JP5075120B2 - デング熱セロタイプ２の弱毒化株 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＤＫ細胞での継代とベロ細胞での衛生化（sanitization）によって弱毒化した野生型デング熱−２株１６６８１に由来する新規な生きた弱毒化ＶＤＶ２株（VERO-Derived Dengue Serotype 2 virus、ベロ−由来のデング熱セロタイプ２ウィルス株）に関するものである。
本発明はさらに、上記ＶＤＶ２株を含むワクチン組成物に関するものである。

デング熱病はフラビビラス（Flavivirus）属 (Gubler, 1988）の４つの互いに密接に関連してはいるが抗原的には全く異なるウィルスのセロタイプ（Gubler, 1988；Kautner et al., 1997；Rigau-Perez et a;., 1998；Vaughn et al., 1997）が病因である。デング熱ウィルスの一つのセロタイプに感染すると、ウイルス性遺伝的症候群が見られないものから深刻で致命的な出血性疾患まで、種々の臨床的病気のスペクトルが生じる。蚊に刺されてからデング熱（dengue fever、DF）が起こるまでの潜伏期間は平均して４日（３〜１４日の範囲）である。このDFの特徴は２相性の発熱、頭痛、体の各部位の痛み、全身衰弱、発疹、リンパ節症および白血球減少症にある（下記文献参照）。
Kautner et al., 1997; Rigau-Perez et al., 1998

ウイルス血症（viremic）期間は熱病(febrile illuness、Vaughn et al., 1997）と同じである。通常は7〜10日でDFから完全に回復するが、無力症が長く続くのが普通である。白血球および血小板のカウント数の減少が頻繁に起こる。デング熱出血熱（ＤＨＦ）は、ホメオスタシス異常および血管透過増加を特徴とする激しい熱病であり、循環血液量減少および低血圧（デング性ショック症候群、DSS）に至り、しばしば厳しい内出血によって事態は複雑になる。ＤＨＦの致死率は治療をしないと１０％の高さになるが、治療経験のある大部分のセンターでは１％以下である（WHO Technical Guide、1986）。

ルーチンのデング熱感染の実験室的診断法はウィルスの単離および／またはデング熱ウィルス−特異抗体の検出である。

デング熱病気はマラリアに続く第２の最も重要な熱帯感染症であり、世界の人口（25億）の半分以上はその流行伝達の危険に曝らされた区域に住んでいる。予測される約5000万〜1億のデング熱の症例の中で、500,000人は入院したＤＨＦ患者であり、毎年の死亡者数は25,000人である。デング熱はアジア、太平洋、アフリカ、ラテンアメリカおよびカリブ海地域の流行病である。100以上の熱帯国にはその地域に特有のデング熱ウイルス感染があり、その中の60以上のＤＨＦが文書化されている（Gubler, 2002; Monath, 1994）。良く知られているように、デング熱の感染は多くのファクター、すなわち人口増加、無計画、無秩序な（特に貧困を伴う）都市化、飛行機での旅行、効果的な蚊対策不足、衛生・公衆衛生のインフラの劣化置に関係している（Gubler、2002）。旅行者および国外追放者のデング熱に対する意識も増加している(Shirtcliffe et al., 1998）。熱帯のデング熱流行地域に展開している米軍での熱病の主たる原因はデング熱であることがわかっている（DeFraites et al., 1994)。

このウィルスはヒトとヒトを好んで刺し日中に刺す（day-biting）蚊であるネッタイシマカ（Aedes aegypti）含む循環サイクルで保持される。ヒトへの感染は感染したネッタイシマカが吸血時にウィルスを注射することによって始まる。蚊の唾液中のウィルスが主としてリンパ管外組織中に入る。植菌の後に感染する第１の細胞サブセットは樹状細胞であり、その後、排出リンパ節へマイグレートする（Wu et al., 2000）。この皮膚での初期複製とリンパ節の排出後、ウィルスは一般に３〜５日間の激しい発熱期中、血液中に居る。

デング熱ウィルスの主要ターゲットの中で単核細胞およびマクロファージは樹状細胞と一緒である。同型再感染に対する保護は完全で、おそらく生涯にわたって続くが、デング熱タイプ間の交叉−保護は12週間以下しか続かない(Sabin, 1952)。従って、被検者は異なる別のセロタイプに第２回目の感染をすることがある。この第２回目のデング熱感染は激しいデング熱病を引き起こす理論的に危険ファクタである。しかし、ＤＨＦは関連するウィルスの株と、年齢、免疫状態および患者の遺伝素因とを含む多因子性である。ＤＨＦの発生には２つのファクタ、すなわち、高いウィルス血症を伴う急速なウイルス複製（この病気の激しさはこのウィルス血症レベルに関連している(Vaughn et al., 2000)と、大きな炎症反応およびそれに伴う高レベルの炎症メディエータの放出 (Rothman and Ennis, 1999) が主要な役割をしている。

デング熱病に対する特別な処理方法はない。ＤＨの管理はベッドで休むことと、解熱薬および鎮痛剤を用いた発熱および痛覚の制御および適切な流動食の摂取である。ＤＨＦの処置では流体のロスを補い、凝固因子を置換し、ヘパリンの注射することが必要である。

現在の行なわれている予防的対策はベクターの管理と、個人的な保護対策であるが、これらは実施が難しく、コストのかかる対策である。デング熱を予防するワクチンとして登録されたものは現在のところない。デング熱の４つのセロタイプが世界的規模で広まっており、それらはＤＨＦの場合に関係していると報告されているので、ワクチン接種は４つのデング熱ウィルスセロタイプの全てに対して理想的に保護するものでなければならない。

自然免疫を再生する生きた弱毒ワクチン（LAV）は多くの病気に対するワクチンの開発で使われてきており、その中にはデング熱と同じ属に属するいくつかのウィルスも含まれる（例えば、市販のフラビウイルスの生きた弱毒ワクチンには黄熱病と日本脳炎ワクチンが含まれる）。生きた弱毒ウィルスワクチンの利点はその複製能力と液性免疫応答および細胞免疫応答の誘導にある。それに加えて、自然感染によって誘発されるそれらを再生したウィルス（構造タンパクおよび非構造タンパク）の異なる成分に対する全てのウィリオンワクチンによって免疫応答が誘導される。

デング熱ワクチンの最初のプロジェクトはタイのCentre for Vaccine Development, Institute of Sciences and Technology for Development Mahidol Universityのプロジェクトである。Primary Dog Kidney（ＰＤＫ）細胞でデング熱セロタイプ1（株16007、継代13）、セロタイプ２（株16681、継代53＝ＬＡＶ２）およびセロタイプ4（株1036、継代48）ウィルス、そして、Primary Green Monkey Kidney（PGMK）細胞（継代30）およびFetal Rhesus Lung（FRhL）細胞（継代3）でセロタイプ3（株16562）ウィルスに対する候補となる生きた弱毒ワクチンの開発が実験室レベルで成功した。これらのワクチンはタイの志願者に対して一価（単一セロタイプ）、二価（２つのセロタイプ）、三価（3つのセロタイプ）および四価（４つのセロタイプ全て）ワクチンとしてテストされた。そして、これらワクチンは安全であり、子供および成体で免疫原であることがわかった（Gubler、1997）。これらのＬＡＶ１〜４株については下記特許にMahidol Universityの名称で開示され、また、ＣＮＣＭにＣＮＣＭ １−２４８０；ＣＮＣＭ １−２４８１；ＣＮＣＭ １−２４８２およびＣＮＣＭ １−２４８３で寄託されている。
欧州特許第EP 1159968号公報

ＤＥＮ２株16681は1964年にバンコクのＤＨＦ（Dengue Hemorrhagic Fever、デング熱）患者の血清から回収された（Halstead et al, 1970）。オリジナルのウイルス血症（viremic）血清はＢＳＣ−１（African Green Monkey Kidney）細胞で４回継代され、ＬＬＣ−ＭＫ₂（アカゲザルMonkey Kidney）細胞で５回連続して継代された。このウィルスは1977年に感受性サル(Macaca Μlatta)でインビボで継代され、次いでＬＬＣ−ＭＫ₂で再度継代された。1980年に蚊（Toxorhynchites amboinensis）で２回追加の継代が行なわれた。ウィルスの弱毒化は32℃でのＰＤＫ (Primary Dog Kidney) 細胞での継代で行なわれた。ウイルス株の弱毒化はいくつかのインビトロおよびインビボマーカーを用いてチェックされた。50継代で全ての弱毒化基準が満足され、53継代でワクチン生産のためのマスターシードが選択された（1982）。ワクチン候補ＤＥＮ２ ＰＤＫ53がヒトで評価され、強い免疫原性があり、望ましくない臨床式兆候および症状は無いということが分った(Bhamarapravati et al., 1989）。

このデング熱−２の生きた弱毒化されたウイルス株（ＬＡＶ２）の完全な配列は2001年にR. Kinney et al.によって確認された(CDC, Fort Collins）。親のＤＥＮ２株16681（配列番号３）とＬＡＶ２（配列番号38）との間の配列の違いは［表１］に示してある。野生のウイルス株16681とＬＡＶ２株との遺伝的比較から、ＬＡＶ２弱毒化に関連付けられる９つ変異セットが示された。

1983年に最初に確認されたこのＬＡＶ２株は潜在的なワクチン候補として早くから同定されていた（Bhamarapravati and Yoksan, 1997)。しかし、当時は、哺乳動物の倍養物を介した海綿状脳炎（Encephalitis）のヒトへの伝播がリスクであると思われておらず、ウィルスはPrimary Dog Kidney（ＰＤＫ）細胞でルーチン通りに保持された。さらに、このＬＡＶ２株は異種個体群（heterogeneous population）に対応する。この異質性 (heterogeneity) には別のリスクもある。すなわち、組成物中に存在する株の1つをインビボおよびインビトロで選択することに起因するリスクがある。

本発明者は上記のようなリスクを全く無くすための衛生化（sanitization）方法を確立した。

本発明者は、ＬＡＶ２の精製された遺伝子ＲＮＡをベロ細胞に形質移入、その後にベロ細胞中での増幅を３サイクル続け、さらに２回の連続したプラーク精製階段を経ることで新規なベロ誘導（Vero-Derived）セロタイプ−２ウィルス（ＶＤＶ２）を得た。
上記の形質移入によってベロ細胞に誘導され、生物学的クローン化された本発明の新規なＶＤＶ２株は配列、均一プラーク寸法および温度感受性の点でＬＡＶ２株とは相違する。しかし、ＬＡＶ２の表現型および遺伝子型の特徴、例えば弱毒化スポット、プラーク表現型が小さい、高温で成長が制限される等の特徴は保持され、ＬＡＶ２株の免疫原特性は維持されるという重要な特徴を有する。これらの特徴から、この新規な株はヒトの子防免疫用の有用なワクチン候補である。

定義
「デング熱ウィルス」は、積極的な意味で、フラビリダ（flaviridae）科のフラビウイルス（Flavivirus）属に属する一重鎖のＲＮＡウィルスである。デング熱セロタイプ２（ＤＥＮ２）株16681の場合、全配列の長さは10723ヌクレオチド長である（配列番号３）。このＲＮＡのゲノムは5'端にタイプIのキャップを含むが、3'端のポリ(A)-テールは欠いている。遺伝子組織は5'端の非コード領域（NCR）、構造タンパク［カプシッド（C）、プレメンブレン／メンブレン（prM/M）およびエンベロープ（E)］および非構造タンパク（NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5）および3'端のNCRである。このウィルスＲＮＡゲノムはＣタンパクと一緒になってヌクレオキャプシッド（正二十面体対称）を形成する。他のフラビウイルスと同様に、ＤＥＮウィルスゲノムは単一ポリタンパクに翻訳される中断されない転写解読枠（ORF）をコードする。

デング熱−２の（病気の原因となる）劇毒株を複数世代継代することで「生きた弱毒化された」すなわち感染力はあるが病気を引き起こさない変性されたウィルスを単離することができる。こうした変性ウィルスは一般にサルでその弱毒化程度が評価されるが、ヒトは臨床病のサインを示す唯一の霊長目動物である。テストした大多数のヒトで副作用（すなわち全身症状および／または生物学的異常および／または局所反応）が低いか無く、軽症（すなわち、積極的な利点／リスト比を表す規制目的で許容される）を生じさせ、しかも、感染し、免疫応答を誘発するウィルスを「生きた弱毒化された」ウイルスと呼ぶ。

「ＬＡＶ」という用語は生きた弱毒化したデングウイルス株を意味する。本発明の「ＬＡＶ」は出発材料のデング熱セロタイプ２（ＤＥＮ２）株16681をプライマリ ドッグ キドニニー（イヌ髄質様腎、Primary Dog Kidney、ＰＤＫ）細胞を継代することによって弱毒化した生きたウイスルである。例えば、「ＬＡＶ２／ＰＤＫ53」は株16681をＰＤＫ細胞で53世代継代した後に確立された弱毒化された株である（ＤＥＮ２ 16681／ＰＤＫ53）。「ＬＡＶ２／ＰＤＫ50」は16681株をＰＤＫ細胞で50世代継代後に確立された弱毒化株である（ＤＥＮ２ 16681／ＰＤＫ50）。ＬＡＶ２／ＰＤＫ53のヌクレオチド配列は配列番号38に示してある。

「ＶＤＶ２」は本発明が開示する衛生化方法によって獲得可能なLAVを意味する。従って、このＶＤＶ２は霊長類、特にヒトに中和抗体を含む特定の液性免疫応答を誘発することができる（均一な）生物学的クローンのベロ適用（VERO-adapted)-デング熱セロタイプ２のウィルスである。本発明のＶＤＶ２株は本明細書に開示のＶＤＶ２配列から直接容易に再構築することができる。特異的な液性免疫応答の誘起はエリザ（ELISA）アッセイによって簡単に求めることができる。ワクチン接種者の血清中の中和抗体の存在は「4.1.1.2.2」で説明するプラーク減少中和テストで評価される。これで求めた中和抗体タイターが少なくとも1:10以上の時に、その血清は中和抗体の存在がポジティブであるとみなされる。

「突然変異」という手段は検出可能な任意の遺伝形質、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡの変化、プロセス、機構の変化またはそうした変化の結果を意味する。この突然変異には一つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む。本明細書でデング熱−２ウィルスゲノム配列またはポリタンパクで同定された突然変異はDunnenとAntonarakis命名法（2000）に従って示される。DunnenとAntonarakisの定義のように、核酸レベルでの置換は「＞」で表される。例えば「３１Ａ＞Ｇ」は基準配列のヌクレオチド３１でＡがＧに変化したことを表わしている。

タンパクレベルでの変化は突然変異の結果を記述し、以下のように報告される。ストップコードンはＸで表す（例えば、R97XはArg96が終結コードンに変化したことを示す）。アミノ酸の置換は例えば「S9G」で示し、これは位置9のSerがGlyに置換したことを意味する。

ベロ誘導（VERO-Derived）デング熱セロタイプ２ウィルス（ＶＤＶ２）
以前に開発したデング熱−２ワクチン候補のＬＡＶ２組成を衛生化プロセスで改良した。本明細書で開示するベロ誘導（VERO-Derived）デング熱セロタイプ２ウィルス（ＶＤＶ２）はＰＤＫ細胞で複数回継代して弱毒化されたＤＥＮ２ 16681ウィルスを使用する。ＶＤＶ２は生きた弱毒化されたＤＥＮ２ウィルスのゲノム配列を全て含み、ヒトでテストされたオリジナルのＬＡＶ２株と同じ弱毒化とリンクされた弱毒化スポットを有している。

ＬＡＶ２ワクチンの衛生化はタンパクを除去し、ベロ細胞に精製されたウィルスの遺伝子材料のみを導入することで実行した。すなわち、株の衛生化はウィルスＲＮＡを精製し、ベロ細胞中へ形質移入の形質移入することで実行した。この方法は以下の工程から成る：
a) プラーク-精製LVA2株（例えばＤＥＮ２ 16681/ＰＤＫ50ウィルス）からウィルスＲＮＡを抽出、精製し、
b) 好ましくは、精製されたＲＮＡをカチオン性リピドと組合せ、
c) ベロ細胞、特にベロ細胞LS10を形質移入し、
d) 新たに合成されたウィルスを回収し、
e) プラーク精製と宿主細胞、特にベロ細胞中での増幅（オプション）によってＶＤＶ株を精製する。

ベロ細胞工学は周知で、各種の商業的製品（注射および経口用ポリオワクチン、狂犬病ワクチン）で使用されている。本発明では偶然薬剤の存在にリンクする潜在的なリスクを無くすためにクォリファイド（qualified）ベロ細胞を用いた。この「クォリファイドベロ細胞」とは培養条件が知られており、上記の偶然薬剤を全く含まない細胞または細胞株を意味する。これには例えば本出願人（Sanofi Pasteur）のベロ細胞LS10が含まれる。

単離されたＶＤＶ株は一般に凍結組成物の形または凍結乾燥製品の形で保存されている。そのため、ＶＤＶは希釈剤（一般に凍結防止剤から成る糖アルコールと安定化剤とを含む緩衝水溶液）と混合することができる。凍結前または凍結乾燥前のpHはｐＨメータによって室温で６〜９の範囲、例えば約７、例えばpH 7.5＋／-0.2にするのが有利である。凍結乾燥製品は使用前に薬学的に許容される希釈剤または賦形剤、例えば無菌NaCI 4％o溶液と混合して、液体の免疫原組成物またはワクチンを再構成する。

形質移入時およびクローン時にＬＡＶ２ワクチン株の位置NS3-250のGIu変異株を選択し、ＬＡＶ２ワクチンの弱毒化にはクリティカルである位置5'ＮＣ-57およびＮＳ1-53の両方はＶＤＶ２配列で保存される。
配列番号38と比較して、形質移入の後に回収したウィルスの弱毒化に特有な遺伝子座での配列に突然変異は無かった。生物学的にクローン化されたＶＤＶ２ウィルスは均質なプラーク表現タイプを示し、弱毒化遺伝子型の保護から推論できるように、そのＬＡＶ２親に対して顕著な遺伝の安定度を示す。

ＶＤＶ２（継代11）株の配列を決定し、生きたセロタイプ２のデング熱弱毒化ウイルス（ＬＡＶ２）株の配列（配列番号38）と比較した。10のヌクレオチドの組の違いが同定された。トリガータとなる６つのアミノ酸置換はMおよびEnv構造ペプチドと、非構造ペプチドNS3およびNS5に位置している。これらの相違はいずれのＬＡＶ２弱毒化位置にも対応していない。

従って、本発明はＰＤＫ細胞で複数回継代した後に、ベロ細胞で衛生化することによって弱毒化した、野生型ウィルスＤＥＮ２ 16681から得られた生きた弱毒化されたデング熱−２ウィルス株を提供する。特に、本発明の弱毒化された株は、少なくとも野生型ＤＥＮ２ 16681株およびＬＡＶ２/ＰＤＫ53株のヌクレオチド配列またはポリタンパク配列に関係する同定された配列変異（ノンサイレントおよびオプショナリーにサイレント）から成る。

従って、本発明はヌクレオチドが少なくとも位置736、1619、4723、5062、9191、10063および10507で突然変異され、位置1638、2520、9222および10361での突然変異は任意であるＬＡＶ２/ＰＤＫ53株（配列番号38）の配列を有する（または、から成る）単離された生きた弱毒化されたデング熱−２ウィルス株に関するものである。ただし、以下の位置のヌクレオチドは突然変異させられていない：57、524、2055、2579、4018、5547、6599および8571。上記突然変異は置換であるのが好ましい。好ましくは、位置736のヌクレオチドはCであり、位置1619のヌクレオチドはAであり、位置4723のヌクレオチドはAであり、位置5062のヌクレオチドはAであり、位置9191のヌクレオチドはAであり、位置10063のヌクレオチドはAであり、位置10507のヌクレオチドはGである。

位置５２７０のヌクレオチドはＡまたはＴ、好ましくはＡにすることができる。
さらに好ましくは、本発明の単離された株は配列配列番号３８を有するし、この配列は少なくとも７３６Ｇ＞Ｃ、１６１９Ｇ＞Ａ、４７２３Ｔ＞Ａ、５０６２Ｇ＞Ｃ、９１９１Ｇ＞Ａ、１００６３Ｔ＞Ａ、および１０５０７Ａ＞Ｇの突然変異を有し、オプションとして、１６３８Ａ＞Ｇ、２５２０Ｇ＞Ａおよび／または９２２２Ａ＞Ｇの突然変異を有する。

すなわち、本発明の生きた弱毒化したデング熱−２ウィルス株は野生型デング熱−２株16681（配列番号３）の配列を有し、または、から成り、この配列において少なくとも５７Ｃ＞Ｔ、５２４Ａ＞Ｔ、７３６Ｇ＞Ｃ、１６１９Ｇ＞Ａ、２０５５Ｃ＞Ｔ、２５７９Ｇ＞Ａ、４０１８Ｃ＞Ｔ、４７２３Ｔ＞Ａ、５０６２Ｇ＞Ｃ、５５４７Ｔ＞Ｃ、６５９９Ｇ＞Ｃ、８５７１Ｃ＞Ｔ、９１９１Ｇ＞Ａ、１００６３Ｔ＞Ａおよび１０５０７Ａ＞Ｇから成る突然変異を有する。本発明の生きた弱毒化された株はさらに、野生型株１６６８１（配列番号３）のヌクレオチド配列を参照して、１６３８Ａ＞Ｇ、２５２０Ｇ＞Ａおよび／または９２２２Ａ＞Ｇの突然変異を有するのが好ましい。

本発明の生きた弱毒化されたデング熱−２ウィルス株は上記の位置736、1619、4723、5062、9191、10063および10507が突然変異し、コードされるアミノ酸の変化を起こさない所定コードン位置での一つまたは複数のヌクレオチドの置換をさらに含む配列番号３８を有する変異株株を含むことができる。

本発明の生きた弱毒化されたデング熱−２ウィルス株は配列番号１から所定た数、例えば５つ、好ましくは２以上ではない突然変異で相違する配列を有するのが好ましい。

本発明のデング熱−２ウィルス株のゲノム配列は配列番号.1から成るヌクレオチド配列から成るのが好ましい。

本発明はさらに、細胞上、特にベロ細胞での継代を経た配列配列番号１のＶＤＶ２株から誘導されることができる生きた弱毒化されたデング熱−２株に関するものである。

本発明はさらに、配列番号１のDNA配列またはその等価なＲＮＡ配列を有する、または、成る単離された核酸に関するものである。

「核酸分子」とはリボヌクレオシドのリン酸エステル重合体の形（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）またはその任意のホスホエステル類似物（例えば一重糸または二重螺旋糸の形のホスホロチオ酸およびチオエステル等）を意味する。

配列番号１と「等価」なＲＮＡ配列とは、デオキシチミジンがウリジンで置換された配列番号１を意味する。配列番号１はＶＤＶ２ｃＤＮＡ配列を構成するので、等価なＲＮＡ配列はＶＤＶ２のポジのストランドＲＮＡに対応する。

本発明はさらに、配列番号２のポリタンパクと、その断片とにも関するものである。配列番号２は配列番号１でコードされるポリタンパクの配列である。

基準蛋白の「断片」とは基準蛋白の一連のアミノ酸鎖の配列を有するポリペチドを意味する。この断片は少なくとも８、少なくとも12、少なくとも20のアミノ酸長にすることができる。

配列番号２のポリタンパクの上記断片はＭタンパクの位置9（配列番号２の位置214）に少なくとも一つのアルギニンを有し、および／または、E蛋白の位置228（配列番号２の位置508）にグルタミン酸を有する、および／またはNS3蛋白の位置69（配列番号２の位置1543）にトレオニンを有し、および／または、NS3蛋白の位置181（配列番号２の位置1656）にヒスチジンを有し、および／または、NS5蛋白の位置541（配列番号２の位置1725）にリシンを有し、および／または、NS5蛋白の位置832（配列番号２の位置3032）にトレオニンを有するのが好ましい。

本発明の一つの実施例では、配列番号１でコードされるポリタンパクの断片はＭタンパクおよび／またはE蛋白および／またはNS3蛋白および／またはNS5蛋白から成る。

免疫原およびワクチン組成物
本発明はさらに、本発明のＶＤＶ２株を含むワクチンとして使用に適した免疫原組成物にも関するものである。本発明の免疫原組成物は、中和抗体から成るデング熱ウィルスに対する特異的な液性免疫応答を誘導する。この免疫原組成物はワクチンであるのが好ましい。
本発明の一つの実施例では、免疫原は一価の組成物、すなわちデング熱−２ウィルスにだけ免疫応答を誘導する、および／または、保護を与えるものである。

本発明の他の実施例では、本発明は多価のデング熱免疫原組成物に関するものである。この多価免疫原組成物またはワクチンは個々の一価のデング熱ワクチンを組み合わせて得ることができる。免疫原組成物またはワクチンは少なくとも一つの他のセロタイプの生きた弱毒化されたデング熱ウィルスをさらに含むことができる。特に、免疫原組成物またはワクチンは本発明のＶＤＶ２とセロタイプ１、セロタイプ３およびセロタイプ４から成る群の中から選択される少なくとも一つの生きた弱毒化デング熱ウィルスとを組み合わせたものにすることができる。

免疫原組成物またはワクチンは四価のデング熱ワクチン組成物にするのが好ましい。すなわち、ワクチン組成物は本発明のＶＤＶ２と生きた弱毒化されたデング-１ウィルス株、生きた弱毒化されたデング-３ウィルス株および生きた弱毒化されたデング-４ウィルス株とを組み合わせたものにすることができる。

生きた弱毒化されたデング-１ウィルス株、デング-３ウィルス株およびデング-４ウィルス株は上記のものである。Mahidol Universityによって開発されたデング熱セロタイプ1（株16007、継代13；ＬＡＶ１）、Primary Dog Kidney（ＰＤＫ）Cellsでセロタイプ４（株1036、継代48、ＬＡＶ４）ウィルス、Primary Green Monkey Kidney（PGMK）細胞（継代30）およびFetal Rhesus Lung（FRhL）細胞（継代3）でセロタイプ３（株16562）（ＬＡＶ３）を継代した弱毒化生ワクチンを参照することができる。ＬＡＶ１（配列番号４０、ＬＡＶ３（配列番号４１）およびＬＡＶ４（配列番号４２）のヌクレオチド配列は添付の配列リストに示してある。

生きた弱毒化されたデング-１株は本発明の衛生化方法によってMahidolが開発したＬＡＶ１株から得られたＶＤＶ１株に対応するのが有利である。特に、生きた弱毒化デング-１株（VDV1）は配列番号39を有し、構成されるのが有利である。
ワクチンを含む免疫原組成物は溶液、懸濁液またはエマルションに対応する注射薬として調製することができる。活性免疫原成分はそれと相溶性を有する薬学的に許容される賦形剤と混合することができる。

本発明の免疫原組成物またはワクチンは当業者に周知の方法を使用して調製することができる。すなわち、本発明の抗原を薬学的に許容される希釈剤または賦形剤、例えば水、リン酸塩緩衝食塩水溶液、湿潤剤、充填剤、乳化剤安定化剤と一緒に混合する。賦形剤または希釈剤は投与方法および投与ルート、医薬品のプラクティス、選択した医薬のタイプに応じて選択する。適切な賦形剤または希釈剤と医薬品調合条件は当該分野の代表的な参考図書のRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
免疫原組成物またはワクチンはｐＨを例えば6〜9の範囲（ｐＨメータで室温で求める）に維持する緩衝水溶液から成る注射薬組成物に対応するのが好ましい。

本発明組成物はさらに、アジュバント、すなわちＶＤＶ２株が誘導する免疫応答を改良または強化する物質を含むことができる。ヒト用ワクチンの分野でこの目的で使用可能な任意の薬学的に許容されるアジュバントまたはアジュバント混合物を使用することができる。
本発明の免疫原組成物またはワクチンは、ヒト用ワクチンの分野で通常使用される任意の従来ルート、例えば非経口（例えば経皮内、経皮下、経筋内）ルートで投与できる。本発明では、免疫原組成物またはワクチンは三角筋領域に皮下注射可能な注射薬組成物であるのが好ましい。

免疫化方法
本発明はさらに、本発明のワクチン組成物の免疫有効量をホスト（受容者、寄主）に投与することから成るデング熱感染に対して免疫を必要とするホストを免疫化する方法を提供する。「免疫を必要とするホスト」とはデング熱の感染のリスクのある人を示し、デング熱ウイルスの感染地域、さらにはその領域の住民を意味する。投与ルートはワクチン分野で使用されている任意の従来ルートにすることができる。投与ルートは選択した調合法に従って選択する。免疫原組成物またはワクチンは三角筋領域に経皮下ルートで投与される注射薬組成物にするのが好ましい。

免疫原組成物またはワクチン中のＬＡＶまたはＶＤＶ、特にＶＤＶ２の量は一般にウイルスプラークユニット（ＰＦＵ）単位で表すか、従来の製薬方法を用いて作ったCell Culture Infectious Dose ５０％（ＣＣＩＤ₅₀）投与量の形で表すことができる。例えば、本発明の組成物はＬＡＶまたはＶＤＶが10〜10⁶ＣＣＩＤ₅₀または10³〜10⁵ＣＣＩＤ₅₀を含む投与量の形に調製でき、例えば、一価組成物に場合、ＶＤＶ２のの４±0.5log₁₀ＣＣＩＤ₅₀を投与する。多価組成物の場合には、ウィルス干渉現象を避けてバランスした免疫応答（すなわち組成物に含まれる全てのセロタイプに対する免疫応答）を誘導するために、投与したワクチン中の各デング熱セロタイプの量は同じでない

「免疫有効量」とは、ワクチン接種を受けたヒトの血清中の抗体を中立化する特異的液性免疫応答を誘発することができる量で、4.1.1.2.2で説明するプラーク減少中和テストで評価される。すなわち、求めた中和抗体の力価が少なくとも1:10以上の時に、血清は中和抗体の存在がポジティブであるとみなされる。投与容積は投与ルートに従って変化する。皮下注射では約0.1ml〜1.0 mlであり、好ましくは0.5 mlである。

組成物の最適投与時期はデング熱ウィルスに最初に曝される時より１〜３ヵ月前である。本発明のワクチンはデング感染の危険に曝された成人または子供の病気予防薬として投与ができる。従って、目標個体群はデング熱ウィルスに対してナイーブおよび非ナイーブな人が含まれる。本発明のワクチンは一回で投与でき、また、当業者が適切であると判断した場合には、必要に応じて、プライマー投与（初回抗原刺激）に続いて、例えば２〜６ヵ月後にブースター投与をすることができる。
以下の添付図面および実施例を参照して本発明を説明する。

実施例１
衛生化
1.1 ウィルスＲＮＡ精製
ＲＮＡの精製および形質移入は下記の方法で行なった。ＤＥＮ２／ＰＤＫ50懸濁液を0.5mlの水に再懸濁させて１ミリリットル当り少なくとも３×10⁴から３×10⁷までのＴＣＩＤ₅₀またはＰＦＵのウィルスを含むまで希釈した。0.01mlのウィリアム培地に希釈されたベンゾナーゼの1単位を0.5mlのウィルスに加えて細胞起源からＤＮＡまたはＲＮＡ分子を消化し、溶液を撹拌下に４℃で２時間培養した。培養段階の終了後、グアニジウクロライド、界面活性剤（SDS）およびβ−メルカプトエタノールを含む0.65mlの変性緩衝液（ＲＴＬ−βメルカプトエタノール緩衝液、RNeasy Mini Kit, Qiagen提供、Ref 74104）を加え、タンパク類をフェノール／クロロホルム（1/1）（vol/vol）で一回、クロロホルム（vol/vol）で一回抽出し、その後、室温で５分間、14,000回転数／分で遠心分離した。各抽出後に、界面の材料（白い沈殿）は回収しないように注意しながら、水相を回収し、きれいな1mlのエッペンドルフチューブに移した。

ＲＮＡ溶液をQIAgenカラムへ加えて、メーカー（RNeasy minikit、QIAgen）の推薦方法に従って痕跡量の溶剤を除去し、0.06mlのヌクレアーゼを含まないH2O水で溶出した。ウィルスＲＮＡの存在は公知のウィルス量（ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ）で確立された基準曲線を用いて定量室温-ＰＣＲで確認した。

1.2 精製ＲＮＡを用いたベロ細胞の形質移入
形質移入はリポフェクタミン（lipofectamine）（LF2000 Reagent、Life Technologies）、チャージ相互作用によりＲＮＡと合体し、細胞膜とのフュージョンによって複合体を細胞の細胞原形質中に移送させるカチオンリピドの混合液を用いて行った。このLF2000試薬の最適量は16〜24時間前にベロ細胞の培養予備実験（６ウエルプレートで１ウエル当り0.3〜0.5×10⁶細胞）でリポフェクタミンを増加させて（５〜20μl）決定した。次に、細胞を32℃で５％CO₂で４〜５時間培養した後、培地をFCSのないフレッシュな培地と取り替え、さらに32℃で培養を継続した。毒性（丸い、リフリンジェントまたは浮いた細胞、細胞単層の均一正）は倒立顕微鏡下で48時間毎に定期的に検査した。これらの条件下で有毒でないリポフェクタミンの最高投与量は10μlであり、これをＲＮＡ形質移入で選択した。

準備したＲＮＡの１／４（約２×10⁴log eqTCID₅₀、qRT-ＰＣＲに従う）を用いて４つの形質移入を平行に実行した。25マイクロリットルのウィルスＲＮＡ溶液を15μlのLF2000 Reagent（チャージ相互作用によりＲＮＡと合体し、細胞膜とのフュージョンによって複合体を細胞の細胞原形質中へ移送させるカチオンリピドの混合液）を含む500μlのOptiMEM培地（GIBCO）中に希釈した。４つの反応の２つでは担体として200ngのイーストｔＲＮＡを加えた。

上記の４つの形質移入混合物を室温で10分間沈澱させた後に、融合性ベロ細胞の６-ウエルプレートに加え、36℃で培養した。４時間後、形質移入混合物を除去し、細胞をＰＢＳで一回濯ぐ。３ミリリットルのポスト-形質移入培地（ウィリアムズ、GIBCO）を加え、培養を32℃で５日間継続する。次に、3mlの培地をデング感染培地（10mM MgSO₄で懸濁したウィリアムズ）と交換した。

形質移入から８日後にｔＲＮＡの存在で形質移入した２つのウエルの1つに典型的な細胞変性効果（丸い、リフリンジェントな細胞）を示す細胞の細胞増殖巣が検出された。これらの細胞の上澄がウィルスを放出することはqRT-ＰＣＲで確認した。形質移入から１１日後にこのウエルのみに顕著な細胞変性効果が検出された。形質移入した他の残りの３つのウエルの上澄はネガのままであった。

形質移入後に回収されたウイルス性溶液は（16681ＰＤＫ50／ベロ-2の代わりに）TV100と命名され、これは低温保護剤（pH＝7.5）から成る緩衝水溶液中に１／２希釈後に5.8 logTCID₅₀/mlの感染力価を示した。

1.3 形質移入後に得られたウィルスの特徴付け
弱毒化に重要な特異的遺伝子座のスポットシークエンシングをR. Kinney (CDC, Fort Collins）で実行した。データは［表３］に示してある。

ＶＤＶ２は重要な弱毒化遺伝子座を5'NC-57およびNS1-53に保持し、およびＰＤＫ53ワクチンのNS3-250-Glu変異株の野性-タイプ16681の遺伝子座を保持していた。ＰＤＫ53ワクチン中のNS3-250-Glu/Val混合物はＰＤＫ45とＰＤＫ53との間の継代で安定しているのが観察され、これは選択がベロ細胞で起こったことを示唆している。ワクチン接種を受けた人の血清から単離したＤＥＮ２ワクチンのこれまでの分析からこの選択はヒトで起こることを示している。

ウィルスのプラーク直径をベロ細胞で測定した。手短に言うと、ベロ細胞を４％のFBSを含む培地中に1.000.000細胞/cm²の密度で植え、一晩培養した後、培地を除去し、細胞を２倍希釈または５倍希釈のウィルスに感染させる。37℃で5％CO₂中に1.5時間置いた後、植菌物が除去し、細胞を1.26％のメチルセルロースと10％のFBSとを含むMimimal Eagle Medium（MEM）中で37℃で5％CO₂中で培養する。11日間培養した後、プレートを-2O℃のコールドアセトン中に20分間固定し、2.5マイクログラム/ミリリットルに希釈したフラビウイルスに特異的なmAbで免疫-呈色反応で発現させる。ウイルス性プラークは画像分析ソフトウェア（Saisam/Microvision）を用いて測定した。

ＶＤＶ２をＬＡＶ２ 16681/ＰＤＫ50シードと比較した（［表４］）。１〜３mm直径の類似した均一な小さいプラークが見られた。

1.4 プラーク-精製
形質移入後に回収したウィルスを追加の３回の増幅継代（P2からP4）を行った。P3 およびP4 の継代ウィルスにプラーク-精製による生物学的クローニングを行った（それぞれ、LST 003およびLST 007と名付けた）。
手短に言うと、ベロ細胞を6-ウエルプレートに塗布し、１プレートに1〜20のプラークを得るために希釈した一連のウィルスに感染させた。37℃、５％CO₂で11.5時間放置した後、接種材料を除去し、細胞を3mlの42℃に予熱されたMEM-10％ FCSに２％の42℃で平衡した溶けたアガロースを即時混合したものから成る固形培地で培養した。培地を室温で30分間のフローフード下に固化させた後、プレートを逆さ位置で10日間、32℃−５％CO₂で培養した。次に、0.01％のニュートラルレッドを補った同じ培地の第２の層を加え、プレートを一晩、32℃で追加培養した。６つのウエル単離された小さいプラークを0.1mlチップを備えたミクロピペットを用いて無菌条件下に採取し、0.2mlのMEM-4％ FCSを収用した無菌チューブへ移した：P3継代からの３つ（クローン31、32、33として同定）とP4継代から３つ（クローン71、72、73と同定）。懸濁液を攪拌して均質化し、同じ培地で一連の希釈をし、直ちにベロ細胞の6-ウエルプレートの感染に用いた。以上のプロトコルを繰り返して、２つのSPの第２の採取をクローン32、33、71、72と、クローン31上の1つのSPで行なった。採取した各プラークを1mlの培地で希釈した後、T25 cm²フラスコ中でベロ細胞で増幅した。感染後６日目に培地を回収し、低温保護剤（pH 7.5）から成る同じ容積の緩衝水溶液で希釈し、-70℃へ凍結した。これらの全ての階段は32℃で実行した。

プラーク精製ウィルスはそれぞれ311、321、322、331、332、341、342、351、352、711、712、721および722と名付けられた。感染力価は最初の増幅後にベロ細胞で求めた（下記参照）：
クローン311： 3.95 LogCCID₅₀/ml
クローン321： 5.20 LogCCID₅₀/ml
クローン322： 5.45 LogCClD₅₀/ml
クローン331： 5.55 LogCCID₅₀/ml
クローン332： 4.95 LogCCID₅₀/ml
クローン341： 2.80 LogCCID₅₀/ml
クローン342： 4.85 LogCCID₅₀/ml
クローン351： 5.35 LogCCID₅₀/ml
クローン352： 5.50 LogCCID₅₀/ml
クローン711： 5.45 LogCCID₅₀/ml
クローン712： 5.65 LogCCID₅₀/ml
クローン721： 5.30 LogCCID₅₀/ml
クローン722： 5.60 LogCCID₅₀/ml

ベロ細胞での第２の増幅を３つのクローン：クローン331、352、722で実行した。感染後８日目に培養上清を回収し、低温保護剤（pH 7.5）から成る緩衝水溶液で１／２に希釈し、TV331、TV352およびTV722と名付けた。

1.5 クローンウィルスの特徴付け
第1増幅後、全ての増幅ウィルスは同じプラーク寸法の表現型および５logCCID50/ml以上の当量力価とを示した（クローン311と341は除く。これらはこの値りかなり低い）。第1増幅からの６つのクローン（クローン321、331、351、352、711、721）および第２増幅からの３つのクローンで弱毒化に特有の位置の配列決定を実行したが、突然変異は見られなかった。

クローン間には大きな相違点は無かったので、TV722を選択し、ベロ細胞で増幅してＶＤＶ２ワクチン候補株を作った。

結論として、ベロ細胞に適した生物学的クローンＤＥＮ２ 166681／ＰＤＫ50を得るためには全部で11代の継代数が必要であった。
次に、ＶＤＶ２継代11の完全配列の決定と表現型決定テストとを実行して追加の特徴付けを行なった。

実施例２
配列決定
ウィルスの完全な配列は以下の手順で求めた。ウィルスの遺伝子ＲＮＡを精製した。完全ゲノムを16のオーパーラップ室温ＰＣＲ反応によってで増幅した。各ＰＣＲは配列決定タグが各ＤＮＡ鎖に付加されるように設計した。それによって単純な配列反応を繰り返すことができ、単一の汎用配列決定プライマ対を用いて全てを実行できる。各ＰＣＲ生成物は両方のＤＮＡ鎖で個別に配列決定した。全ての結果を再び組み立てて、完全ＶＤＶ２ゲノムを再建した。

2.1 材料
2.1.1 ウィルス
使用したウィルスはＤＥＮ２ 16681；ＬＡＶ２/ＰＤＫ53；ＶＤＶ２で、これらのさ配列は添付の配列リストに示してある。これらのウィルスの完全ゲノム配列の長さは10723ヌクレオチドである。

2.1.2 プライマ
全てのプライマはSeqweb bioinformaticsパッケージ（Accelrys）プライマデザインモジュール（［表６］）で設計された。

2.2 方法
2.2.1 ウィルスＲＮＡの精製
前回の経験から次の階段でポジティブな室温-ＰＣＲ反応を得るためには最低でも1000DICC_5Oが必要である。このことは最低でも10⁴DICC₅₀/mLのウィルス力価が必要であることを意味する。ウィルスゲノムＲＮＡはQIAampウィルスＲＮＡミニキット（Qiagen）を使用してメーカー推薦の方法に従って精製した。簡単に言うと、細胞溶解溶液の存在下で天然のウイルスサンプルの140μlを培養し、キットのカラムにかける。洗浄階段後に精製されたウィルスＲＮＡを1μl（40単位）のRNAseインヒビター（RNAse Out、Sigma）を含む60μlの殺菌したヌクレアーゼを含まない水で溶出された。

2.2.2 逆転写
ウィルスＲＮＡをABGeneから逆転写酵素（逆iT）によって相補ＤＮＡに逆転写した。再度、10μlの精製されたＲＮＡを用いて標準的な操作条件を適用し、20μlの最終反応容積にした。反応の開始は負のストランドプライマのハイブリダイゼーションである。ＰＣＲによる室温反応を1回実行した。相補ＤＮＡ合成は47℃で45分間培養して得た。

2.2.3 ＰＣＲ
全てのＰＣＲは［表６］から16対のプライマ（＋）および(-)を使用してExpand High Fidelity ＰＣＲシステム（Roche diagnostics）を用いて実行した。ＰＣＲの条件は以下の通り：

2.2.4 配列決定
配列反応の主要部分はGenome Express社にアウトソースされた。技術的理由でGenome Express社では配列決定されなかったゲノム端、曖昧部分、ある種のインターＰＣＲ結合および領域は社内で行った。
（１）Genome Express社での配列決定：
ＰＣＲ生成物を＋40℃で送り、配列決定結果はinformatic配列ファイルとして受信した。各配列に対してテキストファイル、品質ファイルおよびクロマトグラムが入手可能。配列アランメント後に全ての矛盾はクロマトグラムでチェックし、配列アルゴリズムの間違いとして同定された場合には訂正した。
（２）社内での配列決定：
配列反応はSequitherm Excell Il ＬＣキット（Epicentre）を用いてthermocycler PTC-200（MJ Research）で実行した。各ＰＣＲ生成物は両方のストランドでそれぞれに単一反応で配列決定した。反応物は配列電気泳動ゲルにかけた。配列のランおよび解析は自動シーケンサのGene ReadlR 4200（Li-Cor）で実行した。

2.3 結果
全てのＰＣＲ断片（すなわち5.'で加えられた具体的なモチーフ）が、普通のＰＣＲ加えられたテイルを使用している両方の末端から順番に配列してあった。全てのプライマの末端：
5'プライマ：M13SEQ-GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号36）
3'プライマ：M13REV-AACAGCTATGACCATG（配列番号37）
M13-SEQおよび-REV配列は汎用M13プライマーモチーフ（New England Biolabs 基準）に対応する。
最終contigアセンブリの場合にはContig Expressモジュール（Informax）においてベクターNTiでクイック解析を行った。ＬＡＶ２基準配列を全ての個々の配列決定結果と比較した。この条件下では、いくつかの領域がcontigアセンブリを欠いていたとしても、全ての結果を完全ゲノム上の正しい位置に整列して、全体のゲノム配列を迅速に視覚化することができる。

2.3.1 完全なＶＤＶ２配列アセンブリ
最終的な配列アランメントはベクターNTi、AlignXモジュール（Informax）で行なった。古典的なマルチプル配列アランメントアルゴリズムClustalW（Thompson et al., 1994）をソフトウェアとして全体アランメントを構築した。全ての配列結果をＬＡＶ２基準配列と一緒に並べることで、ゲノムをより良く再構成できる。基準に対する配列での違いは他の独立した配列反応で確認した。ＶＤＶ２の完全配列は配列番号１に示してある。

単一配列にはいくつかの曖昧さ、特に配列極端の近くにあった。これはＰＣＲ断片両端での反応の品質があまり良くなかったためである。そうした品質の悪い配列は他のＰＣＲ生成物から２つの別の独立した配列反応が得られるまでアランメントから除いた。少なくとも２つの独立した別のＰＣＲ配列コンセンサスにマッチで確認されない限り、基準との相違点は最終アランメントには入れなかった。逆に、２つの独立配列で確認された相違は最終配列で維持した。

［表７］は開始、終了および長さを示す各配列反応の特徴の要約である。隣接ＰＣＲ間の重なりも示してある。また、基準配列に対する相違も最後の欄に示してある。

相補ＤＮＡ合成とＰＣＲ ＤＮＡ反応にはゲノムの末端と相補なオリゴヌクレオチドが必要であるので、ゲノムの２つの極端はＰＣＲ増幅から配列決定することはできなかった。増幅階段にこれらオリゴヌクレオチドはＰＣＲ断片に組み込まれる。配列結果は合成オリゴヌクレオチドの配列で、ウィルス自体の配列でない。ウイルスゲノムの両末端からのＰＣＲは正しく働き、ウイルスの配列はオリゴヌクレオチド配列と大きく異ならないことを示唆している（そうである場合にはＰＣＲ増幅が失敗するか、少なくとも品質が悪くなる）。他の全てのＰＣＲ増幅と区別できなかった。従って、再構築したゲノムの両方のゲノム末端はオリゴヌクレオチド配列と同一であり（基準とも同一である）と考えられる。5'端の配列はヌクレオチド1〜32であり、3'端の配列はヌクレオチド10695〜10723である。

2.3.2 配列比較
親のＬＡＶ２ゲノム配列に関してはヌクレオチドの違いが10個所検出された。ＶＤＶ２ワクチン株はＬＡＶ２からウィルス衛生化とイヌからサル細胞への継代によって誘導される。
ＬＡＶ２とＶＤＶ２との違いは複数の原因を有する。第１に、クローニング階段はＬＡＶ２で以前に検出したメジャーな配列に100％同一でないウイルス性亜細胞を選択できる。第２に、ＬＡＶ２はＰＤＫ細胞で作られ、ＶＤＶ２はベロ細胞で作られる。イヌからサル細胞へのこの種の継代はウィルス変化を誘発し、潜在的に新しい細胞系への順応を示すということは知られている。第３に、全てのＲＮＡウィルスの場合のように、低ウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ忠実度の遺伝子突然変異の誘発率はＤＮＡポリメラーゼよりも高い。

配列の面で、ＬＡＶ２のウイルス性弱毒化に関連する9つのヌクレオチド位置の全てはＶＤＶ２継代11で維持される。
さらに、ＶＤＶ２継代9と継代11との間の配列比較から、継代9と11との間で表現型、ウィルス血症および免疫原性の相違とリンクした２つの突然変異が発生したことが示された。

利用可能な全ての遺伝子バンクのセロタイプ２つのデングゲノム配列間で配列整合を行うと、２つの位置のみが他のデング熱−２株（1638および2520）と共通し、アミノ酸レベルでは両方は目立たないように見える。他の全ての位置はＶＤＶ２継代11株に特有で、アミノ酸の置換を誘発する（［表８］）。アミノ酸の変化に関しては非構造ペプチドの４つの変化は生化学的な観点から相対的に保存され、Ｍおよびエンベロープの２つの変化は電価および疎水性の両方を変化させる。

実施例３
特徴付け
この研究の目的は弱毒化マーカーの変化が継代を通じて起こったのか否かを調べることにある。
［図２］は「そのまま直ぐに使用可能な」投与物のフィルドプロダクト（Filled Product）（一価）にするために開発した製造プロセスを要約した流れ図を示している。簡単に言うと、ＶＤＶ２継代８をベロ細胞上で２世代連続して継代した後に各ワーキングシードを得る。最後のウィルス培養もベロ細胞懸濁液の感染で実施する。得られたウィルスを収穫する。デオキシ核酸（ＤＮＡ）を酵素処理によって消化する。不純物は限外濾過で除去する。濃縮段階で感染力価を強くする。低温保護剤（pH ＝ 7.5）から成る緩衝水溶液を加え、0.22-μmの濾過混合液を同じ溶液で目標投与量に希釈する。活性物質をグラス小びんに充填し、凍結乾燥し、使用時まで保存する。

3.1 表現型マーカー
［表９］は、ＤＥＮ２ 16681wt株、ＤＥＮ２ 16681/ＰＤＫ53ワクチン株、ＶＤＶ２継代9およびＶＤＶ２継代11（最後の順応継代）で実行した３つの表現型アッセイのデータ：温度感応性（Ts）、サル（Vero）細胞および蚊（C6/36）細胞での成長曲線およびニューボーンハツカネズミでの神経毒性（CDCで得られたデータ）を示している。現在、デングウィルスの弱毒化基準として科学委員会で受けられるものはハツカネズミ神経毒性の減少（死亡率の減少および平均値生残時間（AST）の伸び）、39℃での成長制限およびC6 /36での複製制限である。ベロ−順応継代は明確なTsプロフィルを示し、ＤＥＮ２/ＰＤＫ53より制限されている。このアッセイでは最終順応継代は約３ｌｏｇだけ制限される。また、ウィルス成長曲線から温度感受性も確認された。ベロ細胞ではテストした全てのウィルスで類似した複製レベルが観察された。蚊細胞ではwt ＤＥＮ２と比較してベロ−順応ウィルスのウィルス成長が明らかに限定され（約３ｌｏｇ）、ＤＥＮ２-ＰＤＫ53と比較した場合にはわずかに限定された（約0.5ｌｏｇ）。驚いたことに、ベロ−順応ウィルスのハツカネズミ神経毒性はwt ＤＥＮ２の神経毒性に近く、ＤＥＮ２/ＰＤＫ53ワクチンの神経毒性よりはるかに高かった。これらのデータはウィルスの株弱毒化（cf臨床データ）に関してはこのアッセイの予想値が低いことを指摘している。

ＶＤＶ２継代9および11、ＤＥＮ２/ＰＤＫ53およびwtＤＥＮ２のプラーク寸法の分布を［図５］で比較した。Wt ＤＥＮ２はヘテロなプロフィルを示し、95％は寸法が均一なプロフィルを有するプラークで、プラークのメジャーな個体群（81％）は＜0.6mmで、プラークのマイナーな個体群（12％）は１〜２mmである。このプロフィルはＤＥＮ２-ＰＤＫ53プロフィルに近いが、それとは別である。注目すべきことに、中間の順応継代ＶＤＶ２ P9がよりヘテロなプロフィルを示し、メジャーな個体群（70％）は１〜２mmのプラークで、マイナーな個体群（25％）は＜0.6mmのプラークである。これらのデータはＶＤＶ２株は継代９では充分に順応しておらず、ベロ細胞で安定して転写する均一な個体群を獲得するためにはさらに２つの追加の継代が必要であるということをが示している。

実施例４
免疫原性、ウィルス血症およびサルでの毒性
サルで得られた最も確実かつ多くのデータは免疫原性とウィルス血症に関するものである。特に、ヒトでの毒性および激しい病気に関連するファクタの1つとしてウィルス血症が同定され、従って、考慮すべき重要なパラメータを構成する。免疫原性はワクチンを試験する際の重要なパラメータであることは明らかである。
本発明者はウィルス血症および免疫原性の最小値／最大値を確立した。

4.1 前臨床薬理学、薬物動力学および動物での製品代謝
4.1.1 材料および方法
4.1.1.1 サル実験
サル実験はアニマル実験に関する欧州ガイドラインに従って実行した。免疫化はモーリシャス（CRP Le Vallon）から送られたカニクイザル（オナガザル科）で実行した。これらのサルは免疫化前に本出願人（Sanofi Pasteur）の動物設備で６週間隔離した。各サルは腕の皮膚（SC）経由で0.5mlのワクチンを投与して免疫化した（各セクションを参照）。ケタミン（Imalgene、Merial）で軽く麻酔した後、鼠径部または伏在静脈に注射をして血液を回収した。抗体応答を評価するために０日および28日目に５mlの血液サンプルを採り、２〜10の間に１mlの血液サンプルを採取してウィルス血症を評価した。血液は氷上に集め、血清分離まで氷上に維持した。すなわち、血液を４℃で20分間、遠心分離し、リッチ・キニー実験室で試験するまで回収した血清を−8O℃で保存した。米国へはドライアイス中に入れての出荷した。

4.1.1.2 ウィルス血症と中和抗体応答（プラーク減少中和テスト（Plaque Reduction Neutralization Test、PRNT）
全ての分析は米国、フォート・コリンズ、CDCのR.キニー実験室で行った。送られてきた血清サンプルは試験まで−80℃で保存した。最初の解凍時に血清のウィルス血症を試験し、1:5希釈サンプルを作った。中和抗体試験前に、1:5希釈血清を56℃で30分間、不活性化した。

4.1.1.2.1 ウィルス血症
96-ウエルプレートの最初のウエルで0.125mlの希釈剤（RPMI培地）に0.125mlの血清を加え、各希釈のためにの0.225mlの希釈剤に0.025mlを移して一連の10-倍希釈を行なった。ベロ細胞の6-ウエルプレートに10^0.3-10^{5 3}希釈シリーズの0.2mlを塗布した（ウィルスは37℃で1.5時間で吸着され、ニュートラルレッドを含まない４mlのアガロースで覆い、６〜７日後にニュートラルレッドを含む２mlのアガロースで覆い、プラークを数えた）。ウィルスの検出限界は＝10PFU/mlであった。参照株として、DEN-16681 ＰＤＫ-53（ＬＡＶ２）ワクチンを塗布した。

4.1.1.2.2 ＰＲＮＴ（プラーク減少中和テスト）
中和抗体の定量化はHuang et al（2000）に記載の方法で行なった。簡単に言うと、0.2mlの加熱−不活性化した1:5希釈血清を96-ウエルプレートの最初のウエルに塗布し、各希釈で0.1mlの希釈剤（RPMI培地）に0.1mlを移して２倍希釈シリーズを作った。結果的に1：10〜1：320の血清希釈シリーズが得られた。各血清希釈ウエルに0.1 mlのＤＥＮウィルス（60〜160PFU；親のＤＥＮ２ 16681ウィルス）を加えて合計で0.2mlの血清-ウィルス混合液にした。96-ウエルプレートは40℃で一晩培養した。6-ウエルVeroプレートに0.1 mlの血清-ウィルス混合液（30〜80 PFUの入力ウィルスを含む）を塗布し（ウィルス血症の項で説明したように）、染色後、ニュートラルレッドでプラークを数えた。２−倍、１−倍および0.5−倍の試験濃度で入力ウィルスのマルチプルバック滴定から入力PFUを実験的に直接求めることができ、それを基にして50％（PRNT50）および（PRNT70）70％終点抗体価を決定することができる。負の血清結果は＜1:10の中和抗体力価を有していなければならない。320の中和力価を示す血清は１：80〜1: 2560の希釈度で再試験して終点力価を決定した。

4.1.2 サル継代9での一価ＶＤＶ２ 候補の評価
実施例1に記載の方法てＶＤＶ２候補を精製／選択した。（表現型マーカーおよび配列に基づいて）選択されたクローンは本出願人（Sanofi Pasteur)で細胞培養で９世代継代後にモーリシャスのルバロンのCRPから送られたオスのカニクイザルマカク（オナガザル科、平均体重3.1kg）で試験された。
０日（DO）の免疫化後、ウィルス血症が２日（D2）から10日（D10）まで続いた。免疫原性はDOとD28に測定した。全てのウィルスおよびワクチンは液体の形で−7O℃で保存した。

ＬＡＶ２：力価：10^3.93 DICC₅₀/ml；凍結乾燥、0.5mlのＰＢＳに再懸濁（Ca²⁺およびMg²⁺を含む；CaCl₂.2H₂O 0.133 g/l；MgCl₂.6H₂O、0.1g/l)し、全体を投与。
継代ＶＤＶ２ ＤＥＮ２-TV722（２回のプラーク精製＋1回の増幅）：力価：10^5.6 DICC₅₀/ml；液体、ＰＢＳに10^5.3pfu/mlで希釈（Ca²⁺およびMg²⁺を含む；CaCl₂. 2H₂O 0133 g/l；MgCl₂-6H₂O, 0,1g/l)；0.5 ml投与。

注射は23G1針で腕にSCルートでＶＤＶ２を10⁵DICC₅₀の投与量で投与した。
結果は［表11］に示してある。28日目の滴定はPRNT₇₀およびPRNT₅₀の両方に対して３回行なった。
ＶＤＶ２とＬＡＶ２の比較からウィルス血症に明確な違いが示されている。ＬＡＶ２と比較してＶＤＶ２は3/4サルで短時間に高いウィルス血症を示し、両方のタイプで大きな免疫原性を示す（ＶＤＶ２の方がむしろ低い）。このウィルス血症はプレマスターレベルでのベロ細胞での単に数回の継代後のＶＤＶ２にしては高過ぎると考えられるが、しかし、野生型ＤＥＮ２（他のタイプも同じ）ではウィルス血症はより長く持続（６〜７日間）し、強くなる（５logプラーク形成単位[ pfu ]）(Monath et al., 2000; Bray et al., 1996)。

4.1.3 継代11での一価ＶＤＶ２候補の評価
ワクチンの免疫原性を継代９で試験したので、追加の実験を設計し、追加の２世代継代（継代10）後に一価継代を試験した。前回と同様に、モーリシャス島、ル バロン C. R. P. から送られたオスのカニクイザル（24匹のサル、平均体重3.4kg）を上記と同様に使用した。
継代１１ＶＤＶ２；バッチ：力価：8.07 log10 DICC₅₀/ml
プラシーボ：ＰＢＳ ＋Ca²⁺およびMg²⁺
ＶＤＶ３：ベロ細胞でのＬＡＶ３の衛生化で得たデング由来ワクチンセロタイプ３株
ＶＤＶ４：ベロ細胞でのＬＡＶ４の衛生化で得たデング由来ワクチンセロタイプ４株
ワクチンはＰＢＳ（Ca²⁺およびMg²⁺を含む；CaCl₂.2H₂O 0.133 g/l； MgCl₂.6H₂O , 0.1g/l)中に10^5.3 DICC₅₀/mlで希釈し、23G1針を用いて腕にSCルートで10⁵ DICC₅₀の投与量に対応する0.5 mlを投与した。ウィルス血症および免疫原性はR KinnwyによりＣＤＣで通常通り測定した。結果は［表１２］に示してある。

ＶＤＶ２継代１１の単価ワクチンは大きな免疫応答を誘発したが、ウィルス血症は低いか、見られなかった。継代９ＶＤＶ２が早くから大きなウィルス血症を誘発した前回の実験から見て、ＶＤＶ２-誘導ウィルス血症が無いか／低いことは考慮すべきことである。継代９と継代１１との間のある種の変化で高いウィルス血症が抑制され、しかも、免疫原性は維持された。従って、ＶＤＶ２は許容される候補になる。

同じ実験で、４匹のサルには同じＶＤＶ２継代11ワクチンを含む４価の調合物をワクチン接種した。ＶＤＶ１およびＶＤＶ２ではウィルス血症は検出されなかったが、ＶＤＶ３およびＶＤＶ４ではウィルス血症が誘発されたことに注目しなければならない。
他の２つの実験ではＶＤＶ２のみか、他のセロタイプと一緒に投与した。
最初の実験（４価の研究；各セロタイプ5-log）ではＶＤＶ２およびＶＤＶ1ではウィルス血症は検出されなかったが、ＶＤＶ３およびＶＤＶ４では高いウィルス血症レベルが検出された。
第２の実験ではＶＤＶ２継代１１を単独投与するか、ＶＤＶ1を含む４価の組合せを投与した。単独投与の場合にはＶＤＶ２継代１１が４匹のサルの中の１匹に低いウィルス血症（ピーク40）を誘発したが、残りの３匹はネガティブであった。４価調合物中にある場合には、例えＶＤＶ２を４-logで投与し、ＶＤＶ３およびＶＤＶ４を2-logで投与したとしても、ＶＤＶ２はウィルス血症を誘発しないか、ＶＤＶ３およびＶＤＶ４より劇的に低いウィルス血症しか誘発しない。このことは、ウィルス血症に関する限り、ＶＤＶ２の方がより高い安全性を示すことを意味している。従って、一価ＶＤＶ２はサルで定義された成功基準を満たした。

4.2 ＶＤＶ２の毒性
4.2.1 サルでの神経毒性試験
このテストの目的は、Sanofi Pasteurによって生じられる弱毒化された2つのデング熱ウィルス結晶核のサル（ph. Eur. 2.6.18）の神経向性の特性の不足を示すことであった。
モーリシャスからの10のカニクイザルは、大脳内のルート（各半球の視床の107の10のCCID50/）によって、ＶＤＶ２継代9を接種された。
テストの終わりに、サルは犠牲にされて、formaline溶液については注がれた。
組織サンプルは、各サル（延髄、橋、そして、左および右を含む視床が分ける小脳（中脳）（大脳皮質の左および右））の脳から取り出された。
セクションは、8マイクロメートルの厚さで切断されて、エオシンおよびgallocyaninによってしみがついた。
病原性のhistopathologicalなしるしは、セロタイプ２つの主要なウィルス結晶核については注入されるサル脳味噌において観察されなかった。

4.2.2 28-Dav Observation PeriodによるＶＤＶ２ Followedの1つのSubcutaneous内閣の後のCvnomolgus MonkeyのGLP Toxicity Study
このGLP研究の目的は、ＶＤＶ２継代9および他のデングワクチン候補者間の相互作用を査定することであった。
研究の第1の階段は、ＶＤＶ２の安全性および免疫原性をもう一人のワクチン候補者の投与の前に査定することであった。
ＶＤＶ２（約104のCCID50ペル投与量）の1つのヒトの投与量が、皮下に投与された‖デイ・カニクイザル（4つの雄および4つの雌）に0。
2つの雄および2つの雌の対照群は、車両（4％o NaCI）を受信した。
死亡率、臨床の条件、肉塊重量および食品消費量は、研究の全体にわたってモニターされた。
肉塊温度は、かつての予備試験（各投与の、そして、2日の間の後に日から毎日の）を持っていかれた。
血液サンプルは、決定が一回予備試験する臨床の実験室のために、そして、Days 8および27にとられた。

臨床のしるし、肉塊重量、食品消費量、皮膚の反応、肉塊温度、血液学、臨床化学または器官重量上の効果がなかった。
死亡は、研究の間、報告されなかった。
結論としてカニクイザルへのＶＤＶ２の皮下の投与｛オナガザル科）テストで線量が逆にサルのそばに中で査定されるように健康体に影響を及ぼさなかったこと-生命臨床の目視観測、そして、臨床病理学。

実施例５
中で一価ＶＤＶ２の安全性健康な（40年へのFLAVIVIRUS-無邪気な成体老人たち18）
この位相1つの試みの目的は、安全性、ウィルス血症および一価のＶＤＶ２継代11の免疫原性プロフィルをflavivirus-naiveな成体のStamarilR（対照群として使われる）と比較される104のCCID50のウィルス濃度で文書化することである。
6および12ヵ月での再調査については、シングルの噴射は、与えられる。
安全性予防措置のために、連続した含有物は、研究において実行される。
登録およびワクチン接種は、それゆえによろめかされる；
第1の一隊（基（全n=12）につきn=4）が、予防注射をされた。
安全性データが、集まった‖デイ28が、Independent Data Monitoring Committee (IDMC)によって、そして、Royal Adelaide Hospital Investigational Drugs Subcommittee (IDSCによってチェックされた）残留する被検者（n=8per基（全n=16））のワクチン接種を続行することを決めることの前に試み下絵の略図は、図6において提供される。

ワクチンの投与の後、忍耐強いアールは、多様な臨床の検査および検定に規則正しく服従した。
このフォローアップの概要は、表13において下で与えられる。
記載された個体群が、18〜40年歳の成体から成る‖（すなわち日、の
第41の誕生日の前の日まで第18の誕生日）フラビウイルス-naである含有物の日上の？ve [フラビウイルス病気（例えば黄熱、日本の脳炎、デング熱発熱）に対して、ワクチン接種を提示している人；
またはフラビウイルス感染（確立された臨床上、serologicallyにmicrobiologicallyに）または前の滞留の高いデング熱感染風土性を有する生立または面積への行程（全然持続）、または少なくとも2週間間のノースクイーンズランドへの滞留または行程）排除した]

試験した製品は以下の通り：
評価したワクチンは、小ビン中に凍結乾燥された製品を別に提供された希釈剤をその場で再構成した：
活性成分： 0.5me投与量当り一価のベロデング熱ウィルス・セロタイプ２（ＶＤＶ２継代11）を４±0.5-log10 CCID_5O；
希釈剤：ワクチン再結合用無菌NaCl 4％₀溶液。
再構成されたワクチン、すなわち、一価ＶＤＶ２のNaCl 4％o溶液の0.5mlは直ちに使用するか、使用するまで、＋２℃および＋８℃に維持しなければならないワクチン接種の後、0.5mLのワクチン投与量を皮下ルートで三角筋領域に投与した。

参照ワクチンのスタマリル（Stamaril、登録商標）はAventis Pasteurが製造した黄熱病ワクチンである。このスタマリル（Stamaril、登録商標）は鳥類白血病ウイルスを含まない安定化された凍結乾燥製品として提供され、使用の直前に希釈剤を用いて再構成した（活性成分：生きた弱毒化黄熱ウィルス（17D株）：≧1,000ハツカネズミLethal Dose 50％（LD₅₀）/希釈剤：殺菌NaCI 4％o溶液）。この参照ワクチンは皮下ルートで三角筋領域に投与した。

ワクチン接種に関連する臨床上重大な遺伝的症候群を示した被検体は無かった。1つの被検体は一過性の発熱（＜38℃）を示した。1つの被検体は局所反応（硬化）を示した。ワクチン接種に関連した重大な悪影響は無かった。全ての被検体はワクチン接種後の28日目にデング熱２に対して応答した（力価は1888〜6393の間）

参照文献
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ＶＤＶ２シードの経歴概要。 「直ちに使用可能な」投与物のフィルド−製品（Filled Product、一価）を得るために本発明で開発した製造プロセスを要約する流れ図。 ＶＤＶ２ゲノム地図を図で表したもので、上側矢印はポリタンパクコード配列、下側矢印は成熟ペプチドコード配列を示し、垂直棒は野生型デング熱２株16681とＬＡＶ２株との間のヌクレオチドの変化を象徴的に示し、星はＬＡＶ２とＶＤＶ２との間のヌクレオチドの変化を示す。 デング-１ウィルスＬＡＶ２、ＶＤＶ２および株16681を37℃で７日間培養した後のプラーク寸法分析を示す図。 デング熱−２ウィルスＬＡＶ２、ＶＤＶ２および株16681をプラーク寸法分布を示す解析グラフィック。 健康なフラビウイルス-ナイーブな成人のＶＤＶ２一価の安全性アセスメントのための試験法の概要。

Claims (13)

1. 配列番号３８の少なくとも７３６、１６１９、４７２３、５０６２、９１９１、１００６３および１０５０７の位置のヌクレオチドが突然変異し、５７、５２４、２０５５、２５７９、４０１８、５５４７、６５９９および８５７１のヌクレオチドは突然変異していない、生きた弱毒化デング熱−２ウィルス株。
2. 少なくとも一つのヌクレオチドが１６３８、２５２０、９２２２および１０３６１から成る群の中から選択される位置でさらに突然変異している請求項１に記載のデング熱−２ウィルス株。
3. 配列番号３８の７３６がＧ＞Ｃ、１６１９がＧ＞Ａ、１６３８がＡ＞Ｇ、２５２０がＧ＞Ａ、４７２３がＴ＞Ａ、５０６２がＧ＞Ｃ、９１９１がＧ＞Ａ、９２２２がＡ＞Ｇ、１００６３がＴ＞Ａ、１０５０７がＡ＞Ｇの突然変異をしている請求項１または２に記載のデング熱−２ウィルス株。
4. 所定コードン位置で一つまたは複数のヌクレオチドが置換され、しかも、その位置でコードされるアミノ酸には変化がない、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデング熱−２ウィルス株。
5. 配列番号１を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載のデング熱−２ウィルス。
6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の生きた弱毒化されたデング熱−２ウィルス株を薬学的に許容される担体中に含む免疫原性組成物。
7. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の生きた弱毒化されたデング熱−２ウィルス株を薬学的に許容される担体中に含むワクチン組成物。
8. 単価ワクチン組成物である請求項７に記載のワクチン組成物。
9. 多価のデング熱ワクチン組成物である請求項７に記載のワクチン組成物。
10. 配列番号３９を有する生きた弱毒化したデング熱−１ウィルス株を含む請求項９に記載のワクチン組成物。
11. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の生きた弱毒化されたデング熱−２ウィルス株を１０〜１０⁵ＣＣＩＤ₅₀含む請求項７〜１０のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
12. ＤＮＡ塩基の配列番号１またはその等価なＲＮＡ配列を有する単離された核酸。
13. Ｍタンパクの位置９に少なくとも一つのアルギニン、および／または、Ｅタンパクの位置２２８にグルタミン酸、および／または、ＮＳ３タンパクの位置６９にスレオニン、および／または、ＮＳ３タンパクの位置１８１にヒスチジン、および／または、ＮＳ５タンパクの位置５４１にリシン、および／または、ＮＳ５タンパクの位置８３２にスレオニンを有する配列番号１によってコードされる単離されたポリタンパク。

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