JP4783731B2 - ピリミドチオフェン化合物 - Google Patents

Description

本発明は、HSP90阻害活性を有する置換された2環式チエノ[2,3-d]ピリミジン（ここで、「ピリミドチオフェン」と呼ばれる）、癌のようなHSP90活性の阻害に応答する疾病に関連した医薬での該化合物の使用、および該化合物を含む医薬組成物に関する。

発明の背景
分子シャペロンは、蛋白質の適切な折り畳みや立体構造を維持し、蛋白質の合成と分解のバランスの調節に非常に重要である。それらは、細胞増殖やアポトーシスのような多くの重要な細胞機能の調節に重要であることが示されている(JollyおよびMorimoto、2000; Smithら、1998; Smith、2001)。

熱ショック蛋白質(HSPs)
細胞が、熱ショック、アルコール、重金属および酸化ストレスを含む多くの環境ストレスに曝されると、熱ショック蛋白質(HSPs)として一般に知られている多くのシャペロンが、細胞に蓄積する。HSPsの誘導は、初期ストレス傷害から細胞を保護し、再生を高め、そしてストレス耐性状態の維持に導く。しかしながら、ある種のHSPsは、正常な、ストレスのない状態のもとで、重要な細胞蛋白質の増殖の一覧(list)である、正確な折り畳み、分解、局在そして機能を調節することにより、主要な分子シャペロンの役割を果たすことも明らかとなっている。

細胞の発現、機能および局在の点で異なっている個々の遺伝子産物をもった多くのHSPs多重遺伝子の一群が存在する。それらは、分子量により、例えば、HSP70、HSP90およびHSP27のように分類される。

ヒトのいくつかの疾病は、蛋白質の間違った折り畳みの結果からもたらされ得る(Tytellら、2001に概説; Smithら、1998)。それゆえに、分子シャペロン機構を混乱させる治療の展開が有益であることを立証するかもしれない。ある容態（例えば、アルツハイマー病、プリオン病およびハンチントン病）において、間違って折り畳まれた蛋白質が、神経変性疾患をもたらす蛋白質凝集の原因となり得る。そのうえ、間違って折り畳まれた蛋白質は、野生型蛋白質の機能の損失をもたらし、細胞内で分子および生理的な機能の非調節に導き得る。

HSPsは癌にも関係している。例えば、腫瘍の進行段階に関係のあるHSPsによる分化発現の証拠がある(Martinら、2000; Conroyら、1996; Kawanishiら、1999; Jameelら、1992; Hoangら、2000; Lebeauら、1991)。種々の重大な腫瘍形成経路でのHSP90の関与、および抗癌活性を有するある種の天然物が、この分子シャペロンを標的にしていることの発見の結果から、HSPの機能を阻害すれば、癌治療に役立つかもしれないとの魅力的で新しい概念が、展開されてきた。最初の分子シャペロン阻害剤が、現在、臨床試験中である。

HSP90
HSP90は、全細胞蛋白質の約1〜2％を構成しており、通常は、細胞中で、他の多くの蛋白質の一つと結合して２量体として存在している(例えば、Pratt、1997参照)。それは、細胞生存のために必須のものであり、二相のシャペロン機能を示す(Youngら、2001)。それは、種々の環境ストレス、例えば熱ショックによって本来の立体構造が変化させられた後に多くの蛋白質と相互作用すること、適切な蛋白質の折り畳みを保証すること、および非特異的な凝集を防ぐことによって、細胞のストレス応答において重要な役割を果たす(S
mithら、1998)。さらに、最近の結果は、HSP90は、多分、突然変異蛋白質の不適当な折り畳みを修正することにより、突然変異の影響を緩和する役割も果たすことを示唆している(RutherfordおよびLindquist、1998)。

しかしながら、HSP90は、重要な調節の役割も有している。正常な生理的状態下、HSP90は、その小胞体ホモローグのGRP94と一緒に、細胞内でハウスキーピングの役割も果たしており、いくつかの重要なクライエント蛋白質の安定な立体構造および成熟（maturation）を維持する。これらは、３グループ：(a)ステロイドホルモン受容体、(b)Ser/Thrまたはチロシン・キナーゼ（例えば、ERBB2、RAF-1、CDK4およびLCK）および(c)例えば変種p53およびテロメラーゼhTERTの触媒サブユニットのような明らかに無関連の蛋白質の集団に細分化できる。これら全ての蛋白質は、細胞内の多くの生理学的および生化学的工程で、重要な調節の役割を果たしている。新規なHSP90クライエント蛋白質が、絶えず同定されている。

ヒトにおいて、多く貯蔵されているHSP90ファミリーは、４つの遺伝子、すなわち、サイトソルHSP90αおよびHSP90β同種体（isoform）（Hickeyら、1989）、小胞体中のGRP94（Argonら、1999）およびミトコンドリア基質中のHSP75/TRAP1（Feltsら、2000）からなる。それらのファミリー全ては、同じような作用形態を有するが、細胞内での局在により、異なったクライエント蛋白質と結合すると考えられる。例えば、ERBB2は、GRP94の特異的なクライエント蛋白質であることが知られており（Argonら、1999）、そしてタイプ1腫瘍壊死因子受容体（TNFR1）およびRBは両方ともTRAP1のクライエントであることが示されている（Songら、1995；Chenら、1996）。

HSP90は、クライエント蛋白質と調節蛋白質の間での一連の複合相互作用に関与している（Smithら、2001）。正確な分子についての詳細な解明は残っているが、最近数年間に行われた生化学的およびＸ-線結晶学的研究は、HSP90のシャペロン機能にますます詳細な洞察を与えた。

この問題に関する以前の議論に次いで、HSP90は、ATP加水分解に必須であるヌクレオチド結合ドメインの２量体の状態にあるATP-依存性分子シャペロンであり（Prodromouら、1997）、そして今度はこれがシャペロン機能に必須である（Prodromouら、2000a）ことが、今明らかになっている。ATPとの結合は、N末端ドメイン同士を、互いにより近づけて接触しやすい状態にし、そして「かすがい機構（clamp mechanism）」として知られている立体構造の切替えをもたらすドーナツ状の２量体構造の形成をもたらす（ProdromouおよびPearl、2000b）。

公知のHSP90阻害剤
最初に発見されたHSP90阻害剤のクラスは、ベンゾキノン アンサマイシン クラスで、それは、ハービマイシンＡおよびゲルダナマイシンを含んでいる。それらにより、v-Src癌遺伝子で形質転換された繊維芽細胞の悪性の遺伝表現型が逆転することが示され（Ueharaら、1985）、次いで、インビトロ（Schulteら、1998）そしてインビボの動物モデル（Supkoら、1995）の両方で、強力な抗腫瘍活性を有することが示された。

免疫沈降およびアフィニティー・マトリックスの研究により、ゲルダナマイシンの主作用機構は、HSP90との結合であることが示された（Whitesellら、1994；SchulteおよびNeckers、1998）。さらに、Ｘ-線結晶学の研究から、ゲルダナマイシンは、ATPとの結合部位で競合し、HSP90の内因性のATPアーゼ（ATPase）活性を阻害することが示された（Prodromouら、1997；Panaretouら、1998）。そして次に、これがクライエント蛋白質をシャペロンする（chaperoning）ことのできる、成熟した多重結合のHSP90複合体の生成を妨げる。その結果、クライエント蛋白質は、ユビキチン・プロテアソーム経路を経る分解の標的にされる。17-アリルアミノ、17-デメトキシゲルダナマイシン（17AAG）は、クライエント蛋白質を涸渇させるHSP90阻害作用ならびに培養細胞および異種移植モデルでの抗腫瘍活性は保持している（Schulteら、1998；Kellandら、1999）が、肝毒性はゲルダナマイシンよりも有意に弱い（Pageら、1997）。17AAGは、現在、フェーズI臨床試験で評価がなされている。

ラジシコールは、v-Srcおよびv-Ha-Rasにより形質転換された繊維芽細胞の悪性の遺伝表現型を逆転することが示された大環状抗生物質である（Kwonら、1992；Zhaoら、1995）。HSP90阻害により、多くのシグナル蛋白質を分解することが示された（Schulteら、1998）。Ｘ-線結晶学のデータにより、ラジシコールもまたHSP90のN末端ドメインに結合し、内因性ATPase活性を阻害することが確認された（Roeら、1998）。ラジシコールは、化合物が化学的に不安定なために、インビボでは抗腫瘍活性が欠如している。

クマリン抗生物質は、HSP90のそれと相同性のあるATP結合部位でバクテリアのDNAジャイレースに結合することが知られている。クマリン、ノボビオシンは、HSP90のカルボキシ末端、すなわちN-末端で結合するベンゾキノン アンサマイシン類およびラジシコールが占める部位とは異なった部位で結合することが示された（Marcuら、2000b）。しかしながら、これでもHSP90機能を阻害し、HSP90でシャペンロンされる多くのシグナル蛋白質の分解をもたらした（Marcuら、2000a）。
ゲルダナマイシンは、ノボビオシンに続いて、HSP90を捕縛することができない。このことは、ＮおよびＣ末端ドメインの間に何らかの相互作用が存在しなければならなことを示しており、このことは、両方の部位が、HSP90シャペロンの性質にとって重要である点と矛盾がない。

プリンを基礎とするHSP90阻害剤であるPU3は、ERBB2を含むシグナル分子の分解をもたらし、そして乳癌細胞の細胞周期停止や分化を起こさせることが示されている（Chiosisら、2001）。

特許公開WO 2004/050087およびWO 2004/056782は、HSP90阻害剤である公知のクラスのピラゾール誘導体に関する。

治療標的としてのHSP90
分子シャペロンHSP90が、腫瘍の遺伝表現型を誘導する際に非常に重要である多くのシグナル経路を調節することに関わっていること、およびある種の生理活性天然物が、HSP90への活性を経てそれらの効果を発揮することの発見により、現在、分子シャペロンHSP90が抗癌剤開発のための新規な標的として、評価されている（Neckersら、1999）。

ゲルダナマイシン、17AAGおよびラジシコールの最も重要な作用機作は、蛋白質のN-末端ドメインに存在しているATP結合部位でHSP90と結合することであり、そして、それがHSP90の内因性ATPase活性の阻害に導く（Prodromouら、1997；Stebbinsら、1997；Panaretouら、1998を参照）。

HSP90 ATPase活性の阻害は、コ−シャペロン（co-chaperones）の補充を妨害し、ユビキチン・プロテアソーム経路を経る分解のためにクライエント蛋白を標的とする、HSP90へテロ複合体型の形成を促進する（Neckersら、1999；Kellandら、1999を参照）。

HSP90阻害剤での処理は、癌において根本的に重要なプロセスである、細胞増殖、細胞周期調節およびアポトーシスに関与する重要な蛋白質の選択的な分解に導く。

HSP90機能の阻害により、根本的に重要であり、そして癌においては一般に非調節な状
態にあるプロセスの、細胞増殖、細胞周期調節およびアポトーシスに関与する重要なシグナル蛋白質の選択的な分解を引き起こすことが示されている（例えばHosteinら、2001を参照）。臨床で使用するために、これを標的とする医薬の開発のための魅力的な根拠は、形質転換された遺伝表現型と関連する蛋白質を同時に涸渇することにより、強力な抗腫瘍効果が得られ、癌細胞対正常細胞に対して治療的利点が得られることである。HSP90阻害によるこれら下流の事象が、HSP90阻害剤が培養細胞および動物モデルで抗腫瘍活性を示す原因であると信じられている（例えば、Schulteら、1998；Kellandら、1999参照）。

発明の概要
本発明は、HSP90阻害剤として、例えば癌細胞増殖の阻害のために、置換されたチエノ[2,3-d]ピリミジン化合物（ここでは、ピリミドチオフェンと呼ばれる）の使用に関する。1つの環炭素原子に芳香族置換分を有する核のピリミドチオフェン環が、本発明の化合物の基本的な特徴である。

発明の詳細な記述
1つの広い観点で、本発明は、インビトロまたはインビボでHSP90活性の阻害用の組成物の製造における、式(I)：

［式中、
R₂は、式(IA):
-(Ar¹)_m-(Alk¹)_p-(Z)_r-(Alk²)_s-Q (IA)
（ここで、
Ar¹は任意に置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール基であり、
Alk¹およびAlk²は任意に置換されていてもよい2価のC₁-C₃アルキレンまたはC₂-C₃アルケニレン基であり、
m、p、rおよびsは独立して0または1であり、
Zは-O-、-S-、-(C=O)-、-(C=S)-、-SO₂-、-C(=O)O-、-C(=O)NR^A-、-C(=S)NR^A-、-SO₂NR^A-、-NR^AC(=O)-、-NR^ASO₂-または-NR^A-（ここで、R^Aは水素またはC₁-C₆アルキルである）であり、そして
Qは水素または任意に置換されていてもよい炭素環式もしくはヘテロ環式基である）
の基であり；
R₃は水素、任意の置換基、または任意に置換されていてもよい(C₁-C₆)アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基であり；そして
R₄はカルボキシエステル、カルボキシアミドまたはスルホンアミド基である］
の化合物またはその塩、N-オキシド、水和物もしくは溶媒和物の使用を提供する。

もう1つの広い観点で、本発明は、HSP90活性を阻害するために、請求項1で定義される化合物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において該HSP90活性の阻害に応答する疾病の治療方法を提供する。

本発明のインビボにおける使用および方法は、免疫抑制のための、またはウイルス病、慢性関節リウマチ、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、I型糖尿病、狼瘡、乾癬および炎症性腸疾患のような炎症性疾患；嚢胞性線維症；糖尿病性網膜症、血管腫および子宮内膜症のような血管形成関連疾患の治療；または化学療法誘発毒性に対する正常細胞の保護；または被アポトーシス不全(failure to undergo apoptosis)が基礎的要因である疾病の治療；または心臓および脳内Hsp70の上昇による低酸素−虚血性傷害からの保護；スクラピー／クロイツフェルト‐ヤコブ病（ＣＪＤ）、ハンチントン病またはアルツハイマー病のための使用を含む、HSP90活性が関与する疾病の治療に適用できる。癌の治療のための使用が、特に指摘される。

刊行物WO 01/62233、Transition Metal Chemistry 19巻、1994、頁335-339、Journal of Heterocyclic Chemistry 30巻、1993、頁1065-1072、およびSynthesis No. 5、1983、頁402-404は、上記の式(I)の範囲内の特定の化合物を開示しているか、または式(I)のいくつかの化合物を含む化合物クラスに関する。しかしながら、本発明の上記の広い観点に関する式(I)の化合物の大部分は、それ自身新規であると信じられる。本発明はそのような新規化合物を含み、特に式(I)：

［式中、
R₂は、式(IA):
-(Ar¹)_m-(Alk¹)_p-(Z)_r-(Alk²)_s-Q (IA)
（ここで、
Ar¹は任意に置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール基であり、
Alk¹およびAlk²は任意に置換されていてもよい2価のC₁-C₃アルキレンまたはC₂-C₃アルケニレン基であり、
m、p、rおよびsは独立して0または1であり、
Zは-O-、-S-、-(C=O)-、-(C=S)-、-SO₂-、-C(=O)O-、-C(=O)NR^A-、-C(=S)NR^A-、-SO₂NR^A-、-NR^AC(=O)-、-NR^ASO₂-または-NR^A-（ここで、R^Aは水素またはC₁-C₆アルキルである）であり、そして
Qは水素または任意に置換されていてもよい炭素環式もしくはヘテロ環式基である）
の基であり；
R₃は水素、任意の置換基、または任意に置換されていてもよい(C₁-C₆)アルキル、アリールもしくはヘテロアリール基であり；そして
R₄はカルボキシエステル、カルボキシアミドまたはスルホンアミド基である］
の化合物およびそれらの塩、N-オキシド、水和物、または溶媒和物を含む。

但し、(i)R₃は-NH₂でないか、または(ii)R₄が-COOCH₃でかつR₃が水素のときは、R₂はエチルアミノ、ジエチルアミノ、フェニルアミノまたは-N(Ph)(C₂H₅)（ここで、Phはフェニルである）ではない。

ここで用いられる、
「カルボキシ基」の語は、式-COOHの基をいい、
「カルボキシエステル基」の語は、式-COORの基をいい、ここでRはヒドロキシ化合物ROHから実際にまたは概念的に誘導される基をいい、そして
「カルボキシアミド基」の語は、式-CONR_aR_bの基をいい、ここで-NR_aR_b は、アンモニアまたはアミンHNR_aR_bから実際にまたは概念的に誘導される（環状アミノを含む）アミノ基である。

「スルホンアミド基」の語は、式-SO₂NR_aR_bの基をいい、ここで-NR_aR_bは、アンモニアまたはアミンHNR_aR_bから実際にまたは概念的に誘導される（環状アミノを含む）アミノ基である。

ここで用いられる「(C_a-C_b)アルキル」（ここで、aおよびbは整数である）の語は、a〜bの炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基をいう。したがって、aが1でかつbが6であるとき、この語は、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、n-ペンチルおよびn-ヘキシルを含む。

ここで用いられる「2価の(C_a-C_b)アルキレン基」（ここで、aおよびbは整数である）の語は、a〜bの炭素原子および2つの未結合原子価を有する飽和の炭化水素鎖をいう。

ここで用いられる「（C_a-C_b）アルケニル」（ここで、aおよびbは整数である）の語は、a〜bの炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルケニル部分をいい、当てはまる場合には、ＥまたはＺの立体配置のどちらかの二重結合を少なくとも1つ有する。この語は、例えばビニル、アリル、1-および2-ブテニルならびに2-メチル-2-プロペニルを含む。

ここで用いられる「2価の(C_a-C_b)アルケニレン基」の語は、a〜bの炭素原子、少なくとも1つの二重結合および2つの未結合原子価を有する炭化水素鎖をいう。

ここで用いられる「シクロアルキル」の語は、3〜8の炭素原子を有する飽和炭素環式基をいい、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルを含む。

ここで用いられる「シクロアルケニル」の語は、少なくも一つの二重結合を含む3〜8の炭素原子を有する炭素環式基をいい、例えばシクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルおよびシクロオクテニルを含む。

ここで用いられる「アリール」の語は、１、２または３環の炭素環式芳香族基をいい。そのような基の例は、フェニル、ビフェニルおよびナフチルである。

ここで用いられる「炭素環式基」の語は、環原子が全て炭素である環基をいい、単環式アリール、シクロアルキルおよびシクロアルケニル基を含む。

ここで用いられる「ヘテロアリール」の語は、Ｓ、ＮおよびＯから選択される1以上のヘテロ原子を含む１、２または３環式芳香族基をいう。そのような基の例は、チエニル、ベンゾチエニル、フリル、ベンゾフリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、ベンズオキサゾリル、イソキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、ベンゾトリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、インドリルおよびインダゾリルである。

ここで用いられる無条件の用語「ヘテロ環式基」または「ヘテロ環系」は、上で定義された「ヘテロアリール」を含み、特に、Ｓ、ＮおよびＯから選択される1以上のヘテロ原子を含む１、２または３環式の非芳香族基をいい、他の基または単環の炭素環式基と共有結合している1以上のヘテロ原子を含む単環の非芳香族基からなる群をいう。そのような基の例は、ピロリル、フラニル、チエニル、ピペリジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピロリジニル、ピリミジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、モルホリニル、ベンゾフラニル、ピラニル、イソオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、メチレンジオキシフェニル、エチレンジオキシフェニル、マレイミドおよびスクシンイミド基である。

用語が使用されている文脈中で、別の方法で特定されていなければ、ここのいかなる部分で用いられている「置換された」の語は、例えば、(C₁-C₆)アルキル、(C₁-C₆)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C₁-C₆)アルキル、メルカプト、メルカプト(C₁-C₆)アルキル、(C₁-C₆)アルキルチオ、ハロ(フッ素および塩素を含む)、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、ニトリル(-CN)、オキソ、フェニル、-COOH、-COOR^A、-COR^A、-SO₂R^A、-CONH₂、-SO₂NH₂、-CONHR^A、-SO₂NHR^A、-CONR^AR^B、-SO₂NR^AR^B、-NH₂、-NHR^A、-NR^AR^B、-OCONH₂、-OCONHR^A、-OCONR^AR^B、-NHCOR^A、-NHCOOR^A、-NR^BCOOR^A、-NHSO₂OR^A、-NR^BSO₂OR^A、-NHCONH₂、-NR^ACONH₂、-NHCONHR^B、-NR^ACONHR^B、-NHCONR^AR^Bまたは-NR^ACONR^AR^B（ここで、R^AおよびR^Bは独立して(C₁-C₆)アルキル基である）から選択される少なくとも1つの置換基で置換されることを意味する。「任意の置換基」は前述の置換基群の1つであり得る。

ここで用いられる「塩」の語は、塩基付加塩、酸付加塩および４級塩を含む。酸性である本発明の化合物は、例えばナトリウムおよびカリウム水酸化物のようなアルカリ金属水酸化物；例えばカルシウム、バリウムおよびマグネシウム水酸化物のようなアルカリ土類金属水酸化物のような塩基と、また例えばN-エチルピペリジン、ジベンジルアミンなどの有機塩基と、医薬的または動物薬的に許容される塩を含む塩を形成することができる。

塩基性であるこれらの化合物(I)は、例えば塩酸もしくは臭化水素酸のようなハロゲン化水素酸、硫酸、硝酸またはリン酸などの無機酸、ならびに例えば酢酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、サリチル酸、クエン酸、メタンスルホン酸およびp-トルエンスルホン酸などの有機酸と、医薬的または動物薬的に許容される塩を含む塩を形成することができる。

適当な塩の総説には、StahlおよびWermuthによるHandbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Wiley-VCH, Weinheim, ドイツ, 2002)を参照。

ここで用いられる「溶媒和物」の語は、本発明の化合物および医薬的に許容される1以上の溶媒分子、例えばエタノールの化学量論量を含む分子複合体を意味する。「水和物」の語は、該溶媒が水のときに用いられる。

本発明に関する化合物は、不斉原子または回転制限の存在により、各々のキラル中心でのＲまたはＳ立体化学を有する多くの立体異性体または各々のキラル軸でのＲまたはＳ立体化学を有するアトロプ異性体として存在することができる。本発明は、そのようなエナンチオマーおよびジアステレオマーならびにそれらの混合物の全てを含む。

式(I)の化合物のいわゆる「プロ-ドラッグ」も、本発明の範囲内である。したがって、それら自身では薬理活性をほとんど有しないかまたは薬理活性を有しないかもしれない式(I)の化合物のある誘導体は、体内または体表に投与されたとき、例えば加水分解により
所期の活性を有する式(I)の化合物に変換され得る。そのような誘導体を「プロドラッグ」という。プロドラッグの使用のさらなる情報は、Pro-drugs as Novel Delivery Systems, 14巻, ACS Symposium Series (T. HiguchiおよびW. Stella)およびBioreversible Carriers in Drug Design, Pergamon Press, 1987 (編集者E. B. Roche, American Pharmaceutical Association)中に見出し得る。

本発明に基づくプロドラッグは、例えば、式(I)の化合物中に存在する適当な官能性を、例えば、H. BundgaardによるDesign of Prodrugs (Elsevier, 1985)に記載されたような「プロ-部分(pro-moieties)」として当業者に公知のある部分で交換することにより製造することができる。

式(I)の化合物の代謝物、すなわち薬剤の投与でインビボで形成される化合物も、本発明の範囲に含まれる。
代謝物のいくつかの例は、
(i) 式(I)の化合物がメチル基を含む場合、そのヒドロキシメチル誘導体 (-CH₃ -> -CH₂OH)；
(ii) 式(I)の化合物がアルコキシ基を含む場合、そのヒドロキシ誘導体 (-OR -> -OH)；(iii) 式(I)の化合物が3級アミノ基を含む場合、その2級アミノ誘導体 (-NR¹R² -> -NHR¹または-NHR²)；
(iv) 式(I)の化合物が2級アミノ基を含む場合、その1級誘導体 (-NHR¹ -> -NH₂)；
(v) 式(I)の化合物がフェニル部分を含む場合、そのフェノール誘導体 (-Ph -> -PhOH)；および
(vi) 式(I)の化合物がアミド基を含む場合、そのカルボン酸誘導体 (-CONH₂ -> COOH)
である。

基R₂
上記のように、R₂は、式(IA)：
-(Ar¹)_m-(Alk¹)_p-(Z)_r-(Alk²)_s-Q (IA)
（ここで、いずれの両立できる組合せで、Ar¹は任意に置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリール基であり、Alk¹およびAlk²は任意に置換されていてもよい2価のC₁-C₃アルキレンまたはC₂-C₃アルケニレン基であり、m、p、rおよびsは独立して0または1であり、Zは、-O-、-S-、-(C=O)-、-(C=S)-、-SO₂-、-C(=O)O-、-C(=O)NR^A-、-C(=S)NR^A-、-SO₂NR^A-、-NR^AC(=O)-、-NR^ASO₂-または-NR^A-（ここで、R^Aは水素またはC₁-C₆アルキルである）であり、そしてQは水素または任意に置換されていてもよい炭素環式もしくはヘテロ環式基である）
の基である。

基R₂中に存在するとき、
Ar¹は、例えばフェニル、シクロヘキシル、ピリジル、モルホリノ、ピペリジニルまたはピペラジニル環であり得る。
現在のところ、Ar¹がフェニル環で存在するとき、
Alk¹およびAlk²は、例えば、-CH₂-、-CH₂CH₂-または-CH=CH-から選択される、任意に置換されていてもよい2価の基であり得るのが好ましい。Alk¹およびAlk²における任意の置換基は、例えばモノ-またはジ(C₁-C₃アルキル)アミノおよびC₁-C₃アルコキシを含み、
Zは、例えば-O-または-NH-であり得、Qは水素である。

本発明にかかわる化合物の単純なサブクラスにおいて、mは1であり、p、rおよびsはそれぞれ0であり、Qは水素であり、それゆえに、R₂は任意に置換されていてもよいアリールまたはヘテロアリールである。そのような場合、R₂は、例えば任意に置換されていてもよいフェニル、2-もしくは3-チエニル、2-もしくは3-フラニル、2-、3-もしくは4-ピリジニ
ル、モルホリニル、またはピペリジニルであり得る。

現在のところ、R₂が任意に置換されていてもよいフェニル（例えば、ここで、任意の置換基は、メチル、エチル、n-もしくはイソプロピル、ビニル、アリル、メトキシ、エトキシ、n-プロピルオキシ、ベンジルオキシ、アリルオキシ、シアノメトキシ、クロロ、ブロモ、シアノ、ホルミル、メチル-、エチル-もしくはn-プロピル-カルボニルオキシ、メチル-もしくはエチル-アミノカルボニルから選択される）である化合物が好ましい。R₂環に存在し得るより複雑な置換基は、(i)式-O(CH₂)_nZ¹（ここで、nは1、2または3であり、Z¹は1級、2級、3級もしくは環状アミノ基、またはC₁-C₆アルコキシ基である）；あるいは(ii)式-(Alk³)_mZ¹（ここで、Alk³は2価の直鎖もしくは分枝鎖(C₁-C₃)アルキレンであり、mは0または1であり、Z¹は1級、2級、3級もしくは環状アミノ基、またはC₁-C₆アルコキシ基である）のものを含む。フェニル環の好ましい置換基の位置は、2、4および5位である。

その他の単純な構造において、mは1であり、p、rおよびsは再度、それぞれ0であり、Qは、任意に置換されていてもよい炭素環もしくはヘテロ環、例えばフェニル、シクロヘキシル、ピリジル、モルホリノ、ピペリジニルもしくはピペラジニル環であり得る。そのような場合、Qは、任意に置換されていてもよいAr¹環中の直接の置換基である。

本発明にかかわるより複雑な構造において、m、p、rおよびsの1つまたはそれ以上は1であり得、Qは水素または任意に置換されていてもよい炭素環もしくはヘテロ環であり得る。例えば、pおよび／またはsは1であり得、rは0であり得、よって、Qは、任意に置換されていてもよいアルキレンもしくはアルケニレン基、例えばC₁-C₃アルキレン基によってAr¹に結合する。その他の場合に、p、rおよびsがそれぞれ1であり得、その場合、Qは、ヘテロ原子を含有するZ基により中断されたアルキレンもしくはアルケニレン基によってAr¹に結合する。なおその他の場合に、pおよびsは0であり得、rは1であり得、その場合、Qは、ヘテロ原子を含有するZ基を経てAr¹に結合する。

本発明の化合物に用いることができるR₂基の具体的な例は、ここの実施例の化合物中に存在するものを含む。

任意の置換基R₃
R₃は水素または上記で定義されたような任意の置換基である。現在のところ、R₃が水素であることが好ましい。

基R₄
R₄がカルボキシアミドまたはスルホンアミド基のとき、その例は、式
-CONR^B(Alk)_nR^Aまたは-SO₂NR^B(Alk)_nR^A
（ここで、
Alkは2価のアルキレン、アルケニレンもしくはアルケニレン基、例えば-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH=CH-または-CH₂CCCH₂-基であり、そのAlkは任意に置換されていてもよく、
nは0または1であり、
R^Bは水素またはC₁-C₆アルキルもしくはC₂-C₆アルケニル基、例えばメチル、エチル、n-もしくはイソプロピル、またはアリルであり（現在のところ、R^Bが水素であることが好ましい）、

R^Aはヒドロキシ、アミノ（モノ-およびジ-(C₁-C₃)アルキルアミノを含む）、カルバモイル(-C(=O)NH₂)、-SO₂OH、トリフルオロメチルのような任意の置換基；または任意に置換されていてもよい炭素環式基、例えばヒドロキシ、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、3,4-メチレンジオキシ、スルファモイル(-SO₂NH₂)、-SO₂OH、メトキシ、メチルスルホニ
ル、トリフルオロメチルで任意に置換されていてもよいシクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル；またはヘテロ環式基、例えばピリジル、フリル、チエニル、ジアゾリル、N-ピペラジニル、ピロリル、テトラヒドロフラニル、チアゾリル、1-アザ-ビシクロ[2.2.2]オクタニルもしくはN-モルホリニル（これらのヘテロ環は、例えば環窒素が(C₁-C₃)アルキルで置換され得る）であるか、

またはR^AおよびR^Bはそれらが結合している窒素と一緒になって、O、SおよびNから選択される1以上のさらなるヘテロ原子を任意に含んでいてもよいN-へテロ環を形成し、それは1以上の環CまたはN原子上で任意に置換されていてもよく、例えばモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルおよびN-フェニルピペラジニルを含むN-ヘテロ環である。
現在のところ、R₄がカルボキシアミド基であることが好ましい。

R₄がカルボキシエステル基のとき、その例は、式-COOR^c（式中、R^cはC₁-C₆アルキルまたはC₂-C₆アルケニル基、例えばメチル、エチル、n-もしくはイソ-プロピル、またはアリル；または任意に置換されていてもよいアリールもしくはヘテロアリール基、例えば任意に置換されていてもよいフェニル、ピリジルもしくチアゾリル；またはベンジルもしくはピリジルメチルのような任意に置換されていてもよいアリール(C₁-C₆アルキル)-もしくはヘテロアリール(C₁-C₆アルキル)-基；またはシクロペンチルもしくはシクロヘキシルのような任意に置換されていてもよいシクロアルキル基である）のものを含む。

本発明の化合物中に用いることができるR₄基の具体例は、ここの実施例の化合物中に存在するものを含む。

本発明にかかわる化合物の好ましいサブクラスは、式(II)

（式中、
Aは2級アミノ基であり；
R₁₀はH、Cl、Br、またはCH₃であり；
R₁₁は水素、Cl、Br、CN、メチル、エチル、n-もしくはイソ-プロピル、ビニルまたはアリルであり；

R₁₂は(i)式-O(CH₂)_nZ¹の基（ここで、nは1、2または3であり、Z¹は1級、2級、3級もしくは環状アミノ基、またはC₁-C₆アルコキシ基である）；あるいは(ii)式-(Alk³)_mZ¹の基（ここで、Alk³は2価の直鎖もしくは分枝鎖(C₁-C₃)アルキレンであり、mは0または1であり、Z¹は1級、2級、3級もしくは環状アミノ基、またはC₁-C₆アルコキシ基である）である。

化合物(II)のこのサブクラスにおいて、Aが2級C₁-C₆アルキルアミノ基（例えば、ここ
で、C₁-C₆アルキル置換基は、メチル、エチル、ならびにn-およびイソ-プロピルから選択される）であり、R₁₂が(i)式-O(CH₂)_nZ¹の基（式中、nは1、2または3であり、Z¹はジ(C₁-C₃アルキル)アミノもしくはC₁-C₃アルコキシ（例えば、ここで、C₁-C₃アルキル部分は、メチル、エチル、ならびにn-およびイソ-プロピルから選択される）であることが好ましい。

本発明にかかわる具体的な化合物は、実施例のもの、特に上記の構造(II)を有する実施例の化合物を含む。
本件発明にかかわる化合物(I)の合成のためには、多数の合成戦略があるが、全て合成有機化学者に既知の公知の化学を基にする。従って、式(I)の化合物は、標準的な文献に記載され、当業者に周知の方法により合成することできる。典型的な文献源は、"Advanced organic chemistry"、第4版 (Wiley)、J March、"Comprehensive Organic Transformation"、第2版 (Wiley)、R.C. Larock、"Handbook of Heterocyclic Chemistry"、第2版 (Pergamon)、A.R. Katritzky、 "Synthesis"、"Acc. Chem. Res."、"Chem. Rev"中に見出されるような総説論文、あるいはオンラインの標準的文献調査によるかまたは2次情報源より特定された"Chemical Abstracts"もしくは"Beilstein"のような基礎的な文献源である。そのような文献の方法は、ここの製造例の方法およびそれらに類似の方法を含む。

例えば、次の一般的な反応スキームを用いることができる。

出発原料は、商業的に入手可能か、文献の方法により作ることができる。続く反応が、式(I)のさらなる化合物を製造するために、R²、R³またはR⁴に行われる。

本発明の化合物はHSP90の阻害剤であり、HSP90活性の阻害に応答する疾病、例えば癌；Ｃ型肝炎(HCV)のようなウイルス病(Waxman、2002)；移植におけるような免疫抑制（Bijlmakers、2000およびYorgin、2000）；慢性関節リウマチ、喘息、多発性硬化症（ＭＳ）、I型糖尿病、狼瘡、乾癬および炎症性腸疾患のような抗炎症性疾患 (Bucci、2000)；嚢胞性線維症(Fuller、2000)；血管形成関連疾患(Hur、2002およびKurebayashi、2001)；糖尿病性網膜症、血管腫、乾癬、子宮内膜症および腫瘍血管形成の治療に有用である。

本発明のHsp90阻害剤は、また、化学療法により誘発される毒性から正常細胞を保護し、そして被アポトーシス不全が基礎的要因である疾病に有用である。そのようなHsp90阻害剤は、細胞ストレスの誘導または熱ショック蛋白質応答によって引き起こされる疾病、例えば、心臓(Hutter、1996およびTrost、1998)および脳(Plumier、1997およびRajder、2000)のHsp70の上昇による低酸素−虚血性傷害からの保護にも有用である。
Hsp90阻害剤により誘発されるHsp70のレベルの上昇は、蛋白質の間違った折り畳みまたは凝集が主な原因である疾病、例えば、スクラピー／クロイツフェルト‐ヤコブ病（ＣＪＤ）、ハンチントン病およびアルツハイマー病(Sittler、2001；Trazelt、1995およびWinklhofer、2001)のような神経発生障害にも用いることができる。

したがって、本発明は：
(i)上記の式(I)の化合物を医薬的または動物薬的に許容される担体とともに含む、医薬ま
たは動物薬組成物
(ii)インビトロおよびインビボでHSP90活性の阻害用の組成物の製造において、上記式(I)の化合物の使用
(iii)HSP90活性を阻害するために、上記の式(I)の化合物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物のHSP90活性の阻害に応答する疾病または病状の治療方法
を含む。

特定の患者に対する特定の投与量レベルは、用いられる特定化合物の活性、年齢、体重、身体全体の健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬の組合せ、治療を受ける特定の疾病の原因機序および重篤度を含む種々の要因に依存することが理解されるであろう。
一般的に、経口投与製剤の適切な投与量は、通常、1日当り１回、２回または３回で、0.1〜3000mgの範囲であるか、または点滴もしくは他の経路により投与される１日量に等しい量であろう。しかしながら、最適な投与量レベルおよび投与回数は、当該技術で慣例の臨床試験によって決定されるであろう。

本発明に関する化合物は、それらの薬物動態の性質と合致した経路による投与を目的として製造される。経口投与可能な組成は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤、経口用、局所用または無菌非経口用溶液もしくは懸濁液のような液もしくはゲル製剤の形態である。
経口投与のための錠剤およびカプセル剤は、単位投与量を含む形態であり、それは慣用の賦形剤：例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントガムまたはポリビニル−ピロリドンのような結合剤；例えばラクトース、砂糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシンのような充填剤；例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、ポリエチレングリコールまたはシリカのような錠剤用滑沢剤；例えばバレイショデンプンのような崩壊剤、またはナトリウムラウリルスルフェートのような許容される湿潤剤を含んでいてもよい。錠剤は、普通の製薬の実務で周知の方法によりコーティングされてもよい。

経口液剤は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、乳液、シロップまたはエリキシルの形態であるか、または使用前に水もしくは他の適当な媒体で溶解する乾燥生成物の形態であってもよい。上記の液剤は、慣用の添加剤：例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、硬化食用油脂のような懸濁剤；例えばレシチン、ソルビタンモノオレエートまたはアラビアゴムのような乳化剤；例えばアーモンド油、ヤシ油、グリセリドのような油状エステル、プロピレングリコールまたはエチルアルコールのような非水性媒体（食用油を含む）；例えばメチルもしくはプロピルp-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸のような保存剤、ならびに所望により慣用の芳香剤または着色剤を含んでいてもよい。

皮膚への局所適用のために、医薬はクリーム、ローションまたは軟膏にされ得る。そのような医薬のために使用されるクリームもしくは軟膏の製剤化は、例えば英国薬局方のような製剤学の標準的な教科書に記載されているような、当該技術で周知慣用の製剤化である。

活性成分は、無菌媒体中、非経口的にも投与され得る。用いられる媒体および濃度により、医薬は媒体に懸濁させるか、または溶解させることができる。局所麻酔剤のような補助剤、保存剤および緩衝剤も媒体に溶解することができる。

以下の実施例は、本発明の特定の化合物の製造および活性を示している。

実施例１
2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

工程１
2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

アセトニトリル中の2-アミノ-4,6-ジクロロ-5-ホルミル-ピリミジン(1当量)および炭酸カリウム(1当量)の撹拌混合物に、室温でエチル-2-メルカプトアセテート(0.95当量)を加え、その混合物を室温で3時間撹拌し、次いで80℃で1時間加熱した。冷却後、混合物を真空下に濃縮乾固した。酢酸エチルおよびヘキサンで溶出するシリカのカラムクロマトグラフィーにより、黄色の粉末として例１を得た。
LC-MS 保持時間：2.371分、[M+H]⁺ 258.0

工程２（スズキ反応）
2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

1,4-ジオキサンおよび水(3.5:1)中の工程１の例１(1当量)、フェニルボロン酸(1.2当量)および炭酸ナトリウム(1.2当量)の溶液を、窒素で5分間バブリングして脱気した。Pd(PPh₃)₄ (0.05当量)を加え、混合物をPersonal Chemistry Synthesiser電子レンジ中、150℃で10分間加熱した。冷却および真空下に濃縮後、プレパラティブHPLCにより、白色の粉末として、例２を得た。
LC-MS 保持時間：2.545分、[M+H]⁺ 300.10
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「A」を有した。

実施例２
2-アミノ-4-(4-トリフルオロメチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

実施例１のように製造した。
LC-MS 保持時間：2.768分、[M+H]⁺ 368.1
¹H NMR (400MHz, d6-DMSO):δ = 1.07 (3H, t, J = 7.1Hz), 4.09 (2H, q, J = 7.1Hz), 7.25 (2H, br s), 7.68 (1H, s), 7.76 (2H, d, J = 8.0Hz), 7.85 (2H, d, J = 8.0Hz)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「B」を有した。

以下の表１の化合物を合成し、後記の蛍光偏光分析で試験した。スズキ反応は、実施例１の工程２のように行った。還元的アミノ化反応は、次の実施例33のように行った。

2-アミノ-4-(4-ピペリジン-1-イルメチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル（表１の実施例33）

メタノール中の2-アミノ-4-(4-ホルミル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(1当量)の懸濁液に、ピロリジン(5当量)を加えた。反応混合物を3.5時間加熱還流し、次いで室温に冷却した。水素化ホウ素ナトリウム(3当量)を加え、10分間撹拌した。混合物を真空下に濃縮し、次いで酢酸エチルおよび水で分配した。相を分離し、有機層を食塩水で洗浄し、乾燥し、黄色の油状物になるまで蒸発した。粗生成物をプレパラティブHPLCで精製した。
LC-MS 保持時間：1.803分、[M+H]⁺ 383

塩素置換反応は、次の実施例22のように行った。
2-アミノ-4-ベンジルアミノ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸メチルエステル（表１の実施例22）

THFの4mL中の2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸メチルエステル(100mg, 0.39mmol)、ベンジルアミン(100μl)を110℃で35分間、MW照射した。反応物を室温に冷却し、（酸性）処理を行い、標準的条件で精製し、中性の化合物を得た。
LC-MS: RT = 2.391分；MS m/z = 329 (M+1)

注：強さと反応時間は、アミンの反応性に依存する。例えば、反応性のより低いアミン（例えばN-メチルアニリンのような）に対しては、適当な反応条件は、MW 160℃、30分間およびアミン0.5mLである。

表１の４番目のカラムは、後記の蛍光偏光分析における化合物の活性を示す。
表１

実施例42
2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸アミド

例１の化合物を濃水酸化アンモニウム中に懸濁し、Personal Chemistry Synthesiser電子レンジ中、140℃で20分間加熱した。真空下で濃縮し、白色の固体として実施例42を得た。
LC-MS 保持時間：1.824分、[M+H]⁺ 271.10

実施例43
2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

工程１
2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸

エタノール(20 ml)および水(2 ml)中の2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(実施例１)(1.00 g; 3.34 mmol)の懸濁液に、水酸化ナトリウム(0.66 g; 16.5 mmol)を加えた。混合物を1時間、加熱還流（均一な淡黄色の溶液を与える）し、室温に冷却する。溶媒を真空下に除去し、固体の残渣を水(30 mL)に溶解し、氷-水浴で冷却した。混合物を撹拌し、濃塩酸を滴下して加え、pHを1〜2に調整した。得られた沈殿を濾過し、水、次いでエタノール、最後にジエチルエーテルで洗浄した。オフホワイトの生成物を真空下に乾燥して、2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸を無色の固体(0.784 g; 87%)として得た。
LC/MS RT = 1.845分；m/z = 272 (M+H)+

工程２
2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸(0.187 g, 0.69 mmol)に、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(0.380 g, 1.0 mmol)を加えた。この混合物をジメチルホルムアミド(DMF)(5.0 ml)に懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン(0.696 ml; 4.0 mmol)を加え、黄色の溶液を得た。ジエチルアミン塩酸塩(0.122 g; 5.0 mmol)を加え、反応混合物を、マイクロウエーブ合成装置の中で、封印したガラス瓶中、100℃で10分間過熱した。DMFを真空下に除去し、残渣を酢酸エチル(30 ml)および水(30 ml)の間で分配した。相を分離し、有機相を飽和食塩溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。混合物を濾過し、濾液の溶媒を真空下に除去し、黄色の固体を得、それをシリカゲルに吸着し、ヘキサン中15〜50%の酢酸エチルの溶媒勾配で溶出する、シリカゲル(20 g)のフラッシュクロマトグラフィーで精製した。このようにして、2-アミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミドを淡黄色の固体(0.051 g; 25%)として得た。
LC/MS RT = 2.08分；m/z = 299 (M+H)+ 1H NMR (400MHz, d6 DMSO) δ 1.11 (t, 3H), 3.26 (m, 2H), 7.12 (s, 2H), 7.61 (m, 3H), 7.86 (m, 2H), 8.03 (s, 1H), 8.71 (t, 1H)
実施例43の化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「A」を有した。

以下の化合物（表２）は、実施例43の方法により、対応するエステル（表１）および適当なアミンから作られた。
表２の最後のカラムは、後記の蛍光偏光分析での化合物の活性を示す。
表２

実施例74

2,5-ジアミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエスエル

工程１
2-アミノ-6-オキソ-4-フェニル-1,6-ジヒドロ-ピリミジン-5-カルボニトリル

無水ピリジン(300ml)に、ベンズアルデヒド(15g, 141.3mmol, 1当量)、グアニジン炭酸塩(25.47g, 141.3mmol, 1当量)、シアノ酢酸エチル(15.99g, 141.3mmol, 1当量)および無水酢酸ナトリウム(11.59g, 141.3mmol, 1当量)を加え、4時間還流した。次いで、反応物を室温に冷却し、溶媒を減圧下に除去した。褐色の残渣を30%酢酸水溶液400 mlで摩砕し、濾別した。次いで黄色の固体をジエチルエーテル300 mlで摩砕し、濾別し、2-アミノ-6-オキソ-4-フェニル-1,6-ジヒドロ-ピリミジン-5-カルボニトリルをオフホワイトの固体として得た。
収量：14.46g (48%)
LCMS 保持時間 = 1.34分、m/z C₁₁H₉N₄Oの計算値 213.22 (M + H)、実測値 213.1

工程２
2-アミノ-4-フェニル-6-チオキソ-1,6-ジヒドロ-ピリミジン-5-カルボニトリル

2-アミノ-6-オキソ-4-フェニル-1,6-ジヒドロ-ピリミジン-5-カルボニトリル(0.200g, 0.942mmol, 1当量)および5硫化リン(0.838g, 3.770mmol, 4当量)をピリジン(5ml)に溶解した。反応物を2時間、還流下に加熱し、室温に冷却し、水100mlに注いだ。混合物を1時間沸騰させ、室温に冷却し、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機抽出液を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を真空下に除去し、橙色の残渣をジエチルエーテルで摩砕し、2-アミノ-4-フェニル-6-チオキソ-1,6-ジヒドロ-ピリジン-5-カルボニトリルを黄色の固体として得た。
収量： 0.118g (55%)
LCMS 保持時間 = 1.94分、m/z C₁₁H₉N₄Sの計算値 229.29 (M + H)、実測値 229.1

工程３
2,5-ジアミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

ナトリウム(0.010g, 0.438mmol, 1当量)を窒素下、無水エタノール4mlに溶解した。2-アミノ-4-フェニル-6-チオキソ-1,6-ジヒドロ-ピリミジン-5-カルボニトリル(0.100g, 0.438mmol, 1当量)を加え、反応物を室温で1時間撹拌した。酢酸2-ブロモエチル(0.073g, 0.438mmol, 1当量)を加えた。反応物を室温でさらに30分間撹拌した。次いで、無水エタノール1mlに溶解したナトリウム(0.010g, 0.438mmol, 1当量)を加えた。次いで、反応物を5時間還流した。反応物を室温に冷却し、水でクエンチした。沈殿を濾別し、ジエチルエーテルで摩砕し、2,5-ジアミノ-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステルを黄色の固体として得た。
収量：0.059g (43%)
LCMS 保持時間 = 2.42分、m/z C₁₅H₁₅N₄O₂Sの計算値 315.38 (M + H)、実測値 315.1
¹H NMR (DMSO-d₆, 2.50) δ 1.19 (t, 3H, J = 7.1), 4.13 (q, 2H, J = 7.1), 5.79 (bs
, 2H), 7.29 (bs, 2H), 7.50-7.56 (m, 5H)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Bを有した。

実施例75
2-アミノ-5-メチル-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸アミド

工程１
5-アミノ-4-ベンゾイル-3-メチル-チオフェン-2-カルボン酸エチルエステル

文献の方法（Bryan P. McKibben, Craig H. Cartwright, Arlindo L. Castelhano Tetrahedron Lett. 1999, 44, 5471）により製造した。

工程２
2-アミノ-5-メチル-4-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸アミド

5-アミノ-4-ベンゾイル-3-メチルチオフェン-2-カルボン酸エチルエステルの溶液にグアニジン炭酸塩を加え、懸濁液を窒素下、175℃で〜3時間加熱した。懸濁液を冷却し、水を加えた。混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出液を洗浄し、乾燥した。溶液を濃縮し、残渣を酢酸エチルおよびヘキサンで溶出するクロマトグラフィーで精製した。
LC 保持時間 2.17分 [M+H]+ 285.1 (運転時間 3.75分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Bを有した。

上記の方法と同様にして製造された追加の例を表３に示す。表３の4番目のカラムは後記の蛍光偏光分析による化合物の活性を示す。
表３

実施例184
2-アミノ-4-(4-ヒドロキシ-2-メチル-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

工程１
2-アミノ-4-(4-ベンジルオキシ-2-メチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

DMF (10mL)中の2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(例1; 工程1)(200 mg; 0.776 mmol)に、2-メチル-4-ベンジルオキシフェニルボロン酸(225 mg; 0.93 mmol)を加えた。NaHCO₃ (1.0M水溶液; 2.33 mL)を加え、混合物を窒素で脱気した。Pd(PPh₃)₂Cl₂ を加え、反応混合物を80℃で5時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、DMFを真空下に除去した。残渣を酢酸エチル(50 mL)および飽和NaCl(aq)(50 mL)で分配した。有機相をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、濾液溶媒をを真空下に除去し、黄色の油状物を得、イオン交換クロマトグラフィー(IST SCX-2カルム)で精製し、黄褐色の固体(230 mg; 71%)として生成物を得た。
LC-MS 保持時間：2.852分、[M+H]⁺ 420 (運転時間 3.75分間)

工程２
2-アミノ-4-(4-ヒドロキシ-2-メチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

氷浴で冷却された、ジクロロメタン(8 mL)中の2-アミノ-4-(4-ベンジルオキシ-2-メチル-フェニル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(211 mg; 0.5 mmol)の溶液に、BCl₃ (DCM中の1.0M溶液; 1.51 mL; 1.5 mmol)を加えた。反応混合物を30分間撹拌し、次いで、アンモニア水溶液を(20 mL)を加え、反応混合物を酢酸エチル(2×30 mL)で抽出した。有機相をNa₂SO₄ で乾燥し、濾過し、濾液溶媒を真空下除去し、黄色の固体を得、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーグラフィー(10g IST Flash;ヘキサン中10〜40%酢酸エチルで溶出)で精製して、無色の固体(102 mg, 62%)を得た。
LC-MS 保持時間：2.852分、[M+H]⁺ 420 (運転時間 3.75分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Aを有した。

実施例185
2-アミノ-4-(2-メチル-4-プロポキシ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

DMF (15 mL)中の2-アミノ-4-(4-ヒドロキシ-2-メチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(50 mg: 0.152 mmol)および炭酸カリウム(25mg; 0.18 mmol)の溶液に、1-ブロモプロパン(15 μL; 0.17 mmol)を加えた。反応混合物を50℃で18時間加熱した。反応混合物を冷却し、溶媒を真空下に除去した。残渣を飽和重炭酸ナトリ
ウム水溶液(10 mL)および酢酸エチル(20 mL)で分配した。有機相をNa₂SO₄ で乾燥し、濾過し、濾液溶媒を真空下に除去し、黄色の固体を得、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン中の酢酸チルで溶出)で精製して、黄色の固体(45mg; 80%)を得た。
LC-MS 保持時間：2.821分、[M+H]⁺ 372 (運転時間3.75分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Aを有した。

以下の化合物(表４)は、適当なアルキル化剤をブロモプロパンと置き換えて、実施例185の方法により作られた。表４の第4カラムは、後記の蛍光偏光分析による化合物の活性を示す。

表４

実施例196

2-アミノ-4-(5-ホルミル-2-メチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

工程１
3-ブロモ-4-メチル-ベンズアルデヒド

EizenberおよびAmmonsにより記載のOrg Prep and Reactions Int., 6(5), 251-253 (1974)のように、p-トルアルデヒド(12.00g)から製造した。
収量：10.97 g (55%)
LCMS 保持時間 = 2.57分；無イオン化
¹H NMR (400 MHz; CDCl₃) δ 2.50 (s, 3H), 7.43 (d, 1H, J = 7.8Hz), 7.75 (dd, 1H, J = 7.8および1.6 Hz), 8.05 (d, 1H, J = 1.6 Hz), 9.94 (s, 1H)

工程２
4-メチル-3-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-ベンズアルデヒド

ジメチルホルムアミド(60 mL)中の3-ブロモ-4-メチル-ベンズアルデヒド(3.105 g; 15.6 mmol)、ビス(ピナコラート)ジボロン(4.29 g; 16.86 mmol)および酢酸カリウム(4.59g;
46.8 mmol)の混合物を、排気−窒素置換(3サイクル)により脱気し、次いで、撹拌した混合物に窒素ガスを5分間バブリングした。酢酸パラジウム(0.120 g; 0.536 mmol)を加え、反応混合物を85℃(油浴温度)で2.5時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、真空下にDMFを除去した。残渣を酢酸エチル(150 mL)および水(150 mL)で分配し、黒色のPd固体を除くために、混合物をセライトのパッドを通して濾過した。濾過ケーキを酢酸エチル(2×50
mL)で洗浄し、合わせた濾液相を分離し、有機相を水(2×150 mL)、次いで飽和食塩溶液(150 mL)で洗浄した。有機相をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、濾液溶媒を真空下に除去し、黄色の油状物を得、シリカゲルのフラッシュクロマトグラフィー(50g IST Flash; ヘキサン中の0〜10%酢酸エチルで溶出)で精製し、無色の固体として生成物を得た。
収量：4.58 g; 85%
LC-MS 保持時間 = 2.799分; [M+H]⁺ 247
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.36 (s, 12H), 2.62 (s, 3H), 7.31 (d, 1H, J = 7.88 Hz), 7.83 (dd, 1H, J = 7.88および1.9 Hz), 8.25 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 9.98 (s, 1H)

工程３
2-アミノ-4-(5-ホルミル-2-メチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

4-メチル-3-(4,4,5,5-テトラメチル-[1,3,2]ジオキサボロラン-2-イル)-ベンズアルデヒド(7.28g, 29.57 mmol)に、2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(7.62g, 29.57 mmol)、次いで炭酸水素ナトリウム(7.45g, 88.71 mmol)を加えた。DMF(110 mL)、次いで水(22 mL)を加え、懸濁液を排気−窒素置換(3サイクル)、次いで撹拌した反応混合物に窒素ガスを5分間バブリングして脱気した。ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロライド(500mg, 0.739 mmol)を加え、反応混合物を85℃(油浴温度)で18時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、DMFを真空下に除去した。残渣を酢酸エチル(500 mL)および水(400 mL)で分配し、混合物を15分間激しく撹拌し、その後、Pdの固体を除くために、セライトのパッドを通して濾過した。濾過ケーキを酢酸エチル(2×50 mL)で洗浄し、合わせた濾液相を分離し、有機相を水(1×300 mL)、次いで飽和食塩溶液(250 mL)で洗浄した。有機相をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、濾液溶媒を真空下に除去し、褐色の油状物を得、酢酸エチルで摩砕し、褐色の固体(5.42 g, 56%)として生成物を得た。
LC-MS 保持時間 = 2.436分; [M+H]⁺ 342
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) 1.30 (t, 3H), 2.38 (s, 3H), 4.32 (q, 2H), 7.48 (s, 2H), 7.71 (d, 2H), 7.91 (s, 1H), 7.97 (d, 1H), 10.11 (s, 1H)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Aを有した。

実施例197
2-アミノ-4-(2-メチル-5-プロピルアミノメチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

2-アミノ-4-(5-ホルミル-2-メチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(100 mg, 0.29 mmol)にメタノール(5mL)を加え、次いで、得られた懸濁液に、プロピルアミン(0.586 mmol)を加えた。反応混合物を4時間加熱還流(均一な褐色溶液が得られる）し、次いで、室温に冷却した。水素化ホウ素ナトリウム(23 mg; 0.58 mmol)を加え、反応混合物を30分間撹拌した。メタノールを真空下に除去し、残渣を水(20 mL)および酢酸エチル(20 mL)で分配した。相を分離し、有機相をNa₂SO₄で乾燥し、濾過し、濾液溶媒を真空下に除去し、褐色の固体を得、メタノール中の2.0Mエチルアミン溶液(5.0
mL, 10 mmol)に懸濁し、封管中、85℃で一晩加熱した。反応混合物を冷却し、溶媒を真空下に除去し、褐色の固体を得、熱酢酸エチルで摩砕し、濾過し、乾燥して、淡褐色の固体(50 mg, 45%)として、表題の生成物を得た。
LC-MS 保持時間 = 2.436分; [M+H]⁺ 342
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 0.79 (t, 3H, J = 7.4 Hz), 1.01 (t, 3H, J = 7.2 Hz),
1.35 (m, 2H), 2.12 (s, 3H), 2.39 (m, 2H), 3.13 (m, 2H), 3.25 (s, 2H), 3.65 (s, 2H), 7.02 (s, 2H), 7.2-7.38 (m, 3H), 7.48 (s, 1H), 8.52 (t, 3H, J = 5.4 Hz)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Aを有した。

以下の化合物(表５)は、適当なアミンをプロピルアミンと置き換えて、実施例197の方法により作られた。表５の第4のカラムは、後記の蛍光偏光分析による化合物の活性を示す。
表５

実施例235

2-アミノ-4-[2,4-ジクロロ-5-(2-ジエチルアミノ-エトキシ)-フェニル]-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

工程１
1-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロ-5-ニトロ-ベンゼン

アセトン中の2,4-ジクロロ-5-ニトロフェノール(15.6g, 75mmol)の溶液に、炭酸カリウム(12g, 87mmol)を加えた。ベンジルブロマイド(9ml, 76mmol)を加え、懸濁液を油浴温度75℃で〜3時間加熱した。得られた懸濁液を冷却し、水(500ml)を加え、混合物をジクロロメタン(2×200ml)で抽出した。合わせた抽出液を水酸化ナトリウム水溶液(150ml, 2M)、水(2×200ml)および飽和食塩水(150ml)で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、淡黄色の固体(21.5g, 96%)まで濃縮した。
R_f 0.73 CH₂Cl₂ (SiO₂)

工程２
5-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロ-フェニルアミン

酢酸(300ml)/水(150ml)中のニトロベンゼン(21.5g, 72mmol)懸濁液に、鉄粉(21g, 376mmol)を加え、混合物を油浴温度85℃で〜90分間加熱した。得られた懸濁液を濾過した。濾液を冷却し、水(750ml)を加え、混合物をジクロロメタン(3×150ml)で抽出した。合わせた抽出液を水酸化ナトリウム水溶液(300ml, 2M)、水(2×500ml)および飽和食塩水(200ml)で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、淡黄色の固体(18.6g, 96%)まで濃縮した。
R_f 0.57 CH₂Cl₂ (SiO₂)

工程３
1-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロ-5-ヨード-ベンゼン

酢酸(240ml)中のアニリン(16.2g, 60mmol)溶液に、塩酸(60ml, 6M)を加え、得られた懸濁液を冷却(氷/水/塩)した。亜硝酸ナトリウム水溶液(40ml中4.8g, 69.5mmol)をゆっくり(温度<5⁰Cに保ちながら)加えた。添加終了後、得られた溶液を〜30分間撹拌した。
得られた溶液を水(200ml)中のヨウ化カリウム(20g, 120mmol)およびヨウ素(4g, 16mmol)の溶液に注ぎ、混合物を〜90分間撹拌した。水(800ml)を加え、混合物をジクロロメタン(3×250ml)で抽出した。合わせた抽出液をチオ硫酸ナトリウム水溶液(2×150ml, 10%)、
水酸化ナトリウム水溶液(250ml, 2M)、水(2×250ml)および飽和食塩水(200ml)で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、淡黄色の油状物まで濃縮し、放置しておくと固化した(20.6g, 90%)。
R_f 0.82 CH₂Cl₂ (SiO₂)

工程４
2-アミノ-4-(5-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

窒素雰囲気下、DMF(50ml)中のヨードベンゼン(20.6g, 54mmol)およびビス(ピナコラート)ジボロン(14.5g, 57mmol)の溶液に、酢酸カリウム(16g, 163mmol)を加えた。酢酸パラジウム(450mg, 触媒)を加え、混合物を油浴温度90℃で〜18時間加熱した。得られた溶液を濃縮し、残渣を酢酸エチル(200ml)中に採取し、溶液を水(3×200ml)および飽和食塩水(150ml)で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、淡褐色の粘性物質まで濃縮した。残渣を1,4-ジオキサン(160ml)中に採取し、窒素雰囲気下、2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(12.85g, 50mmol)およびリン酸カリウム水溶液(40ml, 2M)を加えた。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) (触媒)を加え、混合物を油浴温度100℃で〜3時間加熱した。混合物を冷却し、酢酸エチル(400ml)を加えた。混合物を飽和食塩水(100ml)で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、淡黄色の固体まで濃縮した。固体をジエチルエーテル/ヘキサン(1:1)で洗浄し、オフホワイトの固体を得た。真空下に乾燥(40℃)した。10.7g (45%)
R_f 0.13 EtOAc/Hex (1:3) (SiO₂)
LC 保持時間 2.891分 [M+H]⁺ 474.1/476.1 (運転時間 3.75分間)

工程５
2-アミノ-4-(2,4-ジクロロ-5-ヒドロキシ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

メタノール性エチルアミン(〜2M)中の2-アミノ-4-(5-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロフェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステルの懸濁液を、〜75℃で〜18時間加熱した。得られた溶液を濃縮し、残渣をジエチルエーテル/ヘキサンで摩砕し、淡褐色の粉末を得た。
LC 保持時間 2.654分 [M+H]⁺ 475.1/ 473.1 (運転時間 3.75分間)

窒素雰囲気下、-78℃で、ジクロロメタン中の2-アミノ-4-(5-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロフェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジンン-6-カルボン酸エチルアミド懸濁液に、3塩化ホウ素溶液(ジクロロメタン中1M)を加えた。懸濁液を室温で〜3時間撹拌した。懸濁液を氷で冷却し、メタノールを加え、得られた混合物を〜1時間撹拌し、黄緑色の固体まで濃縮した。固体を酢酸ナトリウム水溶液(10%)に懸濁し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を水および飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、淡褐色の固体まで濃縮し、ヘキサンで洗浄し、真空下に乾燥した。
LC 保持時間 2.180分 [M+H]⁺ 385/383 (運転時間 3.75分間)

工程６
2-アミノ-4-[2,4-ジクロロ-5-(2-ジエチルアミノ-エトキシ)-フェニル]-チエイノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

DMF中の2-アミノ-4-(2,4-ジクロロ-5-ヒドロキシフェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミドの溶液に、炭酸セシウムを加え、2-ブロモ-N,N-ジエチルエチルアミン臭化水素酸塩を加え、懸濁液を〜140℃で〜2時間加熱した。得られた懸濁液を冷
却し、ジクロロメタンを加えた。混合物を水および飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し。暗褐色の粘性物質まで濃縮した。粗生成物を、ジクロロメタンおよびメタノールの混液で溶出するシリカのクロマトグラフィーで精製した。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 0.96 (t, 6H, J = 7.1 Hz), 1.07 (t, 3H, J = 7.2 Hz),
2.55 (q, 4H, J = 7.1 Hz), 2.81 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 3.22 (m, 2H), 4.12 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 7.23 (s, 2H), 7.38 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 8.54 (t, 1H, J = 5.5 Hz)
LC 保持時間 1.774分 [M+H]⁺ 484/482 (運転時間 3.75分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Aを有した。

実施例236
2-アミノ-4-[2,4-ジクロロ-5-(2-モルホリン-4-イル-エトキシ)-フェニル]-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

工程１
2-アミノ-4-[2,4-ジクロロ-5-(2,2-ジエトキシ-エトキシ)-フェニル]-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

アセトニトリル中の2-アミノ-4-(2,4-ジクロロ-5-ヒドロキシフェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミドの懸濁液に、カリウムtert-ブトキシドを加え、ブロモアセトアルデヒドジエチルアセタールを加え、懸濁液を〜8時間、還流下に加熱した。得られた懸濁液を冷却し、水を加え、混合物を酢酸エチルで抽出し、抽出液を水および飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、赤褐色の粘性物質まで濃縮した。粗生成物を、酢酸エチルおよびヘキサンの混液で溶出するシリカのクロマトグラフィーで精製した。
LC 保持時間 2.614分 [M+H]⁺ 501/499 (運転時間 3.75分間)

工程２
2-アミノ-4-[2,4-ジクロロ-5-(2-モルホリン-4-イル-エトキシ)-フェニル]-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド
THF中の2-アミノ-4-(2,4-ジクロロ-5-(2,2-ジエトキシエトキシ)-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミドの溶液に塩酸を加え、溶液を〜18時間撹拌した。モルホリンを加え、溶液を撹拌し、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを加え、得られた懸濁液を〜18時間撹拌した。ジクロロメタンを加え、混合物をアンモニア水(0.880)、水および飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、淡黄色の固体まで濃縮した。粗生成物を酢酸エチルおよびヘキサンの混液で溶出するシリカのクロマトグラフィーで精製した。
LC 保持時間 1.795分 [M+H]⁺ 498/496 (運転時間 3.75分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Aを有した。

実施例237
2-アミノ-4-[2,4-ジクロロ-5-(2-ジエチルアミノ-エトキシ)-フェニル]-チエイノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸イソプロピルアミド

工程１
2-アミノ-4-(5-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸

2-アミノ-4-(5-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(実施例235工程４)に、水酸化ナトリウム(0.190 g; 4.75 mmol)を加えた。エタノール(25 ml)、次いで水(2.5 ml)を加え、反応混合物を1時間加熱還流した。反応混合物を冷却し、溶媒を真空下に除去した。得られた残渣を水に溶解し、氷-水浴中で撹拌し、37%(水性)塩酸溶液を滴下し中和した。反応混合物を凍結乾燥して、黄色の粉末(2当量のNaClを含有)として生成物(1.33 g; 100%)を得た。
LC 保持時間 2.579分 [M+H]⁺ 448/446 (運転時間 3.75分間)

工程２
2-アミノ-4-(5-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸イソプロピルアミド

2-アミノ-4-(5-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸・2NaCl(1.33 g; 2.38 mmol)に、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(1.176 g; 3.07 mmol)を加え、次いで、DMF(25 ml)を加え濁褐色の溶液を得た。イソプロピルアミン(1.01 ml; 11.9 mmol)を加え、反応混合物を60℃(油浴温度)で18時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、真空下にDMFを除去した。残渣を酢酸エチル(200 ml)および水(200 ml)の分配した。相を分離し、有機相を飽和食塩水(200 ml)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濾液溶媒を真空下に濃縮し、黄色の固体を得た。粗生成物を、ヘキサン中20〜50%の酢酸エチルの溶媒勾配で溶出する、シリカゲル(50g IST Flash Si カートリッジ)のフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、無色の固体(0.612 g; 53%)として生成物を得た。
LC 保持時間 2.756分 [M+H]⁺ 489/487 (運転時間 3.75分間)

工程３
2-アミノ-4-(2,4-ジクロロ-5-ヒドロキシ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸イソプロピルアミド

実施例235の工程５のようにして、2-アミノ-4-(5-ベンジルオキシ-2,4-ジクロロ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸イソプロピルアミド(0.594 g)から製造した。生成物を、ヘキサン中20〜100%の酢酸エチルの溶媒勾配で溶出する、シリカゲル(20g
IST Flash Siカートリッジ)のフラッシュクロマトグラフィーで精製した。これにより、無色の固体(0.350 g; 72%)として生成物を得た。
LC 保持時間 2.353分 [M+H]⁺ 399/397 (運転時間 3.75分間)

2-アミノ-4-[2,4-ジクロロ-5-(2-ジエチルアミノ-エトキシ)-フェニル]-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸イソプロピルアミド

実施例235の工程６のようにして、2-アミノ-4-(2,4-ジクロロ-5-ヒドロキシ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸イソプロピルアミド(0.100 g)から製造した。生成物をプレパラティブHPLCで精製した。
LC 保持時間 1.965分 [M+H]⁺ 498/496 (運転時間 3.75分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Aを有した。

以下の化合物(表６)は、実施例235、236および237の方法を利用して作られた。
表６の第4のカラムは、後記の蛍光偏光分析における化合物の活性を示す。
表６

実施例272
2-アミノ-4-[2,4-ジクロロ-5-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-フェニル]-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

THF中の2-アミノ-4-(2,4-ジクロロ-5-(2,2-ジエトキシエトキシ)-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミドの溶液に塩酸を加え、溶液を〜18時間撹拌した。ジクロロメタンを加え、混合物を撹拌し、水素化ホウ素ナトリウムを加え、得られた懸濁液を〜5時間撹拌した。ジクロロメタンを加え、混合物を飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリルムで乾燥し、淡黄色の固体まで濃縮した。粗生成物をプレパラティブHPLCで精製して、オフホワイトの固体として生成物を得た。
LC 保持時間 2.124分 [M+H]⁺ 428.9/426 (運転時間 3.75分間)

実施例273
2-アミノ-4-[2,4-ジクロロ-5-(1-メチル-ピペリジン-2-イルメトキシ)-フェニル]-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

乾燥テトラヒドロフラン(10 ml)中の2-アミノ-4-(2,4-ジクロロ-5-ヒドロキシ-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド(30 mg, 0.08 mmol)および(1-メチル-ピペリジン-2-イル)-メタノール(12 mg, 0.09 mmol)の混合物に、トリフェニルホスフィン(33 mg, 0.13mmol)を加えた。乾燥テトラヒドロフラン中のジエチルアゾジカルボキシレート(0.021 ml, 0.13mmol)を、室温で30秒間隔で滴下した。次いで、混合物を室温で30分間撹拌し、その時に酢酸エチル(30 ml)を加え、得られた溶液を1M 重炭酸ナトリウム溶液(30 ml)、次いで飽和食塩水(30 ml)で洗浄した。得られた有機体を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、黄色の油状物を得、プレパレティブLCMSで精製して、白色の固体(20.4 mg, 53%)を得た。
LC 保持時間 1.84分、[M+H]⁺ 494
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Aを有した。

実施例274

2-アミノ-4-(2,4-ジメチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-スルホン酸シクロプロピルアミド

工程１
2-アミノ-4-クロロ-6-(2,4-ジメチル-フェニル)-ピリミジン-5-カルバルデヒド

窒素雰囲気下、1,4-ジオキサン中の2,4-ジメチルベンゼンボロン酸および2-アミノ-4,6-ジクロロ-5-ピリミジンカルバルデヒド(3 当量)の懸濁液に、リン酸カリウム水溶液を加えた。ジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II) (触媒)を加え、混合物を〜100℃で、〜90分間加熱した。得られた混合物を冷却し、ジクロロメタンを加え、混合
物を水および飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、淡黄色の固体まで濃縮した。粗固体を、ジエチルエーテルおよびヘキサンの混液で溶出するカラムクロマトグラフィーで精製した。
LC 保持時間 2.354分 [M+H]⁺ 262.0 (運転時間 3.75分間)

工程２
2-アミノ-4-(2,4-ジメチル-フェニル)-6-メルカプト-ピリミジン-5-カルバルデヒド

DMF中の硫化ナトリウム(5当量)の懸濁液に、2-アミノ-4-クロロ-6-(2,4-ジメチルフェニル)-ピリミジン-5-カルバルデヒドを加え、混合物を〜60分間撹拌し、黄色の懸濁液を得た。懸濁液を水に注ぎ、溶液を濾過した。濾液を酢酸で酸性とし、黄色の沈殿物を得た。固体を濾過により取り出し、水およびヘキサンで洗浄し、真空下に乾燥して、黄色の粉末を得た。
LC 保持時間 2.048分 [M+H]⁺ 260.0 (運転時間 3.75分間)

工程３
C-[2-アミノ-6-(2,4-ジメチル-フェニル)-5-ホルミル-ピリジジン-4-イルスルファニル]-N-シクロプロピル-メタンスルホンアミド

DMF中の 2-アミノ-4-(2,4-ジメチルフェニル)-6-メルカプト-ピリミジン-5-カルバルデヒドの溶液に、炭酸水素ナトリウムを加え、懸濁液を撹拌した。C-ブロモ-N-シクロプロピル-メタンスルホンアミドを加え、混合物を〜85℃で、〜3時間加熱した。得られた懸濁液を冷却し、酢酸エチルを加え、混合物を水および飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、淡黄色の固体まで濃縮した。粗固体を、酢酸エチルおよびヘキサンの混液で溶出するカラムクロマトグラフィーで精製した。
LC 保持時間 2.413分 [M+H]⁺ 393.0 (運転時間 3.75分間)

工程４
2-アミノ-4-(2,4-ジメチル-フェニル)-チエノ[2,3-d]ピリンミジン-6-スルホン酸シクロプロピルアミド

ジクロロメタン中のC-[2-アミノ-6-(2,4-ジメチルフェニル)-5-ホルミル-ピリミジン-4-イルスルファニル]-N-シクロプロピル-メタンスルホンアミドの懸濁液にピリジンを加え、混合物を氷/水で冷却した。トリフルオロ酢酸無水物を加え、混合物を〜2時間撹拌し、〜24時間還流下に加熱した。得られた暗赤色の溶液を冷却し、アンモニア水(0.880)を加え、混合物を〜30分間撹拌した。ジクロロメタンを加え、混合物を希塩酸、水および飽和食塩水で洗浄した。溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、赤/橙色の固体まで濃縮した。粗固体をプレパラティブHPLCで精製した。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 0.40-0.45 (m, 2H), 0.50-0.55 (m, 2H), 2.22 (s, 3H),
2.27 (m, 1H), 2.36 (s, 3H), 7.17 (bd, 1H, J = 7.6 Hz), 7.18 (s, 1H), 7.21 (bs, 1H), 7.28 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.34 (s, 2H), 8.16 (bs, 1H)
LC 保持時間 2.478分 [M+H]⁺ 375.0 (運転時間 3.75分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性Aを有した。

実施例275
2-アミノ-4-フェネチル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

工程１
2-アミノ-4-スチリル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

DMF中の2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(0.193g, 0.75mmol.)およびアルファ-フェニルビニルボロン酸(0.17g, 1.5当量)の溶液に、室温で1M 炭酸水素ナトリウム溶液(1.88 ml, 2.5当量)、次いで、ビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロライド(26mg, 0.05当量)を加えた。85℃に加熱して、10時間撹拌する前に、混合物に窒素を5分間バブルした。冷却した溶液を酢酸エチルおよび水で分配し、合わせた有機体を水および食塩水で洗浄し、Isolute SCX IIイオン交換カラムに直接充填した。メタノール中の1M アンモニアで溶出し、真空下に蒸発して、純粋な生成物を橙色の粉末(0.169g, 70%)として回収した。
¹H NMR (CDCl₃) δ= 8.03 (1H, s); 8.03 (1H, d, J = 15Hz); 7.59 (2H, m); 7.41-7.30
(4H, m); 5.19 (2H, ブロード s); 4.31 (2H, q, J = 7.1 Hz)および1.35 (3H, t, J = 7.1Hz).
LCMS 保持時間 7.47分, [M+H]⁺ = 326.12 (運転時間 15分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「A」を有した。

工程２
2-アミノ-4-フェネチル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステス

エタノール中の2-アミノ-4-スチリル-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(78mg, 0.18mmol)に、5% パラジウム/活性炭(51mg)を加え、水素雰囲気下、一晩撹拌した。懸濁液をセライトで濾過し、揮発性物を真空下に除去し、残渣をセミ−プレパラティブHPLCを使って精製して、橙色の粉末として純粋な生成物を得た。
¹H NMR (CDCl₃) δ = 7.82 (1H, s); 7.35-7.11 (5H, m); 5.33 (2H, ブロード s); 4.40
(2H, q, J = 7.1 Hz); 3.26 (2H, m); 3.22 (2H, m)および1.43 (3H, t, J = 7.1Hz)
LCMS 保持時間 7.11分, [M+H]⁺ = 327.92 (運転時間 15分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「A」を有した。

以下の化合物(表７)は、適当なボロン酸またはボロネートエステルに置き換えて、実施例275の方法により作られた。対応するアミドは、エステル(実施例235の工程５)から直接、または加水分解(実施例43の工程１)、次いでアミンカップリング(実施例43の工程２)により合成し、セミ−プレパラティブHPLCで精製した。表７の４番目のカラムは、後記の蛍光偏光分析での活性を示す。
表７

実施例294
2-アミノ-4-(1H-インドール-3-イル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

工程１
2-アミノ-4-(1-ベンゼンスルホニル-1H-インドール-3-イル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

1-(フェニルスルホニル)-3-インドールボロン酸および実施例275の工程１を用いて、所
望の生成物を、橙色の固体化合物(105g, 29%)として合成した。
LCMS 保持時間 7.72分, [M+H]⁺ = 478 (運転時間 15分間)

工程２
2-アミノ-4-(1H-インドール-3-イル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸

エタノール(6ml)中の 2-アミノ-4-(1-ベンゼンスルホニル-1H-インドール-3-イル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(80mg, 0.17mmol)の溶液を65℃に加熱し、2M水酸化カリウム(0.25ml, 3当量)を加え、一晩撹拌した。水を加え、揮発性物を真空下に除去した。次いで、溶液を中性にし、凍結乾燥した。
LCMS 保持時間 5.72分, [M+H]⁺ = 311.07 (運転時間 15分間)

工程３
2-アミノ-4-(1H-インドール-3-イル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

粗2-アミノ-4-(1H-インドール-3-イル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸をエタノール(2ml)に溶解し、濃硫酸(５滴)を加えた。溶液を一晩還流し、水を加え、揮発性物を真空下に除去した。水溶液を1M 炭酸水素ナトリウム溶液および酢酸エチルで分配した。有機体を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発乾固した。プレパラティブTLCにより、純粋な化合物をオフホワイト色の粉末として得た。
¹H NMR (d₆-DMSO) δ = 11.93 (1H, ブロード s); 8.62 (1H, d, J = 7.5 Hz); 8.43 (1H, s); 8.27 (1H, s); 7.53 (1H, d, J = 7.5 Hz); 7.27-7.15 (1H + 1H + 2H, m); 4.34 (2H, q, J = 7.1 Hz)および1.34 (3H, t, J = 7.1 Hz).
LCMS 保持時間 6.70分, [M+H]⁺ = 339.08 (運転時間 15分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「B」を有した。

実施例294
2-アミノ-4-ベンジルオキシ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

工程１
2-アミノ-4-ベンジルオキシ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸

無水THF(5ml)中の水素化ナトリウム(0.5mmol, 鉱油中60%)を含む窒素で満たされたフラスコに、ベンジルアルコール(0.5mmol)を加えた。気体の発生がなくなるまで、懸濁液を10分間激しく撹拌し、次いで、2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(0.129g, 0.5mmol)を含むマイクロウエーブ反応管に移した。封がされた管をCEMマイクロウエーブ装置(CARE!)中、300Wにより90℃で5分間加熱した。反応混合物をDCMおよび水で分配し、水層を中性にし、真空下に蒸発乾固し、純粋な生成物を得た。
LCMS 保持時間 6.35分, [M+H]⁺ = 301.93 (運転時間 15分間)

工程２
2-アミノ-4-ベンジルオキシ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルアミド

アミドは、実施例43の工程２に示されたHATUカップリング条件を用いて合成され、カラムクロマトグラフィーで精製された。
¹H NMR (CDCl₃) δ = 7.49 (1H, s); 7.39-7.25 (5H, m); 6.03 (1H, ブロード t, J = 5
Hz); 5.39 (2H, s); 5.15 (2H, ブロード s); 3.38 (2H, dq, J = 5.7 HzおよびJ = 7.2
Hz); 1.14 (3H, t, J = 7.2 Hz)
LCMS 保持時間 6.34分, [M+H]⁺ = 329.05 (運転時間 15分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「B」を有した。

実施例295
2-アミノ-4-(4-クロロ-ベンゾイル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

DMF中の 2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(1モル当量)、p-クロロベンズアルデヒド(1モル当量)および3-エチル-1-メチル-3H-イミダゾール-1-イウムブロマイド(0.3モル当量)の溶液に、水素化ナトリウム(1.1モル当量, 鉱油中60%)を室温で加えた。溶液は直ちに暗色に変わり、3時間撹拌し、その間にそれは橙色の溶液に変わった。これを焼結ガラス漏斗で濾過し、食塩水を加え、得られた沈殿を濾過し乾燥した。得られた黄色の固体をプレパラティブTLCまたはプレパラティブHPLCのどちらかで精製した。
¹H NMR (d₆-アセトン) δ = 8.11 (2H, d, J = 8.8 Hz); 8.03 (1H, s); 7.57 (2H, d, J
= 8.8 Hz); 6.86 (2H, s); 4.33 (2H, q, J = 7.0 Hz)および1.34 (3H, t, J = 7.0 Hz)LCMS 保持時間 7.49分, [M+H]⁺ = 362.06 (運転時間 15分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「A」を有した。

以下の化合物(表８)は、適当なベンズアルデヒドに置き換えて、実施例295の方法により作られた。表８の第4番目のカラムは、後記の蛍光偏光分析による化合物の活性を示す。

表８

実施例315
2-アミノ-4-(1-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-1-ヒドロキシ-エチル)-チエイノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

窒素雰囲気下、2-アミノ-4-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-カルボニル)-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(実施例312) (100mg)を無水THFに溶解し、その後、メチルマグネシウムブロマイド(ジエチルエーテル中3.0M溶液, 5当量)を加えた。溶液を40℃で一晩撹拌し、その後、10%塩化アンモニウム水溶液および酢酸エチルで分配した。有機層を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させて粗生成物を得、それをプレパラティブTLCで精製して、所期の化合物を黄色の粉末として得た。
¹H NMR (d₆-アセトン) δ = 8.04 (1H, s); 6.94 (1H, d, J = 7.7 Hz); 6.91 (1H, s); 6.64 (1H, d, J = 7.7 Hz); 6.50 (2H, ブロード s); 5.81 (2H, s); 5.46 (1H, s); 4.17 (2H, q, J = 7.1 Hz); 1.81 (3H, s)および1.19 (3H, t, J = 7.1 Hz)
LCMS 保持時間 6.37分, (LCMS中でH₂Oの脱離) [M+H]⁺ = 370.07 (運転時間 15分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「A」を有した。

実施例316
2-アミノ-4-(ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-シアノ-メチル)-チエノ[2,3-d]ピリミジ
ン-6-カルボン酸エチルエステル

DMF中の 2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(1当量)およびベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-アセトニトリル(1モル当量)の溶液に、水素化ナトリウム(1.1モル当量,鉱油中 60%)を室温で加えた。アルゴン下、混合物をこの温度で一晩撹拌した。その後、食塩水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機部分を合わせ、食塩水および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過および溶媒の蒸発後、褐色の固体を得、プレパラティブTLCまたはプレパラティブHPLCのどちらかで精製した。
¹H NMR (d₆-アセトン δ = 7.76 (1H, s); 6.84 (1H, d, J = 8.0 Hz); 6.56 (1H+1H+1H,
m); 6.10 (1H, d, J = 1.0 Hz); 6.05 (1H, d, J = 1.0 Hz); 4.30 (2H, q, J = 7.0 Hz)および1.30 (3H, t, J = 7.0 Hz)
LCMS 保持時間 7.04分, [M+H]⁺ = 383.06 (運転時間 15分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「A」を有した。

以下の化合物(表９)は、適当なアセトニトリルに置き換えて、実施例316の方法により作られた。表９の第4番目のカラムは、後記の蛍光偏光分析における化合物の活性を示す。

表９

実施例319
2-アミノ-4-シアノ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル

DMA中で、2-アミノ-4-クロロ-チエノ[2,3-d]ピリミジン-6-カルボン酸エチルエステル(1当量)、Zn(CN)₂ (0.6当量)、 Zn粉末(0.12当量)、Pd₂(dba)₃ (0.02モル当量)および1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン(0.04当量)を混合し、アルゴン下、混合物を120℃で24時間撹拌した。得られた懸濁液を短いセライトカラムで濾過し、濾液を食塩水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。次いで、有機層を食塩水、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒の蒸発後、粗油状物をプレパラティブTLCで精製した。
¹H NMR (d₆-アセトン) δ = 7.92 (1H, s); 7.08 (1H, s); 4.42 (2H, q, J = 7.0 Hz)および1.40 (3H, t, J = 7.0 Hz)
LCMS 保持時間 6.10分 [M+H]⁺ = 249.04 (運転時間 15分間)
この化合物は、後記の蛍光偏光分析で活性「A」を有した。

蛍光偏光分析法
蛍光偏光[蛍光異方性としても知られている]は、溶液中の蛍光発光種の回転を測定する。この場合、分子が大きいほど、蛍光発光をより偏光させる。蛍光体が偏光で励起されるときに、発光もまた偏光される。分子サイズは蛍光発光の偏光に比例する。

蛍光標識プローブ−RBT0045864-FAM−

がHSP90[全長ヒト、全長酵母またはN-末端ドメインのHSP90]と結合し、その異方性[プローブ:蛋白質複合体の回転]が測定される。
試験化合物を分析プレートに加え、平衡状態にし、その異方性を再度測定する。異方性の変化は、化合物のHSP90との競合的な結合(それによりプローブが遊離する)に由来する。

材料
試薬は市販品で最高純度のものであり、全ての水溶液はAR水を用いて調製される。
1) コスター 96-ウェル ブラック分析プレート#3915
2) (a)100mM Tris pH7.4； (b)20mM KCl； (c)6mM MgCl₂の分析緩衝液、室温で保存
3) BSA(ウシ血清アルブミン)10mg/ml(New England Biolabs # B9001S)
4) 100%DMSO中の20mMプローブ貯蔵濃度。暗所、RTで貯蔵。作業濃度はAR水で希釈し200nMであり、4℃で貯蔵。分析での最終濃度は80nM。
5) E.coliにより発現されたヒト全長HSP90蛋白質、95%以上に精製し(例えば、Panaretouら、1998参照)、50μLに分割して-80℃で保存

プロトコール
1) 100μl 1×緩衝液をウェル11Aおよび12A(=FP BLNK)に加える。
2) 分析混合物を調製−プローブが光感受性なので、全試薬はバケツに蓋をして氷上で保存される。

3) 全ての他のウェルに100μlの分析混合物を分割
4) プレートで覆い、平衡状態にするために暗所、室温で20分間放置

化合物希釈プレート−1×3の一連の希釈
1) きれいな96-ウェルv底プレート−[#VWR007/008/257]のウェルB1〜H11に100%DMSO 10μlを加える。
2) ウェルA1〜A11に100%DMSO 17.5μlを加える。
3) 2.5μlのcpdをA1に加える。これはcpds 20mMと仮定して、2.5mM[50×]貯蔵cpdを与える。
4) ウェルA2〜A10に対して繰り返す。列11および列12は対照。
5) 列12を除いた行Aから行Bに5μlを移す。よく混合。
6) 行Bから行Cへ5μlを移す。よく混合。
7) 行Gまで繰り返す。
8) 行Hには化合物を加えない−これが0行。
9) これにより50μM〜0.07μMの1×3の一連の希釈ができる。
10) ウェルB12に100μM標準化合物溶液20μlを調製する。
11) 最初のインキュベーション後、分析プレートをFusion^TM a-FP plate reader(Packard
BioScience、Pangbourne、Berkshire、UK)で読み取る。
12) 最初の読み取り後、希釈された化合物の2μlを列1〜列10の各ウェルに加える。列11[検量線を与える]において、B11〜H11にだけ化合物を加える。100mM標準cpdの2μlをウェルB12からH12(陽性対照である)に加える。
13) Z'因子は0対照および陽性ウェルから計算される。それは典型的に0.7〜0.9の値を与える。
上記の分析で試験された化合物に対して、二つの活性範囲、すなわちA=＜10μM；B=＞10μMのうちの一つが割り当てられ、これらの割り当てが上に報告されている。

増殖阻害分析も、HSP90阻害剤候補の分析に使用された。
スルホロダミンＢ(SRB)分析による細胞毒性試験：50%阻止濃度(IC₅₀)の計算
1日目
1) 血球計数器により細胞数を決定する。
2) ８チャンネルマルチピペッターを用いて、細胞懸濁液(3600細胞/ウェルまたは2×10⁴細胞/ml)の160μlを96-ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加える。
3) CO₂インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートする。

2日目
4) 薬物の貯蔵溶液を調製し、各薬物の連続希釈を媒体中で行い、ウェル中に最終濃度のものを作成した。
5) マルチピペッターを用いて、薬物の40μl(5×最終濃度で)を四重のウェルに加える。
6) 対照ウェルは96ウェルプレートのいずれかの端であり、ここに媒体の40μlを加える。7) CO₂インキュベーター中で4日間(48時間)、プレートをインキュベートする。

6日目
8) 媒体を流しに捨て、プレートを10%氷冷トリクロロ酢酸(TCA)中にゆっくりと浸す。氷上で約30分間放置する。
9) プレートを水道水浴に浸した後、それを捨てることによって、プレートを水道水で3回洗浄する。
10) インキュベーター中で乾燥する。
11) 1%酢酸中の0.4%SRBの100μlを各ウェルに加える(96ウェルプレートの最後の行(右側)を除いて、これは0%対照、すなわち無薬物、無染色である。一番目の行は、無薬物だが有染色の100%対照となる)。15分間放置する。
12) 結合しなかったSRB染色剤を1%酢酸で4回洗浄して洗い流す。
13) インキュベーター中でプレートを乾燥する。
14) 10mMのTrisベースの100μlを用いてSRBを可溶化し、プレートをプレート振盪器の上に5分間置く。
15) プレートリーダーを用いて540nmでの吸光度を測定する。四重のウェルの平均吸光度を計算し、対照の未処理のウェルに対する値のパーセントとして表す。
16) 対数薬物濃度に対する吸光度％をプロットし、IC₅₀を決定する。
説明した方法により、実施例２の化合物は、SRB増殖阻止評価で「A」の範囲(<50μM)のIC50を示した。

参考文献
本発明、および本発明が属する技術の状況を、より十分に記載し、開示するために、多くの刊行物を上で引用している。これら参考文献の完全な引用を以下に示す。これらの参考文献の各々が、本明細書の中で完全に言及され、ここに組み込まれている。

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Claims (33)

1. 式(I)：
   

   

   ［式中、
   R₂は、式(IA):
   -(Ar¹)_m-(Alk¹)_p-(Z)_r-(Alk²)_s-Q (IA)
   （ここで、
   Ar¹は下記A)の置換基で置換されていてもよいフェニルまたは下記B)で定義されるヘテロアリール基であり、
   Alk¹およびAlk²は下記A)の置換基で置換されていてもよい2価のC₁-C₃アルキレンまたはC₂-C₃アルケニレン基であり、
   m、p、rおよびsは独立して0または1であり、
   Zは-O-、-S-、-(C=O)-、-(C=S)-、-SO₂-、-C(=O)O-、-C(=O)NR^A-、-C(=S)NR^A-、-SO₂NR^A-、-NR^AC(=O)-、-NR^ASO₂-または-NR^A-（ここで、R^Aは水素またはC₁-C₆アルキルである）であり、そして
   Qは水素または下記A)の置換基で置換されていてもよいフェニルもしくはC₃-C₈シクロアルキル、または下記C)で定義されるヘテロ環式基である）
   の基であり；
   R₃は水素、下記A)の置換基、または下記A)の置換基で置換されていてもよい(C₁-C₆)アルキル、フェニルもしくは下記B)で定義されるヘテロアリール基であり；そして
   R₄は、
   (i) 式-COOR^C（ここで、R^CはC₁-C₆アルキルもしくはC₂-C₆アルケニル基、または下記A）の置換基で置換されていてもよいアリールもしくは下記B)で定義されるヘテロアリール基、または下記A)の置換基で置換されていてもよいアリール(C₁-C₆アルキル)-もしくは下記B)で定義されるヘテロアリール(C₁-C₆アルキル)-基、または下記A)の置換基で置換されていてもよいシクロアルキル基である）のカルボキシエステル基、
   (ii) 式-CONR^B(Alk)_nR^Aのカルボキシアミド基または式-SO₂NR^B(Alk)_nR^Aのスルホンアミド基（ここで、Alkは下記A）の置換基で置換されていてもよい2価のアルキレン、アルケニレンもしくはアルキレン基であり、nは0または1であり、R^Bが水素、C₁-C₆アルキルまたはC₂-C₆アルケニルであり、R^Aは水素、ヒドロキシまたは下記A)の置換基で置換されていてもよい、単環式アリール、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくは下記C)で定義されるヘテロ環式であるか、またはR^AおよびR^Bはそれらが結合している窒素原子と一緒になって、モルホリノ、ピペリジニルもしくはピラジニル環を形成し、1以上の環CまたはN原子上で下記A)の置換基で置換されていてもよい）であり、
   A) 上記の置換基は、(C₁-C₆)アルキル、(C₁-C₆)アルコキシ、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C₁-C₆)アルキル、メルカプト、メルカプト(C₁-C₆)アルキル、(C₁-C₆)アルキルチオ、ハロゲン、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ニトロ、ニトリル(-CN)、オキソ、フェニル、-COOH、-COOR^A、-COR^A、-SO₂R^A、-CONH₂、-SO₂NH₂、-CONHR^A、-SO₂NHR^A、-CONR^AR^B、-SO₂NR^AR^B、-NH₂、-NHR^A、-NR^AR^B、-OCONH₂、-OCONHR^A、-OCONR^AR^B、-NHCOR^A、-NHCOOR^A、-NR^BCOOR^A、-NHSO₂OR^A、-NR^BSO₂OR^A、-NHCONH₂、-NR^ACONH₂、-NHCONHR^B、-NR^ACONHR^B、-NHCONR^AR^Bまたは-NR^ACONR^AR^B（ここで、R^AおよびR^Bは独立して(C₁-C₆)アルキル基である）から独立して選択される置換基であり、
   B) 上記のヘテロアリールは、チエニル、ベンゾチエニル、フリル、ベンゾフリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、ベンズオキサゾリル、イソキサゾリル、ベンズイソキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、ベンゾトリアゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、インドリルまたはインダゾリルを意味し、
   C) 上記のヘテロ環式基は、上記B)のヘテロアリールまたはピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、ピペラジニルもしくはメチレンジオキシフェニルを意味する］
   の化合物またはその塩、N-オキシド、水和物もしくは溶媒和物を含む、インビトロまたはインビボでのHSP90活性阻害用の組成物。
2. 免疫抑制のための、またはウイルス病、慢性関節リウマチ、喘息、多発性硬化症、I型糖尿病、狼瘡、乾癬、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、糖尿病性網膜症、血管腫もしくは子宮内膜症の治療、または化学療法により誘発される毒性からの正常細胞の保護；または心臓および脳のHsp70の上昇による低酸素−虚血性傷害からの保護、スクラピー／ＣＪＤ、ハンチントン病またはアルツハイマー病のための、請求項1に記載の組成物。
3. 癌の治療のための、請求項1に記載の組成物。
4. 化合物(I)において、mが1であり、p、rおよびsがそれぞれ0であり、Qが水素である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の組成物。
5. 化合物(I)において、R₂が請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいフェニル、2-もしくは3-チエニル、2-もしくは3-フラニル、2-、3-もしくは4-ピリジニル、モルホリニル、またはピペリジニルである、請求項1〜4のいずれか1つに記載の組成物。
6. 化合物(I)において、R₂が、メチル、エチル、n-もしくはイソプロピル、ビニル、アリル、メトキシ、エトキシ、n-プロピルオキシ、ベンジルオキシ、アリルオキシ、シアノメトキシ、クロロ、ブロモ、シアノ、ホルミル、メチル-、エチル-もしくはn-プロピル-カルボニルオキシ、メチル-もしくはエチル-アミノカルボニル、および式-O(CH₂)_nZ¹（ここで、nは1、2または3であり、Z¹は一級、二級、三級もしくは環状のアミノ基であるか、またはC₁-C₆アルコキシ基である）、または式-(Alk³)_mZ¹（ここで、Alk³は2価の直鎖または分枝鎖(C₁-C₃)アルキレンであり、mは0または1であり、Z¹は一級、二級、三級もしくは環状のアミノ基であるか、またはC₁-C₆アルコキシ基である）の置換基から選択される1以上の置換基で置換されていてもよいフェニルである、請求項5に記載の組成物。
7. 請求項1のA)に記載の置換基が、フェニル環の2-および/または4-および/または5-位にある、請求項6に記載の組成物。
8. 化合物(I)において、mが1であり、p、rおよびsが0であり、Qが請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいフェニルもしくはC₃-C₈シクロアルキル、または請求項1のC)で定義されたヘテロ環式基である、請求項1〜7のいずれか1つに記載の組成物。
9. 化合物(I)において、Ar¹がフェニルまたはピリジル環である、請求項１〜8のいずれか1つに記載の組成物。
10. 化合物(I)において、R₃が水素である、請求項1〜9のいずれか1つに記載の組成物。
11. 化合物(I)において、
    R₄が、式-CONR^B(Alk)_nR^Aのカルボキシアミド基または式-SO₂NR^B(Alk)_nR^Aのスルホンアミド基であり、
    Alkが請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH=CH-または-CH₂CCCH₂-であり、
    R^Bが水素またはメチル、エチル、n-もしくはイソ-プロピル、またはアリルであり、
    R^Aが水素、ヒドロキシまたは請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいフェニル、3,4-メチレンジオキシフェニル、ピリジル、フリル、チエニル、N-ピペラジニルまたはN-モルホリニルであるか、
    またはR^AおよびR^Bはそれらが結合している窒素原子と一緒になって、モルホリノ、ピペリジニルもしくはピラジニル環を形成し、1以上の環CまたはN原子上で請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい、
    請求項11に記載の組成物。
12. 化合物(I)において、R₄が式-COOR^C（ここで、R^Cは請求項1のA）に記載の置換基で置換されていてもよいメチル、エチル、n-もしくはイソ-プロピル、アリル、フェニル、ピリジル、チアゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルである）のカルボキシエステル基である、請求項1〜10のいずれか1つに記載の組成物。
13. 化合物(I)が、式(II)：
    

    

    ［式中、
    AはC₁-C₆アルキルアミノ基であり；
    R₁₀はH、Cl、BrまたはCH₃であり；
    R₁₁は水素、Cl、Br、CN、メチル、エチル、n-もしくはイソ-プロピル、ビニルまたはアリルであり；
    R₁₂は、(i)式-O(CH₂)_nZ¹（ここで、nは1、2または3であり、Z¹は一級、二級、三級もしくは環状のアミノ基であるか、またはC₁-C₆アルコキシ基である）の基；あるいは(ii)式-(Alk³)_mZ¹（ここで、Alk³は2価の直鎖もしくは分枝鎖(C₁-C₃)アルキレンであり、mは0または1であり、そしてZ¹は一級、二級、三級もしくは環状のアミノ基、またはC₁-C₆アルコキシ基である）の基である］
    である、請求項1〜3のいずれか1つに記載の組成物。
14. 化合物(II)において、R₁₂が(i)式-O(CH₂)_nZ¹（ここで、nは1、2または3であり、Z¹はジ(C₁-C₃アルキル)アミノまたはC₁-C₃アルコキシである）の基である、請求項13に記載の組成物。
15. 式(I)：
    

    

    ［式中、
    R₂は、式(IA):
    -(Ar¹)_m-(Alk¹)_p-(Z)_r-(Alk²)_s-Q (IA)
    （ここで、
    Ar¹は請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいフェニルまたは請求項1のB)で定義されたヘテロアリール基であり、
    Alk¹およびAlk²は請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい2価のC₁-C₃アルキレンまたはC₂-C₃アルケニレン基であり、
    m、p、rおよびsは独立して0または1であり、
    Zは-O-、-S-、-(C=O)-、-(C=S)-、-SO₂-、-C(=O)O-、-C(=O)NR^A-、-C(=S)NR^A-、-SO₂NR^A-、-NR^AC(=O)-、-NR^ASO₂-または-NR^A-（ここで、R^Aは水素またはC₁-C₆アルキルである）であり、そして
    Qは水素または請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいフェニルもしくはC₃-C₈シクロアルキル、または請求項1のC)で定義されたヘテロ環式基である）
    の基であり；
    R₃は水素、請求項1のA)に記載の置換基、または請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい(C₁-C₆)アルキル、アリールもしくは請求項1のB)で定義されたヘテロアリール基であり；そして
    R₄は、
    (i) 式-COOR^C（ここで、R^CはC₁-C₆アルキルもしくはC₂-C₆アルケニル基、または請求項1のA）に記載の置換基で置換されていてもよいアリールもしくは請求項1のB)で定義されたヘテロアリール基、または請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいアリール(C₁-C₆アルキル)-もしくは請求項1のB)で定義されたヘテロアリール(C₁-C₆アルキル)-基、または請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいシクロアルキル基である）のカルボキシエステル基、
    (ii) 式-CONR^B(Alk)_nR^Aのカルボキシアミド基または式-SO₂NR^B(Alk)_nR^Aのスルホンアミド基（ここで、Alkは請求項1のA）に記載の置換基で置換されていてもよい2価のアルキレン、アルケニレンもしくはアルキレン基であり、nは0または1であり、R^Bが水素、C₁-C₆アルキルまたはC₂-C₆アルケニルであり、R^Aは水素、ヒドロキシまたは請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい、単環式アリール、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくは請求項1のC)で定義されたヘテロ環式であるか、またはR^AおよびR^Bはそれらが結合している窒素原子と一緒になって、モルホリノ、ピペリジニルもしくはピラジニル環を形成し、1以上の環CまたはN原子上で請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい）である、
    但し、(i)R₃は-NH₂ではなく、(ii)R₄が-COOCH₃であり、かつR₃が水素のときは、R₂は-NH₂、エチルアミノ、ジエチルアミノ、フェニルアミノ、-N(Ph)(C₂H₅)（ここで、Phはフェニルである）、ピロリジン-1-イルまたはモルホリン-4-イルではなく、そして(iii)R₄が-CONH₂であり、かつR₃が水素であるときは、R₂は-NH₂ではない］
    の化合物、またはその塩、N-オキシド、水和物もしくは溶媒和物。
16. R₃が水素である、請求項15に記載の化合物。
17. mが1であり、p、rおよびsがそれぞれ0であり、Qが水素である、請求項15または請求項16に記載の化合物。
18. R₂が請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいフェニル、2-もしくは3-チエニル、2-もしくは3-フラニル、2-、3-もしくは4-ピリジニル、モルホリニルまたはピペリジニルである、請求項17に記載の化合物。
19. R₂が、メチル、エチル、n-もしくはイソプロピル、ビニル、アリル、メトキシ、エトキシ、n-プロピルオキシ、ベンジルオキシ、アリルオキシ、シアノメトキシ、クロロ、ブロモ、シアノ、ホルミル、メチル-、エチル-もしくはn-プロピル-カルボニルオキシ、メチル-もしくはエチル-アミノカルボニルで置換されていてもよいフェニルである、請求項17に記載の化合物。
20. 請求項1のA)に記載の置換基がフェニル環の2-および／または4-および／または5-位にある、請求項19に記載の化合物。
21. mが1であり、p、rおよびsが0であり、Qが請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいフェニルもしくはC₃-C₈シクロアルキル、または請求項1のC)で定義されたヘテロ環式基である、請求項18または請求項19に記載の化合物。
22. mが1であり、p、rおよびsの少なくとも1つが1である、請求項15または請求項16に記載の化合物。
23. Ar¹が請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいフェニル環である、請求項15〜22のいずれか1つに記載の化合物。
24. mが0である、請求項15または請求項16に記載の化合物。
25. Alk¹が存在するとき、それは請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい-CH₂-、-CH₂CH₂-または-CH=CH-であり; Alk²が存在するとき、請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい-CH₂-、-CH₂CH₂-または-CH=CH-であり; Zが存在するとき、それは-O-または-NH-であり;Qが水素である、請求項22または請求項23に記載の化合物。
26. ZおよびAlk²が存在し、Alk²がジ(C₁-C₃アルキル)アミノまたはC₁-C₃アルコキシで置換されている、請求項25に記載の化合物。
27. R₄が、式-CONR^B(Alk)_nR^Aのカルボキシアミド基または式-SO₂NR^B(Alk)_nR^Aのスルホンアミド基（ここで、
    Alkは請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい-CH₂-、-CH₂CH₂-、-CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH=CH-または-CH₂CCCH₂-であり、
    R^Bは水素またはメチル、エチル、n-もしくはイソ-プロピル、またはアリルであり、
    R^Aは水素、ヒドロキシまたは請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよいフェニル、3,4-メチレンジオキシフェニル、ピリジル、フリル、チエニル、N-ピペラジニルまたはN-モルホリニルであるか、
    またはR^AおよびR^Bはそれらが結合している窒素原子と一緒になって、モルホリノ、ピペリジニルもしくはピラジニル環を形成し、1以上の環CまたはN原子上で請求項1のA)に記載の置換基で置換されていてもよい、
    請求項15〜26のいずれか1つに記載の化合物。
28. R₄がカルボキシアミド基である、請求項15〜27のいずれか1つに記載の化合物。
29. R₄が式-COOR^C（ここで、R^Cは請求項1のA）に記載の置換基で置換されていてもよいメチル、エチル、n-もしくはイソ-プロピル、アリル、フェニル、ピリジル、チアゾリル、ベンジル、ピリジルメチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルである）のカルボキシエステル基である、請求項15〜26のいずれか1つに記載の化合物。
30. 化合物(I)が、式(II)：
    

    

    ［式中、
    AはC₁-C₆アルキルアミノ基であり；
    R₁₀はH、Cl、BrまたはCH₃であり；
    R₁₁は水素、Cl、Br、CN、メチル、エチル、n-もしくはイソ-プロピル、ビニル、またはアリルであり；
    R₁₂は、(i)式-O(CH₂)_nZ¹（ここで、nは1、2または3であり、Z¹は一級、二級、三級もしくは環状のアミノ基であるか、またはC₁-C₆アルコキシ基である）の基；あるいは(ii)式-(Alk³)_mZ¹（ここで、Alk³は2価の直鎖もしくは分枝鎖(C₁-C₃)アルキレンであり、mは0または1であり、そしてZ¹は一級、二級、三級もしくは環状のアミノ基、またはC₁-C₆アルコキシ基である）の基である］
    である、請求項15に記載の化合物。
31. R₁₂が(i)式-O(CH₂)_nZ¹（ここで、nは1、2または3であり、Z¹はジ(C₁-C₃アルキル)アミノまたはC₁-C₃アルコキシである）の基である、請求項30に記載の化合物。
32. 式：
    

    

    の化合物である、請求項30に記載の化合物。
33. 請求項15〜32のいずれか1つに記載の化合物を、1以上の医薬的または動物薬的に許容される担体および／または賦形剤とともに含む、ヒトまたは動物用医薬組成物。