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JPH10293131A - 血液中の白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬 - Google Patents

血液中の白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬

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JPH10293131A
JPH10293131A JP9101808A JP10180897A JPH10293131A JP H10293131 A JPH10293131 A JP H10293131A JP 9101808 A JP9101808 A JP 9101808A JP 10180897 A JP10180897 A JP 10180897A JP H10293131 A JPH10293131 A JP H10293131A
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hemoglobin
reagent
salt
concentration
leukocytes
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JP9101808A
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欣也 内橋
Yoshio Ikeuchi
喜郎 池内
Atsushi Shirakami
篤 白上
Yukio Hamaguchi
行雄 浜口
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Sysmex Corp
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Abstract

(57)【要約】 【課題】シアン化合物を使用せず、白血球数を測定で
き、また試料の液温が変動しても安定してヘモグロビン
濃度を測定できる試薬を提供する。 【解決手段】(1)赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変性
することのできる量のカチオン性界面活性剤、(2)下記
の(a),(b)及び(c)からなる群から選ばれる少なくとも１
種類のヘモグロビン安定化剤： (a)メトヘモグロビンへの転化を促進するのに有効な量
のスルホサリチル酸あるいはその塩、(b)0.2〜10.0ｇ／
Ｌの窒素原子とカルボキシル基を有する水溶性キレート
剤、及び(c)メトヘモグロビンへの転化を促進するのに
有効な量のピペラジンあるいはその塩、(3)pHを4〜 6に
維持するための緩衝剤を含む血液中の白血球及びヘモグ
ロビン濃度測定試薬。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血液試料中の白血
球及びヘモグロビン濃度測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液中の白血球数及びヘモグロビン濃度
を測定することは、白血病や貧血症等の臨床診断あるい
は、治療経過をモニタリングをする上で極めて重要であ
る。
【０００３】現在では、白血球数及びヘモグロビン濃度
は、自動血液分析装置によって短時間で測定することが
でき、広く使用されている。
【０００４】自動血液分析装置には、光散乱や蛍光等を
検出する光学的検出方式によるものと、細孔を粒子が通
過するときのインピーダンス変化を検出する電気抵抗検
出方式によるものとに大別できるが、後者の方が簡便さ
という点では優れている。電気抵抗検出方式によれば、
白血球数の測定は、血液試料に溶血剤を加えて赤血球を
溶解し、白血球のみを残した白血球測定用試料を調製し
た後、検出器に流して発せられる信号を検出することに
よって行われる。
【０００５】また、通常末梢血液中の白血球には、リン
パ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球の 5種類が
存在するが、溶血剤の組成を好適に配合することによっ
て、2つあるいは 3つに分画したり、特定の種類の白血
球のみを検出することができる。これにより、顕微鏡観
察に頼らざるを得なかった白血球分類も自動的に短時間
で行うことができるようになり、検査技師の負担が軽減
され、また検査に特別の技術を要することがなくなっ
た。
【０００６】一方、ヘモグロビン濃度の測定には、シア
ン化合物を含むVan Kampen試薬によりヘモグロビンをシ
アンメトヘモグロビンに転化して541nm 付近の吸光度を
測定することによって行う方法が国際標準法として採用
されている。また、自動血球分析装置用には、界面活性
作用を有する四級アンモニウム塩で赤血球を断片化し、
かつヘモグロビンを変性し、シアン化アルカリでシアン
メトヘモグロビン様の吸収曲線を得て測定を行い、さら
に白血球の測定をも可能にしたものが知られている。し
かしながらこれらの方法は、試薬中に有害なシアン化合
物を含むため、試薬あるいは測定後の試料は、無毒化し
てから廃棄する必要がある。
【０００７】そこで、ヘモグロビン濃度の測定のために
シアン化合物を使用せず、白血球計数を可能にした試薬
が知られている（米国特許第4,185,964号）。この試薬
では、界面活性作用を有する水溶性四級アンモニウム塩
と、少量の炭素数約8個までのポリカルボン酸を白血球
の溶解を十分阻止できる量で含む。さらには、白血球の
3分類を可能にした溶血剤も知られている。これらは、
四級アンモニウム塩と特定のヘモグロビン安定化剤とを
含む。（特開平3-137566号、特開平3-252557号、特開平
4-13969号）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記の溶血剤は、ヘモ
グロビンを速やかに変性させることができるが、試料の
液温が変動するとヘモグロビン濃度が大きく変動すると
いう欠点がある。とくに、米国特許第4,185,964号で
は、安定化剤がないため、変動が大きい。特開平3-1375
66号、特開平3-252557号、特開平4-13969号では、特定
のヘモグロビン安定化剤が加えられているため変動は小
さくなるものの、液温が変動したときにはヘモグロビン
濃度が変動し、そのような場合の安定化効果としては不
十分である。従って、安定した測定値を得るためには、
液温を一定に保つためのユニットが必要になる。このた
め、装置のコストアップの要因の一つになる。
【０００９】本発明は、シアン化合物を使用せず、白血
球数を測定でき、また試料の液温が変動しても安定して
ヘモグロビン濃度を測定できる試薬を提供することを目
的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の白血球及びヘモ
グロビン濃度測定試薬は、(1)赤血球を溶解し、ヘモグ
ロビンを変性することのできる量のカチオン性界面活性
剤、(2)下記の(a),(b)及び(c)からなる群から選ばれる
少なくとも１種類のヘモグロビン安定化剤： (a)メトヘモグロビンへの転化を促進するのに有効な量
のスルホサリチル酸あるいはその塩、(b)0.2〜10.0ｇ／
Ｌの窒素原子とカルボキシル基を有する水溶性キレート
剤、及び(c)メトヘモグロビンへの転化を促進するのに
有効な量のピペラジンあるいはその塩、(3)pHを4〜 6に
維持するための緩衝剤を含む。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の白血球及びヘモグロビン
濃度測定試薬を用いると、白血球及びヘモグロビン濃度
を同時に測定することもできるし、あるいは別々に測定
することもできる。
【００１２】本発明の白血球及びヘモグロビン濃度測定
試薬には、赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変性しうる
量のカチオン性界面活性剤を含む。カチオン性界面活性
剤としては、好適には、下記の構造を有する四級アンモ
ニウム塩型あるいはピリジニウム塩型の少なくとも１種
類を含む。
【００１３】具体的には以下のものが好ましい： (a)四級アンモニウム塩
【化１】 （式中、Ｒ1はＣ8〜Ｃ20のアルキル基、アルケニル基又
はアルキニル基であり；Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は独立にＣ1〜
Ｃ8のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であ
り、Ｘ-はハロゲンイオン基である） (b)ピリジニウム塩
【化２】 （式中、ｎ＝７〜１９の整数であり、Ｘ-はハロゲンイ
オン基である）
【００１４】本発明の試薬で使用されるカチオン性界面
活性剤の好適な濃度は、0.1〜15.0ｇ／Ｌである。上記
のうち、好ましくは四級アンモニウム塩であり、特に好
適な濃度は0.1〜4.0ｇ／Ｌである。また、上述の界面活
性剤を適宜組み合わせることによって、白血球を例え
ば、リンパ球とその他の２つ、あるいは、リンパ球、好
中球およびその他の３つに分画することができる。
【００１５】また、本発明の白血球及びヘモグロビン濃
度測定試薬には、メトヘモグロビンへの転化を促進する
のに有効な量のヘモグロビン安定化剤を含む。安定化剤
は(a)スルホサリチル酸あるいはその塩、(b)窒素原子と
カルボキシル基を有する水溶性キレート剤及び(c)ピペ
ラジンあるいはその塩からなる群から選ばれる少なくと
も１種類である。水溶性キレート剤としては、例えばエ
チレンジアミン四酢酸あるいはその塩、ジアミノプロパ
ノール四酢酸あるいはその塩、ジアミノプロパン四酢酸
あるいはその塩、エチレンジアミン二酢酸あるいはその
塩、エチレンジアミン二プロピオン酸あるいはその塩が
挙げられる。特に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸
塩である。
【００１６】ヘモグロビン安定化剤はメトヘモグロビン
への転化を促進するのに有効な量で使用するが、通常0.
2〜10.0ｇ／Ｌの範囲で好適に使用される。より好適な
濃度については、用いる物質によって異なるが、スルホ
サリチル酸あるいはその塩を使用する場合、より好適な
濃度は0.2〜2.0ｇ／Ｌである。また、水溶性キレート剤
を使用する場合、例えばエチレンジアミン四酢酸塩では
0.5〜10ｇ／Ｌ、ジアミノプロパノール四酢酸あるいは
その塩では0.5〜5ｇ／Ｌ、ジアミノプロパン四酢酸ある
いはその塩では0.5〜5ｇ／Ｌ、エチレンジアミン二酢酸
あるいはその塩では0.5〜5ｇ／Ｌ、エチレンジアミン二
プロピオン酸二塩酸塩では0.5〜5ｇ／Ｌで特に好適に使
用される。ピペラジンあるいはその塩では、0.5〜5ｇ／
Ｌで好適に使用される。なお、この安定化剤が緩衝能を
有する場合には、緩衝剤の一部として用いてもよい。
【００１７】これらの安定化剤は、上述したカチオン界
面活性剤または、その組み合わせ組成により変性したメ
トヘモグロビン中のヘム鉄と結合することにより安定化
するものと推測できる。
【００１８】緩衝剤は、pHを4.0〜6.0に維持できるもの
であれば、とくに制限されない。pHが低すぎると、白血
球が脆弱化されることにより白血球数の測定に悪影響を
及ぼす。又、pHが高すぎるとヘモグロビンの経時安定性
が悪くなる。具体的には、Good緩衝剤、リン酸緩衝剤、コ
ハク酸緩衝剤、マレイン酸−トリス緩衝剤等公知のもの
が使用できる。濃度は、5〜50mM,さらには15〜30mM が
好適である。
【００１９】なお、上記の各成分の濃度は、血液を直接
本発明の白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬に希釈し
て使用する場合の濃度である。あるいは、あらかじめ、
血液を希釈液（例えば、生理食塩水やセルパックTM（東
亞医用電子（株）））で希釈した後に試薬を添加しても
よい。その場合は、試薬添加後の濃度が上記の範囲にな
るように、各成分の濃度を調整すればよい。このとき用
いられる希釈液は、血球の形態を保持するために、通常
ｐＨが中性付近(6〜8)、浸透圧が等張付近(240〜330 Os
m/kg)のものが好適に使用される。
【００２０】本発明の試薬は電気伝導度を８〜２０mS/c
mとすることが好ましく、１０〜１５mS/cmとすることが
さらに好ましい。電気伝導度の調節はＮａＣｌなどの電
解質を適宜添加して行うことができる。
【００２１】本発明の白血球及びヘモグロビン濃度測定
試薬を用いて血液試料を調製し、自動血球分析装置に試
料を導入し、粒子が細孔を通過するときのインピーダン
ス変化を検出することにより白血球を、また試料の吸光
度を検出することによりヘモグロビン濃度を同一試料で
同時に、又は別々に測定することができる。
【００２２】本発明の試薬の組成例としては例えば次の
ものが挙げられる。組成例１ セチルトリメチルアンモニウムクロライド 0.3〜3.0 ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 0.5〜5.0 ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 15〜30 mM ＮａＣｌ 適量 精製水 １Ｌ
【００２３】組成例２ ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.3〜10.0 ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.1〜 1.0 ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 0.5〜 5.0 ｇ／Ｌ Ｇｏｏｄ緩衝液 15〜 30 mM ＮａＣｌ 適量 精製水 １Ｌ
【００２４】組成例３ ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.3〜10.0 ｇ／Ｌ ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン 0.5〜 5.0 ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 0.5〜 5.0 ｇ／Ｌ コハク酸緩衝液 15〜 30 mM ＮａＣｌ 適量 精製水 １Ｌ
【００２５】組成例１〜３では、白血球及びヘモグロビ
ンを同時に測定することができるが、各界面活性剤の種
類、濃度を調整することにより、白血球を２つ以上の集
団に分画することも可能である。白血球の集団とは、例
えばリンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球などを
示す。組成例１では、白血球を１つの集団に、組成例
２、３では白血球を２〜３つの集団にそれぞれ分けるよ
うに組み合わせたものである。
【００２６】
【実施例】
実施例１：温度変化に対する安定性 以下の本発明の試薬及び比較例１、２の試薬を調製し
て、異なる温度下で反応させたときのヘモグロビンの量
を測定した。
【００２７】本発明の試薬 ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 3.0 ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.2 ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 1.0 ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 20 mM (pH 5.0) ＮａＣｌ 適量 （電気伝導度を約13mS/cmにする量） 精製水 １Ｌ
【００２８】比較例１ ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 3.0 ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.2 ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 20 mM ＮａＣｌ 適量 （電気伝導度を約13mS/cmにする量） 精製水 １Ｌ
【００２９】比較例２ ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 3.0 ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.2 ｇ／Ｌ イミダゾール 1.0 ｇ／Ｌ Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液 （電気伝導度を約13mS/cmにする量） 精製水 １Ｌ
【００３０】血液を上記組成の各試薬で５００倍に希釈
し、１０℃及び３５℃で３０秒反応させた後の吸光度を
分光光度計を用いて測定し、３５℃における吸光度の１
０℃における吸光度に対する変化率、ならびにそれから
計算した変化ヘモグロビン量（換算値）を求めた。得ら
れた結果を表１に示す。
【００３１】 表１ 試薬 変化率 変化ヘモグロビン量（換算値） 本発明 −3.50 % −0.53 g/dl 比較例１ −15.7 % −2.34 g/dl 比較例２ −6.1 % −0.91 g/dl 変化率＝３５℃における吸光度／１０℃における吸光度
【００３２】比較例１の試薬は、本発明の試薬から安定
化剤を除いた組成であるが、この場合、温度による変化
率は大きい。上記本発明の試薬では安定化剤としてＥＤ
ＴＡ−２Ｋを、比較例２では安定化剤としてイミダゾー
ルを含むが、これらにおいては変化率は安定化剤を含ま
ない比較例１に比べて減少した。
【００３３】安定化剤としてはこれ以外のものも使用可
能であるが、その変化率の程度は使用する安定化剤の種
類によって異なっていた。
【００３４】 実施例２：従来法との相関関係試薬組成 ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 8.7 ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 0.8 ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 3.0 ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 60 mM (pH 5.0) ＮａＣｌ 電気伝導度を13mS/cmにする量 精製水 １Ｌ
【００３５】１）ヘモグロビンにおける相関関係 上記試薬を用い、セルパックTM（東亞医用電子（株））
を希釈液とし、Ｋ−４５００（東亞医用電子（株））を
使用して、１１３検体についてヘモグロビン量の測定を
行った。対照は、シアンメトヘモグロビン変法（国際標
準法を自動血球分析装置用に改良された方法：ストマト
ライザーＣ（東亞医用電子（株））を使用し、同様にＫ
−４５００で測定）で測定したヘモグロビン量として相
関図を作成した（図１）。この装置では、血液はまず希
釈液で希釈され、次いで上記試薬と混合される。最終的
には、血液は５００倍に希釈され、上記試薬のカチオン
界面活性剤、EDTA-2K、リン酸緩衝液濃度は１／３にな
る。ＮａＣｌは希釈液中にも含まれており、電気伝導度
はほとんど変わらない。図中、Ｘ軸に従来法を、Ｙ軸に
本発明の試薬を用いた方法を表した。グラフの相関係数
r=0.997、回帰直線Y=0.951X+0.588と良好な相関関係が
得られ、ヘモグロビンが測定可能であることが確認でき
た。
【００３６】２）白血球における相関関係 上記試薬を用い、セルパックTM（東亞医用電子（株））
を希釈液とし、Ｋ−４５００（東亞医用電子（株））を
使用して、白血球数の測定を行った。対照は、ストマト
ライザー３ＷＰTM（東亞医用電子（株））を使用し、同
様にＫ−４５００で測定を行い、相関図（図２）を作成
した（Ｎ＝１１３）。グラフの相関係数r=0.997、回帰
直線Y=0.986X+1.137と良好な相関関係が得られ、従来法
と同様にに白血球が測定可能であることが確認できた。
【００３７】又、白血球分類値についても検討を行った
ところ、従来法と同等の良好な相関関係が得られた（Ｎ
＝５１）。図３〜図５に結果を示す。なお、Ｗ−ＳＣＲ
は溶血剤添加後の小型白血球比率でリンパ球比率に相当
し、Ｗ−ＬＣＲは溶血剤添加後の大型白血球比率で好中
球比率に相当し、Ｗ−ＭＣＲは溶血剤添加後の中型白血
球比率でその他の白血球の比率に相当する。また、粒度
分布図を図６に示す。
【００３８】 実施例３：白血球２分類試薬試薬組成 ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド 6.1 ｇ／Ｌ ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド 1.1 ｇ／Ｌ ＥＤＴＡ−２Ｋ 3.0 ｇ／Ｌ リン酸緩衝液 60 mM (pH 5.0) ＮａＣｌ 電気伝導度を13mS/cmにする量 精製水 １Ｌ
【００３９】上記試薬を用い、セルパックTM（東亞医用
電子（株））を希釈剤とし、Ｋ−４５００（東亞医用電
子（株））を使用して、白血球の測定を行ったところ、
白血球が２分類できることが確認された。粒度分布図を
図７に示す。図中、大きさの小さな集団がリンパ球に相
当し、大きい側の集団がその他の白血球に相当する。
【００４０】
【発明の効果】本発明によれば、試料の液温が変わって
も安定に白血球数及びヘモグロビン濃度を測定すること
ができる。このため、試料の液温を一定にするためのユ
ニットも不要になり、分析装置を安価にすることができ
る。
【００４１】また、シアン化合物を使用せずに白血球数
及びヘモグロビン濃度を測定することができるため、廃
液処理のための特別な操作は不要になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の試薬を用いて測定したヘモグロビン量
と従来法で測定したヘモグロビン量との相関図である。
【図２】本発明の試薬を用いて測定した白血球数と従来
法で測定した白血球数との相関図である。
【図３】実施例２の試薬を用いて測定した、Ｗ−ＳＣＲ
と従来法で測定したＷ−ＳＣＲとの相関図である。
【図４】実施例２の試薬を用いて測定したＷ−ＭＣＲと
従来法で測定したＷ−ＭＣＲとの相関図である。
【図５】実施例２の試薬を用いて測定したＷ−ＬＣＲと
従来法で測定したＷ−ＬＣＲとの相関図である。
【図６】実施例２の試薬を用いて測定した白血球の粒度
分布図である。
【図７】実施例３の試薬を用いて測定した白血球の粒度
分布図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 白上 篤 兵庫県神戸市中央区港島中町７丁目２番地 の１ 東亞医用電子株式会社内 (72)発明者 浜口 行雄 兵庫県神戸市中央区港島中町７丁目２番地 の１ 東亞医用電子株式会社内

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】(1)赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変性
    することのできる量のカチオン性界面活性剤、 (2)下記の(a),(b)及び(c)からなる群から選ばれる少な
    くとも１種類のヘモグロビン安定化剤： (a)メトヘモグロビンへの転化を促進するのに有効な量
    のスルホサリチル酸あるいはその塩、 (b)0.2〜10.0ｇ／Ｌの窒素原子とカルボキシル基を有す
    る水溶性キレート剤、及び (c)メトヘモグロビンへの転化を促進するのに有効な量
    のピペラジンあるいはその塩、 (3)pHを4〜 6に維持するための緩衝剤 を含む血液中の白血球及びヘモグロビン濃度測定試薬。
  2. 【請求項２】水溶性キレート剤が、EDTA塩である請求項
    1記載の試薬。
  3. 【請求項３】メトヘモグロビンへの転化を促進するのに
    有効な量が、0.2〜10.0ｇ／Ｌである請求項１記載の試
    薬。
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