分泌される。
本発明の別の実施形態では、組換え第ＶＩＩＩ因子の発現をコードする遺伝物質がＢＨＫ細胞のＤＮＡに組み込まれる。

本発明の別の実施形態において、ＢＨＫ宿主細胞は、グルタミンシンセターゼタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターでさらに形質転換される。
本発明は、図面と併せて以下の詳細な説明および特許請求の範囲を検討すればより容易に理解されるであろう。

ヒトｃＤＮＡライブラリーからＥＲシャペロンのｃＤＮＡを増幅するのに用いたＲＴ−ＰＣＲプライマーの配列を示す図。下線部は、組み込まれているＥｃｏＲＩ制限部位（５’プライマー）またはＸｂａＩ制限部位（３’プライマー）を示す。ＣＮＸ：カルネキシン；ＣＲＴ：カルレティキュリン。 ＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされたカルネキシンのヌクレオチドおよびアミノ酸の全配列を示す図。プライマー内の５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＸｂａＩ部位には下線が付されている。開始コドンおよび停止コドンは太字で示されている。 ＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされたカルレティキュリンのヌクレオチドおよびアミノ酸の全配列を示す図。５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＸｂａＩ部位には下線が付されている。開始コドンおよび停止コドンは太字で示されている。 ＲＴ−ＰＣＲによりクローニングされたＥｒｐ５７のヌクレオチドおよびアミノ酸の全配列を示す図。５’ＥｃｏＲＩ部位および３’ＸｂａＩ部位には下線が付されている。開始コドンおよび停止コドンは太字で示されている。 ヒトＨｓｐ７０遺伝子コード領域のヌクレオチドおよびアミノ酸の全配列を示す図。 ヒトＨｓｐ４０遺伝子コード領域のヌクレオチドおよびアミノ酸の全配列を示す図。開始コドンは太字かつ下線付き文字で示されている。 グルタミンシンセターゼのコード領域のヌクレオチドおよびアミノ酸の全配列を示す図。開始コドンは太字かつ下線付き文字で示されている。 カルネキシン（Ｘ４．１４：５、Ｘ４／１４：３０）、Ｈｓｐ７０（７−３）またはＥｒｐ５７（Ｘ４／１９：６２）とともに重トランスフェクションされたクローンにおけるビクニンの過剰発現を示す図。いずれの細胞株に関する固有ビクニン生産率もビクニン（ｐｇ）／細胞／日（ＳＰＲ）で示されている。毎日細胞を収穫し、新鮮培地に移し、振盪フラスコ中３７℃で２４時間インキュベートした。翌日、細胞を再度収穫し、計数し、同量の新鮮培地に再懸濁し、同じ条件でさらに２４時間インキュベートした。使用済み培地試料のビクニン活性（ｐｇ／細胞／日）の測定を実施した。細胞数および生存力が低下し始めるまで毎日同じ手順を繰り返した。コントロール細胞株（ＣＦ９−２０）は、ビクニンは発現するが、シャペロンタンパク質は全く発現しない。 Ｈｓｐ７０とともに重トランスフェクションしたクローンにおけるビクニンの過剰発現を示す図。ＣＦ９−２０（コントロール細胞）を除くすべてのクローンをＨｓｐ７０で重トランスフェクションする。実験手順は図３について記載したものと同じである。 ビクニンのアミノ酸配列を示す図。

本発明は、哺乳動物宿主細胞で分泌組換えタンパク質産物を高発現させる方法および該方法のための試薬に関する。
本発明の１つの実施形態においては、組換えタンパク質産物を高発現させるための哺乳動物宿主細胞が提供され、この哺乳動物細胞は、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質を含み、カルネキシン、カルレティキュリン、Ｅｒｐ５７、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１種の発現ベクターでさらに形質転換されている。

本発明の別の実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質で安定に形質転換されている。
用語「哺乳動物宿主細胞」とは、核酸配列でトランスフェクションされているか、または核酸配列でトランスフェクション可能であり、その結果、選択された目的遺伝子を発現し得る哺乳動物細胞を指して用いられる。この用語は、親細胞の子孫を包含し、子孫は、選択された遺伝子が存在する限り、形態または遺伝学的構成が元の親と同一であるか否かを問わない。

本発明に用いるのに適した哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ヒトのＨｅＬａ細胞、サルのＣＯＳ−１細胞、ヒト胎児腎２９３細胞、マウス骨髄腫ＮＳＯおよびヒトＨＫＢ細胞（米国特許第６，１３６，５９９号）があるが、それらには限定されない。他の細胞株はＡＴＣＣから容易に入手できる。

用語「トランスフェクション」とは、細胞による異種または外来ＤＮＡの取り込みを指すのに用いられ、細胞は、外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき「トランスフェクションされた」ことになる。当技術分野では多くのトランスフェクション技術が周知であり、本明細書にも開示されている。例えば、グラハムら（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９７３年、第５２巻、ｐ．４５６；サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１９８９年；デイビスら（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ）、「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、エルゼビア社（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、１９８６年；およびチューら（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ）、Ｇｅｎｅ、１９８１年、第１３巻、ｐ．１９７を参照されたい。そのような技術は、１種以上の外来ＤＮＡ部分を適当な宿主細胞に導入するのに用い得る。

本発明に用いるのに適したトランスフェクション技術としては、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション法、およびエレクトロポレーション法があるが、それらには限定されない。ベーリンガー・マンハイムのトランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）〔Ｎ−＞１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート、米国インディアナ州インディアナポリス所在のベーリンガー・マンハイム社〕、またはＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ（登録商標）もしくはＤＭＲＩＥ（商標）試薬〔米国メリーランド州ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在のギブコ・ビー・アール・エル（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）社〕を含めた市販の試薬を用いたカチオン脂質トランスフェクション法も用い得る。

本明細書において、用語「重トランスフェクション（ｓｕｐｅｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」とは、すでに組換え遺伝子を発現している宿主細胞に２種以上の発現ベクターをトランスフェクションすることを指す。

本明細書において、用語「形質転換」とは、細胞の遺伝学的特性の変化を指し、細胞は、新たなＤＮＡを含むように改変されたとき形質転換されたことになる。例えば、細胞は、その天然状態から遺伝子組換えが行われた場合に形質転換される。トランスフェクション後、形質転換を担うＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれてその細胞のＤＮＡとの組換えを起こしてもよいし、複製されずにエピソームとして一時的に保持されてもよいし、またはプラスミドとして独立に複製してもよい。細胞は、そのＤＮＡが細胞の分裂に伴って複製されたときに安定に形質転換されたと考えられる。

本明細書において、用語「改変細胞株（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）」とは、１種以上のＤＮＡ構築物で一過性または安定に形質転換された細胞株を指す。
本発明の実施に用いるポリヌクレオチド、遺伝物質、組換えＤＮＡ分子、発現ベクターなどは、例えば、サムブルックら（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ニューヨーク）、１９８９年；本明細書に文献援用）により記載されたものなどの標準クローニング法を用いて単離し得る。あるいは、本発明の組換えタンパク質産物をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野では周知の標準技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置などを用いて合成し得る。例えば、本発明の１つの実施形態では、図１に示すプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより、カルネキシンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を合成する。

本明細書において、「発現ベクター」とは、天然には存在しないように組合せて並べたＤＮＡセグメントを含むように人の手を介して改変されたＤＮＡ分子、またはそのような分子のクローンを指す。ＤＮＡ構築物は、本発明のポリペプチドをコードする第１のＤＮＡセグメントを、該第１のＤＮＡセグメントの発現に必要な追加ＤＮＡセグメントに機能可能なように連結させて含むように設計することができる。本発明の文脈では、追加ＤＮＡセグメントには、一般的にはプロモーターや転写ターミネーターが挙げられるが、さらにエンハンサーや他の要素をも含まれ得る。さらに１種以上の選択マーカーも含まれ得る。多様な原核および真核宿主細胞中でクローニングＤＮＡセグメントを発現させるのに有用なＤＮＡ構築物は、容易に入手し得る成分から調製するか、供給業者から購入し得る。

ＤＮＡ構築物は、目的のポリペプチドまたはタンパク質を分泌させるために必要なＤＮＡセグメントをさらに含み得る。そのようなＤＮＡセグメントは、少なくとも１種類の分泌シグナル配列を含み得る。リーダー配列、プレプロ配列および／またはプレ配列とも称される分泌シグナル配列は、細胞からの成熟ポリペプチドまたは成熟タンパク質の分泌を誘導する役割を果たすアミノ酸配列である。そのような配列は、疎水性アミノ酸コアを特徴とし、通常（但し、必須ではないが）、新規合成タンパク質のアミノ末端に見られる。非常に多くの場合、分泌ペプチドは分泌時に成熟タンパク質から切断される。そのような分泌ペプチドは、分泌経路を通過する際に成熟タンパク質から分泌ペプチドが切断されるのを可能にするプロセシング部位を含む。組換えタンパク質は、元のアミノ酸配列中に分泌シグナル配列を含んでいてもよいし、設計された分泌シグナル配列を元のアミノ酸配列中に挿入して分泌タンパク質になるように人為操作されてもよい。適当なプロモーター、ターミネーターおよび分泌シグナルの選択は、当業者のレベルで十分に対応できる範囲内である。例えば、哺乳動物培養細胞およびＥ．ｃｏｌｉにおけるクローン遺伝子の発現については、サムブルックらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９年（本明細書に文献援用）で詳細に論じられている。

本明細書において、用語「組換えタンパク質産物」とは、宿主哺乳動物細胞に導入された遺伝物質から発現された組換えタンパク質またはその断片を指す。
トランスフェクション後、細胞は、ＤＮＡ構築物によって一過性の形質転換状態または安定な形質転換状態に保持され得る。複数のＤＮＡ構築物の導入および複数のＤＮＡ構築物を含む細胞の選択は、同時に、より好ましくは連続的に、実施し得る。遺伝物質または発現ベクターで安定に形質転換された細胞株を確立する技術は当技術分野では周知である（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」）。一般に、トランスフェクション後、ＤＮＡ構築物を含む細胞を増殖培地により選択するが、例えば、薬剤選択を行うか、または必須栄養素を欠乏させて、ＤＮＡ構築物上の選択マーカーもしくはＤＮＡ構築物と共にトランスフェクションされた選択マーカーによって該栄養素を補足することによって選択する。哺乳動物培養細胞は、通常、市販の血清含有培地または無血清培地で培養する。使用される特定の宿主細胞に適した培地の選択は当業者のレベルの範囲内である。

本発明において用いるのに適した薬剤選択用の選択マーカーとしては、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ゼオシン、コルチン（Ｃｏｌｃｈｉｎｅ）、メトトレキサート、およびメチオニンスルホキシミンがあるが、それらには限定されない。

薬剤耐性細胞集団が確立されたら、個々のクローンを選択し、高発現クローンを選別し得る。クローニング細胞株を確立する方法は、当技術分野では周知であり、クローニングシリンダーの使用や限界希釈法が挙げられるが、それらには限定されない。各クローンからの目的の組換え産物の発現は、例えば、イムノアッセイ、酵素アッセイ、または発色アッセイなどの方法で測定し得るが、それらの方法には限定されない。

第１のＤＮＡ構築物で安定に形質転換された細胞株は、次いで、第２以降のＤＮＡ構築物によるトランスフェクション用宿主細胞として用いて、種々の薬剤選択に供することができる。

本発明の１つの実施形態では、ビクニンタンパク質またはその断片を高発現かつ分泌する哺乳動物宿主細胞が提供され、この哺乳動物宿主細胞は、カルネキシン、カルレティキュリン、Ｅｒｐ５７、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１種の発現ベクターでさらに形質転換される。

本発明の１つの好ましい実施形態において、ビクニンを高発現かつ分泌する哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
本明細書において、用語「ビクニン」とは、少なくとも１つのクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ドメインを有する任意のタンパク質を指す。クニッツドメインについては、例えば、ラスコウスキーら（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ）、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９８０年、第４９巻、ｐ．５９３−６２６、および米国特許第５，９１４，３１５号（１９９９年６月２２日）などの文献に記載されている。１つの好ましい実施形態において、本明細書に使用されている用語「ビクニン」とは、図５に示すアミノ酸配列を指す。他のビクニンタンパク質およびその断片は、米国特許出願番号第０９／１４４，４２８号、同第０９／９７４，０２６号、同第０９／２１８，９１３号および同第０９／４４１，９６６号、ならびに国際出願公開公報第９７／３３９９６号として公開されたＰＣＴ出願番号ＵＳ９７／０３８９４号および国際出願公開公報第００／３７０９９号として公開された同ＵＳ９９／０４３８１号に記載されており、これらの特許文献は本明細書に文献援用される。

本発明の別の実施形態において、本発明は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはその断片を高発現かつ分泌する哺乳動物宿主細胞を提供し、この哺乳動物宿主細胞は、カルネキシン、カルレティキュリン、Ｅｒｐ５７、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１種の発現ベクターでさらに形質転換される。

１つの好ましい実施形態において、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、米国特許第４，９６５，１９９号（全体を本明細書に文献援用）に記載の配列を有する。
さらに別の好ましい実施形態において、第ＶＩＩＩ因子を高発現かつ分泌する哺乳動物宿主細胞はＢＨＫ細胞である。

本発明の別の実施形態において、本発明は、ＩＬ２ＳＡタンパク質またはその断片を高発現かつ分泌する哺乳動物宿主細胞を提供し、この哺乳動物宿主細胞は、カルネキシン、カルレティキュリン、Ｅｒｐ５７、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１つの発現ベクターでさらに形質転換される。

１つの好ましい実施形態において、ＩＬ２ＳＡタンパク質は、米国特許第６，３４８，１９２号（全体を本明細書に文献援用）に記載の配列を有する。
さらに別の好ましい実施形態において、ＩＬ２ＳＡタンパク質を高発現かつ分泌する哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

本発明のさらに別の実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、グルタミンシンセターゼタンパク質をコードする発現ベクターでさらに形質転換される。
また本発明は、目的の組換えタンパク質またはその断片を高発現させるための哺乳動物宿主細胞を作出する方法を提供し、この方法は、目的の組換えタンパク質またはその断片の発現をコードする遺伝物質を有する哺乳動物細胞を得るステップと、カルネキシン、カルレティキュリン、Ｅｒｐ５７、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１種の発現ベクターで該哺乳動物細胞を形質転換するステップとを含む。

本発明の１つの実施形態では、組換えタンパク質産物の発現をコードする遺伝物質が宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる。
本発明の別の実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、グルタミンシンセターゼタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターでさらに形質転換される。

本発明の１つの好ましい実施形態において、組換えタンパク質産物はビクニンまたはその断片であり、形質転換は、カルネキシン、Ｅｒｐ５７、カルレティキュリン、またはＨｓｐ７０をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターを用いて実施される。

本発明の別の好ましい実施形態において、組換えタンパク質産物は第ＶＩＩＩ因子またはその断片であり、形質転換は、カルレティキュリンをコードするＤＮＡを含んでなる第１の発現ベクターと、Ｅｒｐ５７をコードするＤＮＡを含んでなる第２の発現ベクターとを用いて実施される。

本発明の別の好ましい実施形態において、組換えタンパク質産物は第ＶＩＩＩ因子またはその断片であり、形質転換は、カルネキシンまたはＨｓｐ７０をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターを用いて実施される。

本発明の別の好ましい実施形態において、組換えタンパク質産物はＩＬ２ＳＡまたはその断片であり、形質転換は、Ｈｓｐ７０をコードするＤＮＡを含んでなる発現ベクターを用いて実施される。

本発明はまた、分泌型組換えタンパク質産物を生産する方法を提供し、この方法は、組換え産物の発現をコードする遺伝物質を有し、カルネキシン、カルレティキュリン、Ｅｒｐ５７、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択されるシャペロンタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１種の発現ベクターでさらに形質転換された哺乳動物宿主細胞を培養するステップと、そのようにして生産かつ分泌されたビクニンタンパク質またはその断片を培地から回収するステップとを含む。

本発明の１つの実施形態において、分泌型組換えタンパク質産物を生産する方法は、組換え産物の発現をコードする遺伝物質で安定に形質転換された哺乳動物宿主細胞を培養するステップを含む。

本発明の別の実施形態において、分泌型組換えタンパク質産を生産する方法は、哺乳動物宿主細胞を、グルタミンシンセターゼタンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクションするステップをさらに含む。

本発明の１つの実施形態は、ビクニンタンパク質またはその断片を生産する方法を提供し、この方法は、ビクニンタンパク質またはその断片と、カルネキシン、カルレティキュリン、Ｅｒｐ５７、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０からなる群から選択される少なくとも１種のシャペロンタンパク質とを発現する哺乳動物宿主細胞を培養するステップと、そのようにして生産かつ分泌されたビクニンタンパク質またはその断片を培地から回収するステップとを含む。

本発明の１つの実施形態では、ＣＨＯ細胞において組換えビクニンタンパク質の生産を増加させる方法を提供し、前記方法は、改変ＣＨＯ細胞株を形成するために、少なくとも１種のシャペロンタンパク質発現ベクターを第１のＣＨＯ細胞株に挿入するステップと、改変ＣＨＯ細胞株から、組換えビクニンタンパク質の収量が増加した少なくとも１種の第２の細胞を選択するステップとを含み、第１のＣＨＯ細胞株には（１９９９年１１月１２日に出願されたチャン（Ｃｈａｎ）の米国特許出願番号第０９／４４１，６５４号（本願に援用）に記載のように）組換えビクニンの発現をコードする遺伝物質があらかじめ導入されていることを特徴とする。

本発明の別の実施形態において、ＣＨＯ細胞株における組換えビクニン収量を増加させる方法は、組換えビクニンを得るための遺伝物質を、シャペロンタンパク質を高発現するＣＨＯ細胞株に導入するステップを含む。

本発明のさらに別の実施形態では、ＢＨＫ細胞において組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の生産を増加させる方法を提供し、前記方法は、改変ＢＨＫ細胞株を形成するために、第１のＢＨＫ細胞株に少なくとも１種のシャペロンタンパク質発現ベクターを挿入するステップと、改変ＢＨＫ細胞株から、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の収量が増加した少なくとも１種の第２の細胞を選択するステップとを含み、第１のＢＨＫ細胞株には組換え第ＶＩＩＩ因子の発現をコードする遺伝物質があらかじめ導入されていることを特徴とする。

本発明のさらに別の実施形態において、ＢＨＫ細胞株における組換え第ＶＩＩＩ因子の収量を増加させる方法は、組換え第ＶＩＩＩ因子を得るための遺伝物質を、シャペロンタンパク質を高発現するＢＨＫ細胞株に導入するステップを含む。

また本発明は、ＣＨＯ細胞において組換えＩＬ２ＳＡタンパク質を高生産させる方法を提供し、前記方法は、改変ＣＨＯ細胞株を形成するために、第１のＣＨＯ細胞株に少なくとも１種のシャペロンタンパク質発現ベクターを挿入するステップと、改変ＣＨＯ細胞株から、組換えＩＬ２ＳＡタンパク質の収量が増加した少なくとも１種の第２の細胞を選択するステップとを含み、第１のＣＨＯ細胞株には組換えＩＬ２ＳＡの発現をコードする遺伝物質があらかじめ導入されていることを特徴とする。

本発明の別の実施形態において、ＣＨＯ細胞株における組換えＩＬ２ＳＡの収量を増加させる方法は、組換えＩＬ２ＳＡを得るための遺伝物質を、シャペロンタンパク質を高発現するＣＨＯ細胞株に導入するステップを含む。

以下の実施例は、例示目的のみを意図しており、したがって、本発明の範囲をどのようにも制限するものと解釈してはならない。
（実施例１）
［シャペロンｃＤＮＡのクローニング］
すべてのシャペロン配列は、ヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングし、次いで、ヌクレオチド配列を確認した。ヒトｃＤＮＡライブラリーからＲＴ−ＰＣＲにより３種のＥＲシャペロンを表すＤＮＡ配列をクローニングした。これらの反応に用いたＲＴ−ＰＣＲプライマーは、Ｇｅｎｂａｎｋから得た適切な配列を用いて全コード領域を増幅するように設計した。各５’および３’プライマー対は、ＰＣＲ産物を発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）にクローニングし易いようにＥｃｏＲＩ（５’プライマー）またはＸｂａＩ（３’プライマー）制限部位（図１）を含む。

高精度のＰＦＵ酵素（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社）を用いてＰＣＲ反応を実施した。予想サイズのバンドを精製し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、同じように消化したｐＣＩ−ｎｅｏベクターにクローニングした。このステップから得た組換えベクターを大腸菌で増殖させた後、ベクター配列を単離、精製した。この配列のシャペロンを表すインサートを、ベクターのマルチクローニング部位のすぐ外側ならびにシャペロン配列内に結合するプライマーを用いて配列決定した。配列決定は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ（登録商標）ターミネーター法を用いて、エム・ジェイ・リサーチ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社のサーマルサイクラーで実施し、ＡＢＩ社の３１０型ジェネティック・アナライザを用いて解析した。ヒトのカルネキシン、カルレティキュリンおよびＥｒｐ５７のｃＤＮＡ配列を図２Ａ〜２Ｃに示す。

ヒト脳のポリＡ^＋ ＲＮＡ（クロンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）社、カタログ番号６５１６−１〕と、２種のプライマーすなわちＦ−Ｈｓｐ７０＝５’ＡＧＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＣＡＴ ＧＧＣ ＣＡＡ ＡＧおよびＲ−Ｈｓｐ７０＝５’ＧＡＡ ＡＧＧ ＣＣＣ ＣＴＡ ＡＴＣ ＴＡＣ ＣＴＣ ＣＴＣ Ａとを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより、完全長のヒトＨｓｐ７０ ｃＤＮＡ断片を得た。Ｈｓｐ７０のプライマー配列は、ヒトの熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ７０）遺伝子に関して先に公開された配列［９］に由来するものとした。Ｆ−Ｈｓｐ７０およびＲ−Ｈｓｐ７０プライマーには、それぞれＥｃｏＲＩまたはＸｂａＩ配列を含めた。所望のＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動で精製し、ヌクレオチドの塩基配列決定により確認した。次いで、この完全長のヒトＨｓｐ７０ ｃＤＮＡ断片をｐＣＩ−ｎｅｏベクターのＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩクローニング部位に挿入してｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｈｓｐ７０ベクターを作製した。ｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｈｓｐ７０ベクターを大腸菌で増殖させた後、ベクター配列を単離、精製した。ｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｈｓｐ７０プラスミドＤＮＡをＡＢＩ社のＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０型ジェネティック・アナライザで配列決定した。ヒトＨｓｐ７０の配列を図２Ｄに示す。
（参考例２）
［カルネキシン、カルレティキュリン、Ｅｒｐ５７またはＨｓｐ７０などのＥＲシャペロンでトランスフェクションした後ではＣＨＯ細胞におけるビクニン生産量が増加する］
組換えビクニンタンパク質を分泌するＣＨＯ細胞株（米国特許出願番号第０９／４４１６５４号、本明細書に文献援用）を、ＥＲシャペロン、カルネキシン（ＣＮＸ）、カルレティキュリン（ＣＲＴ）、Ｅｒｐ５７またはＨｓｐ７０の種々の組合せで重トランスフェクションした後、Ｇ４１８で選択した。細胞集団を取得し、カリクレインアッセイでスクリーニングした（米国特許出願番号第０９／４４１，６５４号、本明細書に文献援用）。手短に述べれば、ビクニン標準液または培養液を系列希釈し、等容量のカリクレインと共に３７℃で３０分インキュベーションした後、発色基質Ｎ−ベンゾイル−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡを加えた。反応液を１５分インキュベーションしてから、５０％酢酸を加えた。放出されたｐ−ニトロアニリドの量を４０５ｎｍで測定した。次いで、ビクニン力価が最も高い集団から単細胞をクローニングし、数週間かけて増殖させた。コントロールのＣＦ９−２０細胞に比べて一貫して高いビクニン力価（２〜４×）を示すクローンを保持し、さらなる分析のために振盪フラスコで増殖させた。これらのクローンを、振盪フラスコ環境下での増殖中に示されたビクニン力価および増殖特性に基づいてさらに限定した。振盪フラスコの段階で数回詳細に分析した後、最終候補クローンを選択した。

すべての細胞株の固有ビクニン生産率を、ビクニン（ｐｇ）／細胞／日（ＳＰＲ）として表す。毎日細胞を収穫し、新鮮培地に移し、振盪フラスコ中３７℃で２４時間インキュベーションした。翌日、細胞を再度収穫、計数し、同量の新鮮培地に再懸濁し、同じ条件でさらに２４時間インキュベーションした。使用済み培地試料のビクニン活性（ｐｇ／細胞／日）の測定を行った。細胞数および生存力が低下し始めるまで毎日同じ手順を繰り返した。

ビクニン発現に及ぼすシャペロンタンパク質の効果を図３および図４に示す。コントロール細胞株（ＣＦ９−２０）は、ビクニンは発現するがシャペロンタンパク質は全く発現しない。ビクニン発現に及ぼすカルネキシン、カルレティキュリン、およびＥｒｐ５７の効果を以下の表１に要約する。

表中、活性測定値の倍率（増加率）は、ビクニンは発現するがシャペロンタンパク質は全く発現しないコントロール細胞株との比較である。細胞は、無血清培地にて振盪フラスコ培養で増殖させた。
（実施例３）
［ＥＲシャペロンでトランスフェクションした後ではＢＨＫ細胞における組換え第ＶＩＩＩ因子の生産量が増加する］
安定な第ＶＩＩＩ因子産生細胞（ＭＷＣＢ１）（米国特許第４，９６５，１９９号；ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ ８５４４）を、１０：１比のシャペロン発現ベクターとｐＰＵＲ（ピューロマイシン耐性遺伝子を含むベクター）でトランスフェクションした。約４×１０^６個のＭＷＣＢ１細胞を、６ウエルプレート中で、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）試薬およびＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）培地（米国メリーランド州所在のライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社）を用いて合計５μｇのＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション３日後に、６ウエルプレートに１００，０００個の細胞を播種し、次いで、１〜２μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下、２％ＦＢＳを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地で２週間培養して選択した。ピューロマイシン耐性コロニーを手作業で採取し、９６ウエルプレートに播種し、薬剤不在下で増殖させた。ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）キット（イタリア国所在のクロモジェニックス（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）社）を用い、製造業者の指示に従って、個々のクローン集団を第ＶＩＩＩ因子の生産についてスクリーニングした。高生産クローンを６ウエルディッシュからＴ７５フラスコまで順次増殖させた後、安定性および生産性をテストするために振盪フラスコの状態にした。次いで、カルネキシン（ＣＮＸ）、カルレティキュリン（ＣＲＴ）、Ｅｒｐ５７、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０シャペロンを個別に、または２種組合せて、細胞をトランスフェクションした。ＣＮＸ、ＣＲＴおよびＥｒｐ５７、Ｈｓｐ７０、ならびにＨｓｐ４０でトランスフェクションしたクローンでは第ＶＩＩＩ因子の生産性に有意な２〜４倍の増大が観察されたのに対し、空のベクターコントロール（ＰＣＩ−Ｎｅｏ）は、親株のＭＷＣＢ１細胞に比べて差が認められなかった（表２）。

表２に関して、細胞は、２日目に、振盪フラスコ中の１５ｍｌに対して１×１０^６個／ｍｌで播種した。
（参考例４）
［ＢｉＰとＰＤＩを同時発現させてもＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞における第ＶＩＩＩ因子および抗ＴＮＦ抗体の発現は増大しない］
高レベルのビクニンを発現する組換えＣＨＯ細胞（実施例２に記載）と、高レベルの組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）を発現する組換えＢＨＫ細胞（実施例３に記載）を、ｐＨｙｇ（ハイグロマイシン耐性を与えるプラスミド）およびｐＢｉＰで重トランスフェクションした。トランスフェクション条件および選択条件は実施例２と同じとした。ハイグロマイシン選択および限界希釈法によるクローニングの後、クローンをビクニン生産性およびｒＦＶＩＩＩ活性について評価した。コントロールベクター（ｐＨｙｇ）のみでトランスフェクションした細胞由来のクローンと、ｐＢｉＰでトランスフェクションした細胞由来のクローンの固有生産率には有意な差がなかった。
（参考例５）
［グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）およびＨｓｐ７０によるＩＬ２ＳＡ生産クローンのトランスフェクション］
ＩＬ２ＳＡ（ＩＬ２選択的アゴニスト；米国特許第６，３４８，１９２号、全体を本明細書に文献援用）を生産するＣＨＯ細胞株、３９−１９−Ｈ４２（ＡＴＣＣ寄託株 ＰＴＡ−８をクローニングしたバリアント）をＰＣＩ−ＧＳおよびＰＣＩ−ｎｅｏ−Ｈｓｐ７０で同時にトランスフェクションした。４×１０^６個の細胞を、ＤＭＲＩＥ−Ｃ試薬およびＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（米国メリーランド州所在のライフ・テクノロジー社）を用い、製造業者の指示に従って、６ウエルプレート中で、２．５μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクション３日後に、細胞を１５０ｍｍの９６ウエルプレートに播種し、次いで、１０μＭのＭＳＸ（メチオニンスルホキシミン）および２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下、２％の透析済ＦＢＳを含むグルタミン欠乏ＤＭＥ：Ｆ１２（１：１）培地で２週間培養して選択した。単細胞コロニーを採取し、９６ウエルに再播種した。これらのコロニーを、高濃度のＭＳＸ（２０μＭ）およびＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）でさらに１週間選択培養した。３週間の選択培養後、１５０ｍｍプレートからのプールが得られる。このプールとクローンを徐々に振盪フラスコまで増殖させ、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ２生産性についてスクリーニングした。フローサイトメーターを用いたＦＡＣＳ分析によりＧＳおよびＨｓｐ７０タンパク質の発現を確認した。「ＧＳ陽性」細胞を、５．６ｍＭのグルタミン酸と４ｇ／Ｌのグルコースを追加したグルタミン非含有培地で培養した。これらのクローンの倍加時間は２４〜８４時間の間でさまざまであった。親株とクローンの生産性の比較を表３に示す。いずれの単細胞クローンにおいても、プールまたは親株と比較して、力価全体では２〜４倍、固有生産率では２〜３倍の増大が観察された。

表３に関して、細胞は、０日目に、完全培地（親株の場合）またはグルタミン非含有培地１５ｍｌに対して、１０^６個／ｍｌで播種した。播種２日後に試料を採取し、ＥＬＩＳＡを用いて分析した。ＧＳおよびＨｓｐ７０の発現を調べるために、細胞を７０％ＥｔＯＨで固定し、適切な抗体で標識し、ＦＡＣＳで分析した。

表中、＋＋＋＝全細胞がＧＳまたはＨｓｐ７０を発現；＋＝３０％の細胞がＧＳまたはＨｓｐ７０を発現；（−）＝発現なし、を意味する。

Claims (4)

1. 組換え第ＶＩＩＩ因子を高発現させるためのベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞であって、組換え第ＶＩＩＩ因子の発現をコードする遺伝物質を有することと、シャペロンタンパク質のカルレティキュリンおよびＥｒｐ５７をコードするＤＮＡを含んでなる少なくとも１種の発現ベクターで形質転換されていることとを特徴とするＢＨＫ細胞。
2. 前記組換え第ＶＩＩＩ因子を分泌する請求項１に記載のＢＨＫ細胞。
3. 前記組換え第ＶＩＩＩ因子の発現をコードする遺伝物質がＢＨＫ細胞のＤＮＡに組み込まれている請求項２に記載のＢＨＫ細胞。
4. グルタミンシンセターゼタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターでさらに形質転換されている請求項３に記載のＢＨＫ細胞。