JP5006196B2 - 経皮または経粘膜投与のためのアジュバントおよび製剤 - Google Patents

Description

本発明は、安全かつ効率的な皮膚免疫活性増強のためのアジュバントおよび主として経皮または経粘膜投与のための医薬製剤に関する。

皮膚は、最外層の角質層、表皮、真皮、および皮下組織結合組織からなり、通常、死細胞層および脂質二重層からなる角質層は、多くの物質に対して強力なバリア機能を示す。表皮層には、ランゲルハンス細胞と呼ばれる抗原提示細胞が存在し、免疫機能を担っている。粘膜もまた、口腔、鼻腔、呼吸器、消化器、生殖器を被う、外部環境との境界であり、皮膚の最外層の角質層がないことを除いては皮膚と同じ構造である。粘膜は、食物摂取、呼吸などを通して種々の異物と接しており、例えば病原微生物にとっては宿主体内へ侵入する主要な経路となっている。そのために、粘膜における免疫防御機構もまた生命バリアとして重要である。

ランゲルハンス細胞は、皮膚内に侵入したタンパク質抗原を捕捉し、内部で分解し、ＭＨＣ分子上にペプチド断片を表出する。ＭＨＣ−ペプチド複合体は、輸入リンパ管から所属リンパ節の皮質下層へと移動し、Ｔ細胞と指状突起細胞とを介して接触する。ランゲルハンス細胞が、このように移動することによって、抗原が皮膚からリンパ節内に存在するＴ_Ｈ細胞へと効率よく伝えられる。ランゲルハンス細胞は、抗原をＴ_Ｈ細胞へ提示するために必要なＭＨＣクラスＩＩ分子を豊富に有している。

アジュバントは、免疫原性を高める物質であり、抗原と共に投与された場合、その抗原に対する応答が増強する。ワクチン接種においては、アジュバントはワクチン用量および投与回数を低減させる点で有用である。これまでに、アジュバントに関する多くの研究がなされており、いくつかの例としてアルミニウム塩、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、細菌由来物質などが知られている。しかしながら、これらアジュバントの多くは、皮下あるいは筋肉内に直接投与されることが多く、かかる場合接触性過敏症、皮下小結節および肉芽腫などの組織障害を誘発する。したがって、ヒトのワクチン接種などの免疫賦活において、安全かつ効率的な投与の可能なアジュバントおよび製剤に関する要望は高い。

アジュバントとしては、弱毒化された病原体またはタンパク質サブユニット抗原を含む多数のワクチン処方物がこれまで多く開発されてきている。従来のワクチン調整物には、大抵の場合、免疫応答を強化するアジュバントを含む。例えば、デポー（Ｄｅｐｏｔ）を形成するアジュバントがよく知られている。このアジュバントは、投与された抗原を吸収／または沈降せしめ、注射位置でデポーを形成する。典型的なデポー形成アジュバントとして、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムゲルなどのアルミニウム化合物および水中油エマルジョンなどが挙げられる。

しかしながら、デポー形成アジュバントは、抗原性を高める一方で、皮下／または筋肉中に投与された場合、紅斑、接触過敏症、肉芽腫形成などの局所組織障害を惹起するため、使用面における問題がある。さらに、経皮投与においては、アルミニウム塩の吸収性の問題も生じる。このような、アジュバント自身の経皮吸収性の問題は、アジュバントとしての免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、細菌由来物質、サイトカイン類においても同様な問題を抱えている。例えば、ムラミルジペプチドは、注射の際に、流感に類似の症状の発熱性反応またはライター症候群、一般的な関節痛、さらに、時には前部ブドウ膜炎、関節炎および尿道炎を引き起こすことなどが知られている。

以上のようにこれまでのアジュバントは、皮下投与あるいは筋肉投与時に激しい局所組織障害を引き起こす場合が多かった。そこでこの局所組織障害を回避すべく経皮での投与が考えられたが、これまでのアジュバントは免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）や細菌由来物質などの巨大分子であるか、アルミニウム化合物などであり、いずれも経皮投与には不向きな化合物ばかりであった。

また、最近では透過を高める手段としてイオントフォレーシスあるいはマイクロニードルを装着した装置による外用投与形態の検討も行われているが、巨大分子の抗原に加えアジュバントが吸収性の悪いものであると、抗原とアジュバントを効率よく透過させることができないのが現状である。

例えば、特許文献１には、巨大分子抗原の皮膚細胞内への送達方法としてイオントフォレーシスが開示されているが、アジュバントについては記載されていない。

特許文献２には、微小突起アレイ、抗原性作用物質および免疫応答増強アジュバントを含有するリザーバを有する皮膚貼付剤、ならびに動物（例えばヒト）にワクチン接種するためのそれの使用方法を開示している。しかしながら、同文献に記載されているアジュバントは金属塩や巨大分子（ペプチド等）のみであって、皮膚透過性を有するアジュバントについては記載されていない。

特許文献３には、長鎖脂肪族アルコール、それらとＣ_１〜Ｃ_６アルカン酸とのエステル、または長鎖脂肪酸とアルカノールおよびポリオールとの特定のエステルが注入によって投与される低分子アジュバントとして開示されているが、経皮投与による抗原に対するそれらの免疫応答については記載されていない。

さらに、特許文献４には、抗原と親油性溶媒の混合物を投与する段階と、その投与後にランゲルハンス細胞の遊走の誘導物質を投与する段階からなる局所投与方法が開示されている。しかしながら、同文献の記載によれば、ランゲルハンス細胞の誘導を促進する物質としては、下記式で示される、ジブチルフタレート等の二価の不飽和カルボン酸エステルに限定されている。

（式中、Ｒ_３およびＲ_４は結合して環式環を形成してもよく、また、Ｒ_１およびＲ_２は独立して１〜１６個の炭素原子を含むアルキル側鎖である）。

特許文献５には、コレラ毒素または関連ＡＤＰ−リボシル化毒素をアジュバントとして含む乾燥製剤が開示されている。かかる製剤において、コレラ毒素または関連ＡＤＰ−リボシル化毒素のアジュバントが、皮膚を通過し免疫応答を誘導するとされている。一方、このようなアジュバントについては安全性に関する情報が少なく、高分子であることから皮膚に対する透過性も低いうえに、高価であるという欠点がある。
特表２００２−５３５１００号 特表２００４−５３８０４８号 特表２００４−５２６７５７号 特表２００２−５１２１８６号 特表２００１−５１７２３３号

上記のとおり、従来の注射で用いられるアジュバントには、局所組織障害などの問題がある。また、経皮吸収製剤は、注射剤と比較して簡便かつ安全性に優れているのが特徴であるが、経皮的に投与されたアジュバントの作用を効率よく示すような物質、特に低分子化合物は極めて少ない。さらに臨床の場においても、安価で安全に提供可能なアジュバントが強く望まれている。

したがって、本発明の目的は、経皮または経粘膜投与により皮膚刺激等を誘発することなく安全に投与可能であり、抗原の免疫原性を効率よく増強するための低分子アジュバントおよびその製剤を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行う中で、驚くべきことに、ある種の低分子化合物が、経皮または経粘膜投与において強い免疫増強作用を示すのみならず皮膚刺激や組織障害が回避されることを見いだし、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、脂肪族アルコール類、遊離脂肪酸類および脂肪酸誘導体から選択される少なくとも１つを含み、下記式で示されるものを含まない、経皮または経粘膜投与のためのアジュバントに関する。

（式中、Ｒ_３およびＲ_４は結合して環式環を形成してもよく、また、Ｒ_１およびＲ_２は独立して１〜１６個の炭素原子を含むアルキル側鎖である。）

また本発明は、脂肪族アルコール類の少なくとも１つが、飽和または不飽和の炭素数８〜２０の直鎖または分枝アルコールである、前記アジュバントに関する。

さらに本発明は、脂肪族アルコール類の少なくとも１つが、ラウリルアルコール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、オクチルドデカノールまたはデカノールである、前記アジュバントに関する。

さらにまた本発明は、脂肪酸誘導体の少なくとも１つが、脂肪酸エステル類である、前記アジュバントに関する。

また本発明は、脂肪酸エステル類の少なくとも１つが、１０〜２０の脂肪酸炭素数および０または１の脂肪酸不飽和度をそれぞれ有する、前記アジュバントに関する。
また本発明は、脂肪酸エステル類の少なくとも１つが、１価の脂肪酸エステルである、前記アジュバントに関する。

さらに本発明は、１価の脂肪酸エステルの少なくとも１つが、ソルビタンモノラウレート、プロピレングリコールモノラウレート、イソプロピルミリステート、ソルビタンモノオレート、モノオレイン酸グリセロール、パルミチン酸セチルまたはオレイル酸オレイルである、前記アジュバントに関する。

さらにまた本発明は、遊離脂肪酸類の少なくとも１つが、飽和または不飽和の炭素数８〜２０の直鎖または分枝脂肪酸である、前記アジュバントに関する。

また本発明は、遊離脂肪酸類の少なくとも１つがオレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、リノレン酸、ラウリン酸、ステアリン酸またはパルミチン酸である、前記アジュバントに関する。

さらに本発明は、前記いずれかのアジュバントを含む医薬製剤に関する。

さらにまた本発明は、少なくとも１種の抗原をさらに含む、前記医薬製剤に関する。
また、本発明は、経皮または経粘膜投与に用いられる前記医薬製剤に関する。

また本発明は、軟膏剤、クリーム剤、粉末剤、ゲル剤、座剤、パップ剤、パッチ製剤、ローション剤、液剤および塗布剤の少なくとも１種である、前記医薬製剤に関する。
さらに本発明は、マトリックス型または積層型のテープ製剤またはリザーバー型のパッチ製剤である、前記医薬製剤に関する。
さらに本発明は、無傷の皮膚もしくは粘膜または物理的もしくは化学的な処理を施された皮膚もしくは粘膜に適用される、前記医薬製剤に関する。
また本発明は、物理的もしくは化学的な処理が、レーザー照射、皮膚研磨、またはマイクロニードル、サーマル、超音波、電場、磁場、圧力もしくはアルカリ処理の少なくとも１つである、前記医薬製剤に関する。

さらに本発明は、皮膚研磨、マイクロニードルまたは無針注射の少なくとも１つによって適用される、前記医薬製剤に関する。
また、本発明は、マイクロニードルの針部の一部または全面に抗原および／またはアジュバントをコーティングする前記医薬製剤に関する。

さらにまた本発明は、角質層のラメラ構造変化、水和、変性、小孔形成、剥離またはバイパス形成の少なくとも１つによって適用される、前記医薬製剤に関する。

そして、本発明は、イオントフォレーシス、ソノフォレーシスまたはエレクトロポレーションの少なくとも１つによって適用される、前記医薬製剤に関する。

本発明は、経皮投与によるアジュバント活性を有することが知られていなかった脂肪族アルコール、脂肪酸および脂肪酸誘導体をアジュバントとして用いることによって、抗体の免疫原性を安全に増強するものである。本発明のアジュバントは、一般に従来のアジュバントより低分子であるため、経皮または経粘膜投与も可能なのである。

（１）本発明のアジュバントによれば、低分子アジュバントの経皮または経粘膜投与によって、抗体の免疫原性を効率的かつ安全に増強することができる。
（２）本発明のアジュバントのうち、脂肪族アルコール類の少なくとも１つが、飽和または不飽和の炭素数８〜２０の直鎖または分枝アルコールである、前記アジュバントであるものによれば、抗体の免疫原性を、より効率的かつ安全に増強することができる。
（３）本発明のアジュバントのうち、脂肪族アルコール類の少なくとも１つが、ラウリルアルコール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、オクチルドデカノールまたはデカノールであるものによれば、抗体の免疫原性を、さらにより効率的かつ安全に増強することができる。
（４）本発明のアジュバントのうち、脂肪酸誘導体の少なくとも１つが、脂肪酸エステル類であるものによれば、抗体の免疫原性を、より効率的かつ安全に増強することができる。
（５）本発明のアジュバントのうち、脂肪酸エステル類の少なくとも１つが、１０〜２０の脂肪酸炭素数および０または１の脂肪酸不飽和度をそれぞれ有する、前記アジュバントにものによれば、抗体の免疫原性を、さらにより効率的かつ安全に増強することができる。
（６）本発明のアジュバントのうち、脂肪酸エステル類の少なくとも１つが１価の脂肪酸エステルであるものによれば、抗体の免疫原性を、さらにより一層効率的かつ安全に増強することができる。
（７）本発明のアジュバントのうち、１価の脂肪酸エステルの少なくとも１つが、ソルビタンモノラウレート、プロピレングリコールモノラウレート、イソプロピルミリステート、ソルビタンモノオレート、モノオレイン酸グリセロール、パルミチン酸セチルまたはオレイル酸オレイルであるものによれば、抗体の免疫原性を、とくに効率的かつ安全に増強することができる。
（８）本発明のアジュバントのうち、遊離脂肪酸類の少なくとも１つが、飽和または不飽和の炭素数８〜２０の直鎖または分枝脂肪酸であるものによれば、抗体の免疫原性を、より効率的かつ安全に増強することができる。
（９）本発明のアジュバントのうち、遊離脂肪酸類の少なくとも１つがオレイン酸、リノール酸、γ―リノレン酸、リノレン酸、ラウリン酸、ステアリン酸またはパルミチン酸であるものによれば、抗体の免疫原性を、さらにより効率的かつ安全に増強することができる。
（１０）本発明の医薬製剤によれば、抗体の免疫原性を、より簡便に増強することができる。
（１１）本発明の医薬製剤のうち、少なくとも１種の抗原をさらに含むものによれば、抗体の免疫原性を、より簡便かつ効率的に増強することができる。
（１２）本発明の医薬製剤のうち、経皮または経粘膜投与に用いられるものによれば、抗体の免疫原性を、さらにより簡便かつ効率的に増強することができる。
（１３）本発明の医薬製剤のうち、軟膏剤、クリーム剤、粉末剤、ゲル剤、座剤、パップ剤、パッチ製剤、ローション剤、液剤および塗布剤の少なくとも１種であるものによれば、抗体の免疫原性を、さらに一層より簡便かつ効率的に増強することができる。
（１４）本発明の医薬製剤のうち、マトリックス型または積層型のテープ製剤またはリザーバー型のパッチ製剤であるものによれば、アジュバントの送達がより効率的および／または長期にわたり行われる。
（１５）本発明の医薬製剤のうち、無傷の皮膚または物理的もしくは化学的な処理を施された皮膚または粘膜に適用されるものによれば、アジュバントの送達がより迅速に行われる。
（１６）本発明の医薬製剤のうち、物理的もしくは化学的な処理が、レーザー照射、皮膚研磨、またはマイクロニードル、サーマル、超音波、電場、磁場、圧力もしくはアルカリ処理の少なくとも１つであるものによれば、アジュバントの送達が一層より迅速に行われる。
（１７）本発明の医薬製剤のうち、皮膚研磨、マイクロニードルまたは無針注射の少なくとも１つによって適用されるものによれば、前記医薬製剤の効果を増強せしめることができる。
本発明の医薬製剤のうち、マイクロニードルの針部の一部または全面に抗原および／またはアジュバントをコーティングするものによれば、さらに有用で安全性の高い、抗原に対する免疫応答を完成させることができる。
（１８）本発明の医薬製剤のうち、角質層のラメラ構造変化、水和、変性、小孔形成、剥離またはバイパス形成の少なくとも１つによって適用されるものよれば、アジュバントの経皮吸収が促進され、その効果、すなわち抗体の免疫原性の増強を、より効率的かつ安全に奏せしめることができる。
（１９）本発明の医薬製剤のうち、イオントフォレーシス、ソノフォレーシスまたはエレクトロポレーションの少なくとも１つによって適用されるものによれば、アジュバントの吸収がより効率的に行われ、その効果を、さらにより効率的かつ安全に奏せしめることができる。

以上のとおり、本発明によれば、経皮または経粘膜投与において強い免疫増強作用を有し、かつ皮膚刺激や組織障害を与えることがない安全なアジュバントが提供される。また、本発明のアジュバントおよびその製剤は、抗原と共に用いてもよく、つまりイオントフォレーシス、エレクトロポレーション、ソノフォレーシス（超音波）などのディバイスを用いる方法やマイクロカニューレ、マイクロニードルなどによる経皮または経粘膜投与においても効果的に抗原の免疫活性を高めることができる。さらに、本発明の経皮または経粘膜吸収用のアジュバントは低融点、低分子量であるため高い経皮または経粘膜吸収性を示すことから、種々の経皮吸収製剤、例えば液剤、貼付剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤等への製剤適用が可能であり、安価に提供可能である。

本発明のアジュバントに含有され得る成分の１つは、脂肪族アルコール類から選ばれるものである。このような脂肪族アルコール類においては、直鎖または分枝状の脂肪族アルコール類が好ましい。このような脂肪族アルコール類において、炭素数および分子量に特に限定はないが、皮膚透過性を考慮すると、炭素数８〜２０であることがより好ましい。また、かかる脂肪族アルコール類は、飽和または不飽和のいずれであってもよい。

そのような脂肪族アルコール類は、例えばオクチルドデカノール、ラウリルアルコール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、デカノールなどであるが、その中でもラウリルアルコール、オクチルドデカノール、イソステアリルアルコールが特に好ましく、ラウリルアルコールが最も好ましい。

本発明のアジュバントに含有され得る成分の他の１つは、脂肪酸誘導体から選ばれる。本発明において「脂肪酸誘導体」とは、脂肪酸部分を含む化合物を意味し、典型的には脂肪酸エステル、脂肪酸アミド、脂肪酸ハライド等が包含される。これらの脂肪酸誘導体のうち、脂肪酸エステルが好ましく、脂肪酸炭素数が１０〜２０、脂肪酸不飽和度が０または１である脂肪酸エステルおよび１価の脂肪酸エステルはそれぞれより好ましい。

そのような脂肪酸エステル類は、例えば、ソルビタンモノラウレート、プロピレングリコールモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、イソプロピルミリステート、ポリエチレングリコール、モノオレイン酸グリセロール、パルミチン酸セチルまたはオレイル酸オレイルの脂肪酸エステル類などであるが、特にソルビタンモノラウレートが最も好ましい。
本発明のアジュバントに含有され得る成分のさらに他の１つは、遊離脂肪酸から選ばれるものである。このような遊離脂肪酸においては、炭素数８〜２０のものが好ましい。また、かかる脂肪酸は、飽和または不飽和、直鎖または分枝のいずれであってもよい。遊離脂肪酸として好ましいのは、オレイン酸、リノール酸、γ―リノレン酸、リノレン酸、ラウリン酸、ステアリン酸またはパルミチン酸である。オレイン酸およびラウリン酸はとくに好ましい。

本発明のアジュバントは、単独あるいは組み合わせてのいずれにおいても用いることができる。とくに、アジュバント間の相乗効果がある場合には、これらを組み合わせて用いるとよい。他の場合には、アジュバントを単独で用いてもよいが、目的に応じて、組み合わせて用いてもよい。
本発明のアジュバントは、経皮または経粘膜投与により簡便に効果を奏することができる。したがって、本発明のアジュバントは、従来から用いられている経皮投与製剤に含有せしめることによって、外用形態の医薬製剤における非侵襲的体内投与が可能となる。かかる医薬製剤の形態としては、本発明のアジュバントが含まれる剤型であって、該アジュバントを経皮的に投与できる形態であれば特に限定されないところ、ハップ剤、パッチ製剤、軟膏剤、クリーム剤、液剤、ゲル剤、ローション剤などから必要に応じて選択できる。なお、本明細書においてパッチ製剤にはマトリックス型、積層型のテープ製剤およびリザーバー型のパッチ製剤が包含される。

また、かかる経皮または経粘膜投与製剤は、基剤として溶解剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、吸収促進剤、安定化剤、充填剤、増粘剤、粘着剤、湿潤剤などの任意の成分を、本発明のアジュバントとを組み合わせたものを用いることによって、常法により製造することができる。また、本発明の医薬製剤のうち、他の剤型の医薬製剤も、常法により製造することができる。

例えば、本発明の経皮または経粘膜投与製剤における基剤の成分のうち、増粘剤としては、水分を３０％〜８０％安定に保持でき、かつ保水性を有することが好ましい。この具体例としては、グァーガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、寒天、アラビアガム、トラガカントガム、カラヤガム、ペクチン、澱粉等の植物系、ザンサンガム、アカシアガム等の微生物系、ゼラチン、コラーゲン等の動物系等の天然高分子、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース系、可溶性デンプン、カルボキシメチルデンプン、ジアルデヒドデンプン等のデンプン系等の半合成高分子、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタクリレート等のビニル系、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム等のアクリル系、その他ポリエチレンオキサイド、メチルビニルエーテル／無水マイレン酸共重合体等の合成高分子等の水溶性高分子等が好適に用いられる。特に、ポリアクリル酸ナトリウムが好ましい。ゲル強度が強く、かつ保水性に優れるからである。更に、平均重合度２００００〜７００００のポリアクリル酸ナトリウムが好ましい。平均重合度が２００００より小さくなるにつれ増粘効果が乏しくなり十分なゲル強度が得られなくなる傾向が現れだし、平均重合度が７００００より大きくなるにつれ増粘効果が強すぎ作業性が低下する傾向が現れだし、いずれも好ましくない。また、前記水溶性高分子を２種類以上併用することにより、例えば、ポリアクリル酸ナトリウムの強イオン高分子と高分子コンプレックスを形成し、より一層ゲル強度の大きい弾性ゲルを得ることができる。

湿潤剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール等の多価アルコール等や、充填剤として、カオリン、酸化亜鉛、タルク、チタン、ベントナイト、珪酸アルミニウム、酸化チタン、酸化亜鉛、メタ珪酸アルミニウム、硫酸カルシウム、リン酸カルシウム等を添加してもよい。また、溶解補助剤または吸収促進剤として、炭酸プロピレン、クロタミトン、ｌ−メントール、ハッカ油、リモネン、ジイソプロピルアジペート等や、薬効補助剤として、サリチル酸メチル、サリチル酸グリコール、ｌ−メントール、チモール、ハッカ油、ノニル酸ワニリルアミド、トウガラシエキス等を添加してもよい。更に、必要に応じて、安定化剤や抗酸化剤、乳化剤、界面活性剤等を添加してもよい。

本発明において界面活性剤とは、非イオン性活性剤、イオン性活性剤（カチオン、アニオン、両性）のいずれでもよいが、安全性の面から通常医薬品基剤に用いられる非イオン性活性剤が望ましい。更に詳しくは、ショ糖脂肪酸エステルなどの糖アルコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が挙げられる。

本発明の経皮投与製剤には、その他必要に応じて、架橋剤や重合剤等を添加してもよい。膏体を強固にするとともに保水性を持たせることができる。この架橋剤や重合剤は、増粘剤等の種類に応じて適宜選択される。例えば、増粘剤にポリアクリル酸またはポリアクリル酸塩を適用した場合は、分子中に少なくとも２個のエポキシ基を有する化合物、Ｃａ、Ｍｇ、Ａｌ等の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、炭酸塩等の無機酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、ステアリン酸塩等の有機酸塩、酸化亜鉛、無水珪酸等の酸化物、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム等の水酸化物等の多価金属化合物等が好適に用いられる。また、増粘剤にポリビニルアルコールを適用した場合は、アジピン酸、チオグリコール酸、エポキシ化合物（エピクロルヒドリン）、アルデヒド類、Ｎ−メチロール化合物、Ａｌ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｓｎ、Ｖ、Ｃｕ、Ｂ、Ｃｒ等の化合物等の錯化物等が好適に用いられる。また、増粘剤にポリビニルピロリドンを適用した場合は、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸共重合体、ポリアシッド化合物またはそのアルカリ金属塩（ポリアクリル酸やタンニン酸およびその誘導体）等が好適に用いられる。また、増粘剤にポリエチレンオキサイドを適用した場合は、パーキオサイド、ポリスルホンアザイド等が好適に用いられる。

また、増粘剤にメチルビニルエーテル／無水マレイン酸共重合体を適用した場合は、多官能ヒドロキシ化合物、ポリアミン、ヨウ素、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、鉄、水銀、鉛塩等が好適に用いられる。増粘剤にゼラチンを適用した場合は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン等のアルデヒド類、グリオキサール、ブタジエンオキシド等のジエポキシド類、ジビニルケトン等のジケトン類、ジイソシアネート類等が好適に用いられる。また、増粘剤にポリアクリル酸ナトリウムを適用した場合、架橋剤として、水酸化リチウム、水酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ほう酸ナトリウム等の多価金属塩が添加されるのが好ましい。特に、亜鉛塩、アルミニウム塩が好ましい。架橋反応が促進されるからである。架橋剤として添加される多価金属塩の濃度は、増粘剤（または水溶性高分子）１当量に対し０．５〜１．５当量が好ましい。多価金属塩の濃度を０．５当量以上とすることによって、反応が促進されてゲル強度が高くなり、多価金属塩の濃度を１．５当量以下とすることによって、反応を適度な速度において行わせしめ、ゲル化を均一とし、作業性が向上するからである。

上記医薬製剤にアジュバントを含有させる場合には、その配合量は特に限定されない。アジュバント効果を発揮できる濃度のアジュバントが非侵襲的に体内へ吸収されるのに十分な配合量であればよい。したがって、本発明のアジュバントは該アジュバント単独で好適に用いられるのみならず、０．１〜９９重量％で製剤中に好ましく配合され、５〜９０重量％で配合されるのがより好ましく、特に１０〜８０重量％であるとさらに好ましい。最も好ましくは１５〜７５重量％である。

また、本発明のアジュバントは、抗原とともに体内に投与することも可能である。この場合においても、抗原が経皮投与可能であれば、アジュバントと抗原とを含有する経皮的な非侵襲性製剤とすることができる。この経皮投与製剤の形態としては、ハップ剤、パッチ製剤、軟膏剤、クリーム剤、液剤、ゲル剤、ローション剤などの経皮投与製剤を必要に応じて選択でき、抗原および低分子アジュバントが含まれる剤型で経皮から投与できる形態であれば特に限定されない。前記のとおり、本明細書においてパッチ製剤にはマトリックス型、積層型のテープ製剤およびリザーバー型のパッチ製剤が包含される。また、かかる経皮製剤も、基剤として溶解剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、吸収促進剤、安定化剤、充填剤、増粘剤、粘着剤などの任意の成分を用い、抗原および本発明のアジュバントとを組み合わせることによって、常法により製造することができる。なお、基剤には前記吸収促進剤として、アジュバントおよび／または抗原の皮膚透過性を高めるものを含むことができるが、かかる吸収促進剤を含まなくても、本発明のアジュバントは抗原の免疫原性を増強することができる。
一方、併用される抗原が十分な経皮活性を有していない場合には、本発明のアジュバントのみを経皮投与し、併用される抗原は非経皮的に投与してもよい。

上記抗原とアジュバントとの併用製剤における抗原とアジュバントの配合量は、抗原とアジュバントの組み合わせによって適宜決定することができる。また、かかる製剤中におけるアジュバントの含量もとくに限定されることはなく、経皮経路により十分な抗原免疫応答を誘起せしめる量であればよい。したがって、抗原とアジュバントとの併用製剤中において、本発明のアジュバントは０．１〜９９重量％で好ましく配合され、５〜９０重量％で配合されるのがより好ましく、とくに１０〜８０重量％であるとさらに好ましい。最も好ましい製剤中におけるアジュバントの含量は１５〜７５重量％である。

ここで用いられる抗原は、特に限定されず、ポリヌクレオチド（ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン）、タンパク質ベースのワクチンなどが挙げられる。具体的には、タンパク質、多糖、オリゴ糖、リポタンパク質、弱毒化もしくは殺された、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、風疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹のようなウイルス、弱毒化もしくは殺された、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、グループＡ連鎖球菌属、レジオネラ・ニューモフィラ菌、髄膜炎菌、緑膿菌、肺炎連鎖球菌、梅毒トレポネーマおよびコレラ菌のような細菌、ならびにそれらの混合物の形態の抗原が包含される。抗原性作用物質を含有する、多数の商業的に入手可能なワクチンもまた、本発明において用いることができる。そして、インフルエンザワクチン、ライム病ワクチン、狂犬病ワクチン、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、水痘ワクチン、天然痘ワクチン、肝炎ワクチン、百日咳ワクチンおよびジフテリアワクチン、さらには、癌、動脈硬化、神経疾患、アルツハイマー等のワクチン療法で使用される抗原も包含される。また、この抗原は、抗原性（感作性）を有するアレルゲン物質であってもよく、多種多様な金属、化学物質がそれにあたる。例えば、アトピー性皮膚炎の抗原を明らかにするアレルギー検査および治療の場合は、ホコリ、不活化ダニ等のハウスダスト、各種の花粉などが使用されてもよい。また、Ｔ細胞性介在性の自己免疫疾患または症状に関連する炎症性Ｔ細胞により認識される抗原も包含される。

これらの抗原の投与経路は特に限定されないが、経口、注射（筋肉内、皮下、皮内）による投与方法や経粘膜、経皮投与が挙げられる。経皮投与の場合は、抗原の皮膚透過性と必要な投与量に応じた経皮投与手段が選択される。

本発明のアジュバントを上記抗原と同一手段または異なる経皮投与手段で投与することによって、皮膚のランゲルハンス細胞が活性化され、皮膚からリンパ節内に存在するＴ_Ｈ細胞へと効率よく伝えられることにより高い免疫応答が完成される。このことにより、外用医薬品、化粧品あるいはアレルゲン物質の抗原性の簡便な評価や、感染症、癌、アレルギー等の、ワクチンによる予防または治療、Ｔ細胞性介在性の自己免疫疾患の治療などが可能となる。

本発明のアジュバント製剤またはアジュバントと抗原とを同時に含む製剤は、さらに経皮的な吸収性を上げることを目的として、皮膚の研磨処理後の塗布、或いはイオントフォレーシス、エレクトロポレーション、ソノフォレーシス（超音波）などのデバイスを用いる方法、マイクロカニューレ、マイクロニードルなどを装着した装置による経皮投与形態を取ることによって、さらに有用で安全性の高い、抗原に対する免疫応答を完成させることができる。また、上記投与形態は特に限定されず、抗原の皮膚透過性や必要とされる投与量に応じて最適な投与手段を選択することができる。

好ましくは、マイクロニードルの針部の一部または全面に抗原および／またはアジュバントを担体とともにコーティングする方法である。この場合、アジュバントは必ずしもコーティングする必要はなく、事前に皮膚に塗布しておくことも可能である。
例えば、マイクロニードルの針部へのコーティングの記載は、特表２００４−５０４１２０号公報、特表２００４−５２８９００号公報、ＷＯ２００５／０１６４４０などにある。

実施例１
雄性７〜８ＷのＢａｌｂ／Ｃマウスの腹部を剃毛し、候補アジュバントのアセトン溶液（５０％）を５０ｕＬ経皮投与した。一方、抗原ハプテン併用群はＦＩＴＣ溶液（５ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ａｃｅｔｏｎｅ）とアジュバント溶液の１：１混合液を腹部に５０ｕＬを経皮投与した。５日後にリンパ節（頸部、鼠頸）を摘出し、リンパ細胞のＭＨＣ ＣｌａｓｓＩＩ分子の発現強度についてフローサイトメトリーで解析した（図１）。

図１に示すとおり、遊離脂肪酸（オレイン酸）、脂肪酸エステル類（ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート）および脂肪族アルコール類（ラウリルアルコール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール）の低分子アジュバントの経皮投与において著しいリンパ細胞数の増加が認められた。すなわち、低分子遊離脂肪酸類、脂肪酸エステル類および脂肪族アルコール類が、経皮投与において、高いアジュバント効果を有することが確認された。特にラウリルアルコールのアジュバント効果が最も顕著であった。

実施例２
雄性７〜８ＷのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部を剃毛し、候補アジュバント（原液）を２５ｕＬ皮内投与した郡と、アセトン溶液（５０％）を５０ｕＬ経皮投与した群の皮膚刺激の程度をスコアで評価した（表１）。

表１に示すとおり、脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノラウレート、ソルビタンモノラウレート）および脂肪族アルコール類（ラウリルアルコール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコール、オクチルドデカノール）のそれぞれの低分子アジュバントの経皮投与は、皮膚刺激がなく、皮内投与に比べて皮膚刺激が極めて小さいことが確認された。

実施例３
雄性７〜８ＷのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部を剃毛し、動物を無処置群、抗原皮内投与群に分けた。ＯＶＡを１０ｕｇ／ｈｅａｄになるように生理食塩液に溶解させて調整し、ＯＶＡ単独群はＯＶＡ水溶液を２５ｕＬ皮内投与した。各種アジュバント併用群はＯＶＡ溶液を皮内投与後、直ちにアジュバント溶液２５ｕＬを腹部皮膚表面に経皮投与（塗布）した。投与は０、２、４Ｗに行ない、採血は２、４、５Ｗに行い、２、４、５Ｗ 後のＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡにて測定した。結果は５Ｗのデータを表２に示す。

表２に示すとおり、抗原Ｏｖａｌｂｕｍｉｎの皮内投与、もしくは各種アジュバントの無傷皮膚への経皮投与を併用し、抗原特異的ＩｇＧ変化を調査したところ、いずれのアジュバント候補剤においても高い抗原ＩｇＧの免疫応答が確認された。最も高い免疫応答を示したのは、ラウリルアルコール、オレイルアルコールの併用投与群であった。これらの結果から、脂肪族アルコール類が、抗原の経皮吸収性を高めるだけでなく、アジュバントとしての免疫賦活作用を有することが確認された。

実施例４
雄性７〜８ＷのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部を剃毛し、動物を無処置群、マイクロニードル、皮膚研磨前処理群、イオントフォレーシス適用群に分けた。ＯＶＡ（抗原Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）を１００ｕｇ／ｈｅａｄになるように調整し、ＯＶＡ単独群はＯＶＡ水溶液を適用し、ラウリルアルコール（ＬＡ）併用群はＯＶＡ溶液とＬＡとＴｗｅｅｎ２０（乳化剤）を１：１：０．０１の比率で混合しエマルジョン化した溶液を調整した。マイクロニードル適用群においては、１ｃｍ^２のマイクロニードル（針長約２００ｕｍ、 ４００本／ｃｍ^２）を予め剃毛した腹部皮膚に穿刺した後、直ちに上述したエマルジョン溶液を５０ｕＬ塗布した。また、皮膚研磨処理群は、マイクロニードルの代わりに３Ｍ ＲＥＤ Ｄｏｔ^ＴＭ ２２３６を用いて皮膚を５回擦過した後、エマルジョン溶液を５０ｕＬ塗布した後、エマルジョン溶液を５０ｕＬ塗布した。イオントフォレーシス適用群は、剃毛腹部皮膚にエマルジョン溶液を５０ｕＬ塗布した後、塗布部位に生理食塩液を不織布に含浸させたイオントフォレーシス製剤（不織布製剤：Ａｇ、Ａｇ／ＡｇＣｌ １ｃｍ^２）を貼付し、直流電流（０．４ｍＡ／ｐａｔｃｈ）を１時間印加した。投与は０、２、４Ｗに行い、採血は２、４、５Ｗに行い、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡにて測定した。結果は４Ｗのデータを図２に示す。

図２に示すとおり、抗原Ｏｖａｌｂｕｍｉｎおよび／またはラウリルアルコールを含有する製剤のＩＰ（イオントフォレーシス）、ＭＮ（マイクロニードル）、Ｓｋｉｎ Ｐｒｅｐ（皮膚研磨前処理）の経皮投与による抗原特異的ＩｇＧ変化（４Ｗ）を見たところ、いずれの経皮投与形態においても高い抗原ＩｇＧの免疫応答が確認された。最も高い免疫応答を示したのは、イオントフォレーシスによる投与であった。ラウリルアルコールを併用した場合には、抗体価の有意な増大が認められた。

実施例５
雄性７〜８Ｗのへアレスラットの腹部にＯＶＡを２ｍｇ／patchになるように調整し、マイクロニードル群は抗原と５％ポリビニルアルコール液をマイクロニードルの針部にコーティングし、生理食塩水を皮膚側に滴下し２時間穿刺した。また、マイクロニードル＋ラウリルアルコール群は、事前にＬＡを塗布し、生理食塩水を皮膚側に滴下し前記抗原と５％ポリビニルアルコール液をマイクロニードルの針にコーティングしたものを２時間穿刺した。投与は０、２、４Ｗに行い、採血は２、４、５Ｗに行い、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡにて測定した。結果を図３に示す。

図３に示すとおり、抗原コーティングを穿刺した場合は抗体価が上昇しなかったが、ＬＡを塗布した場合には顕著に上昇した。したがって、抗原コーティングしたマイクロニードルにおいて、ＬＡを併用することでの有用性が確認された。

実施例６
雄性７〜８Ｗのへアレスラットの腹部にＯＶＡを２ｍｇ／patchになるように調整し、マイクロニードル（ＯＶＡ＋５％ポリビニルアルコール）群は抗原と５％ポリビニルアルコール液をマイクロニードルの針部にコーティング［抗原溶液：１０％ポリビニルアルコール＝１：１で混合］し、２時間穿刺した。また、マイクロニードル（ＯＶＡ＋オリーブ油）または（ＯＶＡ＋ラウリルアルコール）群は、エマルジョン［抗原溶液：オリーブ油またはラウリルアルコール：界面活性剤（Tween８０）＝１：１：０．０１］をマイクロニードルの針にコーティングし、２時間穿刺した。投与は０、２、４Ｗに行い、採血は２、４、５Ｗに行い、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡにて測定した。結果を図４に示す。

図４に示すとおり、抗原単独もしくは抗原＋オリーブ油(OLV)でエマルジョンコートしたマイクロニードルを穿刺した場合は抗体価の上昇がみられなかったがラウリルアルコールを用いコートしたマイクロニードルでは顕著に上昇した。したがって、抗原＋ラウリルアルコールのエマルジョンンをマイクロニードルにコーティングすることでの有用性が確認された。

実施例７
雄性７〜８ＷのＢＡＬＢ／ｃ マウスの腹部を剃毛し、ＯＶＡを０．１ｍｇ／patchになるように調整し、マイクロニードル（ＯＶＡ）群は抗原と５％ポリビニルアルコール液をマイクロニードルの針にコーティング［抗原溶液：１０％ポリビニルアルコール＝１：１で混合］し、２時間穿刺した。また、マイクロニードル（ＯＶＡ＋ラウリルアルコールまたはオレイルアルコール）群は、エマルジョン［抗原溶液：オリーブ油またはラウリルアルコール：界面活性剤（Tween８０）＝１：１：０．０１］をマイクロニードルの針にコーティングし、２時間穿刺した。投与は０、２、４Ｗに行い、採血は２、４、５Ｗに行い、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡにて測定した。結果を図５に示す。

図５に示すとおり、抗原のみコーティングしたマイクロニードルは、顕著な抗体価の上昇はみられなかったが、抗原＋ラウリルアルコールもしくはオレイルアルコールでエマルジョンコートしたマイクロニードルを穿刺した場合は顕著に抗体価が上昇した。したがって、抗原＋ラウリルアルコールまたはオレイルアルコールのエマルジョンをマイクロニードルにコーティングすることでの有用性が確認された。

実施例８
雄性７〜８ＷのＢＡＬＢ／ｃ マウスを吸入麻酔（セボフレン）下で呼吸に合わせて抗原５０μＬ（インフルエンザＨ３Ｎ２：１μｇ／ｈｅａｄ）を鼻に滴下投与した。抗原+ＬＡは、［抗原溶液：ＬＡ：界面活性剤（Tween８０）＝９：１：０．０５で混合］を鼻に滴下投与した。
また、皮内投与群はネンブタール麻酔下で腹部を剃毛し、抗原５０μＬ（インフルエンザＨ３Ｎ２：０．０７μｇ／ｈｅａｄ）を皮内投与した。抗原＋ＬＡは、［抗原溶液：ＬＡ：界面活性剤（Tween８０）＝１：１：０．０１で混合］を皮内投与した。初回投与より２，４週間後に同条件でブースト、２，４，５週間後に眼底採血し、抗体価を測定した。結果を図６に示す。

経鼻から抗原とＬＡのエマルジョンを投与した場合、抗原単独に比べ抗体価の上昇がみられた。皮内投与の場合はこれまで同様にＬＡによるアジュバント効果がみられた。

実施例９ 口腔粘膜投与におけるLAアジュバントの効果確認(マウス)
雄性７〜８ＷのＢＡＬＢ／ｃマウスの口腔に２５ｕＬずつ２回投与した（ＯＶＡ２５００ｕｇ／ｈｅａｄ。結果を示す図７において、「０」はｎ＝４、投与量５０ｕＬ[抗原溶液]、「２０」はｎ＝２、投与量５０ｕＬ [抗原溶液：ＬＡ：界面活性剤(Tween８０)＝８：２：０．０５で混合]、「５０」はｎ＝４、投与量５０ｕＬ [抗原溶液：ＬＡ：界面活性剤(Tween８０)＝５：５：０．０５で混合]の各処理群をそれぞれ示す）。初回投与より1週間後にブーストし、2週間後に眼底採血し抗体価を測定した（図７中の−は、各処理群において得られた抗体価の平均値を示す）。

（結果）
口腔粘膜から抗原単独もしくはＬＡ濃度を変えた２種のエマルジョンを投与した場合、抗原単独群（０）では抗体価の上昇はみられなかったが、ＬＡ併用群（（２０）および（５０））においてはＬＡ濃度に依存して抗体価の上昇が確認された（図７）。なお、本実施例において抗原、ＬＡ、界面活性剤の一部は消化管粘膜おもに腸管粘膜から吸収されて効果を示しているものと考えられる。

以上のように、本発明によれば、安全かつ効率的な皮膚免疫活性増強のための脂肪酸誘導体あるいは脂肪族アルコールから選ばれる低分子アジュバントおよび経皮投与製剤が提供される。すなわち、本発明のアジュバントおよび製剤は、そのまま経皮投与等するか、あるいは皮膚研磨処理後の塗布、あるいはイオントフォレーシス、マイクロニードル等を用いて経皮投与することによって、外用医薬品、化粧品あるいはアレルゲン物質の評価、感染症、癌、動脈硬化症、アルツハイマー病等の脳神経疾患、アレルギー等のワクチン治療等に幅広く利用される。また、本発明は、Ｔ細胞介在性の疾患のための治療用の抗炎症性免疫調節物質としても利用される。したがって、本発明は、医薬産業およびその関連産業の発展に寄与するところ大である。

ＭＨＣ−ＣｌａｓｓＩＩ分子の発現強度に対する本発明のアジュバントの効果を示す図である。 抗原Ｏｖａｌｂｕｍｉｎの抗原特異的ＩｇＧ変化（４Ｗ）に対する本発明のアジュバント製剤（ラウリルアルコール含有）の効果を、ＩＰ（イオントフォレーシス）、ＭＮ（マイクロニードル）、Ｓｋｉｎ Ｐｒｅｐ（皮膚研磨前処理）において示す図である。

抗原コーティングしたマイクロニードルにおいて、ＬＡを併用することによる、本発明のアジュバントの効果を示す図である。 抗原＋ラウリルアルコールのエマルジョンンをマイクロニードルにコーティングすることによる、本発明のアジュバントの効果を示す図である。 抗原＋ラウリルアルコールまたはオレイルアルコールのエマルジョンをマイクロニードルにコーティングすることによる、本発明のアジュバントの効果を示す図である。 経鼻投与による、本発明のアジュバントの効果を示す図である。 口腔粘膜投与による、本発明のアジュバントの効果を示す図である。

Claims (7)

1. 抗原の免疫原性を増強するためのアジュバントであって、
   脂肪族アルコール類、遊離脂肪酸類および脂肪酸誘導体から選択される少なくとも１つを含み、下記式で示されるものを含まず、
   ここで、脂肪族アルコール類の少なくとも１つが、飽和または不飽和の炭素数１２〜２０の直鎖または分枝アルコールであり、
   前記遊離脂肪酸類の少なくとも１つがオレイン酸であり、
   前記脂肪酸誘導体の少なくとも１つがソルビタンモノラウレートまたはソルビタンモノオレートである、
   経皮または経粘膜投与のためのアジュバント。
   

   

   （式中、Ｒ_３およびＲ_４は結合して環式環を形成してもよく、また、Ｒ_１およびＲ_２は独立して１〜１６個の炭素原子を含むアルキル側鎖である）。
2. 脂肪族アルコール類の少なくとも１つが、ラウリルアルコール、オレイルアルコール、イソステアリルアルコールまたはオクチルドデカノールである、請求項１に記載のアジュバント。
3. 無傷の皮膚もしくは粘膜または物理的もしくは化学的な処理を施された皮膚もしくは粘膜に適用される、請求項１または２に記載のアジュバント。
4. 物理的もしくは化学的な処理が、レーザー照射、皮膚研磨、またはマイクロニードル、サーマル、超音波、電場、磁場、圧力もしくはアルカリ処理の少なくとも１つである、請求項３に記載のアジュバント。
5. 皮膚研磨、マイクロニードルまたはマイクロカニューレの少なくとも１つによって適用される、請求項１〜４のいずれかに記載のアジュバント。
6. 角質層のラメラ構造変化、水和、変性、小孔形成、剥離またはバイパス形成の少なくとも１つによって適用される、請求項１〜４のいずれかに記載のアジュバント。
7. イオントフォレーシス、ソノフォレーシスまたはエレクトロポレーションの少なくとも１つによって適用される、請求項６に記載のアジュバント。

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