JP3469584B2 - ヒト ビクニン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明の組成物は、セリンプロテアーゼ活性を阻害す
るタンパク質の分野に関する。本発明は、また、セリン
プロテアーゼを阻害するタンパク質を産生するための核
酸構築物、ベクターおよび宿主細胞、このタンパク質を
含む薬剤組成物、ならびに、それらを使用するための方
法の分野に関する。

発明の背景 取り組んだ問題 血液損失は、心臓切開手術のような大手術や、その他
の複雑な処置の重大な合併症である。心臓手術患者はか
なりの輸血された供血を使う。輸血は伝染病や副作用を
起こす危険性がある。さらに、供血は高価で、しばし
ば、過剰な量の供給を必要とする。血液損失を抑えるた
めの薬学的方法と、その結果生じる輸血の必要性につい
て説明されている（Scottら、Ann.Thorac.Surg.50:843
−851,1990年）。

タンパク質のセリンプロテアーゼ阻害剤 クニッツ（Kunitz）ファミリーのウシセリンプロテア
ーゼ阻害剤であるアプロチニンが、薬剤Trasylol（登録
商標）における活性物質である。アプロチニン（Trasyl
ol）（登録商標））は、手術時の血液損失を抑制する効
果があることが報告されている（Roystonら、Lancet i
i:1289−1291,1987;Dietrichら、Thorac.Cardiovasc.Su
rg.37:92−98,1989;W.van Oeverenら、（1987）,Ann.Th
orac.Surg.44.pp 640−645;Bistrupら、（1988）Lancet
I,366−367）。一方、低血圧や潮紅を含む副作用（Boh
rerら、Anesthesia 45:853−854,1990）とアレルギー反
応（Dietrichら、前掲）があることも報告されている。
以前にアプロチニンを施用した患者にアプロチニンを使
用することは勧められない（Dietrichら、前掲）。ま
た、Trasylol（登録商標）は、線溶亢進性出血と外傷性
出血ショックを治療するためにも使用されている。

アプロチニンは、トリプシン、キモトリプシン、プラ
スミン、およびカリクレインなど、いくつかのセリンプ
ロテアーゼを阻害することが知られており、急性膵炎、
様々なショック症候群、線溶亢進性出血、および心筋梗
塞の治療における治療薬として用いられている（Trapne
llら、（1974）Brit.J.Surg.61:177;J.McMichanら、（1
982）Circulatory Shock 9:107;Auerら、（1979）Acta
Neurochir.49:207;Sher、（1977）Am.J.Obstet.Gyneco
l.129:164;Schneider、（1976）,Artzneim.−Firsch.2
6:1606）。Trasylol（登録商標）は、一般的に、カリク
レインとプラスミンとを阻害することによって、生体内
で血液損失を抑制すると考えられている。アプロチニン
（３−58、Arg15、Ala17、Ser42）は、天然のアプロチ
ニンそのものに比べて、強い血漿カリクレイン阻害能力
を示すことが分かっている（WO 89/10374）。

アプロチニンに伴う問題 アプロチニンはウシに由来するため、人間の患者で
は、薬剤との再接触によって、アナフィラキシーが誘導
されるという限定された危険がある。したがって、アナ
フィラキシーの危険を低くするために、ヒトにおける機
能的なアプロチニンの等価物が最も有用で望ましい。

アプロチニンは、また、齧歯類や犬に、繰り返し高用
量で投与すると、腎臓毒性がある（バイエル社（Baye
r）、Trasylol（登録商標）、プロテイナーゼの阻害剤;
Glasserら、in“erhandlungen der Deutshen Gesellsch
aft fur Innere Medizin,78.Kongress",Bergmann,Munch
en,1972,pp.1612−1614）。この効果は、正味にして高
い正の電荷をもつために、アプロチニンが負に荷電して
いる近位尿細管に蓄積することが原因だという説がある
（WO 93/14120）。

したがって、本発明の目的の一つは、アプロチニンと
同じ機能活性をもつヒトのタンパク質を同定することで
ある。また、荷電の程度は低いが、アプロチニンで見つ
けられたのと同一の、または同様の、特にプラスミンと
カリクレインの阻害能力に関し、向上したプロテアーゼ
特異性を示すヒトのタンパク質を同定することも本発明
の目的である。このような阻害剤は、有害な免疫反応の
危険と腎臓毒性とを低下させて、人間の患者に薬剤とし
て繰り返し使用できるようになるであろう。

発明の簡単な概要 本発明は、特にカリクレインを特異的に阻害すること
ができる、精製したヒトのセリンプロテアーゼ阻害剤を
提供するためのものであって、この阻害剤はアフィニテ
ィークロマトグラフィーによってヒトの胎盤組織から単
離されたものである。

本発明は、クニッツ型の２つのセリンプロテアーゼ阻
害領域をもち、本明細書においてヒト胎盤ビクニンと名
付けられた、新たに同定されたヒトのタンパク質を提供
する。特定の態様において、本発明は、具体的には、次
のアミノ酸配列をもつタンパク質である。

好ましい態様において、本発明は、次のアミノ酸配列
をもつ、天然のヒト胎盤ビクニンを提供するためのもの
である。

一つの局面において、本発明のタンパク質の生物学的
活性は、トリプシン、ヒト血漿および組織カリクレイ
ン、ヒトプラスミン、ならびに第XII a因子に結合し
て、実質的にこれらの生物学的活性を阻害できることで
ある。好ましい態様において、本発明は、天然のヒト胎
盤ビクニンタンパク質をグルコシル化された状態で提供
するためのものである。本発明の更なる態様において、
本発明には、少なくとも一つのシステイン−システイン
のジスルフィド結合をもつように形成された、天然のヒ
トのビクニンタンパク質が含まれる。好ましい態様にお
いて、このタンパク質は、CYS11−CYS61、CYS20−CYS4
4、CYS36−CYS57、CYS106−CYS156、CYS115−CYS139、
およびCYS131−CYS152からなるグループより選択される
システイン対の間に形成される、少なくとも一つの鎖内
のシステイン−システインのジスルフィド結合を有す
る。なお、システインの番号は、天然のヒト胎盤ビクニ
ンのアミノ酸配列に従っている。当業者は、本発明のタ
ンパク質が、天然のヒト胎盤ビクニンの生物学的活性が
維持されるように、適切な３次元構造に折り畳まれてい
ることを理解し、天然の鎖内システイン−システインの
ジスルフィド結合は一つもないか、あるいは一つ以上有
しているものであるか、あるいはすべての結合を有する
ものであることも理解することができる。最も好ましい
態様において、本発明のタンパク質は、適切に折り畳ま
れて、すべての正しいシステイン−システインのジスル
フィド結合を形成している。

本発明の活性をもつタンパク質は、胎盤などのヒトの
組織から精製することによって、または、下記の実施例
によって例示されているような合成タンパク質化学技術
によって得ることができる。本発明のタンパク質は、自
己複製するベクターに、形質転換された細胞から、本発
明のタンパク質を発現させるという、分子生物学的技術
を用いても得られることが分かる。このようなタンパク
質は、形質転換させた細胞から分泌されない状態にも、
分泌される状態にも作製することができる。形質転換細
胞からの分泌を促進するか、翻訳されたタンパク質の機
能的安定性を高めるか、または、ビクニンタンパク質の
折畳みを補助するために、天然のヒト胎盤ビクニンタン
パク質のNH2−末端に、ある種のシグナルペプチドを付
加することができる。

従って、一つの態様において、本発明は、天然のシグ
ナルペプチド配列の少なくとも一部をそのままもつ、天
然のヒト胎盤ビクニンタンパク質を提供するためのもの
である。つまり、本発明の一つの態様は、シグナルペプ
チドの少なくとも一部をもつ天然のヒトビクニンで、以
下のアミノ酸配列をもつものを提供するものである。

好ましい態様において、本発明は、完全なリーダー配
列の部分をもつ天然のヒト胎盤ビクニンタンパク質で、
以下のアミノ酸配列の完全なリーダーセグメントをもつ
配列番号:52（SEQ ID NO:52）のアミノ酸配列をもつも
のを提供するものである。

もう一つの態様において、本発明は、完全なリーダー
配列の部分をもつビクニンタンパク質で、以下のアミノ
酸配列の完全なリーダーセグメントをもつ配列番号:52
（SEQ ID NO:52）のアミノ酸配列をもつものを提供する
ものである。

本明細書において使用される好ましい番号システムで
は、天然のヒト胎盤ビクニンに対するアミノ酸配列のNH
2−末端をアミノ酸番号＋１と指定している。天然のヒ
ト胎盤ビクニンの生物学的活性の少なくとも一部をもち
続け、セリンプロテアーゼ阻害因子として作用する、機
能的なタンパク質の断片が天然のヒト胎盤ビクニンから
得られることが容易に認識されるであろう。

一つの態様において、本発明のタンパク質は、少なく
とも一つの機能的なクニッツ様ドメインをもち、天然の
ヒト胎盤ビクニンのアミノ酸７〜159のアミノ酸配列
（以後、ビクニン（７−159）という）を持つ天然のヒ
ト胎盤ビクニンの断片を含んでいる。従って、本発明は
以下のアミノ酸配列を有するタンパク質となる。

ここでのアミノ酸の番号は、天然のヒト胎盤ビクニンの
アミノ酸配列の番号に対応している。この態様の別の機
能的な変異体は、少なくとも一つの機能的なクニッツ様
ドメインをもち、天然のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸11
〜156のアミノ酸配列「ビクニン（11−156）」をもつ天
然のヒト胎盤ビクニンの断片でもある。

個々のクニッツ様ドメインは天然のヒト胎盤ビクニン
の断片でもあることが分かる。特に、本発明は、天然の
ヒト胎盤ビクニンのアミノ酸７〜64のアミノ酸配列から
なる第一のクニッツ様ドメイン（以下、ビクニン（７−
64）という）のアミノ酸配列をもつタンパク質を提供す
るものである。したがって、一つの態様において、本発
明は、以下のアミノ酸配列をもつクニッツ様ドメインを
少なくとも一つもつタンパク質を含む。

ここで、アミノ酸番号は、天然のヒト胎盤ビクニンのア
ミノ酸配列の番号に対応している。本発明のタンパク質
のもう一つの形は、以下のアミノ酸配列である天然のヒ
ト胎盤ビクニンのアミノ酸11〜61のアミノ酸配列からな
る第一のクニッツ様ドメイン、ビクニン（11−61）であ
ってもよい。

また、本発明は、天然のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸
102〜159のアミノ酸配列（以下、ビクニン（102−159と
いう）からなるクニッツ様ドメインのアミノ酸配列をも
つタンパク質を提供するものである。したがって、一つ
の態様において、本発明は、以下のアミノ酸配列をもつ
クニッツ様ドメインを少なくとも一つもつタンパク質を
含む。

ここで、アミノ酸番号は、天然のヒト胎盤ビクニンのア
ミノ酸配列の番号に対応している。このドメインのもう
一つの形は、以下のアミノ酸配列である天然のヒト胎盤
ビクニンのアミノ酸106〜156のアミノ酸配列、ビクニン
（106−156）からなるクニッツ様ドメインであってもよ
い。

このように、当業者は、天然のタンパク質の生物学的
活性の少なくともいくつかを保持している天然のヒトビ
クニンの断片が作出できることを認めるであろう。ま
た、天然のヒトビクニンタンパク質の生物学的活性のい
くつか、または同じ活性、またはより強い活性を保持し
ている別の形のタンパク質を提供するために、このよう
な断片を、異なった方向や複数の組合せに組み合わせる
ことができる。

本発明の生物学的に活性のあるタンパク質は、一個以
上の本発明のクニッツ様ドメインと、別の生物に由来す
る他のクニッツ様ドメインとが結合されていてもよいこ
とは、容易に認識されよう。本発明の生物学的活性をも
つタンパク質は、さまざまな生物学的活性をもつ別の生
物源に由来する他のタンパク質部位と結合した、一個以
上の本発明のクニッツ様ドメインを含んでいてもよい。
予測可能な生物学的活性をもつ多機能性融合タンパク質
を提供するために、本発明のタンパク質の生物学的活性
を、他の既知のタンパク質の生物学的活性と組み合わせ
ることができる。したがって、一つの態様において、本
発明は、配列番号:5、または配列番号:7のいずれかのア
ミノ酸配列と、同一か、または機能的に同等のアミノ酸
配列を少なくとも一つもつタンパク質を含む。

早朝の終止コドンで終結するオープンリーディングフ
レームでも、機能的なタンパク質をコードすることがで
きる。本発明には、このような選択的な終結も含まれ、
一つの態様として、以下のアミノ酸配列のタンパク質を
提供する。

一つの態様において、本発明は、実質的に精製され
た、または、完全なリーダー配列の一部と、天然の膜貫
通領域の少なくとも一部とで組換えられ、産生された天
然のヒトのビクニンを提供する。したがって、本発明の
一つの態様は、完全なリーダー配列と、膜貫通ドメイン
の少なくとも一部（下線部）をもち、下記のものから選
択されたアミノ酸配列を有する天然のヒトのビクニンを
提供するものである。

ここで、配列１）は、共通配列番号:45由来のESTで、
２）は、PCRクローン配列番号:47で、および３）は、ラ
ムダcDNAクローン配列番号:49である。好ましい態様に
おいて、本発明のタンパク質は、配列番号:45、47、ま
たは49のアミノ酸配列の一つであって、タンパク質はク
ニッツドメインの最後と膜貫通領域との間の領域で切断
されているものである。

本発明は、また、シグナルペプチドが欠失したタンパ
ク質を具体化している。すなわち、本発明は、膜貫通ア
ミノ酸配列が続く、配列番号:52のアミノ酸配列を有す
るタンパク質を提供する。

膜貫通アミノ酸配列： または、膜貫通アミノ酸配列： 本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、本発明のタン
パク質を産生するための分子生物学的手法において用い
ることのできる適切な塩基配列を、当業者に教示する。
したがって、本発明の一つの態様は、図３（配列番号:1
0）の天然のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列に翻訳さ
れる、図３（配列番号:9）のDNA共通配列をもつヒトの
ビクニンをコードする塩基配列を提供する。別の態様に
おいて、本発明は、図4D（配列番号:45）のアミノ酸配
列をコードする、図4C（配列番号:51）の塩基共通配列
を提供する。

好ましい態様において、本発明は、配列番号:49のタ
ンパク質配列をコードする図4F（配列番号:48）のDNA配
列をもつ天然のヒト胎盤ビクニンをコードする塩基配列
を提供する。別の態様において、本発明は、配列番号:4
7のタンパク質配列をコードする、図4E（配列番号:46）
の塩基配列を提供する。

塩基配列中に作出された対立遺伝子突然変異、および
保存的な置換により、本発明に包含されるタンパク質の
アミノ酸配列となるような塩基配列を作出することがで
きることは、簡単に認識できる。当業者は、本発明のタ
ンパク質の自然の対立遺伝子突然変異、および、本発明
のタンパク質におけるアミノ酸の保存的な置換は、タン
パク質の生物学的活性を有意に変更するものではなく、
本発明に包含されるものであることが認識される。

本発明は、また、手術を受けている患者における手術
時の出血を低減させるのに有用なヒト胎盤ビクニンとそ
の断片を含む薬剤組成物を提供する。

本発明は、また、本発明に係る公開されたヒトセリン
プロテアーゼ阻害因子を有効量を、生物学的に適合性の
あるビヒクル中に入れて、患者に投与して、手術を受け
ている患者における手術時の出血を低減させるための方
法を提供する。

本発明は、また、プロテアーゼ特異性を変更するアミ
ノ酸置換を含む、胎盤ビクニンの変異体と、上記の特異
的なクニッツドメインとを提供する。好ましい置換部位
は、下記に、天然のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸配列中
に、Xaa¹からXaa³²の位置で示されている。Xaa¹からXaa
¹⁶での置換は、ビクニン（７−64）の変異体として好ま
く、一方、Xaa¹⁷からXaa³²での置換は、ビクニン（102
−159）の変異体として好ましいものである。

すなわち、本発明は、以下のアミノ酸配列をもつタン
パク質を実現する。

ここで、Xaa¹〜Xaa³²は、Xaa¹〜Xaa³²の少なくとも一つ
のアミノ酸残基が、対応する天然の配列のアミノ酸残基
とは異なるという条件付きで、それぞれ独立に、Cys以
外の天然のアミノ酸残基を表す。

本明細書において、「天然のアミノ酸残基」という語
は、普遍的に存在する20種のアミノ酸、すなわち、Al
a、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Le
u、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、およびV
alのいずれか一つを示すものである。

上で示した一つ以上の位置で、一つ以上のアミノ酸を
置換することによって、天然のヒト胎盤ビクニンの阻害
因子特異性プロファイルや、個々のクニッツ様ドメイ
ン、ビクニン（７−64）、またはビクニン（102−159）
の阻害因子特異性プロファイルを変化させることがで
き、限定はされないが好ましくは例えば、補体カスケー
ドの酵素、TF/F VII a、F X a、トロンビン、好中球エ
ラスターゼ、カテプシンＧ、またはプロテアーゼ−３な
どの別のセリンプロテアーゼを阻害するようにすること
ができる。

胎盤ビクニン変異体の好ましい例には、Xaa¹は、Hi
s、Glu、Pro、Ala、ValまたはLysからなる群より選択さ
れるアミノ酸残基で、特に、Xaa¹がHisまたはProであ
り；もしくは、Xaa²は、Val、Thr、Asp、Pro、Arg、Ty
r、Glu、Ala、Lysからなる群より選択されるアミノ酸残
基で、特に、Xaa²がValまたはThrであり；もしくは、Xa
a³は、Arg、Pro、Ile、Leu、Thrからなる群より選択さ
れるアミノ酸残基で、特に、Xaa³がArgまたはProであ
り；もしくは、Xaa⁴は、Arg、Lys、Ser、Glnからなる群
より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa⁴がArgまた
はLysであり；もしくは、Xaa⁵は、Ala、Gly、Asp、Thr
からなる群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa⁵
がAlaであり；もしくは、Xaa⁶は、Ser、Ile、Tyr、As
n、Leu、Val、Arg、Pheからなる群より選択されるアミ
ノ酸残基で、特に、Xaa⁶がSerまたはArgであり；もしく
は、Xaa⁷は、Met、Phe、Ile、Glu、Leu、ThrおよびVal
からなる群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa⁷
がMetまたはIleであり；もしくは、Xaa⁸は、Pro、Lys、
Thr、Gln、Asn、Leu、Ser、またはIleからなる群より選
択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa⁸がProまたはIleで
あり；もしくは、Xaa⁹が、Arg、LysまたはLeuからなる
群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa⁹がArgで
あり；もしくは、Xaa¹⁰は、Val、Ile、Lys、Ala、Pro、
Phe、Trp、Gln、LeuおよびThrからなる群より選択され
るアミノ酸残基で、特に、Xaa¹⁰がValであり；もしく
は、Xaa¹¹は、Gly、Ser、およびThrからなる群より選択
されるアミノ酸残基で、特に、Xaa¹¹がGlyであり；もし
くは、Xaa¹²は、Asp、Arg、Glu、Leu、Gln、Glyからな
る群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa¹²が、A
spまたはArgであり；もしくは、Xaa¹³は、GlyおよびAla
からなる群より選択されるアミノ酸残基であり；もしく
は、Xaa¹⁴は、AsnまたはLysからなる群より選択される
アミノ酸残基であり；もしくは、Xaa¹⁵は、Gly、Asp、L
eu、Arg、Glu、Thr、Tyr、ValおよびLysからなる群より
選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa¹⁵が、Leuまたは
Lysであり；もしくは、Xaa¹⁶が、Val、Gln、Asp、Gly、
Ile、Ala、MetおよびValからなる群より選択されるアミ
ノ酸残基で、特に、Xaa¹⁶が、ValまたはAlaであり；も
しくは、Xaa¹⁷は、His、Glu、Pro、Ala、LysおよびVal
からなる群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa
¹⁷が、GluまたはProであり；もしくは、Xaa¹⁸は、Val、
Thr、Asp、Pro、Arg、Tyr、Glu、AlaまたはLysからなる
群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa¹⁸が、Thr
であり；もしくは、Xaa¹⁹は、Arg、Pro、Ile、Leuまた
はThrからなる群より選択されるアミノ酸残基で、特
に、Xaa¹⁹が、Proであり；もしくは、Xaa²⁰は、Arg、Ly
s、Gln、およびSerからなる群より選択されるアミノ酸
残基で、特に、Xaa²⁰が、ArgまたはLysであり；もしく
は、Xaa²¹は、Ala、Asp、Thr、またはGlyからなる群よ
り選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa²¹が、Alaであ
り；もしくは、Xaa²²は、Ser、Ile、Tyr、Asn、Leu、Va
l、ArgまたはPheからなる群より選択されるアミノ酸残
基で、特に、Xaa²²が、SerまたはArgであり；もしく
は、Xaa²³は、Met、Phe、Ile、Glu、Leu、ThrおよびVal
からなる群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa
²³が、PheまたはIleであり；もしくは、Xaa²⁴は、Pro、
Lys、Thr、Asn、Leu、Gln、SerまたはIleからなる群よ
り選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa²⁴が、Proまた
はIleであり；もしくは、Xaa²⁵は、Arg、LysまたはLeu
からなる群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa
²⁵が、Argであり；もしくは、Xaa²⁶は、Val、Ile、Ly
s、Leu、Ala、Pro、Phe、Gln、TrpおよびThrからなる群
より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa²⁶が、Valま
たはIleであり；もしくは、Xaa²⁷は、Gly、SerおよびTh
rからなる群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa
²⁷が、Glyであり；もしくは、Xaa²⁸は、Asp、Arg、Gl
u、Leu、GlyまたはGlnからなる群より選択されるアミノ
酸残基で、特に、Xaa²⁸が、Argであり；もしくは、Xaa
²⁹は、GlyおよびAlaからなる群より選択されるアミノ酸
残基であり；もしくは、Xaa³⁰は、AsnまたはLysからな
る群より選択されるアミノ酸残基であり；もしくは、Xa
a³¹が、Gly、Asp、Leu、Arg、Glu、Thr、Tyr、Valおよ
びLysからなる群より選択されるアミノ酸残基で、特
に、Xaa³¹が、ArgまたはLysであり；もしくは、Xaa
³²は、Val、Gln、Asp、Gly、Ile、Ala、MetおよびThrか
らなる群より選択されるアミノ酸残基で、特に、Xaa³²
は、GlnまたはAlaであるものを含む。

図面の説明 本発明は、以下の図面とともに、その後の詳細な説明
および請求の範囲を考慮すれば、よりよく理解されるで
あろう。

図１は、EST R35464（配列番号:12）の塩基配列と、
アプロチニンにいくらか配列が類似したオープンリーデ
ィングフレームを与えるこのDNA配列の翻訳（配列番号:
13）を示している。翻訳産物は、クニッツ様阻害因子ド
メインに特徴的な、６個のシステインのうち５個（太字
で示されている）を正しい間隔でもっていた。通常、残
りのシステインによって占められている位置（コドン3
8）には、代りに、フェニルアラニンが含まれていた
（アスタリスクで示されている）。

図２は、EST R74593（配列番号:14）の塩基配列と、
クニッツ型のセリンプロテアーゼ阻害因子ドメインに相
同なオープンリーディングフレームを与えるこのDNA配
列の翻訳（配列番号:15）を示している。翻訳産物は、
クニッツ様阻害因子ドメインに特徴的な６個のシステイ
ン（太字で示されている）を正しい間隔でもっていた。
しかし、このリーディングフレームの配列には、コドン
３と23に終止コドンが含まれている。

図３は、「共通（consensus）」と表示された、ヒト
胎盤ビクニンの推定塩基配列（配列番号:9）と、それに
一致する、「翻訳された（translated）」と表示され
た、タンパク質アミノ酸配列（配列番号:10）を示して
いる。また、EST H94519（配列番号:16）、N39798（配
列番号:17）、R74593（配列番号:14）、およびR35464
（配列番号:12）の塩基配列が比較のために示されてい
る。共通配列中の下線を施した塩基は、実施例で説明さ
れるPCRプライマーの部位に対応している。翻訳された
共通配列の下線を施したアミノ酸は、その同一性が、精
製した天然のヒト胎盤ビクニンのアミノ酸の配列決定に
よって確認された残基である。塩基（ヌクレオチド）と
アミノ酸のコードは標準の一文字法であり、塩基コード
中の「Ｎ」は、特定されなかった核酸を示し、「＊」
は、アミノ酸配列中の終止コドンを示す。

図4Aは、ヒト胎盤ビクニンをコードするESTもしくは
その一部にいくらかの塩基配列相同性を有する一連のES
Tのオリジナルの重ね合わせを示したものである。参照
のために示されているのは、それぞれ、KID1およびKID2
と表示されている、ビクニン（７−64）とビクニン（10
2−159）の相対的な位置である。

図4Bは、別のESTを組み込んだ、より包括的なESTの重
ね合わせのまとめを示している。上側のＸ軸上の数字
は、最も5'側のEST配列からの最初の塩基から始まる、
塩基対の長さである。各バーの長さは、ギャップを含む
各ESTの塩基対の長さに比例している。ESTのアクセショ
ン番号は、それぞれのESTバーの右に示されている。

図4Cは、図4Bに概略的に示された、重複するESTの各
々の塩基配列に対応するアラインメントを示している。
ビクニンと表示された上側の配列（配列番号:51）は、
各位置で重複するヌクレオチドに由来する共通のオリゴ
ヌクレオチド配列を表している。数字は、EST地図の中
の塩基対の位置を表している。太線で下線を施してあ
る、EST R74593のオリゴヌクレオチド（地図上の位置9
94と1005）は、別の重複するESTのいずれにも一致して
存在しない、R74593で見られた塩基の挿入である。

図4Dは、図4C（配列番号:45）に示したビクニンに共
通するオリゴヌクレオチド配列をアミノ酸に翻訳したも
のを示している。

図4Eは、PCRに基づく増幅によって、ヒト胎盤cDNAラ
イブラリーから採られた胎盤ビクニンをコードする塩基
配列（配列番号:46）と、それに対応するアミノ酸翻訳
（配列番号:47）とを示している。

図4Fは、ヒト胎盤ラムダcDNAライブラリーから、コロ
ニーハイブリダイゼーションによって単離された、天然
のヒト胎盤ビクニンをコードするクローンの塩基配列
（配列番号:48）と、それに対応するアミノ酸翻訳（配
列番号:49）とを示している。

図4Gは、ESTの重ね合わせ（配列番号:45）、PCRに基
づくクローニング（配列番号:47）、および、従来のラ
ムダコロニーハイブリダイゼーション（配列番号:49）
によって得られた、胎盤ビクニンに対するオリゴヌクレ
オチド配列をアミノ酸に翻訳したもののアラインメント
を比較している。

図５は、スーパーデックス（Superdex）75ゲル濾過の
後の、胎盤組織にからのヒト胎盤ビクニンの精製のグラ
フを示している。図は、OD 280nmで測定した、タンパ
ク質の溶出プロファイル（実線）と、トリプシン阻害ア
ッセイでの溶出したタンパク質の活性（阻害率％が丸で
示されている）と、および、カリクレイン阻害アッセイ
での溶出したタンパク質の活性（阻害率％が四角で示さ
れている）とを重ね合わせたものである。

図６は、C18逆相クロマトグラフィーを用いた、胎盤
組織からのヒト胎盤ビクニンの精製を表示するグラフを
示している。図は、OD 215nmで測定した、タンパク質
の溶出したプロファイル（実線）と、トリプシン阻害ア
ッセイでの溶出タンパク質の活性（阻害率％が丸で示さ
れている）と、および、カリクレイン阻害アッセイでの
溶出したタンパク質の活性（阻害率％が四角で示されて
いる）とを重ね合わせたものである。

図７は、高度に精製された胎盤ビクニンのSDS−PAGE
ゲルを銀染色したもの（レーン２）と、キロダルトンで
示された一連の分子サイズマーカータンパク質（レーン
１）とを示す。

図８は、胎盤ビクニン（102−159）の発現を指令する
プラスミド（pS604）で安定的に形質転換された酵母菌
株SC101（パネル8A）またはWHL341（パネル8B）を増殖
させた、無細胞発酵ブロス中に存在するトリプシン阻害
活性の量を示している。

図９は、銀染色したSDS−PAGE（左側パネル）と、ウ
シのアプロチニンまたは胎盤ビクニン（102−159）のい
ずれかの発現を指令するプラスミドで安定的に形質転換
した酵母菌株SC101（組換え体2.4と2.5）を増殖させた
無細胞発酵ブロスの抗−胎盤ビクニン（102−159）pAb
によるウエスタンブロット（右側パネル）とを示してい
る。泳動は上から下の方向に行われている。

図10は、高度に精製された胎盤ビクニン（102−159）
のSDS−PAGEゲルを銀染色したもの（レーン２）と、キ
ロダルトンで示された一連の分子サイズマーカータンパ
ク質（レーン１）とを示す写真である。泳動は上から下
の方向に行われている。

図11は、胎盤ビクニン（102−159）（パネル11A）ま
たは胎盤ビクニン（１−213）（パネル11B）のいずれか
をコードしている、³²P標識化cDNAプローブにハイブリ
ダイズした、ヒトのさまざまな組織からのmRNAのノーザ
ンブロットの結果を示す写真である。泳動は上から下の
方向に行われている。各ブロットの右側の数字は、その
隣のRNAマーカーのサイズをキロベースで表している。m
RNAが得られた器官が、ブロットの各レーンの下に記載
されている。

図12は、合成的に短くされた胎盤ビクニン（７−64）
（パネルＡ）または102−159（パネルＢ）のいずれかに
対して作製されたウサギの抗血清による、胎盤由来の胎
盤ビクニンの免疫ブロットを示している。各パネルでレ
ーン毎の内容は、分子サイズマーカー（レーン１）；ヒ
トの胎盤から分離された天然のヒト胎盤ビクニン（レー
ン２）；合成された胎盤ビクニン（７−64）（レーン
３）；および合成された胎盤ビクニン（102−159）（レ
ーン４）である。トリシン10−20％SDS−PAGEゲルをブ
ロットして、プロテインＡで精製された一次ポリクロー
ナル抗体（20mlの0.1BSA/トリス緩衝食塩水（pH7.5）中
の８μｇのIgG）で処理し、その後、アルカリホスファ
ターゼ結合ヤギ抗−ウサギ二次抗体で現像した。泳動は
上から下の方向に行われている。

図13は、バキュロウイルス/Sf9発現系から得た３μｇ
の高度に精製した胎盤ビクニン（１−170）の、クーマ
シーブルー染色したトリシン10−20％SDS−PAGEゲルを
示したものである（レーン２）。レーン１は、分子サイ
ズマーカーを含んでいる。泳動は上から下の方向に行わ
れている。

図14は、Sf9由来のヒト胎盤ビクニン（１−170）（黒
丸）、合成した胎盤ビクニン（102−159）（白丸）、ま
たはアプロチニン（白四角）のいずれかの濃度を増加さ
せたときの、ヒト血漿のトロンボプラスチンが部分的に
活性化される時間に対する効果を比較して示したもので
ある。凝血はCaCl₂によって起こる。タンパク質の濃度
が、凝血時間の延長倍数に対して示されている。阻害を
受けない凝血時間は30.8秒であった。

発明の詳細な説明 本発明は、本明細書においてヒト胎盤ビクニンと名付
けられた新たに同定されたヒトのタンパク質を含み、こ
れは、クニッツ型の２つのセリンプロテアーゼ阻害因子
ドメインを有している。本発明は、また、手術を受けて
いる患者や重症な外傷を負った患者の、手術時の出血を
低減させるのに有用な胎盤ビクニンとその断片を含む薬
剤組成物を含む。

また、本発明は、手術を受けている患者や重症な外傷
を負った患者の手術時の出血を低減させるための方法
で、有効な量の、本発明で開示されたヒトセリンプロテ
アーゼ阻害因子を生物学的に適合性のあるビヒクルに入
れて、患者に投与するための方法を提供する。

胎盤ビクニン、分離されたドメイン、およびその他の
変異体の好ましい応用は、大量の出血の可能性がある外
傷や手術によって起こる出血の低減を図るためのもので
ある。これらの方法と組成物により、全供血や血液製剤
に対する需要を減少させるか消滅させ、それによって、
手術費用だけでなく、感染の危険やその他の有害な副作
用を減少させる。このように、この方法は、先天性の、
または、その他の手術前に血液凝固因子の欠乏を患って
いない通常の患者の出血を減少させるのに有用である。
出血の低減は、手術時の出血の低減として、また、手術
後の出血の減少として、または、その両方に見られる。
好ましい手術上の応用には、胸部および腹部の手術、全
部または一部の股関節部置換手術、ならびに、眼の上皮
に傷害をもつ患者を治療するための手術に用いることを
含むが、これらに限定はされない。好ましい胸部手術に
は、冠状大動脈のバイパス、心臓および大動脈の動脈瘤
の切除、および食道の静脈瘤の手術、および、冠状動脈
のバイパス手術が含まれるが、これらに限定はされな
い。好ましい腹部手術には、肝臓移植、根治的な前立腺
の切除、結腸の憩室炎に対する手術、腫瘍の縮小、腹部
大動脈の手術と十二指腸潰瘍手術、および、肝臓または
脾臓の外傷の修復が含まれるが、これらに限定はされな
い。外傷を治療するための好ましい利用には、事故現場
で、例えば、四肢の喪失や重大な胸部／腹部傷害で、苦
しむ重症患者を安定させるための使用が含まれるが、こ
れらに限定はされない。手術によって起こる出血の低減
させるために用いる場合には、手術の前、または手術の
最中に、胎盤ビクニン、分離されたドメイン、またはそ
の他の変異体を投与することが好ましいが、一方、外傷
の場面で用いる場合には、胎盤ビクニンの変異体、分離
されたドメイン、またはその他の変異体を、事故現場に
向かう救急車に持ち込み、傷害が起きたらできるだけ早
く投与するべきである。

第XII因子（ヘイグマン因子としても知られている）
は、循環血の中に、約29〜40μg/mlで、チモーゲンの形
（80kD）で見出されるセリンプロテアーゼで（Pixley
ら、（1993）Meth.in Enz.,222,51−64参照）、組織お
よび血漿のカリクレインによって活性化される。いった
ん活性化されると、第XII因子は、血液または血漿が
「異物」または陰イオンを帯びた表面に接触すると活性
化される内因性凝固経路に関与する。いったん活性化さ
れると、次に、第XII a因子が、第XI因子、プレカリク
レイン、および補体系のC1とを含む、数多くその他の血
漿プロテアーゼを切断し、活性化させることができる。
このように、活性化されたカリクレインが、ブラジキニ
ンを放出するキニノーゲンを切断できるため、第XII因
子は、低血圧反応の原因に含まれるのかもしれない（Co
lman、（1984）J.Clin.Invest.,73,1249参照）。

敗血症は、細菌の内毒素またはリポ多糖（LPS）が原
因の細菌感染により生じる疾患である。第XII因子をLPS
と接触させると、第XII因子の活性化がもたらされる。
敗血症患者は、しばしば、LPSによる第XII因子の活性化
が原因かもしれない血管内凝固という病徴を示す。敗血
性ショックは、細菌感染によって起き、発熱、全身性血
管抵抗の低下、および動脈血圧の低下と関連している。
これは、米国の集中治療室での死亡のごく普通の原因で
あり、敗血性ショックで死ぬ患者の75％が、持続性の低
血圧症に罹っている（Parilloら、（1989）Ann.Rev.Me
d.,40,469−485を参照）。

成人呼吸窮迫症候群（adult respiratory distress s
yndrome）は、肺水腫、低酸素血症、および、肺のコン
プライアンスの減少などによって特徴づけられる。この
病気の原因は、今のところ未知であるが、血液凝固のタ
ンパク質分解性の経路とフィブリン溶解系が関係してい
ると考えられている（Carvalhoら、（1988）J.Lab.Cli
n.Med.,112:270−277を参照）。

本発明のタンパク質は、また、第XII因子の活性因子
であるカリクレインの新規なヒトのクニッツ型阻害因子
でもある。したがって、本発明のもう一つの目的は、敗
血性ショック、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、子かん前
症、多臓器不全、および汎発性血管内凝固症候群（DI
C）などの、全身性炎症反応の予防的または治療的な処
置をするための方法を提示することである。本発明のペ
プチドを、予防または治療のために投与することは、こ
れらの炎症状態を緩和し、患者にとっては有益である。

プラスミンは、細胞外の基質分解と、基質−金属プロ
テアーゼ（matrix−metallo protease、MMP）カスケー
ドの活性化において、重要な役割を果たしている。これ
らのプロテアーゼは、まとまって、血管形成／新生血管
形成の過程にある内皮細胞と、転移過程にある癌細胞と
の両者による移動と組織侵襲を媒介する。新生血管形成
は、腫瘍の増殖を支えるのに不可欠であり、転移は、腫
瘍が広がるのを媒介する過程であり、患者の予後が非常
に悪いことに関連する。

いくつかの臨床前の研究によって、アプロチニンに類
似したプロテアーゼ特異性をもつクニッツ様セリンプロ
テアーゼ阻害因子が、癌に対する薬剤として有用なこと
が示唆された。例えば、アプロチニンは、非常に侵襲性
が高い線維肉腫を罹ったハムスターか、または、同じよ
うな悪性の強い乳がんを罹ったマウスに投与すると、腫
瘍壊死が増加するとともに、腫瘍の増殖と侵襲を迎えた
（Latnerら、（1974）,Br.J.Cancer 30:60−67;Latner
及びTurner、（1976）,Br.J.Cancer 33:535−538）。さ
らに、ルイス肺癌細胞を接種したオスのC57B1/6Crマウ
スに、接種後１日から14日目に、腹腔内からアプロチニ
ン200,000KIUを投与すると、肺への転移は50％抑制され
たが、原発性の腫瘍塊には何の効果もなかった（Girald
iら、（1977）Eur.J.Cancer,13:1321−1323）。同様
に、C57B1/6Jマウスにルイス肺癌細胞を接種した13日か
ら16日後の毎日、腹腔内から10,000KIUを投与すると、
原発性の腫瘍の増殖へは影響することなく、肺への転移
を90％抑制した（Uetsujiら、（1992）,Jpn.J.Surg.22:
429−442）。この同じ実験において、プラスミンかカリ
クレインを同じ投薬スケジュールで投与すると、肺への
転移が増加することが示された。これらの結果から、著
者らは、癌患者への手術時のアプロチニン投与は、転移
の可能性を低下させるであろうと示唆していると考え
た。BlackとSteger（1976,Eur.J.Pharmacol.,38:313−3
19）は、ラットにおいて、アプロチニンが、移植した齧
歯類のマーフィー−シュトラムリンパ肉腫（Murphy−St
rum lymphosarcoma）の増殖を阻害することを発見し、
この効果が、キニン形成酵素の阻害に関わることを示唆
した。３−メチルコラントレン処理によって生じた自発
性の扁平上皮細胞癌を一つずつもつメスのddYマウス
に、10,000KIUのアプロチニンを一日２回ずつ毎日、７
週間、腹腔内注射したところ、原発性腫瘍の増殖を90％
抑えた。腫瘍の後退が見られた動物もいた。ビヒクルだ
けで処理した動物は、７週間以内に死んだが、アプロチ
ニンで処理したグループはすべて生き残った。腫瘍増殖
の減少は、角質増殖を伴っていた（Ohkoshi、Gann（198
0）,71:246−250）。

臨床的には、手術によって治癒したグループの26人の
患者で、アプロチニンを静脈注射により受け入れた患者
は、腫瘍の再発なしに、術後２年で70％の生存率を示し
たが、同時に偽薬を与えられた26人の患者グループは、
かなりの腫瘍再発率を伴いながら、38％の生存率しか示
さなかった（Freemanら、Br.Soc.Gastroenterol.（198
0）supplement A:902）。ある症例研究（Guthrieら、J.
Clin.Pract.（1981）35:330−332）において、頚部に進
行した癌をもつ患者に、ブロモクリプチンとアプロチニ
ンとを投与したところ、緩解がもたらされた。１カ月に
全部で７日間、500,000KIUの腹腔内丸薬を８時間おき
に、それと同時に、６時間につき200,000KIUの量で、継
続的にアプロチニンを静脈注射して、アプロチニンを投
与した。アプロチニンに対するアレルギー反応が発生し
たために、４か月目の終わりに、処置を止めた。より新
しい証拠は、転移に対する、アプロチニンのこれらの効
果を標的とするプラスミンの役割を、さらに強調してい
る。

これらの現象のメカニズムは、アプロチニンが癌細胞
系の侵襲能力を遮断するという事実に関連するかもしれ
ない（Liu G.ら、Int.J.Cancer（1995）60:501−50
6）。さらに、本発明のタンパク質は、プラスミンとカ
リクレインの強力な阻害因子でもあるため、抗癌剤とし
て使用することも考えられる。例えば、当初の腫瘍侵襲
である新生血管形成を制限することにより、原発癌の増
殖を阻害するときや、および、組織浸潤を阻害して、転
移を遮断するときに使用することが考えられる。この化
合物は、腫瘍に局所的に投与してもよいし、また、全身
的に投与してもよい。好ましい治療方式において、腫瘍
縮小させる手術時に、転移の危険を最小限にするため
に、このタンパク質を投与してもよい。このような養生
法においては、この化合物の血液を節約できるという特
質が、より明快な外科分野という観点を提供するとき
に、さらなる長所となるだろう。もう一つの好ましい投
与方式は、MMP阻害因子、または化学療法のいずれかと
組み合わせた治療方式であろう。さらに好ましい投与方
式は、腫瘍細胞、または、それらに関連する間質および
脈管床の中で、胎盤ビクニンの選択的な発現を実現する
ために設計された、局所的に投与された遺伝子治療の方
式である。

治療の標的となる癌の好ましいタイプは、高い転移能
力を示す乳がん、結腸癌、肺癌、前立腺癌、および卵巣
癌などの、血管に依存する固形の腫瘍で、肺への輸送に
よる肺癌、肝臓の転移部位に対する肝臓への輸送による
結腸癌、または、皮下への輸送による頭や首の癌、また
はメラノーマなどの皮膚癌などに、高濃度のタンパク質
を局所的に輸送できるものであろう。本発明のタンパク
質は、ヒトに由来するものであるため、再使用に際し
て、Guthrieら、前掲、によって観察されたような、ア
レルギーやアナフィラキシー反応を伴う可能性はより低
いであろう。

さらに、本発明のタンパク質を、内因性凝固経路の活
性化を伴う血栓塞栓症の合併症を低減するのに使用する
ことが考えられる。これには、末期癌患者における、頻
度の高い死亡原因である肺塞栓症を防止することが含ま
れる（Donati MB.、（1994）,Haemostasis 24:128−13
1）。

脳および脊椎の水腫は、外傷性の脳および脊髄損傷、
発作、大脳虚血、大脳およびクモ膜下出血、外科手術
（開心手術を含む）、脳炎や髄膜炎などの感染症、なら
びに、サルコイドや病巣または散在性腫瘍などの慢性肉
芽腫によって起きる合併症であり、これらの病気の後
に、再発病率や死亡率のレベルが高いことの原因となっ
ている。ブラジキニンは、血液脳関門を破壊すること
が、実験的に知られており（Greenwood J.、（1991）,N
euroradiology,33:95−100;Whittleら、（1992）,Acta
Neurochir.,115:53−59）、頚動脈の中へのブラジキニ
ンの注入は、普通の頚動脈閉塞を起こさせた突発性高血
圧症ラット（SHR）において、脳水腫を誘発した（Kamiy
a、（1990）,Nippon Ika Daigaku Zasshi 57:180−19
1）。ブラジキニンの濃度の上昇が、外傷をつけたラッ
トの脊髄を含むモデルにおいて、外傷の後、細胞外液の
中（Xuら、（1991）,J.Neurochem.,57:975−980）、お
よび、脳虚血の結果脳水腫を起こしたラットの血漿と組
織の中で（Kamiyaら、（1993）,Stroke,24:571−575）
見られた。ブラジキニンは、高分子量キニノーゲンか
ら、カリクレインを含むセリンプロテアーゼによって放
出され（Coleman（1984）J.Clin.Invest.,73:1249）、
セリンプロテアーゼ阻害因子のアプロチニンが、SHRラ
ット（Kamiya、（1990）,Nippon Ika Daigaku Zasshi 5
7:180−191;Kamiya、（1993）,Stroke,24:571−575）
と、脳に低温傷害を起こしたウサギ（Uterbergら、（19
86）,J.Neurosurgery,64:269−276）とにおいて、脳虚
血から起きる脳水腫を大幅に阻害することが分かった。

これらの観察は、ブラジキニンなどのキニンが、高分
子量キニノーゲンから局部的なタンパク質分解によって
放出され、その後、ブラジキニンに誘導された血液脳関
門の透過性の上昇が起きることによって、脳水腫が起き
ることを示している。したがって、胎盤ビクニンと、そ
の断片は、水腫を起こす危険のある患者、特に、死亡や
脳損傷の危険性が高い患者における水腫を予防するため
の薬剤と考えられる。これには、頭部と脊髄の外傷患
者、多外傷患者、脳または脊髄およびそれに結合した血
管の手術、または、開心手術を含む、一般的な手術を受
けている患者、発作、脳またはクモ膜下出血、脳の感染
症、脳の慢性肉芽腫、または病巣または散在性腫瘍、お
よび、脳腫瘍、または血液脳関門の崩壊を含む多発性硬
化症を患う患者、または、その他、脳または脊髄の炎症
作用を患う患者が含まれる。患者は、輸液または丸薬注
射で、静脈内または頭蓋内への胎盤ビクニンの投与を受
ける。その後１週間から３週間にわたり、胎盤ビクニン
の追加用量の投与を受けることもできる。用量レベル
は、循環する濃度が、ブラジキニンや、セリンプロテア
ーゼの作用によって形成される、その他の血管作用性ペ
プチドの、血漿におけるレベルの上昇を中和するのに必
要な濃度を越え、水腫を抑えるのに十分になるよう設計
されていよう。このタンパク質は、ヒトに由来するた
め、この治療過程における反復投与は、このタンパク質
に対する免疫反応の発生をもたらさない。胎盤ビクニン
とその断片は、単一治療法、または予防法のため、およ
び、神経治療薬や神経保護薬などのその他の薬剤とを組
み合わせて用いるためのものと考えられる。

新しい証拠（Dela Cadena R.A.ら、（1995）FASEB J.
9:446−452）によって、接触活性化経路が、関節炎と貧
血の病因に寄与するかもしれないこと、および、カリク
レイン阻害因子が、治療上有益であるかもしれないこと
が示されている。したがって、本発明のプロテアーゼ阻
害因子は、ヒトのカリクレインを阻害することができる
ために、人間の関節炎と貧血の治療薬と考えられる。

アプロチニンによる、男性の非インシュリン依存性糖
尿病（NIDDM）の治療により、全グルコース摂取量が有
意に向上し、インシュリンの代謝除去率が減少した（La
urentiら、（1996）,Diabetic Medicine 13:642−64
5）。したがって、本発明に係るヒトのタンパク質は、N
IDDMを治療するための薬剤として継続的に使用されるこ
とが考えられる。

早産の危険がある患者を、尿トリプシン阻害因子で、
２週間の間、毎日治療したところ、子宮収縮の再発を有
意に低下させた（Kanayamaら、Eur.J.Obstet.Gynecol.
＆ Reprod.BIol.67:133−138）。したがって、本発明の
ヒトタンパク質は、早産の防止に用いられることが考え
られる。

アプロチニンは、TGFbによって阻害されるプロセスで
ある、マウスの筋原細胞の培養で分化を刺激することが
分かっている（Wells及びStrickl、Development,（199
4）,120:3639−3647）。TGFbは、限定的なタンパク質分
解によって活性化される、不活性なポリペプチド前駆体
として存在する。アプロチニンの作用機構には、TGFb前
駆体を成熟した活性型にするプロテアーゼを阻害するこ
とが含まれると提言されている。TGFbは、さまざまな線
維症傷害部において上昇制御されることが分かってお
り、抗線維症治療の標的である可能性があると長い間考
えられていた。例えば、肺線維症のラットのモデルにお
いて、TGFbの濃度は、ブレオマイシンによって誘導され
る炎症の程度に比例していた。さらに、肺胞マクロファ
ージにおけるプラスミンのレベルは、成熟したTGFbのレ
ベルと一致しており、プラスミン阻害因子ａ−２−抗プ
ラスミンの添加によって、マクロファージによるTGFb前
駆体の翻訳後の活性化を排除した（Khalら、（1996）,A
m.J.Respir.Cell Mol.Biol.15:252−259）。このデータ
は、プラスミンが、肺胞マクロファージによる活性TGFb
の形成に寄与していることを示唆しており、また、この
過程が、ブレオマイシンにより誘導される肺の炎症にお
いて、病原としての役割を果たしていることを示唆して
いる。

これらの観察を考慮すると、胎盤ビクニンとその断片
は、肺、肝臓、腎臓、皮膚（強皮症）の線維症を含む、
さまざまな線維症障害に対する治療薬と考えられる。

エアロゾル化されたアプロチニンは、致死量のインフ
ルエンザウイルスまたはパラミクソウイルスのいずれか
に感染したマウスの50％以上を防御することが示された
（Ovcharenko及びZhirnov、Antiviral Research,（199
4）,23:107−118）。致命的な出血性気管支肺炎の発生
が抑制されること、および、体重当りの摂取量が標準化
されることも、エアロゾル化したアプロチニンによる治
療で注目された。これらの観察に照らして、胎盤ビクニ
ンとその断片は、さまざまな呼吸器に関連した、インフ
ルエンザ様疾患に対する治療薬と考えられる。

本発明のヒト胎盤ビクニン、その単離されたドメイ
ン、およびその他の変異体は、天然のアプロチニン、ま
たは別の阻害プロファイル、特に大量の使用を必要とす
るプロファイルをもつアプロチニンの類似体について示
唆されている、医学／治療に応用するために使用するこ
とが考えられる。これらには、トリプシン、プラスミ
ン、カリクレイン、エラスターゼ、カテプシンＧ、およ
びプロテイナーゼ−３などのヒトのセリンプロテアーゼ
を阻害する能力によって、ヒトのタンパク質の使用が指
示される病気が含まれ、急性膵炎（膵臓エラスターゼと
トリプシン）、炎症、血小板減少症、血小板の機能の保
存、臓器保存、傷害の治癒、ショック肺、内毒素ショッ
クおよび手術後の合併症を含むさまざまな形のショッ
ク；線溶亢進性出血などの血液凝固阻害；特に、例え
ば、膵炎および放射線によって誘発された腸炎などの、
臓器傷害の治療と予防のための、急性または慢性の炎症
反応、免疫性脈管炎、糸球体腎炎、および関節炎のいく
つかのタイプのような、複合体によって媒介される炎症
性反応；特にリューマチ性関節炎における膠原病；代謝
に関連した沈着物によって起きる関節炎のいくつかのタ
イプ（例えば、通風）；アテローム性硬化症（血清エラ
スターゼ）または肺気腫（好中球エラスターゼ）など
の、臓器の結合組織部分の弾性成分の変性；成人呼吸窮
迫症候群、炎症性腸疾患、および乾癬が含まれるが、こ
れらに限定はされない。

主な思いがけない発見は、ビクニン（７−64）とビク
ニン（102−159）をコードする合成ペプチドは、活性の
あるプロテアーゼ阻害因子の生物活性をもつ、適正な３
次元構造に正しく折り畳まれることである（それぞれ、
実施例２と１）。折畳みに当たって、ビクニンのこれら
の断片の各々は、各場合における形成と一致して、各断
片の６個のシステイン残基の間にできる、３つの鎖内ジ
スルフィド結合に、６マスユニットの減量が起きた。も
う一つの驚くべき発見は、ビクニン（７−64）、ビクニ
ン（102−159）、およびビクニン（１−170）をコード
する合成ペプチドは、プラスミンと、組織カリクレイン
と血漿カリクレインの両方とを強度に阻害する（それぞ
れ、実施例４、３および10）。Trasylol（登録商標）に
よるプラスミンとカリクレインの阻害は、Trasylol（登
録商標）が、開心手術の最中の血液損失を低減するメカ
ニズムに関係すると考えられている。本発明者らは、思
いがけずに、本発明のクニッツドメインの特異性を発見
したことから、これらの部位は、かなりの出血がある手
術や外傷の過程で血液を節約するための、または、プラ
スミンおよび／またはカリクレインが有益である、別の
症状のための適当な治療薬となる。

さらに、本発明者らは、本開示（実施例10）におい
て、胎盤ビクニン（１−170）が第XI a因子の強力な阻
害因子であり、第X a因子の中程度の阻害因子であるこ
とを明らかにした。第XI a因子は、血液凝固の内因性経
路において、不可欠な役割をもち、不活性な第IX因子
を、活性のある第IX a因子に相互転換させる役目を果た
している。このように、胎盤ビクニンは、この内因性経
路の２つの主要酵素であるカリクレインと第XI a因子を
阻害する。これらの観察に一致して、本発明者らは、胎
盤ビクニン（１−170）が、内因性経路によって起こる
凝固の速さの測定値である、活性化された部分的なトロ
ンボプラスチン時間の強力な阻害因子であることも示し
た。一方、本発明者らは、胎盤ビクニン（１−170）が
組織因子VII a複合体の非常に弱い阻害因子であること
を示し、外因性の凝固カスケードの制御において重要で
はないことを示唆した。これらの予期できない発見に基
づくと、胎盤ビクニンは、凝固の内因性経路の活性化が
病気のメカニズムに有意に寄与する病気のための治療薬
になると考えられる。このような病気の例には、外傷後
ショック、および汎発性血管内凝固症候群が含まれるで
あろう。

本発明のクニッツドメインの重要な利点は、それらが
ヒトのタンパク質であり、Trasylol（登録商標）よりも
正の荷電度が低いこと（実施例１）であるが、これらに
よって、タンパク質を大量に投与しても腎臓に与える危
険が少なくなる。ヒトに由来するため、本発明のタンパ
ク質は、Trasylol（登録商標）を同量投与したときに較
べると、望ましくない免疫学的反応の危険をかなり減ら
して、人間の患者に投与することができる。さらに、ビ
クニン（102−159）、ビクニン（７−64）およびビクニ
ン（１−170）は、生体外で、Trasylol（登録商標）よ
りも有意に強力な、血漿カリクレインの阻害因子である
（実施例３、４、および10）。したがって、ビクニン
と、その断片は、生体内で患者の出血を低下させるに当
たって、より有効であると期待される。

投与されるセリンプロテアーゼ阻害剤の量は、上記の
正常な血漿レベルを提供するために十分な量でなければ
ならない。冠状動脈バイパス手術（CABG）の最中と術後
の出血を予防的に減少させるために、能力の差異を考慮
に入れながら、Trasylol（登録商標）の代りに、本発明
のタンパク質を用いることができる。Trasylol（登録商
標）の用法は、Trasylol（登録商標）補遺Ａとして載せ
てある医学用卓上参考書（Physicians Desk Referenc
e）（1995）に概説されている。簡単にいうと、仰向け
に寝せた患者に、麻酔を誘導した後、胸骨切開を行なう
前に、施用量のヒト胎盤ビクニン、その単離されたドメ
イン、またはその他の変異体を、約20〜30分かけてゆっ
くりと投与する。一般的に、全投与量は、患者の体重
や、手術時間の長さなどの要素に応じて、約２×10⁶KIU
（カリクレイン阻害単位）と約８×10⁶KIUとの間になる
よう用いる。好ましい施用量は、全部で、100万から200
万カリクレイン阻害単位（KIU）である。施用量が完全
であれば、次に、定常的に輸液投与し、手術が完了し、
患者が手術室を出るまで注入を続ける。好ましい定常的
な注入量は、１時間当り約250,000から500,000KIUの範
囲である。心肺バイパス回路の呼び水の中に、心肺バイ
パスを作る前に呼び水の一部を置き換えて、ポンプの呼
び水となる量を加える。好ましいポンプの呼び水となる
量は、全部で、約100万から200万KIUを含む用量であ
る。

本発明のタンパク質は、当技術分野において既知の態
様に処方された薬剤組成物に用いられる。このような組
成物は、活性成分と、想定された投与方式と投薬形態に
応じて、薬学上許容される、一つ以上の担体、希釈剤、
充填剤、結合剤、およびその他の賦形剤を含む。当業者
によって知られている、治療薬としての活性のない無機
または有機の担体には、ラクトース、コーンスターチ、
またはそれらの派生物、タルク、植物油、蝋、油脂、ポ
リエチレングリコールなどのポリオール、水、ショ糖、
アルコール類、グリセリンなどが含まれるが、これらに
限定はされない。さまざまな保存剤、乳化剤、分散剤、
着香剤、湿潤剤、抗酸化剤、甘味料、着色料、安定剤、
塩類、緩衝液なども、処方剤の安定性を補助したり、活
性成分の生物学的有効性を高めるのを補助したり、ま
た、経口投与の場合には、受け入れやすい風味と香りの
処方剤をえるための必要に応じて加えることができる。
このような組成物で用いられる阻害剤は、もともとの化
合物そのものの形状にあるかもしれないし、場合によっ
ては、治療薬として許容される塩の状態になっているか
もしれない。本発明のタンパク質は、単独で投与するこ
とも、さまざまな組み合わせで投与することも、また、
別の治療薬組成物と組み合わせて投与することもでき
る。このように処方された組成物が、当業者により既知
の適当な方式に応じて、阻害剤の投与に必要なものとし
て選ばれる。

非経口投与法には、静脈内（i.v.）、皮下（s.c.）、
腹腔内（i.p.）、および筋肉内（i.m.）経路が含まれ
る。静脈内投与は、薬剤のピークの血漿内濃度を、必要
に応じて、急速に制御するために用いることができる。
または、静脈内カテーテルによって、望みの速度で、継
続的に薬剤を投与することもできる。適当なビヒクルに
は、注射用の滅菌水、滅菌された緩衝液、または、滅菌
した整生理食塩水などの滅菌した、非発熱性の液状希釈
剤が含まれる。得られた組成物を、注射または輸液によ
って、手術前、および／または手術中に患者に投与す
る。

半減期を改善させ、炎症に関係する好中球やマクロフ
ァージなどの食作用胞へ薬剤を向かわせるには、リポソ
ーム中の薬剤が捕捉されることで促進することができ
る。リポソームの外側に、胃腸管や肺のような、臓器／
組織特異的な高分子に結合するリガンドを結合させるこ
とによって、リポソーム指向性の選択性を向上させるこ
とが可能なはずである。あるいは、分解性のミクロスフ
ァー（小球体、例えば、ポリ−DL−ラクチド−コ−グリ
コリドを含む）の中に薬剤を包み込むか、包み込まない
で、または、コラーゲンを含む保護的処方剤による、筋
肉内、または皮下への沈着物の注射を用いて、薬剤の放
出を長時間維持するようにできる。投薬形態の利便さを
向上させるために、パーキュシールシステム（percusea
l system）のように、腹腔内に埋め込んだ貯臓器と隔膜
を使用することができる。インジェクターペン（例え
ば、Novo PinまたはＱ−pen）、または、針なしジェッ
トインジェクター（例えば、Biojet、Mediject、または
Becton Dickinson）のいずれかを用いて、便利さと患者
のコンプライアンスの向上をもたらすこともできる。カ
ニューレによって、望みの部位に輸送する、埋め込み可
能なポンプを用いて、正確に制御された放出の実現も可
能になる。実施例には、ALZET浸透圧ポンプなど、ALZA
から購入可能な、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプが含
まれる。

セルロース、ポリアクリル酸、またはポリカーボフィ
ルを含む、生物性接着性の粒状の担体（＜200mm）に、
リン脂質やアシルカルニチンなどの吸着促進剤ととも
に、薬剤を取り込ませることによって、鼻からの輸送を
行なうことができる。市販で利用可能なシステムには、
Dan BiosysとScios Novaによって開発されたシステムが
ある。

肺への輸送は、循環血液の中に薬剤を投与する非経口
法の代表である。気道下部の上皮は、非常に透過性が高
く、分子量が約20kDaまでの広い範囲のタンパク質を透
過させる。マンニトール、スクロース、またはラクトー
スなどの適当な担体の中に薬剤を含む、ミクロンサイズ
の乾燥粉末が、Inhale（登録商標）、Dura（登録商
標）、Fison（Spinhaler（登録商標））、およびGlaxo
（Rotahaler（登録商標））などの乾燥粉末吸入器、ま
たはAstra（Turbohaler（登録商標））プロペラントに
よるメーター付き薬剤吸入器を用いて、遠隔の肺胞表面
に輸送することができる。リポソーム入り、または、リ
ポソームなしの溶液処方剤が、超音波噴霧器を用いて輸
送されうる。

消化用プロテアーゼの活性が低い結腸の中に薬剤を放
出するように設計された錠剤、コートされた錠剤、糖衣
錠、硬いあるいは柔らかいゼラチンカプセル、溶液、乳
剤、懸濁剤、または腸溶性のコートされたカプセルの中
に薬剤を組み込み、経口輸送を行なうことができる。後
者の実施例には、ALZA社のOROS−CT/Osmet（登録商標）
システム、および、シェーラードラッグデリバリーシス
テム（Scherer Drug Delivery Systems）のPULSINCAP
（登録商標）システムが含まれる。別のシステムでは、
結腸特異的なバクテリアのアゾレダクターゼによって分
解されるアゾ−架橋されたポリマー、または、結腸での
pHの上昇によって活性化される、pH感受性のポリアクリ
レートリマーが用いられる。上記のシステムは、広い範
囲の有効な吸着促進剤とともに用いることができる。直
腸への輸送は、座薬の中に薬剤を取り込ませることによ
って行なうことができる。

好ましい医学的な応用において、手術時の出血を低減
させるための、本発明の胎盤ビクニン変異体の好ましい
投与方法は、非経口的に、好ましくは中枢ラインを通る
静脈内経路によるものである。

用いられるべき薬剤組成物の量は、受容者と治療を受
けている病状とによる。必要量は、当業者に既知のプロ
トコールによって、不必要な実験をすることなく決定す
ることができる。あるいは、病状を治療するために阻害
されなければならないプラスミンまたはカリクレインな
どの標的プロテアーゼの量を決定して、計算することが
できる。本発明において考えられている活性物質は、無
毒であると考えられるので、治療には、好ましくは、活
性剤としての最適な必要量よりも過剰に投与することが
含まれる。

さらに、胎盤ビクニン、単離されたドメイン、その他
の変異体を、親和性に基づいた分離法を用いて、ヒトを
材料として採った同族のプロテアーゼなど天然の物質を
単離するために用いてもよいし、また、さらに、組織分
布と胎盤ビクニンの有用な機能を探すために用いること
ができる、プロテアーゼに対する抗体を誘導するために
用いることもできる。

ヒト配列データの検索 機能においてアプロチニンと相同なヒトのタンパク質
とはっきりしたわかるものが存在することを、NCBI（メ
リーランド州、国立生物学情報センター）の発現配列デ
ータベース（以後、dbESTという）に対して、以下に示
す独自の配列エントリーの解析行い、導き出した。TBla
stNアルゴリズム（BLAST、すなわち、基本的な部分配列
比較検索ツールは、問い合わせ配列とデータベース中の
すべての配列、タンパク質または塩基配列のどのような
組み合わせとの間の類似性を検索するために、Altschul
ら、（1990）J.Mol.Biol.215:403−410の方法を用いて
いる）を用いて、ウシのプレプロアプロチニンであるTr
asylol（登録商標）の配列に相同性がある塩基配列を得
るために、データベースを調べた。この多数のクローン
を検索し、アプロチニンと相同な機能を有するヒトのタ
ンパク質に相当するような推定アミノ酸配列をコードす
る可能性がある２つの特定のクローンに絞り込んだ。選
択された塩基配列は、ヒト胎盤DNAライブラリーから作
成されたR35464（配列番号:12）とR74593（配列番号:1
4）であった。R35464に関して、最も長いオープンリー
ディングフレームの翻訳タンパク質配列（配列番号:1
3）は、クニッツドメイン共有結合構造を形成するのに
重要な６個のシステインのうち１個を失っており、これ
は、R35464の塩基配列からは、機能的な阻害因子を得ら
れないことを意味している。同様に、クローンR74593の
最も長いオープンリーディングフレームの翻訳したもの
（配列番号:15）は、クニッツ様配列コードしている領
域の5'側に終止コドンを含んでいた。これは、この配列
が、機能的な分泌型クニッツドメインが得られるように
は翻訳されないことを意味している。これらの配列の意
義自体は不明である。それらは、ａ）偽遺伝子の産物で
ある、ｂ）mRNAの非翻訳領域である、または、ｃ）不正
確に配列決定された翻訳可能なmRNAの産物であることを
示している可能性がある。

ヒトビクニンの発見 実際のヒトの配列を特異的に分離し、決定するため、
R35464とR74593の中にある、発明者らがクニッツ様配列
であると提唱している配列をコードするcDNAのセグメン
トの5'と3'に位置する配列にハイブリダイズできるよう
にcDNAプライマーを設計した。R74593のクニッツ様配列
をコードする断片を増幅するために用いられたプライマ
ーは、CGAAGCTTCATCTCCGAAGCTCCAGACG（Hind III部位を
もつ3'側プライマー、配列番号:33）と、AGGATCTAGACAA
TAATTACTGACCAAGGA（Xba I部位をもつ5'側プライマー、
配列番号:34）であった。

これらのプライマーは、クローンテック（Clontech）
社のヒト胎盤cDNAライブラリー（MATCHMAKER、カタログ
番号HL4003AB、Clonetech Laboratories、カリフォルニ
ア州パロアルト）からの500塩基対の産物を、PCR（30サ
イクル）で増幅するために用いられ、この産物は、ブル
ースクリプト−SK⁺（Buluescript−SK⁺）にサブクロー
ニングされて、シーケナーゼ（登録商標）（Sequenas
e）キットバージョン2.0を用いて、T3プライマーによっ
て配列決定された。驚いたことに、本発明者らのプライ
マーを用いて得られた断片の配列は、dbESTデータベー
スに載せられているR74593クローンの配列とは異なって
いた。特に、本発明者らの新しい配列は、終止コドンと
推定されるものに対して3'に挿入されたグアノシン塩基
をもう一つもっていたが、クニッツ様配列をコードして
いるセグメントの5'側には無かった（図３）。付加的な
Ｇの挿入によって、終止コドンがずれて、クニッツ様ド
メインに関するリーディングフレームからなくなった
（R74593の修正された配列の114番目の塩基対にあるG;
図３）。

その後、R74593のクニッツ様ペプチド配列に相同な配
列をdbESTに照会したところ、ヒトの網膜ライブラリー
に由来するH94519が得られ、またN39798が得られた。こ
れらの配列は、R35464が特徴的なシステイン６個を全て
含んでいる以外、R35464にコードされているクニッツ様
ドメインと殆ど同一のクニッツ様配列を含んでいた。各
々の塩基配列を、R74593（114番目の塩基対にＧを挿入
して修正したもの）とR35464の配列とに重ね合わせたも
のを用いて、部分的なヒト胎盤ビクニン（配列番号:9;
図３）の共通配列を得た。共通配列を翻訳すると、それ
ぞれ、アミノ酸残基17〜64と102〜159の領域にある、２
つの完全なクニッツ様ドメイン配列を含む、−18残基か
ら＋179残基の範囲にあるオープンリーディングフレー
ムが得られた（図3;完全な翻訳、配列番号:10）。

R35464の配列で、dbESTを検索して、さらに5'側配列
を得ようとさらに努力してみた。この検索から得た可能
な組み合わせで、付加的な5'配列をもつものを、さらに
交替して用いて、dbESTを再検索した。このように巡回
するような方法で、一連の5'側で重複する配列が同定さ
れた。これには、クローンH16866、T66058、R34808、R8
7894、N40851およびN39876が含まれる（図４）。これら
の配列のいくつかのアラインメントは、共通の翻訳タン
パク質配列の合成の開始部位として使われている5'ATG
が存在することを示唆している。この選ばれた情報か
ら、今や、ヒトアプロチニンに相同な機能をもつヒトタ
ンパク質の塩基配列とポリペプチド配列とを、選択的に
スクリーニングし、決定することが可能になった。

dbESTを再検索したところ、図4Bに概略を示した、多
数の新しいESTが明らかになった。これらの追加的なEST
との重複によって、図３に示された最初のオリゴヌクレ
オチド配列の5'端と3'端を超えて延びた、ずっと長い共
通のオリゴヌクレオチド配列（図4C）を構築することが
可能になった。実際、全長1.6キロ塩基の新しい配列
は、3'ポリ−Ａテールまで延びていた。配列に沿って、
各塩基対の位置で重複するESTの数が増加したために、E
ST R74593の3'末端で重複する配列のような、一定の位
置での信頼性のレベルが向上した（図３）。この領域に
ある重複ESTのいくつかで、R74593と比較すると、２つ
の重要な塩基の欠失があるのが確認された（図4Cに太線
で下線を施して位置を示した、地図上の位置は994と100
5）。ビクニンをコードしているフレームの、新しい共
通配列の翻訳（図4D）により、本来の共通配列（配列番
号:1）でコードされているた成熟配列（179アミノ酸）
よりも大きな（248アミノ酸）形の胎盤ビクニンが得ら
れ、また、この翻訳は、共通オリゴヌクレオチド配列の
フレーム内の終止コドンによって終結していた。サイズ
の増加は、EST R74593に固有な２塩基の挿入を除去し
て生じた3'コーディング領域におけるフレームシフトに
よるものであった。このフレームシフトによって、最初
の共通配列（図３）の終止コドンが、フレームのリード
スルーによって、付加的なアミノ酸配列をコードする新
しいフレームに移動した。新しい翻訳産物（図4D）は、
最初のタンパク質の共通配列（配列番号:1）と、＋１か
ら＋175残基のところ（クニッツドメインをコードして
いる）で一致していたが、新しくＣ末側に延びて、24残
基の長さの膜貫通ドメインと推定される部位（図4Dの下
線部）を示し、その後に、短い31残基の細胞質ドメイン
をもっていた。開始のメチオニンとシグナルペプチドの
付近の正確な配列は、この領域で重複するEST配列の間
にかなりの不均一性が見られたため、いくらか仮想的な
ものになった。

Geneworks（登録商標）によるタンパク質配列の解析
は、Ｎ−結合グリコシル化の推定共通部位として、30番
目と67番目のアスパラギン残基が強調された。30番目の
アスパラギンは、ヒト胎盤から分離された完全長のタン
パク質のＮ末端の配列決定をしたときには見られなかっ
たので、グリコシル化されていることと矛盾しない。

ヒトビクニンのクローニング 図３の解析から推定されたヒトビクニンの塩基配列に
対応する、ヒトのmRNAが存在することが、以下のように
して確認された。R35464のクニッツをコードするcDNA配
列の5'側にハイブリダイズする核酸プライマー（図３の
共通塩基配列の３〜27塩基目）:GGTCTAGAGGCCGGGTCGTTT
CTCGCCTGGCTGGGA（Xba I部位をもつ、R35464の配列に由
来する5'プライマー；配列番号:35）と、R74593のクニ
ッツをコードする配列の3'側にハイブリダイズする核酸
プライマー（図３の共通塩基配列の680〜700塩基目）と
を用いて、クローンテック社のヒト胎盤ライブラリーか
ら、図３の胎盤ビクニンの配列をコードしているcDNAの
共通塩基配列から予想される長さ（約670塩基対）の断
片をPCR増幅した（概略的に図4Aに示されている）。

上述したATGの推定開始部位から、5'側に126塩基対長
いR87894の配列にハイブリダイズする5'側プライマー
（110塩基対のところで、概略的に図4Aに示されてい
る）と、上で使用されたものと同じ、R74593に対する3'
側プライマーとを用いて、ESTを重ね合わせて示した配
列（概略的に図4Aに示されている）から推定された大き
さ（約872塩基対）の断片を、クローンテック社のヒト
胎盤ライブラリーから増幅することができた。

この872塩基対の断片の配列決定によって、この断片
が、EST R87894の110〜218塩基対目に対応するヌクレ
オチドセグメントを5'末端にもち、またEST重ね合わせ
てまとめた（図３の）配列から推定された、ヒト胎盤ビ
クニンの共通配列の310〜542塩基対の配列を3'末端にも
つことが示された。この3'ヌクレオチド配列は、胎盤ビ
クニン（102−159）によってコードされているクニッツ
様ドメインのすべてを含んでいた。

タンパク質の細胞外の全領域をコードするcDNAを得る
ために、EST R34808の中の配列にハイブリダイズする
よう設計された、次の5'プライマー:CACCTGATCGCGAGACC
CC（配列番号:36）と、EST 74593に対する同じ3'側プ
ライマーとを用いて、ヒト胎盤cDNAライブラリーから
の、約780塩基対のcDNA産物を増幅した（30サイク
ル）。この産物をゲル精製して、TAベクター（Invitrog
en社）にクローニングし、以下のプライマーを用いて、
ジデオキシ法（Sanger F.ら、（1997）Proc.Natl.Acad.
Sci.（USA）,74:5463−5467）によってDNA配列決定を行
なった： ベクター特異的 遺伝子特異的 得られたcDNA配列を、翻訳産物とともに図4Eに示す。
塩基配列のレベルでは、この配列は、共通のEST配列
と、わずかな違いを示しただけであった（図4D）。この
配列の翻訳すると、フレーム内に、開始ATG部位、シグ
ナルペプチドと成熟胎盤ビクニン配列、および膜貫通ド
メインを含む配列が得られた。PCR産物を翻訳した配列
は、PCR増幅のための3'プライマーを選択した結果、細
胞質ドメインから、最後の12アミノ酸残基が失われてい
た。この3'PCRプライマー（R74593の配列に基づいて設
計されている）の選択は、PCRに由来する配列を翻訳し
た配列の211番目のアミノ酸で、ＳからＦへの人為的な
突然変異が導入される原因ともなった。PCR断片の翻訳
から導き出されたシグナルペプチドは、EST共通配列と
は幾分異なっていた。

完全長の胎盤ビクニンcDNAを得るために、PCRに由来
する産物（図4E）をゲル精製して、ビクニン配列を発現
する、PCRに基づかない、完全長のクローンを単離する
ために用いた。PCRで得られたcDNA配列を、ハイプライ
ム（High Prime）ベーリンガーマンハイム社（Boehring
er Mannheim）によって、³²P−CTPで標識し、コロニー
ハイブリダイゼーション技術を用いて、胎盤cDNAライブ
ラリー（Stratagene社、ユニザップλライブラリー（Un
izap^TMλ library）を探索した。およそ、２×10⁶個の
ファージプラークを３回スクリーニングして、プラーク
精製した。制限酵素解析、およびESTの共通配列の長さ
の比較（上記参照）によって判定すると、２個のクロー
ンが完全長（〜1.5キロ塩基）だと考えられた。ジデオ
キシ法によって、これらのクローンの一つを配列決定す
ると、図4Fに示されたオリゴヌクレオチド配列が得られ
た。この配列からの翻訳産物は、フレーム内に開始メチ
オニン、シグナルペプチド、および、成熟胎盤ビクニン
配列をもつタンパク質を与える。成熟胎盤ビクニン配列
は、EST共通配列の翻訳によって得られた成熟タンパク
質の配列と同一であったが、シグナルペプチドの配列長
と配列とは異なっていた。PCRに由来する産物とは異な
って、コロニーハイブリダイゼーションによって得られ
たcDNAは、外部部位の全部、膜貫通ドメイン、細胞質ド
メイン、および、フレーム内の終止コドンを含んでい
た。実際、このクローンは、ポリ−Ａテールまで延びて
いた。開始メチオニンの後に、PCR由来のクローンにコ
ードされているシグナルペプチドと同一の疎水性シグナ
ルペプチドが続いていた。次に、本発明者らは、Sf9細
胞から採ったビクニン（１−170）である胎盤ビクニン
（実施例９）の可溶性断片を発現、精製して、それが、
機能的なプロテアーゼ阻害因子であることを見つけた
（実施例10）。さらに、本発明者らは、これもまた、活
性のあるプロテアーゼ阻害因子である胎盤ビクニンの可
溶性断片を、ヒト胎盤から単離した（実施例７）。天然
のタンパク質、およびSf9細胞で発現されるタンパク質
の形の両者は、Ｎ−末側の配列決定におけるPTH−アミ
ノ酸の回収に基づけば、おそらく、30番目の位置にある
アスパラギン残基でグリコシル化されているであろう
（実施例７と９）。

上記の観察に基づけば、完全長の胎盤ビクニンは、細
胞の表面上で膜貫通タンパク質として存在することも、
可溶性タンパク質として存在することもできると思われ
る。クニッツドメインをもつ別の膜貫通タンパク質は、
タンパク質分解処理を受け、可溶化した形と膜に結合し
た形との混合物が得られることが知られている。これら
には、APP751（Esch F.ら、（1990）Science,248:1122
−1124）およびAPP770（Wang R.ら、（1991）J.Biol.Ch
em.,266:16960−16964）と名付けられたアミロイド前駆
体タンパク質の２つの形状が含まれる。

接触活性化とは、損傷を受けた血管の表面が、凝固カ
スケードの成分に接触することにより活性化されるプロ
セスである。血管形成は、内皮の表面で、プラスミンを
局所的に活性化することを含むプロセスである。胎盤ビ
クニンの特異性と細胞表面に定着すると推定される能力
とは、膜貫通する胎盤ビクニンの生理学的な機能に接触
活性化と血管形成の調節とが含まれていることを示唆す
る。

Gentics Computer GroupのプログラムであるTFastAを
用いて、PIR（バージョン46.0）、Patch X（バージョン
46.0）タンパク質データベースと、GeneSeq（バージョ
ン20.0）特許の配列タンパク質データベースに対して、
胎盤ビクニン（７−64）、ビクニン（102−159）、およ
び完全長の胎盤ビクニン（図4F）のアミノ酸配列を検索
した。Gentics Computer GroupのプログラムであるTFas
tA（Peason及びLipman、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
85:2444−2448）を用いて、GenBank（1/26/96に更新さ
れたバージョン92.0）、およびEMBL（更新されたバージ
ョン45.0）の塩基配列データベースと、特許の配列の塩
基配列データベースであるGeneSeq（バージョン20.0）
の６フレームに対して、これらの同じタンパク質配列を
検索した。GenBankおよびEMBLの、ESTおよびSTSのサブ
セットは、このときの検索の中には含まれなかった。こ
れらの検索の結果、最もよくマッチした配列には、本発
明者らによる、クローンR74593とR35464の解析から得ら
れた58アミノ酸のタンパク質配列に対して、それらの全
長にわたってわずかに約50％が一致した配列が含まれて
いただけであった。

ヒトビクニンの単離 上述したように、ビクニン（図３）に共通な配列を翻
訳して決めた、ビクニン（７−64）とビクニン（102−1
59）に相当する合成ペプチドは、再び折り畳まれて（そ
れぞれ、実施例２と１）、活性カリクレイン阻害因子タ
ンパク質（それぞれ、実施例４と３）が得られた。本発
明者らは、ヒトの組織から採った天然の胎盤ビクニンを
単離するための精製スキームを考案するために、この思
いがけない特性を利用した。

第一ステップとして、カリクレイン−セファロースア
フィニティークロマトグラフィーを用いた精製スキーム
を用いて、高度に精製された天然の強力なカリクレイン
阻害因子を単離した。単離された天然のヒトビクニン
は、共通塩基配列（図３）の翻訳によって予測された配
列のアミノ酸残基＋１から＋50（実施例７）と同じＮ−
末（50アミノ酸残基を配列決定した）をもっていた。こ
れによって、ヒトの胎盤から単離した、新しい天然のカ
リクレイン阻害因子の存在が初めて確認された。

既知のクニッツ様ドメインを下記に列挙する。標的と
なるプロテアーゼと接触すると考えられている残基を、
特に興味あるものとして強調してある（太字／下線）。
これら特定の残基は、下にXaaと表示して示されている
ように、特別の参照としてXaa^1-16の位置と名付けられ
ている。

ここで、配列１）は、ビクニン（７−64）（配列番
号:4）；配列２）は、ビクニン（102−159）（配列番
号:6）；配列３）は、組織因子経路阻害因子前駆体１
（配列番号:18）；配列４）は、組織因子経路阻害因子
前駆体１（配列番号:19）；配列５）は、組織因子経路
阻害因子前駆体（配列番号:20）；配列６）は、組織因
子経路阻害因子前駆体２（配列番号:21）；配列７）
は、組織因子経路阻害因子前駆体２（配列番号:22）；
配列８）は、アミロイド前駆体タンパク質相同体（配列
番号:23）；配列９）は、アプロチニン（配列番号:2
4）；配列10）は、インター−α−トリプシン阻害因子
前駆体（配列番号:25）；配列11）は、インター−α−
トリプシン阻害因子前駆体（配列番号:26）；配列12）
は、アミロイド前駆体タンパク質（配列番号:27）；配
列13）は、コラーゲンα−３（VI）前駆体（配列番号:2
8）；および、配列14）は、HKI−B9（配列番号:29）で
ある。

胎盤ビクニン（７−64）と（102−159）とは、クニッ
ツ型のセリンプロテアーゼ阻害因子のメンバーに見られ
るように、それぞれ、同じ数（６個）のシステイン残基
を同じ間隔でもっているのが見られる。３つの鎖内ジス
ルフィド結合を形成するための、システイン残基の適正
な結合が知られており、以前から知られているクニッツ
ファミリーの全メンバーで不変である（Laskowski,M.
ら、1980,Ann.Rev.Biochem.49:593−626）。この既知の
結合パターンと、胎盤ビクニン（７−64）と（102−15
9）が折り畳まれると、３つの鎖内ジスルフィド結合
（実施例２と１）が形成されるのと一致して、質量の減
少を伴いながら、活性のあるプロテアーゼ阻害因子にな
るという事実に基づくと、胎盤ビクニンのクニッツドメ
インの中でのジスルフィド結合は、次のシステイン残基
の間で起こる可能性が高い:C11とC61;C20とC44;C36とC5
7;C106とC156;C115とC139;C131とC152。さらに、このジ
スルフィド結合パターンは、両方のクニッツドメインを
含む、より大きな形の胎盤ビクニンの中にある可能性が
高いが、これは、このような形状のタンパク質が活性セ
リンプロテアーゼ阻害因子でもあり、また、天然の胎盤
ビクニンのＮ−末端を、50サイクルの間だけ配列決定す
ると、システイン残基があると思われる位置で、配列が
得られないからである。

本発明の胎盤ビクニン、単離されたドメイン、また
は、その他の変異タンパク質は、Merrifield R.B.とBar
any G.によって、Academic Press（1980）Gross E.ら
編、第１章、ペプチド、分析、合成、生物学、２で説明
されているようなｔ−Boc化学法、または、Carpino L.
A.とHan G.Y.、（1970）J.Amer.Chem.Soc.,92:5748−57
49で説明されているようなＦ−moc化学法のいずれかを
用いる標準的な固相ペプチド合成によって産生され、こ
れは、実施例２に例示されている。または、胎盤ビクニ
ン変異タンパク質をコードしているDNAの発現を用い
て、組換え胎盤ビクニン変異タンパク質を産生してもよ
い。

本発明は、また、本発明の胎盤ビクニン変異タンパク
質をコードするDNA構築物に関する。これらの構築物
は、Beaucage S.L.とCaruthers M.H.、（1981）Tetrahe
dron Lett.22,pp1859−1862;Matteucci M.D.とCaruther
s M.H.、（1981）,J.Am.Chem.Soc.103,p3185で説明され
ている方法などの合成法によって調製してもよく、胎盤
ビクニンをコードしているDNA配列とハイブリダイズす
るように設計されたcDNAプローブによって、ゲノミック
ライブラリーまたはcDNAライブラリーをスクリーニング
して得られたゲノム、またはcDNAから調製してもよい。
本開示において説明されているアミノ酸の置換や欠失の
いずれかをコードしているcDNAを得るために、一つ以上
の部位で、ゲノムまたはcDNAの配列を改変することがで
きる。

本発明は、また、組換え胎盤ビクニン変異体の産生に
用いることができる、本発明の胎盤ビクニン、単離され
たドメイン、または、その他の変異タンパク質をコード
しているDNA構築物を含む発現ベクターに関する。このc
DNAは、選択した宿主細胞における転写活性を示す、適
当なプロモーター配列に結合されており、適当なターミ
ネーターとポリアデニル化シグナルをもっていなければ
ならない。cDNAによってコードされるタンパク質が分泌
されるよう、5'シグナルペプチドに、胎盤ビクニン変異
体をコードするcDNAを融合させることができる。シグナ
ルペプチドは、宿主生物によって認識されるものにする
ことができる。哺乳動物の宿主細胞のときには、シグナ
ルペプチドは、また、完全長の胎盤ビクニンに見られる
天然のシグナルペプチドでもよい。このようなベクター
を、胎盤ビクニン変異体が発現されるよう調製するため
に用いられる手順は、当技術分野においてよく知られて
おり、例えば、Smbrookら、の分子クローニング：実験
マニュアル、Cold Spring Harbor,New York（1989）で
説明されいる。

本発明は、また、組換え胎盤ビクニン変異体の産生に
用いることができる、本発明の胎盤ビクニン、単離され
たドメイン、または、その他の変異タンパク質をコード
しているDNA構築物を含む形質転換された細胞に関す
る。胎盤ビクニン変異体の産生に用いることができる、
発現ベクターと宿主細胞のさまざまな組み合わせがあ
る。適切な宿主細胞には、バキュロウイルスに感染した
Sf9昆虫細胞、BHK、CHO、HeLaおよびＣ−127などの哺乳
動物細胞、大腸菌などのバクテリア、サッカロミセス・
セルビシェ（Saccharomyces cervisiae）などの酵母が
含まれる。胎盤ビクニンの発現を実現させるのに必要な
哺乳動物や昆虫または微生物の発現系を用いるための方
法は、当技術分野において、よく知られており、例え
ば、Ausubel F.M.ら、分子生物学の最新プロトコール、
John Wiley ＆ Sons（1995）、第16章で説明されてい
る。胎盤ビクニン（７−64）と（102−159）のような、
単独のクニッツ阻害因子ドメインを含む、胎盤ビクニン
の断片については、酵母と大腸菌の発現系が好ましく、
酵母の系が最も好ましい。典型的には、酵母の発現系
は、アプロチニン変異体について、米国特許5,164,482
号で説明され、本明細書の実施例５で胎盤ビクニン（10
2−159）に関して適用したようにして実施されよう。大
腸菌での発現は、米国特許5,032,573号で説明されてい
る方法を用いて実施されよう。変異体ビクニン（７−15
9）などのように阻害因子ドメインの両方を含む、より
大きな胎盤ビクニン変異体の発現には、哺乳動物の系と
酵母の系が最も好ましい。天然のアミノ酸配列を置換し
たアミノ酸をもつ胎盤ビクニンの変異体をコードするDN
Aを、Kunkel T.A.ら、（1985）Proc.Natl.Acad.Sci USA
82:488−492の方法を用いて、組換えタンパク質を発現
させるために調製することができる。簡単にいうと、変
異させようとするDNAを、M13などの一本鎖のバクテリオ
ファージの中にクローニングする。変更を加えようとす
る領域を含み、置換するアミノ酸をコードするオリゴヌ
クレオチドを、標準的な分子生物学的手法によって、一
本鎖DNAにハイブリダイズさせ、二本鎖にする。次に、
このDNAを、適当なバクテリア宿主に形質転換させ、ジ
オキシヌクレオチド配列決定法によって確認する。そし
て、適正なDNAを、発現プラスミドにクローニングす
る。あるいは、標準的なPCR技術によって、標的DNAを変
異させ、配列決定し、適当な発現プラスミドに挿入して
もよい。

以下の個別の実施例は、本発明のある局面と好ましい
態様を例示するために提示されているものであって、制
限はない。

実施例１ 合成胎盤ビクニン（102−159）の調製 材料および使用した方法／試薬 蛍光性基質（fluorogenic substrate）Tos−Gly−Pro
−Lys−AMCは、Bachem BioScience Inc（King of Pruss
ia,PA）から入手した。PNGB、Pro−Phe−Arg−AMC、Ala
−Ala−Pro−Met−AMC、ウシトリプシン（III型）、ヒ
ト血漿カリクレイン、およびヒトプラスミンは、Sigma
（St.Louis,MO）から入手した。

組み換えアプロチニン（Trasylol（登録商標））は、
Bayer AG（Wuppertal,Germany）から入手した。予備充
填Gln Wang樹脂は、Novabiochem（La Jolla,CA）から
入手した。チオアニソール、エタンジチオール、および
ｔ−ブチルメチルエーテルは、Aldrich（Milwaukee,W
I）から入手した。

機能性胎盤ビクニン（７−64）および（102−159）の定
量比： 精製の種々の段階において、再折り畳み試料中に存在
するトリプシン阻害活性の量を、GPK−AMCを基質として
用いて測定した。ウシトリプシン（200pmole）を、精製
の種々の段階からのビクニン（７−64）または（102−1
59）を用いて、37℃において、緩衝液Ａ（50mM Hepe
s、pH7.5、0.1M NaCl、2mM CaCl₂、および0.01％トリ
トンＸ−100）中で５分間インキュベートした。GPK−AM
Cを加え（最終20μＭ）、Perkin−Elmer LS−50B蛍光計
で２分間、蛍光（ex＝370nm、em＝432nm）を測定するこ
とによって、生成されるクマリンの量を求めた。試験さ
れる試料に関して、それぞれの％阻害を、式１によって
計算した［式中、R₀は、阻害剤の存在下における蛍光の
増加率であり、R₁は添加試料の不存在下において求めら
れた率である］。阻害剤の活性の１単位は、記載された
条件を用いたアッセイにおいて、50％阻害を達成するの
に必要とされる量として定義される。

％阻害＝100x［１−R₀/R₁］ （１） 合成： 胎盤ビクニン（102−159）を、Applied Biosystemsモ
デル420Aペプチド合成機によって、NMP−HBTU Fmoc品
を用いて合成した。各カップリングおいて、８倍過剰の
アミノ酸を用いて、予備充填したGln樹脂上でペプチド
を合成した。84.6％トリフルオロ酢酸（TFA）、4.4％チ
オアニソール、2.2％エタンジチオール、4.4％液体のフ
ェノール、および4.4％H₂Oの中で、開裂および脱保護
を、室温で２時間行った。粗ペプチドを沈殿させ、遠心
分離し、ｔ−ブチルメチルエーテルで２回洗浄した。Dy
namax 60A C18逆相HPLCカラムによって、TFA/アセトニ
トリル勾配を用いて、ペプチドを精製した。最終調製品
（61.0mg）は電子噴射質量分析（Electrospray mass sp
ectroscopy）によって、以下の予測配列に関して正確な
アミノ酸組と分子質量とを示した（MH＋＝6836.1;計算
値＝6835.5）： 精製： 胎盤ビクニン（102−159）の再折り畳みを、Tamら
（J.Am.Chem.Soc.1991,113:6657−62）の方法に従って
行った。精製ペプチドの一部（15.2mg）を、4.0mLの0.1
Mトリス、pH6.0、および8M尿素中に溶解した。23％DMS
O、および0.1Mトリス、pH6.0を含有する溶液の滴下によ
って、ジスルフィドの酸化を行って、20％DMASO、0.1M
トリス、pH6.0、および1M尿素中で、0.5mg/mLペプチド
の最終濃度を得た。溶液を25℃で24時間攪拌し、その
後、50mMトリス、pH8.0、および0.1M NaClを含有する
緩衝液中で1:10に稀釈した。製造者の指示に従って、30
mgのウシ膵臓カリクレイン（Bayer AG）と3.5mLのCNBr
活性化セファロース（Pharmacia）とを共有結合させる
ことによって調製されるカリクレイン親和性カラムを用
いて、物質を精製した。再折り畳み物を1mL/分の流量に
おいて親和性カラムに充填し、洗浄液の280nmにおける
吸収が検出されなくなるまで、50mMトリス、pH8.0、お
よび0.1M NaClで洗浄した。カラムを0.2M酢酸、pH4.0
および1.7の各３容量で溶離した。活性画分を溜め（下
記参照）、溶液のpHを2.5に調節した。0.1％TFA中の22.
5％アセトニトリルで平衡化したVydac C18逆相カラム
（５ミクロン、0.46x25cm）に、物質を直接充填した。
0.1％TFA中の22.5％〜40％アセトニトリルの直線勾配を
1.0mL/分で40分間用いて、分離を行った。活性画分を溜
め、凍結乾燥し、0.1％TFAに再溶解し、必要になるまで
−20℃で保管した。

結果： 前記のように、酸化剤として20％DMSOを用いて、合成
胎盤ビクニン（102−159）を再折り畳みを行い、下記に
示される２段階精製プロトコールによって精製して、活
性トリプシン阻害剤を得た（下記表１）。

固定化ウシ膵臓カリクレインカラム上での、折り畳ま
れた粗再生物質のクロマトグラフィーでは、タンパク質
の6.0％を選択的に単離し、トリプシン阻害活性は97％
であった。その後の、C18逆相を用いるクロマトグラフ
ィーによって、全回収率74％で、さらに２倍の精製を得
た。RPHPLCにおいて、還元されたおよび再生された胎盤
ビクニン（102−159）が、溶離時間26.3分および20.1分
をそれぞれ示した。精製物質の質量分析は、分子質量68
29.8を示し、出発物質から６質量単位の損失であった。
これはペプチド配列から予測される３つのジスルフィド
の完全な形成を示す。

製造者の指示によって操作されるMultiphor II電気泳
動装置（Paramacia）を用い、pI標準と共にプレキャス
トAmphorine PAGplate（登録商標）（pH3.5〜9.5）を用
い、1.5時間集中させて、精製され再生された合成胎盤
ビクニン（102−159）の等電点を求めた。染色後、ゲル
の陰極端から種々のタンパク質バンドへの移動距離が測
定された。対応するpIに対する標準の移動距離のプロッ
トによって生じる標準曲線を用いて、未知のそれぞれの
pIが求められた。この方法によって、胎盤ビクニン（10
2−159）のpIが8.3であることが求められ、アミノ酸配
列から予測される値と一致した。これは、アプロチニン
のpIに関して確定されている10.5の値よりも低い（Test
adら、1994,Acta Physiol.Scand.152:33−50）。

実施例２ 合成胎盤ビクニン（７−64）の調製 胎盤ビクニン（102−159）に関して記載したのと本質
的に同様であるが、下記の変更を加えて、胎盤ビクニン
（７−64）を合成し、再生し、精製した：再生の間に、
合成ペプチドを、20％DMSO中の溶液として、25℃で30時
間攪拌した;C18 RP−HPLCによる精製を、0.1％TFA中の
25％〜45％アセトニトリルの直線勾配を用いて40分間
（1mL/分）で行った。最初のC18の実験からの活性画分
を、カラムに再充填し、0.1％TFA中の20％〜40％アセト
ニトリルの直接勾配（60分、1mL/分）で分別した。

結果： 最終精製還元ペプチドは、MH＋＝6563を示し、下記配
列と一致した： 再生および精製は、トリプシンの阻害剤として活性
な、機能的なクニッツドメインを生じた（下記表２）。

精製再生タンパク質は、MH＋＝6558を示し、即ち、還
元ペプチドよりも５±１質量単位少なかった。このこと
は、再生によって、少なくとも１つの適切なジスルフィ
ド結合が形成されたことを示している。

胎盤ビクニン（７−64）のpIは、胎盤ビクニン（102
−159）のpIを求めるために用いた方法によって求めら
れた。胎盤ビクニン（７−64）は、予測値（pI＝7.9）
よりもかなり高いpIを示した。再生胎盤ビクニン（７−
64）は、ゲル（pH9.5）の陰極端に移動し、これらの条
件下において正確なpIを求めることができなかった。

合成胎盤ビクニン（７−64）の調製の継続 合成胎盤ビクニン（７−64）は、精製および再生の前
に、完全な脱保護を受けていない場合があるので、完全
に脱保護されたことが確かなタンパク質を用いて、再生
を繰り返した。胎盤ビクニン（102−159）に関して記載
したのと本質的に同様であるが、下記の変更を加えて、
胎盤ビクニン（７−64）を合成し、再生し、精製した：
再生の間に、合成ペプチド（0.27mg/mL）を、20％DMSO
中の溶液として、25℃で30時間攪拌した;C18 RP−HPLC
による精製を、0.1％TFA中の22.5％〜50％アセトニトリ
ルの直線勾配を用いて40分間（1mL/分）で行った。

結果： 最終精製還元ペプチドは、MH＋＝6567.5を示し、下記
配列と一致した： 再生および精製は、トリプシンの阻害剤と同様の活性
の、機能性クニッツドメインを生じた（下記表2B）。

精製再生タンパク質は、MH＋＝6561.2を示し、即ち、
還元ペプチドよりも6.3質量単位少なかった。このこと
は、再生によって、予測される３つのジスルフィド結合
が形成されたことを示している。

胎盤ビクニン（７−64）のpIは、胎盤ビクニン（102
−159）のpIを求めるために用いた方法によって求めら
れた。再生胎盤ビクニン（７−64）は、予測値（pI＝7.
9）よりも僅かに高い8.85のpIを示した。

実施例３ 機能性胎盤ビクニン断片（102−159）の生体外特異性 プロテアーゼ： 以前に記載されているように、ｐ−ニトロフェニル
p'−グアニジノベンゾエート HClを用いて、活性部位
滴定によって、ウシトリプシン、ヒトプラスミン、およ
びウシ膵臓カリクレインを定量した（Chase,T.およびSh
aw,E.、（1970）Methods Enzmol.,19:20−27）。1:1の
複合体を想定して、標準としてウシアプロチニンおよび
基質としてPFR−AMCを用いて、活性部位滴定によって、
ヒトカリクレインを定量した。各酵素に関して使用され
る条件下において、トリプシンおよびプラスミンでのGP
K−AMCのK_mは、それぞれ29μＭおよび726μＭであり；
ヒト血漿カリクレインおよびウシ膵臓カリクレインでの
PFR−AMCのK_mは、それぞれ457μＭおよび81.5μＭであ
り；エラスターゼでのAAPR−AMCのK_mは、1600μＭであ
った。以前に記載されているように、p'ニトロフェニル
p'−グアニジノベンゾエート HClを用いて、ヒト組
織カリクレイン（Bayer,Germany）の定量を行った（Cha
se,T.およびShaw,E.、（1970）Methods Enzmol.19:20−
27）。

阻害速度論： 胎盤ビクニン（102−159）またはアプロチニンによる
トリプシンの阻害を、合計容量1.0mLの緩衝液Ａ中にお
いて、胎盤ビクニン（102−159）（０〜2nM）またはア
プロチニン（０〜3nM）を用いて、50pMトリプシンとイ
ンキュベーションすることによって測定した。37℃で５
分後、15μＬの2mM GPK−AMCを加え、蛍光の変化（前
述）を監視した。50mMトリス−HCl（pH7.5）、0.1M Na
Cl、および0.02％トリトンｘ−100を含有する緩衝液中
で、プラスミン（50pM）と胎盤ビクニン（102−159）
（０〜10nM）もしくはアプロチニン（０〜4nM）を用い
て、胎盤ビクニン（102−159）およびアプロチニンによ
るヒトプラスミンの阻害を測定した。37℃で５分間のイ
ンキュベーション後、25μＬの20mM GPK−AMCを加え、
蛍光の変化を監視した。50mMトリス−HCl（pH8.0）、50
mM NaCl、および0.02％トリトンｘ−100中において、
カリクレイン（2.5nM）と胎盤ビクニン（102−159）
（０〜3nM）もしくはアプロチニン（０〜45nM）を用い
て、胎盤ビクニン（102−159）またはアプロチニンによ
るヒト血漿カリクレインの阻害を測定した。37℃で５分
後、15μＬの20mM PFR−AMCを加え、蛍光の変化を監視
した。胎盤ビクニン（102−159）およびアプロチニンに
よるウシ膵臓カリクレインの阻害を、カリクレイン（92
pM）、胎盤ビクニン（102−159）（０〜1.6nM）および
アプロチニン（０〜14pM）を用いて、最終基質濃度100
μＭで、同様に測定した。見掛の阻害定数K_i ^＊を、非直
線回帰データ分析プログラムエンツフィッターソフトウ
エア（nonlinear regression data analysis program E
nzfitter software）（Biosoft,Cambridge,UK）を用い
て求めた。各実験からの動力学データを、密結合阻害剤
（tight binding inhibitor）に関する式によって分析
した： V_i/V₀＝１−（E₀＋I₀＋K_i ^＊−［（E_o＋I₀＋K_i ^＊）^２−4E₀I₀］^1/2）/2E
₀ （２） ［式中、V_i/V_oは、酵素活性比（阻害対非阻害の比）で
あり、E_oおよびI_oは、それぞれ酵素および阻害剤の合計
濃度である。K_i値は、式： K_i＝K_i ^＊／（１＋［S₀］/K_m） （３） によって、基質の効果に関して修正することによって得
られた。］（Boudier,C.およびBieth,J.G.、（1989）Bi
ochim Biophys Acta.,995:36−41）。

胎盤ビクニン（102−159）およびアプロチニンによる
ヒト好中球エラスターゼの阻害のために、0.1Mトリス−
HCl（pH8.0）および0.05％トリトンＸ−100を含有する
緩衝液中において、胎盤ビクニン（102−159）（150n
M）またはアプロチニン（０〜7.5μＭ）を用いて、エラ
スターゼ（19nM）とインキュベーションした。37％Ｃで
５分後、AAPM−AMC（500μＭまたは1000μＭ）を加え、
蛍光を２分間測定した。２つの異なる基質濃度において
行ったフォーム1/V対［Ｉ］のディクソン（Dixon）プロ
ットから、K_i値を求めた（Dixonら、1979）。

50mMトリス−HCl緩衝液 pH9.0、50mM NaCl、および
0.1％トリトンｘ−100を含有する1mL反応容量中におい
て、胎盤ビクニン（７−64）（０〜40nM）または胎盤ビ
クニン（102−159）（０〜2.5nM）、またはアプロチニ
ン（０〜0.5nM）を用いて、0.35nMヒト組織カリクレイ
ンとインキュベーションすることによって、アプロチニ
ン、胎盤ビクニン断片（７−64）または胎盤ビクニン断
片（102−159）による、ヒト組織カリクレインの阻害を
測定した。37℃で５分後、５μＬの2mM PFR−AMCを加
えて、最終10μＭとし、蛍光の変化を監視した。用いた
条件下における、ヒト組織カリクレインでのPFR−AMCの
K_mは5.7μＭであった。20mMトリス（pH7.5）、0.1M Na
Cl、および0.1％BSAを含有する緩衝液中において、阻害
剤の量を増加ながら、0.87nMのヒト第X a因子とインキ
ュベーションすることによって、合成胎盤ビクニン（10
2−159）、組み換え胎盤ビクニン、およびアプロチニン
による、ヒト第X a因子（American Diagnostica,Inc,Gr
eenwich,CT）の阻害を測定した。37℃で５分後、30μＬ
の20mM LGR−AMC（Sigma）を加え、蛍光の変化を監視
した。50mMトリス−HCl（pH8.0）、50mM NaCl、および
0.1％トリトンｘ−100を含有する合計容量1mLの緩衝液
中において、ウロキナーゼ（2.7ng）を阻害剤を用いて
インキュベーションすることによって、クニッツ阻害剤
によるヒトウロキナーゼ（Sigma）の阻害を測定した。3
7℃で５分後、35μＬの20mM GGR−AMC（sigma）を加
え、蛍光の変化を監視した。合計容量1mL中に、50mM H
epes pH7.5、100mM NaCl、2mM CaCl₂、0.01％トリト
ンｘ−100、１％BSAを含有する緩衝液中において、０〜
800nM胎盤ビクニン（７−64）、０〜140nM胎盤ビクニン
（102−159）または０〜40μＭアプロチニンを用いて、
第XI a因子（0.1nM）とインキュベーションすることに
よって、第XI a因子（Enzyme Research Labs,Southben
d,INから入手）の阻害を測定した。37℃で５分後、10μ
Ｌの40mM Boc−Glu（OBzl）−Ala−Arg−AMC（Bachem
Biosciences,King of Prussia,PA）を加え、蛍光の変化
を監視した。

結果： 胎盤ビクニン（102−159）およびアプロチニンの阻害
プロフィールの直接比較を、同一条件下において種々の
プロテアーゼを用いて、それらの阻害定数を測定するこ
とによって行った。K_i値を下記表３に示す。

胎盤ビクニン（102−159）およびアプロチニンは、ウ
シトリプシンおよびヒトブラスミンを、用いた条件下に
おいて同等程度に阻害する。アプロチニンは、8.5μＭ
のK_iでエラスターゼを阻害した。胎盤ビクニン（102−1
59）は323nMのk_iでエラスターゼを阻害した。ウシ膵臓
カリクレインの胎盤ビクニン（102−159）阻害のK_i値
は、アプロチニン阻害のK_i値よりも20倍高かった。対照
的に、胎盤ビクニン（102−159）は、アプロチニンより
もヒト血漿カリクレインのより有効な阻害剤であり、56
倍高い親和性で結合する。

胎盤ビクニン（102−159）が、カリクレインの阻害剤
としてTrasylol（登録商標）よりも50倍以上有効である
ので、KIUでの阻害剤の有効患者投与用量を維持するた
めに、Trasylol（登録商標）よりも少ない量のヒト胎盤
ビクニンまたはその断片が必要とされる。このことは、
薬剤の用量当たりのコストを減少させ、患者への薬剤の
再曝露時の有害な腎毒性効果の可能性を減少させる。さ
らに、このタンパク質はヒト由来であり、従って、雌ウ
シ由来のアプロチニンよりもヒトにおける免疫原性がよ
り少ないである。この結果として、患者への薬剤の再曝
露時の、有害な免疫学的事象の誘発の危険性を、有意に
減少させる。

実施例４ 機能性胎盤ビクニン断片（７−64）の生体外特異性 機能性ヒト胎盤ビクニン（７−64）の生体外特異性
を、前記実施例に記載の物質および方法を用いて測定し
た。

結果： 下記表は、生体外における種々のセリンプロテアーゼ
の阻害剤としての、胎盤ビクニン（７−64）の有効性を
示す。胎盤ビクニン（102−159）またはアプロチニン
（Trasylol（登録商標））のどちらかを用いた阻害のス
クリーニングに関して得たデータと比較して、データが
示されている。

結果は、胎盤ビクニン（７−64）をコードするアミノ
酸配列が再生され、少なくとも４つのトリプシン様セリ
ンプロテアーゼに対して有効な、活性セリンプロテアー
ゼ阻害剤が得られることを示している。

下記表4Bも、生体外での、種々のセリンプロテーアー
ゼの阻害剤としての、再生胎盤ビクニン（７−64）の有
効性を示している。再生胎盤ビクニン（７−64）は、精
製および再生の前に、完全に脱保護されることが確実な
タンパク質から調製された。胎盤ビクニン（102−159）
またはアプロチニン（Trasylol（登録商標））のどちら
かを用いての阻害のスクリーニングに関して得たデータ
と比較して、データが示されている。

驚くべきことに、胎盤ビクニン（７−64）は、ヒト血
漿カリクレインの阻害において、アプロチニンよりも有
効であり、プラスミン阻害剤としての有効性において、
少なくとも同様であった。これらのデータは、胎盤ビク
ニン（７−64）が、生体外アッセイを用いた場合に、ア
プロチンと少なくとも同様の有効性であること、および
生体内においてより良好な、または同様の有効性が期待
できることを示している。

実施例５ 酵母における胎盤ビクニン変異体（102−159）の発現 胎盤ビクニン102−159をコードするDNA配列（配列番
号:6）は、合成オリゴヌクレオチドを使用して得られ
た。最終DNA生産物（5'から3'）は、胎盤ビクニン（102
−159）をコードするフレーム内cDNA配列、続くフレー
ム内停止コドンに融合された酵母α接合因子プロペプチ
ド配列からの15のヌクレオチドから成る。酵母発現ベク
ターpS604へのクローニングの際に、cDNAが、胎盤ビク
ニン（102−159）の58アミノ酸配列に融合したＮ末端の
酵母α接合因子プロペプチドを含んで成る融合タンパク
質の発現を導く。α接合因子とクニッツドメインとの間
の接合部での、KEX−２切断部位における、この融合タ
ンパク質のプロセッシングは、クニッツドメインを、そ
れの自然なＮ末端に生じるようになっている。

下記配列を有し、クローニングのためのHind III部位
を有する、5'センスオリゴヌクレオチドを合成した： 下記配列を有し、クローニングのためのBamH I部位と
停止コドンとの両方を有する、3'アンチセンスオリゴヌ
クレオチドを合成した： 1mM EDTAを含有する10mMトリス緩衝液pH8.0に、オリ
ゴヌクレオチドを溶解し、各オリゴ12μｇを加え、混合
し、0.25M NaClを入れた。ハイブリダイズさせるため
に、オリゴヌクレオチドを５分間煮沸することによって
変性し、65℃から室温に２時間かけて冷ました。オーバ
ーラップ部をクレノウフラグメントを用いて伸長し、Hi
nd IIIおよびBamH Iで消化した。得られた消化された二
本鎖の断片を、pUC19にクローニングし、配列を確認し
た。正確な配列の断片を有するクローンを、BamH I/Hin
d IIIで消化して、下記の＋鎖配列を有するビクニン含
有フラグメントを得た： 次に、ゲル精製し、BamH I/Hind IIIで切断されたpS6
04に連結した。連結混合物を、フェノール／クロロホル
ム中で抽出し、Ｓ−200ミニスピカラムで精製した。連
結産物を、酵母菌株SC101およびWHL341に形質転換し、u
ra選択プレートにまいた。各菌株からの12のコロニー
を、ura欠如（drop out）プレート上で再び画線培養し
た。単一コロニーをuraDO培地2mL中に植え込み、30℃で
一晩増殖させた。細胞を２分間、14000xgにおいてペレ
ット化し、胎盤ビクニン（102−159）の含量に関して上
澄みを評価した。

形質転換酵母における胎盤ビクニン（102−159）の発現
の検出 初めに、実施例１（アッセイ容量1mL）に記載のアッ
セイ方法によって、トリプシンの生体外活性を阻害する
能力に関して、上澄み（50μL/アッセイ）を評価した。
未使用の培地のみのサンプル、およびアプロチニンの不
活性変異体を発現する酵母クローンとはネガティブ対照
としての役割を果たした。天然アプロチニンを発現する
酵母クローンは、ポジティブ対照としての役割を果た
し、比較のために示される。

胎盤ビクニン（102−159）発現を定量する第二の方法
は、合成ペプチドに対するポリクローナル抗体（pAb）
を使用して、ウエスタンブロットを用いて組み換えペプ
チドの蓄積を監視した。これらの試験は、SC101菌株由
来の組み換え体のみを用いて行われたが、その理由は、
これらがWHL341菌株由来の組み換え体よりも高い阻害活
性を生じたからである。

pAbを調製するために、２匹の６〜８週のニュージー
ランドホワイト（New Zealand White）雌ウサギ（Hazel
ton Research Labs,Denver,Pa）を、０日目に、完全フ
ロイントアジュバント中の、精製された、短くした合成
胎盤ビクニン（102−159）250μｇを用いてで免疫化
し、続いて、14、35および56および77日目にそれぞれ、
不完全フロイントアジュバント中の同じ抗原125μｇを
用いて追加免疫した。この実験に使用された抗血清を、
確立した方法によって、第三の追加免疫後に集めた。ポ
リクローナル抗体を、タンパク質Ａ上で抗血清から精製
した。

酵母SC101の形質転換からのコロニー2.4および2.5
（図８）、ならびにアプロチニン対照を、uraDO培地50m
L中、30℃で一晩増殖させた。細胞をペレット化し、Cen
triprep 3（Amicon,Beverly,MA）濃縮機を用いて、上澄
みを100倍に濃縮した。製造者が提供する手順に従い、
各サンプル（30μＬ）を、10％〜20％トリシン緩衝化ゲ
ル（Novex,San Diego,CA）上でSDS−PAGEにかけた。ゲ
ルの複製を、銀染色キット（Integrated Separation Sy
stems,Nantick,MA）で現像するか、またはニトロセルロ
ースに移し、合成ビクニン（102−159）で誘発された精
製ポリクローナル抗体を用いて現像した。アルカリ性ホ
スファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体を、製造者の指示
（Kirkegaard and Perry,Gaithersburg,MD）に従い、第
二の抗体として使用した。

SC101の形質転換菌株からの胎盤ビクニン（102−159）
の精製 SC101菌株2.4の1L培養物からの発酵ブロスを遠心分離
（4,000gx30分）によって採収し、次に、0.1M NaCl、2
mM CaCl₂、および0.01％（v/v）トリトンＸ−100を含
有する50mM Hepes緩衝液pH7.5で予め平衡化したアンハ
イドロキモトリプシン−セファロース（Takara Biochem
ical Inc.,CA）の1.0mLカラムにかけた。A280nmが０に
低下するまで、1.0M NaClを含有する以外は同じ緩衝液
を用いてカラムを洗浄し、その後、0.1M蟻酸pH2.5によ
りカラムを溶離した。溶離画分を集め、0.1％TFAで予め
平衡化したC18カラム（Vydac、５μｍ、4.6x250mm）に
入れ、0.1％TFA中の20％〜80％アセトニトリルの直線勾
配で50分間溶離した。胎盤ビクニン（102−159）を含有
する画分を集め、0.1％TFA中の22.5％〜50％アセトニト
リルの直線勾配を用いて、再度C18クロマトグラフを行
った。

結果： 図８は、SC101およびWHL341の各菌株の形質転換から
誘導された12個のコロニーによって阻害されるトリプシ
ン活性％を示す。結果は、トリプシン阻害剤胎盤ビクニ
ン（102−159）で形質転換された酵母菌株SC101の12個
の全てのコロニーが、トリプシンを阻害する能力を示さ
なかった両方のネガティブ対象と比較して、有意な量の
トリプシン阻害活性を生じる能力を有することを示して
いる。従って、活性は、胎盤ビクニン変異体（102−15
9）改質転換細胞中の特異的阻害剤の発現に関係してい
る。酵母WHL341サンプルは、最少のトリプシン阻害活性
を有した。このことは、使用した条件下において、この
菌株に観察された遅い増殖に関係していると考えられ
る。

図９は、酵母SC101上澄みの、SDS−PAGEおよびウエス
タン分析を示す。胎盤ビクニン（102−159）を発現する
組み換え酵母2.4および2.5からと、アプロチニンを発現
する酵母からとの上澄みの銀染色SDS−PAGEは、各組み
換えクニッツ阻害剤ドメインに関して予測されるサイズ
に対応する、約6kDaのタンパク質バンドを生じていた。
ウエスタン分析は、菌株2.4および2.5によって発現され
る6kDaバンドが、胎盤ビクニン（102−159）に誘発され
たpAbと反応することを示した。アプロチニン対照の同
じ6kDaバンドは同じ抗体と反応せず、胎盤ビクニン変異
体（102−159）に関する抗体の特異性を示していた。

胎盤ビクニンＣ末端ドメインの最終調製品は、銀染色
SDS−PAGEによると、非常に純粋であった（図10）。最
終調製品におけるブロス誘導トリプシン阻害活性の全回
収率は31％であった。精製阻害剤のＮ末端配列決定によ
り、タンパク質の40％が正確にプロセッシングされて、
胎盤ビクニン（102−159）の正確なＮ末端を生じ、一
方、この物質の約60％は酵母α接合因子の一部を含むこ
とが分かった。精製物質は、血漿カリクレインの生体外
阻害に関して0.35nMの見掛K_iを示す活性なセリンプロテ
アーゼ阻害剤であった。

結論として、発酵ブロス中の胎盤ビクニン（102−15
9）に免疫化学的に関係するプロテアーゼ阻害剤活性と
タンパク質との両方の蓄積、ならびに、形質転換系の１
つからの胎盤ビクニン（102−159）の単離は、本明細書
に記載の組み換え酵母中の胎盤ビクニンの発現を証明す
るものであり、胎盤ビクニン断片の生産における酵母の
有効性を初めて示したものである。

胎盤ビクニン102−159中に含まれるクニッツドメイン
の発現レベルを増加させるため、ならびに、正確なＮ末
端を有するタンパク質の収量を増加させるために、追加
の構築体が調製された。胎盤ビクニン102−159のＮ末端
残基（YEEY−−）は、酵母ａ因子プロ領域を酵素的に除
去する酵母KEX−２プロテアーゼによってほんの僅かに
認識されるにすぎない切断部位しか与えないと我々は推
測した。従って、KEX−２切断部位の周囲のP'サブサイ
トを修飾するために、胎盤ビクニン103−159（EEY...の
Ｎ末端）、101−159（NYEEY...のＮ末端）、および98−
159（DMFNYEEY..）を生産する酵母発現構築体を調製し
た。組み換えタンパク質発現のレベルを増加させるため
に、下記の構築物のいくつかの調製において、哺乳類の
優先コドンよりもむしろ酵母の優先コドンを使用した。
構築物は、本質的に、胎盤ビクニン102−159（構成物＃
１とする）に関して前記に記載したように調製された
が、下記の変更を加えた： 構築体＃２ 胎盤ビクニン103−159、酵母のコドン使用 A5'センスオリゴヌクレオチド および、3'アンチセンスオリゴヌクレオチド を、胎盤ビクニン102−159の発現のための発現構築体
（上記、構築体＃１）の調製に関して記載したように操
作した。

構築体＃３ 胎盤ビクニン101−159、酵母のコドン使用 A5'センスオリゴヌクレオチド および、構築体＃２に関して使用したのと同じ3'アン
チセンスオリゴヌクレオチドを、胎盤ビクニン102−159
の発現のための発現構築体（上記、構築体＃１）の調製
に関して記載したように操作した。

構築体＃４胎盤ビクニン98−159、酵母のコドン使用 A5'センスオリゴヌクレオチド および、構築体＃２に関して使用したのと同じ3'アン
チセンスオリゴヌクレオチドを、発現構築体（上記、構
築体＃１）の調製に関して記載したように操作した。

酵母菌株SC101（MATα、ura ３−52、suc 2）を、前
記cDNAをそれぞれ含有するプラスミドを用いて形質転換
し、ヒトのコドンを使用した胎盤ビクニン102−159の調
製に関して前記に記載した方法によって、タンパク質を
発現させた。約250mLの各酵母培養物を採収し、遠心分
離（15分x3000RPM）からの上澄みを、前記した1mLのカ
リクレイン−セファロースカラムで個々に精製した。得
られたもののトリプシン阻害活性の相対量、回収された
精製タンパク質の量、および精製タンパク質のＮ末端配
列を求め、下記表７に示す。

結果は、Ｃ末端クニッツドメインを有する種々の長さ
の胎盤ビクニン断片により、機能的な分泌タンパク質を
発現する能力が広範囲に変動することを示している。断
片101−159および断片103−159を発現する構築体は、精
製前の上澄み中でほとんど無いかまたは低い酵素活性で
あり、各精製画分の0.05mLアリコートのＮ末端配列決定
では、阻害剤は検出不可能な量であった。一方、胎盤ビ
クニン102−159または98−159のいずれかの発現は、精
製前に有意量のプロテアーゼ活性を生じた。しかし、Ｎ
末端配列決定では、102−159の発現から回収される精製
タンパク質が、再び非常に不正確にプロセッシングされ
ていることを示し、酵母α接合因子プロ配列内の部位で
大部分のプレタンパク質のプロセッシング一致するＮ末
端であることを示していた。しかし、胎盤ビクニン98−
159の発現から回収される精製タンパク質は、完全に正
確な部位においてプロッセシングされて、正確なＮ末端
を生じていた。さらに、胎盤ビクニン102−159の回収と
比較して、ほぼ２倍のタンパク質が回収された。従っ
て、胎盤ビクニン98−159は、α接合因子プレ−プロ配
列/S.セルビシェ（S.cerevisiae）のKEX−２プロセッシ
ング系による、胎盤ビクニンのＣ末端クニッツドメイン
の産生のための、好ましい断片長であることを示す。

実施例６ 酵母発現の他の手順 R74593翻訳産物に由来する58アミノ酸ペプチドは、DN
A配列決定された後にTAベクター（登録商標、Invitroge
n,San Diego,CA）にクローニングされたR87894−R74593
のPCR産物から、またはヒト胎盤cDNAからのいずれかか
ら増幅されたPCR体であってもよい。増幅DNA産物は、翻
訳産物をフレーム内に形成するように、YEEY−−CFRQ
（58残基）をコードするR74593配列に接合された酵母α
接合因子のリーダー配列からの19のヌクレオチドからな
り、α接合因子／クニッツドメイン融合タンパク質を構
成する。タンパク質配列は、クニッツドメインをその天
然のＮ末端において切り離すkex2開裂部も有する。

クローニングのためのHind III部位を有する5'センス
オリゴヌクレオチドは、下記の配列を有する： 3'アンチセンスオリゴヌクレオチドは、クローニング
のためのBamH I部位と、停止コドンとを有し、下記配列
を有する： 酵母発現ベクターにクローニングされる全206ヌクレ
オチドのcDNA配列は、下記配列である。

PCR増幅した後で、このDNAはHind III、BamH Iで消化
され、Hind IIIおよびBamH Iで消化された酵母発現ベク
ターpMT15にクローニングされる（本明細書の開示の一
部を構成する米国特許第5,164,482号を参照）。得られ
たプラスミドベクターを使用して、米国特許第5,164,48
2号に開示されている方法によって、酵母菌株SC106を形
質転換する。URA ３＋ 酵母形質転換体を単離し、誘
導条件下で培養した。前記した生体外アッセイ法を用
い、全時間にわたり培養上澄み中に蓄積したトリプシン
阻害活性の量により、組み換え胎盤ビクニン変異体の収
量を求める。発酵ブロスを9000rpmで30分間遠心分離す
る。次に、上澄みを、0.4μｍフィルター、次いで0.2μ
ｍフィルターで濾過し、7.5msの導電率に希釈し、クエ
ン酸でpH3に調節する。次に、50mMクエン酸ナトリウ
ム、pH3中の、200mLのＳ−セファロース・ファーストフ
ロー（Ｓ−sepharose fast flow、Pharmacia）上で、サ
ンプルをバッチ吸収し、60分間攪拌する。続いて、各2L
の、50mMクエン酸ナトリウム、pH3.0;50mMトリス−HC
l、pH9.0;20mM HEPES、pH6.0で、ゲルを連続して洗浄
する。洗浄したゲルを、適切なカラムに移し、20mM HE
PES pH6.0中の０〜1M塩化ナトリウムの直線勾配で溶離
する。次に、生体外トリプシン阻害活性を有する溶離画
分を溜め、ａ）アンハイドロトリプシン固定化カラム
（実施例２で述べたもの）でのクロマトグラフィー;b）
ウシカリクレイン固定化カラムでのクロマトグラフィ；
またはｃ）ゲル濾過を含む通常のクロマトグラフィー段
階の組み合わせ、および／またはアニオン交換クロマト
グラフィーによって、さらに精製する。

実施例７ 胎盤からの天然ヒト胎盤ビクニンの単離および特性決定 ビクニンタンパク質を、凍結された全胎盤（Analytic
al Biological Services,Inc.,Wilmington,DE）から精
製して見掛上均質にした。胎盤（740gm）を室温に溶か
し、0.5cm〜1.0cmの片に切り、氷の上にのせ、PBS緩衝
液600mLで洗浄した。洗液をデカンテーションし、胎盤
片240mLをワーリングブレンダー（Waring blender）ブ
レンダーに入れた。0.1Mトリス（pH8.0）および0.1M N
aClからなる緩衝液300mLを加えた後、混合物を高速で２
分間混合し、750.0mL遠心分離管にデカンテーションし
て入れ、氷の上にのせた。全物質が処理されるまで、こ
の手順を繰り返した。合わせたスラリーを、４℃におい
て、4500xgで60分間遠心分離にかけた。上澄みをチーズ
クロスで濾過し、製造者の指示に従って、70mgのウシ膵
臓カリクレイン（Bayer AG）を5.0mLのCNBr活性化セフ
ァロース（Pharmacia）に共有結合させることによって
作られるカリクレインアフィニティーカラムを用いて胎
盤ビクニンを精製した。流量2.0mL/分において、物質を
アフィニティーカラムに入れ、洗液の280nmにおける吸
収が検出されなくなるまで、0.1Mトリス（pH8.0）、0.1
M NaClで洗浄した。0.1Mトリス（pH8.0）、0.5M NaCl
でカラムをさらに洗浄し、次に、0.2M酢酸、pH4.0の３
容量を用いて溶離した。カリクレインおよびトリプシン
阻害（下記参照）活性を有する画分を集め、凍結し、凍
結乾燥した。Beckman System Gold HPLC装置に取付けた
スーパーデックス 75 10/30（Superdex 75 10/30、Ph
armacia）カラムを用いるゲル濾過クロマトグラフィー
によって、胎盤ビクニンをさらに精製した。簡単にいう
と、0.1Mトリス、0.15M NaCl、および0.1％トリトンＸ
−100中で、流量0.5mL/分で、カラムを平衡化した。凍
結乾燥サンプルを、1.0mLの0.1Mトリス、pH8.0中で再構
成し、200μＬアリコートをゲル濾過カラムに注入し
た。画分を集め（0.5mL）、トリプシンおよびカリクレ
イン阻害活性に関して分析した。活性画分を溜め、TFA
を加えることによって、溶液のpHを2.5に調節した。0.1
％TFA中の20％アセトニトリル中で平衡化されたVydac C
18逆相カラム（５ミクロン、0.46x25cm）に、物質を直
接入れた。0.1％TFA中の20％アセトニトリルで20分間初
期洗浄した後に、0.1％TFA中の20％〜80％アセトニトリ
ルの直線勾配を用いて、1.0mL/分において50分間分離を
行った。画分（1mL）を集め、トリプシンおよびカリク
レイン阻害活性に関して分析した。阻害活性を有する画
分を、speed−vac濃縮機（Savant）を用いて濃縮し、Ｎ
末端配列分析にかけた。

胎盤ビクニンの機能アッセイ： ウシトリプシンおよびヒト血漿カリクレインを阻害す
る能力を測定することによって、機能性胎盤ビクニンの
同定を行った。アッセイ用緩衝液（50mM Hepes、pH7.
5、0.1M NaCl、2.0mM CaCl₂、0.1％トリトンｘ−100）
中、室温において、96ウェルミクロタイタープレート
（Perkin Elemer）で、基質としてGly−Pro−Lys−アミ
ノメチルクマリンを用いトリプシン阻害活性を実施し
た。プレートリーダーを備えたPerkin−Elemer LS−50B
蛍光計で、蛍光（ex＝370nm、em＝432nm）を測定するこ
とによって、トリプシンにより生成されるクマリンの量
を求めた。トリプシン（100μＬ緩衝液中に23μｇ）
を、試験されるサンプル20μＬと混合し、25℃で10分間
インキュベートした。アッセイ用緩衝液中に、50μＬの
基質GPK−AMC（最終33μＭ）を加えることによって、反
応を開始した。蛍光強度を測定し、各画分の％阻害を、
下式によって求めた： ％阻害＝100x［１−F_o/F₁］ ［式中、F_oは、未知の蛍光であり、F₁は、トリプシンの
みの対照の蛍光である。］。アッセイ用緩衝液（50mMト
リス、pH8.0、50mM NaCl、0.1％トリトンｘ−100）中
の7.0nMカリクレイン、および基質として66.0μＭのPro
−Phe−Arg−AMCとを用いて画分のカリクレイン阻害活
性を同様に測定した。

胎盤ビクニンの生体外特異性の測定 天然ヒト胎盤ビクニンの生体外特異性を、前記実施例
に記載の物質および方法を用いて測定した。GPK−AMCを
基質として用いて、トリプシンの既知濃度に対する活性
部位滴定によって、胎盤ビクニンを定量して、未結合ト
リプシンの画分を監視した。

タンパク質の配列決定 1mL画分（C18−29 Delaria）をSpeed Vacで300mL容量
に希釈して、有機溶媒の量を減少させた。次に、サンプ
ルをHewlett−Packard小型二相反応カラムに入れ、２％
トリフルオロ酢酸1mLで洗浄した。エドマン分解を使っ
て、Hewlett−Packard Model G1005Aタンパク質配列決
定装置で、サンプルの配列決定を行った。バージョン3.
0の配列決定法および全試薬は、Hewlett−Packardから
入手した。配列を50サイクルで確認した。

結果： 連続的なカリクレイン親和性、ゲル濾過、および逆相
クロマトグラフィーによって、胎盤ビクニンを見掛上均
質に精製した（下記の精製表を参照）。

大部分のカリクレインおよびトリプシンの阻害活性
が、pH4.0溶離におけるカリクレインアフィニティーカ
ラムから溶離した。続くゲル濾過クロマトグラフィー
（図５）は、同一条件下において分子量標準で実施する
ことによって生じる標準曲線から判断して、10〜40kDa
の分子量範囲で、カリクレインおよびトリプシンの阻害
活性のピークを生じた。逆相C18クロマトグラフィー
（図６）は、約30％アセトニトリルでの最も有効な溶離
によって、阻害活性の４つのピークを生じた。C18から
溶離する最初のピーク（画分29）に伴う活性は、胎盤ビ
クニンの予測されるアミノ酸配列のアミノ酸１で開始す
るアミノ酸配列を示し（ADRER...;配列番号:1）、配列
分析の50サイクルに関して予測される配列と同一であっ
た（図３中の下線を引いたアミノ酸）。この配列ストレ
ッチ中のシステイン残基は、酸化されたタンパク質の配
列決定に関して予測されるようにサイレントであった。
成長胎盤ビクニンのアミノ酸の11位および20位における
システイン残基は、後に、Ｓ−ピリジルエチル化タンパ
ク質の配列決定から同定され、そのときにPTH−ピリジ
ルエチル−システインがサイクル11および20において回
収された。

興味深いことに、配列（図３）のアミノ酸残基番号30
におけるアスパラギンはサイレントであり、この位置が
グリコシル化されている可能性があることを示した。画
分29は、残基＃１において開始する胎盤ビクニンの配列
に対応する１つの主要な配列（サイクル１において27pm
ol）と、残基６において開始する胎盤ビクニン（SIH
D...）から導かれる副配列（2pmol）とを生じた。この
ことは、画分29中に配列した最終調製品が非常に純粋で
あり、この画分に関係するプロテアーゼ阻害活性に最も
関係していると考えられることを示している（図６）。

従って、C18クロマトグラフィーからの胎盤ビクニン
の最終調製品は、銀染色SDS−PAGE分析に基づいて非常
に純粋であり（図７）、この分析において、以下の分子
量マーカー：インシュリン（2.9kDa）；ウシトリブシン
阻害剤（5.8kDa）；リゾチーム（14.7kDa）；β−ラク
タグロブリン（18.4kDa）；カルボニックアンヒドラー
ゼ（29kDa）；およびオボアルブミン（43kDa）；で校正
された10％〜20％アクリルアミド トリシンゲル（Nove
x,San Diego,CA）上で、タンパク質は24kDaの見掛Mrで
移行している。SDS−PAGEにおける胎盤ビクニンの前記
サイズは、全長コード配列から予測されるサイズと一致
する（図4F）。

前記のＮ末端配列決定結果に基づいて予測されるよう
に、精製タンパク質は、胎盤ビクニン（７−64）に誘発
される抗体と反応して、銀染色によってゲル上に検出さ
れる、精製調製品で観察されたのと同じMr（図12A）を
有するバンドを生じた（図７）。しかし、同じ調製品
を、合成胎盤ビクニン（102−159）に誘発された抗体と
反応させた場合には、全長タンパク質に対応するバンド
が観察されなかった。むしろ、約6kDaの合成ビクニン
（102−159）と共に移動する断片が観察された。これら
の結果を単純に解釈すると、精製調製品が、精製後に分
解して、Ｎ末端ドメインを含んでいるＮ末端断片と、Ｃ
末端ドメインを含んでいるＣ末端断片とを生じたという
ことである。胎盤ビクニン（７−64）に対する抗血清に
対して反応性の断片が、全長タンパク質のＣ末端を欠失
していると考えるならば、このサイズ（24kDa）は高い
グリコシル化状態を示唆している。

下記表６は、胎盤ビクニンによる、種々のセリンプロ
テアーゼの生体外阻害の有効性を示している。データ
は、アプロチニン（Trasylol（登録商標））を用いて得
たデータと比較されている。

結果は、天然源（ヒト胎盤）から単離された胎盤ビク
ニンが、トリプシン様セリンプロテアーゼの有効な阻害
剤であることを示している。

実施例８ 種々のヒト臓器および組織中における、胎盤ビクニンの
発現パターン ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、お
よび膵臓からの、ポリＡ＋RNA2μｇを含有する、多種組
織ノーザン製品（multiple tissue northern）を、Clon
techから購入した。２種の異なるcDNAプローブを使用し
た:1）胎盤ビクニン（102−159）をコードしているゲル
精製されたcDNA;2）EcoR Iでの消化によりTAクローンか
ら得られ、ゲル精製された、780塩基対のPCR由来cDNA
（図4E）。各プローブを、Boehringer Mannheim Bioche
micals（Indiana）から入手できるランダムプライミン
グ標識キットと、³²P−dCTPとを用いて標識し、次に、
製造者の仕様に従い多種組織ノーザン製品にハイブリダ
イズさせるのに使用した。Biomaxフィルムを用い、18時
間の曝露してオートラジオグラフを得、Umaxスキャナー
を用いて現像し、Adobe Photoshopを用いてスキャンし
た。

結果： 胎盤ビクニン（102−159）プローブ（図11A）または
胎盤ビクニン（図11B）の両方のクニッツドメインを有
するより大きいプローブを使用して観察された組織発現
のパターンは、予測したものと本質的に同じであった。
胎盤ビクニンmRNAは、膵臓および胎盤において、最も多
かった。有意なレベルが、肺、脳、および腎臓において
も観察され、一方、心臓および肝臓においては、より低
いレベルであった。また、骨格筋においてはmRNAが検出
されなかった。転写サイズは全ての場合において1.95キ
ロベースであり、ESTの重ね合わせ（overlay）および前
記の全長cDNAのクローニングの両方から推定される胎盤
ビクニンの予測サイズと近似していた。

mRNAの広い組織分布は、胎盤ビクニンが広範囲に発現
されることを示す。このタンパク質はリーダー配列をも
有するので、ヒト免疫系に充分に提示し、自己タンパク
質として認識される必要がある。胎盤ビクニンmRNA発現
の広い組織分布をさらに証拠づけるのは、胎盤ビクニン
に相同のESTエントリーのいくつかが（図4B）、ヒト成
人および幼児の脳、ヒトの網膜、乳房、卵巣、嗅覚上
皮、および胎盤に由来したという事実である。従って、
天然ヒトタンパク質のヒト患者への投与は、免疫応答を
誘起させないであろうと結論づけられる。

興味深いことに、胎盤ビクニンの発現パターンは、ウ
シの肺および膵臓において高レベルに見い出されるウシ
アプロチニンの発現パターンを幾分想起させるものであ
る。胎盤ビクニンの発現パターンをさらに解明するため
に、下記のヒト細胞からの全RNAのRT−PCRを決定した：
非刺激のヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、HK−２（腎
臓近位尿細管に由来する系）、TF−１（赤白血病系）、
およびホルボールエステル（PMA）刺激のヒト末梢血液
白血球。使用したプローブは、 で、600b.pの胎盤ビクニンをコードするcDNA断片を増幅
するようにデザインされている。800b.p.のアクチン断
片を増幅するアクチンプライマーを包含することによっ
て、比較を標準化した。アガロースゲル上において臭化
エチジウムで同定される800b.p.の断片は全てのレーン
で等しい強度であったが、600b.p.の胎盤ビクニン断片
は、HUVECに存在しなかったが、他の各細胞系には有意
量で存在した。胎盤ビクニンは、少なくともいくつかの
内皮細胞において発現されないが、いくつかの白血球集
団では発現されると我々は結論付けた。

実施例９ バキュロウイルス/Sf9発現系から高度に精製された胎盤
ビクニン（１−170）の精製および特性 両方のクニッツドメインを有する胎盤ビクニン（胎盤
ピクニン１−170）の大きいフラグメントを、下記のよ
うにSf9で発現させた。PCR（図4E）によって得られ、TA
ベクター（前記実施例を参照）中に含まれる胎盤ビクニ
ンcDNAを、Hind IIIおよびXba Iでの消化によって、5'X
ba I部位および3'Hind III部位が隣接した断片をを得
た。この断片をゲル精製し、次に、M13mp19ベクター（N
ew England Biolabs,Beverly,MA）にクローニングし
た。生体外突然変異誘発法（Kunkel T.A.,（1985）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,82:488−492）を用いて、5'末端
においてXba I部位に対して3'にPst I部位を生じさせた
が、ATG開始部位、天然胎盤ビクニンシグナルペプチド
および成熟胎盤ビクニンをコードする配列に対して5'に
は生じさなかった。突然変異誘発に使用されたオリゴヌ
クレオチドは、下記配列を有した： 停止コドン（TAG）およびBGl II/Xma I部位も、以下の
オリゴヌクレオチドを用いて、cDNAの3'末端において同
様に処理した。

停止コドンは、胎盤ビクニンをコードする配列と共にフ
レーム内にあり、アミノ酸残基170におけるリジンの直
ぐ後で終結を生じさ、従って、推定膜貫通ドメインを欠
失したトランケートされた胎盤ビクニン断片をコードし
ているものである。Pst IおよびBgl IIによる消化から
の産物を単離し、両方のクニッツドメインを有するが、
推定膜貫通セグメントのＮ末端で直ぐにトランケートさ
れた胎盤ビクニン断片（１−170）を発現するためのBac
Pac8ベクターにクローニングした。

Sf−９昆虫細胞によるビクニンの発現は、感染後72時
間で培地が採収された場合に、1:1の感染多重度におい
て最適であった。採収後、バキュロウイルス細胞培養上
澄み（2L）を、トリス−HClを加えることによってpH8.0
に調節した。胎盤からの天然胎盤ビクニンの精製に関し
て実施例７に記載したように、5mLのウシ膵臓カリクレ
インアフィニティーカラムを用いるクロマトグラフィー
によって、ビクニンを精製した。溶離された物質を、TF
AでpH2.5に調節し、流量1mL/分で、0.1％TFA中10％アセ
トニトリル中で平衡化したC18逆相カラム（1.0x25cm）
でクロマトグラフィーにかけた。0.1％THF中10％〜80％
アセトニトリルの直線勾配を用い、40分間でビクニンを
溶離した。活性画分を溜め、凍結乾燥し、50mM Hepes
（pH7.5）、0.1M NaCl、2mM CaCl₂、および0.1％トリ
トンｘ−100中に再溶解し、必要になるまで−20℃で保
管した。組み換えビクニンの濃度はアミノ酸分析によっ
て求めた。

結果： 下記に示す２段階精製プロトコールを用いて、組み換
えビクニンをバキュロウイルス細胞培養上澄みから精製
し、活性なトリプシン阻害剤を得た（下記表８参照）。

ウシ膵臓カリクレイン固定化アフィニティーカラムで
の粗物質のクロマトグラフィーによって、タンパク質の
0.013％および存在するトリプシン阻害活性の0.67％を
選択的に単離した。出発上澄み中に存在するトリプシン
阻害活性の大部分は、固定化カリクレインと結合せず、
ビクニンと関係がない（結果を示さず）。続くC18逆相
を用いたクロマトグラフィーによって、さらに５倍の精
製を0.2％の回収率で得た。最終調製品は、SDS−PAGEに
よって高純度であり（図13）、21.3kDaのMrを示し、イ
ムノブロットにおいて、ウサギ抗胎盤ビクニン102−159
に反応した（図示せず）。Ｎ末端配列決定（26サイク
ル）によって、残基＋１（ADREP...）で開始する成熟胎
盤ビクニンの予測される配列（図4F）が得られ、シグナ
ルペプチドがSf9細胞において正確に処理されたことを
示している。

Sf9細胞からの精製胎盤ビクニン（100pmol）を、ピリ
ジルエチルアルキル化し、CNBr化し、次に、得られた断
片を分別することなしに配列決定を行った。20サイクル
の配列決定によって、下記のＮ末端を得た： 従って、予測される４つの断片にそれぞれ対応するＮ
末端が回収された。このことは、Sf9発現タンパク質
が、胎盤ビクニン（１−170）の全エクトドメイン配列
を有することを確認するものである。未消化の胎盤ビク
ニン（１−170）の追加サンプルのＮ末端配列決定（50
サイクル）は、サイクル30においてPTH−アミノ酸（PTH
−アスパラギンが予測された）が欠失したアミノ酸配列
を生じた。同様の結果が、ヒト胎盤からの天然タンパク
質の配列決定時に得られ（実施例７）、また、このアス
パラギン残基を囲むアミノ酸配列から予測して、グリコ
シル化されているこの残基と一致した。さらに、この領
域内のシステイン残基も、ジスルフィド結合へのそれら
の参加と一致してサイレントであった。

実施例10 Sf9細胞由来の精製胎盤ビクニンの阻害特異性 実施例３、４、および７に記載の物質および方法を使
って、組み換えビクニンの生体外特異性を測定した。さ
らに、ビクニンによるヒト組織カリクレインの阻害を、
50mMトリス（pH9.0）、50mM NaCl、および0.01％トリ
トンｘ−100を含有する緩衝液中で、0.35nMのヒト組織
カリクレイン 組み換えビクニンをインキュベーション
することによって測定した。５分後、37℃において、５
μＬの2mM PER−AMCを加え、蛍光の変化を監視した。

組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）の阻害も、
下記のように測定した:tPA（Sigma Chemical Co,St Lou
is,MOから入手されるヒトメラノーマ細胞培養物からの
一本鎖形）を、150mM NaClおよび0.02％アジ化ナトリ
ウムを含有する20mMトリス緩衝液pH7.2中において、室
温で２時間、阻害剤と予備インキュベーションした。続
いて、下記の開始成分濃度:0.04％（v/v）トリトンｘ−
100および0.005％（v/v）アジ化ナトリウムを含有する2
8mMトリス緩衝液pH8.5中の、tPA（7.5nM）、阻害剤０〜
6.6μＭ、DIle−Lpro−Larg−ｐニトロアニリン（1m
M）、を含む反応系に移すことによって反応を開始し
た。ｐ−ニトロアニリンの形成を、37℃で２時間のイン
キュベーション後に測定されたA405nmから求めた。

下記表は、種々のセリンプロテアーゼの阻害剤として
の組み換えビクニンの生体外での有効性を示している。
組み換えビクニンまたはアプロチニンのどちらかを用い
ての阻害のスクリーニングに関して得たデータと比較し
て、データが示されている。

結果は、組み換えビクニンが昆虫細胞に発現されて、
少なくとも５種類のセリンプロテアーゼ阻害剤に対して
有効な、活性プロテアーゼ阻害剤を生じ得ることを示し
ている。組み換えビクニンは、ヒト血漿カリクレイン、
トリプシン、およびプラスミンに対して、アプロチニン
よりも有効であった。驚くべきことに、組み換えビクニ
ンは、試験された全ての酵素に対して、合成的に誘導さ
れたビクニンフラグメント（７−64）および（102−15
9）よりも有効であった。これらのデータは、生体外ア
ッセイを用いて、組み換えビクニンがアプロチニンより
も有効であること、および、より良好な生体内有効性が
期待できることを示している。

特定のプロテアーゼに対する有効性の測定に加えて、
活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partia
l thromboplastian time、APTT）を延長する胎盤ビクニ
ン（１−170）の能力を、評価し、アプロチニンに関係
する活性と比較した。150mM NaClおよび0.02％アジ化
ナトリウムを含有する20mMトリス緩衝液pH7.2中で、阻
害剤を稀釈し、MLA Electra（登録商標）800 Automati
c Coagulation Timer coagulometer（Medical Laborato
ry Automation,Inc.,Pleasantville,N.Y.）内のキュベ
ットに入れた（0.1mL）。装置を、300秒の活性化時間で
のAPTTモード、および繰り返し（duplicate）モードに
セットした。0.1mLの血漿（Specialty Assayed Referen
ce Plasma lot 1−６−5185,Helena Laboratories,Beau
mont,TX）の添加に続いて、APTT試薬（Automated APTT
−lot 102345,Organon Teknika Corp.,Durhan,NC）およ
び25mM CaCl₂を、自動的に供給して、血液凝固を開始
させ、凝固時間を自動的に監視した。結果（図14）は、
凝固時間を２倍にするには、約２μＭの最終アプロチニ
ンを必要とするが、Sf9からの胎盤ビクニンは0.3μＭの
みでよいことを示している。これらのデータは、胎盤ビ
クニンが有効な抗凝固物質であり、凝固の内因性経路の
病理学的活性化を含む病気のための薬剤として有用であ
ることを示している。

本発明のいくつかの実施態様を、例示を目的として詳細
に説明したが、本明細書に記載されている方法および製
剤が、本発明の意図および範囲を逸脱することなく変更
できることは当業者に明らかである。従って、本発明
は、請求の範囲による以外は制限されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／７２５，２５１ (32)優先日 平成８年10月４日(1996．10．4) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (72)発明者 デイヴィス、ゲイリー. アメリカ合衆国 06460 コネティカッ ト州 ミルフォード タングルウッド サークル 137 (72)発明者 デラリア、キャスリーン エイ. アメリカ合衆国 06516 コネティカッ ト州 ウエスト ヘイヴン ウエスト ウォーク ストリート 180 (72)発明者 マーラー、クリストファー ダブリュ ー. アメリカ合衆国 06524 コネティカッ ト州 ベサニー ロバートスン ドライ ブ 11 (72)発明者 ミューラー、ダニエル ケイ. アメリカ合衆国 06477 コネティカッ ト州 オレンジ ヘムロック ヒル ロ ード 253 (56)参考文献 特開 平９−95498（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/02 C07K 14/47 - 14/825 C12N 9/99 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記アミノ酸配列の１つをそれぞれ含む物
   質からなるタンパク質の群から選択され、セリンプロテ
   アーゼ阻害活性を有する実質的に精製されたタンパク
   質。 【配列番号５２】 【配列番号４９】 【配列番号７１】 【配列番号２】 【配列番号４５】 【配列番号４７】 【配列番号７０】 【配列番号３】 【配列番号５０】 【配列番号１】 上記配列中、前記配列のアミノ酸は、シグナルペプチド
   の除去によって得られるＮ末端残基が残基１として指定
   されており、図4Fに示されている天然ヒト胎盤ビクニン
   のアミノ酸配列に従って番号付けされている。
2. 【請求項２】下記アミノ酸配列の１つをそれぞれ含む物
   質からなるタンパク質の群から選択され、セリンプロテ
   アーゼ阻害活性を有する実質的に精製されたタンパク
   質。 【配列番号４】 【配列番号５】 【配列番号８】 上記配列中、前記配列のアミノ酸は、シグナルペプチド
   の除去によって得られるＮ末端残基が残基１として指定
   されており、図4Fに示されている天然ヒト胎盤ビクニン
   のアミノ酸配列に従って番号付けされている。
3. 【請求項３】下記アミノ酸配列の１つをそれぞれ含む物
   質からなるタンパク質の群から選択され、セリンプロテ
   アーゼ阻害活性を有する実質的に精製されたタンパク
   質。 【配列番号６】 【配列番号７】 上記配列中、前記配列のアミノ酸は、シグナルペプチド
   の除去によって得られるＮ末端残基が残基１として指定
   されており、図4Fに示されている天然ヒト胎盤ビクニン
   のアミノ酸配列に従って番号付けされている。
4. 【請求項４】配列番号８を含み、ただし配列番号49また
   は71からならない請求項２に記載のタンパク質。
5. 【請求項５】前記タンパク質が、グリコシル化される
   か、または少なくとも１つの鎖内システイン−システイ
   ンジスルフィド結合を有するか、あるいは、グリコシル
   化され、かつ少なくとも１つの鎖内システイン−システ
   インジスルフィド結合を有するかのいずれかである請求
   項１乃至４のいずれか一項に記載のタンパク質。
6. 【請求項６】請求項１乃至４のいずれか一項に記載のタ
   ンパク質をコードする単離された核酸。
7. 【請求項７】請求項１乃至５のいずれか一項に記載のタ
   ンパク質を、コードし、発現することができる核酸を有
   する自己複製タンパク質発現ベクター。
8. 【請求項８】セリンプロテアーゼと、請求項１乃至５の
   いずれか一項に記載の少なくとも１つのタンパク質の有
   効量とを接触させることを備えるセリンプロテアーゼ活
   性を阻害する方法。
9. 【請求項９】組み換えDNA技術を用いて、請求項１乃至
   ５のいずれか一項に記載のタンパク質を調製する方法。