JP2006512308A - 糖尿病関連及び／又は動脈低治癒性創傷の治療及び／又は予防のための、α−１−アンチキモトリプシン（ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）ポリペプチドまたはそれをコードしている核酸の、α−１−アンチトリプシン（ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）ポリペプチドまたはそれをコードしている核酸と組み合わせた使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、α−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）ポリペプチド、その機能的変異体及び／又はそれをコードしている核酸の、またはＡＣＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸の、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド、その機能的変異体またはそれをコードしている核酸と、またはＡＡＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸と組み合わせた使用に関する。

Description

本発明は、α−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）ポリペプチド、その機能的変異体及び／又はそれをコードしている核酸の、またはＡＣＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸の、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド、その機能的変異体またはそれをコードしている核酸と、またはＡＡＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸と組み合わせた使用に関する。

健康患者における皮膚創傷は、通常、合併症無しに治癒する。しかしながら、組織の完全な治癒を達成するためには、皮膚の細胞組成における多くの時間的かつ空間的変化が必要である。このプロセスは２年まで続くことがあり非胎児組織中では常に瘢痕形成を伴う。これは、皮膚における創傷治癒プロセスのかなりの複雑性を意味する。創傷治癒プロセス中、異なる時間的かつ空間的重複相：すなわち、凝固、炎症、増殖及び再構築（ｒｅｍｏｄｅｌ）を識別することができる（Ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ、１９９８，Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｉｎｇ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ）。凝固中、血小板は凝集し、成長及び凝固因子を放出する。線維素マトリクスが形成され、すなわち、細胞が創傷部中に遊走可能になる。創傷の約５〜７日後、種々の細胞型、特に炎症反応の媒介物質を放出する好中性顆粒球及び単球が創傷部中に遊走することにより炎症反応が引き起こされる。増殖相中、血管が修復され、創傷組織が再生され、再生組織が再構築される。増殖相中のプロセスは、特に、血管新生、線維芽細胞増殖及び、ケラチノサイトの増殖及び分化による再上皮形成を含む。線維芽細胞は、ＰＤＧＦやＴＧＦ−βのような幾つかの成長因子を放出し、それにより、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン及びコラーゲンのような細胞外マトリクス（ＥＣＭ）成分の合成及び析出が制御される。

組織の再編成中、ＥＣＭ成分、特に、コラーゲンが再配列される。コラーゲンが連続的に分解され新しく合成される結果、再上皮形成された創傷部が成熟し、扁平瘢痕が２年以内に形成される。この場合もやはり、組織を調和的に再構成するのに、多数の成長因子及び化学的誘引物質が必要である。すなわち、インターロイキン１、ＴＮＦ−β及びインターフェロンγが、ＥＣＭ成分の分泌に影響を与える。ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ及びＦＧＦも、再構築に必須である。

しかしながら、破壊された構造の再構成に貢献するプロセスに加えて、蛋白分解プロセスも創傷治癒に重要である。蛋白分解プロセスは、細胞破片の除去及び線維素マトリクスのような中間構造体の分解に関与する。すなわち、創傷部の端部において多くのプロテアーゼが活性である（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：７５−８１）。例えば、プラスミノーゲンがプラスミノーゲン活性化剤により活性化され、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤がケラチノサイトの遊走において上方制御され、その前方に配された線維素マトリクスを分解できるようになる。このことは、プラスミノーゲンノックアウトマウスが実質的に再上皮形成を示さないという観察に一致する。メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）も重要な役割を果たす。ＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ）、ＭＭＰ１（間質性コラゲナーゼ）及びＭＭＰ１０（ストロメリシン−２）が、種々の時点において活性化され、異なる基質特異性により特徴付けられる。好中性顆粒球及び単球（マクロファージ）もプロテイナーゼを分泌する（Ｄｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐ．Ｒｅｇ.７：４３３−４４１；Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９１，２７：９５−９８）。単球は、細胞内セリンプロテアーゼであるエラスターゼ及びカテプシンＧを含み、少量のメタロプロテイナーゼを分泌する。すなわち、単核食細胞の分化において、カテプシンＧの発現が抑制され、コラゲナーゼの発現が遅延する。成熟マクロファージにおいて、刺激に続いてメタロプロテイナーゼの発現が強力に誘発されることが観察された（Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９１，２７：９５−９８）。

慢性創傷に関しては、マトリクスメタロプロテイナーゼに特に関心の的が注がれた。すなわち、慢性創傷の浸出液において見られるコラーゲン分解活性の量は、手術創傷部または切開皮膚創傷部の浸出液において見られるものと比べて著しく増加する（Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０７：７４３−７４８）。例えば、種々の検討により、ＭＭＰ−１の量が慢性創傷部において著しく増加すること、ＭＭＰ−１が慢性創傷部の浸出液において優勢なコラゲナーゼであることの証拠が得られた（Ｖａａｌａｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１０９：９６−１０１；Ｎｗｏｍｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，８１：１８９−１９５）。慢性創傷部においてＭＭＰ８もより強力に発現される（Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０７：７４３−７４８；Ｎｗｏｍｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，８１：１８９−１９５）。間質性コラゲナーゼクラスに属するＭＭＰに加えて、他のＭＭＰ、すなわち、ゼラチナーゼＭＭＰ２及びＭＭＰ９及びストロメライシンＭＭＰ３、ＭＭＰ１０及びＭＭＰ１１が、慢性創傷部中に増加量で存在することが示された（Ｎａｇａｓｅ及びＷｏｅｓｓｎｅｒ，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７４；２１４９１−２１４９４）。セリンプロテアーゼ活性、すなわち、エラスターゼ活性が慢性創傷部中に存在し、この活性が線維素及びフィブロネクチンを分解すると仮定された（Ｐａｌｏｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ.，２：２９−３７；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０５：５７２−５７８；Ｇｒｉｎｎｅｌｌ及びＺｈｕ，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０６：３３５−３４１；Ｈｅｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７７：２８１−２８８）。

もう一つのセリンプロテアーゼであるカテプシンＧが、慢性床ずれにおける肉芽組織において検出された（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐ．Ｒｅｇ，３：２７３−２８３）。これに対して、静脈の足壊疽において増加量のカテプシンＧを観察することはできなかった（Ｗｅｃｋｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０６：１１１９−１１２４）。これらの明らかに矛盾する結果は、「慢性皮膚創傷」という用語が、異なる病因背景を有する異なる疾病を完全に網羅していることを示す。通常、糖尿病性潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍及び床ずれは識別される。床ずれは、非常に深い創傷であり、組織の壊死、感染及び浸軟を伴う。これらは、所定の皮膚領域への長期の加圧により形成される。これに対して、静脈潰瘍は、むしろ表面的であり、静脈鬱血により引き起こされ、一方、動脈潰瘍は、動脈閉塞疾患により頻繁に引き起こされる。一方、糖尿病性潰瘍は、糖尿病患者においてしばしば生じる潰瘍である。多数の糖尿病関連合併症のうち、糖尿病の晩期合併症は、頻繁な感染、栄養障害及びリポイド類壊死のような皮膚における特徴的変化も含む。これらの変化が発達して、多くの場合微小血管障害の結果として、低治癒性潰瘍になる。これらの疾患の疫学的重要性が、以下の調査発見事項を考慮すると、明らかである：ＩＩ型糖尿病を被っている患者の２５％が、しばしば、慢性潰瘍（「糖尿病脚」）を発現し、その約半分が、入念な入院による治療を必要とする。それにも拘わらず、これらの潰瘍は、結局治癒性が低い。糖尿病脚は、糖尿病に拘わるいずれの合併症よりも入院率が高い。Ｉ型及びＩＩ型糖尿病に拘わるこれらの症例の数は増加しており、全ての入院患者の約２．５％を占める。

阻害された過度に強力な蛋白分解活性が、慢性創傷における低治癒の原因であると仮定された（Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐ．Ｒｅｇ．，７：４３３−４４１）。正常治癒性創傷においては、広範囲のプロテアーゼ阻害剤により蛋白分解活性と抗蛋白分解活性との間の平衡が提供される。この理論は、メタロプロテイナーゼ阻害剤ＴIＭＰ−１、非特異的プロテアーゼ阻害剤α２−マクログロブリン及びエラスターゼ阻害剤α１−プロテアーゼ阻害剤のような慢性創傷部中のプロテアーゼ阻害剤の量の低下の観察により支持される（Ｙａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐ．Ｒｅｇ，５：２３−３２；Ｇｒｉｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１０；７７１−７７６；Ｂｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０４；２３６−２４０；Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０５：５７２−５７８；Ｇｒｉｎｎｅｌｌ及びＺｈｕ，１９９６，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０６：３３５−３４１）。この欠乏により、これらのプロテアーゼ阻害剤に関して不完全な「抗プロテアーゼ遮蔽」が起こり得ると考えられる。その結果、コラーゲンの代謝がその合成より速い。これらの結果は、他の研究により確認される（Ｎｗｏｍｅｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，８１：１８９−１９５；Ｖａａｌａｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１３５；５２−５９；Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｓｕｒｇｅｒｙ １２４：４６４−４７０）。すなわち、外因性プロテアーゼ阻害剤を投与することにより、それぞれ低下または欠如するプロテアーゼ阻害剤の発現を、高めるまたは誘発することにより抗プロテアーゼ遮蔽を増加させる指摘がなされた。この仮定に基づいて多数のメタロプロテイナーゼの阻害剤が開発された（ＷＯ２０００７３２９５；ＵＳ６１６６０８４；ＷＯ２００１０５３９７；ＷＯ２０００６３１６５；ＷＯ２０００４６１８９；ＷＯ２０００４４７２３；ＤＥ１９８５１１８４；ＵＳ６０７１９０３；ＥＰ−１００４５７８；ＥＰ−９４９２４６；ＷＯ９８５８９２５；ＥＰ−８７８４６７）が、そのいずれも、慢性皮膚創傷の治療を意図しプロテアーゼ−抗プロテアーゼ平衡に介在する薬剤として認可されていない。さらに、現在までの研究は、「慢性潰瘍」という用語下に分類されている種々の疾患の間を識別していなかった。この理由のため、研究の結果を創傷治癒プロセス中に他の障害へと容易に転換することができない。すなわち、今まで、慢性創傷治癒障害のための効果的治療はなかった。達成された治療形式は、創傷治癒の物理的支持（例えば、ドレッシング、圧迫ガーゼ及びゲル）に限定され、壊死組織の擦過除去に限定され、皮膚組織、培養皮膚組織及び／又はマトリクス蛋白の移植に限定される。近年、成長因子なしで創傷治癒を向上させる一方で、決定的なやり方で従来の治療を向上できる可能性に関して、成長因子を検証してきた。

ＩＩ型糖尿病患者の数が世界的に著しく増加していること、及び動脈潰瘍を被っている患者の数が多いことを考慮すると、低治癒性糖尿病関連創傷及び低治癒性動脈創傷の治療を著しく向上させる新規活性化合物の需要が大きい。従って、本発明の目的は、低治癒性糖尿病関連創傷及び低治癒性動脈創傷の治療を著しく向上させる新規活性及び安定治療組成物を発見することであった。

ＡＣＴポリペプチドの活性は、静脈潰瘍のみならず正常治癒性創傷におけるＡＣＴの活性の観察された増加と比較して、低治癒性糖尿病創傷において選択的に減少することが発見された。また、ＡＣＴは、非糖尿病生物と比べて糖尿病生物を治療するのに特に適していると分かった。しかしながら、創傷の環境はポリペプチドに対して極めて侵襲的である。すなわち、創傷中に多量に存在するエラスターゼによりＡＣＴが特に不活化され得る（実施例２を参照）。エラスターゼによる蛋白分解不活性化及び／又は劣化に対してＡＣＴを保護するために、ＡＣＴポリペプチド及び／又はそれをコードしている核酸、またはＡＣＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸を、ＡＡＴポリペプチド及び／又はそれをコードしている核酸と、またはＡＡＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸と組み合わせて用いて、哺乳動物における糖尿病関連創傷及び／又は動脈低治癒性創傷を治療及び／又は防止することができる。一つの好ましい実施形態において、この組み合わせは、単一のＡＣＴ／ＡＡＴハイブリッドポリペプチドにより達成され、このポリペプチドはエラスターゼとキモトリプシンの両方の阻害機能を有し、配列番号９（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）によるＬｅｘ０３２ポリペプチドが特に好ましい。そのようなハイブリッドポリペプチドは、例えば、ＷＯ９５／２７０５５で知られており、成熟蛋白の位置３５８におけるアミノ酸がメチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニン及びグルタミン酸に突然変異されているＡＣＴポリペプチドを含む。成熟ヒトＡＣＴのアミノ酸３５６−３６１がＩｌｅ−Ｐｒｏ−ＸＸＸ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ（ここで、ＸＸＸは、メチオニン、トリプトファン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン及びバリンからなる群より選択される）で置換されているようなポリペプチドも開示されている。特に、成熟ヒトＡＣＴのアミノ酸３５６−３６１がＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏで置換されているポリペプチドＬｅｘ０３２が、エラスターゼ及びキモトリプシンの両方の阻害において効果的であると分かった。

本発明の脈絡の中で実施された実施例１は、健康動物の治療と比較して、糖尿病哺乳動物の低治癒性創傷及び低治癒性動脈創傷の治療へのＡＣＴの特異的効果を示している。実施例２は、ＡＣＴポリペプチドが糖尿病患者の慢性創傷液において豊富であるが、急性創傷または慢性静脈創傷からの創傷液と比べて、活性ＡＣＴの割合が極めて低いことを示している。これらの発見は、驚くべきことに、ＡＡＴと組み合わされたＡＣＴが、糖尿病関連創傷及び／又は動脈低治癒性創傷の治療及び予防に特に適しているという概念を支持している。好ましい実施形態において、糖尿病関連創傷は慢性糖尿病創傷である。特に好ましい実施形態において、糖尿病関連創傷は糖尿病潰瘍である。特に好ましい実施形態において、創傷は糖尿病潰瘍または動脈潰瘍であり、最も好ましくは糖尿病潰瘍である。

ＡＣＴは、カテプシンＧの主な既知の内因性プロテアーゼ阻害剤である。ヒトにおいては、多形性が特にシグナルペプチド配列に記載されている一つのＡＣＴ遺伝子が、知られている（Ｒｕｂｉｎ，１９８９，データベース登録）。シグナルペプチドを有するヒトＡＣＴポリペプチド配列の配列が配列番号６（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）に示されている。シグナルペプチドを有しない成熟ヒトＡＣＴポリペプチド配列の配列が配列番号７（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）に示されている（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９９７：９０−９５（１９８９）。もう一つの生体内で優勢な成熟ＡＣＴポリペプチドの配列が配列番号１０に示されている。両方の成熟ＡＣＴポリペプチドが、シグナルペプチドの開裂により得られる。配列番号７及び１０によるＡＣＴポリペプチドと比べてＡＣＴ活性を示すＡＣＴポリペプチドは、例えば酵母中での組換え発現により得ることができると共に配列番号７及び配列番号１０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）による成熟ＡＣＴポリペプチドの配列が続くＮ−末端メチオニンにより特徴付けられる配列番号１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）および配列番号１２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２）によるポリペプチドである。そのようなＮ−末端延長、例えば、発現及び／又は精製を容易にするために導入することができるメチオニン延長は、ＡＣＴ活性に影響を与えない。配列番号６をコードしている、ヒトＡＣＴ核酸コード配列の配列が、配列番号８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８）に示されている。げっ歯類の場合、ＡＣＴに相同の多数の遺伝子の証拠があり、マウスセリンプロテアーゼ阻害剤２−２（ｓｐｉ２−２）（配列番号１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１））は、反応中心、組織分布及び炎症に続く誘発性について一致が著しいので、ヒトＡＣＴ遺伝子への機能的相同体である（Ｉｎｇｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ １０６：２１３−２２０）。ｓｐｉ２−２のコード配列が配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）に示されている。げっ歯類セリンプロテアーゼ阻害剤２−２ファミリーの他のメンバーは、ラットのｓｐｉ２−２及びｓｐｉ３及びヨーロッパモリネズミ（Ａｄｏｄｅｍｕｓ ｓｙｌｖａｔｉｃｕｓ）（Ｉｎｇｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，前述参照）からのｓｐｉ２−２相同体である。

α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、好中球エラスターゼの主要な天然阻害剤であり、それにより、エラスターゼによる蛋白分解劣化及び不活性化からＡＣＴを保護する。ＡＡＴの種々の対立遺伝子が存在し、最も頻繁に発生する対立遺伝子を配列番号３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）に示す。シグナルペプチドの一部を欠く成熟ポリペプチドの配列を配列番号４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）に示す。成熟ＡＡＴポリペプチドの配列を配列番号１４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）に示す。配列番号４及び１４によるＡＡＴポリペプチドに匹敵するＡＡＴ活性を示すＡＣＴポリペプチドは、例えば酵母中での組換え発現により得ることができると共に配列番号４及び配列番号１４による成熟ＡＡＴポリペプチドの配列が続くＮ−末端メチオニンにより特徴付けられる配列番号１３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）および配列番号１５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５）によるポリペプチドである。そのようなＮ−末端延長、例えば、発現及び／又は精製を容易にするために導入することができるメチオニン延長は、ＡＡＴ活性に影響を与えない。配列番号３によるＡＡＴポリペプチドのためのコード配列が、配列番号５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）に示されている。ＡＡＴの主要な生理学的機能は、ヒト白血球エラスターゼによる破壊に対する下部呼吸器管の保護である。ＡＡＴの遺伝的欠損は、慢性閉塞性疾患を進行させる２０〜３０倍増加した危険性に関与する。皮膚創傷において、ヒト好中球エラスターゼの阻害剤としてのその機能が顕著である。創傷治癒におけるＡＡＴの役割が、文献に記載されている（例えば、Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０５：５７２−５７８）；しかしながら、糖尿病関連創傷及び／又は動脈創傷の治療のためにＡＡＴと組み合わせたＡＣＴの特異的適合性は未だ指摘されていない。

ＡＣＴは肥満細胞中のチマーゼを阻害することも示され、その理由で、ＡＣＴが、アレルギー反応について記載されている（Ｌｉｎｄｍａｒｋ ａｎｄ Ｗａｌｌｅｎｇｒｅｎ，Ａｌｌｅｒｇｙ，１９９２，４７：４５６−４５８）。さらに、乾癬病変におけるチマーゼ及びその阻害剤ＡＣＴの役割が検討された。しかしながら、結果は、チマーゼが、乾癬の病理機構において劣った役割しか果たさないこと（Ｈａｒｖｉｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｃｔａ Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｏｒｏｌ，７９：９８−１０４）、及び乾癬患者の非創傷皮膚におけるキモトリプシン阻害活性の水準が変化しないこと（Ｇｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．，２８３：２２４−２２９）を示している。ＥＰ０４３２１１７によれば、ＡＣＴを、「皮膚炎症」、「熱傷」及び「皮膚症状（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」の治療に用いることができる。しかしながら、ＥＰ０４３２１１７は、「皮膚症状」の意味を説明していない。「皮膚炎症」は、機械的に損なわれた皮膚、すなわち、創傷と異なる、または創傷治癒中に失われる組織を回復するプロセスにおける劣化と異なる、乾癬または皮膚炎のような皮膚の炎症性疾患を意味する。従って、ＥＰ０４３２１１７に用いられる「皮膚炎症」は、本発明による低治癒性動脈創傷または低治癒性糖尿病関連創傷を含まない皮膚の病理症状を示す。同じ特徴により、ＥＰ０４３２１１７に用いられる「皮膚症状」は、本発明による創傷を含まず：「皮膚症状」という用語は、本質的内部プロセスから生じる皮膚の疾患の徴候を表す水疱、嚢胞、班のような疾患皮膚の症状を意味する。創傷は、一方、体外から加わる機械的力により引き起こされる。

Ｌｅｘ０３２（配列番号９）は、単一ポリペプチド鎖におけるＡＣＴとＡＡＴとの組み合わせとして、カテプシンＧ及びエラスターゼの両方に作用し、膵炎の処理において用いられる（ｖｏｎ Ｄｏｂｓｃｈｕｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ，２９０：７８２−８）。Ｌｅｘ０３２は、前述の他のニ作用性変異体保有のエラスターゼ阻害及びカテプシンＧ阻害特性と同様に、炎症性疾患、例えば、慢性創傷及び乾癬の処理のために開示されている（ＷＯ９５／２７０５５）。しかしながら、糖尿病関連創傷の治療及び／又は予防のための特異的適合性は、現在までの従来技術に記載または予想されていなかった。

これらを合わせると、酵素ＡＣＴ及びＡＡＴは以前から生物学的技術において知られており医療的観点から入念に検討されてきたが、糖尿病関連創傷及び動脈創傷を治療及び／又は予防するためのＡＡＴと組み合わせたＡＣＴの特異的適合性は未だ記載されていなかった。また、糖尿病関連創傷及び動脈創傷を治療及び／又は予防するための、エラスターゼ及びキモトリプシンの両方の阻害機能を有する単一ポリペプチド（例えば、Ｌｅｘ０３２）を用いるＡＣＴとＡＡＴとの組み合わせは、未だ記載されていなかった。本発明は、初めて、多数の異なる可能な創傷のうち、二つの低治癒性創傷、すなわち、糖尿病関連潰瘍及び動脈潰瘍が、予想外に、当業者により考えられなかったＡＡＴと組み合わせたＡＣＴによる有効な治療のための最高のチャンスを有することを示す。

本発明の目的は、低治癒性糖尿病関連創傷及び／又は低治癒性動脈創傷の治療及び／又は予防のための、α−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）ポリペプチド、その機能的変異体及び／又はそれをコードしている核酸の、またはＡＣＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸の、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド、その機能的変異体またはそれをコードしている核酸と、またはＡＡＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸と組み合わせた使用により解決される。

特に、本発明は、低治癒性糖尿病関連創傷及び／又は低治癒性動脈創傷から選択される疾患を処理及び／又は防止するための、配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択される配列を有するＡＣＴポリペプチド、またはその機能的変異体またはそれをコードしている核酸の、配列番号３、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される配列を有するＡＡＴポリペプチド、またはその機能的変異体またはそれをコードしている核酸と組み合わせた使用に関する。

好ましい実施形態において、本発明は、低治癒性糖尿病関連創傷及び／又は低治癒性動脈創傷から選択される疾患を処理及び／又は防止するための、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択される配列を有するＡＣＴポリペプチドの、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される配列を有するＡＡＴポリペプチドと組み合わせた使用に関する。

もう一つの好ましい実施形態において、本発明は、低治癒性糖尿病関連創傷及び／又は低治癒性動脈創傷から選択される疾患を処理及び／又は防止するための、最初の二つのアミノ酸（Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）の一または二が欠損している及び／又はＮ−末端延長、好ましくは、Ｎ−末端メチオニン延長を有する、配列番号９によるポリペプチドまたはその機能的変異体の使用に関する。

「機能的変異体」という用語は、本発明により用いることができるそれぞれＡＣＴポリペプチドまたはＡＡＴポリペプチドの変異体であって、それぞれ野生型ＡＣＴポリペプチド及びＡＡＴポリペプチドに類似のカテプシンＧまたは好中球エラスターゼに関するプロテアーゼ阻害特異性を有する変異体を意味すると解される。「機能的変異体」は、単一ポリペプチド鎖上において、天然ＡＣＴポリペプチド及びＡＡＴポリペプチドの両方に類似のエラスターゼ及びカテプシンＧの両方の阻害作用を有するＡＣＴまたはＡＡＴ変異体も含み、そのような機能的変異体及びこれらをコードする核酸は、本発明によるＡＣＴ及びＡＡＴの組み合わせである。例えば、ＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチドの機能的変異体は、配列番号１，配列番号３，配列番号４，配列番号６，配列番号７，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４及び配列番号１５の一つと少なくとも約７０％、特に少なくとも約８０％、特に少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有し、前述のプロテアーゼ阻害活性を有する。このポリペプチドの機能的変異体は、本発明により用いられるポリペプチドの一部でもあり得、天然ＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチドと比べて、それぞれ類似のプロテアーゼ阻害活性を示す。例えば、最初のアミノ酸、すなわちメチオニンが、ポリペプチド中で欠損することがあり得、ポリペプチドの機能は著しく変化しない。また、前述のように、Ｎ−末端メチオニンを、ＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチドまたはその機能的変異体に付加することができ、例えば、ポリペプチドの機能が著しく変化することなくメチオニンを成熟ＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチドのＮ−末端に付加することができる。プロテアーゼ阻害特異性が、それぞれの野生型ポリペプチドのそれと比べて本質的に変化しないで維持されるなら、約１〜６０、好ましくは約１〜３０、特に約１〜１５、特に約１〜５の範囲のアミノ酸からなるポリペプチドのＮ−及び／又はＣ−末端及び／又は内部欠損も含まれる。ＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチドのＮ末端においてシグナルペプチドまたはその一部に影響を与える欠損が特に好ましく、例えば、配列番号１０の成熟ＡＣＴポリペプチドの配列が続くシグナルペプチドの最後の４つのアミノ酸を有するＡＣＴポリペプチドが、全ＡＣＴ活性を維持することが示された（ＵＳ５，３６７，０６４）。配列番号６のＡＣＴポリペプチドのシグナルペプチドの全てまたは一部が欠損していることを特徴とするＡＣＴポリペプチド、特に、配列番号７及び配列番号１０のＡＣＴポリペプチドが特に好ましい。さらなるＮ−末端メチオニンを有するＡＣＴポリペプチド、特に配列番号１１及び配列番号１２のＡＣＴポリペプチドも、本発明による好ましいＡＣＴポリペプチドである。配列番号３のＡＡＴポリペプチドのシグナルペプチドの全てまたは一部が欠損していることを特徴とするＡＡＴポリペプチド、特に、配列番号４及び配列番号１４のＡＡＴポリペプチドが特に好ましい。さらなる付加されたＮ−末端メチオニンを有するＡＡＴポリペプチド、特に配列番号１３及び配列番号１５のＡＡＴポリペプチドも、本発明による好ましいＡＡＴポリペプチドである。

野生型ポリペプチドと比べてそのプロテアーゼ阻害特異性が大きく変化しないそのような変異体の他の例として、本発明により用いられるポリペプチドと相同性であると共に、特に、ヒトまたはマウス以外の生物から、好ましくは、サル、ブタ及びラットのような非ヒト哺乳動物から誘導されるポリペプチドがある。ポリペプチドの他の例は、異なる個体または異なる器官における異なる対立遺伝子によりコードされると共に、野生型ポリペプチドと比較したときに、生物中の野生型ポリペプチドと比べて著しく変化するプロテアーゼ阻害特異性を示さない。例えば、幾つかのＡＡＴ対立遺伝子が存在することが知られている。さらに、天然状態で存在するポリペプチド鎖の翻訳後修飾または共翻訳修飾を欠損または改変することができる。特に、共有結合糖残基を欠損または改変することができ、活性も同様である。例えば、ヒトＡＣＴを大腸菌内で非糖付加状態で生成することができ、特異的酵素的活性がなお維持される（例えば、ＵＳ５，０７９，３３６）。同様に、ＡＣＴ及びＡＡＴ及びそれらの機能的変異体を細菌または酵母菌株内で生成して非糖付加機能的変異体を得ることができる。この場合、本発明で用いることができるポリペプチドの組換え生成を、成熟型のためのコード化配列及び発現開始のためのＮ−末端メチオニンを発現することにより行うことができる。Ｎ−末端メチオニンを有するそのようなポリペプチドが、本発明による好ましいＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドである。

好ましい機能的変異体は、シグナルペプチドまたはその一部が欠失しているＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドであり、例えば、配列番号４または配列番号１４のポリペプチドと配列番号７または配列番号１０との組み合わせが、本発明の使用に特に好ましい。さらに、好ましい機能的変異体は、Ｎ−末端延長、好ましくはメチオニン延長を有するＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドであり、より好ましくは、シグナルペプチドまたはその一部が欠失しているＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチドへのＮ−末端延長を有する。ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドのそのような機能的変異体を組み合わせることができ、例えば、全てのシグナルペプチドが欠失しているＡＣＴポリペプチド、例えば、配列番号１０のＡＣＴポリペプチドを、全てのシグナルペプチドが欠失され次にＮ−末端メチオニンが付加されたＡＡＴポリペプチド、例えば、配列番号１５のＡＡＴポリペプチドと組み合わせることができる。配列番号４、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５のポリペプチドを含む群より選択されるポリペプチドと、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２のポリペプチドを含む群より選択されるポリペプチドとの組み合わせが、本発明による使用に特に好ましい。

同様に、本発明による好ましいポリペプチドは、配列番号９の最初の二つのアミノ酸（すなわち、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ）が欠損している、及び／又は、Ｎ−末端メチオニンがそこに付加されている、配列番号９のポリペプチドＬｅｘ０３２の機能的変異体である。そのようなポリペプチドは、本発明により使用することができる好ましいポリペプチドである。

さらに、本発明により用いることができるＡＣＴ及びＡＡＴは、糖付加、部分的糖付加または非糖付加とし得る。好ましい実施形態において、ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドは糖付加されていない。そのようなＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドは、例えば、細菌または酵母菌株中での組換え発現により得ることができる。もう一つの好ましい実施形態において、ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドは糖付加されている。そのようなＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドは、哺乳動物組織からの単離により、または哺乳動物細胞中での組換え発現により得ることができる。

本発明による「シグナルペプチド」は、ＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチドのＮ−末端部分と解すべきであり、発現中における哺乳動物細胞からの輸出に必要であり、哺乳動物細胞からの輸出中に結果的に除去され、それにより、蛋白の成熟型が放出される。ＡＣＴの場合、配列番号６のＡＣＴポリペプチドのアミノ酸１〜２３及び１〜２５を含む二つの異なるシグナルペプチドが存在し、対応する成熟ＡＣＴポリペプチドは、配列番号７及び配列番号１０のポリペプチドである。ＡＡＴの場合、配列番号３のＡＡＴポリペプチドのアミノ酸１〜２４を含む一つのシグナルペプチドが確認され、対応する成熟ＡＡＴポリペプチドは配列番号１４のポリペプチドである。

「コード化核酸」または「・・をコードする核酸」（ＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチド）という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を示し、これは本発明により用いることができるＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチド、またはその機能的変異体もしくはその前駆体段階、例えば、プロポリペプチドまたはプレプロポリペプチドをコードする。ポリペプチドは、ポリペプチドが機能的変異体である限り、コード化配列の全長配列または任意の部分によりコードすることができる。

「変異体」という用語は、本発明により用いられるポリペプチド、特に、配列番号１，配列番号３，配列番号４，配列番号６，配列番号７，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４または配列番号１５のポリペプチドまたはそれらの機能的変異体をコードすると共に、参照配列と少なくとも約７０％、特に少なくとも約８０％、特に少なくとも約９０％の配列同一性を示す、ＤＮＡ配列（参照配列）に相補的な全てのＤＮＡ配列を意味する。「変異体」という用語は、さらに、参照配列に相補的であると共に、緊縮条件下に参照配列にハイブリッド形成し、参照配列によりコードされるポリペプチドと同じ活性を本質的に示す全てのＤＮＡ配列、及びそれらの分解型も意味する。本発明により用いることができる核酸の配列中に、例えば機能的変異体の特性が失われることなく、小さな変化が存在することができ、これらの変化が、遺伝子コードの変化によりまたは、核酸の５’末端及び／又は３’末端に付加された非翻訳配列により引き起こされ得ることが知られている。従って、本発明は、先に記載した核酸の所謂「変異体」も含む。

「緊縮ハイブリッド条件」という用語は、特に、例えば２．５×ＳＳＣ緩衝液中で６０℃でハイブリッド形成が起こり、続いて、より低い緩衝液濃度において３７℃で複数の洗浄工程が行われる条件を意味すると解すべきである。

配列同一性は、二つの配列の同一性の度合い（同一性％）と解され、ポリペプチドの場合、例えば、ＢｌａｓｔＰ２．０．１により決めることができ、核酸の場合、例えば、フィルターが取り除かれＢＬＯＳＵＭが６２であるＢＬＡＳＴＮ２．０１４により決めることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）。「配列相同性」は、例えば、フィルターが取り除かれＢＬＯＳＵＭが６２であるＢｌａｓｔＰ２．０．１により決められる、二つのポリペプチド配列の類似性（陽性％）と解される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）。

本発明の意味において、低治癒性の糖尿病関連創傷は、糖尿病を被っている哺乳動物及びヒトの皮膚病変であると解すべきである。そのような皮膚病変の例は、特に、糖尿病により引き起こされる潰瘍、すなわち、糖尿病性潰瘍、例えば、糖尿病患者における下腿動脈潰瘍、リポイド類壊死及び動脈潰瘍、及び糖尿病患者における血管の動脈硬化的破壊により引き起こされる創傷治癒の遅延であると解すべきである。

本発明の意味において、低治癒性の動脈創傷は、例えば、動脈潰瘍、すなわち、血管の動脈硬化的破壊により引き起こされる動脈潰瘍及び創傷治癒遅延であると解すべきである。

本発明の意味において、ＡＣＴの機能は、ＡＣＴがプロテアーゼカテプシンＧに発揮する活性であると解すべきである。ＡＣＴのこの機能は、ＡＣＴとカテプシンＧの複合体、すなわち、受容体に結合するカテプシンＧ：ＡＣＴ複合体、例えば、セルピン−酵素複合受容体（ＳＥＣＲ）としてのＡＣＴの活性も含む（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４３：１２２３−７；Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０ ＰＮＡＳ：８７：３７５３−７）。

本発明の意味において、ＡＣＴの機能は、好ましくは、カテプシンＧプロテアーゼの結合及び阻害を含む。ＡＣＴの活性を決めるための適当なアッセイは、例えば、実施例２またはＨｅｉｄｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ３６：２０７７−２０８１のようなプロテアーゼ阻害アッセイである。

本発明の意味において、ＡＡＴの機能は、プロテアーゼ好中球エラスターゼの結合及び阻害であると解すべきである。適当なアッセイが、Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：７６２７−７６３３に記載されている。

本発明の意味における「類似のプロテアーゼ阻害活性」は、天然の酵素の活性の好ましくは０．１％以上、より好ましくは１％以上、さらにより好ましくは５０％以上、最も好ましくは９０％以上である、ＡＣＴまたはＡＡＴ機能的変異体のプロテアーゼ阻害活性である。

本発明で用いることができる核酸であり、また本発明で用いることができるＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチドをコードする核酸、またはそれらの機能的変異体は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ，特に、二本鎖ＤＮＡである。さらに、一つの実施形態において、核酸の配列を、少なくとも一つのイントロン及び／又はポリＡ配列を有することにより特徴付けることができる。

通常、本発明により用いることができるポリペプチドの調製及び、遺伝子治療に適用可能であると共に本発明により用いることができるベクターとの組合わせ両方について、関連遺伝子を発現するために二本鎖ＤＮＡが好ましく、特に好ましいのは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域である。真核生物において、この領域は、Ｋｏｚａｋ配列（Ｋｏｚａｋ，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：８１２５−４８）中に配されると共に、ＡＴＧと同じ読み枠中に配される次の停止コドン（ＴＡＧ，ＴＧＡまたはＴＡＡ）まで延長する第一の開始コドン（ＡＴＧ）で始まる。原核生物の場合、この領域は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の後の第一のＡＵＧ（またはＧＵＧ）で始まり、ＡＴＧと同じ読み枠中に配される次の停止コドン（ＴＡＧ，ＴＧＡまたはＴＡＡ）で停止する。

さらに、本発明を実行するために合成的に調製された核酸を用いることができる。例えば、本発明に従って使用される核酸は、例えばホスホエステル法により化学的に合成可能であり、この核酸は配列リストに記載されたＤＮＡ配列を利用し／または遺伝子コードを表した表に記載されたような蛋白配列を利用する（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．＆Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．(１９９０)Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０，５４３−５８４，Ｎｏ．４参照）。

本発明の特に好ましい実施形態において、本発明により用いることができる少なくとも一つの核酸が、ベクター、好ましくは遺伝子治療で適用可能なベクターの発現カセット中に含まれる。本発明は、本発明により使用できる融合蛋白を発現しているベクターの使用も含む。遺伝子治療において適用可能なベクターは、好ましくは、組織特異的、創傷特異的または皮膚特異的、細胞サイクル特異的、細胞型特異的、代謝特異的または構成的に活性な、先に記載の核酸に機能的に結合している調節配列を含む。

真核生物中で構成的発現させる適当な調節要素の例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより確認されるプロモーター、または、ウイルス性プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター（実施例３も参照）、ＳＶ４０プロモーターまたはＬＴＲプロモーター、例えば、ＭＭＴＶ（マウス乳房腫瘍ウイルス；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２１４、２２８−２３２）から誘導されるもの、及び、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶまたはＨＩＶから誘導される他のウイルス性プロモーター及びアクチベーター配列である。

真核生物中で発現を誘発し得る調節要素の例は、適当なリプレッサーと組み合わされたテトラサイクリンオペレーターである（Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，(１９９４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５，５１６−２０)。

本発明により用いることができる核酸の発現は、好ましくは、組織特異的プロモーターの制御下に行われ、皮膚特異的プロモーター、例えば、ヒトＫ１０プロモーター（Ｂａｉｌｌｅｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｃｅｌｌ ６２：６９７−７０８）、ヒトＫ１４プロモーター（Ｖａｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１５６３−６７）または特に好ましくはウシサイトケラチンＩＶプロモーター（Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８；Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｗｏｏｌ ａｎｄ Ｈａｉｒ（Ｇ．Ｅ．Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ），ｐｐ． ２８７−３０９．Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、ロンドン／ニューヨーク在）が特に好ましい。

真核生物中で組織特異的に発現させる調節要素の他の例は、プロモーターまたは、プロモーターからのアクチベーター配列または、特別の細胞型中でのみ発現される蛋白をコードするこれら遺伝子のエンハンサーである。

真核生物中で細胞サイクル特異的発現を可能とする調節要素の例は、以下の遺伝子：ｃｄｃ２５Ａ、サイクリンＡ、サイクリンＥ、ｃｄｃ２、Ｅ２Ｆ、Ｂ−ｍｙｂ及びＤＨＦＲ（Ｚｗｉｃｋｅｒ Ｊ． ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ Ｒ．（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１３，３−６）のプロモーターである。

真核生物中で代謝特異的発現させる調節要素の例は、低酸素症、グルコース欠乏、リン酸塩濃度またはヒートショックにより調節されるプロモーターである。

皮膚中でケラチノサイト特異的発現させる調節要素の例は、ＦｉＲＥ要素である（Ｊａａｋｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ，７：１６４０−１６４７）。ＦｉＲＥ要素は、シンデカン（ｓｙｎｄｅｃａｎ）−１遺伝子のＡＰ−１−誘導、ＦＧＦ−誘発性反応要素である（Ｊａａｋｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１２：９５９−９）。

本発明により用いることができる核酸を、形質移入、形質転換または感染により真核または原核細胞に導入できるようにし、それによりポリペプチドを発現可能にするために、核酸が、プラスミドとして、またはウイルスまたは非ウイルスベクターの一部として存在することができる。この点において特に適当なウイルスベクターは：バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス及びヘルペスウイルスである。この点において特に適当な非ウイルスベクターは：リポソーム、人口ウイルス粒子、カチオン性脂質及びポリリジン接合ＤＮＡである。

遺伝子治療において適用可能なベクターの例は、例えば、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである（Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３：４６６−７６；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５４９−５８）。局所的に投与すると裸のＤＮＡが皮膚細胞に貫入することができるので、真核生物の発現ベクターは単離状態で存在する場合、遺伝子治療に用いるのに適している（Ｈｅｎｇｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２９１１−６；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：３７０−５）。

本発明により用いることができる核酸をリポソームと複合することにより、遺伝子治療で適用可能なベクターを得ることもできる。これにより、特に皮膚細胞の形質移入の非常に高い効率を達成することが可能になるからである（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ａｎｄ Ａｋｈｕｒｓｔ，１９９５，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ ｅｔ．４：２２７９−８５）。リポフェクション法においては、リポソーム懸濁液を超音波処理に付することによりカチオン性脂質からなる小さな単層状小嚢（ｓｍａｌｌ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）が調製される。特に正味陽電荷が維持されプラスミドＤＮＡの１００％がリポソームにより複合化されるような関係で、ＤＮＡがリポソームの表面にイオン結合する。Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９８７，前記参照）により用いられるＤＯＴＭＡ（臭化１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−トリメチルアンモニウム（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ））とＤＰＯＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）との脂質混合物に加えて、今まで、多数の新しい脂質組成物が合成され、種々の細胞系の形質移入におけるそれらの効率について試験された（Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，６９８２−６９８６；Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｊ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０−２５６１；Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ Ｌ．(１９９１)，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１８９，１９５−２０３）。新しい脂質組成物の例には、ＤＯＴＡＰ（硫酸Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムエチル）またはＤＯＧＳ（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）がある。シトフェクチン（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ） ＧＳ２８８８カチオン性脂質も、試験管内及び生体内でケラチノサイトを形質移入するのに非常に良好に適していると分かった（ＵＳ５，７７７，１５３；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３１７６−３１８１）。細胞内への核酸の移動を増加させる補助物質は、例えば、ＤＮＡまたは合成ペプチドＤＮＡ分子に結合される蛋白またはペプチドであり得、これにより、核酸を細胞の核内に輸送することが可能になる（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６，２８２；Ｂｒａｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７，７８４）。補助物質は、核酸を、細胞の細胞質内に放出可能にする分子も含む（Ｐｌａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１２９１８；Ｋｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．８，２１３）。リポソームは、本発明の意味において、製薬的に許容できる担体である。リポソームは、多層小嚢（ＭＬＶ）、小さな単層小嚢（ＳＵＶ）及び大きな単層小嚢（ＬＵＶ）を含む。

リポソーム−核酸複合体を調製する方法は当業者に知られている（例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０１：５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：４１９４−４１９８）。「リポソーム」という用語は、例えば、ＵＳ５，４２２，１２０、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５及びＥＰ５２４，９６８ Ｂ１に開示のリポソーム組成物を含む。リポソームを、本発明により用いることができる核酸のために、並びに、本発明により用いることができるポリペプチドのために、または両者のために薬剤担体として用いることができ、好ましくは、それらが、本発明による核酸用の薬剤担体として用いられる。治療活性物質をリポソームに接合させることができる、またはヒドロゲルポリマーに接合させることができ、ヒドロゲルポリマー（または、ヒドロゲルポリマーの成分）はリポソームに接合されるかまたは、リポソームにより封入され得る。もう一つの特に適した型の遺伝子治療ベクターは、本発明により用いることができる核酸を金粒子に適用することにより得ることができ、所謂「遺伝子ガン」を利用して皮膚または細胞内に注入することにより局所的に適用される（実施例１；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１１２：７７５−８１，Ｔｕｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１１１：１８３−８）。ＡＡＴ及びＡＣＴポリペプチドをコードしている核酸を、次に、同時に一緒に適用する、または互いに時間的に離れて適用することができる。

「リポソーム」という用語は、例えば、ＵＳ５，４２２，１２０、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５及びＥＰ５２４，９６８ Ｂ１に開示のリポソーム組成物を含む。リポソームは、本発明により用いることができる核酸及び本発明により用いることができるポリペプチド用の薬剤担体として用いることができ；好ましくは、本発明により用いることができる核酸用の薬剤担体として用いることができる。治療活性物質はリポソームに接合することができる、または、ヒドロゲルポリマーに接合することができ、ヒドロゲルポリマー（または、ヒドロゲルポリマーの成分）がリポソームに接合することができるかまたは、リポソームにより封入することができる。もう一つの特に好ましい型の遺伝子治療用ベクターは、本発明により用いられる核酸を金粒子に適用し、遺伝子ガンを用いて負荷粒子を皮膚または細胞内に注入して局所的に投与することにより得ることができる（実施例１、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１１２：７７５−８１、Ｔｕｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１１１：１８３−８）。圧力を用いて皮内注入するための装置が、例えば、ＵＳ５６３０７９６に開示されている。

遺伝子治療で適用することができるもう一つの型のベクターは、「裸」発現ベクターを生物適合性マトリクス、例えば、コラーゲンマトリクスに導入することにより調製することができる。このマトリクスは、例えば、糖尿病関連創傷及び／又は動脈創傷に導入して、移入してくる細胞にその発現ベクターを形質移入すると共に、本発明により用いられるポリペプチドをその細胞内で発現させることができる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ及びＢａｎａｄｉｏ，ＵＳ５，９６２，４２７）。

前述した核酸を遺伝子治療で用いるために、ポリペプチドをコードする核酸の一部が、好ましくはポリペプチド（実施例１参照）及び／又はｐｏｌｙＡ配列、特に、天然に生じるｐｏｌｙＡ配列またはＳＶ４０ウイルスｐｏｌｙＡ配列のためのプロモーターと開始コドンの間に、特に、遺伝子の３’末端において、イントロン配列を含む一または二以上の非コード化配列を含むことも有利である。これによりｍＲＮＡを安定化させ得るからである（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．(１９９３）Ｃｅｌｌ ７４，９−１４及びＰａｌｍｉｔｅｒ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４７８−４８２)。

ポリペプチドの生成のために、細胞は原核細胞でも真核細胞でも良い。原核細胞の例には大腸菌があり、真核細胞の例にはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または昆虫細胞がある。すなわち、大腸菌が、例えば、ヒトＡＣＴを発現するための適当な細胞であると分かった（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ，２６５：１１９９−１２０７）。本発明により用いることができるＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドを調製するための大腸菌の使用は、好ましい実施形態を構成する。さらに好ましい実施形態において、ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドが酵母菌株内で生成される。本発明により用いることができるポリペプチドは、当業者に良く知られている方法を用いて、例えば、前述の核酸を既述のような適当な発現系において発現させることにより調製される。適当な細胞の例には大腸菌菌株ＤＨＳ、ＨＢ１０１またはＢＬ２１、酵母菌株サッカロマイセス・セレビシエ、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からの昆虫細胞系鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）、または動物細胞ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、２９３、ＨａＣａＴ及びＨｅＬａがあり、それらは全て一般的に入手されるものである。

本発明の他の好ましい実施形態は、低治癒性の糖尿病関連創傷および／または動脈創傷の予防および／または治療のために、本発明により用いることができるＡＡＴポリペプチドまたはその機能的変異体を組合わせた、融合蛋白の形でなる、ＡＣＴポリペプチドまたはその機能的変異体の使用であり、前記融合蛋白は、本発明により用いることができる前述の核酸を用いて調製される。

これは、本発明により用いることができる前述のポリペプチドまたはその機能的変異体を含む融合蛋白であって、それ自体が、既に、前述のＡＣＴまたはＡＡＴポリペプチドの一つの機能的変異体を構成する、または除去後に単なる機能的変異体である融合蛋白を調製することを含む。これらの融合蛋白は、特に、約１〜３００、好ましくは約１〜２００、特に好ましくは約１〜１５０、特に約１〜１００、特に約１〜５０の異種アミノ酸を含む融合蛋白である。そのようなペプチド配列の例には、例えば大腸菌ガラクロシダーゼから誘導することができる原核生物ペプチド配列がある。

融合蛋白用のペプチド配列の他の好ましい例には、融合蛋白の検出を容易にするペプチドがあり、これらは、例えば、グリーン蛍光蛋白またはその変異体を含む。

本発明により用いることができるポリペプチドは、合成的に調製することもできる。すなわち、ポリペプチド全体またはその一部を、例えば、古典的合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術）により合成することができる。前述した核酸の一つを用いて組換え調製したポリペプチドを用いることが特に好ましい。さらに、ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドを、生物または組織もしくは細胞から単離し、次に、本発明により用いることができる。すなわち、例えば、本発明により用いることができるポリペプチドを、例えばヒト血清から精製することができる（例えば、Ａｂｄｕｌｌａｈ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２２５：３０６−３１２）。さらに、ＡＣＴ発現細胞から細胞系を調製することができ、この細胞系を、次に、ＡＣＴの単離に用いることができる。すなわち、活性ＡＣＴを、例えば、大腸菌内での組換え発現により調製することができる（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６５：１１９９−１２０７）。

前述の蛋白を精製する目的で、少なくとも一つの「ポリペプチドタグ」を加えることができる。例えば、適当な蛋白タグが、精製すべき蛋白を、高い親和性でマトリクスに吸収できるようにする。この次に、例えば、以下の工程を行う：複合体を著しい程度に溶離することなく適当な緩衝液で過酷に洗浄し、続いて、吸収された複合体を特異的に溶離する。当業者に知られている蛋白タグの例には、（Ｈｉｓ）_６タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニンタグ、グルタチオン転移酵素（ＧＳＴ）タグ、親和キチン結合性領域が隣接するインテインからなるタグ、及びマルトース結合性蛋白（ＭＢＰ）タグがある。これらの蛋白タグを、Ｎ−末端に、Ｃ−末端に及び／又は内部に配することができる。

もう一つの実施形態において、抗体または抗体フラグメントを本発明により用いることができ、ここで、一つの抗体は、ＡＣＴポリペプチドの活性を増加させる触媒抗体であり、第二の抗体は、ＡＡＴポリペプチドの活性を増加させる触媒抗体である。触媒抗体の例が、例えば、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１５６６−７０に見られる。

本発明は、低治癒性糖尿病関連創傷及び／又は低治癒性動脈創傷の治療及び／又は予防のための薬剤を製造するために、α−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）ポリペプチド、その機能的変異体及び／又はそれをコードしている核酸を、またはＡＣＴポリペプチドを発現している細胞、またはそれをコードしている核酸を、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド、その機能的変異体またはそれをコードしている核酸と、またはＡＡＴポリペプチドを発現している細胞、またはそれをコードしている核酸と組み合わせて用いることにも関する。

本発明は、低治癒性糖尿病関連創傷及び／又は低治癒性動脈創傷から選択される疾患の処理及び／又は予防のための薬剤組成物を製造する方法であって、ＡＣＴポリペプチド、またはＡＣＴポリペプチドをコードしている核酸、またはＡＣＴポリペプチドを発現している細胞、またはＡＣＴポリペプチドをコードしている核酸を、ＡＡＴポリペプチド、またはＡＡＴポリペプチドをコードしている核酸、またはＡＡＴポリペプチドを発現している細胞、またはＡＡＴポリペプチドをコードしている核酸と組み合わせる方法にも関する。

好ましくは、配列番号１，配列番号６，配列番号７，配列番号１０，配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択される配列を有するＡＣＴポリペプチド、またはその機能的変異体、またはそれをコードしている核酸を、配列番号３，配列番号４，配列番号１３，配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される配列を有するＡＡＴポリペプチド、またはその機能的変異体、またはそれをコードしている核酸と組み合わされる。

好ましい実施形態において、配列番号７，配列番号１０，配列番号１１及び配列番号１２による配列を有するポリペプチドの群より選択されるＡＣＴポリペプチドを、配列番号４，配列番号１３，配列番号１４及び配列番号１５により配列を有するポリペプチドの群より選択されるＡＡＴポリペプチドが組み合わされる。

一つの実施形態において、付加Ｎ−末端メチオニンを欠損及び／又は有する二つのＮ−末端アミノ酸（Ｈｉｓ及びＰｒｏ）の一つを有する配列番号９による配列を有するポリペプチドまたはその機能的変異体、好ましくは、配列番号９による配列を有するポリペプチドが用いられる。

一つの実施形態において、創傷は糖尿病潰瘍または動脈潰瘍であり、好ましくは、創傷は糖尿病潰瘍である。

一つの実施形態において、ポリペプチドは糖付加されていない。

一つの実施形態において、ポリペプチドは、組織から、好ましくは血清から単離される。

好ましくは、ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドは別々に投与される。

一つの実施形態において、核酸は、発現ベクターとして用いられる。

好ましくは、発現ベクターは、遺伝子治療において適用可能なベクターである。

好ましい実施形態において、細胞は自己由来または同種異系の細胞であり、好ましくは、細胞は、ケラチノサイト、線維芽細胞または内皮細胞のような皮膚細胞である。

低治癒性の糖尿病関連創傷及び／又は動脈創傷の治療は、従来法により、例えば、本発明により用いることができる薬剤を含むドレッシング、軟膏剤、圧迫ガーゼまたはゲルを用いて行うことができる。すなわち、薬剤を局所的に投与して、創傷治癒に直接的効果を奏することができる。治療組成物の局所投与は、例えば、溶液、エマルジョン、クリーム、軟膏、泡、エアロゾルスプレー、ゲルマトリクス、スポンジ、ドロップまたは洗浄剤として行うことができる。適当な添加剤または補助物質は等張溶液、例えば、生理学的食塩水またはアルギン酸ナトリウム、脱塩水、安定化剤、ＺｙｄｅｒｍＩＩのような物質を含むコラーゲン、またはポビドンのようなマトリクス形成物質である。ゲルベースを生成するために、組成物、例えば、水酸化アルミニウム、ポリアクリル酸誘導体、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ(登録商標)、セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースが好適である。これらのゲルは、水ベース上のヒドロゲルとして、または低及び高分子量パラフィンまたはワセリン及び／又は黄色もしくは白色ワックスを用いるオレオゲル（ｏｌｅｏｇｅｌ）として調製することができる。乳化剤として、アルカリ石鹸、金属石鹸、アミン石鹸または、ソルビタンの部分的脂肪酸エステルを用いることができ、脂質を、ワセリン、天然及び合成ワックス、脂肪酸、モノ、ジ−、トリグリセリド、パラフィン、天然油類、例えば、ヤシ油、合成脂肪、例えば、Ｍｉｇｌｙｏｌ(登録商標)として添加することができる。これらの投与型は、本発明により用いることができる少なくとも一つのＡＣＴポリペプチドを用いるのに好ましい。本発明の薬剤は、適切な場合、創傷の領域において、リポソーム複合体または金粒子複合体として、局所的に投与することができる。この投与型は、遺伝子治療において適用可能であると共に本発明により用いることができる核酸を含むベクターに好ましい。ＡＣＴ及び／又はＡＡＴポリペプチドの局所組成物は、従来技術において、例えば、ＵＳ６，２９４，１８１、ＵＳ６，０９６，３２７、ＵＳ５，００８，２４２、ＥＰ０５１２０９０、ＥＰ０４３２１１７及びＵＳ５，１９０，９１７において良く知られている。

さらに、経皮治療系（ＴＴＳ）を用いて治療を行うことができ、これにより、本発明による薬剤を時間的に制御した方法で放出可能にする。投与した薬剤の膜の透過を向上させるために、エタノール、尿素またはプロピレングリコールのような添加剤を、Ｅｕｄｒａｇｉｔ(登録商標)のようなポリマー助剤に加えて、添加することができる。ＴＴＳは、例えば、ＥＰ０９４４３９８Ａ１、ＥＰ０９１６３３６Ａ１、ＥＰ０８８９７２３Ａ１またはＥＰ０８５２４９３Ａ１に開示されている。

もう一つの実施形態において、本発明の薬剤は、創傷部位に分泌される本発明のポリペプチドの組み合わせを発現する細胞として投与することもできる。好ましい細胞は、自己由来または同種異系細胞であり、特に好ましいのは、ケラチノサイト、線維芽細胞または内皮細胞のような皮膚細胞である。これらの修飾細胞を投与するために適した担体は、例えば、デキストランマトリクスのような生物適合性材料からなるミクロキャリアである（ＵＳ５，９８０，８８８）。

しかしながら、本発明による薬剤での処理は、注射または輸液のような非経口手段または経口手段を用いて全身的に行うこともできる。注射液は、皮下、皮内、上皮内、筋紡錘内、筋肉内、静脈内、皮内、腹膜内または鞘内に適用することができ、溶液、懸濁液、濃厚液または、等張液中に希釈し得る凍結乾燥粉末として調製することができる。輸液は、等張液または脂肪エマルジョンとして、リポソーム、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ミクロ粒子、マイクロカプセルのような「ハイテク」組成物として適用することもできる。

非経口適用薬剤の蛋白またはポリマーへの吸着を向上させる、及び／又は、薬剤とガラスまたはプラスチック表面との結合を低下させるために、アルブミン、有機溶媒、血漿増量剤、または界面活性物質のような物質を用いることができる。非経口適用薬剤の生成のための適当な助剤は等張物質、例えば、塩化ナトリウム、等水素イオン濃度物質、例えば、ナトリウム水素炭酸または界面活性剤すなわち界面活性物質及び、乳化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ(登録商標)、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ(登録商標)または、尿素及びクエン酸塩のような複合誘発物質である。別の非経口投与は、鼻腔、口腔または直腸投与である。鼻腔及び口腔適用のために、例えば、吸入することができるスプレー、軟膏、エアロゾルまたはドロップのような投与手段を用いることができる。適当な推進剤は、テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｌｕｒａｎ）またはヘプタフルオロプロパン（ｈｅｐｔａｆｌｕｏｒｐｒｏｐａｎ）であるが、手動加圧システムも適している。これらの推進剤は、イソプロピルミリステートのような界面活性物質を含むことができる。直腸投与のために、錠剤、カプセルまたは座剤のような浣腸製剤が用いられる。補助物質として、Ｗｉｔｅｐｓｏｌ（登録商標）、Ｍａｓｓａ Ｅｓｔａｒｉｕｍ（登録商標）またはＮｏｖａｔａ（登録商標）を用いることができる。非経口放出の修飾型は、好ましくは生物学的分解性ポリマーに基づいてなる、皮膚の下に入れられるデポー剤の利用である。

さらなる全身的に適用される型は、錠剤、発泡性錠剤、カプセル、ペレット、糖衣錠、粉末、顆粒、香剤、チューインガム、ドロップまたは懸濁液のような経口投与である。適当な助剤は、例えば、澱粉、ラクトース、タルク、ステアリン酸、セルロース、ＰＶＰまたはＡｅｒｏｓｉｌ（登録商標）である。適当な添加剤は、例えば、風味料、着色剤、酸化防止剤、ビタミン、甘味料、例えば、グルコースまたはアスパルテームである。これらの経口投与系は、例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）を用いることにより遅延系として、または、胃腸治療系もしくは経口浸透系として調製することもできる。胃または腸内での薬剤の空間的遊離は、異なる溶解性を有する異なる被覆を用いた被覆錠剤の使用により変化させることができる。

ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドまたはその機能的変異体、特に好ましくは、ＡＡＴポリペプチドまたはその機能的変異体の量及び／又は機能、特に活性を増加させる薬剤が好ましい。ポリペプチドは合成または組換えにより調製することができる、または、組織または細胞から単離することができ、前述の発現系、特に大腸菌または酵母細胞を用いて調製し、組織、特に血清から精製することが特に好ましい。このように調製された組換え蛋白は、融合蛋白として存在し、例えば、精製または検出を容易にすることができる。

本発明の薬剤のもう一つの好ましい実施形態は、本発明に従って、ＡＣＴポリペプチドの活性を増加させる活性化抗体またはそのフラグメントを、ＡＡＴポリペプチドの活性を増加させる活性化抗体またはそのフラグメントと組み合わせて投与することである。そのような触媒抗体の適用は、前述のように実施することができる。

治療活性化合物ＡＣＴ及びＡＡＴの投与は、一緒にまたは、空間的及び／又は時間的に別々に行うことができる。例えば、ＡＣＴまたはその機能的変異体を含む組成物を、ＡＡＴまたはその機能的変異体を含む組成物とは別に適用することができる。好ましくは、ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドは一緒に調製される。治療効果を発揮するのに必要な濃度は同じ、類似または異なり得る。

もう一つの好ましい実施形態において、低治癒性の糖尿病関連創傷及び／又は低治癒性の動脈創傷から選択される疾患の治療及び／又は予防のための薬剤を製造するために、ＡＣＴポリペプチドをコードする少なくとも一つの核酸またはその機能的変異体またはこれらをコードしている核酸を、ＡＡＴポリペプチドをコードしている少なくとも一つの核酸またはその機能的変異体またはこれらをコードする核酸と組み合わせて含む細胞が用いられる。

本発明により用いることができると共に前述の発現ベクターまたは遺伝子治療で適用可能なベクターとしての核酸を含む細胞が特に好ましい。もう一つの好ましい実施形態において、本発明により用いることができる融合蛋白を発現している細胞、抗体、または本発明により用いることができるそれらのフラグメントが用いられる。この細胞は、次に、創傷に直接導入することができる、または適当な場合には、適当な担体系及び／又は添加剤及び／又は補助物質と組み合わせてから、創傷に導入することができる。適当な担体系が、例えば、ＵＳ５，９８０，８８８、ＷＯ９２／０６１７９、ＥＰ０２４２２７０またはＷＯ９０／０２７９６に開示されている。好ましい細胞は、自己由来または同種異系細胞、特に好ましくは皮膚細胞であり、特に、ケラチノサイト、内皮細胞及び線維芽細胞である。好ましい実施形態において、ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドの両方を発現している細胞を、本発明により用いることができる。もう一つの好ましい実施形態において、ＡＣＴポリペプチドまたはその機能的変異体を発現している細胞が、ＡＡＴポリペプチドまたはその機能的変異体を発現している細胞と組み合わされる。

本発明により用いることができると共に前述のようにベクターまたは細胞内に含まれる核酸を含む、または本発明により用いることができるポリペプチドを含む、遺伝子治療用の薬剤が特に好ましい。

糖尿病潰瘍及び／又は動脈潰瘍の、または糖尿病患者における低治癒性創傷または血管の動脈硬化的破壊を被っている患者における低治癒性創傷の、治療及び予防が好ましい。慢性糖尿病創傷または動脈創傷が特に好ましい。さらにより好ましい実施形態において、創傷は、糖尿病潰瘍または動脈潰瘍である。最も好ましい実施形態において、創傷は糖尿病潰瘍である。

本発明が、以下の表及び実施例を利用してさらに明らかとなるが、それらに限定はされない。

（表及び配列）
表１：対照ベクターで治療された創傷の引っ張り強度と比較した、遺伝子治療によりｍＡＣＴ（ｓｐｉ２−２）で治療された正常及び糖尿病ラットにおける創傷の引っ張り強度の変化についての平均値。Ｅ／Ｃ値は、ＡＣＴ（Ｅ）で処理したラットにおいて測定された絶対引っ張り強度と、対照ベクター（Ｃ）で処理したラットにおいて測定された絶対引っ張り強度との商である。

表２：正常治癒性創傷と、異なる低治癒性創傷における、ヒト創傷浸出液中の活性ＡＣＴ蛋白の相対的量の比較であり、示すように、糖尿病関連低治癒性創傷において選択的に生じる活性が減少した例である。

配列番号１，配列番号３，配列番号４，配列番号６，配列番号７，配列番号９，配列番号１０，配列番号１１，配列番号１２，配列番号１３，配列番号１４及び配列番号１５は、本発明により用いることができるポリペプチドの配列を示す。

配列番号２，配列番号５及び配列番号８は、本発明により用いることができる核酸の配列を示す。

特に、配列番号１は、マウスセリンプロテアーゼ阻害剤２−２（ｓｐｉ２−２）のアミノ酸配列を示す。

配列番号２は、ｓｐｉ２−２のコード化配列を示し；
配列番号３は、シグナルペプチド配列を有するＡＡＴの最も頻繁に発生するヒト対立遺伝子のアミノ酸配列を示し；
配列番号４は、シグナルペプチドの成熟ＡＡＴ−ポリペプチド欠損部分の配列を示し；
配列番号５は、配列番号３の成熟ＡＡＴ−ポリペプチドについてのコード化配列を示し；
配列番号６は、シグナルペプチド配列を有するヒトＡＣＴ−ポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号７は、シグナルペプチドを有しない成熟ヒトＡＣＴ−ポリペプチドを示し；
配列番号８は、配列番号６をコードしている、ヒトＡＣＴについての核酸コード化配列を示し；
配列番号９は、Ｌｅｘ０３２ポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号１０は、生体内で優勢な成熟ＡＣＴ−ポリペプチドのアミノ酸配列を示し；
配列番号１１は、配列番号７のアミノ酸配列とさらなるＮ−末端メチオニンを示し；
配列番号１２は、配列番号１０のアミノ酸配列とさらなるＮ−末端メチオニンを示し；
配列番号１３は、配列番号４のＡＡＴのアミノ酸配列とさらなるＮ−末端メチオニンを示し；
配列番号１４は、成熟ＡＡＴ−ポリペプチドのアミノ酸配列を示し；そして
配列番号１５は、配列番号１４のＡＡＴアミノ酸配列とさらなるＮ−末端メチオニンを示す。

ここで図を参照する：
特に、創傷前の図１において、マウスに、遺伝子ガン（４００ｐｓｉ、金粒子１．０μｍφ、０．５μｇＤＮＡ／発射、２発射／創傷）を用いて、対照または、ヒトＡＣＴ遺伝子を含む実験用発現プラスミドを形質移入した。生体内形質移入に続いて直ちに、一つの全厚１０ｍｍ切り傷を、脊椎に垂直な標的組織部位の中心に設けた。創傷を施した５日後に、糖尿病マウスにおいて、切り傷の引っ張り強度をＢＴＣ−２０００システムにより測定した。創傷の破壊を誘発するのに必要な陰圧（ｍｍＨｇ）の最大値として、及び、平均陰圧（±ＳＤ）として、データを表す。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付き順位和検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋ Ｔｅｓｔ）により統計的分析を行った。中空円：対照創傷。灰色円：ＡＣＴ試験創傷。黒色円：データの平均値。

図２において、水性緩衝液中のヒトＡＣＴ蛋白の１投与量（０．４ｍｇ／ｍｌ）を、糖尿病マウスの切り傷の正常に機能しない治癒において試験した。単一の創傷を、蛋白溶液７５μｌで処理し、３０μｌを、二つの創傷境界の各々に平行に皮下注射し（創傷境界当たり１つの注射部位）、１５μｌを、創傷に局所的に適用した。対照動物は、蛋白無しに緩衝液のみを適用した。蛋白または緩衝液を創傷を設けた１日及び２日後に、２回適用した。創傷を施した５日後に、創傷の引っ張り強度を、ＢＴＣ−２０００システムにより測定した。創傷の破壊を誘発するのに必要な陰圧（ｍｍＨｇ）の最大値として、及び、平均陰圧（±ＳＤ）として、データを表す。スチューデントｔ検定により統計的分析を行った。中空円：対照創傷。灰色円：ヒトＡＣＴ蛋白で処理した創傷。黒色円：データの平均値。

（生体内でのネズミＡＣＴ相同体の投与による糖尿病ラットにおける創傷治癒の向上）
配列番号２のネズミＡＣＴ遺伝子を糖尿病オスＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに投与した後に、創傷治癒を調べた。創傷治癒を定量するために、創傷の引っ張り強度を調べた。より高い引っ張り強度は、創傷治癒の向上を反映している。

糖尿病ラット動物モデルは、低治癒性の糖尿病関連創傷を調べるために達成されたモデル系である（Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２９０：Ｓ１−Ｓ１１）。糖尿病には微小血管障害が伴うので、この動物モデルはまた、動脈で認められる創傷治癒の妨害を調べるのに適している。

最初に、ＣＭＶプロモーターと多重クローニング部位との間のＨｉｎｄＩＩＩ開裂部位にラットインシュリン遺伝子のイントロンＩＩを挿入することにより、ベクターｐＭＨ（Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）に基づいて調製された適当な発現ベクターｐＭＨｉｎｔを組み立てた。次に、ｍＡＣＴ ｃＤＮＡを、多重クローニング部位を用いてｐＭＨｉｎｔ中にクローニングした。このために、ｍＡＣＴ ｃＤＮＡのコード化領域を、ＰＣＲ（ｍＡＣＴプライマー１：５’ＧＡＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＡＧ３’及びｍＡＣＴプライマー２：５’ＧＡＡＴＣＡＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＧＧＧＴＴＧＧ ＣＴＡＴＣ３’）により増幅し、次に、ＫｐｎＩ及びＰｍｌＩで切断し、ＫｐｎＩ及びＰｍｌＩで切断しておいた発現ベクターｐＭＨｉｎｔにライゲートし、これにより、発現プラスミドｐＭＨｉｎｔＡＣＴを完成させた。ルシフェラーゼ遺伝子（ｐＭＨｉｎｔＬｕｃ）を含むｐＭＨｉｎｔを対照ベクターとして用いた。

糖尿病を誘発するために、体重２５０〜３００ｇの４匹のラットに、ストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ製）の新しく調製された水溶液を腹腔内注射した（５０ｍｇ／体重ｋｇ）。注入の７〜９日後に、動物の血糖を調べ、２００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値で糖尿病状態と確認した。

続いて、４匹の糖尿病ラットと４匹の非糖尿病対照動物を、２％Ｏ_２（２Ｌ／分）と１．２５％イソフルランからなる混合物で麻酔した。その後の創傷のために、背部を除毛し、各動物の背部の上に４つの部位をマークした。各々の場合、金粒子上に固定されたプラスミドＤＮＡ（ＢｉｏＲａｄ製）０．５μｇを、Ｈｅｌｉｏｓ遺伝子ガン（ＢｉｏＲａｄ製）を用いて５００ｐｓｉで各部位に注入し、各々の場合、２つの部位にＡＣＴ発現ベクターｐＭＨｉｎｔＡＣＴをうちこみ、２つの部位に対照ベクターｐＭＨｉｎｃＬｕｃをうちこみ、また、各々の場合、ｐＭＨｉｎｔＡＣＴの１回のうちこみを腹側に行い、１回のうちこみを背側に行った。次に、うちこみ部位を通して長さ１ｃｍの切り傷を設け、創傷部を傷クリップで閉じた。１０日後に創傷部生検を行い、Ｉｎｓｔｒｏｎ張力計を用いて製造者の指示に従って創傷部の引っ張り強度を決め、創傷部の断面積に標準化した。続いて、ｐＭＨｉｎｔＡＣＴをうちこんだ創傷部の引っ張り強度の絶対値及び、対照ベクターｐＭＨｉｎｔＬｕｃをうちこんだ同じ動物の創傷部の引っ張り強度の絶対値から商（Ｅ／Ｃ値）を計算した。Ｅ／Ｃ値の平均を決め、それにより、ｍＡＣＴに依存する引っ張り強度の変化を確認した。平均を表１に示す。

ｐＭＨｉｎｔＡＣＴを用いて治療した創傷部の引っ張り強度が、糖尿病動物において唯一明らかに増加し、このプラスミドの投与が、対照動物において著しい効果を奏さないことが分かった。このことは、低治癒性糖尿病関連創傷及び／又は動脈低治癒性創傷におけるＡＣＴの発現の緩和が、ＡＣＴの投与により特に補うことができ、創傷治癒の顕著な向上につながることを強調している。一方、この治療は、対照動物における創傷治癒の向上に適しておらず、ｍＡＣＴの投与により創傷治癒の著しい向上を達成することができなかった。

（正常治癒性創傷、低治癒性静脈潰瘍及び糖尿病患者創傷のヒト傷浸出液におけるＡＣＴ活性の決定）
異なる低治癒性創傷を有する患者からの傷浸出液においてＡＣＴポリペプチドの活性を測定し、手術後の急性正常治癒性創傷からの傷浸出液において見られる活性と比較した。

Ｈｅｉｄｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：２０７７−２０８１による活性アッセイにより、ＡＣＴポリペプチドの活性の測定を行った。このアッセイの原理は、９６ウエル微量滴定プレートに、カテプシンＧを被覆することを含む。カテプシンＧは、傷浸出液からの活性ＡＣＴ分子を結合することができる。活性ＡＣＴポリペプチドをカテプシンＧと複合した後、ＡＣＴポリペプチドを、ＡＣＴポリペプチドに対する一次ウサギ抗−ヒト抗体により検出し、続いて、アルカリホスファターゼに結合した二次ヤギ抗−ウサギ抗体により検出する。次に、結合した活性ＡＣＴポリペプチドの量を、Ｖｅｒｓａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｕｃｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）において４９０ｎｍでの吸収の増加をモニターすることによりアルカリホスファターゼ用の色素基質の適用により検出する。

この実験を開始するために、低治癒性創傷の例として、静脈潰瘍を患っている１人の患者からの傷浸出液及び２人の糖尿病患者からの創傷からの傷浸出液を、それぞれ２４時間及び４８時間集めた。対照として、１人の急性正常治癒性患者からの傷浸出液も、それぞれ２４時間及び４８時間集めた。これらの創傷は、典型的には、乳房縮小を企図した手術中に生じる。低治癒性創傷からの傷浸出液を、真空療法により集め、傷に圧力を均一にかけるスポンジと共に対応する創傷に真空抽出器を適用した。吸引流体を瓶に集めた。これに対して、急性手術対照創傷後の創傷から誘導される傷浸出液を、創傷の皮下組織中に入れると共に感染防止のために手術後創傷に通常適用される排液システムにより集めた（Ｒｅｄｏｎ’ｓ吸引排液）。続いて、集めた創傷浸出液を、Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ ３ Ｓ−Ｒにおいて１０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ管内で１５００ｒｐｍ及び４℃で１０分間遠心分離して、汚染細胞を除去した。上澄みを用いて遠心分離を１００００ｒｐｍ及び４℃で１５分間一度繰り返して、精製を完了させた。異なる患者からの精製創傷浸出液をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１：５０００、１：１００００及び１：２００００で希釈して、活性アッセイを行った。すなわち、９６ウエルマイクロタイタープレートを、まず、ウシ血清アルブミン溶液（ＮａＨＣＯ_３ ５０ｍＭ中１０ｇ／ｌ ＢＳＡ、ｐＨ９．６）２００μｌで被覆し、プレートシーラー（Ｑｉａｇｅｎ製）で覆い、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＢＳＡ溶液を吸引し、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ２５０μｌで２分間、４回洗った。次に、洗浄溶液を、貯蔵溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム中３．３ｇ／ｌカテプシンＧ（Ｇａｌｂｉｏｃｈｅｍ製）、ｐＨ５．５、及び０．５Ｍ ＮａＣｌ）の１０００倍希釈により調製されたカップリング溶液１００μｌで置き換えた。再び、３７℃で３０分間のインキュベーションとし、ウエルを、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２５０μｌで２分間、４回洗った。カテプシンＧのカップリングを制御するために、通常、カテプシンＧ基質溶液（０．１Ｍ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホネート緩衝液中２００μｇ／ｌスクシニル−アラニル−アラニル−プロピル−バリル−ｐ−ニトロアニリド、ｐＨ７．５、１Ｍ ＮａＣｌ、１２％ＤＭＳＯ）１００μｌを、マイクロタイタープレートに添加した。３７℃で１００分間のインキュベーション後、Ｖｅｒｓａｍｅｘプレートリーダーにおいて４１４ｎｍでの吸光度の増加を測定した。３０分間のインキュベーション期間後にマイクロタイタープレートに結合されたカテプシンＧの定量的量を制御するために、カップリング溶液中のカテプシンＧの活性を、マイクロタイタープレート中でのインキュベーションを行った場合と行わなかった場合で比較した。すなわち、基質溶液（ＤＭＳＯ中５ｇ／ｌスクシニル−アラニル−アラニル−プロプリル−バリル−ｐ−ニトロアニリド）１００μｌを、マイクロタイタープレートに接触する前及び後に、カップリング溶液９００μｌに添加した。両方の溶液について４１４ｎｍで吸光度の増加を２５℃にて１分間測定した。結果は、アッセイの線形性内であった。

カテプシンＧ予備結合マイクロタイタープレートを、１００μｌの急性正常治癒性創傷部からの希釈傷浸出液、静脈潰瘍からの傷浸出液及び２人の糖尿病患者の創傷からの傷浸出液、及び、傷浸出液の加えない対照を用いて、インキュベートした。全ての患者からの全ての濃度のサンプルを、マイクロタイタープレートに２連で適用した。インキュベーション期間としては、封止したマイクロタイタープレートを用いで３７℃で３０分間であり、続いて、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで繰り返し洗浄した。インキュベーション期間後、マイクロタイタープレートを、ウサギ抗−ヒトＡＣＴ抗体（Ｄａｋｏ製、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で１：１０００、２．５％ドライミルク）１００μｌを用いて３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで４回洗った。一次抗体のインキュベーション後に、アルカリホスファターゼに結合された二次ヤギ抗−ウサギ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ製、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中１：５０００、２．５％ドライミルク）１００μｌを用いて３７℃で３０分間インキュベートし、続いて、前述のような洗浄手順を行った。抗体の陰対照として、傷浸出液のみ、一次抗体のみ、二次抗体のみ、傷浸出液と一次抗体のみ、傷浸出液と二次抗体のみ、またはＰＢS−Ｔｗｅｅｎのみをそれぞれ含むウエルをマイクロタイタープレート上に調製した。ＯＰＤ（Ｄａｋｏ製；４２０μｌ／ｌ ３０％Ｈ_２Ｏ_２を含む６．６ｍｇ／ｌ）の１００μｌ／ウエルを用いて室温でインキュベーションすることによりアルカリホスファターゼを検出した。反応を、ウエル当たり１００μｌの０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することにより停止し、吸光度を、前述のＥＬＳＩＡリーダーを用いて４９０ｎｍで測定した。平行して、市販のＡＣＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ中１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を段階的に希釈することにより、検定した。４９０ｎｍで測定された吸光度に対して希釈列（１：５０００、１：８０００、１：１００００、１：１２０００、１：２００００；１：３００００、１：４００００、１：５００００、１：８００００、１：１０００００及び１：１２００００）をプロットすることにより標準曲線を決めた。続いて、異なる傷浸出液中の活性ＡＣＴポリペプチドの量を、標準曲線により決めた。次に、急性正常治癒性創傷から２４時間集めた傷浸出液中で測定された活性ＡＣＴポリペプチドの量の平均値を１に設定することにより、数値を標準化した。異なる収集期間後の異なる患者からの傷浸出液において測定された活性ＡＣＴポリペプチドの平均値の相対的変化を表２に示す。

結果は、急性正常治癒性創傷と比べて、糖尿病患者の低治癒性創傷中の活性ＡＣＴポリペプチドの量の３．３〜２．３倍の減少を明らかに示している。さらに、結果は、低治癒性静脈潰瘍の傷浸出液中の活性ＡＣＴの量が、急性正常治癒性創傷の増加範囲内であるので、活性ＡＣＴの減少が、低治癒性糖尿病関連創傷に本質的に選択的であることを示している。低治癒性糖尿病関連創傷のこの減少は、これらの創傷中における多量のエラスターゼの存在に起因する。

合わせると、実験１及び２は、ＡＣＴが、糖尿病関連創傷及び動脈低治癒創傷の治療に効果的であるが、不活性化し易く、従って、ＡＡＴと組み合わされたＡＣＴが、驚くべきことに、糖尿病関連創傷及び動脈低治癒性創傷の治療及び／又は予防用の効果的かつ安定な治療を提供することを示している。

予防及び／又は治療のために、ＡＣＴ及びＡＡＴの、特にＡＣＴの量及び／又は活性を創傷の領域において増加させなくてはならない。好ましく処理される徴候は、糖尿病潰瘍及び動脈潰瘍、特に糖尿病潰瘍である。ＡＡＴと組み合わせてＡＣＴを含む薬剤の投与は、好ましくは局所的に行われ、好ましくは、遺伝子治療により行われる。投与は、さらに好ましくは、本発明によりＡＡＴポリペプチドと組み合わせてＡＣＴポリペプチドを局所的に適用することにより行われる。ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドの作用部位が細胞外であり、その結果、蛋白が細胞内に貫入する必要がないからである。好ましくは、ポリペプチドは組織から、特に血清から単離される。例えば、ＵＳ４，６９７，００３、ＵＳ４，４３９，３５８、ＵＳ４，３７９，０８７、ＷＯ０２／４８１７６Ａ１、ＷＯ０１／３８３５４Ａ１及びＵＳ４，６５６，２５４が、ＡＡＴを血清から単離する方法を記載している。さらに好ましい実施形態において、ポリペプチドは組換え的に、好ましくは細菌、酵母または哺乳動物細胞中で生成される。ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドは、糖付加しても良く糖付加しなくても良い。

（ヒトＡＣＴ遺伝子の投与による糖尿病マウスの創傷治癒の向上）
配列番号８のヒトα−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）遺伝子を、実施例１に記載のものと同じ発現ベクターｐＭＨｉｎｔ中にクローニングした。創傷治癒へのヒトＡＣＴ遺伝子の効果を、ＢＴＣ−２０００（登録商標）システムにより引っ張り強度を測定することにより測定した。

１０週齢メス糖尿病（Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＯｌａＨｓｄ−Ｌｅｐｒ ｄｂ／ｄｂ）マウスに麻酔をかけ、背部の微細毛を市販の脱毛クリーム（Ｐｉｌｃａ製）で除去した。皮膚を７０％イソプロピルアルコールで清浄化した後、創傷を施した部位（背面の頭側（ｄｏｒｓｏｃｒａｎｉａｌ）領域でマウス当たり一箇所）に遺伝子ガン（４００ｐｓｉ、金粒子１．０μｍφ、０．５μｇＤＮＡ／発射、２発射／創傷領域）を用いて対照（ｐＭＨｉｎｔ）またはヒトＡＣＴ遺伝子を含む実験用発現プラスミドｐＭＨｉｎｔを形質移入した。生体内形質移入に続いて直ちに、一つの全厚１０ｍｍ切り傷を、脊椎に垂直な標的組織部位の中心に設けた。傷プラスター（ハンブルク、バイエルスドルフ在Ｆｉｘｏｍｕｌｌ ｓｔｒｅｔｃｈ製）の２つの小さなストリップを用いて創傷部を閉じた。創傷を施した５日後に、マウスをナルコレン（Ｎａｒｃｏｒｅｎｅ）０．１ｍｌで安楽死させた。相対的破壊強度を測定するために、生体内張力測定装置（ＢＴＣ−２０００（商標）システム、テネシー州ナッシュビル在Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｉｎｃ．製）により切り口を分析した。

適切に処理されなかった創傷は、引っ張り強度の計算から排除した。結果を図１に要約する。５日後に創傷の破壊を誘発するのに必要な陰圧（ｍｍＨｇ）の最大値として、及び、全ての群についての平均陰圧（±ＳＤ標準偏差）として、データを表す。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付き順位和検定により統計的分析を行った。０．０５を下回るＰ値は、統計的有意を示すと考えた。統計的分析のために、２５の対照創傷及び、ヒトＡＣＴ遺伝子で処理した２２の創傷を含んだ。創傷を設けた５日後に、糖尿病動物におけるベクター対照創傷と比べた、ヒトＡＣＴ遺伝子で処理した創傷における引っ張り強度の有意の増加（陰圧ｍｍＨｇ平均±ＳＤ：１８６．６８±５７．６９対１５３．９６±３９．１１；Ｐ＝０．０１３、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付き順位和検定、図１参照）が観察され、糖尿病関連創傷の治癒へのヒトＡＣＴの有益な効果が示された。

（ヒトＡＣＴ蛋白の投与による糖尿病マウスの創傷治癒の向上）
１投与量の成熟ヒトＡＣＴ蛋白（０．４ｍｇ／ｍｌ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製α−１−アンチキモトリプシン、番号１７８１９６、配列番号１０に相当）を、水性緩衝液中で、糖尿病マウスにおける切り傷の低治癒について試験した。ヒトＡＣＴ遺伝子の創傷治癒への効果をＢＴＣ−２０００（商標）システムにより引っ張り強度を測定することにより測定した。

１０週齢メス糖尿病（Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＯｌａＨｓｄ−Ｌｅｐｒ ｄｂ／ｄｂ）マウスに麻酔をかけ、背部の微細毛を市販の脱毛クリーム（Ｐｉｌｃａ製）で除去した。皮膚を７０％イソプロピルアルコールで清浄化した後、一つの全厚１０ｍｍ切り傷を、脊椎に垂直な背面の頭側領域に設けた。傷プラスター（ハンブルク、バイエルスドルフ在Ｆｉｘｏｍｕｌｌ ｓｔｒｅｔｃｈ製）の２つの小片を用いて創傷部を閉じた。創傷を施した５日後に、マウスをナルコレン０．１ｍｌで安楽死させた。相対的破壊強度を測定するために、生体内張力測定装置（ＢＴＣ−２０００（商標）システム、テネシー州ナッシュビル在Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｃ．製）により切り口を分析した。

凍結乾燥ＡＣＴ蛋白を、水性緩衝液（０．４ｍｇ／ｍｌ、濾過しオートクレーブにかけた緩衝液の組成物：５０ｍＭ燐酸カリウム、ｐＨ７．２、ＫＣｌでイオン強度を１５４ｍＭに調節）中で再構築した。単一の創傷を、蛋白溶液７５μｌで処理し、３０μｌを、二つの創傷境界の各々に平行に皮下注射し（創傷境界当たり１つの注射部位）、１５μｌを、創傷に局所的に適用した。対照動物は、蛋白無しに緩衝液のみを適用した。蛋白または緩衝液を、創傷を施した１日及び２日後の、２回適用した。創傷の５日後に、糖尿病マウスにおいて、創傷の引っ張り強度をＢＴＣ−２０００システムにより測定した。適切に処理されなかった創傷は、計算から排除した。結果を図２に要約する。５日後に創傷の破壊を誘発するのに必要な陰圧（ｍｍＨｇ）の最大値として、及び、全ての群についての平均陰圧（±ＳＤ標準偏差）として、データを表す。スチューデントｔ検定により統計的分析を行った。０．０５を下回るＰ値は、統計的有意を示すと考えた。統計的分析のために、３０の対照創傷及び、ヒトＡＣＴ遺伝子で処理した２６の創傷を含んだ。創傷を施した５日後に、糖尿病動物における対照創傷と比べた、ヒトＡＣＴ遺伝子で処理した創傷において引っ張り強度の有意の増加（陰圧ｍｍＨｇ平均±ＳＤ：２６３．００±５５．６７対２１６．５３±５７．１１；Ｐ＝０．００３、スチューデントｔ検定、図２参照）が観察され、糖尿病関連創傷の治癒へのヒトＡＣＴの有益な効果が示された。

本発明の組成物及び方法に種々の修飾を設け得ることが当業者には明らかである。すなわち、添付の請求の範囲及び等価物の範囲に含まれるならば、そのような修飾及び変化は本発明に含まれるものとする。

図１は、実施例３に記載のような糖尿病マウスモデルにおけるヒトＡＣＴ遺伝子の検証を示す。 図２は、実施例４に記載のような糖尿病マウスモデルにおけるヒトＡＣＴ蛋白の検証を示す。

【配列表】

Claims (14)

1. 低治癒性糖尿病関連創傷及び／又は低治癒性動脈創傷の治療及び／又は予防のための、α−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）ポリペプチド、その機能的変異体及び／又はそれをコードしている核酸の、またはＡＣＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸の、α−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）ポリペプチド、その機能的変異体またはそれをコードしている核酸と、またはＡＡＴポリペプチドを発現している細胞またはそれをコードしている核酸と組み合わせた使用。
2. 配列番号１、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択される配列を有するＡＣＴポリペプチド、またはその機能的変異体またはそれをコードしている核酸を、配列番号３、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される配列を有するＡＡＴポリペプチド、またはその機能的変異体またはそれをコードしている核酸と組み合わせる請求項１に記載の使用。
3. 配列番号７、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２からなる群より選択される配列を有するＡＣＴポリペプチドを、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される配列を有するＡＡＴポリペプチドと組み合わせる請求項１または２に記載の使用。
4. 配列番号９による配列を有するポリペプチドを用いる請求項１に記載の使用。
5. 創傷が糖尿病潰瘍または動脈潰瘍である請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
6. 創傷が糖尿病潰瘍である請求項５に記載の使用。
7. ポリペプチドが糖付加されていない請求項１〜４に記載の少なくとも1つの使用。
8. ポリペプチドが組織から単離される請求項１〜４に記載の少なくとも1つの使用。
9. ＡＣＴ及びＡＡＴポリペプチドが別々に投与される請求項１〜３に記載の少なくとも１つの使用。
10. 核酸が発現ベクターとして用いられる請求項１に記載の使用。
11. 発現ベクターが遺伝子治療において適用可能なベクターである請求項１０に記載の使用。
12. 細胞が自己由来または同種異系細胞である請求項１に記載の使用。
13. 細胞がケラチノサイト、線維芽細胞または内皮細胞のような皮膚細胞である請求項１２に記載の使用。
14. 低治癒性糖尿病関連創傷及び／又は低治癒性動脈創傷から選択される疾患の治療及び／又は予防のための薬剤組成物を製造する方法であって、ＡＣＴポリペプチドまたはこのＡＣＴポリペプチドをコードしている核酸、またはこのＡＣＴポリペプチドを発現している細胞またはこのＡＣＴポリペプチドをコードしている核酸を、ＡＡＴポリペプチドまたはこのＡＡＴポリペプチドをコードしている核酸、またはこのＡＡＴポリペプチドを発現している細胞またはこのＡＡＴポリペプチドをコードしている核酸と組み合わせる方法。

Images