JP4502352B2

JP4502352B2 - ヘムタンパク質の安定化方法および保存溶液

Info

Publication number: JP4502352B2
Application number: JP2001199224A
Authority: JP
Inventors: 哲司山口; 昌宏高木
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2021-06-29
Also published as: JP2003014768A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヘムタンパク質の安定化方法に関し、特に糞便、尿、血液試料中のヘムタンパク質検査におけるヘムタンパク質の安定化方法に関するものである。
【０００２】
【従来技術】
近年、大腸癌などの消化器系の疾患を検査する方法として、消化器官からの出血に起因する糞便中のヒトヘモグロビン（便潜血）の検出が広く行われている。
このヒトヘモグロビンの検出方法は、従来の化学的な発色反応に基づく試験紙法に代わり、ヒトヘモグロビンに特異的な抗体を利用した免疫学的手法であり、食事制限を必要としない手軽な検査方法として定着している。
【０００３】
ヒトヘモグロビンの免疫学的検出法としては、例えば寒天平板内で抗ヒトヘモグロビン抗体と被検試料中のヒトヘモグロビンとの沈降線を利用する一次元免疫拡散法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテックス粒子を用いるラテックス凝集法、酵素や放射性元素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を用いる酵素免疫法や放射性免疫法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用いる金コロイド凝集比色法等が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、ヒトヘモグロビンは、保存温度等の保存条件によって変性が促進されたり、検体中の細菌や酵素によって分解されてしまうことも多い。このような変性・分解の結果、ヒトヘモグロビンの立体構造が破壊されて抗原性の低下を招くことになる。このため、免疫学的なヒトヘモグロビンの測定方法においては、ヘモグロビンの変性・分解は誤った診断結果を生ずる原因となる。
【０００５】
一方、便潜血検査においては、被験者自身が自宅などで採取した糞便を密閉容器内の便溶解液に溶解して検査に供する場合が多い。この場合、糞便中のヒトヘモグロビンは、溶液中で数日間放置されたり、郵便等の輸送手段を利用することによって高温下に置かれることも多い。また、検査機関で採便する場合においても、他項目の検査を実施しているため、便潜血の検査までに多くの時間を要することもある。このような状況下では、前述したように、ヒトヘモグロビンの変性・分解が生じるため、精度良く測定する際の妨げとなっていた。
【０００６】
このような溶液中でのヒトヘモグロビンの変性・分解を防止するため、例えばチメロサールやクロルヘキシジン等一般的抗菌剤を添加する方法（特開昭６３−２７１１６０号公報）の他に、糖類を添加する方法（特開昭６３−２４３７５６号公報）、ヒト以外の動物ヘモグロビンの添加（特開平２−２９６１４９号公報）、ヒト以外の動物血清の添加（特開平４−１４５３６６号公報）、溶菌酵素の添加（特公平５−６９４６６号公報）、鉄プロトポルフィリンの添加（特開平５−２８１２２７号公報）等が提案されている。
しかしながら、これらの公報に記載されたヒトヘモグロビン安定化技術では、糞便を含む被検液中のヒトヘモグロビンの変性・分解を十分に抑制することができない。
【０００７】
この他にも、エチレンジアミン４酢酸（以下、ＥＤＴＡと省略する）を用いたヘモグロビン安定化方法が提案されている（特開平５−９９９２３号公報）。
しかしながら、本発明者らによる追試の結果、ＥＤＴＡ単独では糞便中のヘモグロビンに対して十分な安定化作用を期待できないことが確認された。
このため、本出願人は、ＥＤＴＡ単独よりも安定化効果の高い水溶性遷移金属錯体を添加する方法を提案している（特開平７−２２９９０２号公報）。更に、本出願人は、フェロシアン化合物と共存させたヘモグロビンの安定化方法（特開平１１−１１８８０６号公報）、ヘモグロビンの酵素分解産物を共存させたヘモグロビンの安定化方法（特開平１１−２１８５３３号公報）、および遷移金属類を共存させたヘムタンパク質の安定化方法（特願２０００−６０５９７号）を既に提案している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第一の課題は、ヘモグロビンに代表されるヘムタンパク質の変性・分解作用に対して有効な、新規なヘムタンパク質の安定化方法を提供することにある。特に変性・分解作用の強い糞便成分と共存するヘモグロビンを効果的に安定化する技術の提供を目的とする。
本発明の第二の課題は、新規なヘムタンパク質の安定化剤を利用したヘムタンパク質の保存溶液を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の課題は、ヘムタンパク質を含有する試料中に、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類を共存させることを特徴とするヘムタンパク質の安定化方法により達成された。
また、本発明の第二の課題は、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類を含有させることを特徴とするヘムタンパク質の保存溶液により達成された。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【００１０】
本発明においては、ヘムタンパク質含有試料中に、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類を０．１ｍＭ〜２Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは１Ｍとなるように共存させる。これらの物質の濃度が０．１ｍＭ未満になると、安定化効果が不十分となり、逆に２Ｍを超えると、溶解しにくくなり、免疫反応も阻害される。
【００１１】
また、本発明においては、上記物質に加えてアジ化物を添加することにより、試料中のヘムタンパク質をより一層安定化させることができる。アジ化物の具体例としては、例えば、アジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化アンモニウムおよびアジ化リチウムから成る群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００１２】
このアジ化物は、ヘムタンパク質含有試料中に０．０１〜０．２Ｗ/Ｖ%、好ましくは０．１Ｗ/Ｖ%となるように含有させる。アジ化物の濃度が０．０１Ｗ/Ｖ%未満となると、安定化効果が不十分となる。一方、アジ化物のうち、アジ化ナトリウムは、劇毒物指定品（政令第４０５号：毒物および劇物指定令の一部を改正する政令）となっているため、０．２Ｗ/Ｖ%を超えて使用することは好ましくない。
【００１３】
本発明においては、特に必要とされないが、公知のタンパク質保護剤を必要に応じて加えることによってヘムタンパク質の安定化効果をより高めることができる。このようなタンパク質保護剤としては、アルブミンやゼラチンに代表される不活性タンパク質等を挙げることができる。
【００１４】
アルブミンは、任意のものを使用することができるが、特に動物の血清や卵に由来するアルブミンが好ましい。その具体例としては、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、並びにこれらの動物の幼獣、または胎児の血液に由来するアルブミンが挙げられる。
このアルブミンには、上記したもの以外にその酵素分解物も知られているが、本発明におけるアルブミンには、このようなアルブミンから誘導されるタンパク質をも含めることができる。
【００１５】
上記タンパク保護剤の他に、例えば微生物の不必要な繁殖を防ぐための抗菌剤やヘムタンパク質の保存に有利なｐＨを与える緩衝剤などこれまでに知られている多くのヘムタンパク質保護成分の添加も有効である。
抗菌剤としては、溶菌酵素、安息香酸エチル、ペニシリン、ファンギソン、ストレプトマイシン、あるいはセファマイシン他非ペニシリン系の一連の抗生物質等が挙げられる。また、トリプシンインヒビターやα２マクログロブリンのようなプロテアーゼ抑制物質もヘムタンパク質を安定化することが知られている。
【００１６】
保存溶液のｐＨは、ヘムタンパク質を安定に保持できる範囲に設定する。極端な酸やアルカリ条件下ではヘムタンパク質の安定性を損なう恐れがあり、中性域のｐＨが望ましい。具体的には５〜１０、好ましくは６〜８程度のｐＨとする。
ｐＨの維持のためには適当な緩衝剤を利用する。たとえば、ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳと省略する）やピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳと省略する）等のグッド緩衝剤は、ヘムタンパク質の構造を最も安定化すると思われるｐＨ（６〜８）を与えると同時に、免疫反応によってヘムタンパク質を検出する時の反応用緩衝液としても利用されているものであり、特に好ましい緩衝剤として挙げられる。この他、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等を利用することもできる。
【００１７】
本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、糞便、尿、血液試料中のヘムタンパク質の検出に利用することができる。ヘムタンパク質としては、ヘムを構成成分とするタンパク質の中から適宜選択でき、例えばヘモグロビン、ミオグロビン、ペルオキシダーゼ、またはカタラーゼが挙げられる。特に抗原構造の保護が要求される免疫学的な分析対象としてのヘムタンパク質について、その抗原性の維持に有用である。
【００１８】
本発明においては、ヘムタンパク質の安定化因子として作用するリンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類を含有させたヘモクロビンの保存溶液を提供することができる。
【００１９】
更に、本発明の保存溶液には、必要に応じてアジ化物、タンパク質保護剤および緩衝剤を含有させることができる。アジ化物、タンパク質保護剤および緩衝剤としては、上記したものの中から適宜選択して使用することができる。
【００２０】
本発明は、前記ヘムタンパク質の安定化技術を応用したヘムタンパク質の免疫学的測定方法を提供することができる。免疫学的測定方法としては、例えばラテックス凝集反応法、金コロイド凝集反応法、イムノクロマトグラフ法、またはＥＬＩＳＡ法等を挙げることができる。いずれの測定方法においても、ヘムタンパク質含有試料に、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類を共存させることによって、保存中の抗原活性は保護され測定値の低下が抑制される。
【００２１】
【発明の実施の態様】
本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、生体試料中に存在する分析対象としてのヘムタンパク質を安定化するために有用である。特にヘムタンパク質を認識する抗体を用いた免疫学的手法によるヘムタンパク質の測定方法において、測定対象となるヘムタンパク質の抗原性を高度に安定化する。ヘムタンパク質を検出すべき生体試料には、糞便、尿、血液が知られている。特に糞便中のヘモグロビンは消化器における出血の指標となり、尿中のヘモグロビンは、尿路における出血の指標となる。
【００２２】
本発明の安定化方法を、糞便試料に存在するヘモグロビンに応用する場合には、糞便を懸濁させる保存溶液にリンゴ酸等の物質を添加しておくと良い。通常の糞便中のヘモグロビンの検出にあたっては、糞便を適当な保存溶液に懸濁させ必要に応じてろ過して免疫学的な分析用試料とする。
【００２３】
【発明の効果】
本発明のヘムタンパク質の安定化方法では、ヘムタンパク質に対して強い変性・分解作用を持つ生体成分、特に糞便成分との共存下においても保護作用を得ることができる。したがって、生体成分の分析、例えば糞便潜血の検出を目的とする試料に含まれるヘモグロビンの安定化に有用である。特に抗原構造の保護が要求される免疫学的な分析対象としてのヘムタンパク質について、その抗原性の維持に貢献する。本発明によって糞便試料中のヘモグロビンが効果的に安定化され、ヘモグロビンの変性・分解による偽陰性結果の防止を期待することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【００２５】
実施例１．各添加物質によるヘモグロビンの安定化効果
（１）リンゴ酸ナトリウム（１Ｍ）、（２）グリコール酸ナトリウム（１Ｍ）、（３）コハク酸２ナトリウム（１Ｍ）、（４）２−ケトグルタール酸２ナトリウム（１０ｍＭ）、（５）イソクエン酸３ナトリウム（１００ｍＭ）、（６）フマル酸２ナトリウム（１Ｍ）を含有する保存溶液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０、０．９％ＮａＣｌ、０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３）と各物質（１）〜（６）を添加しない保存溶液２ｍｌに、正常便検体Ａ、Ｂ、Ｃ１０ｍｇとヒト溶血液とを添加し、添加直後のヘモグロビン測定値と３７℃で１７時間保存したときのヘモグロビン測定値を比較した。測定は、ＯＣ−２７０Ｒ（栄研化学製）を用いてラテックス凝集反応を測定原理とする専用試薬（ＯＣヘモディアオートII:栄研化学製）で行った。
その結果を表１〜表３に示す。表に示すように、無添加のものに比べて、各物質（１）〜（６）を添加したものは、３７℃で１７時間保存後のヘモグロビンの安定化効果が著しく高いことが確認された。
【００２６】
【表１】

【００２７】
【表２】

【００２８】
【表３】

Claims

ヘムタンパク質を含有する試料中に、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類を共存させることを特徴とするヘムタンパク質の安定化方法。
リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、２-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類の濃度が０．１〜２０００ｍＭの範囲である請求項１記載のヘムタンパク質の安定化方法。
アジ化物を共存させる請求項１または２記載のヘムタンパク質の安定化方法。
アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化アンモニウムおよびアジ化リチウムから成る群から選択される少なくとも１種である請求項３記載のヘムタンパク質の安定化方法。
ヘムタンパク質がヘモグロビン、ミオグロビン、ペルオキシダーゼ、またはカタラーゼである請求項１記載のヘムタンパク質の安定化方法。
ヘムタンパク質を含有する試料が糞便、尿または血液である請求項１記載のヘムタンパク質の安定化方法。
リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、グリコール酸、2-ケトグルタル酸およびイソクエン酸から成る群から選択される少なくとも１種、またはそれらの塩類を含有することを特徴とするヘムタンパク質の保存溶液。
アジ化物を含有する請求項７記載のヘムタンパク質の保存溶液。
アジ化物がアジ化ナトリウム、アジ化カリウム、アジ化アンモニウムおよびアジ化リチウムから成る群から選択される少なくとも１種である請求項８記載のヘムタンパク質の保存溶液。